195 Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl., v. 26, n.3, p. 195-198, 2005 ISSN 1808-4532 Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences Plantas do cerrado brasileiro com atividade contra Mycobacterium fortuitum *Autor correspondente: Profa. Dra. Clarice Queico Fujimura Leite - Departamento de Ciências Biológicas - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Rodovia Araraquara-Jaú, km 01 - 14801-902 - Araraquara - SP. e-mail: leitecqf@fcfar.unesp.br - Fone: (16) 3301-6953 Recebido 18/08/05 / Aceito 14/03/06 Arantes, V.P.1,2; Sato, D.N.3; Vilegas, W.4; Santos, L.C.4; Leite, C.Q.F.1* 1 Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Araraquara, SP, Brasil 2 Departamento de Ciências Biológicas, Médicas e da Saúde, Universidade Paranaense, UNIPAR, Paranavaí, PR 3 Instituto Adolfo Lutz, Ribeirão Preto, SP 4 Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Araraquara, SP, Brasil INTRODUÇÃO Mycobacterium fortuitum causa infecções pulmonares, septicemia, infecções cardíacas, infecções em feridas cirúrgicas e em feridas traumáticas. O microrganismo também pode ser encontrado como contaminante de aparelhos médicos e soluções, afetando principalmente pacientes imunodeprimidos (Blanco et al., 2002). Esta micobactéria de crescimento rápido foi descrita pela primeira vez em 1938 por Costa Cruz (Falkinham III, 1996) sendo naturalmente resistente aos medicamentos utilizados no tratamento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Swenson et al., 1985; Goodfelow & Magee 1998). Segundo Unni et al. (2005), M. fortuitum também é resistente aos medicamentos empregados no esquema terapêutico da tuberculose. Neste sentido, salienta-se a necessidade da pesquisa de novos compostos, menos tóxicos e mais efetivos contra M. fortuitum. A descoberta de novas drogas representa um desafio principalmente em relação as substâncias com atividade contra micobactérias que são organismos de crescimento lento, patogênicas e, sua parede rica em lipídio, representa verdadeira proteção contra os agentes agressores (Rando et al., 2002). As plantas através de vias metabólicas secundárias produzem diversos compostos, sendo já verificada atividade biológica contra micobactérias em algumas classes de terpenóides (Cantrell et al., 2001) e fisalinas (Pietro et al., 2000; Janúario et al., 2002). Em relação à polaridade, os extratos vegetais apolares são pouco estudados, pois requerem uso de solventes e meios de culturas especiais para a execução do trabalho experimental. No entanto, devido à alta porcentagem de lipídios na parede das micobactérias, são os extratos e princípios ativos apolares, os mais promissores em relação à atividade antimicobacteriana. (Grange, 1998; Goodfelow & Magee, 1998). A atividade antimicobacteriana de extratos vegetais frente as micobactérias pode ser avaliada por diferentes metodologias (Cardoso et al., 2004), sendo determinada preferencialmente pela microtécnica em placas de 96 poços denominada de MABA (Microplate Alamar Blue Assay). Nesta, é verificada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato necessário para inibir em 90% a proliferação bacteriana. O corante Alamar Blue é empregado para avaliar a viabilidade bacilar (Franzblau et al., 1998). A técnica do MABA tem sido utilizada por diversos autores para triar princípios ativos naturais (Pietro et al., 2000; Januário et al., 2002) e novas drogas sintéticas (Rando et al., 2002; Kritski, 2003) com atividade contra o bacilo da tuberculose. Neste estudo procurou-se pesquisar plantas do Cerrado brasileiro com atividade contra M. fortuitum empregando o MABA para avaliar atividade antimicobacteriana dos extratos vegetais. RESUMO Mycobacterium fortuitum é uma micobactéria de crescimento rápido, ubíquo na natureza e relacionada a micobacteriose de importância médica. Ela tem sido isolada de bacteremias, abscessos, endocardites, feridas cirúrgicas e traumáticas. De difícil tratamento, o bacilo é reconhecido na literatura como resistente inclusive aos medicamentos utilizados na terapêutica da tuberculose. O objetivo deste trabalho foi pesquisar extratos vegetais do Cerrado brasileiro com atividade contra M. fortuitum, empregando a técnica do Microplate Alamar Blue Assay (MABA) como método analítico. Dos 26 extratos testados frente ao M. fortuitum, o extrato apolar de Quassia amara (extrato diclorometanico) foi o que apresentou melhor resultado com valor de CIM de 62,5µµµµµg/mL seguidos pelos extratos apolares de Syngonanthus macrolepsis, Davilla elliptica, Turnera ulmifolia com CIM de 125µµµµµg/mL. Para as mesmas plantas analisadas, utilizando-se agentes extratores polares (etanol e metanol), foram verificados CIM superiores a 500µµµµµg/mL. Os valores foram semelhantes aos de extratos de outras plantas analisadas sendo considerados não promissores. Palavras-chave: M. fortuitum, plantas do Cerrado, fitoterápicos, Microplate Alamar Blue Assay (MABA). 196 Sensibilidade de M. fortuitum aos extratos vegetais MATERIAL E MÉTODOS Material analisado: Foram analisados 26 extratos vegetais (Tabela 1). Os espécimes vegetais foram coletados e identificados pelo Prof. Dr. Jorge Tamashiro do Instituto de Biociências da Unicamp (2001-2003) e os extratos vegetais obtidos no Instituto de Química –UNESP. Obtenção de extratos: Para a obtenção dos extratos polares e apolares, em linhas gerais, o material vegetal foi desidratado em estufa a 50oC e pulverizado em moinho de facas. O pó obtido (500g) foi submetido à extração exaustiva por maceração com clorofórmio ou diclorometano (extratos apolares) e etanol ou metanol (extratos polares), à temperatura ambiente por 48 horas, empregando no total dois litros de cada solvente. Em seguida, os solventes foram evaporados a 60°C sob pressão reduzida. Os extratos secos foram transferidos para frascos de vidro e armazenados em geladeira até sua utilização. Para o uso, inicialmente os extratos foram diluídos em DMSO obtendo assim concentrações denominados de solução estoque, cujos valores são apresentados na Tabela 1. Micobactéria empregada: Cultura confluente crescida no meio de Lowenstein-Jensen (LJ) da cepa padrão de M. fortuitum ATCC 6841 foi mantida sob refrigeração até o momento do uso. Para o ensaio inicialmente, foi retirada uma alçada que foi semeada no meio de Middlebrook 7H9 com incubação por 10 dias. A cultura foi então diluída até a turvação correspondente a turvação do tubo 1 da escala de MacFarland e a partir desta, realizada a diluição 1:25 que foi empregada como suspensão inoculante Avaliação da atividade antimicobacteriana por MABA: Para determinar a atividade antimicobacteriana, a partir da Planta Parte vegetal Agente Extrator Estoque (mg/mL) 1. Ananas ananassoides Folhas Diclorometano 115 2. Ananas ananassoides Folhas Metanol 630 3. Byrsonima cinera Folhas Metanol 292 4. Byrsonima crassa Folhas Clorofórmio 177 5. Byrsonima crassa Folhas Etanol 494 6. Byrsonima crassa Aéreas Clorofórmio 228 7. Byrsonima fagifolia Folhas Metanol 419 8. Cissus suscicaulis Folhas Clorofórmio 159 9. Curatella americana Cascas Clorofórmio 173 10. Davilla elliptica Folhas Diclorometano 211 11. Eriocaulon ligulatum Escapos Clorofórmio 500 12. Leiothrix flavescens Escapos Clorofórmio 206 13. Mouriri pusa Folhas Diclorometano 224 14. Mouriri pusa Folhas Metanol 729 15. Quassia amara Cascas Diclorometano 53 16. Solanum cernuum Folhas Diclorometano 225 17. Strychnos pseudoquina Folhas Metanol 679 18. Strychnos pseudoquina Folhas Diclorometano 183 19. Syngonanthus artrothichus Escapos Diclorometano 195 20. Syngonanthus bissulcatus Capitulo Etanol 214 21. Syngonanthus macrolepsis Escapos Diclorometano 163 22. Syngonanthus macrolepsis Escapos Clorofórmio 199 23. Syngonanthus xerantemoides Escapos Etanol 718 24. Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanol 729 25. Turnera ulmifolia Flores Cloroformio 87 26. Turrnera ulmifolia Folhas Diclorometano 260 solução estoque os extratos foram diluídos para obter concentrações de 4000 a 62,5µg/mL. A atividade foi determinada em triplicatas utilizando microplacas estéreis de 96-poços. (Falcon 3072; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) e o método de MABA segundo Franzblau et al.(1998) com redução do tempo de incubação das micobactérias de cinco para dois dias. Reduziu-se o tempo de incubação das placas baseado no ensaio prévio descrito abaixo, pois Franzblau et al.(1998) padronizaram a metodologia para M. tuberculosis, micobactéria de crescimento lento e o M. fortuitum é de crescimento rápido. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida como a menor concentração da droga capaz de prevenir a alteração de cor do reagente Alamar Blue (Accumed International, Westlake, Ohio) de azul para rosa. A cor azul no poço foi interpretada como ausência de crescimento da micobactéria e a cor rosa como de viabilidade e multiplicação bacilar. No presente estudo foram considerados promissores, extratos com valor de CIM igual ou inferior a 250µg/mL. Padronização do tempo de incubação: Para determinar o tempo de incubação e adição do Alamar Blue, a suspensão de M. fortuitum na diluição de 1:25 foi inoculada em microplacas e a partir de 24 horas de incubação, foram adicionados 25µL da solução de MABA na primeira coluna, com reincubação e leitura após 24 horas. Para os controles negativos foram adicionados 25µL de solução de Alamar Blue na segunda coluna e incubação por mais 24 horas, repetindo a operação, nos dias subseqüentes, até a viragem da solução de Alamar Blue de azul para rosa. Neste procedimento, verificou-se que o melhor tempo de incubação para o M. fortuitum era de dois dias e a adição da solução reveladora de Alamar Blue foi padronizada para o segundo dia de incubação. No terceiro dia foi então realizada a leitura do teste. Tabela 1 - Relação do componente do vegetal utilizado, agente extrator e concentração dos extratos utilizados na determinação da atividade antimicobacteriana. 197 RESULTADOS Os resultados da atividade antimicobacteriana dos diferentes extratos são apresentados na Tabela 2. Os valores de CIM variaram num intervalo de 62,5 a 4000µg/mL. Com exceção de extratos apolares de Q. amara, de D. elliptica, de S. macrolepsis e de T. ulmifolia, os demais extratos apresentaram valores de CIM iguais ou superiores a 500µg/ mL. O extrato apolar de Q. amara apresentou valor de CIM promissor de 62,5µg/mL, seguidos pelos extratos apolares de D. elliptica, S. macrolepsis e T. ulmifolia com CIM de 125µg/mL. Para as mesmas plantas analisadas, utilizando extratores polares (etanol ou metanol), foram verificados CIM superiores a 500µg/mL. Planta Agente Extrator CIM (µg/mL) 1. Ananas ananassoides DCM 4000 2. Ananas ananassoides Metanol 4000 3. Byrsonima cinera Metanol 1000 4. Byrsonima crassa Clorofórmio 4000 5. Byrsonima crassa Etanol 4000 6. Byrsonima crassa Clorofórmio 500 7. Byrsonima fagifolia Metanol 4000 8. Cissus suscicaulis Clorofórmio 1000 9. Curatella americana Clorofórmio 4000 10. Davilla elliptica Diclorometano 125 11. Eriocaulon ligulatum Clorofórmio 500 12. Leiothrix flavescens Clorofórmio 1000 13. Mouriri pusa Diclorometano 4000 14. Mouriri pusa Metanol 4000 15. Quassia amara Diclorometano 62,5 16. Solanum cernuum Diclorometano 500 17. Strychnos pseudoquina Metanol 70% 4000 18. Strychnos pseudoquina Diclorometano 500 19. Syngonanthus artrothichus Diclorometano 500 20. Syngonanthus bissulcatus Etanol 4000 21. Syngonanthus macrolepsis Diclorometano 1000 22. Syngonanthus macrolepsis Clorofórmio 125 23. Syngonanthus xerantemoides Etanol 4000 24. Syngonanthus xerantemoides Etanol 4000 25. Turnera ulmifolia Cloroformio 125 26. Turnera ulmifolia Diclorometano 125 Tabela 2 - Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. fortuitum ATCC 6841 pela técnica do MABA. DISCUSSÃO A necessidade de pesquisas de novas drogas para tratamento de micobacterioses, é relatada por diferentes autores (Swenson et al., 1985; Brown et al., 1992). Neste estudo, para M. fortuitum valores de CIM igual ou inferior a 125µg/mL foram encontrados apenas nos extratos apolares de Q. amara, D. elliptica, S. macrolepsis, T. ulmifolia e T. ulmifolia indicando que extratos apolares destas plantas têm componentes com atividade promissoras contra M. fortuitum. A elevada concentração de lipídios de alto peso molecular presentes na parede de micobactérias (Cantrell et al., 2001) provavelmente funcionou como uma barreira para os compostos polares, justificando os valores mais promissores para os extratos apolares. Os componentes ativos apolares sendo compostos lipofílicos, provavelmente puderam permear mais facilmente a barreira lipídica presente na parede das micobactérias. Em relação aos componentes ativos presentes nos extratos, alguns óleos essenciais como terpeneol, geraniol, citronelol, cineol e outros presentes no gênero Eucalyptus L’Herit, são reconhecidas como bactericidas (Hinou et al. 1989; Leite et al., 1998). Outros constituintes químicos como os terpenóides, flavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e alcalóides também tem sido estudados quanto a sua atividade antimicrobiana (Cechinel Filho & Yunes, 1998; Cantrell et al., 2001). As espécies Q. amara, D. elliptica, S. macrolepsis, T. ulmifolia e T. ulmifolia, que neste trabalho apresentaram melhor atividade antimicobacteriana, possuem como constituintes flavonóides, triterpenos e esteróides (David et al., 1996; Cantrell et al., 2001) os quais são melhor extraídos por extratores apolares (Other Phythochemical Screening, 2004). Os terpenóides são chamados de inseticidas naturais e esta classe integra os limonóides, limoneno e o mirceno, os quais desempenham um papel de proteção às plantas contra os insetos. Alguns terpenóides já foram testados e apresentaram atividade contra micobactérias (Cantrell et al., 2001). Os terpenos são formados por unidades básicas de isopentenil-pirofosfato ou isopreno ativo, originando os triterpenos e os sesquiterpenos já citados na literatura como substâncias dotadas de ação bactericida(Pietro et al., 2000; Januário et al., 2002). Os flavonóides constituem um grande grupo de pigmentos vegetais de ampla distribuição na natureza que protegem as plantas contra infecções bacterianas e fúngicas (Hamburger & Hostettman, 1991). Em relação ao método analítico, o método do MABA empregado neste trabalho apresentou inúmeras facilidades na triagem de extratos vegetais com atividade antimicobacteriana como rapidez nos resultados, sensibilidade e possibilidade de testar inúmeros compostos empregando quantidade reduzida de extratos vegetais. Outras vantagens que podem ser citadas são: não alterar a constituição dos componentes termolábeis e possibilidade de avaliar concentrações múltiplas e diversos extratos simultaneamente (Franzblau et al., 1998). MABA foi empregado neste trabalho para determinar a atividade de substâncias naturais contra o M. fortuitum. Para M. tuberculosis já é preconizando a incubação de cinco dias para adição da solução de Alamar Blue (Franzblau et al., 1998). Para M. fortuitum com menor tempo de geração, foi padronizada a aplicação do corante Alamar Blue após dois dias de incubação. O estudo mostrou a viabilidade da utilização do MABA mesmo para as micobactérias de crescimento rápido, fato que possibilita estudo de novas drogas contra M. fortuitum que mesmo pertencendo ao gênero Mycobacterium, apresenta sensibilidade diferenciada em relação ao M. tuberculosis. Com os resultados deste trabalho pode-se concluir que a técnica do MABA pode ser usada, com sucesso, na triagem rápida de extratos vegetais com atividade contra Sensibilidade de M. fortuitum aos extratos vegetais 198 M. fortuitum utilizando tempo de incubação de dois dias e que extratos apolares de Q. amara, D. elliptica, S. macrolepsis e T. ulmifolia apresentam atividade promissora contra esta bactéria. AGRADECIMENTOS: AUXILIO FAPESP 02/05503-6 ABSTRACT Brazilian cerrado plants active against Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum is a rapidly-growing species of bacteria, ubiquitous in the environment and related to important human mycobacterioses. It has been isolated from blood, abscesses, the endocardium and surgical and traumatic wounds. This mycobacterium is hard to treat, being recognized in the literature as resistant even to the drugs used in the treatment of tuberculosis. The objective of this study was to screen extracts prepared from plants of the Brazilian cerrado (extended savanna- like belt) with known activity against M. fortuitum, employing the Microplate Alamar Blue Assay (MABA) as the analytical method. Out of 26 extracts tested against M. fortuitum, the nonpolar extract of Quassia amara (in methylene dichloride) gave the best result (MIC 62.5µµµµµg/ mL), followed by the nonpolar extracts of Syngonanthus macrolepsis, Davilla elliptica and Turnera ulmifolia, with equal MICs of 125µµµµµg/mL. The polar extracts (in ethanol and methanol) obtained from the same plants were considered inactive, since the MIC values determined were above 500µµµµµg/mL and not significantly different from those of extracts from other plants, without known activity. Keywords: M. fortuitum, Cerrado plants, phytotherapy, Microplate Alamar Blue Assay (MABA). REFERÊNCIAS Blanco RM, Inumaru VTG, Martins MC, Giampaglia CMS, Ueki SYM, Chimara E, Yoshida JTU, Telles MAS. Estratégias para a identificação de espécies do complexo Mycobacterium fortuitum. Rev Inst Adolfo Lutz 2002;61(2):91-6. Brown BA, Swenson JM, Wallace JM. Agar disk elution test for rapidly growing mycobacteria. In: Isenberg H D. 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