UNESP - Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho” 

Faculdade de Odontologia de Araraquara 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Renata Cristina Lima Silva 

 

 

 

 

 

 

Efeito da diacereína no tratamento da doença periodontal induzida em molares de ratos 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

 

2020 

 

  



 

 

UNESP - Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho” 

Faculdade de Odontologia de Araraquara 

 

 

 

 

 

Renata Cristina Lima Silva 

 

 

 

 

 

 

Efeito da diacereína no tratamento da doença periodontal induzida em molares de ratos 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dissertação apresentada à Universidade Estadual 

Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia de 

Araraquara para obetenção do título de Mestre em 

Odontologia, Área de Periodontia 

 

Orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

 

2020 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 
 
 

 
 
 

 
 
 
 

 
 
 

 

                    
       
       Silva, Renata Cristina Lima  

           Efeito da diacereína no tratamento da doença periodontal 
induzida em molares de ratos / Renata Cristina Lima Silva.--  
Araraquara: [s.n.], 2020 

            69 f.; 30 cm. 
   Te               
                      Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade   

                  Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia 
            Orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri 
                                                                      

1. Doença periodontal 2. Citocinas  3. Metaloproteinases  

        da matriz 4. Interleucina-1   5. Periodontite  I. Título 
. 

            Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB/5646 
                         Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara   

Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação  



 

 

Renata Cristina Lima Silva 

 

 

 

 

 
 

 
Efeito da diacereína no tratamento da doença periodontal induzida em molares de ratos 

 

 

 

Comissão julgadora 

 

 

 

 

 

 

 

Presidente e orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri 

 

2º Examinador: Prof. Dr. Manuel de Jesus Simões 

 

3º Examinador: Profa. Dra. Rosemary Adriana Chierici Marcantonio 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara, 27 de março de 2020. 



 

DADOS CURRICULARES 

 

 
Renata Cristina Lima Silva 

 

 

 
 

NASCIMENTO: 03/10/1994 – Campinas – São Paulo 

 

FILIAÇÃO: Roseli Aparecida de Lima Silva e Vagner João da Silva 

 

2013/2017: Cirurgiã-Dentista graduada pela Faculdade de Odontologia de Araraquara da 

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (FOAr-UNESP); 

 

2018/2020:  Mestranda em Odontologia (Área de Periodontia) pela Faculdade de Odontologia 

de Araraquara da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (FOAr-UNESP). 

  



 

Dedico esta dissertação a meus familiares, em especial minha mãe, Roseli, e meu pai, 

Vagner. O apoio e estímulo vindo de vocês foi fundamental para minha persistência e foco no 

desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por cada momento e alegria que temos juntos, e por 

me mostrar que valeria a pena.  



 

AGRADECIMENTOS 

 

O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de 

Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. 

FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo nº 

2018/11757-9) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa. 

Ao meu orientador, Prof. Paulo, por todo ensinamento, suporte e sabedoria a mim 

confiados durante todo o curso de Mestrado. Obrigada por me passar todo seu admirável 

conhecimento sobre Histologia, e me ajudar a aplicá-lo à Periodontia. 

Aos meus amigos e colegas de laboratório: Camila, Evelin, Mateus, Salmo, Fabiane, 

Flávia e José Paulo. Por todo suporte, paciência, amizade, ajuda com os animais e carinho em 

me explicar e me ajudar em cada pormenor, mesmo que não fosse incumbência “oficial” de 

vocês. Especialmente à Fabiane e à Flávia, por me encorajar a aprender a tratar os animais da 

melhor forma possível; e ao Salmo, pela ajuda com os períodos de medicação. 

Aos meus amigos e colegas de Mestrado: Gabriel, Carolina, Mariely, Natalie, 

Jhonatan, Ingra, Amanda e Marco pela amizade e ajuda em todos os momentos que solicitei. 

Em especial a Julio e Lorena, pelas fotografias tiradas para este trabalho. 

Às minhas amigas mais próximas do curso: Dania, Flávia, Karen e Lorena. Minha 

gratidão por todos os momentos que tivemos, dos mais divertidos aos mais conturbados. Vocês 

tornaram tudo mais leve. 

Aos Professores Joni e Daniela, pelas considerações durante o Exame Geral de 

Qualificação. Suas observações foram de grande relevância e contribuíram muito para esta 

dissertação. Em especial ao Prof. Joni, pela orientação que me deu durante o estágio de 

Iniciação Científica, do qual guardo ensinamentos até hoje. 

À Professora Adriana, por cuidar tão bem das questões relativas à Periodontia, pelos 

ensinamentos, e por ser amparo e um ombro amigo quando precisamos. 

E aos demais amigos, familiares e professores que passaram por mim ao longo dos 

anos. Todos colaboraram para que chegasse até aqui. 

  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“De uma gota d’água (...) um pensador lógico poderia inferir a possibilidade de um Atlântico ou de um 

Niágara, sem jamais ter visto um e outro ou ouvido falar deles. Assim, toda vida é uma grande cadeia, 

cuja natureza se revela ao examinarmos qualquer dos elos que a compõem. Como todas as outras artes, 

a Ciência da Dedução e Análise só pode ser adquirida por meio de um demorado e paciente estudo, mas 

a vida não é tão longa que possibilite a um mortal aperfeiçoar-se ao máximo nesse campo. Antes de 

passar aos aspectos morais e mentais de um assunto que apresenta as maiores dificuldades, o pesquisador 

deve principiar por tomar conhecimento dos problemas mais elementares. Ao deparar-se com um 

semelhante, aprenda ele a distinguir imediatamente qual a história do homem e a profissão que exerce. 

Por mais pueril que esse exercício possa parecer, aguça as faculdades de observação e ensina aonde se 

deve olhar e o que procurar. Pelas unhas de um homem, pela manga do seu paletó, pelos seus sapatos, 

pelas joelheiras nas calças, as calosidades do seu indicador e polegar, pela sua expressão, pelos punhos 

da camisa... em cada uma dessas coisas a profissão de um homem é claramente sugerida. Não se pode 

aceitar que, em qualquer caso, o conjunto dessas observações deixe de elucidar um investigador 

competente”1.  



 

Silva RCL. Efeito da diacereína no tratamento da doença periodontal induzida em molares de 

ratos [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. 
 

RESUMO 

 

A periodontite (DP) é uma doença imunoinflamatória que promove o recrutamento de células 

específicas que liberam mediadores, dentre eles interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral-

alfa (TNF-α) e metaloproteinases da matriz (MMPs). Há evidências de que a diacereína, uma 

medicação anti-IL-1, reduz a produção de MMPs e TNF-α. O objetivo do presente estudo foi 

avaliar se a diacereína acelera a regressão da inflamação e reduz a perda óssea na DP induzida. 

No total, foram utilizados 66 ratos Holtzman distribuídos, aleatoriamente, nos diferentes 

grupos. Em 42 ratos, a DP foi induzida com inserção de uma ligadura no 1º molar superior 

direito por 7 dias. Após a indução, 12 animais foram sacrificados: 6 animais do grupo GP (grupo 

periodontite) e 6 animais do grupo controle (GC), usado como parâmetro da DP induzida. No 

7º dia de indução da DP, a ligadura colocada em 36 ratos foi removida e iniciou-se o tratamento 

com 100 mg/kg de massa corpórea de diacereína (GPD) ou solução fisiológica (GPS) por 

gavagem durante 7, 15 e 30 dias. Após 24 horas da administração da última dose, 6 animais de 

cada grupo (GPD, GPS e GC) foram sacrificados. Após eutanásia, fragmentos de maxila com 

molares do lado direito foram removidos e logo imersos em solução de formaldeído 4%. Em 

seguida, os espécimes foram descalcificados em EDTA 7% e processados para inclusão em 

parafina. De cada fragmento, 5 cortes sagitais semi-seriados foram corados com hematoxilina 

e eosina (HE) para análises morfológica e quantitativa dos seguintes parâmetros: densidade de 

volume de células inflamatórias (VvCI) e fibroblastos (VvFb) na mucosa gengival interdentária 

molares e mensuração das distâncias do epitélio juncional à junção cemento-esmalte (EJ-JCE) 

e da JCE à crista do processo alveolar (JCE-PA). A reação histoquímica para fosfatase ácida 

resistente ao tartarato (TRAP), usada como marcador de osteoclastos, foi realizada e o número 

de osteoclastos TRAP-positivos na superfície do processo alveolar computado. A densidade 

numérica de células IL-1β- e MMP-8-positivas, após reações de imuno-histoquímica, também 

foi avaliada. Os dados quantitativos foram submetidos à análise de variância de dois fatores 

(two-way ANOVA) e pós-teste de Tukey (p ≤ 0,05); quando GP e GC foram comparados, 

utilizou-se o teste t de Student não paramétrico. Os resultados revelaram um aumento 

significante nas distâncias de EJ-JCE e JCE-PA em GP, GPD e GPS comparados a GC, no qual 

o término do EJ coincidiu com a JCE em todos os períodos. Entretanto, não foram detectadas 

diferenças entre GPD e GPS de todos os períodos. Em todos os períodos, foi verificada uma 

redução significante na VvCI dos animais tratados com diacereína comparados ao GPS. Não 

foi detectada diferença no número de osteoclastos entre GPD e GC. Aos 7 e 15 dias, o número 

de osteoclastos foi significantemente menor no GPD do que no GPS, enquanto aos 30 dias, 

diferenças não foram detectadas. A imunoexpressão de IL-1β nos espécimes do GPD foi 

significantemente menor em comparação ao GPS, nos diferentes períodos. Após 15 e 30 dias, 

não foram detectadas diferenças entre os grupos GPD e GC. Uma acentuada imunoexpressão 

de MMP-8 foi detectada na mucosa com DP, exceto aos 30 dias. Neste período, não foi 

detectada diferença entre GPD e CG. O número de células MMP-8-imunopositivas foi 

significantemente menor no GPD em comparação ao GPS de todos os períodos. Nossos 

resultados apontam para uma ação inibitória da diacereína sobre a IL-1β na mucosa gengival 

com periodontite, promovendo redução no infiltrado inflamatório, no número de osteoclastos e 

na imunoexpressão de MMP-8, exercendo papel benéfico na regressão da doença periodontal.  

 

Palavras – chave: Doença periodontal. Citocinas. Metaloproteinases da matriz. Interleucina-

1. Periodontite. 



 

Silva RCL. Effect of diacerein in the treatment of induced periodontal disease in rat molars 

[dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. 

 

ABSTRACT 

 

Periodontitis (PD) is an immunoinflammatory disease that promotes the recruitment of specific 

cells. These cells release mediators, including interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor-alpha 

(TNF-α) and matrix metalloproteinases (MMPs). There is evidence that diacerein, an anti-IL-1 

drug, reduces the production of MMPs and TNF-α. The aim of the present study was to evaluate 

if diacerein accelerates the regression of inflammation and reduces bone loss in induced PD. 

Sixty-six Holtzman male rats were randomly distributed in different groups. Periodontal disease 

was induced for 7 days in the upper right first molar of 42 rats. After 7 days of PD induction, 

12 animals were killed: 6 animals from the control group (CG) and 6 animals from the PG group 

(periodontitis group). Thirty-six rats with PD received 100 mg/kg of diacerein body mass 

(PDG) per gavage or saline solution (PSG) for 7, 15 and 30 days. In each period, 6 animals of 

PDG, PSG and 6 animals without any treatment (healthy periodontium) were killed (CG). After 

euthanasia, fragments of maxilla containing the molars were removed and immediately 

immersed in a 4% formaldehyde solution. After decalcification in 7% EDTA, the fragments 

were processed for paraffin-embedding. From each specimen, non-serial sagittal sections were 

stained with hematoxylin and eosin (HE) for morphological and quantitative analyses of the 

following parameters: volume density of inflammatory cells (VvIC) and fibroblasts (VvFb) in 

the lamina propria of the interdental gingiva, between the 1st and 2nd molars; the distances 

between the junctional epithelium to the cemento-enamel junction (JE-CEJ) and the CEJ to the 

alveolar process crest (CEJ-AP) were measured. The histochemical reaction for tartrate-

resistant acid phosphatase (TRAP), used as an osteoclast marker, was performed and the 

number of TRAP-positive osteoclasts on the alveolar process surface was computed. Moreover, 

the numerical density of IL-1β- and MMP-8-immunopositive cells was obtained. Quantitative 

data were subjected to two-way analysis of variance (two-way ANOVA) and Tukey's post-test 

(p ≤ 0.05); when PG and CG were compared, the non-parametric t Student test was used. The 

results revealed a significant increase in the distances of JE-CEJ and CEJ-AP in the animals of 

PG, PDG and PSG groups compared with the CG; in the CG, the most apical portion of JE was 

situated at the JCE, at all periods. Significant differences in the CEJ-PA and JE-CEJ 

measurements were not detected between the PDG and PSG groups, at all time points. 

Significant reduction in VvIC was observed in diacerein-treated animals compared to the GPS 

group, at all periods. At all periods, no significant difference was detected in the number of 

osteoclasts between the PDG and CG groups. At 7 and 15 days, the number of osteoclasts was 

significantly lower in the PDG than in PSG, while significant difference was not detected at 30 

days. The immunoexpression of IL-1β in PDG specimens was significantly lower than in PSG, 

at all time points. After 15 and 30 days, no significant differences were detected between 

animals of PDG and CG groups. An enhanced immunoexpression of MMP-8 was seen in the 

gingival mucosa of animals with periodontal disease, except at 30 days. In this period, no 

significant difference was detected between animals of PDG and CG groups. The number of 

MMP-8-immunopositive cells was significantly reduced in PDG specimens in comparison with 

PSG, at all periods. Our results point to an inhibitory action of diacerein on IL-1β in the gingival 

mucosa of rat molars with periodontitis, promoting a reduction in the inflammatory infiltrate, 

in the number of osteoclasts and in the immunoexpression of MMP-8, thus playing a beneficial 

role in the regression of periodontal disease. 

 

Keywords:  Periodontal disease. Cytokines. Matrix metalloproteinases. Interleukin-1. 

Periodontitis.  



 

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

%: porcentagem 

< : menor 

=: igual 

> : maior 

≤ : menor ou igual 

≥ : maior ou igual 

°C: graus Celsius 

°GL: graus Gay-Lussac 

µL: microlitro 

µm: micrômetro 

ADAMTS: desintegrina e metaloproteinase com trombospondina 

BSA: albumina sérica bovina 

bw: body weight 

COX: cicloxigenase 

CXCL8: gene para expressão de IL-8 

DAB:3,3-diaminobenzidina 

DP: doença periodontal 

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético 

EJ: epitélio juncional 

Fb: fibroblasto 

FI: fibras interdentárias 

Fig.: figura 

GC: grupo controle, sem tratamento 

GP: grupo com periodontite induzida, sem tratamento 

GPD: grupo com periodontite induzida, tratado com diacereína 

GPS: grupo com periodontite induzida, tratado com solução fisiológica 

HE/H&E: hematoxilina e eosina 

I-CAM1: molécula de adesão intercelular-1 

ICE: enzima conversora de IL-1 

Ig: imunoglobulina 

IgG: imunoglobulina G 

IL-1: interleucina-1 



 

IL-17: interleucina-17 

IL-1R: receptor de IL-1 

IL-1Ra: antagonista de receptor de IL-1 

IL-1α: interleucina-1 alfa 

IL-1β: interleucina-1 beta 

IL-6: interleucina-6 

IL-8: interleucina-8 

iNOS: óxido nítrico sintase 

JCE: junção cemento-esmalte 

kDa: kiloDalton 

LP: ligamento periodontal 

LPS: lipopolissacarídeo 

M: molar ou mol/litro 

MEC: matriz extracelular 

mg: miligrama 

mL: mililitro 

mm: milímetro 

mM: miliMolar 

mm²: milímetro quadrado 

MMP (-1 a -28): metaloproteinases da matriz (variam de 1 a 28) 

NF-κB: fator nuclear kappa B 

OPG: osteoprotegerina 

p: nível de significância 

PA: processo alveolar 

PBS: solução salina com tampão fosfato 

PGE2: prostaglandina E2 

pH: potencial hidrogeniônico 

RANK: receptor ativador do fator nuclear kB 

RANK-L: ligante de RANK 

TIMP: inibidores de metaloproteinases da matriz 

TNF-α: fator de necrose tumoral-alfa 

TRAP: fosfatase ácida resistente ao tartarato 

VCAM-1: proteína de adesão celular vascular-1 

Vv: densidade de volume 



 

VvCI: densidade de volume de células inflamatórias 

VvFb: densidade de volume de fibroblastos 

VvO: densidade de volume de outros componentes 

  



 

SUMÁRIO 

 

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 16 

 

2 PROPOSIÇÃO  .................................................................................................................................... 18 

 

3 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................................... 19 

3.1 Doença Periodontal ........................................................................................................................... 19 

3.1.1 Interleucina-1 .................................................................................................................................. 19 

3.1.2 Fator de necrose tumoral-alfa ...................................................................................................... 20 

3.1.3 Metaloproteinases da matriz  ....................................................................................................... 21 

3.1.4 Reabsorção óssea decorrente da periodontite  ........................................................................... 22 

3.2 Diacereína ........................................................................................................................................... 23 

3.3 Diacereína e Doença Periodontal .................................................................................................... 24  

 

4 MATERIAL E MÉTODO .................................................................................................................. 25 

4.1 Procedimentos Experimentais ......................................................................................................... 25 

4.2 Processamento Laboratorial para Inclusão em Parafina ........................................................... 27 

4.3 Formas de Análise ............................................................................................................................. 28 

4.3.1 Análise morfológica ....................................................................................................................... 28 

4.3.2 Análise morfométrica dos cortes corados com HE ................................................................... 29 

4.3.2.1 Mensuração do nível de inserção do epitélio juncional......................................................... 29  

4.3.2.2 Mensuração no nível da crista do processo alveolar ............................................................. 29 

4.3.2.3 Densidade de volume de células inflamatórias (VvCI) e de fibroblastos (VvFb)  ............ 30  

4.3.3 Osteoclastos TRAP-positivos na superfície óssea...................................................................... 31  

4.3.4 Análise imuno-histoquímica para detecção de IL-1 e MMP-8  .............................................. 32 

4.4 Análise Estatística ............................................................................................................................. 33 

 

5 RESULTADOS  .................................................................................................................................... 34 

5.1 Análises Morfológica e Morfométrica............................................................................................ 34  

5.1.1 Mensuração do nível de inserção do epitélio juncional ............................................................ 37  

5.1.2 Mensuração da distância da junção cemento-esmalte à crista do processo alveolar .........  38 

5.1.3 Densidade de volume de células inflamatórias (VvCI) e de fibroblastos (VvFb) ................ 40 

5.2 Número de Osteoclastos TRAP-positivos ...................................................................................... 43  



 

5.3 Detecção de IL-1β na Mucosa Gengival  ....................................................................................... 49  

5.4 Imunopositividade da MMP-8 na Mucosa Gengival ................................................................... 51 

 

6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 55  

 

7 CONCLUSÃO....................................................................................................................................... 60 

 

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 61 

 

ANEXO A – Certificado de Aprovação pela CEUA ......................................................... 70 

 



16 

 

1 INTRODUÇÃO 

 

As condições patológicas mais comuns que afetam tecidos periodontais desencadeiam 

processos inflamatórios, que afetam, de modo geral, a gengiva e o aparato de inserção, 

ocasionando as doenças periodontais. Dentre elas, a periodontite tem etiologia multifatorial e é 

uma das doenças mais prevalentes em humanos, que leva a reabsorção óssea (ou perda óssea)2-

4. Durante o acúmulo de biofilme subgengival característico da periodontite, inicia-se a resposta 

do hospedeiro ao agente agressor, de modo a liberar citocinas pró-inflamatórias, como 

interleucina-1 (IL-1), IL-6, TNF-α e IL-17, que colaboram para inflamação aguda e crônica, 

além de estimular a liberação de mediadores secundários (como metaloproteinases da matriz - 

MMPs)5,6. 

A IL-1 está envolvida em uma diversidade de mecanismos patogênicos da 

periodontite; sítios com periodontite ativa levam ao aumento nos níveis tanto de IL-1α quanto 

de IL-1β. No entanto, a forma predominante na periodontite é a IL-1β7. Esta interleucina é 

produzida por células como monócitos, macrófagos, neutrófilos, fibroblastos, queratinócitos, 

células epiteliais, células B e osteócitos8,9. Além disso, a IL-1β estimula a secreção da 

quimiocina IL-8, ocasionando o recrutamento de neutrófilos ao sítio10. A IL-1B induz a 

reabsorção óssea via prostaglandina E2 (PGE2), e desempenha um papel importante na resposta 

imunológica adaptativa, controlando células apresentadoras de antígeno, e estimulando 

macrófagos a secretarem IL-6 e, por consequência, ativar linfócitos B9,11. A IL-1β induz à 

formação de osteoclastos, estimula a secreção de MMPs, desencadeando reabsorção óssea 

alveolar e degradação da matriz extracelular do tecido conjuntivo12. 

As MMPs fazem parte de uma família de endopeptidases que contém 28 membros 

(desde MMP-1 até MMP-28), sendo responsáveis pela remodelação tecidual e pelo processo de 

degradação do tecido conjuntivo13. Uma destas enzimas, a MMP-8, também denominada 

colagenase-2, é responsável pela degradação de colágenos dos tipos I, II e III14. Na terapia 

periodontal básica (raspagem e alisamento radicular), é encontrada uma diminuição nos níveis 

de MMP-8 no fluido crevicular, ao passo que bolsas periodontais com risco de destruição 

tecidual irreversível apresentam níveis elevados desta MMP15. Além disso, foi demonstrado 

que níveis de mieloperoxidase, oriunda de neutrófilos (encontrada nos grânulos primários deste 

polimorfonuclear), no fluído crevicular estão relacionados à ativação da MMP-8, estando então 

relacionados à severidade da periodontite16.  Desta maneira, a MMP-8 é uma colagenase 

relevante na patogênese da doença periodontal. 



17 

 

A diacereína17, é um medicamento com efeitos anti-inflamatórios e analgésicos5,18,19. 

Atualmente, é utilizada como abordagem terapêutica em casos como osteoartrite5,20,21, com 

ação sobre a sintomatologia dolorosa e sobre a estrutura da articulação22. Estudos in vitro e in 

vivo têm reportado que este fármaco exerce um papel como inibidor de IL-119,22,23, além de 

possuir efeito inibitório em eventos subsequentes à ação da citocina mencionada, como sobre 

MMPs e NF-kB5. Assim, devido a sua ação anti-inflamatória e anti-reabsortiva, é possível que 

a diacereína possa amenizar os efeitos deletérios promovidos pela doença periodontal. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



18 

 

2 PROPOSIÇÃO 

 

No presente estudo, o objetivo foi investigar se a diacereína acelera a regressão do 

processo inflamatório e inibe a perda óssea, exercendo efeito benéfico no tratamento de molares 

de ratos com doença periodontal induzida. Assim, os objetivos específicos foram investigar se 

a diacereína: 

 

✓ exerce interferência na regressão do processo inflamatório na mucosa gengival; 

✓ inibe a reabsorção do processo alveolar;  

✓ exerce influência sobre a imunoexpressão de IL-1 na mucosa gengival;  

✓ interfere com a imunoexpressão de MMP-8, enzima responsável pela degradação 

dos componentes da matriz extracelular na doença periodontal.  

  



19 

 

3 REVISÃO DE LITERATURA 

3.1 Doença Periodontal 

  

A periodontite é uma condição inflamatória caracterizada pela destruição de estruturas 

de suporte dos dentes, representa um fator modificador da saúde sistêmica, sendo iniciada e 

mantida pelo complexo microbiano derivado do biofilme. Embora seja desencadeada por 

acúmulo de bactérias anaeróbias Gram-negativas subgengivais, tem sido demonstrado que a 

resposta imunoinflamatória contra patógenos resulta em destruição de tecidos moles e 

mineralizados do periodonto de sustentação24,25. O organismo do hospedeiro inicia então uma 

resposta local, recrutando células inflamatórias, liberando enzimas líticas e mediadores 

inflamatórios, como citocinas pró-inflamatórias [interleucina-1 (IL-1), IL-6 e fator de necrose 

tumoral-alfa (TNF-α)] e mediadores secundários [metaloproteinases da matriz (MMPs) e 

prostaglandina E2 (PGE2)]. Em adição ao tratamento periodontal tradicional, a regulação da 

interação imunoinflamatória pode ser uma abordagem potencial para prevenir e tratar doenças 

periodontais5. 

A periodontite é considerada a doença óssea lítica mais prevalente em humanos4, e 

tem etiologia multifatorial; fatores de risco genéticos e ambientais agravam ou auxiliam no 

desencadear da patologia, como idade, microbiota específica do biofilme, tabagismo, diabetes 

mellitus, obesidade, além de fatores psicossociais2,3. Existe então o consenso de que a 

periodontite pode estar associada a condições sistêmicas e que algumas formas da doença 

podem ser refratárias ao tratamento convencional26. 

 

 

3.1.1 Interleucina-1 

 

A subfamília Interleucina-1 (IL-1) engloba: IL-1α, IL-1β, antagonista do receptor de 

IL-1 (IL-1Ra)12,27. IL-1α e IL-1β ligam-se ao receptor de IL-1 (IL-1R), sendo potentes 

interleucinas pró-inflamatórias; ambas são processadas em formas ativas menores e então 

secretadas via retículo endoplasmático/complexo de Golgi-independente, porém os 

mecanismos de secreção proteica não são convencionais e ainda pouco se sabe a respeito28. Esta 

citocina pró-inflamatória é uma das responsáveis pela indução de destruição óssea 

características de uma série de doenças, como artrite reumatoide, doença periodontal e 

osteoartrite29. 



20 

 

A IL-1β é produzida após a pro-1L-1β ser processada pela caspase-1, em terminal-N 

14-kDa (inativo) e terminal-C 17-kDa (forma madura e ativa)28, e ativada pelo complexo 

multiproteico intracelular (inflamassoma)12. A citocina tem papel na inflamação e imunidade, 

essencialmente imunidade inata. A IL-1β induz síntese e secreção de mediadores que 

contribuem para alterações inflamatórias e dano tecidual, como PGE2, fator de ativação das 

plaquetas e óxido nitroso, resultando em maior fluxo sanguíneo para o local de infecção ou 

lesão tecidual. Esta citocina é produzida por monócitos, macrófagos, neutrófilos, além de 

fibroblastos, queratinócitos, células epiteliais, células B e osteócitos8,9. A IL-1β aumenta a 

expressão do ICAM-1 nas células endoteliais e estimula secreção da quimiocina CXCL8 (IL-

8), recrutando neutrófilos aos tecidos afetados. A IL-1β tem sinergia com outras citocinas e 

PGE2 para induzir reabsorção óssea. Além disso, tem seu papel na resposta imune adaptativa, 

desde que controla as células apresentadoras de antígeno (como células dendríticas), estimula 

a secreção de IL-6 por macrófagos (ativando células B), e foi demonstrado que a sinalização 

deste mediador induz respostas mais duradouras e robustas de células CD49,11. Esta interleucina 

também induz a formação de osteoclastos, expressão de MMPs, culminando na reabsorção do 

osso alveolar e degradação do tecido conjuntivo12. Concentrações de IL-1β no fluído crevicular 

são maiores em sítios com gengivite30 e periodontite31. 

Foi demonstrado, em culturas de osteoblastos e células do baço de camundongos, que 

a IL-1 induz indiretamente à osteoclastogênese via síntese de PGE2
32. No entanto, seu papel é 

direto na multinucleação dos osteoclastos33. 

A indução de mediadores primários, como IL-1, estimula a produção de mediadores 

secundários (como MMPs, cicloxigenase - COX e PGE), os quais amplificam a resposta 

inflamatória, promovendo infiltração de células inflamatórias, indução de enzimas que 

degradam tecido conjuntivo e reabsorção óssea alveolar5. Consequentemente, o uso de terapia 

com mediador anti-inflamatório, junto a tratamentos anti-biofilme, pode neutralizar e atenuar a 

progressão da doença. Portanto, a estratégia envolve antagonizar efeitos destrutivos de citocinas 

específicas, propagação da inflamação, perda de tecido conjuntivo, ativação de osteoclastos e 

perda de osso alveolar5. 

 

 

3.1.2 Fator de necrose tumoral-alfa 

  

O TNF-α é um mediador fundamental na doença periodontal e compartilha muitas das 

ações celulares da IL-1β34. Este fator aumenta a atividade neutrofílica, promovendo a 



21 

 

degradação tecidual, aumentando secreção de MMPs, além de estimular osteoclastogênese e 

induzir apoptose de fibroblastos. O TNF-α é secretado por macrófagos ativados e outros tipos 

celulares, particularmente em resposta ao LPS (lipopolissacarídeo) bacteriano. Seus efeitos 

incluem estimulação de células endoteliais para expressar selectina, que facilita recrutamento 

de leucócitos, ativação da produção de IL-1β pelo macrófago e indução da PGE2 pelos 

macrófagos e fibroblastos gengivais35. 

IL-1β e TNF-α regulam expressão de RANKL e OPG (osteoprotegerina), participando 

do processo de remodelação óssea12,36. São consideradas citocinas osteotrópicas, pois 

estimulam a diferenciação de osteoclastos e, por conseguinte, a reabsorção óssea37. Apesar da 

similaridade de atividade com a IL-1β, o TNF-α tem um efeito menos potente sobre os 

osteoclastos e está presente em níveis mais baixos que a IL-1β nos tecidos gengivais 

inflamados38. Desta forma, a importância do TNF-α na patogênese da doença periodontal é 

evidente. Antagonistas de IL-1β e TNF-α causam redução de 80% no recrutamento de células 

inflamatórias nas proximidades do osso alveolar e 60% na perda óssea39. Além disso, foi 

evidenciada correlação positiva entre severidade da periodontite e concentração da IL-1β no 

fluído gengival40. 

 

 

3.1.3 Metaloproteinases da matriz  

 

O ligamento periodontal é um dos tecidos de maior atividade metabólica, sendo que 

maior parte desta atividade está na remodelação de componentes da matriz extracelular (MEC). 

A razão para isso está na capacidade de adaptação às forças oclusais durante a função. A 

remodelação dos componentes da MEC envolve diversas enzimas, incluindo as MMPs25,41. 

As MMPs são uma família de enzimas dependentes do zinco capazes de degradar 

moléculas da matriz extracelular, incluindo colágeno42,43. As MMPs desempenham função na 

degradação de componentes, particularmente proteínas da MEC, e são secretadas pela maioria 

dos tipos de células do periodonto: fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, 

osteoclastos, neutrófilos e macrófagos41,44. 

A transcrição de genes que codificam as MMPs é suprarregulada por citocinas, como 

IL-1β e TNF-α44. TIMPs (inibidores de metaloproteinases da matriz) produzidos por 

macrófagos, fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais) são inibidores específicos que se 

ligam às MMPs em proporção 1:145. Nos tecidos periodontais sadios, existe um processo 

controlado de homeostase do colágeno, mediado extracelularmente pela MMP-1 (expressa por 



22 

 

células residentes, em maior parte fibroblastos) e intracelularmente por enzimas lisossômicas. 

Nos tecidos periodontais inflamados, há quantidades excessivas de MMPs secretadas por 

células residentes e células do infiltrado inflamatório (particularmente, neutrófilos). O 

rompimento no equilíbrio entre MMPs e seus inibidores resulta na degradação da matriz de 

tecido42,46. 

Na periodontite, as enzimas secretadas por neutrófilos são predominantemente MMP-

8 e -947, envolvidas na degradação do colágeno tipo I, o mais abundante do ligamento 

periodontal48. Foi demonstrado que níveis destas enzimas aumentam com o agravamento da 

doença periodontal e diminuem após tratamento47,49. Os sinais clínicos da doença tendem a 

aparecer com a liberação excessiva e prolongada destas enzimas, destruindo componentes 

estruturais do tecido conjuntivo27. 

Desta forma, MMPs exercem fundamental papel na homeostase do tecido conjuntivo 

e na patogênese das doenças periodontais, além de possuírem ampla gama de efeitos de 

importância na periodontite. Estas enzimas são relevantes no processo de destruição do osso 

alveolar, sendo expressas por osteoclastos27,41 e são fundamentais para acesso do osteoclasto ao 

sítio de reabsorção, particularmente MMP-950 e MMP-1451. A MMP-14 está na borda em 

escova dos osteoclastos, enquanto osteoblastos e osteócitos expressam MMP-13, a qual atua 

nas superfícies previamente reabsorvidas removendo restos de colágeno52. 

 

 

3.1.4 Reabsorção óssea decorrente da periodontite  

 

A reabsorção do processo alveolar ocorre simultaneamente à degradação do ligamento 

periodontal na periodontite34. Osteoclastos são células gigantes multinucleadas, ativadas por 

uma série de mediadores, como IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2
53.  

Avanços na biologia óssea têm demonstrado que a reabsorção óssea é regulada pela 

interação de um sistema de citocinas pertencentes às superfamílias de ligante e receptor do fator 

de necrose tumoral, que compreende o sistema de osteoclastogênese RANK/RANKL/OPG54-

56. Além disso, células imunológicas expressam as três moléculas mencionadas, e acredita-se 

que o eixo RANK/RANKL/OPG está associado à regulação de respostas inflamatórias e 

imunes57. RANK é um receptor de superfície celular expresso por células progenitoras de 

osteoclasto e osteoclastos maduros54. O RANKL, ligante do RANK, é expresso por células 

estromais da medula óssea, osteoblastos, osteócitos e fibroblastos, além de células B e T 

estimuladas por citocinas e LPS bacteriano54,56. A ligação RANK-RANKL resulta em 



23 

 

diferenciação e ativação de osteoclastos e, consequentemente, reabsorção óssea. A OPG 

(osteoprotegerina) é produzida por células estromais da medula óssea, osteoblastos e 

fibroblastos54, sendo solúvel e circulante; esta glicoproteína atua como “receptor decoy” do 

RANKL, portanto, interferindo na interação RANK-RANKL55,56. 

Na reabsorção óssea fisiológica, o equilíbrio entre atividades de osteoblastos e 

osteoclastos é essencial para que a integridade óssea seja mantida55,58. Enquanto RANKL 

promove ativação e diferenciação de osteoclastos, a OPG inibe diferenciação dos 

osteoclastos24,54. Em condições patológicas, tal equilíbrio é prejudicado, levando a predomínio 

do processo de reabsorção sobre o de formação óssea24,58. A formação excessiva de osteoclastos 

é observada em doenças inflamatórias crônicas, como periodontite24,25,37, na qual proporções 

de RANKL:OPG no fluído crevicular59 e mucosa gengival24 são mais altas em comparação ao 

periodonto saudável. Desta maneira, é claro o envolvimento destes componentes na patogênese 

periodontal24,36. 

 

 

3.2 Diacereína 

 

A diacereína, comercializada como “Artrodar®”17, é um derivado purificado de 

antraquinona descoberto em plantas com propriedades anti-inflamatórias e analgésicas5,18,19. 

Esta droga é metabolizada no fígado e filtrada nos rins60 e sua ação tem sido observada, 

principalmente, em processos inflamatórios em articulações. Por esta razão, é aplicada no 

tratamento de osteoartrite, atuando com moderado efeito anti-inflamatório e antipirético, além 

de efeitos antiartríticos5,20,21. Sugere-se que seu efeito seja tanto sobre a sintomatologia dolorosa 

da artrite quanto sobre a estrutura articular22. 

O fármaco é metabolizado, nos animais e humanos23,61, em reína (ácido 4,5-di-hidroxi-

9,10-dioxo-9,10-di-hidroantraceno-2-carboxílico) por acetilação no fígado. Há evidências, in 

vivo e in vitro, de que este componente reduz a degeneração da cartilagem, inibindo síntese de 

IL-1β e, consequentemente, reduzindo ativação de MMPs62,63. Além disso, foi demonstrado in 

vivo que regula produção de MMPs (retroalimentação negativa), e a produção de inibidores de 

MMP-1 (retroalimentação positiva) em condrócitos articulares64. Seu mecanismo de ação não 

foi completamente identificado, mas sabe-se que não inibe síntese de COX (e de 

prostaglandinas, por consequência), como anti-inflamatórios não esteroidais23. Estudos têm 

demonstrado que a diacereína possui potencial efeito anti-inflamatório por inibir síntese e 

atividade de citocinas como TNF-α, IL-6 e IL-1 em monócitos humanos20,21. 



24 

 

A diacereína reprime a síntese de IL-1 e seus eventos subsequentes, incluindo das 

enzimas induzíveis iNOS, estromelinisina-1, colagenase, MMPs-1, -3, -9 e -13 e suas 

atividades, um domínio de desintegrina e metaloproteinase com padrões de trombospondina 

(ADAMTS), através da inibição de cascatas intracelulares de NF-kB ou MAP quinases. Além 

disso, a diacereína afeta a ativação da IL-1, devido à inibição da enzima conversora de IL-1 

(ICE)5. Foi demonstrado in vitro que a diacereína tem como principal mecanismo de ação a 

inibição da IL-1β, mostrando impacto sobre essa citocina por reduzir a concentração da ICE, 

assim como aumentou a sensibilidade a IL-1 por diminuir níveis de receptores na superfície 

celular de condrócitos e, indiretamente, aumentar a produção do antagonista do receptor de IL-

1 (IL-1Ra)19. 

Os efeitos farmacológicos da diacereína também interferem na quimiotaxia e 

fagocitose de células imunes, supressão da diferenciação de osteoclastos pelo bloqueio de IL-

1β, e redução da síntese de fatores de reabsorção em termos de modulação da proporção 

RANKL/OPG. Além disso, a diacereína reduz a produção de IL-6 em osteoblastos subcondrais 

de osso humano, contribuindo para modular remodelação óssea em articulações5. 

O efeito anti-inflamatório da diacereína pode ser devido, parcialmente, à inibição da 

produção de espécies de oxigênio reativo, baseando-se em inibição da ativação de neutrófilos. 

Além disso, inibe a produção de IL-1 (in vivo e in vitro). Em suma, é provável que a droga 

module a resposta inflamatória interferindo com diversas vias de sinalização22,23,61. 

 

 

3.3 Diacereína e Doença Periodontal  

Até o momento, não há relatos descrevendo efeitos terapêuticos da diacereína para 

doenças periodontais, porém é possível que a medicação possa modular este processo, 

considerando a sua interferência, particularmente, sobre a IL-1 e MMPs, mediadores que 

desempenham importante papel na complexa série de eventos moleculares envolvidos na 

instalação da doença periodontal. Recentemente, fatores do hospedeiro ligados à destruição do 

tecido periodontal têm sido investigados como promissores alvos da terapêutica para inibir a 

progressão da doença5. Portanto, é provável que a diacereína possa ter um importante papel 

terapêutico no tratamento da doença periodontal. 

  



25 

 

4 MATERIAL E MÉTODO 

 

4.1 Procedimentos Experimentais 

 Este protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais 

(CEUA, Processo número 17/2018 – Anexo A). Foram utilizados 66 ratos (Ratus norvegicus 

albinus, Holtzman), adultos, com peso aproximado de 250 gramas, oriundos do Biotério da 

Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP. Os animais foram mantidos em temperatura 

(23±2°C) e umidade (55±10%) controladas, com fotoperíodo das 7h00 às 19h00 (12h claro, 

12h escuro) e sob regime hídrico e alimentar ad libitum. Os animais foram distribuídos 

randomicamente entre os grupos.   

A doença periodontal (DP) foi induzida com inserção de uma ligadura (fio de algodão 

n°40) no colo cervical do primeiro molar superior direito. Os ratos foram anestesiados com 0,08 

mL/100 g de cloridrato de cetamina a 10% (Cetamin®, Syntec do Brasil Ltda. Santana de 

Parnaíba, SP - Brasil) adicionando-se cloridrato de xilazina a 2% (Xilazin®, Syntec do Brasil 

Ltda.  Santana de Parnaíba, SP - Brasil) na dosagem de 0,04 mL/100 g por via intraperitonial, 

utilizando-se seringa e agulha de insulina. Os animais anestesiados foram posicionados em 

decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica; a mandíbula e a maxila foram mantidas fixas com 

auxílio de argolas da mesa cirúrgica (Figuras 1A e 1B). Com a maxila e mandíbula fixas, o fio 

de algodão foi inserido no primeiro molar superior direito e mantido por 7 dias (Figuras 1C e 

1D). Após este período, a ligadura foi removida (Figura 1E).   

Os animais foram pesados uma vez na semana, sempre no mesmo dia, para verificar 

se houve perda de massa corporal; este procedimento foi realizado como meio de monitorar o 

animal durante o experimento, bem como para ajuste da dose de diacereína e solução salina. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



26 

 

Figura 1 – Procedimentos cirúrgicos  

Fotografias mostrando os 
procedimentos cirúrgicos. Figs. 

1A e 1B - ilustram a mesa 

cirúrgica com o animal 
posicionado e os incisivos 
superiores e inferiores presos por 
argolas metálicas, mantendo a 
boca do rato aberta. Fig. 1C – 
mostra o fio de algodão ao redor 
do colo cervical do primeiro 

molar superior direito, logo após 
sua inserção. Fig. 1D – evidencia 
o fio de algodão, anteriormente 
posicionado, agora situado no 
nível subgengival. Fig. 1E – 
mostra o sangramento marginal 

logo após a remoção da ligadura. 

  

 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

No sétimo dia à colocação da ligadura, os animais foram anestesiados com 0,08 mL 

de cloridrato de cetamina a 10% para cada 100 g de peso corpóreo e 0,04 mL de cloridrato de 

xilazina a 2% para cada 100 g de peso do rato administrada por via intraperitoneal com uso de 

agulha e seringa de insulina; após analgesia, a ligadura foi removida. Neste momento, 6 animais 

com DP alocados no grupo periodontite (GP) e 6 animais sem DP, ou seja, grupo controle (GC) 

foram sacrificados. Imediatamente após a remoção das ligaduras, 36 animais com DP foram 

distribuídos aleatoriamente em dois grupos: GPD - grupo tratado com 100 mg/kg de peso 

corporal (bw) de diacereína17 administrada diariamente e grupo GPS – animais que receberam 

solução fisiológica estéril (cloreto de sódio 0,9%). A dose de 100 mg/Kg de bw foi baseada 

num estudo que demonstrou o efeito da diacereína sobre citocinas envolvidas com atividade 

osteoclástica18. A diacereína e a solução fisiológica foram administradas por gavagem usando 

uma cânula de aço inox para ratos com 54 mm de comprimento, 1,2 mm de diâmetro e esfera 

de 2,3 mm (BD-12, Ribeirão Preto-SP, Brasil) acoplada a uma seringa de insulina. Os ratos 

foram tratados durante 7, 15 e 30 dias após a remoção da ligadura. Em cada período, 18 animais 

foram sacrificados, portanto, 6 animais em cada grupo: GPD, GPS e GC (grupo controle, sem 

tratamento), de acordo com o organograma ilustrado na Figura 2. 

 

1A 1B 

1C 1D 1E 



27 

 

A eutanásia dos animais de cada período foi realizada 24 horas após a última aplicação 

de diacereína ou solução salina com sobredose (aproximadamente, 3 vezes a dose utilizada para 

anestesia) de anestésico (cloridrato de cetamina a 10% e cloridrato de xilazina a 2%) por via 

intraperitoneal. Fragmentos da maxila foram então removidos e, imediatamente, fixados. 

 

Figura 2 – Modelo experimental 

 

 

Organograma do modelo experimental mostrando a cronologia do ensaio e seus períodos. O dia -7 

corresponde ao momento da inserção da ligadura no colo cervical do primeiro molar dos animais em 
GP, GPS e GPD. O período transcorrido entre -7 e Dia 0 (ou seja, 7 dias) corresponde à indução da 
doença periodontal pelo fio de algodão mantido no primeiro molar dos ratos dos grupos com DP. No 
Dia 0, as ligaduras foram removidas e animais do GP foram sacrificados; os animais dos grupos GPD 
começaram a ter a diacereína administrada enquanto os animais do GPS começaram a receber solução 
salina durante 7, 15 e 30 dias. No Dia 7, GC-7d, GPD-7d e GPS-7d foram sacrificados, assim como GC-
15d, GPD-15d e GPS-15d foram sacrificados após 15 dias de tratamento, e no Dia 30 GC-30d, GPD-

30d e GPS-30d. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

4.2 Processamento Laboratorial para Inclusão em Parafina 

Os fragmentos das maxilas do lado direito foram removidos e, imediatamente, imersos 

na solução de formaldeído a 4% (preparado a partir do paraformaldeído) contendo 0,1 M de 

fosfato de sódio com pH 7,2, durante 72 horas. Após fixação, foi realizada descalcificação em 

solução de ácido etileno-diamino-tetracético (EDTA) a 7%, contendo 0,5% de formaldeído, 

tamponada com fosfato de sódio 0,1 M e pH 7,2. A descalcificação foi realizada com auxílio 

de um micro-ondas de laboratório (BioWave® Pro, PELCO), com temperatura de 28º C e 



28 

 

potência de 300 watts, durante aproximadamente 32 horas; a solução de EDTA foi trocada a 

cada 8 horas. Subsequentemente, os fragmentos da maxila foram desidratados em 

concentrações crescentes de etanol, a partir da solução 70º GL até etanol absoluto. Após 

diafanização, os fragmentos foram imersos em parafina líquida no interior de uma estufa (58-

60º C), durante 4 horas, com 2 trocas de parafina. Então, os fragmentos imersos em parafina 

líquida foram levados para a estufa à vácuo (SVAC2 Shel Lab Vacuum Oven 1.67 CU.FT., 

Santa Ana, CA, Estados Unidos da América) onde permaneceram, aproximadamente, durante 

1 hora. Subsequentemente procedeu-se a inclusão dos fragmentos de maxila de maneira a 

possibilitar a obtenção de cortes sagitais (de vestibular para palatino). Após a inclusão, a 

microtomia foi realizada com auxílio de micrótomo (Micron, modelo HM 325) e navalhas de 

aço descartáveis (Leica 818, Leica Biosystems; Germany). Os cortes sagitais com 6 μm de 

espessura foram aderidos às lâminas de vidro; de cada bloco obteve-se, aproximadamente, 50 

cortes. Cortes não seriados, com distância mínima de 100 µm, foram corados com Hematoxilina 

& Eosina (H&E) para análise morfológica e morfométrica dos seguintes parâmetros: densidade 

de volume (Vv) de células inflamatórias (VvCI) e de fibroblastos (VvFb), nível de inserção do 

epitélio juncional e mensuração da crista do processo alveolar. A reação histoquímica para 

detecção da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) foi realizada nos cortes de maxilas 

para obtenção do número de osteoclastos na superfície óssea. Cortes aderidos às lâminas 

silanizadas foram submetidos às reações imuno-histoquímicas para detecção de IL-1 e MMP-

8. As análises foram realizadas por um examinador calibrado e as mensurações foram repetidas 

(foram realizadas em duplicata), com um intervalo mínimo de 4 semanas.  

 

 

4.3 Formas de Análise 

4.3.1 Análise morfológica 

A partir dos cortes corados com H&E, fragmentos de maxila contendo o primeiro 

molar foram analisados considerando os seguintes parâmetros: presença de células 

inflamatórias e extensão do processo inflamatório, organização dos feixes de fibras colágenas, 

presença de osteoclastos na superfície do osso alveolar, número de osteoclastos positivos ao 

TRAP (Tartrate Resistant Acid Phosphate), forma da gengiva interdentária e nível de inserção 

do epitélio juncional. 

 

 

 



29 

 

4.3.2 Análise morfométrica dos cortes corados com HE 

 Esta análise foi conduzida com auxílio de um microscópio de luz Olympus (modelo 

BX-51, Olympus, Tokyo, Japão) contendo uma câmera digital (DP-71, Olympus, Japão) para 

captura das imagens. As análises quantitativas foram realizadas com um sistema de análise de 

imagem da Olympus (programa Image-Pro Express 6.0, Olympus, Japão).  

 

 

4.3.2.1 Mensuração do nível de inserção do epitélio juncional  

Esta mensuração foi realizada a partir da distância da porção mais apical do epitélio 

juncional (EJ) até a junção cemento-esmalte (JCE)24. Foram utilizados três cortes/animal, com 

intervalo mínimo de 100 µm entre eles; as mensurações foram realizadas na região distal do 

primeiro molar superior. As imagens da gengiva interdentária foram capturadas usando a 

objetiva de 4x. Com o programa de análise de imagem foi traçada uma linha entre o término 

mais apical do EJ até a JCE. Esta linha foi considerada como o índice de retração gengival; 

quando o término do epitélio juncional estava situado junto ao JCE, a distância foi considerada 

como sendo zero. A partir das medidas realizadas nos três cortes/animal foi obtida uma 

média/animal. 

 

 

4.3.2.2 Mensuração no nível da crista do processo alveolar  

Os dados foram obtidos dos 6 (seis) animais de cada grupo, de todos os períodos. A 

mensuração da altura do processo alveolar foi realizada a partir da distância da junção cemento-

esmalte (JCE) até a região da crista óssea (PA)24. As mensurações foram realizadas na região 

distal do primeiro molar, ou seja, processo alveolar interdentário (entre primeiro e segundo 

molares). Em cada animal, foram mensurados três cortes não seriados, com intervalo mínimo 

de 100 µm entre eles. Inicialmente, as imagens da região mostrando a crista do processo 

alveolar interdentário e a superfície dentária com a JCE foram capturadas em 4x. Com o 

programa de análise de imagens, foi traçada uma linha entre crista alveolar e junção cemento-

esmalte, determinando-se assim a distância JCE-PA. A partir das medidas realizadas nos três 

cortes/animal foi obtida uma média/animal. 

 

 

 

 



30 

 

4.3.2.3 Densidade de volume de células inflamatórias (VvCI) e de fibroblastos (VvFb)  

Para avaliar a extensão do processo inflamatório, a proporção entre células 

inflamatórias (VvCI) e fibroblastos (VvFb) na lâmina própria da mucosa da gengiva 

interdentária, entre 1º. e 2º. molares, foi estimada nos 6 animais de cada grupo, de todos os 

períodos. Em cada animal, três cortes não seriados, mantendo-se intervalo mínimo de 100 μm 

entre os cortes, foram quantificados. Em cada corte, uma imagem foi capturada em aumento de 

100x; estas imagens foram obtidas a partir da interface epitélio-lâmina própria, ou seja, do 

tecido conjuntivo subepitelial.  Posteriormente, a imagem foi “aberta” no programa de análise 

de imagens, foi realizada a calibração da imagem e, subsequentemente, um sistema teste 

reticulado contendo 208 pontos foi sobreposto a imagem. As células inflamatórias (exibindo 

núcleo lobulado, irregular ou esférico com cromatina basófila) e fibroblastos (células 

fusiformes exibindo núcleo elíptico com cromatina frouxa) que incidiram sob os pontos de 

intersecção foram computados, como descrito previamente24; vasos sanguíneos, fibras 

colágenas e espaços na matriz extracelular foram considerados como outros componentes 

(VvO), conforme ilustrado na Figura 3. 

 

Figura 3 – Contagem de células inflamatórias e fibroblastos 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Print screen da tela do computador de uma imagem da lâmina própria da mucosa gengival capturada 
com a objetiva de 100x. Usando o programa de análise de imagem (Image-Pro Express 6.0, Olympus), 
a imagem previamente capturada foi aberta e, após a calibração, um sistema teste (grade reticular) 

contendo 208 intersecções/pontos foi sobreposto à imagem. As intersecções incidentes sobre as células 
inflamatórias (setas verdes) e fibroblastos (setas vermelhas) foram computadas, enquanto os demais 
componentes (vasos sanguíneos, matriz extracelular, espaços dentre outros) incidentes sobre os pontos 
das interseções foram computados como outras estruturas (VvO). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

3 



31 

 

4.3.3 Osteoclastos TRAP-positivos na superfície óssea  

Como a diacereína apresenta efeito anti-IL-1, citocina envolvida com a 

osteoclastogênese, a distribuição e o número de osteoclastos foram avaliados na superfície do 

processo alveolar. 

Para identificar os osteoclastos, foi utilizado o método do TRAP65. Este método é 

baseado na detecção da enzima fosfatase ácida resistente ao tartarato, presente em osteoclastos. 

Os cortes foram incubados em solução preparada no momento do uso, usando o protocolo 

descrito por Faloni et al66. Resumidamente, preparou-se 50 mL de tampão acetato de sódio 0,2 

M com pH ajustado para 5,0-5,2. Neste tampão foi adicionado 70 mg de Fast Red Salt TR 

(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) que foi dissolvido com auxílio de um agitador. A 

esta solução, adicionou-se 8 mg de naftol AS-BI fosfato (Sigma Chemical Company, St. Louis, 

MO) previamente dissolvido em 500 μL de N-N-dimetilformamida. A solução de aspecto 

“leitoso” foi agitada até se tornar homogênea e, então, foi adicionado 50 mM de tartarato de 

sódio. Após o tartarato de sódio ter sido dissolvido, a solução foi filtrada. Os cortes foram 

incubados em estufa a 37° C durante, aproximadamente, 4 horas. Subsequentemente, os cortes 

foram lavados em água destilada, contracorados com hematoxilina de Carazzi e montados em 

meio aquoso. Como controle de especificidade, alguns cortes foram incubados na ausência do 

substrato (naftol AS-BI). 

O número de osteoclastos na superfície do osso alveolar ao redor do primeiro molar 

foi estimado usando a metodologia previamente descrita50,66-68. Brevemente, foram 

quantificados 2 cortes não seriados por animal, com intervalo mínimo de 100 μm entre os cortes. 

Imagens do processo alveolar do 1º molar (da mesial à região distal) foram capturadas com a 

objetiva de 4x (aumento final de 65x), possibilitando a visualização completa da região; quando 

necessário, foram capturadas duas imagens de cada dente para se ter toda a extensão do processo 

alveolar. Cada imagem capturada foi aberta no sistema de análise de imagem e após a calibração 

do sistema, a superfície óssea correspondente ao primeiro molar superior foi delimitada e o 

programa forneceu a medida. Subsequentemente, com auxílio de microscópio de luz em 

aumento de 40x, foi realizada contagem dos osteoclastos TRAP-positivos exibindo, no mínimo, 

dois núcleos, situados na superfície alveolar previamente mensurada. Dessa maneira, foi obtida 

uma estimativa do número de osteoclastos/mm de superfície óssea. Os resultados foram 

submetidos à análise estatística a fim de verificar se houve diferença significante entre os 

diferentes grupos e períodos. 

 

 



32 

 

4.3.4 Análise imuno-histoquímica para detecção de IL-1 e MMP-8  

Considerando que a diacereína é um anti-IL-1, foi avaliado se o fármaco administrado 

sistemicamente interfere na imunoexpressão desta citocina na mucosa gengival. Além disso, 

avaliamos se a diacereína altera a imunoexpressão de MMP-8 após remoção da ligadura e, 

consequentemente, exerce algum papel benéfico na reparação dos tecidos periodontais. Os 

cortes aderidos às lâminas silanizadas foram desparafinados, hidratados e imersos em peróxido 

de hidrogênio a 5% para inativação da peroxidase endógena. Após lavagem em tampão fosfato 

de sódio com cloreto de sódio (PBS) com pH ajustado para 7,2, os cortes foram, então, 

submetidos ao tratamento em micro-ondas, por aproximadamente 30 minutos a temperatura de 

98ºC. Após o resfriamento, os cortes foram lavados em tampão PBS e, subsequentemente, 

incubados com soro bovino a 2% (BSA) por 20 minutos, para evitar a inespecificidade. Os 

cortes foram incubados em anticorpo primário anti-IL-1β produzido em coelho (1:400; Abcam, 

Cambridge, Massachusetts – EUA; código: ab9722) ou anticorpo primário anti-MMP-8 

produzido em coelho (1:450; Abcam, Cambridge, Massachusetts – EUA; código: ab53017) 

durante 16 horas a 4ºC. Em seguida, os cortes foram lavados em tampão PBS e incubados com 

o sistema de polímeros com peroxidase e conjugados com imunoglobulinas (IgG) anti-

camundongo e anti-coelho (Dako EnVision + Dual Link System-HRP, K4061; Santa Clara, 

California - EUA) por 1h, e então lavados com tampão PBS; a atividade da peroxidase foi 

revelada com solução de 3.3-diaminobenzidina (ImmPACTTM DAB Vector, Burlingame, CA, 

USA), durante 2 minutos. Subsequentemente, os cortes foram lavados e contracorados com 

hematoxilina. No controle negativo, o anticorpo primário foi substituído por soro não imune, e 

os cortes foram submetidos às mesmas etapas que àqueles incubados com os anticorpos 

primários.  

 

Em cada corte contendo os molares, foi capturada uma área padronizada (0,015 mm2) 

da lâmina própria da mucosa gengival interdentária (entre 1o e 2o molares), utilizando o 

microscópio Olympus (modelo BX-51) em aumento de 100x. Com auxílio do programa de 

análise de imagens, foi computado o total de células imunopositivas em cada área. A densidade 

numérica de células imunopositivas (IL-1-positivas e MMP-8-positivas) foi obtida dividindo-

se o número total de células pela área, obtendo-se, assim, o número de células 

imunopositivas/mm2. Ao final, foi estabelecida uma média para cada grupo nos diferentes 

períodos.  

 

 



33 

 

4.4 Análise Estatística  

Os resultados quantitativos dos parâmetros analisados foram submetidos à análise de 

variância de dois fatores (two-way ANOVA) e pós-teste de Tukey; com nível de significância 

de p ≤ 0,05. Para os grupos sem tratamento utilizados como parâmetro para indução ou não da 

doença periodontal (GP e GC), foi aplicado o teste t de Student - não paramétrico, também com 

nível de significância de p ≤ 0,05. 

  



34 

 

5 RESULTADOS  

 

5.1 Análises Morfológica e Morfométrica  

 

ANÁLISE MORFOLÓGICA 

O periodonto da região interproximal, entre primeiro e segundo molares superiores 

direitos, do GC (Figura 4A) exibiu processo alveolar estendendo-se até o terço cervical das 

raízes dos molares. A papila interdentária apresentou formato piramidal e o epitélio juncional 

com sua inserção apical coincidente ao limite cemento-esmalte. A lâmina própria da mucosa 

gengival dos molares do GC continha algumas células inflamatórias, principalmente nas regiões 

próximas à interface epitélio-conjuntivo (Figura 4B). Em contraposição, nos molares do grupo 

GP a porção mais apical do epitélio juncional estava, invariavelmente, justaposta ao cemento 

acelular do terço médio radicular, ou seja, situava-se aquém da junção cemento-esmalte. Além 

disso, a porção mais cervical do processo alveolar alcançava o terço médio das raízes (Figura 

4C). Na lâmina própria da mucosa gengival do GP, diversas células inflamatórias foram 

observadas entre fibroblastos (Figura 4D).  

Alterações morfológicas significativas não foram observadas nos tecidos periodontais 

dos molares do GC, com o decorrer dos períodos. Dessa maneira, a papila interdentária manteve 

seu formato piramidal, o término do epitélio juncional coincidia com a junção cemento-esmalte 

e a crista do processo alveolar estava ligeiramente aquém do término do epitélio juncional 

(Figuras 5A, 5D e 5G).  Em todos os períodos, os grupos GPD (Figuras 5B, 5E e 5H) e GPS 

(Figuras 5C, 5F e 5I) exibiram o término do epitélio juncional situado aquém da junção 

cemento-esmalte, justaposto à superfície do cemento acelular. Evidente perda óssea no processo 

alveolar interdentário foi observada; assim, a porção mais cervical do processo alveolar estava 

situada frequentemente junto ao terço médio das raízes. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



35 

 

Figura 4 – Fotomicrografias de cortes em H&E (GC e GP) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figuras 4A-4D - Fotomicrografias de cortes sagitais de molares de ratos dos grupos controle (GC) e 
com doença periodontal (GP). Figs. 4A e 4B (GC) - a Fig. 4A mostra a região interproximal, entre 

primeiro e segundo molares. Note que o a porção mais apical do epitélio juncional (EJ) é coincidente à 
junção cemento-esmalte (JCE) e a crista do processo alveolar (PA) atinge o terço cervical das raízes. 
Fig. 4B – detalhe da área delimitada em 4A, uma porção da lâmina própria da mucosa gengival, 
mostrando algumas células inflamatórias (setas) e fibroblastos (Fb). EJ, epitélio juncional. Figs. 4C e 

4D (GP) – Em 4C, região interproximal entre primeiro e segundo molares, a porção mais apical do 
epitélio juncional (EJ) está situado aquém da junção cemento-esmalte (JCE). Na Fig. 4D, área 
demarcada em 4C, diversas células inflamatórias (setas), principalmente neutrófilos e macrófagos são 
observados na lâmina própria, entre os fibroblastos (Fb). H&E. Figs. 4A e 4C: 28x; Figs. 4B e 4D: 575x. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

 

 



36 

 

Figura 5 – Fotomicrografias em menor aumento de cortes em H&E (GC, GPD e GPS) 

Figuras 5A-5I - Fotomicrografias de cortes sagitais de molares de ratos dos grupos controle (GC), com 

doença periodontal tratados com a diacereína (GPD) e com doença periodontal tratados com solução 
salina (GPS) durante 7, 15 e 30 dias. As fotomicrografias mostram a região interproximal, entre primeiro 
e segundo molares superiores do lado direito. Figs. 5A, 5D e 5G - No GC, a porção mais apical do 
epitélio juncional (EJ) é coincidente à junção cemento-esmalte (JCE) e a crista do processo alveolar 
(PA) está situada subjacente à mucosa gengival, no terço cervical das raízes. Figs. 5B, 5C, 5E, 5F, 5H 

e 5I – Nos grupos com doença periodontal tratados com diacereína ou solução fisiológica o término do 
epitélio juncional (EJ) está localizado aquém da junção cemento-esmalte (JCE) e a porção mais cervical 
do processo alveolar (PA) está na situado no terço médio das raízes. H&E. 28x. 
 

Fonte: Elaboração da autora. 



37 

 

5.1.1 Mensuração do nível de inserção do epitélio juncional  

De acordo com a Figura 6, no GC o término do epitélio juncional estava situado na 

junção cemento-esmalte, sendo, portanto, atribuído o valor zero à distância EJ-JCE. No grupo 

GP, a porção mais apical do epitélio juncional estava aquém da junção cemento-esmalte, 

possuindo diferença estatística significante em relação a GC (p < 0,0001).  

Em todos os períodos, o término do epitélio juncional estava situado na junção 

cemento-esmalte dos molares do GC (Figura 7). Em todos os períodos, a porção mais apical do 

epitélio juncional dos molares nos grupos GPD e GPS apresentou-se aquém da junção cemento-

esmalte, com diferença significante em comparação ao GC (p < 0,0001). Em contrapartida, 

GPD e GPS não possuíram diferença estatisticamente significante aos 7 (p = 0,0528), 15 (p = 

0,6556) e após 30 (p = 0,9999) dias de tratamento. Além disso, não houve diferença significante 

em nenhum dos grupos ao longo do tempo. 

 

Figura 6 – Distância do epitélio juncional à junção cemento-esmalte  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
Mensuração (em micrômetros) da distância do nível de inserção do epitélio juncional em relação à 
junção cemento-esmalte (EJ-JCE) do periodonto de ratos dos grupos GC e GP. 
a = diferença significante em relação a GC (teste não paramétrico t Student; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

 

 

 

 



38 

 

Figura 7 - Distância do epitélio juncional à junção cemento-esmalte  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mensuração (em micrômetros) da distância do nível de inserção do epitélio juncional em relação à 

junção cemento-esmalte (EJ-JCE) do periodonto de ratos dos grupos GC, GPD e GPS, aos 7, 15 e 30 
dias de tratamento. 
A comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 
gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

5.1.2 Mensuração da distância da junção cemento-esmalte à crista do processo alveolar  

Como pode-se observar na Figura 8, GP demonstrou um aumento significante na 

distância linear entre junção cemento-esmalte e processo alveolar (JCE-PA), quando 

comparado a GC (p < 0,0001).  

A análise dos dados obtidos com o tratamento (Figura 9) revelou que, em todos os 

períodos, os grupos GPD e GPS exibiram valores significantemente maiores da distância PA-

JCE em comparação aos do grupo GC diferenças significantes em relação ao grupo GC (p ≤ 

0,0062). Diferenças significantes não foram detectadas entre os grupos GPD e GPS aos 7 (p = 

0,7937), 15 (p = 0,5259) e 30 (p = 0,3395) dias. Com o decorrer do tempo de tratamento, GPD 

apresentou uma diminuição significante de 7 para 15 dias (p = 0,0029) e de 7 para 30 dias (p = 

0,0178) enquanto, de 15 para 30 dias, nenhuma diferença significante foi detectada (p = 

0,7881). Os grupos GPS e GC não tiveram alterações estatisticamente significantes em relação 

ao tempo de tratamento. 

 



39 

 

Figura 8 - Distância da junção cemento-esmalte à crista óssea do processo alveolar  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mensuração (em micrômetros) da distância da crista óssea do processo alveolar em relação à junção 
cemento-esmalte (JCE-PA) do periodonto de ratos dos grupos GC e GP.  
a = diferença significante em relação a GC (teste não paramétrico t Student; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

Figura 9 -Distância da junção cemento-esmalte à crista óssea do processo alveolar  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mensuração (em micrômetros) da distância da crista óssea do processo alveolar em relação à junção 

cemento-esmalte (JCE-PA) do periodonto de ratos dos grupos GC, GPD e GPS aos 7, 15 e 30 dias. 
A comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 
gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 



40 

 

5.1.3 Densidade de volume de células inflamatórias (VvCI) e de fibroblastos (VvFb) 

A análise morfológica do tecido conjuntivo subepitelial (lâmina própria) da mucosa 

gengival dos molares do GC revelou a presença de fibroblastos imersos numa matriz 

extracelular contendo fibras colágenas e substância fundamental amorfa em proporções 

equivalentes. Além disso, algumas células inflamatórias, principalmente, neutrófilos foram 

também observados (Figuras 10A, 10D e 10G). Nos ratos dos grupos GPD (Figuras 10B, 10E 

e 10H) e GPS (Figuras 10C, 10F e 10I), o tecido conjuntivo da mucosa gengival apresentava 

conteúdo celular aparentemente mais numeroso, particularmente o GPS, nos diferentes 

períodos. Além disso, observou-se uma desorganização dos componentes celulares e fibrilares, 

em particular a disposição de fibroblastos entre feixes de fibras colágenas.  

A análise quantitativa (Figuras 11 e 12) revelou que GP apresentou um aumento 

significante na VvCI (p < 0,0001), enquanto a VvFb reduziu significantemente (p = 0,0043) em 

comparação ao GC. Em todos os períodos, nenhuma diferença significante foi detectada na 

VvCI entre os grupos GPD e GC (p ≥ 0,0986), enquanto para GPS os valores de VvCI foram 

significantemente superiores aos grupos GPD (7 e 30 dias: p < 0,0001; 15 dias: p = 0,0017) e 

GC (7 e 30 dias: p < 0,0001; 15 dias: p = 0,0098). Entre os períodos, GC não apresentou 

alterações significantes na VvCI (p ≥ 0,3483), bem como o GPD (p ≥ 0,1063). Porém, GPS 

exibiu uma diminuição significante de 7 para 15 dias (p < 0,0001) e de 7 para 30 dias (p = 

0,0005); não houve diferença estatística na VvCI entre os períodos de 15 e 30 dias (p = 0,2400) 

conforme mostra a Figura 12A. De acordo com a Figura 12B, significantes diferenças na VvFb 

não foram observadas entre os grupos, aos 7 e 15 dias. Aos 30 dias, os grupos GPD e GPS não 

apresentaram diferenças significantes na frequência de fibroblastos (p = 0,9930), que foram 

significantemente inferiores ao observado no GC (p = 0,0119 e p = 0,0088, respectivamente). 

Com o decorrer do tempo, nenhuma diferença significante foi observada na VvFb nos grupos.  

 

  



41 

 

Figura 10 – Fotomicrografias em maior aumento de cortes em H&E (GC, GPD e GPS)  

Figuras 10A-10I Fotomicrografias mostrando porções da lâmina própria da mucosa gengival de 

molares de ratos dos grupos controle (GC), com doença periodontal tratados com a diacereína (GPD) e 
com doença periodontal tratados com solução salina (GPS) durante 7, 15 e 30 dias. No GC (Figs. 10A, 
10D e 10G), algumas células inflamatórias (setas) são observadas, principalmente na porção da lâmina 
própria subjacente ao epitélio juncional (EJ); os fibroblastos (Fb) apresentam-se entre feixes de fibras 
colágenas e vasos sanguíneos (VS). Nos grupos GPD (Figs. 10B, 10E e 10H) e GPS (Figs. 10C, 10F e 
10I), as células inflamatórias (setas) aparecem distribuídas entre os fibroblastos (Fb), os quais se 
dispõem sem um arranjo definido. VS, vasos sanguíneos. H&E. 460x. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 



42 

 

Figura 11 - Densidade de volume de células inflamatórias e de fibroblastos (GC e GP) 

 

Densidade de volume (Vv) de células inflamatórias (%CI) e de fibroblastos (%Fb) na lâmina própria da 

mucosa gengival de ratos dos grupos GC GP (teste t de Student não paramétrico; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

Figura 12 - Densidade de volume de células inflamatórias e de fibroblastos (GC, GPD e 

GPS) 

 

Figura 12. A) Densidade de volume (Vv) de células inflamatórias (%CI) na lâmina própria da mucosa 
gengival de ratos dos grupos GC, GPD e GPS, aos 7, 15 e 30 dias. B) Densidade de volume (Vv) de 
fibroblastos (%Fb) na lâmina própria da mucosa gengival de ratos dos grupos GC, GPD e GPS, aos 7, 
15 e 30 dias. 
A comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 

gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

A) B) 



43 

 

5.2 Número de Osteoclastos TRAP-positivos  

Os cortes submetidos ao método do TRAP revelaram osteoclastos com citoplasma 

fortemente reativo à enzima fosfatase ácida, observado em vermelho. Osteoclastos TRAP-

positivos foram observados na superfície óssea do processo alveolar de todos os grupos (Figuras 

13A-13D; 14A-14I).  

A análise quantitativa (Figuras 15 e 16) mostrou um aumento significante no número de 

osteoclastos TRAP-positivos em GP comparado a GC (p = 0,0051). Aos 7 e 15 dias de 

tratamento, o número de osteoclastos no grupo GPD foi significantemente menor em 

comparação ao GPS (7 dias: p = 0,0091; 15 dias p < 0,0001). Aos 30 dias, diferenças 

significantes não foram verificadas entre o grupo GPD comparado a GPS e GC, porém 

diferença significante foi observada entre os grupos GC e GPS (p = 0,0186). A análise de cada 

grupo com o decorrer do tratamento revelou que os grupos GPD e GC não apresentaram 

diferenças significantes. No grupo GPS, houve um aumento significante no número de 

osteoclastos de 7 para 15 dias (p = 0,0091), enquanto de 15 para 30 dias houve uma redução 

significante (p = 0,0213); diferenças significantes não foram observadas entre os períodos de 

30 e 7 dias (p = 0,9433).    

 

 

 

 



44 

 

Figura 13 – Fotomicrografias de cortes submetidos ao método TRAP (GC e GP)  

Figuras 13A-13D – Fotomicrografias de cortes sagitais de molares de ratos dos grupos controle (GC) e 
com doença periodontal (GP). Os cortes foram submetidos ao método TRAP e contracorados com 
hematoxilina. Figs. 13A (GC) e 13C (GP) - osteoclastos TRAP-positivos (em vermelho) adjacentes à 
superfície óssea são observados por toda extensão do processo alveolar (PA), ao redor do primeiro 
molar. 5,8x As Figs. 13B e 13D, áreas demarcadas em 13A e 13C respectivamente, mostram porções 
do processo alveolar (PA) da região interproximal com osteoclastos positivos ao TRAP (setas). Note 

que no grupo GP (Fig. 13D) diversas células em vermelho (setas) são observadas nas proximidades do 
processo alveolar. 90x 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

 

 



45 

 

Figura 14 – Fotomicrografias de cortes submetidos ao método TRAP (GC, GPD e GPS) 

Figuras 14A-14I – Fotomicrografias de cortes sagitais de molares de ratos dos grupos controle (GC), 
doença periodontal tratados com a diacereína (GPD) e com doença periodontal tratados com solução 
salina (GPS) durante 7, 15 e 30 dias. Os cortes foram submetidos ao método TRAP e contracorados com 
hematoxilina. As fotomicrografias mostram porções do processo alveolar (PA) interproximal, entre o 1º 

e o 2º molares. Note que no grupo GC (Figs. 14A, 14D e 14G) a crista do processo alveolar (PA) está 
recoberta pelas fibras interdentárias (FI); poucos osteoclastos (setas) são observados na superfície óssea. 
Nos grupos GPD (Figs. 14B, 14E e 14H), diversos osteoclastos (setas), principalmente no grupo GPS 
(Figs. 14C, 14F e 14I), estão presentes junto à superfície irregular do processo alveolar. GI, gengiva 
interdentária; EJ, epitélio juncional; D, dentina. 40x. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 



46 

 

Figura 15 - Osteoclastos TRAP-positivos (GC e GP) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Número de osteoclastos TRAP-positivos por milímetro de superfície do processo alveolar do primeiro 
molar de ratos dos grupos GC e GP. 
a = diferença significante em relação a GC (teste não paramétrico t Student; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

Figura 16 - Osteoclastos TRAP-positivos (GC, GPD e GPS) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Número de osteoclastos TRAP-positivos por mm de superfície linear do processo alveolar do primeiro 

molar de ratos dos grupos dos GC, GPD e GPS, aos 7, 15 e 30 dias de tratamento. 
A comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 
gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 
 

Fonte: Elaboração da autora. 



47 

 

 Figura 17 – Imuno-histoquímica (IL-1β): GC e GP 
 

Figuras 17A-17D – Fotomicrografias de cortes sagitais de maxilas de ratos dos grupos GC e GP 
mostrando porções de gengiva interproximal, entre os 1º e 2º molares. Os cortes foram submetidos à 
reação de imuno-histoquímica para detecção de IL-1β e contracorados com hematoxilina. Figs. 17A 

(GC) e 17C (GP) – células imunopositivas (em castanho) são observadas na lâmina própria (LP). Note 
que poucas células exibem positividade (setas) no GC em comparação ao GP. 227x. As Figs. 17B e 17D 
mostram em aumento maior a presença de fibroblastos (Fb) e células inflamatórias (setas) 
imunopositivas. 511x. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 



48 

 

Figura 18 - Imuno-histoquímica (IL-1β): GC, GPD e GPS  

Figuras 18A-18I – Fotomicrografias mostrando porções da gengiva interdentária, entre os 1º e 2º 
molares de ratos dos grupos GC, GPD e GPS, aos 7, 15 e 30 dias. Os cortes foram submetidos à reação 
de imuno-histoquímica para detecção de IL-1β e contracorados com hematoxilina. No GC, poucas 
células imunopositivas (em castanho) são observadas na lâmina própria, em todos os períodos. Aos 7 
dias de tratamento com diacereína (GPD), acentuada marcação é observada na lâmina própria em 
comparação aos períodos de 15 (Fig. 18E) e 30 (Fig. 18H) dias. Figs. 18C, 18F e 18I (GPS) - diversas 

células imunopositivas são observadas na lâmina própria da mucosa gengival em todos os períodos. 
394x. 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

 

 

 

 

 



49 

 

5.3 Detecção de IL-1β na mucosa gengival  

 

Os cortes submetidos à imuno-histoquímica para detecção de IL-1β mostraram fraca 

positividade na lâmina própria da mucosa gengival dos ratos do GC (Figuras 17A e 17B). Em 

contraposição, diversas células inflamatórias e alguns fibroblastos apresentaram 

imunopositividade à IL-1β após a indução da doença periodontal (Figuras 17C e 17D). Aos 7, 

15 e 30 dias, a mucosa gengival dos ratos do GC mostrou poucas células imunopositivas à IL-

1β na lâmina própria (Figuras 18A,18B D 18G). No GPD, uma evidente imunomarcação na 

mucosa gengival foi observada após 7 dias de tratamento (Figuras18B). No entanto, poucas 

células positivas foram observadas nas amostras do GPD após 15 e 30 dias (Figuras 18E e 18H). 

Em contraste, no GPS evidente imunomarcação foi observada na lâmina própria da mucosa 

gengival em todos os períodos (Figuras 18C, 18F e 18I). 

De acordo com a Figura 19, a mucosa gengival dos animais do GP mostrou um 

significante aumento no número de células imunopositivas à IL-1 em comparação ao GC (p < 

0,0001). 

A análise do tratamento (Figura 20) revelou que, aos 7 dias, o número de células 

imunopositivas foi significantemente menor nos animais do grupo GPD em comparação ao 

GPS (p < 0,0001), embora ambos grupos mostraram valores maiores em comparação ao GC (p 

< 0,0001). Após 15 e 30 dias, diferenças significantes não foram observadas entre os grupos 

GPD e GC (p = 0,4188 e p = 0,1771, respectivamente). Em contraposição, a imunoexpressão 

na mucosa gengival dos animais do GPS, em todos os períodos, foi significante maior do que 

nos grupos GPD (p < 0,0001) e GC (7 e 15 dias: p ≤ 0,0001; 30 dias: p = 0,0004). De 7 para 15 

dias, uma significante redução na quantidade de células positivas à IL-1 foi observada no GPD 

(p < 0,0001). No entanto, nenhuma diferença significante foi encontrada no grupo GPD entre 

os períodos de 15 e 30 dias (p = 0,5815).    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



50 

 

Figura 19 - Imunoexpressão de IL-1β (GC e GP) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Gráfico representando o número de células imunopositivas para IL-1β na lâmina própria da mucosa 
gengival dos animais dos grupos GC e GP. 
a = diferença significante em relação a GC (teste t de Student não paramétrico; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

Figura 20 - Imunoexpressão de IL-1β (GC, GPD e GPS) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gráfico representando o número de células IL-1β-imunopositivas/mm2 na lâmina própria da mucosa 

gengival dos animais dos grupos GC, GPD e GPS, nos períodos de 7, 15 e 30 dias de tratamento. A 
comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 
gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 
 

Fonte: Elaboração da autora. 



51 

 

5.4 Imunopositividade da MMP-8 na mucosa gengival 

 

A detecção imuno-histoquímica da MMP-8 revelou poucas células imunopositivas 

(em castanho) na lâmina própria da mucosa gengival dos ratos do GC, em todos os períodos 

(Figuras 21A e 21C). Nos animais dos grupos GP (Figuras 21C e21D), GPD (Figuras 22B, 22E 

e 22H) e GPS (Figuras 22C, 22F e 22I) a imunoexpressão foi mais acentuada em comparação 

ao GC.  

Como ilustra a Figura 23, a lâmina própria da gengiva dos animais do GP apresentou 

um aumento estatisticamente significante no número de células MMP-8-positivas, quando 

comparado a GC (p < 0,0001). 

Após 7 e 15 dias de tratamento (Figura 24), os animais do GPD exibiram menor 

densidade numérica de células imunopositivas em comparação ao GPS (p < 0,0001), apesar dos 

valores serem significantemente superiores quando comparados aos do grupo GC (p < 0,0001). 

No entanto, nenhuma diferença significante foi detectada entre os grupos GPD e GC (p = 

0,4582) aos 30 dias. Neste período, a imunoexpressão de MMP-8 foi significantemente maior 

na lâmina própria da mucosa gengival dos animais do GPS em comparação aos grupos GPD e 

GC (p < 0,0001). De 7 para 15 dias, GPD não apresentou alterações significantes no número de 

células imunopositivas (p = 0,7866), no entanto, quando ambos os períodos foram comparados 

aos 30 dias de tratamento, houve uma redução significante na imunoexpressão de MMP-8 (p = 

0,0021 e p = 0,0003). No grupo GPS, uma diminuição significante no número de células 

imunopositivas foi detectada somente no período de 30 dias em comparação aos 7 dias (p = 

0,0054). Diferenças significantes na imunoexpressão de MMP-8 não foram detectadas no GC 

com o decorrer do tempo (p ≥ 0,4544). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



52 

 

Figura 21 – Imuno-histoquímica (MMP-8): GC e GP 

 
Figuras 21A-21D – Fotomicrografias de cortes sagitais de maxilas de ratos dos grupos GC e GP 
mostrando porções de gengiva interproximal, entre os 1º e 2º molares. Os cortes foram submetidos à 
reação de imuno-histoquímica para detecção de MMP-8 e contracorados com hematoxilina. Figs. 21A 

(GC) e 21C (GP) – células imunopositivas (em castanho) são observadas na lâmina própria (LP) da 
mucosa gengival. 185x. Nas Figs. 21B e 21D, observa-se a presença de células imunopositivas para 
MMP-8 em aumento maior. Pode-se observas que no grupo GP (Fig. 21D) maior quantidade de células 

imunopositivas (setas) são observadas na lâmina própria. Ep: epitélio da mucosa gengival. 470x 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 



53 

 

Figura 22 – Imuno-histoquímica (MMP-8): GC, GPD e GPS 

 

Figuras 22A-22I – Fotomicrografias mostrando porções da gengiva interdentária, entre os 1º e 2º 
molares de ratos dos grupos GC, GPD e GPS, aos 7, 15 e 30 dias. Os cortes foram submetidos à reação 
de imuno-histoquímica para detecção de MMP-8 e contracorados com hematoxilina. Figs. 22A, 22D e 

22G - no GC, escassas células positivas à MMP-8 (castanho) são observadas na lâmina própria. Nos 
grupos GPD (Figs. 22B, 22E e 22H) e GPS (Figs. 22C, 22F e 22I) diversas células mostram positividade, 
diminuindo com o decorrer do tempo. 388x 

 

Fonte: Elaboração da autora. 



54 

 

Figura 23 - Imunoexpressão de MMP-8 (GC e GP) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Gráfico representando o número de células MMP-8-imunopositivas/mm2 (expressos os valores da 

média) na lâmina própria da mucosa gengival dos animais dos grupos GC e GP. 
a = diferença estatística significante em relação a GC (teste t de Student não paramétrico; p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 

 

Figura 24 - Imunoexpressão de MMP-8 (GC, GPD e GPS) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Gráfico representando o número de células MMP-8-imunopositivas/mm2 (expressos os valores da 
média) na lâmina própria da mucosa gengival dos animais dos grupos GC, GPD e GPS, nos períodos de 
7, 15 e 30 dias de tratamento.  
A comparação entre grupos no mesmo período é indicada por letras minúsculas sobre as barras dos 

gráficos; letras iguais indicam que não houve diferença estatisticamente significante. A comparação 
entre períodos no mesmo grupo é indicada por números sobre as barras dos gráficos; números iguais 
indicam que diferenças significantes não foram detectadas (teste Two-way ANOVA com pós-teste de 
Tukey, p < 0,05). 

 

Fonte: Elaboração da autora. 



55 

 

6 DISCUSSÃO  

 

No presente estudo, a diacereína ocasionou uma redução na imunoexpressão de IL-1β 

na lâmina própria da mucosa gengival de ratos com doença periodontal induzida. O tratamento 

com diacereína reduziu significantemente o processo inflamatório e a imunoexpressão de 

MMP-8 na mucosa gengival, além de promover uma marcante redução no número de 

osteoclastos na superfície óssea de molares de ratos com periodontite. Assim, estes achados 

indicam que a diacereína reduz significantemente os efeitos deletérios da doença periodontal 

sobre os tecidos periodontais, favorecendo a sua reparação. Portanto, nossos resultados 

reforçam a ideia de que a IL-1β tem um importante papel na cascata de eventos celulares e 

moleculares envolvidos na doença periodontal. 

A periodontite induzida nos molares de ratos causou um aumento significante de 

células inflamatórias, perda de inserção do epitélio juncional e marcante perda óssea, 

comprovando que a ligadura foi realizada com êxito e que constitui uma metodologia capaz de 

promover a doença periodontal24,69,70. No grupo controle, embora uma baixa porcentagem de 

células inflamatórias estava presente na mucosa gengival dos molares, diferenças significantes 

não foram detectadas na frequência destas células com o decorrer do tempo. Sabe-se que a 

gengiva de indivíduos que apresentam condições clínicas de saúde periodontal exibe um 

infiltrado inflamatório residente, caracterizado pela presença de neutrófilos e macrófagos fixos, 

assim como elementos do sistema mononuclear fagocitário (sistema retículo-endotelial), os 

quais são derivados de monócitos do sangue. Embora escassos, os eosinófilos também estão 

presentes na lâmina própria, além de focos de linfócitos e plasmócitos os quais são observados 

principalmente na lâmina própria subjacente ao epitélio do sulco gengival71. Em ratos, a 

presença de infiltrado inflamatório discreto em mucosa gengival de molares sem doença 

periodontal tem sido reportado em outros estudos24,25,72. 

No presente estudo, uma acentuada imunomarcação para IL-1β foi detectada na 

mucosa gengival de molares com doença periodontal, apontando para o envolvimento desta 

citocina na instalação da periodontite. Nossos resultados mostraram claramente um efeito da 

diacereína (inibidor de IL-1β) na regressão do processo inflamatório, pois não foram observadas 

diferenças significantes na frequência de células inflamatórias entre os grupos GPD e GC, em 

todos os períodos de tratamento. Por outro lado, nos períodos de 7, 15 e 30 dias, a frequência 

de células inflamatórias nos animais do grupo GPS foi elevada em comparação aos grupos GPD 

e GC. Estes resultados mostram que, embora após a remoção da ligadura ocorra uma redução 

no infiltrado inflamatório na mucosa gengival, o tratamento com a diacereína promoveu uma 



56 

 

redução mais acentuada. Isso é confirmado pelo fato de que após 7 dias de tratamento, 

significantes diferenças não foram encontradas entre os animais do GPD e do GC enquanto no 

GPS, a incidência de células inflamatórias ainda permaneceu elevada após 30 dias. A IL-1, 

principalmente a IL-1β, tem um papel de relevância tanto na inflamação aguda quanto crônica8. 

Células inflamatórias (como linfócitos Th17 e macrófagos) possuem o receptor para IL-1 (IL-

1R); portanto, quando esta citocina pró-inflamatória se liga ao seu respectivo receptor, dá-se 

início a ativação destas células73,74. Nas células endoteliais, a IL-1β, após ligar-se ao seu 

receptor, é capaz de aumentar a expressão de ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1), 

estimulando a secreção de quimiocinas, dentre elas a IL-8 que estimula o recrutamento e a 

migração de neutrófilos até os sítios afetados. A IL-1β, uma citocina pró-inflamatória, também 

regula a síntese e a secreção de PGE2 e óxido nitroso, promovendo um aumento no fluxo 

sanguíneo e no processo inflamatório8,9,75. Além disso, esta interleucina tem um papel 

importante na diferenciação de células inflamatórias da resposta imune inata, as quais possuem 

receptor de IL-1 (IL-1R), bem como sobre a resposta imune adquirida74.  

Há evidências, a partir de estudos in vitro, de que a diacereína possui efeito inibitório 

sobre a síntese de IL-162,63. No presente estudo, a marcante redução da imunoexpressão de IL-

1β dos animais do GPD sugere que o tratamento com diacereína foi capaz de promover uma 

diminuição na síntese desta citocina na mucosa gengival dos animais com doença periodontal. 

Esta ideia é reforçada desde que na mucosa gengival dos animais do grupo GPS, o número de 

células positivas à IL-1β foi significantemente superior aos animais do GPD, em todos os 

períodos. Além disso, diferenças significantes não foram observadas na imunoexpressão entre 

os grupos GPD e GC, aos 15 e 30 dias. Portanto, nossos resultados mostraram que a diacereína 

apresentou um efeito mais evidente a partir dos 15 dias de tratamento, sugerindo que o seu 

efeito pode ser tempo-dependente. Assim, é concebível sugerir que o tratamento com a 

diacereína promoveu uma redução na síntese de IL-1β, explicando, pelo menos em parte, a 

menor frequência de células inflamatórias na mucosa gengival dos animais do grupo GPD.  

Sabe-se que a IL-1, tanto IL-1α quanto IL-1β, tem uma série de atributos, dentre eles 

funções hematopoiéticas, inflamatórias, metabólicas, fisiológicas e imunológicas76. Foi 

demonstrado in vivo que a inibição deste mediador e de TNF-α gera uma deficiência no 

recrutamento de células inflamatórias ao sítio afetado pela doença periodontal, evidenciando 

sua importância para este processo39. Isto se deve ao fato de que ambos os mediadores 

estimulam a expressão de moléculas de adesão tecidual pelo endotélio, como ICAM-1 e 

VCAM-1 (proteína de adesão celular vascular-1)77, favorecendo a diapedese e a adesão 

leucocitária78. O ICAM-1 é uma glicoproteína de superfície celular que faz parte da constituição 



57 

 

da porção vascular do tecido endotelial, bem como de fibroblastos, células epiteliais e alguns 

leucócitos79. Por ser uma proteína de membrana que possui um domínio extracelular contendo 

cinco regiões semelhantes à das imunoglobulinas, é classificada como membro da superfamília 

de imunoglobulinas80. A expressão de ICAM-1 é regulada inicialmente de maneira 

transcricional, sendo submetida ao estímulo de citocinas como IL-1β, TNF e também LPS 

bacteriano (lipopolissacarídeo)79,81,82. Os baixos níveis constitutivos de ICAM-1 no endotélio 

são suprarregulados pelo estímulo de receptores endoteliais, incluindo receptores para citocinas 

(como o receptor-1 para TNF) e do tipo Toll-like83. O ICAM-1 é capaz de se ligar ao antígeno 

integrina-b2 associado à função de linfócitos (b2-integrin lymphocyte function-associated 

antigen) pelo seu primeiro domínio de imunoglobulina, enquanto que o antígeno de macrófago-

1 se liga ao terceiro domínio de imunoglobulina do ICAM-184-86. Após sua adesão ao endotélio, 

os leucócitos migram através de junções interendoteliais (realizando a diapedese) e se dirigem 

aos sítios de inflamação guiados pelos fatores quimiotáticos87. Dentre os fatores quimiotáticos, 

destaca-se a IL-8, quimiocina capaz de recrutar células inflamatórias, principalmente 

polimorfonucleares. A IL-1 é capaz de interagir com o endotélio, ativando de maneira 

transcricional o gene de IL-8 nestas células10. Assim, é possível que a inibição da IL-1β, causada 

pela diacereína, tenha interferido no recrutamento e na transmigração dos leucócitos para a 

lâmina própria da mucosa gengival e, promovendo a regressão do processo inflamatório.  

Nossos resultados também apontam para um efeito inibidor da diacereína sobre o 

processo reabsortivo, desde que o número de osteoclastos no GPD foi significantemente menor 

nos animais do GPS, aos 7 e 15 dias. Além disso, no GPD o número de osteoclastos não diferiu 

significantemente em relação ao GC, em todos os períodos. Em contraposição, nos animais do 

GPS, em todos os períodos, o número de osteoclastos foi significantemente maior em 

comparação ao GC. Foi demonstrado que a formação de osteoclastos pode ser induzida por 

citocinas como TNF-α, IL-6 (quando ligada a seu receptor solúvel sIL-6R) e IL-1. Há 

evidências de que a IL-1, associada a níveis mínimos de RANKL, é capaz de induzir 

osteoclastogênese a partir de células precursoras29,88. A IL-1 regula a expressão de RANKL em 

células do estroma88,89 e estimula citocinas, entre elas o TNF-α e a IL-6 que exercem papel na 

ativação de NF-κB, fator importante para a osteoclastogênese, e induzem a fusão e 

diferenciação de osteoclastos90,91.  

Portanto, o reduzido número de osteoclastos observado nos animais tratados com 

diacereína em comparação aos ratos do GPS pode ser explicado, pelo menos em parte, pelo 

efeito inibidor da diacereína sobre a IL-1β, citocina que atua sobre o fator NF-ĸB, o qual 

estimula a osteoclastogênese. Monócitos e macrófagos ativados produzem o que antes era 



58 

 

denominado “fator de ativação de osteoclasto”, fator este mais tarde reconhecido como IL-

1β92,93. O NF-κB (Fator Nuclear Kappa B) envolve uma família de cinco proteínas: p50, p52, 

p65, RelA e c-Rel, capazes de regular a expressão de uma diversidade de genes relacionados 

com a resposta imunológica, atividades celulares, além controlar o tempo de sobrevivência da 

célula94. Sabe-se que a expressão das proteínas p50 e p52 são essenciais em precursores de 

osteoclastos para osteoclastogênese, porém dispensável no que diz respeito à sobrevivência da 

célula multinucleada95. No entanto, a redução significante no número de osteoclastos nos 

molares dos animais do GPD não foi capaz de reduzir a perda óssea do processo alveolar 

interproximal, posto que significantes diferenças na altura deste processo não foram detectadas 

entre os animais do GPD e GPS. De fato, após a remoção da ligadura, a perda óssea 

interproximal foi aparentemente “interrompida”, independentemente do tratamento.    

A MMP-8, uma metaloproteinase da matriz associada a degradação do colágeno tipo I, 

II e III14, foi detectada na mucosa gengival de ratos com periodonto saudável. No entanto, 

nossos resultados mostraram um aumento na imunoexpressão desta MMP na lâmina própria da 

mucosa gengival de molares com doença periodontal. A MMP-8 foi observada em neutrófilos 

e macrófagos, além de fibroblastos na lâmina própria da gengiva, como tem sido reportado por 

outros autores96-98. A MMP-8 está presente na mucosa gengival de periodonto saudável (sem 

doença periodontal), pois esta MMP desempenha um papel na remodelação dos componentes 

da matriz extracelular do tecido conjuntivo, participando, portanto, na homeostase dos 

tecidos99. A maior parte das MMPs, dentre elas a MMP-8, são enzimas secretadas em sua forma 

inativa, ou seja, como uma pró-MMP. A ativação da MMP-8 depende de várias citocinas, dentre 

as quais outras MMPs, como a MMP-10100 e a IL-134. O aumento desta MMP tem sido 

associado à degradação do tecido conjuntivo gengival durante a doença periodontal101,102, 

degradação do colágeno em periodonto submetido à tração ortodôntica103 e a progressão de 

doenças reumáticas104. Assim, a MMP-8 tem um importante papel na instalação e progressão 

de diferentes doenças, dentre elas a doença periodontal. Nossos resultados demonstraram que a 

mucosa gengival de ratos, após 7 dias de indução da DP, exibiu um aumento de, 

aproximadamente, 4 vezes na imunoexpressão de MMP-8. De fato, a MMP-8 (ou colagenase-

2) tem sido considerada como um dos principais biomarcadores da degradação do tecido 

conjuntivo característico da periodontite105-107. É importante ressaltar que o aumento da MMP-

8 foi paralelo ao aumento da imunoexpressão de IL-1β na mucosa gengival dos ratos com 

doença periodontal.  

Os animais tratados com diacereína apresentaram um menor número de células 

imunopositivas para MMP-8 em comparação ao GPS que pode ser explicado, pelo menos em 



59 

 

parte, devido à baixa incidência de células inflamatórias na mucosa gengival destes animais. 

Além disso, é possível que a redução de IL-1β causada pela diacereína possa ter promovido 

uma redução na síntese desta MMP pelas células da lâmina própria da gengiva. No entanto, 

futuros estudos devem ser realizados para investigar esta possibilidade. 

Nossos resultados apontam para um efeito benéfico da diacereína nas alterações 

estruturais dos tecidos periodontais após a remoção da ligadura em molares de ratos. A 

diacereína foi capaz de promover uma redução marcante na interleucina-1β na mucosa gengival 

de molares de ratos com doença periodontal induzida. Considerando que a IL-1 é uma das 

citocinas envolvidas no recrutamento e migração de leucócitos a partir dos vasos sanguíneos, a 

redução significante de IL1-β deve ser responsável pela supressão rápida do processo 

inflamatório observada na mucosa gengival dos animais do GPD. Além disso, a redução 

significante de osteoclastos na superfície óssea dos animais do GPD indica uma interferência 

da diacereína, seja na formação ou na sobrevivência destas células multinucleadas. A redução 

da IL-1β, induzida pela diacereína, deve também ser responsável pela baixa imunoexpressão de 

MMP-8 na mucosa gengival. 

 

  



60 

 

7 CONCLUSÃO 

 

Com base nos resultados acima descritos, pode-se concluir, portanto, que a diacereína 

deve reduzir a síntese e liberação de IL-1β e MMP-8 na periodontite e, consequentemente, 

diminui o infiltrado inflamatório e o número de osteoclastos, restringindo assim a destruição 

característica da doença periodontal. Futuros estudos são necessários para melhor compreender 

os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no uso deste inibidor de IL-1β e comprovar 

sua ação terapêutica na doença periodontal. 



61 

 

REFERÊNCIAS 

 

 

1. Doyle AC. Um estudo em vermelho: uma Aventura de Sherlock Holmes. 1. ed. São 

Paulo: Martin Claret; 2009. p. 24.  

2. Papapanou PN, Lindhe J. Epidemiologia das doenças periodontais. In: Lindhe J, Lang 

NP, Karring T. Tratado de periodontia clínica e implantologia oral. Trad. 

Kuchenbecker Rosing C. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2014. p. 123-72.  

3. Boukortt KN, Saidi-Ouahrani N, Boukerzaza B, Ouhaibi-Djellouli H, Hachmaoui K, 

Benaissa FZ, et al. Associati