Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161920996655 10/08/2020 870200099960 15:40 Número do Processo: BR 10 2020 016245 4 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 2 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 63025530000104 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua da Reitoria, 374 - Butantã Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05508220 País: Brasil Telefone: (11) 3091.4474 Fax: Email: pidireto@usp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 1/91 Depositante 2 de 2 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO - UNESP Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): USO DE DITERPENOIDES ENT-CAURÂNOS EM ASSOCIAÇÃO A ANTIBIÓTICOS PARA INIBIÇÃO DE ENZIMAS PEROXIRREDOXINAS DE MICRORGANISMOS PARA O COMBATE DE INFECÇÕES MICROBIANAS Resumo: A presente invenção descreve o uso de diterpenoides ent- caurânicos, como a adenantina (Adn), ou seus derivados em associação a antibióticos que promovem aumento do estresse oxidativo, como os ß-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, por exemplo a canamicina (Kan) e a gentamicina (Gen), e também as polimixinas, como potencializadores da atividade antimicrobiana desses fármacos. Além disso, o efeito sinérgico da utilização em conjunto dessas substâncias apresenta um elevado potencial de aplicação farmacêutica em tratamentos de diferentes infecções causadas por microrganismos, a fim de sensibilizar bactérias que apresentem resistência a esses últimos e, também, pode reduzir as quantidades administradas de antibióticos em pacientes reduzindo os efeitos colaterais. 4Figura a publicar: Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 2/91 Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Maria Aparecida de Souza Procurador: Numero OAB: Numero API: 1833 CPF/CNPJ: 12184617806 Endereço: Av. Torres de Oliveira, 76 - Jaguaré Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05347020 Telefone: 11 30911580 Fax: Email: pidireto@usp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 3/91 Dados do Inventor (72) Inventor 1 de 12 Nome: GISELE MONTEIRO CPF: 27866400830 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua José Lopes da Silva, 235 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05376-110 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 2 de 12 Nome: ADALBERTO PESSOA JÚNIOR CPF: 03144080888 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua Aibi, 16, Apto 114 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05054-010 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 3 de 12 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 4/91 Nome: ANA JÚLIA FERNANDES CARDOSO DE OLIVEIRA CPF: 09449014841 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua República do Iraque, 1745, Casa 2 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 04611-003 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 4 de 12 Nome: BRUNA DEL BUSSO ZAMPIERI CPF: 09475807608 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Doutorando Endereço: Rua Sylvia Monteiro Franco, 19 Cidade: Poços de Caldas Estado: MG CEP: 37718-101 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 5 de 12 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 5/91 Nome: CARLOS ABRUNHOSA TAIRUM JUNIOR CPF: 32048506844 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Avenida Nossa Senhora da Assunção, 647, Apto 54D Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05359-001 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 6 de 12 Nome: CARLOS ALEXANDRE BREYER CPF: 00972409904 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Empresário e produtor de espetáculos Endereço: Rua Aldo Coli, 843, Casa 4 Cidade: Praia Grande Estado: SP CEP: 11704-760 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 7 de 12 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 6/91 Nome: LUIS EDUARDO SOARES NETTO CPF: 09082264897 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua Doutor Manole de Paiva Ramos, 265, Apto 51M Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05351-015 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 8 de 12 Nome: MARCOS ANTONIO DE OLIVEIRA CPF: 11917879822 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Avenida Ariovaldo Reis, 253 Cidade: Guarujá Estado: SP CEP: 11421-190 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 9 de 12 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 7/91 Nome: MARCOS HIKARI TOYAMA CPF: 12069390870 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Rua Frei Gaspar, 253, Apto 1009 Cidade: São Vicente Estado: SP CEP: 11310-060 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 10 de 12 Nome: MELINA CARDOSO DOS SANTOS CPF: 33204185800 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Doutorando Endereço: Rua Serra da Mantiqueira, 129 Cidade: Barueri Estado: SP CEP: 06413-080 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 11 de 12 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 8/91 Nome: ROLANDO IÉ CPF: 23463366886 Nacionalidade: Guineense Qualificação Física: Mestrando Endereço: Rua Rangel Pestana, 273, Apto 11 Cidade: São Vicente Estado: SP CEP: 11230-120 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Inventor 12 de 12 Nome: VANESSA DA COSTA ANDRADE CPF: 39919332844 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Doutorando Endereço: Avenida Padre Antonio Jose dos Santos, 78, Apto 78 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 04563-000 País: BRASIL Telefone: (11) 309 11580 Fax: Email: pidireto@usp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 9/91 NomeTipo Anexo Comprovante de pagamento de GRU 200 GRU depósito Inibição de enzimas.pdf Procuração Procuração USP - Prof Vahan Agopyan.pdf Procuração Procuração Unesp-USP.pdf Relatório Descritivo Relatório descritivo.pdf Reivindicação REIVINDICAÇÕES.pdf Desenho FIGURAS.pdf Resumo RESUMO.pdf Autorizações dos inventores Autorizações dos inventores - Inibição de Enzimas-19.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica. Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 10/08/2020 às 15:40, Petição 870200099960 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 10/91 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 11/91 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 12/91 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 13/91 PROCURAÇÃO Por este instrumento part icular de Procuração, a UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” - UNESP, autarquia estadual de regime especial , criada pela Lei n° 952 de 30.01.1976, com sede na Rua Quirino de Andrade, 215, Centro, CEP 01.049-010, São Paulo/SP, inscrita no CNPJ/MF sob nº 48.031.918/0001-24, doravante designada simplesmente UNESP, neste ato, representada por seu Magnífico Reitor, Prof. Dr. SANDRO ROBERTO VALENTINI, de acordo com o Art . 34, I de seu Estatuto, ou quem legalmente o substitua, nomeia e const itui sua bastante procuradora, a UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, denominada USP, autarquia estadual de regime especial , regida por seu Estatuto, aprovado pela Resolução n.º 3.461, de 07 de outubro de 1988 e pelo Regimento Geral , aprovado pela Resolução n.º 3.745, de 19 de outubro de 1990, com sede na Rua da Reitor ia, 374, São Paulo – SP, inscrita no CNPJ/MF sob n.º 63.025.530/0001 -04, neste ato representada por seu Magnífico Reitor, Prof. Dr. VAHAN AGOPYAN, inscrito no CPF sob o n.º 839.536.208-000, outorgando-lhes poderes para representá-los perante o Inst ituto Nacional da Propriedade Industrial – INPI, para o fim de requerer e processar direitos de propriedade intelectual , tais como patentes de invenção, de modelos de ut i l idade, desenhos industriais, registros de marcas de produto, de serviço; colet ivas ou de cert i f icação, de indicações geográficas, direitos do autor, de software e mantê -los em vigor com amplos e i l imitados poderes para assinar petições e documentos, pagar taxas, anotar transferências, fazer prova de uso das invenções patenteadas ou das marcas registradas, apresentar oposições, recursos, répl icas, desist ir , renunciar, anotar, averbar contratos de l i cença e transferências de tecnologia, elaborar noti f icações extrajudiciais, e prat icar para os fins mencionados todos os atos necessários perante as autoridades administrat ivas competentes no Brasi l , em benefício da Outorgante, rat i f i cando os atos já prat icados, especialmente para o pedido de privi légio de invenção: “USO DE DITERPENOIDES ENT- CAURÂNOS EM ASSOCIAÇÃO A ANTIBIÓTICOS PARA INIBIÇÃO DE ENZIMAS PEROXIRREDOXINAS DE MICRORGANISMOS PARA O COMBATE DE INFECÇÕES MICROBIANAS”. São Paulo , 15 de julho de 2020. _______________________ UNESP Prof. Dr. SANDRO ROBERTO VALENTINI Reitor Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 14/91 1/55 USO DE DITERPENOIDES ENT-CAURÂNOS EM ASSOCIAÇÃO A ANTIBIÓTICOS PARA INIBIÇÃO DE ENZIMAS PEROXIRREDOXINAS DE MICRORGANISMOS PARA O COMBATE DE INFECÇÕES MICROBIANAS CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se insere no campo da Microbiologia, mais precisamente na área da Bacteriologia, e descreve o uso de diterpenoides ent-caurânicos, como a adenantina (Adn), ou seus derivados em associação a antibióticos que promovem aumento do estresse oxidativo, como os β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, por exemplo a canamicina (Kan) e a gentamicina (Gen), e também as polimixinas, como potencializadores da atividade antimicrobiana desses fármacos. Além disso, o efeito sinérgico da utilização em conjunto dessas substâncias apresenta um elevado potencial de aplicação farmacêutica em tratamentos de diferentes infecções causadas por microrganismos, a fim de sensibilizar bactérias que apresentem resistência a esses últimos e também pode reduzir as quantidades administradas de antibióticos em pacientes reduzindo os efeitos colaterais. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] Antibióticos revolucionaram as medicinas humana e veterinária e são considerados um dos maiores, senão o maior, avanço médico no século XX. A era dos antibióticos normalmente remete a nomes como Paul Ehrlich, Sahachiro Hata e Alexander Fleming (Strebhardt e Ullrich, 2008). Na busca de compostos químicos que fossem eficientes no tratamento da sífilis, uma doença sexualmente transmissível cujo agente etiológico é representado pela bactéria Treponema pallidium, o químico Paul Ehrlich sintetizou centenas de moléculas orgânicas derivadas do arsênio, as quais foram testadas pelo bacteriologista Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 15/91 2/55 Sahachiro Hata e levou à descoberta da molécula 606 (Aminov, 2010; Strebhardt e Ullrich, 2008). Esta molécula se mostrou eficaz no tratamento de infecções causadas por T. pallidium e foi lançada no mercado pela Hoechst sob o nome Salvarsan. Entretanto, a molécula era extremamente suscetível à oxidação pelo O2 atmosférico, exibia baixa solubilidade e diversos efeitos colaterais, incluindo erupções cutâneas, danos ao fígado, náuseas e vômitos. Posteriormente, ela foi substituída pela Neosalvarsan o qual não era suscetível à oxidação e apresentava maior solubilidade e menor toxicidade, entretanto, efeitos colaterais como náuseas e vômitos continuavam comuns (Aminov, 2010). [003] Finalmente nos anos 1940, como consequência da segunda guerra mundial, ocorreu a colaboração entre governos de países distintos e diferentes laboratórios como Merck, Pfizer e Squibb, o que viabilizou a produção e distribuição de um novo medicamento que apresentava maior eficiência/estabilidade e reduzidos efeitos colaterais que substituiu o Neosalvarsan, a Penicilina. A penicilina é uma substância com ação bactericida produzida pelo fungo Penicillium notatum identificada e caracterizada por Alexander Fleming (Alexander Fleming, 1929). Esta molécula é denominada de β lactâmico em razão de possuir um anel característico que recebe este nome pela sua estrutura (Aminov, 2010; Strebhardt e Ullrich, 2008). [004] Baseados nos trabalhos pioneiros de Paul Ehrlich, Sahachiro Hata e Alexander Fleming, pesquisadores ligados a indústrias farmacêuticas e instituições de ensino e pesquisa caracterizaram as mais diferentes classes de antibióticos com distintas ações biológicas. O período Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 16/91 3/55 compreendido entre os anos 1950 e 1970 foi o auge das descobertas de novas classes de antibióticos (Aminov, 2010; Strebhardt e Ullrich, 2008) (Tabela 1). Entretanto, após este período o número de novos antibióticos se tornou muito escasso e a principal abordagem para o desenvolvimento de novos medicamentos para combater a resistência emergente e re- emergente de patógenos a antibióticos tem sido, em sua grande maioria, baseada na modificação dos antibióticos existentes, inclusive por razões econômicas (Chopra, Hesse e O’Neill, 2002). Tabela 1: Principais classes de antibióticos, exemplos, processos biológicos atingidos e ação descoberta. Classe de antibiótico Exemplos Alvo Biológico Modo de ação / Descoberta β lactâmicos Penicilinas (ampicilina), cefalosporina (cefamicina), penema (meropenema), monolactâmicos (aztreonam) Biossíntese de peptoglicanos (proteínas de ligação a penicilina - PBPs) Bacteriostático ou bactericida (dependente da concentração) / 1928 Aminoglicosídeos Gentamicina, estreptomicina, espectinomicina Tradução Bacteriostático/1943 Glicopeptídeos Vancomicina, teicoplanina Biossíntese de peptoglicanos Bactericida/1950 Tetraciclinas Minociclina, Tigeciclina Tradução Bacteriostático/1953 Macrolídeos Eritromicina, Tradução Bacteriostático ou Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 17/91 4/55 azitromicina bactericida (dependente da bactéria) / 1950 Lincosamidas Clindamicina Tradução Bacteriostático ou bactericida (dependente da concentração) / 1963 Estreptograminas Synercid Tradução Bacteriostático/1953 Oxazolidinonas Linezolida Tradução Bacteriostático/1952 Fenicóis cloramfenicol Tradução Bacteriostático/1947 Quinolonas Ciprofloxacino Replicação do DNA (Topoisomerase) Bactericida/1962 Pirimidinas Trimetoprima Metabolismo C1 Bacteriostático/1962 Sulfonamidas Sulfametoxazol Metabolismo C1 Bacteriostático/1932 Rifamicinas Rifamicinas Transcrição Bactericida/1957 Lipopeptídeos Daptomicina Membrana celular Bactericida/1986 Peptídeos catiônicos Colistina Membrana celular Bactericida/1949 Modificado de Davies e Davies (2010). [005] De fato, o desenvolvimento de novos antibióticos pela indústria farmacêutica, experimentou e tem experimentado um vertiginoso decréscimo devido a obstáculos econômicos e regulatórios bem como fusões empresariais que reduziram substancialmente o número de pesquisas. Das 18 maiores empresas farmacêuticas, 15 abandonaram a produção de antibióticos (Bartlett, Gilbert e Spellberg, 2013; Piddock, 2012). [006] Para a indústria farmacêutica os antibióticos não são mais considerados um investimento economicamente vantajoso, uma vez que, sua utilização ocorre somente por um curto período de tempo, e portanto, não são tão lucrativos como aqueles utilizados para o tratamento de doenças crônicas como Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 18/91 5/55 diabetes, transtornos psiquiátricos, asma, doenças cardíacas dentre outros (Bartlett, Gilbert e Spellberg, 2013; Gould e Bal, 2013; Piddock, 2012). Uma análise custo-benefício do Escritório de Economia da Saúde (Office of health economics - OHE) da Inglaterra calculou que o valor líquido de um novo antibiótico é de apenas 50 milhões de dólares, o que é bastante inferior a medicamentos utilizados para tratamentos de cardiopatias e doenças neuromusculares que podem alcançar 1 bilhão de dólares (Bartlett, Gilbert e Spellberg, 2013). [007] Ainda no que concerne ao fator econômico, o valor dos antibióticos é considerado baixo pela indústria farmacêutica. O tratamento de doenças infeciosas com antibióticos mais modernos apresenta um custo variando de 1.000-3.000 dólares, enquanto quimioterápicos utilizados no tratamento de neoplasias alcançam dezenas de milhares de dólares (Bartlett, Gilbert e Spellberg, 2013; Gould e Bal, 2013; Piddock, 2012). Agravando este cenário, as pesquisas conduzidas por grupos de instituições acadêmicas também foram substancialmente reduzidas em razão da crise econômica mundial iniciada em 2007, e, que ainda traz grandes reflexos para a sociedade como um todo (Piddock, 2012). A grande necessidade de novos antibióticos reside no aparecimento crescente de bactérias resistentes a diversos antibióticos utilizados atualmente, tópico que será abordado a seguir. Bactérias resistentes a múltiplos antibióticos [008] As taxas de mortalidade relacionadas às infecções bacterianas resistentes a múltiplas drogas (Multi Drug Resistance - MDR) têm se tornado cada vez mais elevadas, o que constitui um grave problema de saúde em todo o mundo. Na União Europeia (UE) a cada ano, cerca de 25.000 pacientes Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 19/91 6/55 morrem em decorrência de infecções ocasionadas por bactérias MDR (ECDC / EMEA Joint Working Group, 2009). Nos Estados Unidos da América (EUA) cerca de 63.000 pacientes morrem anualmente como consequência de infecções hospitalares ocasionadas por bactérias MDR (Ventola, 2015). Os custos econômicos estimados na UE revelam que os gastos para o sistema de saúde, em conjunto com a perda de produtividade dos pacientes, geram um prejuízo aproximado de 1.5 bilhões de euros por ano (ECDC / EMEA Joint Working Group, 2009). Em período similar (2006), o custo anual do tratamento de infecções hospitalares nos EUA de apenas seis espécies de bactérias MDR foi estimado em aproximadamente 1.9 bilhão de dólares (Ventola, 2015). [009] Pelos dados acima é possível perceber que a situação é altamente preocupante e, em 2013 o CDC (Centers for Disease Control and Prevention) dos EUA declarou que estamos na "era pós-antibiótica". Esta declaração está alinhada com a Organização Mundial da Saúde (OMS) que, em 2014, alertou que a crise de resistência aos antibióticos está se tornando alarmante uma vez que o percentual de bactérias MDR aumenta ano a ano (Michael, Dominey-Howes e Labbate, 2014; Reardon, 2015). [010] Entre os patógenos Gram positivos, a maior ameaça para uma pandemia global é representada por bactérias como Staphylococcus aureus e o gênero Enterococcus (CDC, 2013; Rossolini, 2014). De fato, ainda na década de 1960 já foram descritos isolados de Staphylococcus resistentes a metaciclina, denominados de MRSA (para Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Nessa época, para o tratamento das infecções causadas por este agente etiológico, foi utilizada a vancomicina. Entretanto, duas décadas mais tarde, foram Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 20/91 7/55 identificadas linhagens resistentes à vancomicina e, atualmente, as MRSA representam uma grande ameaça a saúde pública mundial (Ventola, 2015). De fato, somente nos EUA, as MRSAs são responsáveis todos os anos por mais mortes do que a AIDS, doença de Parkinson, enfisema e homicídio juntos (CDC, 2013). Adicionalmente, apesar da resistência aos antibióticos anti-MRSA geralmente ocorrer através de mutações, existem estudos que demonstram a transferência de genes de resistência aos antibióticos linezolida (oxazolidinonas) e glicopeptídeos, aspecto de grande gravidade (Rossolini et al., 2014). [011] Patógenos Gram-negativos também trazem preocupação porque estão se tornando resistentes a quase todos os antibióticos disponíveis (Golkar, Bagasra e Pace, 2014; Rossolini et al., 2014). O surgimento de bacilos Gram-negativos MDR tem tido grande impacto na medicina, e as infecções mais graves ocorrem em ambientes hospitalares sendo as mais comuns causadas por Enterobacteriaceae (principalmente Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter (CDC, 2013; Rossolini et al., 2014). Bactérias patogênicas Gram- negativas MDR como Escherichia coli e Neisseria gonorrhoeae também estão se tornando cada vez mais prevalentes em ambientes hospitalares, e já foi demonstrado que diversas linhagens produzem β-lactamases capazes de inibir a ação de diversos antibióticos β-lactâmicos (Ventola, 2015). [012] É importante deixar claro que bactérias MDR ameaçam o atendimento hospitalar tanto em países de alta renda per capita quanto naqueles que possuem baixa renda, afetando tanto os procedimentos terapêuticos de alta complexidade como aqueles de rotina para doenças infecciosas comuns. Uma vez que a resistência tenha se manifestado, as bactérias resistentes Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 21/91 8/55 podem espalhar-se nos hospitais, nas comunidades e meio ambiente. A escassez de novos antibióticos possibilita que infecções intratáveis se tornem cada vez mais comuns, o que é particularmente preocupante, pois após o aparecimento, a resistência antimicrobiana é irreversível ou caracteriza-se por uma reversão muito lenta apesar da introdução de programas de contenção e vigilância. De fato, em razão da falta de novos medicamentos e do aparecimento de linhagens multirresistentes, antibióticos que haviam sido proibidos por conta de graves efeitos colaterais, incluindo danos renais e nervosos, voltaram a ser utilizados, como a colistina, que foi banida entre os anos 1990 até meados de 2010. Causas da Resistência e Disseminação [013] Trabalhos recentes demonstram que um grande número de bactérias ambientais filogeneticamente distintas é capaz de utilizar antibióticos, como β lactâmicos, tetraciclinas, vancomina, dentre outros, como única fonte de carbono, o que revela um amplo reservatório de genes que codificam proteínas de resistência a antibióticos (Dantas et al., 2009). Adicionalmente, existe um número crescente de evidências da transferência de genes que codificam proteínas de resistência a antibióticos para bactérias patogênicas humanas (D’Costa et al., 2011; Dantas et al., 2008; Forsberg et al., 2012; Hu et al., 2016). [014] O descarte constante no meio ambiente de antibióticos, através de esgotos não tratados e que são lançados em corpos de água como rios e oceanos, representa um risco para o aparecimento de bactérias resistentes (Segura et al., 2009). Atenção especial é dada às estações de tratamento de esgoto, onde ocorre grande concentração de bactérias Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 22/91 9/55 ambientais e oriundas do microbioma de humanos e animais em uma diminuta área, o que torna as condições particularmente adequadas para troca/alteração de material genético contendo genes de resistência e posterior propagação de bactérias (Alós, 2015; Czekalski et al., 2012; Rizzo et al., 2013). [015] No que diz respeito a mutações nos genes que codificam proteínas alvo dos antibióticos, trabalhos recentes sugerem que baixas doses de antibióticos levam ao aparecimento de linhagens resistentes em razão de mutações, ponto que será discutido em maior detalhe na próxima seção. De fato, foi demonstrado o aparecimento de bactérias resistentes em concentrações de antibióticos bem abaixo da concentração mínima inibitória para crescimento, o que demonstra que o aparecimento das linhagens resistentes pode ocorrer no regime ambulatorial, onde as concentrações de antibióticos não são muito elevadas ou quando a prescrição médica não é seguida integralmente por pacientes externos aos hospitais (Gullberg et al., 2011). Por estas razões, diversos países possuem a venda de antibióticos extremamente controlada. No Brasil, a restrição de venda está em vigor desde 2010 e engloba 119 antibióticos (http://www.anvisa.gov.br/sngpc/Documentos2012/RDC%2020%20201 1.pdf). [016] Outro fator bastante relevante para o aparecimento de linhagens resistentes reside na utilização de baixas concentrações de antibióticos na ração animal, prática associada com o maior ganho de peso, de modo que os antibióticos são utilizados como promotores de crescimento (em massa) para animais, contribuindo para o aparecimento de bactérias resistentes (Giguère, Prescott e Dowling, 2007). Em razão deste grande problema para a saúde pública, diversos países têm Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 23/91 10/55 banido a utilização de antibióticos na ração animal, como é o caso dos países constituintes da União Europeia (UE), que proibiram sua utilização em 2006. Essa proibição levou à interrupção da utilização de antibióticos para fins de ganho de peso em bovinos no Brasil, em razão do grande volume de importações para países da UE (Millen et al., 2011). [017] Por outro lado, nos EUA 13 toneladas de antibióticos foram utilizadas em animais em 2010, principalmente como promotores de crescimento (Bartlett, Gilbert e Spellberg, 2013). Apesar de restrições introduzidas em 01/2017 pelo FDA (Food and drug admnistration), diversas moléculas que possuem propriedades antibióticas (Amprolium, Bacitracina, Bambermicina, Carbadox, Decoquinato, Fenbendazole, Lasaloacid, Monensina, Melengestrol, Ractopamina e Tiamulina) ainda são permitidas para utilização no agronegócio (https://www.federalregister.gov/documents/2016/12/27/2016- 31083/newanimal-drugs-for-use-in-animal-feed-approval-of-new- animal-drug-applications-withdrawal-of). É importante salientar que regulamentações não estão presentes na maioria dos países; por exemplo, a China produz aproximadamente 40 toneladas de antibióticos, dos quais 50% são utilizados na produção animal (Wang et al., 2016). [018] Outro caso emergente é representado pela aquicultura, a qual experimentou um significativo crescimento nos últimos anos. Nela, os antibióticos crescentemente utilizados como profiláticos contaminam corpos de água, o que por si só possui grande potencial para o aparecimento de linhagens resistentes a antibióticos em razão da transferência gênica, seleção e/ou mutação (Cabello, 2006; Done, Venkatesan Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 24/91 https://www.federalregister.gov/documents/2016/12/27/2016-31083/newanimal-drugs-for-use-in-animal-feed-approval-of-new-animal-drug-applications-withdrawal-of https://www.federalregister.gov/documents/2016/12/27/2016-31083/newanimal-drugs-for-use-in-animal-feed-approval-of-new-animal-drug-applications-withdrawal-of https://www.federalregister.gov/documents/2016/12/27/2016-31083/newanimal-drugs-for-use-in-animal-feed-approval-of-new-animal-drug-applications-withdrawal-of 11/55 e Halden, 2015). Entretanto, não existe uma regulamentação clara em nenhum país que vise diminuir a utilização de antibióticos nessa área (Cabello, 2006; Done, Venkatesan e Halden, 2015). [019] No que concerne à disseminação de linhagens resistentes a antibióticos, a globalização sem dúvida contribui de forma extremamente significativa. O maior intercâmbio entre os países por meio do comércio de animais, alimentos, bens de consumo, viagens de turismo e negócios, movimentos migratórios de fundo religioso, científico ou político (estágios no exterior, refugiados, missionários, intervenções militares), dentre outros, favorece fortemente a dispersão de bactérias super-resistentes, o que evidencia que este é um problema de dimensões globais (Alós, 2015; Kennedy e Collignon, 2010). [020] Como pode ser observado acima, o problema com os antibióticos é mundial, bastante complexo e sua resistência engloba aspectos, genéticos, evolutivos e ambientais. De fato, outros fatores envolvendo saneamento básico, idade, nutrição, estado imunológico também influenciam na dispersão de linhagens MDR (Martínez e Baquero, 2014). Apesar de ocorrer de forma acentuada em diversos países, a ausência de um controle mais rígido para a utilização de antibióticos - seja para a saúde humana ou animal e a falta de colaboração integrada global faz com que o perigo do surgimento de bactérias MDR prospere, uma vez que em diversos países das Américas central e do sul, parte da Europa, do continente Africano e do continente Asiático, o controle dos antibióticos é bastante precário. Neste contexto, além de uma política de controle global de antibióticos é bastante importante que sejam efetuados esforços na busca de novos alvos biológicos e novas classes de antibióticos com o Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 25/91 12/55 objetivo de evitar epidemias ou mesmo pandemias. A letalidade de antibióticos é acompanhada pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) [021] Estudos recentes e independentes indicam que diferentes classes de antibióticos, independentemente das suas interações fármaco-alvo, geram níveis variáveis de EROs que contribuem decisivamente para a morte celular dos patógenos. Os trabalhos investigaram o efeito de classes de antibióticos distintas e muito utilizadas como β-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas em diversas espécies bacterianas (Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Burkholderia cepecia, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, dentre outros) (Bizzini et al., 2009; Breidenstein et al., 2008; Calhoun e Kwon, 2011; Davies et al., 2009; Foti et al., 2012; Girgis, Hottes e Tavazoie, 2009; Grant et al., 2012; Gusarov et al., 2009; Kang et al., 2012; Kohanski et al., 2008; Ling et al., 2012; Liu et al., 2010, 2012; Nguyen et al., 2011; Shatalin et al., 2011; Wang et al., 2010; Yeom, Imlay e Park, 2010). Apesar de existir ainda grande debate sobre a relação de antibióticos, geração de EROs e letalidade em patógenos, trabalhos recentes utilizando as mais distintas abordagens confirmam os dados obtidos pelos diferentes grupos de pesquisa (Acker, Van et al., 2016; Dwyer, Belenky, Yang, MacDonald, et al., 2014). Também foi demonstrado que o aumento intracelular dos níveis de EROs é capaz de promover eficientemente a morte de patógenos (Brynildsen et al., 2013; Jee et al., 2016). [022] Neste contexto, foi demonstrado que as três Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 26/91 13/55 principais classes de drogas bactericidas (β-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas) utilizam um mecanismo comum que estimula a produção de doses letais de radicais hidroxila (HO•) por meio de reações químicas de Fenton. De fato, a administração de quelantes de ferro (Fe) atenua a morte bacteriana por fármacos, sugerindo que os radicais hidroxila contribuem para a morte celular bacteriana por antibióticos. Dessa forma, é importante salientar que a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por meio da dismutação efetuada pela enzima superóxido dismutase (Sod) também pode favorecer a formação HO•. Além disso, o H2O2 juntamente com o radical ânion superóxido (O2•) também é capaz de produzir HO• por meio da reação de Harber-Weiss (Figura 1). Ponto de importância reside no fato que, apesar dos diferentes fármacos bactericidas (β- lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas) terem diferentes alvos biológicos (proteínas de ligação à penicilina, ribossomo e topoisomerase, respectivamente), todos eles convergem em uma via comum. [023] Essa via é baseada na produção de oxidantes através de resposta metabólica envolvendo o ciclo do ácido tricarboxílico (Tricarboxylic Acid Cycle – TCA) que induz a rápida depleção de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NADH), resultando em uma hiperativação da cadeia de transporte de elétrons que aumenta a produção de produtos secundários como o O2•- e o H2O2 (Kohanski, DePristo e Collins, 2010). O O2•- pode atacar grupamentos ferro-enxofre (Fe-S) presentes em diversas proteínas que executam funções variadas, desde transporte de elétrons à catálise enzimática e regulação gênica. Neste contexto, em especial o O2•- pode levar à disponibilização de Fe ferroso dos grupos Fe-S que participa da reação de Fenton, Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 27/91 14/55 resultando em formação de HO• que auxilia na morte celular (Figura 2) (Kohanski, DePristo e Collins, 2010). [024] O H2O2 também é capaz de danificar grupos Fe-S (Imlay, 2008; Jang e Imlay, 2010), o que deve maximizar este processo e levar a mais danos celulares. A importância do H2O2 e do Fe2+ (férrico) é ressaltada pela existência de proteínas denominadas de Dps (DNA-binding protein from starved cells) que pertencem à família das ferritinas. Este grupo de proteínas é capaz de se ligar ao DNA bacteriano e sequestrar o Fe2+, o que evita sua reação com H2O2 (reação de Fenton 1) e protege fisicamente o DNA (Haikarainen e Papageorgiou, 2010; Wolf et al., 1999). De fato, bactérias Δdps (bactérias com o gene dps deletado) são altamente suscetíveis à morte por H2O2 e possuem sua virulência atenuada em macrófagos e camundongos (Halsey et al., 2004; Velayudhan et al., 2007). [025] Outro ponto de grande importância dos trabalhos acima mencionados é demonstrar que, apesar de possuírem alvos biológicos distintos, os antibióticos atuam gerando EROs que possuem capacidade de danificar o DNA. Portanto, é importante perceber a relação observada previamente entre baixas doses de antibióticos e o aparecimento de bactérias resistentes (Giguère, Prescott e Dowling, 2007). Concluindo, altas concentrações ou concentrações apropriadas de antibióticos levam a sérios danos em biomoléculas em especial no DNA impossibilitando a sobrevivência do patógeno. No lado oposto, baixas concentrações de antibióticos podem produzir mutações no DNA acelerando as taxas de evolução, o que deve contribuir para o aparecimento de linhagens resistentes. Defesas oxidativas do organismo na infecção por patógenos [026] Quando um patógeno invade um hospedeiro ocorre Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 28/91 15/55 um dos mecanismos de defesa mais estudados, denominado de explosão respiratória (respiratory burst), o qual se caracteriza pela geração de grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERN). A geração das EROs é devido à ativação de uma oxidase multicomponente (NADPH oxidase, também denominada de fagócito oxidase), que oxida o NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) e, no processo, reduz o oxigênio a O2•- (Halliwell e Gutteridge, 2015). Em neutrófilos, essa rápida reação oxidativa é disparada pelos sinais de ativação e acompanha a fagocitose (Babior, 2004). Quando o radical O2•- sofre dismutação, produz H2O2, uma molécula altamente difusível no organismo capaz de desencadear mecanismos potencialmente tóxicos para as células (Gordon, 2016; Halliwell e Gutteridge, 2015; Underhill e Ozinsky, 2002). O H2O2, por si só, não é capaz de destruir eficientemente o patógeno. Entretanto, grânulos azurófilos dos neutrófilos contêm a enzima mieloperoxidase (MPO), que catalisa a reação entre o H2O2 e íons haletos (Cl-), produzindo ácido hipocloroso (HOCl), um potente agente microbicida (Klebanoff, 2005; Winterbourn e Kettle, 2013). Adicionalmente, conforme já mencionado, o H2O2 também é convertido HO•, por meio de reações químicas como as de Fenton e de Haber-Weiss, outro agente destrutivo muito potente podendo atingir e destruir membranas celulares, proteínas e causar mutações em ácidos nucleicos (Halliwell e Gutteridge, 2015). [027] Outra forma de eliminar os organismos invasores é através da produção do radical óxido nítrico (NO•). O NO• é gerado quando ocorre a oxidação da arginina na presença da molécula de oxigênio, sendo esta reação catalisada pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS) (Fritzsche, Schleicher e Bogdan, Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 29/91 16/55 2010; Prolo, Alvarez e Radi, 2013). Elevadas concentrações de NO• podem originar uma série de compostos reativos, as ERNs. Por exemplo, a reação NO• com o radical ânion superóxido promove a liberação de peroxinitrito (ONOO•), um potente agente oxidante cujos derivados são capazes de causar danos ao DNA e oxidação lipídica (Calcerrada, Peluffo e Radi, 2011; Niles, Wishnok e Tannenbaum, 2006). [028] Diante da exposição às diversas fontes de espécies reativas, os hospedeiros possuem mecanismos de defesa para evitar danos maiores provocados por estas substâncias produzidas endogenamente durante a interação hospedeiro- patógeno. Os patógenos, da mesma maneira, para se defenderem dos efeitos tóxicos destas espécies reativas, dispõem de enzimas antioxidantes capazes de ajudá-los a superar a barreira oxidante imposta pelo hospedeiro, possibilitando assim a infecção. Proteínas antioxidantes na defesa de patógenos [029] Para se defenderem das diferentes fontes de estresse oxidativo, os patógenos possuem diversas enzimas capazes de metabolizar as EROs e ERNs em produtos menos tóxicos ou atóxicos. Entre as mais importantes enzimas estão as superóxido dismutases (Sod) e as peroxidases como as catalases (Cat) e as peroxirredoxinas (Prx). As Sod são enzimas capazes aumentar a velocidade de dismutação do O2•- a H2O2 de ~105 M-1s-1 (pH7) para ~109 M-1s-1 (Halliwell e Gutteridge, 2015). Por sua vez, a Cat converte o H2O2 em H2O em taxas de ~106 M-1s-1 e as Prx são capazes de fazer esta conversão em taxas que alcançam até ~107 M-1s-1. A importância destas enzimas pode ser medida pelo grande número de isoformas em bactérias patogênicas. Como exemplo, em Salmonella entérica são encontradas quatro Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 30/91 17/55 isoformas de Sod (SodA, SodB, SodC1 e SodC2), três de Cat (KatE, KatG e KatN) e três de Prx (AhpC, TsaA e Tpx) (Ammendola et al., 2008; Brooks et al., 2011; Fang et al., 1999). Redundância similar é encontrada em outras bactérias o que revela a importância das enzimas antioxidantes (Bansal et al., 2012; Mishra e Imlay, 2012). [030] Ponto importante reside no fato que a Sod pode impedir a formação de peroxinitrito e, consequentemente de seus derivados, pela decomposição do O2•- impedindo que ele reaja com o NO•. Adicionalmente, tanto a Sod quantos as peroxidases (Cat e Prx) são fundamentais para impedir a formação do HO• que pode ocorrer diretamente pela reação de Harber Weiss entre H2O2 e o O2•- ou mediado pelo Fe nas reações de Fenton (Figura 1). A redundância de enzimas antioxidantes é somente aparente, pois várias diferem quanto ao substrato, cofatores, regulação gênica, estabilidade dentre outros aspectos. Adicionalmente, mutantes sem enzimas antioxidantes individuais apresentam susceptibilidade aumentada de EROs (Mishra e Imlay, 2012). [031] Diversos trabalhos revelam que o bloqueio de enzimas antioxidantes por agentes químicos é capaz de acentuar a morte celular dos patógenos quando submetidos a estresse oxidativo ou tratamento com antibióticos e, dessa forma, uma alternativa lógica seria a utilização destes inibidores de enzimas antioxidantes em terapias antimicrobianas (Birben et al., 2012). No entanto, os hospedeiros, e aí se incluem os humanos, possuem enzimas extremamente semelhantes as dos patógenos, principalmente quando se trata da Sod e Cat e os inibidores acabam por ser tóxicos também às células dos hospedeiros (Benov e Fridovich, 1994; Heikkila e Cohen, 1977; Lu et al., 1998; Misra e Fridovich, 1978; Roberts e Hirst, Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 31/91 18/55 1996; Sugadev, Ponnuswamy e Sekar, 2011). Neste contexto um importante alvo seria as Prx, uma vez que diversas destas enzimas possuem características distintas entre procariotos e eucariotos. Peroxirredoxinas e sua importância em bactérias patogênicas [032] As Prx foram a última grande família de peroxidases a ser descoberta. Diferentemente da Sod e Cat, estas enzimas não possuem grupos prostéticos e utilizam uma cisteína (cisteína peroxidásica, CP) altamente reativa para decompor hidroperóxidos (Kim et al., 1988; Netto et al., 1996). Adicionalmente, quando se analisa as estruturas quaternárias destas enzimas, observa-se que a CP se encontra em grande proximidade com uma Thr (ou Ser, em alguns casos) e com uma arginina (Arg), a qual é totalmente conservada em todas as Prx já descritas até o momento. Estes três resíduos de aminoácidos (CP, Thr/Ser e Arg) formam a tríade catalítica, e a desprotonação e a manutenção de CP na forma de tiolato são altamente dependentes da integridade de Thr/Ser e Arg (Tairum et al., 2016). [033] Apesar de todas as Prx possuírem a CP, elas constituem uma família de enzimas bastante heterogênea e diversas classificações já foram propostas, sendo que a mais utilizada subdivide essas proteínas em três grandes grupos (Prx 1-Cys, Prx 2-Cys típicas e Prx 2-Cys atípicas) de acordo com a quantidade de resíduos de cisteína envolvidos no processo de redução do hidroperóxido (Wood et al., 2003). As Prx 1-Cys são proteínas homodiméricas que apresentam apenas um resíduo de cisteína (CP) envolvido no ciclo catalítico localizado na região N-terminal. Já as Prx 2-Cys utilizam dois resíduos de Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 32/91 19/55 cisteína no ciclo catalítico, um na região N-terminal (CP) e outro na C-terminal, este último denominado de cisteína de resolução (CR). Durante o ciclo catalítico forma-se um dissulfeto CP - CR, sendo que as Prx 2-Cys típicas apresentam- se em homodímeros e formam uma ligação dissulfeto intermolecular, e as Prx 2-Cys atípicas apresentam-se como monômeros ou homodímeros e formam uma ponte dissulfeto intramolecular (Wood, Poole e Karplus, 2003). Após sua oxidação, as Prx são geralmente reduzidas pelo sistema Trx, composto pelas enzimas tiorredoxina (Trx) e tiorredoxina redutase (TrxR), que utiliza elétrons provenientes do NADPH via uma molécula de FAD (flavina adenina dinucleotídeo). A redução pelo sistema Trx restaura a atividade peroxidásica das Prx, tornando-as aptas à decomposição de uma nova molécula de hidroperóxido. Neste contexto, a partir deste ponto iremos nos referir somente as Prx 2-Cys típicas que são alvo desta solicitação. [034] Enquanto a Cat é capaz de decompor somente H2O2 com constante de 106 M-1s-1, as Prx 2-Cys apresentam constantes de 107-8 M-1s-1. Em contraste com Cat que responde somente pela decomposição de H2O2, as Prx são capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos, dentre eles hidroperóxidos de lipídeos (Lp-OOH) e peroxinitrito (NOO-), com constantes de segunda ordem de 107-8 M-1s-1 (Ogusucu et al., 2007; Perkins et al., 2015; Tairum et al., 2016). Também foi demonstrado que as Prx 2-Cys típicas são capazes de decompor até mesmo peróxidos de proteínas e aminoácidos com eficiência moderada (104 M-1 s- 1), o que revela sua grande versatilidade na decomposição de hidroperóxidos (Peskin et al., 2010). [035] Adicionalmente, estas proteínas estão entre as Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 33/91 20/55 mais abundantes em bactérias. Como exemplo, em Escherichia coli as Prx estão entre as dez proteínas mais expressas (Link, Robison e Church, 1997). Em bactérias, as 2-Cys Prx típicas, são normalmente denominadas de AhpC (Alquil hidroperóxido redutase C). Assim como as Prx de eucariotos, as enzimas bacterianas são capazes de decompor com taxas extremamente elevadas tanto H2O2 quanto peróxidos de lipídeos. Já foi demonstrado que linhagens de Helicobacter pylori e Helicobacter hepaticus, agentes causadores de úlceras/gastrites estomacais e de hepatite crônica em mamíferos, respectivamente, apresentam níveis elevados de peróxidos de lipídeos quando o gene ahpc é deletado (Mehta et al., 2007). Resultados similares foram descritos para Campylobacter jejuni, o agente etiológico de gastroenterites (Oh e Jeon, 2014). [036] Em Salmonella typhimurium, patógeno responsável por moléstias gastrointestinais, febre tifoide e septicemia, foi demonstrado que linhagens deficientes de Prx apresentam alteração da morfologia celular e proliferação reduzida no interior da célula. O estudo também revelou que quando uma AhpC é superexpressa em células de S. typhimurium nocautedas para genes envolvidos na decomposição de peróxidos (ΔKatE, ΔKatG, ΔKatN, ΔAhpC e ΔTSA A), o patógeno recupera as características da linhagem selvagem (Hébrard et al., 2009). Estes dados indicam que as Prx de Salmonella contribuem para a virulência do patógeno ao capacitá-lo a sobreviver em ambientes hostis. [037] Em Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, a expressão de AhpC em isolados clínicos com a deleção de uma das isoformas de Cat (ΔkatG) é aumentada tanto no meio intracelular quanto no extracelular, o que aparentemente é de importância para a manutenção da Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 34/91 21/55 virulência de M. tuberculosis (Nieto R et al., 2016). No caso de S. aureus, o agente etiológico de diversas infecções hospitalares, AhpC juntamente com a catalase possuem papéis compensatórios e são fundamentais para a sobrevivência e colonização do trato respiratório (Cosgrove et al., 2007). Estudos envolvendo metatranscriptoma de S. aureus e S. epidermidis revelaram que ahpc é altamente expresso no trato respiratório, sendo ao menos três vezes maior no ambiente in vivo quando comparado com os microrganismos crescidos em meio de cultura (in vitro) (~1320 reads per million  ~540 rpm) (Chaves-Moreno et al., 2016). [038] Insultos oxidativos revelam que antioxidantes bacterianos desempenham um papel na proteção de microorganismos (Melillo, Bakshi e Melendez, 2010), não somente atuando na decomposição das EROs como também são capazes de subverter vias de sinalização como os envolvidos na resposta imunológica (Baxt, Garza-Mayers e Goldberg, 2013). Neste contexto, é fundamental explorar novos paradigmas para desenvolver novos fármacos antibacterianos, e aí se incluem as 2-Cys Prx de bactérias patogênicas (Baxt, Garza-Mayers e Goldberg, 2013; Melillo, Bakshi e Melendez, 2010). Inibição de Prx2-Cys típicas por Adenantina (Adn) e efeito em células tumorais [039] Os compostos extraídos de plantas despertam um interesse especial da indústria farmacêutica em função de sua potencialidade para o desenvolvimento de novas drogas. Entre esses compostos naturais encontram-se os diterpenoides, uma ampla classe de metabólitos secundários com significativa atividade biológica que vem sendo investigada quanto à sua eficácia no tratamento de diversas doenças como câncer, doenças Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 35/91 22/55 cardiovasculares e inflamatórias (Tirapelli et al., 2008). Recentemente, foi demonstrado que a adenantina (Adn), um diterpenoide da classe dos ent-caurânicos, extraído de Isodon adenantha, possui propriedades antitumorais (Liu et al., 2012, 2013). Os autores observaram que a Adn possui a capacidade de induzir a diferenciação de células de Leucemia Mieloide Aguda (LMA), a forma de leucemia aguda mais comum entre adultos (Liu et al., 2012). Na LMA ocorre um bloqueio da diferenciação de células sanguíneas em estágios específicos de maturação, impedindo a especialização celular e levando a proliferação descontrolada de células leucêmicas. Acredita-se que essa diferenciação seja mediada por hidroperóxidos, em especial o H2O2, através da oxidação de MAP quinases como ERK1 e ERK2 que estão envolvidas na diferenciação de células hematopoiéticas e, portanto, sujeitas a regulação por peroxidases (Cassinat et al., 2011; Hu et al., 2000). [040] Através de análises bioquímicas e de biologia molecular foi demonstrado que os alvos biológicos da Adn eram as isoformas citosólicas de 2-Cys Prx típicas: Prx1 e Prx2. Também foi demonstrado que a ligação da Adn ocorria especificamente com o Sγ de resíduos de cisteína, onde esta atuaria como um aceptor de Michael em uma reação de adição entre o C17 da Adn com cisteínas das 2-Cys Prx típicas Prx1 e Prx2 de células de LMA, originando um aduto e inibindo a atividade peroxidásica dessas enzimas (Liu et al., 2012). [041] Assim, foi proposto um modelo de ligação onde a Adn interagiria com outros aminoácidos na região do sítio ativo, incluindo os resíduos da tríade catalítica por meio de uma interação hidrofóbica com a Thr49 e uma interação polar com a Arg128, ambos pertencentes à tríade catalítica. Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 36/91 23/55 Consequentemente, ocorreria a inibição da atividade peroxidásica dessas proteínas, permitindo então o acúmulo de H2O2 intracelular (Liu et al., 2012, 2013). [042] Posteriormente, Hou e colaboradores observaram que a inibição de Prx1 e Prx2 por Adn foi capaz de induzir a morte de células de hepatocarcinoma (CHC) com mais eficiência do que em células normais imortalizadas, além de inibir significantemente o crescimento de tumores xenográficos sem efeitos tóxicos significativos (Hou et al., 2014). Foi observado pelos autores que células tratadas com adenantina tiveram seus níveis de hidroperóxidos aumentados de duas a três vezes em relação às células que não receberam o tratamento, o que possibilitaria a utilização destes compostos em processos de morte celular induzida por hidroperóxidos e espécies geradas através de reações como a de Fenton e Harber-Weiss, sendo portanto, um potencial agente terapêutico para pacientes com hepatocarcinoma (Hou et al., 2014). Recentemente, foi demonstrado que a administração de Adn juntamente com o antitumoral VD3 (1,25-dihydroxyvitamin D3) é capaz de aumentar significativamente a diferenciação e atividade apoptótica em células de leucemia promilelocítica aguda (APL) (Wei et al., 2016). [043] Em razão da promissora utilização da Adn como inibidor de Prx para o tratamento de neoplasias em 2011 foi solicitada a patente para o tratamento de neoplasias (CN103045715A). Também existe patente prévia (2010) para a utilização de Adn para o tratamento de esclerose múltipla em humano (CN102462677A). Entretanto, não existe até o presente momento solicitação de patente para o tratamento de doenças infecciosas incluindo aquelas causadas por bactérias. Neste Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 37/91 24/55 contexto, diferenças entre as 2-Cys Prx típicas de eucariotos e AhpCs de procariotos podem significar importantes características para serem exploradas na utilização de fármacos que sejam capazes de inibir essas proteínas em bactérias, potencializando o estresse oxidativo promovido pela administração de antibióticos, mas que tenham pouco ou nenhum efeito sobre as proteínas dos hospedeiros. ESTADO DA TÉCNICA [044] O documento CN103045715A refere‐se ao conhecido uso da substância Adenantina para o tratamento de leucemia pela inibição da atividade enzimática de enzimas antioxidantes resultando no efeito da diferenciação celular nas células de leucemia. O documento ainda revela que a Adenantina é segura, não tóxica e é um forte composto em atividade farmacológica. Conforme observado, tal documento cita a utilização de adenantina (Adn) como inibidor de peroxirredoxinas de humanos e também relata que é uma molécula segura para utilização como fármaco no tratamento de leucemia. De fato, tal molécula é considerada segura desde os estudos pioneiros em células humanas (Liu et al., 2012. Nat. Chem. Biol. 2012. 5:486-93) e, posteriormente, em mamíferos contendo tumores xenográficos (Hou, JK et al. 2014. Cell Death & Disease, 5, e1400) e esse é um fator bastante favorável para a utilização do composto em terapias médicas. Entretanto, é importante ressaltar que tal documento foca em uma doença genética e não uma doença infecciosa, como as ocasionadas por bactérias patogênicas, e também não prevê sua utilização em conjunto com antibacterianos. De fato, a presente invenção demonstra que as doses utilizadas para inibir isoformas bacterianas são menores que as de enzimas humanas, o que pode estar relacionado a Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 38/91 25/55 diferenças estruturais existentes entre enzimas de eucariotos (e.g. mamíferos) e procariotos (bactérias) (Wood et al. 2003. Science, 300:650-3). [045] O documento CN102462677A refere‐se ao diterpenoide Adenantina, discorrendo sobre sua atividade farmacológica, toxicidade e segurança. Adicionalmente refere‐ se ao uso como aditivo em uma nova formulação medicamentosa como inibidor de NF‐kB para o tratamento de Esclerose Múltipla. Entretanto, tal documento não apresenta conflito com a presente invenção por ser direcionado ao tratamento de doença genética (esclerose múltipla) e propõe sua utilização com outros agentes já utilizados no tratamento (glicocorticoides, imunoglobulinas, interferon, ciclofosfamida, dentre outros). Novamente se trata de uma doença genética, muito distinta de doenças causadas por agentes infeciosos, e, em nenhum momento, é proposto a utilização de Adenantina em conjunto com antibióticos, como na presente invenção. [046] O documento CN108721275A refere‐se ao uso da Adenantina em conjunto com Andrografolida. Quando administrados em conjunto possuem ação sinérgica contra a atividade proliferativa de células cancerígenas. Adicionalmente, é revelado que Andrografolida possui atividades antimicrobianas. Ainda, é informado que, em conjunto, permitem redução da dose administrada, proporcionando menos efeitos adversos e colaterais. Conforme observado, no documento é citado que a Andrografolida possui atividade antimicrobiana, e existem estudos publicados de sua utilização para esta finalidade Zhang et al., 2019. Biomed Pharmacother. 117:109065; Banerjee et al., 2017. Acta Trop. 176:58-67). A atividade antimicrobiana discutida é para o outro Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 39/91 26/55 composto (Andrografolida). Novamente, é importante ressaltar que, a utilização da Adenantina em conjunto com a Andrografolida é proposta para tratamento de doença genética e não infecciosa, como proposto na presente invenção. [047] O documento em nome de Chuan‐Xu Liu et al., intitulado “ADENANTHIN TARGETS PEROXIREDOXIN I AND II TO INDUCE DIFFERENTIATION OF LEUKEMIC CELLS” relata e reforça que a adenantina induz a diferenciação de células APL sensíveis ao ácido trans‐retinoico (ATRA) e resistentes a ATRA, visando diretamente o CR de Prx I e Prx II, juntamente com a inibição de suas atividades antioxidantes. Entretanto, tal documento não apresenta conflito com a presente invenção por propor a utilização da Adenantina para doença genética e não infecciosa, como na presente invenção. [048] O documento em nome de Marta Siernicka et al., intitulado “ADENANTHIN, A NEW INHIBITOR OF THIOL‐DEPENDENT ANTIOXIDANT ENZYMES, IMPAIRS THE EFFECTOR FUNCTIONS OF HUMAN NATURAL KILLER CELLS”, também evidencia a capacidade que Adenantina possui de inibir enzimas antioxidantes. Adicionalmente, descreve que tais ações são mediadas pela regulação de ligações dissulfeto intra ou intermolecular. Tal documento foca novamente em enzimas humanas de células NK (Natural Killers) e como mencionado, a Adenantina interfere na regulação de ligações dissulfeto com o sistema redutor representado pelas enzimas Trx e TrxR. Entretanto, existem diferenças fundamentais entre enzimas do sistema redutor de bactérias e humanos; como exemplo, a enzima TrxR de mamíferos não utiliza cisteína, mas sim selenocisteína para as atividades enzimáticas (Oliveira et al., 2010. Biochemistry, 15:3317-26), um aminoácido muito mais reativo e presente quase que Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 40/91 27/55 exclusivamente em organismos com células nucleadas. Aqui ressalta-se que além de diferenças entre sistema redutor, existem diferenças fundamentais entre enzimas de bactérias e humanos, como apontado no esclarecimento ao documento 1 (Wood et al. 2003. Science, 300:650-3), o que não torna óbvio que um composto utilizado para enzimas humanas seja ativo para bactérias. De fato, foi demonstrado na presente invenção que a inibição por Adn é extremamente mais eficaz para peroxirredoxinas bacterianas quando comparadas com as humanas. [049] Assim, conforme observado, não há no estado da técnica documentos que pudessem prever o sinergismo entre a Adenantina e o Aminoglicosídeo Canamicina, conforme sugerido pela presente invenção. Adicionalmente, a presente invenção mostra-se bastante promissora, visto que: 1) As enzimas bacterianas apresentam diferenças significativas estruturais e funcionais com as de mamíferos, o que a princípio pode explicar uma inibição acentuada das enzimas bacterianas; 2) Os compostos (Adenantina e amioglicosídeos) que são alvo da presente invenção são considerados seguros pela comunidade científica internacional; 3) Infecções hospitalares ocasionadas por bactérias super-resistentes sendo muitas delas Gram+ levam a um elevado número de comorbidades, óbitos, despesas hospitalares e reflexos de grande monta financeira, uma vez que, somente nos EUA e Europa ocidental são gastos bilhões de dólares anuais em decorrência de infecções de origem bacterianas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [050] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme segue. Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 41/91 28/55 [051] A Figura 1 apresenta as reações de Fenton (A) e Haber-Weiss (B), onde em (A) a interação entre uma molécula de Fe3+ com uma de ânion superóxido resulta na liberação de Fe2+ que, ao reagir com peróxido de hidrogênio, produz o radical hidroxila; enquanto que em (B), a hidroxila é originada a partir da reação entre peróxido de hidrogênio e ânion superóxido. [052] A Figura 2 apresenta o mecanismo comum de morte celular induzida por antibióticos, onde em (1) as interações primárias fármaco-alvo biológico (aminoglicosídeos com ribossomos, quinolonas com topoisomerase e β-lactâmicos com proteínas ligadas à penicilina (PBPs) da parede celular) estimulam a oxidação do NADH através da cadeia transportadora de elétrons, que é dependente do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA); em (2) a hiperativação da cadeia transportadora de elétrons estimula a formação do radical ânion superóxido (O2- ), o qual danifica grupamentos Fe-S (3), tornando o ferro ferroso disponível para oxidação pela reação de Fenton (4), que produz radical hidroxila (OH-), danificando DNA, lipídios e proteínas (5), o que contribui para a morte celular induzida por antibióticos. Figura modificada de Kohanski et al. (2010). [053] A Figura 3 mostra as diferenças que a porção C- terminal, presente somente em proteínas de eucariotos como o homem, alteram o microambiente do sítio ativo em torno da cisteína catalítica. A Superfície molecular de decâmeros de 2- Cys Prx típicas de eucarioto e procarioto são representados por (A) e (B), respectivamente. As estruturas estão coloridas em cinza, os aminoácidos da tríade catalítica estão coloridos em laranja (CP), azul (Arg) e vermelho (Thr/Ser) e a cauda C- terminal presente somente em eucariotos, em verde escuro. Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 42/91 29/55 [054] A Figura 4 mostra graficamente a inibição da formação de dissulfeto intermolecular e da atividade peroxidásica de EcAhpC e SaAhpC por Adn. As proteínas EcAhpC (A) e SaAhpC (B) foram reduzidas com 5mM de DTT por 1 hora (lane 1) e, em seguida, dessalinizadas para a remoção do excesso de redutor (lane 2). Alíquotas contendo 10µM das enzimas reduzidas e dessalinizadas foram tratadas com concentrações variadas de Adn (0.5, 1, 2.5, 5 e 10 equivalentes molares - lanes 4, 5, 6, 7 e 8, respectivamente) por 1 hora e posteriormente oxidadas com 5 equivalentes molares de H2O2 por 30 minutos. As reações foram paralisadas com a adição de stop buffer (Tris 50mM pH 6,8, NEM 50mM, SDS 2%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0.1%) e analisadas em SDS-PAGE não redutor corado com coomassie blue. A lane 3 representa a proteína reduzida/dessalinizada e posteriormente oxidada, sem tratamento com Adn. Os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente. Os ensaios foram feitos em triplicata e com repetições independentes. Inibição da atividade peroxidásica de EcAhpC e SaAhpC por Adn. EcAhpC (C) e SaAhpC (D) reduzidas e dessalinizadas foram tratadas com concentrações variáveis de Adn (0.5 -■, 1 - ▲ e 2.5 - ▼ equivalentes molares) por 1 hora em temperatura ambiente e, posteriormente, dessalinizadas novamente. A seguir, 3µM das proteínas tratadas foram adicionadas a reações contendo EcTrx 6µM, EcTrxR 0,9µM, NADPH 150µM, HEPES 50mM pH 7,0, DTPA 100µM e azida sódica 1mM. As reações foram incubadas a 37°C por 3 minutos antes de serem iniciadas pela adição de H2O2 500µM e monitoradas espectrofotometricamente a 340nm, 37°C, por 5 minutos. Como controle positivo foram utilizadas reações em que as proteínas não foram previamente tratadas com Adn (●) e, como controle Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 43/91 30/55 negativo, foram utilizadas reações sem a adição de AhpC(⧫). As velocidades iniciais de cada reação foram calculadas, transformadas em valores de porcentagem e plotadas para o cálculo dos valores de IC50 de Adn para EcAhpC (E) e SaAhpC (F). Os ensaios foram feitos em triplicata e com repetições independentes. [055] A Figura 5 mostra imagens da avaliação da inibição do crescimento de bactérias Gram + (B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis) e avaliação da atividade bactericida/bacteriostática de Adn. (A) Viabilidade celular de B. subtilis, S. aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium após tratamento com Adn. As células de B. subtilis F41923-PY79 (⬣), S. aureus ATCC 25923 (■), S. epidermidis ATCC 12228 (▲), E. coli ATCC 35218 (▼), P. aeruginosa ATCC29853 (⬥) e S. typhimurium ATCC 700720 (●), em concentração de 105 UFC, foram inoculadas em meio Mueller Hinton contendo concentrações crescentes de Adn e incubadas por 24 horas, a 37°C, sendo então quantificadas espectrofotometricamente a 600nm. Células de S.aureus (B) e S. epidermidis (C) foram incubadas em meio de cultura LB sem Adn (figuras à esquerda) ou contendo Adn 750μM (figuras à direira) por 24 horas a 37°C. A seguir, as células não tratadas foram diluídas 10.000 e 100.000 vezes e inoculadas em meio de cultura LB-ágar, sem Adn. As células tratadas foram inoculadas no mesmo meio de cultura sem diluição ou diluídas 100 vezes. Após 16 horas de incubação a 37°C, foi possível observar que as células que não receberam o tratamento com Adn foram capazes de formar colônias abundantes (figuras à esquerda), enquanto as células tratadas com Adn apresentaram formação de colônias reduzida (figuras à direita). Este ensaio foi realizado em duplicata. Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 44/91 31/55 [056] A Figura 6 mostra graficamente o teste de toxicidade de canamicina em combinação com adenantina sobre células de bactérias patogênicas de S. aureus e S. epidermidis. S. aureus e S. epidermidis foram cultivadas por 6 horas em meio LB e, posteriormente, diluídas no mesmo meio de cultura até OD600=0.01. As células foram então tratadas com 1,5 µg/ml de canamicina (Kan) e 200µM adenantina (Adn) separadamente (colunas 2 e 3), ou simultaneamente (coluna 4) por 24 horas, a 37°C e sem agitação. Após o período de incubação, a densidade celular foi quantificada por espectrofotometria a 600nm. Os ensaios foram feitos em triplicata e com repetições independentes. [057] A Figura 7 mostra graficamente a avaliação da toxicidade de gentamicina associada a Adn sobre S. aureus. Células de S. aureus (ATCC 25923) em concentração de 105 UFC foram inoculadas em meio Mueller Hinton contendo apenas gentamicina 50ng/ml, ou associada Adn (60μM) e incubadas por 24 horas, a 37°C, sendo então quantificadas espectrofotometricamente a 600nm. Os ensaios foram feitos em triplicata e com repetições independentes. [058] A Figura 8 mostra graficamente a avaliação da toxicidade de polimixina B (PMNB) associada à adenantina (Adn) sobre células da bactéria Gram- E. coli. Células de E. coli (ATCC25922) em concentração de 105 UFCs foram inoculadas em meio Mueller Hinton contendo apenas PMNB (0,2μg/ml em A; 0,3 μg/ml em B), apenas Adn 200μM ou a associação dessas duas moléculas e incubadas por 24 horas, a 37°C, sendo então quantificadas espectrofotometricamente a 600nm. Os ensaios foram feitos em triplicata e com repetições independentes. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 45/91 32/55 [059] A presente invenção refere-se ao uso de diterpenoides ent-caurânicos, como a adenantina (Adn), seus derivados em associação a antibióticos que promovem aumento do estresse oxidativo, como os β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, por exemplo a canamicina (Kan), como potencializadores da atividade antimicrobiana desses fármacos. [060] A adenantina (Adn) extraída de Isodon adenanthus, também conhecida como Rabdosia adenantha (Cat. No: CFN99215) oriundo da flora da China, que possui a propriedade antitumoral através da inibição de peroxirredoxinas 2-Cys típicas de humanos. Uma vez que, existem diferenças significativas no ambiente de ligação de substratos (sítios ativos) entre 2-Cys Prx típicas de eucariotos e procariotos (Figura 3), avaliamos a capacidade inibitória sobre enzimas 2- Cys Prx (AhpC) de bactérias Gram- e Gram+. Através de dois ensaios enzimáticos distintos (oxidação DTT – Tabela 2; oxidação de NADPH - Figura 4) foi demonstrado que Adn é capaz de inibir de forma acentuada as enzimas de ambas as classes bacterianas. Também demonstramos que Adn é capaz de aniquilar linhagens de bactérias patogênicas Gram+ de forma isolada (Figura 5) e de Gram + e Gram-, potencializando a ação de antibacterianos conhecidos (Figuras 6,7 e 8). De forma clara, foi demonstramos que a Adn é capaz de inibir de forma mais eficiente as 2-Cys Prx bacterianas, quando comprado com as de humanos, e potencializar a ação de antibacterianos de forma acentuada. A descrição detalhada da invenção é apresentada a seguir. Diferenças entre 2-Cys Prx de eucariotos e procariotos [061] Uma diferença marcante entre as 2-Cys Prx típicas de procariotos e eucariotos reside na existência de um Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 46/91 33/55 prolongamento C-terminal que insere uma α hélice nas enzimas de eucariotos que se projeta para o interior do sítio ativo alterando de forma substancial o microambiente catalítico (Figura 3A e 3B). Já foi postulado que a ausência dessa região está relacionada com uma maior resistência de 2-Cys Prx típicas à inativação por altas doses de hidroperóxidos, enquanto que, nas representantes de eucariotos este prolongamento favorece a superoxidação de CP da enzima em CP-SO2H, impedindo a formação de dissulfeto e levando à sua inativação (Wood, Poole e Karplus, 2003). Esta diferença parece bastante relevante, uma vez que para patógenos é importante possuir uma enzima altamente resistente à inativação por superoxidação para garantir a sua sobrevivência no hospedeiro. [062] Na presente invenção, explorou-se se Adn é capaz de inibir de forma eficiente e diferencial as 2-Cys Prx bacterianas (AhpCs). Para tanto, foram testadas individualmente por meio do ensaio de oxidação do DTT, um ensaio pouco rápido e simples para avaliar a atividade de peroxirredoxinas. Como alvos de inibição foram utilizadas as 2-Cys Prx bacterianas, denominadas de AhpC, das seguintes bactérias de linhagens patogênicas Gram-: Eschericchia coli (ATCC 35218), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 29853)e Salmonella typhimurium (ATCC 700720); ou Gram+: Bacillus subtilis (F41923- PY79), S. aureus (ATCC 25923) e S. epidermidis (ATCC 12228). Os resultados demonstraram que Adn é capaz de inibir, eficientemente, com taxas de inibição da velocidade inicial (v0) da reação de  40-80% (Tabela 2). Tabela 2: Velocidade inicial (v0) de enzimas AhpCs de espécies de bactérias Gram- (E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium) e Gram+ (B. subtilis, Staphylococcus aureus e Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 47/91 34/55 Staphylococcus epidermidis) tratadas (Adn+) ou não (Adn-) com Adenantina. Velocidade inicial (v0)de reação (µM/s) Adn- Adn+ EcAhpC 10.53 (±0.75) 6.69 (±0.13) PaAhpC 9.36 (±0.13) 6.52 (±1.67) StAhpC 8.03 (±0.83) 6.77 (±0.61) BsAhpC 19.49 (±0.06) 3.21 (±0.06) SaAhpC 12.04 (±0.73) 4.84 (±1.62) SeAhpC 15.88 (±0.78) 5.14 (±0.14) O inibidor Adn é capaz de inibir a atividade de AhpCs ao se ligar a cisteínas e apresenta alta atividade inibitória [063] Uma vez que a ligação de Adn ao sítio ativo das Prx impede a formação do dissulfeto intermolecular, o sucesso desse tratamento pode ser observado através de SDS-PAGE não redutor. Dessa forma, a porção de proteína que não estiver ligada a Adn apresenta sua forma oligomérica usual, caracterizada por dímeros unidos por dissulfeto (~44 kDa), enquanto a porção de proteína ligada a Adn será visualizada no gel como monômeros (~22kDa), devido à sua incapacidade de formar o dissulfeto. Para isso, foi separada uma alíquota de proteína após o tratamento com cada concentração de Adn (0.5- 10 equivalentes molares) e adicionados 5 equivalentes molares (em relação à concentração da proteína) de H2O2, sendo a reação incubada por 30 minutos à temperatura ambiente e, posteriormente, analisada por SDS-PAGE não redutor. As proteínas avaliadas foram a AhpC de E. coli (EcAhpC)(Gram-) e S. epidermidis (SeAhpC) (Gram-). Os resultados revelam que, quanto maior a dose de Adn aplicada maior foi a inibição da formação de dissulfetos intermoleculares (Figuras 4A e 4B) e, Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 48/91 35/55 portanto, demonstram que Adn é capaz de inibir as AhpCs bacterianas por meio do bloqueio das cisteínas. [064] Com a finalidade de determinar o IC50 de Adn foram efetuados ensaios de oxidação de NADPH com enzimas tratadas com as concentrações de Adn e enzimas utilizadas no ensaio em SDS-PAGE. Os resultados revelaram que mesmo doses estequiométricas de Adn (0.5 eq.) foram capazes de inibir fortemente a atividade das enzimas (Figuras 4C e 4D). O cálculo da concentração inibitória mínima aparente (IC50) revelou IC50 de 0,481 ± 0,024 μM para EcAhpC e 1,650 ± 0,100 μM para SaAhpCT (Figuras 4E e 4F), cerca de 10-30 ⋅ menores aos determinados para Prx2 humana e até 3 ⋅ menor que o determinado para Prx1 humana utilizando o mesmo método (Liu et al., 2012). Neste contexto, os dados obtidos inicialmente indicam um IC50 bastante diminuto tanto para EcAhpC quanto par SaAhpC. Adn é capaz de agir como bactericida em linhagens de bactérias patogênicas [065] Com o objetivo de investigar a possível atividade bactericida/bacteriostática da Adn, realizamos testes de susceptibilidade a antimicrobianos pelo método de microdiluição em meio de cultura (Eloff, 1998; NCCLS, 2003) utilizando as linhagens das bactérias Gram+ B. subtilis (ATCC 39094), S. aureus (ATCC 29213) e S. epidermidis (ATCC 12228), e das bactérias Gram- e E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 29853) e S. typhimurium (ATCC 19585), na presença de concentrações crescentes de Adn. Para isso, uma concentração final de 105 UFC de cada bactéria foi inoculada em microplacas contendo meio Mueller Hinton e concentrações crescentes de Adn e incubada a 37°C por 24 horas. Após o período de incubação, a densidade celular foi estimada espectrofotometricamente a 600 Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 49/91 36/55 nm para o cálculo do valor de MIC50. O crescimento de E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium não foi inibido pela presença de Adn e, portanto, não foi possível calcular o MIC50 para essas linhagens. Entretanto, as linhagens de B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis foram sensíveis à toxicidade de Adn, apresentado IC50 de 116µM, 111µM e 146µM, respectivamente (Figura 5A). [066] A seguir, para avaliar se Adn possui efeito bactericida ou bacteriostático sobre as linhagens S. aureus e S. epidermidis, essas cepas foram pré-tratadas com 750μM de Adn por 24 horas, a 37°C, e posteriormente inoculadas em meio LB-ágar sem Adn (Figura 5B). Ao contrário do observado para o controle positivo, em que as células não receberam o pré- tratamento com Adn e foram capazes de formar colônias abundantes no meio LB-ágar sem Adn, as células tratadas com Adn apresentaram crescimento bastante reduzido após serem inoculadas em meio sem Adn, indicando o efeito bactericida deste composto. Efeito do tratamento de linhagens de bactérias patogênicas Gram+ com Adn em associação com antibióticos [067] Adicionalmente ao efeito bactericida isolado de Adn, sua utilização pode ser combinada com antibióticos para que promovam um aumento do estresse oxidativo, como os β- lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas (Dwyer, Belenky, Yang, Macdonald, et al., 2014), o que potencializaria o efeito antimicrobiano desses fármacos. Com o objetivo de avaliar o efeito sinérgico de Adn e aminoglicosídeos, as linhagens bacterianas S. aureus e S. epidermidis foram tratadas isoladamente com 1,5μg/ml de canamicina (Kan) ou 200μM de Adn e, a seguir, simultaneamente com as mesmas concentrações de Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 50/91 37/55 Kan e Adn (Figura 6). Os resultados indicam que o tratamento apenas com Adn provocou morte celular de ~60% para S. aureus e 47% para S. epidermidis, enquanto o tratamento apenas com Kan provocou morte celular de ~29% para S. aureus e ~44% para S. epidermidis. Já quando essas cepas bacterianas foram tratadas simultaneamente com Adn e Kan, a morte celular atingiu ~97% para ambas as linhagens, indicando um efeito sinérgico promovido por Adn e Kan. [068] Também avaliamos os efeitos da associação do antibiótico gentamicina sobre linhagens de S. aureus. Os resultados revelaram que o tratamento das células com gentamicina (50μg/ml) levou à mortalidade de ~55% das células bacterianas, ao passo que, quando combinada com Adn a morte celular foi elevada para ~90% (Figura 7). Em conjunto, os resultados demonstram que Adn combinada com antibióticos é capaz de potencializar a ação dos antibióticos. A combinação de Adn com o antibiótico polimixina B nonapeptídeo (PMBN) é capaz de aniquilar bactérias Gram- [069] Não escapou à nossa atenção que, apesar da Adn inibir de forma muito acentuada a atividade de AhpC de bactéria Gram- (Figuras 4C e 4E), as bactérias que não apresentaram suscetibilidade ao tratamento com Adn foram justamente as Gram- (E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium). De fato, é bem conhecido que bactérias Gram- podem ser mais resistentes ou mesmo insensíveis ao tratamento com moléculas que apresentam atividade bactericida ou bacteriostática, pois seu sistema de membranas representa uma barreira para a entrada de compostos, incluindo antibacterianos, fornecendo uma camada extra de proteção às bactérias (Delcour, 2009; Krishnamoorthy et al., 2017; Vaara, 1992). A membrana externa (ME) de bactérias Gram- Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 51/91 38/55 negativas é uma bicamada assimétrica composta de lipopolissacarídeos (LPS) na camada externa e glicerofosfolipídeos (PL) na interna (Nikaido, 1998). As principais características da estrutura LPS, como a presença do lipídio A e do antígeno O, são conservadas entre várias espécies. A maior parte do conhecimento atual sobre a seletividade das barreiras de permeabilidade da ME foi determinada por estudos envolvendo E. coli. Nesta bactéria, a atividade antibacteriana de antibióticos grandes e polares excedendo o tamanho para o transporte em porinas (> 600 Da em E. coli), são geralmente as mais restritas pela ME (Krishnamoorthy et al., 2017; Nikaido, 1998; O’Shea e Moser, 2008; Lakaye et al., 2001). Por outro lado, o caráter zwiteriônico de compostos se correlaciona com o aumento da permeabilidade através da ME, enquanto a hidrofobicidade está correlacionada com a propensão aumentada de um determinado composto ser substrato de bombas de efluxo de drogas (Krishnamoorthy et al., 2017). Neste contexto, compostos como Adn o qual apresenta baixa polaridade e peso molecular de 500Da, se encaixam nas drogas as quais este tipo de bactéria são refratárias (Vaara, 2019). [070] As características da membrana de Gram- são alvo de uma classe de antibióticos denominados de polimixinas, os quais podem subjugar a barreira membranar desta classe de bactérias (Vaara et al., 2019). Neste contexto, avaliamos a capacidade da administração de Adn em conjunto com doses subletais de polimixina B nonapeptídeo (PMBN) sobre linhagem de E. coli. Os resultados revelaram que a administração de 0,2μg de PMBN, Adn (200μM) ou a combinação dos dois compostos não foi capaz de alterar de forma significativa as taxas de Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 52/91 39/55 sobrevivência das bactérias (Figura 8A). Entretanto, quando foi aplicada a dose de 0,3μg de PMBN a sua combinação com Adn levou à redução da taxa de sobrevivência celular em ~ 90% (Figura 8B). Diterpenoides ent-caurânicos, novos fármacos [071] Do ponto de vista farmacológico, a avaliação da relação entre estrutura e atividade biológica de diterpenoides em geral incluindo os diterpenoides ent-caurânicos sugerem que determinadas características destas moléculas estão envolvidas em suas funções biológicas. Foi constatada a presença de um esqueleto decalínico substituído (porção hidrofóbica), capaz de interagir com lipídeos das membranas biológicas, e uma região que apresenta um grupo doador de hidrogênio (H) (porção hidrofílica), o qual é capaz de interagir com grupos aceptores de H presentes na membrana plasmática. Estas características permitem que estas moléculas sejam capazes de atravessar a membrana celular exercendo sua atividade biológica (Wang et al., 2011). De fato, características como as apresentadas para este grupo de moléculas são altamente importantes para que um fármaco possa ser mais facilmente absorvido pelo organismo (Walters, 2012). Adicionalmente, é importante observar nestas estruturas a presença de um carbono (C) capaz de atuar como um doador de Michael para a reação com as cisteínas das 2-Cys-Prx (Liu et al., 2012). [072] Neste contexto, apesar de Adn ter sido utilizada para o tratamento de doenças genéticas, ela não é utilizada para o tratamento de doenças infecciosas. Neste pedido, demonstramos claramente que Adn é capaz de inibir as Prx bacterianas por meio da inativação do resíduo catalítico. Também demonstramos que as doses utilizadas (IC50) para inativar Petição 870200099960, de 10/08/2020, pág. 53/91 40/55 as enzimas bacterianas é significativamente menor que as determinadas para enzimas de humanos (até 30 menor) (Liu et al., 2012). Também demonstramos que possui propriedade bactericidas, em concentrações de micromolar, sobre bactérias Gram-, e, em conjunto com baixas concentrações de antibióticos é capaz de aniquilar bactérias Gram+ (Adn + Kan ou Gen) e também bactérias Gram– (Adn + polimixina nonapeptídeo), demostrando um amplo espectro para sua utilização no tratamento de infecções ocasionadas por bactérias patogênicas. Dessa forma, o presente pedido de patente consiste em proteger o uso de Adn, seus derivados (moléculas modificadas) e diterpenoides ent-caurânicos quando associado a antibacterianos que promovem aumento do estresse oxidativo (β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas) e também de polimixinas, uma vez que Adn e derivados são inibidores de 2-Cys Prx bacterianas (AhpCs) e agem como potencializadores da atividade antimicrobiana de fármacos antibacterianos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [073] ACKER, H. VAN et al. The Role of Reactive Oxygen Species in Antibiotic-Induced Cell Death in Burkholderia cepacia Complex Bacteria. PloS one, v. 11, n. 7, p. e0159837, 2016. [074] ALEXANDER FLEMING. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. International Journal of Experimental Pathology, v. 10, p. 226–236, 1929. [075] ALÓS, J.-I. [Antibiotic resistance: A global crisis]. 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