UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E MOLECULAR DE Chlamydophila felis EM GATOS DOMÉSTICOS (Felis catus) Meire Christina Seki Médica Veterinária JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Outubro de 2011 DADOS CURRICULARES DO AUTOR MEIRE CHRISTINA SEKI – Filha de Toyoshi Seki e Maria Soledade Barros Seki, nasceu na cidade de São Paulo, São Paulo, no dia 12 de agosto de 1980. É médica veterinária formada pela Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal – SP, em 2003. Durante o curso de graduação foi bolsista de iniciação científica do PIBIC-CNPq. Em fevereiro de 2004 ingressou no curso de Aprimoramento Profissional (residência) em Medicina Veterinária na área de Patologia Clínica Veterinária, no Hospital Veterinário “Governador Naudo Latel” - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias- Universidade Estadual Paulista (UNESP)- Câmpus de Jaboticabal-SP. Em março de 2006, ingressou no Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de concentração em Patologia Animal, na FCAV-UNESP, Jaboticabal- SP, sob orientação do Prof. Dr. Aramis Augusto Pinto, sendo bolsista de mestrado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, (FAPESP, Processo 05/58236-3), obtendo o título de mestre em fevereiro de 2008. Em março de 2008, ingressou no Curso de Pós- graduação em Medicina Veterinária, Área de concentração em Patologia Animal, na FCAV-UNESP, Jaboticabal- SP, sob orientação do Prof. Dr. Aramis Augusto Pinto, sendo bolsista de doutorado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, (FAPESP, Processo 07/59892-7). Desde agosto de 2010 é professora colaboradora do curso de Medicina Veterinária na Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO) – PR. SUMÁRIO Página ÍNDICE DE TABELAS......................................................................................... ix ÍNDICE DE FIGURAS......................................................................................... x LISTA DE ABREVIAÇÕES.................................................................................. xii RESUMO..................................................................................... ........................ xiv SUMMARY.......................................................................................................... xv I. INTRODUÇÃO............................................................................................... .. 1 II. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 2 III. OBJETIVOS................................................................................................... 16 3.1. Objetivo geral............................................................................................ 16 3.1. Objetivos específicos................................................................................ 16 IV. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 4.1. Animais..................................................................................................... 4.2. Colheita de material biológico................................................................... 4.3. Produção do antígeno para os testes sorológicos.................................... 17 17 17 18 4.4. Detecção de anticorpos anti-Chlamydophila............................................. 19 4.4.1. Reação de Imunofluorescência Indireta para Chlamydiaceae através de kit comercial (RIFI COMERCIAL)...................................................... 19 4.4.2. Reação de imunofluorescência indireta para antígenos Chlamydiaceae produzidos em ovos embrionados (RIFI OVO)......................... 22 4.4.2.1. Preparação do Antígeno................................................. ............... 22 4.4.2.2. Descrição da reação de imunofluorescência indireta (RIFI).......... 23 4.4.3. Ensaio Imunoenzimático (ELISA) indireto......................................... 24 4.4.3.1. Elementos da reação..................................................................... 24 4.4.3.1.1. Antígeno...................................................................................... 24 4.4.3.1.2. Purificação dos Corpos Elementares (CE) de Chlamydophila abortus................................................................................................................ 26 4.4.3.1.3. Controle negativo do antígeno................................................... . 27 4.4.3.1.4. Determinação da diluição ótima de uso do antígeno, do controle negativo e dos soros testes.............................................. ..................... 27 4.4.3.2. Descrição da reação com concentração e diluente dos soros testes definidos ............................................................................................. ..... 28 4.4.3.3. Leitura e interpretação dos resultados........................................... 29 4.4.3.4. Análise estatística dos dados...................................................... ... 29 4.5. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)............................................... 29 4.5.1. Extração de DNA............................................................................... 29 4.5.2. Amplificação...................................................................................... 30 4.5.2.1. Gene da ompA do gênero Chlamydiaceae ................................... 30 4.5.2.2. Gene da omp2 do gênero Chlamydiaceae .................................... 31 4.5.2.3. Gene da MOMP do gênero Chlamydiaceae ................................. 31 4.5.2.4. Gene timidina quinase do herpesvírus felino tipo I........................ 32 4.5.3. Detecção do produto amplificado...................................................... 32 4.5.4. Enzimas de restrição......................................................................... 33 4.6. Sequenciamento...................................................................................... . 34 4.7. Análise das Seqüências............................................................................ 34 4.8. Detecção de anticorpos para FIV e de antígeno para FeLV..................... 35 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... .. 36 5.1. Detecção de anticorpos anti-Chlamydophila............................................. 36 5.1.1. Correlação entre os testes sorológicos............................................ . 43 5.2. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)............................................... 46 5.2.1. Pesquisa de DNA de Chlamydiaceae............................................... 46 5.2.2. Pesquisa de DNA de Herpesvirus Felino tipo 1................................ 51 5.3. Correlação entre os testes sorológicos (RIFI COMERCIAL, RIFI OVO e ELISA) nas amostras de soros de felinos contendo fragmentos de DNA para Chlamydiaceae.................................................................................................... 54 5.4. Pesquisa de anticorpos para FIV e de antígeno p 27 para FeLV............. 55 5.5. Coinfecção de Chlamydophila felis com herpesvirus felino tipo 1, FIV e FeLV.................................................................................................................... 58 VI. CONCLUSÕES ............................................................................................. 60 VII. REFERÊNCIAS ........................................................................................... 61 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1: Número de amostras de soro e de suabes de conjuntivas colhidas dos felinos domésticos estudado e o local de procedência............................19 Tabela 2: Resultados dos títulos dos soros de felinos domésticos (n=201) submetidos à detecção de anticorpos anti-Chlamydophila spp, pelas Reações de Imunofluorescência Indireta (RIFI COMERCIAL e RIFI OVO)............................................................................................... .........41 Tabela 3: Resultados dos testes sorológicos (RIFIs e ELISA) dos felinos domésticos, conforme o local de origem.................................................42 Tabela 4 Resultados obtidos nos exames sorológicos nas amostras de soro de felinos domésticos...................................................................................44 Tabela 5 Resultado da análise comparativa das RIFI para Chlamydiaceae (RIFI COMERCIAL), RIFI OVO e ELISA indireto (ELISA)................................44 Tabela 6 Resultados de títulos de anticorpos anti-Chlamydophila spp, obtidos pela RIFI COMERCIAL, pela RIFI OVO e ELISA Indireto nas amostras de soros de felinos domésticos positivos pela PCR.....................................54 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Reação de Imunofluorescência Indireta para Chlamydiaceae com kit comercial (RIFI COMERCIAL). A: Reação negativa, Aumento de 400X. B: Reação positiva, aumento de 400X....................................21 Figura 2 Reação de imunofluorescência indireta para antígeno de Chlamydiaceae produzidas em ovos embrionados (RIFI OVO) A: Reação positiva. Objetiva de imersão. B: Reação negativa. Objetiva de imersão.........................................................................................25 Figura 3: Resultados das pesquisas de anticorpos anti-Chlamydophila realizadas nas 201 amostras de soro de felinos domésticos submetidas às RIFI (RIFI COMERCIAL e RIFI OVO) e ao ELISA Indireto (ELISA)..................................................................................38 Figura 4: Número de felinos domésticos reagentes nos testes sorológicos RIFI COMERCIAL (n=162), RIFI OVO (n= 111) e ELISA Indireto (n= 69), conforme o local de origem................................................................39 Figura 5: Resultados da PCR dos suabes de conjuntiva de felinos domésticos (n= 235) submetidos à detecção de fragmentos de DNA para os genes MOMP, OmpA e Omp2...........................................................47 Figura 6: Resultados da eletroforese em gel de agarose (1%), realizados com os produtos da Chlamydophila sp para o gene MOMP, provenientes de suabe de conjuntiva de felinos domésticos. Da esquerda para direita: Marcador de Pares de Base (100p.b.); controle negativo (1), amostra negativa (2), amostra positiva (3), controle positivo (4).......48 Figura 7 Resultado da digestão dos produtos amplificados segundo protocolo de HARTLEY et al. (2001) com enzima Alu I, em gel de agarose a 2%. Ordem das canaletas no gel: 1- Marcador Phi X 174/ Hae II; 2- Cepa positiva para Chlamydophila sp sem digestão enzimática (Fragmento de 603 pb); 3- Controle positivo da PCR (cepa vacinal de Chlamydophila felis), (Fragmentos de 224, 142, 93, 85,47 e 46 pb); 4- Cepa de Chlamydophila abortus, utilizada como fonte de antígeno para os exames sorológicos (Fragmentos de 352 e 235 pb); 5- Cepa de pombo positivo para Chlamydophila psittaci (Fragmentos de 227, 220 e 140); 6- Amostra clínica de pombo inconclusiva, 7- Controle negativo da reação; 8 - Cepa de pombo positivo para Chlamydophila psittaci................................................................................................49 Figura 8: Resultado da eletroforese em gel de agarose (1%), realizado com os produtos da PCR para Hespesvirus Felino tipo 1, provenientes de suabe de conjuntiva de gatos domésticos. Da esquerda para direita: Marcador de pares de base (100p.b.); amostra positiva (1 e 3), controle positivo (2) e controle negativo (4).......................................53 Figura 9: Resultados da detecção de anticorpos para FIV e de antígeno p27 para FeLV realizadas em soro de gatos domésticos (n= 150)..........56 LISTA DE ABREVIAÇÕES ATP- adenosina trifosfato BGM – buffalo green monkey BSA – soro albumina bovina CE- corpo elementar CECF- centro de esterilização de caninos e felinos CR- corpo reticular CRFK – crabdell feline kidney CVF- calicivírus felino DNA – ácido desoxirribonucleico DO- densidade óptica EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA – ensaio imunoenzimático FCAV- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária FeLV – vírus da leucemia felina FITC- isotiocianato de fluoresceína FIV- vírus da imunodeficiência felina HIV – vírus da imunodeficiência humana HVF-1 – herpesvírus felino tipo 1 IgG – imunoglobulina tipo G IgG 1 – imunoglobulina tipo G1 IgG 2 - imunoglobulina tipo G2 LPS- lipopolissacarídeo MIF- micro imunofluorescência MOMP – proteína de membrana Omp 2 – proteína de membrana tipo 2 Omp A- proteína de membrana tipo A OPD – ortofenilenodiamino pb – pares de base PBS – 0,01 M PO-4 , 0,14 M NaCl, pH 7,4 PBS-T- PBS contendo 0,05% de tween 20 PCR – reação em cadeia pela polimerase RFC- reação de fixação de complemento RIFI – reação de imunofluorescência indireta RIFI COMERCIAL – reação de imunofluorescência indireta para Chlamydiaceae com kit comercial RIFI OVO - reação de imunofluorescência indireta para Chlamydiaceae produzidos em ovos embrionados RNA – ácido ribonucleico SDS - dodecil sulfato de sódio SPF – specific pathogen free – livre de patógenos TBE- Tampão tris-borato-EDTA UNESP- Universidade Estadual Paulista DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E MOLECULAR DE Chlamydophila felis EM FELINOS DOMÉSTICOS (Felis catus) RESUMO: O presente trabalho teve o objetivo de realizar o diagnóstico sorológico de Chlamydophila felis utilizando duas técnicas sorológicas: imunofluorescência indireta, nas modalidades de kit comercial (RIFI COMERCIAL), e ensaio in house (RIFI OVO), e ELISA, sendo estes testes de RIFI OVO e ELISA preparados com antígeno de Chlamydophila abortus produzidos em ovos embrionados SPF de galinha. Adicionalmente, objetivou-se a realização do diagnóstico molecular de C. felis e estabelecimento do diagnóstico diferencial da clamidiose felina em relação à infecção pelo herpesvírus felino tipo 1 (HVF-1), vírus da Imunodeficiência felina (FIV) e vírus da leucemia felina (FeLV). Anticorpos anti-Chlamydiaceae foram detectados pela RIFI COMERCIAL em 81% dos animais (162/201), pela RIFI OVO em 55% (111/201) e pelo ELISA em 31% (69/201) das amostras. Verificou-se que o antígeno de Chlamydophila abortus inoculado em ovos embrionados não é indicado para utilização em técnicas imunológicas, devido à baixa sensibilidade, especificidade e correlação entre os testes estudados. Das amostras de suabes de conjuntiva submetidas à PCR, em 5,1% (12/235) foi amplificado o gene MOMP de C. felis e três amostras (1,3%) foi detectado DNA de herpesvírus. Houve coinfecção para os dois agentes em 0,4% (1/235) das amostras analisadas. Ademais, 150 amostras de soro foram avaliadas, sendo anticorpos anti-FIV detectados em 8 amostras (5,3%) e o antígeno de FeLV detectado em 11 amostras (7,3%). Não houve coinfecção por C. felis e HVF-1 com os vírus imunossupressores, demonstrando não haver correlação entre a infecção de FIV e/ou FeLV e o complexo respiratório felino. Palavras-Chave: clamidiose, complexo respiratório felino, reação de Imunofluorescência Indireta, ELISA teste, reação em cadeia pela polimerase. Serological and molecular diagnosis of domestic Chlamydophila felis in cats (Felis catus) ABSTRACT: This study aimed at perfoming the serological diagnosis of Chlamydophila felis by three serological approaches, using a commercial kit for Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT COMMERCIAL), and Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT EGG) and ELISA prepared with Chlamydophila abortus with antigen produced in SPF embryonated chicken eggs. Additionally, our study aimed at performing the molecular diagnosis of C. felis and establishing the differential diagnosis of feline chlamydiosis in relation to Feline Herpesvirus type-1 (HVF-1) in cat conjunctival swab samples, as well as investigate the presence of antibodies to Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and presence of Feline Leukemia Virus (FeLV) antigen in cat serum samples. IgG antibodies to Chlamydophila sp. were detected by in 81% (162/201), 55% (111/201), and 31% (69/201) of serum samples, by IFA Chlamydiaceae COMMERCIAL, IFA EGG and ELISA, respectively. The use of Chlamydophila spp antigen produced in embryonated eggs is not indicated for serological tests due to its low sensitivity, specificity and correlation with other serological tests. Twelve (5.1%) out of 235 conjunctival swab samples were positive to C. felis- MOMP gene PCR; three samples (1.3%) were positive to herpesvirus PCR. Co-infection for both agents (C. felis and Herpesvirus) was found in 1 cat (0.4%). Furthermore, 150 serum samples were evaluated by commercial ELISA kit-Snap ® Combo FeLV-FIV. IgG antibodies to FIV were detected in 8 samples (5.3%), and FeLV antigen was detected in 11 samples (7.3%). The presence of co-infection for C. felis and HVF-1 with immunosuppressive viruses was not observed, showing no correlation between FIV infection and / or FeLV and upper respiratory tract disease. Keywords: Chlamydiosis, upper respiratory tract disease, Indirect Immunofluorescence, enzyme immunoassay, polymerase chain reaction. I. INTRODUÇÃO A clamidiose ou pneumonite felina é uma doença infecto-contagiosa do trato respiratório superior (complexo respiratório felino), responsável por conjuntivite variando de aguda à crônica em felinos domésticos. A comprovação da suspeita clínica desta enfermidade, tendo em vista que outros microrganismos, entre os quais, Mycoplasma, calicivírus e o herpesvírus felino tipo 1 (HVF-1), também apresentam sinais clínicos semelhantes (conjuntivite; secreção ocular e nasal; espirros), necessita maior investigação. O diagnóstico laboratorial, importante para o tratamento efetivo e o controle da clamidiose é realizado por meio do isolamento e identificação do agente causal, ou indiretamente por meio do sorodiagnóstico. Por se tratar de assunto pouco estudado em nosso país, foi delineado o presente estudo com o propósito de pesquisar DNA de Chlamydophila felis na conjuntiva de felinos domésticos naturalmente infectados, assim como avaliar o estado imune humoral de felinos frente a essa enfermidade. Para atingir tais objetivos, foi necessário estabelecer as condições ideais de uso das técnicas moleculares (PCR), para detecção genômica de Chlamydophila felis, e de métodos imunológicos (reação imunoenzimática - ELISA e de imunofluorescência - RIFI), para detecção da resposta imune humoral. Adicionalmente, por entender que o maior entrave na rotina clínica é estabelecer o diagnóstico diferencial da clamidiose felina em relação aos demais agentes responsáveis por conjuntivite (complexo respiratório felino), foi também realizada a pesquisa de fragmentos de DNA para o HVF-1, assim como a pesquisa de agentes imunossupressores virais da imunodeficiência felina (FIV) e da leucemia felina (FeLV), complementado com o sequenciamento dos produtos amplificados, com vistas a se obter informações sobre a similaridade do material genético com a amostra de Chlamydophila felis e a estirpe de HVF-1. II- REVISÃO DE LITERATURA As publicações científicas que trazem algum tipo de informação sobre a clamidiose ou pneumonite felina, particularmente no Brasil, ainda são escassas. Desta forma, justifica-se a necessidade de mais pesquisas sobre o tema. Nossa intenção é revisar e enfatizar apenas aspectos relacionados à temática do presente trabalho, ou seja, o melhor conhecimento a situação da doença no país. Antes, porém, por ser assunto pouco estudado em nosso país, julgamos de importância, embora de maneira sintética, fornecer algumas informações sobre o agente, a doença, o hospedeiro e o diagnóstico, na esperança de que tal medida possa contribuir para um melhor entendimento do assunto, motivo da presente investigação. A Chlamydophila felis está associada às bactérias gram negativas, pertencente à Ordem Chlamydiales e a Família Chlamydiaceae. Até 1999, era conhecida como Chlamydia psittaci var. felis (EVERETT, 2000). São parasitas intracelulares obrigatórios, devido à incapacidade de produzir adenosina trifosfato (ATP) e, apresentam um ciclo de desenvolvimento bifásico característico (LONGBOTTON & COULTER, 2003). Na forma infecciosa, também denominada de corpo elementar (CE), cujo tamanho é de aproximadamente 0,3 m de diâmetro, o microrganismo é estável no meio ambiente. Após a fixação do CE em receptores específicos da célula do hospedeiro, ocorre a endocitose, ficando este envolvido em um vacúolo dentro da célula infectada. Na fase seguinte, ainda dentro do vacúolo, o CE sofre divisão binária, diferenciando-se em uma nova partícula, denominada de corpo reticular (CR), cujo tamanho varia de 0,5-1,0 m. Os CR resultantes da divisão dão origem às inclusões dentro do citoplasma da célula hospedeira e, posteriormente, novamente diferenciam-se em CE, os quais podem ser eliminados das células hospedeiras, infectando novas células. O ciclo tem a duração de 24-48h (MOULDER, 1991). A patogenia da clamidiose felina ainda não está totalmente esclarecida. O primeiro relato sobre isolamento do agente etiológico da clamidiose felina ocorreu em 1942, a partir de material proveniente do pulmão de um felino naturalmente infectado (BAKER, 1942). Em decorrência deste fato, a doença foi denominada de pneumonite felina, termo este erroneamente empregado, tendo em vista que o microrganismo raramente causa pneumonia em gatos (BART et al., 2000). Em 1967, CELLO, citado por RAMSEY (2000), relatou conjuntivite em gatos causada por C. felis. A partir daí, ficou demonstrado o tropismo deste agente pelas células do epitélio da conjuntiva, causando conjuntivite aguda à crônica (HOOVER et al., 1978). A bactéria já foi isolada de pulmões, fígado, baço e rins de gatos (DICKIE, 1980; WILLS et al., 1988; MASUBUSHI et al., 2002), não obstante o significado da presença deste microrganismo nestes locais ainda continua obscuro. C. felis também tem sido encontrada na mucosa gástrica de gatos, em macrófagos e células de descamação no exsudato peritonial, além de células intestinais (DICKIE, 1980, HARGIS et al., 1983; GAILLARD et al., 1984), estes são indícios de que o trato gastrointestinal seria um local de infecção persistente em felinos, assim como ocorre em outras espécies de clamídias que parasitam aves e ruminantes (SYKES, 2001). A transmissão horizontal de C. felis de felinos domésticos infectados a gatos susceptíveis, independente da presença de sinais clínicos da doença, ocorre primariamente por meio de contato direto com secreções oculares contaminadas e, indiretamente, pela contaminação de fômites. A transmissão por aerossóis tem sido motivo de controvérsia entre alguns autores. Assim, HOOVER et al. (1978) relataram a ocorrência de infecção experimental em gatos submetidos experimentalmente à nebulização de C. felis durante 3 minutos. Entretanto, POVEY (1990) propõe que a transmissão por aerossóis não é um evento comum, uma vez que dificilmente a C. felis compromete o trato respiratório superior e, ainda, segundo esse autor, os felinos possuem um pequeno volume de secreção expiratória, o que limita a produção e projeção de gotículas contendo CE. A transmissão venérea em felinos ainda não foi comprovada, contudo, sabe-se que a transmissão para neonatos ocorre na superfície da mucosa do trato reprodutivo e no ducto nasolacrimal durante o parto (TERWEE et al., 1998). Os sinais clínicos da doença variam conforme a idade do animal, imunocompetência, modo de exposição ao agente (experimental ou natural), tecido e volume inoculado (RAMSEY, 2000). Em geral, na infecção natural os sinais clínicos da doença são observados entre 5 a 14 dias pós-exposição. Durante a fase aguda da doença, observa-se secreção ocular serosa profusa, com presença de quemose, hiperemia da mucosa conjuntival e blefarospasmos. Inicialmente, um dos olhos é atingido e, após 5 a 21 dias, o outro olho também apresenta os mesmos sinais. A hipertermia pode ou não ocorrer, bem como coinfecções na conjuntiva, resultando em descarga ocular purulenta (WILLS et al., 1984). Secreção nasal e espirros têm sido observados em alguns felinos, sendo tal ocorrência mais comumente observada em animais jovens (cinco semanas a nove meses de idade). Na maioria dos felinos naturalmente infectados, a doença é auto limitante. Infecções brandas em filhotes regridem espontaneamente após duas a seis semanas e em menos de duas semanas em gatos mais velhos (RAMSEY, 2000). Os sinais clínicos melhoram após poucas semanas, contudo a conjuntivite pode persistir por meses. Em alguns casos, a conjuntivite melhora 60 dias pós- infecção, mas os gatos continuam a abrigar o agente (O’DAIR et al., 1994). Anticorpos maternais contra C. felis foram detectados no colostro provenientes de gatas expostas a uma infecção prévia, os quais persistiram e protegeram os filhotes durante nove a 12 semanas de vida (WILLS et al., 1984). Por outro lado, C. felis também foi isolada de felinos neonatais com conjuntivite, embora muitos dos filhotes aparentemente estivessem protegidos pelos anticorpos maternos (SYKES, 2005). Acredita-se que a C. felis também possa estar envolvida em casos de abortos, mortalidade neonatal e infertilidade em gatos, embora tal suspeita ainda não tenha sido definitivamente confirmada (BRANDT et al., 1986). Todavia, POINTON et al. (1991) demonstraram que a infertilidade e abortos estão igualmente distribuídos em gatis com ou sem infecção por C. felis. Consoante revelam SYKES et al. (1999a), a infecção de tecido placentário por C. felis já foi confirmada por meio da PCR em uma gata experimentalmente infectada durante o período de gestação. Embora tenha tido parto normal, a gata eliminou C. felis, via vaginal, do momento do parto até 12 dias pós-parto, apesar de no exame histopatológico, não ter apresentado placentite. A habilidade da Chlamydophila em causar doenças do trato reprodutivo também depende do estágio de prenhez em que ocorre a infecção, além de coinfecção com outros microrganismos, imunossupressão concomitante, grau de infecção e a amostra envolvida (SYKES, 2005). O potencial zoonótico da C. felis ainda é controverso e está sendo investigado. Alguns autores atribuem a C. felis a etiologia de casos de pneumonia atípica (COTTON & PARTRIDGE, 1998), de hepatoesplenomegalia (GRIFFITHS et al., 1978), de glomerulonefrite e de endocardite (REGAN et al., 1979) em humanos. Entretanto, em todos os casos assinalados, as associações foram baseadas em resultados de provas sorológicas gênero-específicas e no contato destes pacientes com gatos, contudo não foi realizado um teste laboratorial de diagnóstico confirmatório da presença do agente nos animais. Por outro lado, HARTLEY et al. (2001) relatam, após a tipificação do DNA, por meio de enzimas de restrição, que uma amostra de clamídia isolada de um homem HIV positivo apresentando sintoma de conjuntivite crônica era idêntica à amostra isolada de um filhote de gato recentemente adquirido por ele. O diagnóstico precoce de infecção por C. felis é importante, pois possibilita um tratamento adequado e previne a disseminação da doença (OHYA et al., 2010). Tal diagnóstico é passível de ser realizado por meio da detecção direta do agente em amostras de tecidos ou em suabes ou por meio da pesquisa de anticorpos anti-clamídia, realizada em amostras de sangue (SACHSE et al., 2009). O isolamento do agente em cultura de células ou ovos embrionados é o método padrão para o diagnóstico de Chlamydiaceae, porém, a necessidade de técnicos experientes e laboratório de biossegurança dificultam a realização do procedimento como técnica de rotina, restringindo este tipo de diagnóstico a poucos laboratórios (PEELING & BRUNHAM, 1996). Em síntese, o diagnóstico da infecção por clamídia é difícil, pois o isolamento do patógeno requer pelo menos duas semanas para ser concretizado (SACHSE et al., 2009). Usualmente o isolamento da C. felis é realizado em cultura de células das linhagens McCoy, HeLa, Vero, L929 e BGM ou em ovos embrionados de galinha de 6 a 7 dias de incubação, a partir de amostras oriundas de conjuntiva, orofaringe, reto, fezes, secreção vaginal ou de tecidos dos animais suspeitos. As monocamadas de células entre o 2º e o 6º dia pós-inoculação e os esfregaços das membranas dos sacos vitelinos dos embriões mortos entre 4º e 12º dias são fixados em metanol e submetidos aos métodos de coloração de Gimenez, Macchiavello ou Stamp para a visualização do agente. Anticorpos monoclonais gênero-específicos, acoplados ao isotiocianato de fluoresceína, são também utilizados para identificar as inclusões intracitoplasmáticas de Chlamydiaceae nas células hospedeiras (ANDERSEN, 1998). O procedimento de inoculação em ovos embrionados, por ser demorado, é comumente utilizado para conservação de amostras e produção de antígeno (GRIMES, 1996). A técnica de PCR vem sendo avaliada na medicina veterinária em comparação às técnicas tradicionais de diagnóstico de Chlamydiaceae. Tem como vantagem a capacidade de detectar pequenas quantidades de DNA presente na amostra e não necessitar de organismos viáveis (MCDONALD et al., 1998; SYKES et al., 1999a). Amostras para o isolamento podem ser colhidas do saco conjuntival de gatos, por meio de suabes embebidos com salina. Por se tratar de microrganismo intracelular, é importante obter suabes com quantidade suficiente de células conjuntivais (GRUFFYDD-JONES et al., 2009). SYKES et al. (1999a) demonstraram que a cultura celular permanece positiva um dia após o início do tratamento com doxiciclina, enquanto na PCR, o DNA do microrganismo continua sendo detectado após cinco dias de tratamento. Segundo estes autores, a técnica de PCR é significativamente mais sensível que a de cultura celular em gatos não tratados (85,7% para PCR versus 72,9% para cultura) e em gatos com sinais clínicos da doença (89,2% para PCR e 79,2% para cultura). O diagnóstico molecular das Chlamydiaceae é baseado na detecção dos genes 16S, 23S e dos genes codificadores para as proteínas de membrana (ompA, omp2, MOMP) presentes na parede da bactéria (SACHSE et al., 2009). Deve ser considerado que o diagnóstico pela PCR é gênero-específico e não espécie-específica, razão pela qual, se faz necessário o uso de enzimas de restrição (EVERETT et al., 1999; HARTLEY et al., 2001). Teste de detecção gênero-específico do antígeno clamidial usando ELISA também pode ser utilizado no diagnóstico, apesar de tais procedimentos serem menos sensíveis e confiáveis que a PCR (GRUFFYDD-JONES et al., 2009). O exame de esfregaços de conjuntiva corados com Giemsa ou Gimenez também pode ser utilizado como método auxiliar no diagnóstico da clamidiose felina; contudo, não é um método seguro, pois depende da experiência do citopatologista. As inclusões intracitoplasmáticas, adjacentes ao núcleo de célula, aparecem coradas (de azul a púrpura); corpos reticulares livres podem ser reconhecidos como manchas bipolares (LAVACH et al., 1977). Os corpos reticular e elementar devem ser diferenciados dos grânulos de melanina, restos nucleares, bactérias ou inclusões induzidas por medicamentos tópicos como a Neosporina (LAVACH et al., 1977; WILLS et al., 1988; VON BOMHARD, 2003). O sorodiagnóstico é o procedimento mais comumente utilizado para a detecção de anticorpos na rotina das doenças causadas por Chlamydiaceae. Entre as provas sorológicas, as mais utilizadas são a reação de fixação do complemento (RFC), a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA). Em felinos não vacinados, a detecção de anticorpos é indicativa de infecção por C. felis (GRUFFYDD-JONES et al., 2009). A RFC é utilizada desde 1930 para o diagnóstico de clamidioses (FUKUSHI et al., 1985; WERTH, 1989; BART et al. 2000). O teste é gênero-específico, ou seja, é bastante específico, porém de baixa sensibilidade; utiliza o lipopolissacarídeo (LPS) como fonte de antígeno, comum a todas as Chlamydiaceae, sendo empregado para confirmar um diagnóstico presuntivo (MANNION, 1991). É relativamente pouco sensível, particularmente na presença de uma infecção em andamento. Entretanto pode ser útil na detecção de anticorpos tardios (CELLO, 1971). WILLS et al. (1988) relatam que a RFC não é um teste sorológico confiável, já que alguns autores não têm conseguido detectar anticorpos fixadores de complemento em felinos experimentalmente infectados (CELLO, 1971; SHEWEN et al., 1980). Segundo esses autores, provavelmente ocorra em felinos um fenômeno semelhante ao que ocorre em infecção por clamídia em bovinos, em cuja espécie a resposta de IgG2 é maior que IgG1, particularmente nos casos de infecções locais (PEREZ-MARTINEZ & STORZ, 1986). Como o soro de cobaio fixa melhor IgG1 e não IgG2, a reação pode dar um falso negativo, tornando assim a RFC um método não confiável para a detecção de anticorpos em algumas espécies de animais (SCHMMER et al., 1987), entre elas os felinos. A RFC, embora específica, é menos sensível do que a RIFI, quando utilizada na pesquisa de anticorpos anti-Chlamydiaceae em felinos domésticos, uma vez que em somente 9,4% (10/106) dos soros positivos à RIFI, foram detectados anticorpos fixadores do complemento (SEKI et al., 2010). WILLS et al. (1987), ao estudarem comparativamente os resultados das RFC e RIFI em soros de felinos vacinados e não vacinados, ambos infectados experimentalmente após a imunização, observaram que soros de animais cujos títulos de anticorpos foram ≥ 1024 na RIFI, não apresentaram níveis detectáveis de anticorpos fixadores de complemento. A RIFI é um método eficiente para detecção de anticorpos séricos em animais infectados. Contudo, face à possibilidade de ocorrência de reações cruzadas com outras bactérias, baixos títulos (≤ 32) na RIFI são considerados negativos. Infecções ativas ou recentes são frequentemente associadas com títulos > 512. Dessa forma, a sorologia pode ajudar a confirmação de uma infecção endêmica em um grupo, onde a presença de altos títulos de anticorpos sugere que a Chlamydophila seja agente etiológico, enquanto baixos títulos descartam o envolvimento da bactéria (GRUFFYDD-JONES et al., 2009). A utilização de testes sorológicos, por meio de titulação de soro pareada, com intervalos de três semanas, também pode caracterizar o diagnóstico de uma infecção ativa (PEREZ-MARTINEZ & STORZ, 1986). Em estudo realizado por WILLS et al. (1988), mais de 95% dos felinos positivos para detecção direta da C. felis apresentaram títulos séricos superiores a 32, contudo em 7,5% dos animais, nos quais não foi possível a detecção direta do agente, também foram detectados soros com títulos nesses mesmos patamares (32). Na Suécia, pesquisa de anticorpos pela RIFI em felinos, sem sinais clínicos de clamidiose, revelou que a maioria dos animais apresentou títulos de anticorpos inferiores a 128 (HOLST et al., 2006). Embora altos títulos de anticorpos sejam indício de exposição prévia ao agente, não indicam necessariamente que um felino esteja com uma infecção ativa. Consoante revelam MCDONALD et al. (1998) revelam que somente 41% dos gatos soropositivos pela RIFI foram positivos na PCR, reafirmando a importância da detecção direta do agente. No que diz respeito às técnicas imunoenzimáticas (ELISA), são poucos os estudos sorológicos descritos em que tais métodos são utilizados no diagnóstico indireto da C. felis. LANG (1992), utilizando uma amostra de C. abortus como fonte de antígeno para ELISA, obteve positividade em 22% dos 132 felinos atendidos em rotina hospitalar. WASMOEN et al. (1992) utilizaram com sucesso um kit imunoenzimático comercial (ELISA) aplicado ao diagnóstico humano de clamídias (C. trachomatis), em estudo objetivando verificar a soroconversão em animais vacinados. Um ano após a imunização e o desafio dos animais com C. felis, anticorpos ainda foram detectados por este teste. Estudos utilizando proteínas recombinantes como fonte de antígeno no ELISA, revelaram ser possível a diferenciação de felinos vacinados de não vacinados (OHYA et al., 2008, OHYA et al., 2010). Comparações entre técnicas de ELISA, RFC e RIFI, utilizando-se amostras de soros de ovinos revelaram uma correlação de 50 a 98% entre a RFC e ELISA e de 70,5% a 94,3% entre a RIFI e ELISA (MARKEY et al., 1993; GRIFFITHS et al., 1996). Os resultados obtidos por esses autores comprovam a possibilidade de utilização de antígeno anti-Chlamydiaceae, ou seja, gênero-específico, na realização de provas sorológicas. Antígeno de Chlamydophila psittaci produzido a partir de ovos embrionados infectados foi utilizado por SALINAS et al. (1993) para detecção de anticorpos anti- clamídia em pombos, pelo método de microimunofluorescência Indireta (MIF). Ao comparar as amostras de soro destes pombos submetidas à MIF e RIFI, RFC e ELISA, observaram que MIF é um eficiente método para diagnóstico sorológico, entretanto o ELISA revelou-se mais sensível embora menos específico. Trabalhos realizados com amostras de Chlamydia trachomatis de origem humana revelaram que a reação de ELISA é mais sensível que a RFC e, ainda, há uma boa correlação entre o ELISA e a RIFI (MAHONY et al., 1983; SAIKKU et al., 1983). A RIFI é um teste relativamente fácil de ser executado e interpretado, todavia requer o uso de um microscópio equipado para fluorescência. Por outro lado, o ELISA elimina interpretações subjetivas inerentes a RIFI, devido aos valores objetivos da espectrofotometria (PEREZ-MARTINEZ & STORZ, 1986). Estudos referentes à detecção direta e indireta de C. felis em felinos domésticos já foram realizados em vários países. A presença de anticorpos variou de 0 a 40% em estudos realizados pela RFC (STUDDERT & MARTIN, 1970; POVEY & JOHNSON, 1971; STUDDERT et al., 1981; WERTH, 1989) e de 5,3 a 59% pela RIFI (GETHINGS et al., 1987, WILLS et al., 1988, GUNN-MOORE et al., 1995, HOLST et al., 2006). A presença do antígeno foi revelada em 11,5% dos animais estudados após o isolamento em cultura celular (WILLS et al., 1988); 14,1 e 76,92% pelo ELISA direto (GRUFFYDD-JONES et al., 1995; TRÁVNICEK et al., 2002); 18 a 49% pela imunofluorescência direta (POINTON et al., 1991; NASISSE et al., 1993) e 1,1 a 23% pela PCR (MCDONALD et al., 1998; SYKES et al., 1999b, MOCHIZUKI et al., 2000; RAMPAZZO et al., 2003; VON BOMHARD et al., 2003; MARSÍLIO et al., 2004). A diferenciação entre a C. felis e outros agentes causadores de conjuntivite e doença do trato respiratório superior de felinos é de suma importância para confirmação do diagnóstico clínico da doença. Os agentes mais comumente envolvidos no complexo respiratório felino além da C. felis são: calicivírus felino (CVF), vírus da rinotraqueíte viral felina ou herpesvírus felino tipo 1(HVF-1) e Mycoplasma sp. A distinção clínica entre C. felis e HVF-1 é bem difícil, uma vez que os sinais clínicos são similares e o diagnóstico conclusivo do agente é importante para o tratamento efetivo e a adoção de medidas profiláticas específicas. Portanto, a associação destes agentes com a C. felis pode mascarar ou dificultar o diagnóstico clínico (GASKELL & DAWSON, 1990). Felinos domésticos com infecções concomitantes por CVF e clamidiose felina frequentemente apresentam, além da conjuntivite, ulcerações orais. Os calicivírus são menos virulentos, podendo ou não produzir lesões pulmonares; as estirpes virais mais patogênicas causam pneumonia severa acompanhadas de transtorno do trato respiratório inferior. Uma leve rinite também pode ocorrer (LOVE, 1972; POVEY, 1976; RAMSEY, 2000). Na rinotraqueíte viral felina, causada pelo HVF-1, rinite e traqueíte associados a outros sinais clínicos, principalmente descarga nasal, são mais severas que a pneumonia (LOVE, 1972; POVEY, 1976). Coinfecções com o vírus da imunodeficiência felina (FIV) prolongam a duração da conjuntivite e o tempo de eliminação da Chlamydophila (O´DAIR et al., 1994). O HVF-1 é um alfa herpesvírus, com dupla fita de DNA que possui envoltório bilipídico e capsídeo icosaédrico. Têm tropismo pelo epitélio da conjuntiva, da córnea e do trato respiratório superior (NASISSE et al., 1989; STILES, 1995; STILES, 2000). Acomete principalmente filhotes e jovens adultos e estima-se que 80% dos felinos apresentam infecções latentes, característica comum aos membros da família Herpesviridae (GASKELL & POVEY, 1977; GASKELL & POVEY, 1979). A transmissão horizontal ocorre por contato direto com secreções nasais e oculares contaminadas. Devido ao efeito citopático do vírus, ocorrem erosão e inflamação dos epitélios (THIRY et al., 2009). Em linhas gerais, a fase aguda da rinotraqueíte viral felina é caracterizada por conjuntivite, na maioria das vezes bilateral, acompanhada de descarga serosa ou mucopurulenta, assim como, envolvimento do trato respiratório superior acompanhado de descarga nasal, traqueíte, tosse e espirros. Nos casos severos, ocorre ceratite e úlceras de córnea (NASISSE et al., 1989; NASISSE et al., 1992; STILES et al., 1997; STILES, 2000). De distribuição mundial, em muitos felinos a infecção pode ser reativada em situações de estresse e tratamento a base de imunossupressores (corticoides ou quimioterápicos) (THIRY et al., 2009). O diagnóstico sorológico do HVF-1 é obtido por meio do teste de vírus neutralização, apesar deste teste ser pouco utilizado, uma vez que os títulos de anticorpos são variavelmente baixos após uma infecção primária; títulos mais elevados raramente são observados em felinos com infecções recrudescentes (MAGGS, 2005). A detecção direta do HVF-1 pode ser realizada por meio do isolamento do vírus em linhagem celular de rim de felino (CRFK- Crandell feline kidney) e da PCR (SYKES et al., 1997b; STILES et al., 1997, MAGGS et al., 1999). Contudo, o resultado positivo da PCR deve ser interpretado com cautela, uma vez que pode representar uma pequena quantidade de vírus sendo eliminada ou que se trata de uma infecção latente e não necessariamente que o felino avaliado apresente sinais clínicos causados pelo herpesvírus felino, devendo ser levantada a possibilidade de uma coinfecção com outros agentes patogênicos (VOGTLIN et al., 2002). Em pequenas populações de felinos domésticos saudáveis a ocorrência da eliminação do HVF-1 foi menor que 1% e em grandes populações, especialmente quando os animais apresentavam sinais clínicos, o índice foi de 20% (GASKELL & POVEY, 1982; COUTTS et al., 1994, BINNS et al., 2000, HELPS et al., 2005). Alguns estudos relatam a coinfecção de HVF-1 e Chlamydophila felis em gatos domésticos, sendo esta infecção dupla relatada em 0,6% dos gatos domésticos na Austrália, 3% no Reino Unido, 7% na Itália e 10,6% no Japão (SYKES et al., 1999b; YAN et al., 2000; RAMPAZZO et al., 2003; HELPS et al., 2003). No Brasil, não encontramos relato de coinfecção em gatos domésticos. Além da coinfecção com C. felis, existe a possibilidade de uma coinfecção com agentes virais imunossupressores, como os vírus da FIV e FeLV, os quais podem exacerbar a apresentação clínica de uma enfermidade (HVF-1 e/ou C. felis) ou ainda, aumentar a eliminação do agente patogênico, facilitando desta forma à disseminação da enfermidade (REUBEL et al., 1992, O’DAIR et al., 1994). O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um retrovírus do gênero Lentivírus, cuja estrutura, ciclo e patogenia são muito semelhantes ao do vírus da imunodeficiência humana (HIV) (MILLER et al., 2000). O FIV é endêmico nas populações de gatos domésticos em todo o mundo, com ocorrência estimada em 1-14% em gatos sem sinais clínicos e em mais de 44% em gatos com manifestações clínicas ou na fase crônica da doença (PEDERSEN et al., 1987; HARTMANN, 1998). A transmissão vertical é rara de ocorrer, contudo o vírus é transmitido por mordidas, podendo ocorrer à transmissão durante o coito, tendo em vista que nesse momento, o macho tem o comportamento de morder a fêmea (YAMAMATO et al., 1989). Os gatos domésticos infectados permanecem assintomáticos por vários anos, sendo que alguns deles nem chegam a manifestar clinicamente a doença (ADDIE et al., 2000). Os sinais clínicos só se manifestam no momento da ocorrência da imunodeficiência, a qual é caracterizada por infecções secundárias, tais como gengivite-estomatite, rinite crônica, linfadenomegalia, perda de peso e glomerulonefrite imunomediada (HOSIE et al., 2009). O diagnóstico laboratorial direto é usualmente realizado por meio de cultura de células ou pela PCR; no caso específico da PCR, a sensibilidade e especificidade desta técnica variam entre 40 e 100%, quando comparado aos testes sorológicos (BIENZLE et al., 2004). A análise por Western blot é considerada o “teste ouro” para sorologia do FIV, pois detecta anticorpos que reconhecem a proteína p24 e o peptídeo da proteína de transmembrana (HOSIE et al., 2009). O vírus da leucemia felina (FeLV) é um Gammaretrovírus transmitido principalmente pelo contato direto frequente ou prolongado entre animais e ainda pela ingestão de água e alimentos contaminados (HOOVER & MULLINS, 1991). O vírus também pode ser transmitido pelas secreções respiratórias, lacrimais, pelo leite, urina e fezes (ARJONA et al., 2000), além de ser possível a transmissão venérea e durante a gestação (HARBOUR et al., 2002). Os sinais da infecção incluem leucemias, linfomas, síndromes mieloproliferativas e imunossupressão (LUTZ et al., 2009). Felinos jovens, que vivem em grupos, devido ao contato íntimo são mais susceptíveis à infecção (HOOVER & MULLINS, 1991). O diagnóstico direto da infecção é realizado pelo método de ELISA, utilizando para tanto a proteína p27 do vírus da FeLV, que é um marcador da infecção, apesar de nem sempre indicar viremia. Trata-se, portanto, de teste de alta sensibilidade (98,6%) (HOFMANN-LEHMANN et al., 2001) e especificidade (98,2%) (HARTMANN et al., 2001; HARTMANN et al., 2007; PINCHES et al., 2007). A imunocromatografia também é outro teste que pode ser utilizado para o diagnóstico da enfermidade, pois sua sensibilidade e especificidade são comparadas ao do teste de ELISA (HARTMANN et al., 2007; PINCHES et al., 2007). O teste de imunofluorescência direta em esfregaços sanguíneos também pode ser utilizado; contudo, em felinos leucopênicos ou quando poucos leucócitos estão infectados pelo vírus, limitam o uso desta técnica. O diagnóstico molecular tem por base a detecção do DNA (provírus) ou do RNA viral. Entretanto, o diagnóstico molecular somente tem sido preconizado nos casos em que o ELISA (baseado no p27) for inconclusivo. Os métodos sorológicos de diagnóstico em animais infectados pelo FeLV são difíceis de serem interpretados, uma vez que muitos gatos desenvolvem anticorpos contra retrovírus endógeno (LUTZ et al., 2009). De distribuição cosmopolita, a prevalência do FeLV vai depender da densidade da população de felinos domésticos. Quando há somente um felino doméstico, a prevalência é menor que 1% enquanto em gatis com grande população de gatos, e sem medidas de prevenção da enfermidade, esta percentagem excede os 20% (SARMA et al., 1973, ANDERSON et al., 2000; HOSIE et al., 1989; LEVY et al., 2006). Poucos trabalhos relatam a ocorrência de coinfecção por C. felis, Herpesvírus felino tipo 1, FIV e FeLV em felinos domésticos. O’DAIR et al. (1994) após realização de infecção experimental com Chlamydophila felis em felinos domésticos infectados ou não com FIV, demonstraram que nos animais com infecção secundária há exacerbação da progressão clínica da infecção viral e que os sinais clínicos da clamidiose são mais duradouros, levando ao aparecimento de conjuntivite crônica nestes felinos. A coinfecção por FIV e HVF-1 em felinos domésticos revelou que felinos infectados pelo FIV são mais propensos a ficarem doentes do que felinos não infectados por tais agentes, requerendo um tratamento mais adequado (REUBEL et al., 1992). Assim, a clamidiose e o herpesvírus felino são importantes patógenos do trato respiratório superior dos felinos domésticos e a coinfecção com agentes imunossupressores, particularmente FIV e o FeLV, podem piorar os sinais clínicos e o controle de tais agentes respiratórios nas populações de felinos acometidos. Portanto, a pesquisa destes agentes se torna importante, uma vez que na literatura nacional, são ainda escassos os trabalhos sobre este tema. III- OBJETIVOS 3.1 - Objetivo geral Avaliar a ocorrência de infecção por Chlamydophila felis e a coinfecção por herpesvírus felino tipo 1, vírus da imunodeficiência felina e vírus da leucemia felina, em gatos domésticos por meio de técnicas sorológicas e moleculares. 3.2 - Objetivos específicos - Produzir em ovos embrionados de galinha SPF, inoculados via saco vitelino, suspensão antigênica purificada de Chlamydophila abortus, antígeno para os testes sorológicos: reações de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA indireto; - Detectar, por meio da PCR, a presença de DNA de Chlamydophila felis comparando protocolos de PCR utilizando-se diferentes genes, e a presença de DNA de herpesvírus felino tipo 1, em suabes de conjuntiva de gatos domésticos, - Avaliar comparativamente os resultados obtidos por meio da PCR com aqueles obtidos na RIFI e ELISA indireto. - Detectar anticorpos anti FIV assim como antígeno de FeLV, por meio do kit comercial ELISA Snap-Combo® FIV-FeLV, na população de gatos domésticos naturalmente infectados, bem como investigar a ocorrência de coinfecção com Chlamydophila felis e HVF-1. IV- MATERIAL E MÉTODOS 4.1- Animais Foram avaliados 235 gatos domésticos, machos e fêmeas, jovens e adultos, sem histórico de vacinação para C. felis, dos quais, 145 eram oriundos do Centro de Esterilização de Caninos e Felinos (CECF) da FCAV – UNESP, Campus de Jaboticabal, cujo exame físico não apresentou sinais clínicos compatíveis com complexo respiratório felino; 20 oriundos de um gatil com histórico e sinais clínicos compatíveis com clamidiose felina na cidade de Jaboticabal e 70 gatos eram provenientes da cidade de São Luís, Estado do Maranhão, cujos proprietários não relataram histórico de complexo respiratório felino. 4.2- Colheita de material biológico A colheita bilateral de material da membrana conjuntival (n=235) foi realizada com auxílio de suabes esterilizados que, após a colheita e identificação de cada amostra, foram acondicionados em microtubos plásticos contendo 1 mL de etanol absoluto. Posteriormente, as amostras foram acondicionadas à temperatura de -20o C para posterior processamento. A colheita de sangue dos gatos (n=201) foi realizada por punção da veia jugular, com agulha (20 mm x 5,5 mm) e seringas esterilizadas de 3 mL descartáveis. Após a formação do coágulo, o soro foi separado do sangue total por centrifugação (800 x g) e acondicionado à temperatura de -20o C até o momento de uso. Não foi possível a colheita de sangue de 31 felinos. O número de amostras de soro (n= 201) e de suabe de conjuntiva (n= 235) conforme o local de procedência dos animais encontra-se sumariado na Tabela 1. Tabela 1: Número de amostras de soro e de suabes de conjuntivas colhidas dos felinos domésticos e o local de procedência. Jaboticabal-SP, 2011 Local de Procedência Número de amostras de soro Número de amostras de suabe de conjuntiva CECF 136 145 Gatil – Jaboticabal-SP 19 20 São Luís-MA 46 70 TOTAL 201 235 CECF- centro de Esterilização de Caninos e Felinos 4.3 – Produção do antígeno para os testes sorológicos O antígeno a ser utilizado nas reações sorológicas foi produzido em ovos embrionados – SPF (Specific Pathogen Free – livre de patógenos), gentilmente cedidos pela Hyline do Brasil. Para sua produção, foi utilizada a amostra de referência de Chlamydia psittaci sorotipo 1 (amostra S26/3), oriunda de aborto ovino (atualmente denominada Chlamydophila abortus), a qual foi propagada em ovos embrionados SPF, aos 7 dias de incubação. A suspensão de Chlamydophila abortus foi previamente diluída em solução salina tamponada com fosfato esterilizado (PBS - 0,01 M PO4 - 0,14 M NaCl pH 7,4), contendo antibióticos e antifúngicos (100μg/mL de cloridrato de vancomicina, 100μg/mL de sulfato de estreptomicina, 50μg/mL de sulfato de gentamicina e 10μg/mL de anfotericina B). A propagação foi realizada com a inoculação de 0,1 mL da suspensão de 200μg/mL do microrganismo no saco vitelino de cada ovo, em ponto de inoculação previamente demarcado, com o auxílio de um ovoscópio, segundo protocolo preconizado por e RASO et al (2006). Os ovos foram incubados à temperatura de 37o C, durante 4 a 12 dias e observados diariamente. Embriões mortos durante as primeiras 72 horas foram descartados. Os ovos contendo embriões mortos e todos aqueles que permaneceram vivos até o 19º dia de incubação foram abertos para visualização de alterações e para colheita da membrana do saco vitelino. A membrana corioalantóide foi retirada e o conteúdo de cada ovo colocado em placa de Petri esterilizado; as membranas dos sacos vitelinos foram recolhidas, posteriormente acondicionadas em criotubos estéreis e armazenadas à temperatura de -70o C. Para a confirmação da presença do microrganismo, foram realizados decalques dos fragmentos de cada saco vitelino, os quais foram secos ao ar, fixados com metanol por cinco minutos e corados pela técnica de Gimenez modificada (ANDERSEN, 1998). Os decalques foram considerados positivos quando inclusões de Chlamydophila foram visualizadas nas lâminas, por meio de microscópio de luz. As inclusões foram quantificadas, observando-se cinco campos microscópicos (aumento de 1000x), e considerando-se para leitura os escores: 0 (nenhuma inclusão), 1 (≤ 10 inclusões), 2 (11 a 20 inclusões) e 3 (≥ 21 inclusões). Como controle à purificação do antígeno específico e para identificação de eventuais reações inespecíficas entre proteínas do saco vitelino e soros de gato, optou-se em utilizar, como controle negativo do antígeno, sacos vitelinos de ovos embrionados, de 13 a 17 dias de incubação, não inoculados. Os procedimentos de colheita dos sacos vitelinos e armazenamento dos mesmos foram idênticos aos descritos acima. 4.4- Detecção de anticorpos anti-Chlamydophila 4.4.1.- Reação de Imunofluorescência Indireta para Chlamydiaceae com kit comercial (RIFI COMERCIAL) Com o intuito de ter um “Gold Standart Test” ou teste de referência, realizou-se pesquisa de anticorpos nas 201 amostras de soro de felinos domésticos do presente estudo, utilizando-se o kit comercial de RIFI, contendo como antígeno Chlamydia trachomatis cultivada em cultura de células L929, segundo protocolo adaptado previamente (SEKI et al, 2010). Como controle positivo da reação utilizou-se o soro proveniente de um felino imunizado com vacina contendo antígeno de C. felis, e o controle negativo foi um soro proveniente de um felino clinicamente sadio, com sorologia e PCR negativos para C. felis. Em linhas gerais, cada amostra de soro foi diluída 1:32 em PBS. Vinte e cinco microlitros da amostra diluída (1:32) de soro de cada animal foram adicionados à concavidade apropriada da lâmina – KIT COMERCIAL para Chlamydiaceae (BION™ Chlamydia-G Antibody Test System, Bion Interprises, EUA) já contendo o antígeno fixado para a RIFI. As lâminas, após incubação em câmara úmida a 37o C por 30 minutos, foram lavadas três vezes com PBS durante 10 minutos e, finalmente, secas ao ar. Em seguida, foram adicionados a cada concavidade das lâminas 25 L de conjugado (anticorpo anti-IgG felino conjugado ao isotiocianato de fluoresceína FITC™, F4262, Sigma Aldrich, EUA), diluído na sua dose de reatividade ótima, em PBS adicionado de 0,02% de azul de Evans, seguido de nova incubação em câmara úmida a 37o C por 30 minutos. Novamente as lâminas foram lavadas por duas vezes consecutivas em PBS e uma vez em água destilada, secas ao ar e montadas. Para cada lâmina utilizada foram preparados controles positivo e negativo da reação num volume de 25 L cada. A leitura das lâminas foi realizada com auxílio de microscópio equipado com luz fluorescente (Olimpus Mod. BX60, Tokyo, Japão), em aumento de 400x. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram fluorescência na diluição 1:32 (Figura 1). Após a triagem das amostras positivas, realizou-se a diluição seriada das amostras positivas para a obtenção do título final de anticorpos. FIGURA 1: Reação de Imunofluorescência Indireta para Chlamydiaceae com kit comercial (RIFI COMERCIAL). A: Reação negativa, aumento de 400X. B: Reação positiva, aumento de 400X. Jaboticabal, 2011. 4.4.2.- Reação de imunofluorescência indireta para Antígeno de Chlamydiaceae produzidas em ovos embrionados (RIFI OVO) 4.4.2.1.- Preparação do Antígeno O antígeno utilizado nas reações sorológicas foi produzido em ovos embrionados SPF conforme o protocolo descrito por HANNA et al, (1972), com algumas alterações. Os sacos vitelinos com escore 2 ou 3 foram homogeneizados com auxílio de pérolas de vidro autoclavadas e 1mL de uma solução de tripsina 0,1% para cada saco vitelino, durante cinco minutos. A seguir, o material homogeneizado foi diluído em nove partes de PBS, e centrifugado a 500 × g por 5 minutos a 4o C. Após a centrifugação, em cada tubo foram visualizadas três bandas, sendo a superior constituída predominantemente por resíduos de saco vitelino, a intermediária correspondente à suspensão de Chlamydophila, e a inferior formada pela pérola de vidro e detritos celulares. Na sequência, a camada intermediária foi separada das demais, por meio de aspiração, utilizando uma pipeta Pasteur, e centrifugada a 10000 × g por 10 minutos a 4o C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em PBS contendo 1% de formol, seguido de incubação por 20 minutos à temperatura ambiente. O material foi centrifugando novamente a 10000 × g por 10 minutos a 4o C para a retirada do excesso de tampão fixador. Após tal procedimento, o sedimento foi ressuspenso em PBS contendo 1% de soroalbumina bovina (BSA) e centrifugado a 500 × g por 5 minutos a 4o C. Objetivando uma melhor clarificação do antígeno, foi acrescentado a este igual volume de PBS, seguido de três ciclos de centrifugação a 500 × g por 5 minutos a 4o C, sempre colhendo o sobrenadante e descartando o sedimento. O sobrenadante final foi então colhido e considerado a solução estoque de antígeno. A concentração ótima de uso do antígeno a ser colocada nas concavidades da lâmina foi obtida a partir de reações realizadas em lâminas com diluições seriadas do antígeno estoque. Após o teste de RIFI, realizado com um soro na diluição de 1:32 de gato doméstico, sabidamente positivo, aquela concentração cuja aparência microscópica foi a mais homogênea e, ademais, melhor distribuída, foi a escolhida para a preparação do substrato antigênico das lâminas. Portanto, 10 μL da suspensão do antígeno assim aferida, ou seja, na sua concentração ótima de uso, foram adicionadas a cada concavidade das lâminas de RIFI. As lâminas foram secas à temperatura ambiente, envoltas individualmente em papel higiênico de folha dupla e separadas em blocos contendo quatro lâminas, envoltas em papel alumínio e devidamente etiquetadas. Após, as lâminas foram acondicionadas em sacos plásticos hermeticamente fechados, estocadas a -20o C até o momento do uso. 4.4.2.2.-Descrição da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) Foram avaliadas por meio deste ensaio sorológico, 201 amostras séricas de gatos domésticos. No momento da reação, as lâminas contendo o extrato antigênico foram descongeladas à temperatura ambiente. A seguir, 10μL de cada amostra de soro, diluída a 1:32 em PBS foram depositados em cada concavidade das lâminas. Estas foram incubadas a 37o C por 30 minutos, em câmara úmida e, a seguir, foram submetidas a duas lavagens de 5 minutos cada em PBS. Seguiu- se a secagem das lâminas e a adição de 10 μL do conjugado (anticorpo anti-IgG felino conjugado ao isotiocianato de fluoresceína - FITC-Sigma, EUA), diluído a 1:150 em PBS contendo 0,01% de azul de Evans. A seguir, as lâminas foram novamente incubadas a 37o C, por 30 minutos, após o qual, foram feitas mais duas novas lavagens, conforme anteriormente descrito, seguido de montagem das lâminas com lamínula e glicerina tamponada com bicarbonato de sódio, pH 9,6. Em cada lâmina utilizava-se soro de gato controle positivo e soro de gato controle negativo, diluídos a 1:32. A leitura das lâminas foi feita com auxílio de microscópio equipado com luz fluorescente (Olympus Mod. BX60, Tokyo, Japão). Após a triagem das amostras na diluição de 1:32, realizadas em duplicata, as amostras positivas foram tituladas, partindo-se de diluições seriadas (1:64, 1:128, 1:256, 1:512 e 1:1024). Após a leitura em microscópio equipado para fluorescência, consideraram-se positiva as reações contendo partículas brilhantes e bem demarcadas do antígeno (corpos elementares-CE) cujo título foi maior a 32 (Figura 2). 4.4.3.- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) indireto A reação de ELISA indireto foi baseada nos protocolos recomendados por MARKEY et al. (1993), com as devidas modificações que se fizeram necessárias para a otimização da reação. As condições ideais dos diferentes componentes da reação, ou seja, diluições de antígeno, anticorpo, além do tempo e temperaturas ideais de incubação das diferentes fases da reação foram estabelecidos, bem como a escolha dos melhores reagentes e tipo de placas a serem utilizados, com o propósito de se obter uma maior sensibilidade e especificidade da técnica. Foram avaliadas por este protocolo 201 amostras de soros de felinos domésticos. 4.4.3.1.- Elementos da reação 4.4.3.1.1- Antígeno O antígeno foi produzido por meio de inoculações em ovos embrionados (SPF) de galinhas com 7 dias de incubação, a partir de uma suspensão da amostra de referência Chlamydophila abortus. O DNA extraído da amostra foi submetido a sequenciamento nucleotídico, após amplificação de fragmentos genômicos pela PCR, para sua melhor caracterização, confirmando desta forma a sua origem. Figura 2: Reação de imunofluorescência indireta para antígeno de Chlamydiaceae produzidas em ovos embrionados (RIFI OVO) A: Reação positiva. Objetiva de imersão. B: Reação negativa. Objetiva de imersão. Jaboticabal, 2011. B A 4.4.3.1.2- Purificação dos Corpos Elementares (CE) de Chlamydophila abortus Os sacos vitelinos provenientes da inoculação do antígeno foram classificados com escores de presença de corpos elementares, após a coloração de Gimenez Modificada. Este escore variava de zero a três, sendo, zero ausência de corpos elementares e três, número de inclusões igual ou maior que 21, quando avaliados cinco campos microscópicos. Isto posto, os sacos vitelínicos com escore 2 ou 3 foram homogeneizados com auxílio de areia esterilizado e, a seguir, ressuspensos em 1 mL de PBS esterilizado para cada saco vitelino macerado. Após homogeneização, o material foi submetido a 800 × g, sob refrigeração durante 5 minutos. Após a centrifugação, em cada tubo foram visualizadas três bandas, sendo a superior constituída predominantemente por resíduos de saco vitelino, a segunda (banda intermediária) correspondente à suspensão de Chlamydophila, e a inferior, formada por areia e detritos celulares. Na sequência, a camada intermediária foi separada das demais por meio de aspiração com auxílio de uma pipeta Pasteur, sendo a seguir tratada com clorofórmio na proporção de 1/3 (v/v), ou seja, 1 mL de clorofórmio para 2 mL da amostra, durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após o tratamento, a suspensão foi novamente centrifugada a 900 × g por 10 min a 4o C, resultando em três camadas distintas, constituídas, respectivamente, de clorofórmio (base), saco vitelino (intermediária) e PBS (sobrenadante). A fase intermediária foi adicionada de igual volume de PBS, pH 7,2, e a seguir armazenada a -70o C até a fase de purificação. O procedimento de purificação do antígeno consistiu em peletagem em colchão de ditrizoato sódico de meglumina (Pielograf 76%, Justesa Imagem do Brasil S/A). Conforme preconizado por MARKEY et al (1993), a suspensão antigênica foi submetida a dois ciclos de centrifugação a 24000 × g por 2 horas a 4o C; sendo o primeiro com 20% de ditrizoato sódico de meglumina e o segundo com 32% de ditrizoato sódico de meglumina, ambos em PBS. O sedimento originado da purificação através dos ciclos citados, foi centrifugado a 17000 × g durante 15 minutos a 4o C e o sedimento resultante ressuspenso em 0,5 mL de uma solução de SDS (Dodecil sulfato de sódio) a 1% em PBS, a seguir, incubado a 37o C por 1 hora. Após este período de incubação, foi submetido à diálise (membrana de celulose D9277, SIGMA) durante 18 horas em PBS à 4o C. A presença do antígeno foi confirmada por meio da RIFI, frente a um soro de referência positivo. O conteúdo proteíco do antígeno solúvel foi determinado pelo método do ácido bicinconiníco, utilizando-se o kit de reagentes BCA (BCA Reagents Kit- Pierce Chemical Company), de acordo com as recomendações do fabricante. 4.4.3.1.3- Controle negativo do antígeno Como controle à purificação do antígeno específico e com o propósito de identificar eventuais reações inespecíficas entre proteínas do saco vitelino e soros de felinos, o mesmo protocolo realizado para a purificação de CE oriundos de sacos vitelinos infectados, também foi usado, porém com sacos vitelinos não inoculados com o antígeno, de ovos embrionados de 13 a 17 dias de incubação. 4.4.3.1.4.- Determinação da diluição ótima de uso do antígeno, do controle negativo e dos soros testes As diluições ótimas de reatividade do antígeno e do controle negativo foram determinadas pela diluição dos reagentes nas concentrações de 1, 5 e 10 μg/mL de proteína, em tampão carbonato bicarbonato de sódio 0,05M, pH 9,6. Os soros testes foram diluídos nas concentrações de 1:100, 1:200, 1:300 e 1:400. Foram testadas três soluções de diluição: PBS –tween 20 contendo 5% de leite em pó desnatado, PBS-tween 20 acrescido de 0,5% de soro albumina bovina (BSA) e PBS-tween 20 acrescido de 4% de soro equino. 4.4.3.2- Descrição da reação com concentração e diluente dos soros testes definidos Inicialmente, microplacas rígidas de fundo chato de 96 cavidades (Polysorb NUNC Immunoplate, NUNC, Dinamarca) foram sensibilizadas com 100 μL, por cavidade, da suspensão do antígeno e de seu respectivo controle negativo, na concentração de 1 μg/mL de proteína, diluído em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M pH 9,6. Após 24 horas de incubação, em câmara úmida, à temperatura de 4o C, as microplacas foram lavadas por cinco vezes com PBS, contendo 0,05% de tween 20 (PBS-T). Entre todas as fases da reação, as microplacas foram submetidas ao mesmo tratamento de lavagem. Na sequência, adicionaram-se, a cada cavidade da microplaca, 200μL da substância bloqueadora (PBS-T contendo 4% de soro equino), seguida de incubação em câmara úmida à temperatura de 37o C por 60 minutos. Após serem lavadas, conforme descrito anteriormente, as microplacas receberam 100 μL dos soros de referência (positivo e negativo), diluídos a 1:100 em PBS-T contendo soro de equino a 4%, e foram incubadas à temperatura de 37o C por 60 minutos, em câmara úmida. Na etapa seguinte, foram adicionados às microplacas lavadas, 100μL do conjugado imunoenzimático (IgG de caprino anti-IgG de gato (Anti-Cat IgG [H&L] – KPL - EUA) acoplado à peroxidase), na sua dose de reatividade ótima de uso (1:2000), diluído em PBS-T contendo 4% de soro de equino. As microplacas foram novamente incubadas em câmara úmida, por 60 minutos, à temperatura de 37o C. Finalmente, após a lavagem das microplacas foram adicionados a cada cavidade da microplaca, 100 μL do substrato enzimático, composto de uma solução cromógena de 10mg de ortofenilenodiamino (OPD) diluída em 25 mL de solução de citrato de sódio-fosfato pH 5,0, acrescida de 10 μL de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 30%. As microplacas foram mantidas a 37o C durante 10 minutos e, a seguir, bloqueadas por meio de 50 μl de uma solução de ácido sulfúrico 3M. 4.4.3.3.- Leitura e interpretação dos resultados A leitura final das densidades ópticas (DOs) de cada cavidade das microplacas foi realizada em leitor de microplacas de ELISA (Microplate Reader MRX TC Plus, Dynex Technology), a 490 nm (conjugado acoplado à peroxidase), contra branco constituído unicamente pelo substrato e bloqueador enzimático. O valor de ELISA do soro (DO líquida) foi expresso pela diferença dos valores de DO entre o antígeno e o controle negativo do antígeno. O ponto de corte da reação, calculado para cada placa, foi determinado pela média dos valores de diferença de DO (DO líquida) de soros de felinos utilizados como controle negativo, acrescido de três desvios-padrão (SOUSA et al., 2008). 4.4.3.4. Análise estatística dos dados A determinação da sensibilidade, especificidade e a estatística kappa foi realizada pela tabela de contingência, utilizando o kit comercial BION™ Chlamydia-G Antibody Test System (Bion Interprises, EUA) como teste de referência (BRAILE & GODOY, 1999). O valor do coeficiente de correlação (r de Pearson) foi determinado pela correlação entre os títulos obtidos na RIFI COMERCIAL e a RIFI OVO e os títulos obtidos na RIFI COMERCIAL e as DOs líquidas obtidos no teste ELISA. 4.5-Reação em cadeia pela polimerase (PCR) 4.5.1-Extração de DNA A extração do DNA foi realizada a partir das amostras de suabes de conjuntiva de gatos domésticos (n=235), colhidas em tubos contendo etanol. Os suabes foram descartados e os tubos centrifugados a 20.000 g, à temperatura de 4ºC, durante 30 minutos (RASO et al., 2006). O sobrenadante resultante foi descartado e o sedimento submetido ao protocolo de extração proposto pelo fabricante do kit Genomic DNA from Tissue® (Macherey-Nagel, Alemanha). Ao final do procedimento, o material extraído foi diluído em 70 μL de tampão Tris/HCl, pH 8,0. 4.5.2- Amplificação Com o intuito de se obter um fragmento maior e posteriormente utilizar enzimas de restrição para a confirmação da espécie de Chlamydiaceae envolvida, optou-se em testar três protocolos de PCR, cada um baseado na amplificação parcial de um gene (ompA, omp2 e MOMP). 4.5.2.1- Gene da ompA do gênero Chlamydiaceae Utilizaram-se iniciadores correspondentes à região conservada do gene da ompA do gênero Chlamydiaceae, conforme descrito por SYKES et al. (1997a). Foram utilizados os iniciadores Chla F (5’-ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG-3’) e Chla R (5’-CAAGATTTTCTAGACTTCATTTTGTT-3’), amplificando fragmento de 1094 pares de base (pb). A amplificação das amostras foi realizada em volume total de 25 μL, contendo 10mM de tampão tris-HCl pH 8,3 (Tampão 10X Biotools, Espanha), 1,5 mM de cloreto de magnésio (Invitrogen, EUA), 50 mM de cloreto de potássio, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP (Biotools, Espanha), 1 μg de cada oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, EUA), 1,25U de Taq DNA polimerase (Biotools, Espanha), 5 μL de amostra de DNA extraído e água ultrapura autoclavada. A seguir, a reação foi colocada em termociclador automático (MJ Research - PTC 200) programado para 1 ciclo de 95o C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 90o C por 1 minuto, de 56o por 1 minuto e um ciclo final de 72o C por 1 minuto. Foi utilizado como controles positivos da reação uma amostra de vacina contendo antígeno de “Chlamydia psittaci” (Fel-O-Vax LVK-IV®, FortDodge, EUA) e como controle negativo, água ultrapura autoclavada. 4.5.2.2- Gene da omp2 do gênero Chlamydiaceae O protocolo de HARTLEY et al. (2001) utiliza iniciadores correspondentes à região conservada do gene da omp2 do gênero Chlamydiaceae. Foram utilizados os iniciadores Ch 1 (5’-ATG TCC AAA CTC ATC AGA CGA G-3’) e Ch 2 (5’-CCT TCT TTA AGA GGT TTT ACC CA -3’), amplificando fragmento de 603 pares de base (pb). A amplificação das amostras foi realizada em volume total de 25 μL, contendo 10mM de tampão tris-HCl pH 8,3 (Tampão 10X Biotools, Espanha), 1,5 mM de cloreto de magnésio (Invitrogen, EUA), 200 μM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP (Biotools, Espanha), 5 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, EUA), 1,25U de Taq DNA polimerase (Biotools, Espanha), 5 μL de amostra de DNA extraído e água ultrapura autoclavada. A seguir, a reação foi colocada em termociclador automático (MJ Research - PTC 200) programado para 1 ciclo de 94o C por 4 minutos, seguido por 40 ciclos de 94o C por 1 minuto, 55o C por 1 minuto, 72o por 1 minuto, e um ciclo final de 72o C por 7 minutos. Foi utilizado como controle positivo da reação uma amostra de vacina contendo antígeno de “Chlamydia psittaci” (Fel-O-Vax LVK-IV®, FortDodge, EUA) e como controle negativo, água ultra pura autoclavada. 4.5.2.3- Gene da MOMP do gênero Chlamydiaceae A PCR para detecção da região conservada do gene da MOMP das Chlamydyaceae foi realizada conforme descrito por BUXTON et al. (1996), com algumas modificações já padronizadas (RASO et al., 2004). Foram utilizados os iniciadores 1 (5’-CAGGATATCTTGTCTGGCTTTAA-3’) e 2 (5’- GCAAGGATCGCAAGGATC-3’), amplificando fragmento de 260 pares de base (pb). A amplificação das amostras foi realizada em volume total de 25 μL, contendo 10mM de tampão tris-HCl pH 8,8 (Tampão 10X Biotools, Espanha), 0,2mM de DNTPs (Biotools, Espanha), 0,2 μM de cada oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, EUA), 1,25U de Taq DNA polimerase (Biotools, Espanha), 5 μL de amostra de DNA (para a reação de PCR) e água ultrapura autoclavada. A seguir, a reação foi colocada em termociclador automático (MJ Research - PTC 200) programado para 1 ciclo de 94o C por 10 minutos, seguido por 34 ciclos de 94o C por 1 minuto, 54o C por 1 minuto e 72o C por 1 minuto e 30 segundos e um ciclo final de 72o C por 4 minutos. Foram utilizados como controles positivo e negativo da reação, uma amostra de vacina contendo antígeno de “Chlamydia psittaci” (Fel- O-Vax LVK-IV®, FortDodge, EUA) e água ultra pura autoclavada, respectivamente. 4.5.2.4- Gene timidina quinase do herpesvírus felino tipo I A PCR para detecção de herpesvírus felino 1 foi realizada conforme protocolo descrito por SYKES et al. (1997b). Os iniciadores utilizados foram derivados da sequência do gene timidina quinase do herpesvírus felino tipo I (5’- GACGTGGTGAATTATCAGC-3’ e 5’-CAACTAGATTTCCACCAGGA-3’), amplificando fragmento de 287 pares de base (pb). A amplificação das amostras foi realizada em volume total de 50 μL, contendo 10mM de tampão Tris-HCl pH 8,3 (Tampão 10X Biotools, Espanha), 1,5mM MgCl2, 50mM KCl, 200mM de DNTPs (Amersham Biotools, Spain), 1 μg de cada oligonucleotídeo iniciador (Invitrogen, EUA), 1,25U de Taq DNA polimerase (Biotools, Espanha), 10 μL de amostra de DNA (para a reação de PCR) e água ultrapura autoclavada. A seguir, a reação foi colocada em termociclador automático (MJ Research - PTC 200) programado para 1 ciclo de 95o C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 90o C por 1 minuto, 56o C por 1 minuto e 72o C por 1 minuto e um ciclo final de 72o C por 4 minutos. Foram utilizados como controles positivos da reação uma amostra de vacina contendo antígeno de “Herpesvírus felino I” (Fel-O-Vax LVK-IV®, FortDodge, EUA) e como controle negativo, água ultrapura autoclavada. 4.5.3-Detecção do produto amplificado Os fragmentos gerados na PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose, preparado a 1,5% em tampão tris-borato-EDTA (Tampão TBE) 1X. Uma mistura de 8 μL de produto amplificado com 2μL de tampão de carregamento foi colocada em um poço do gel, com brometo de etídio na concentração final de 0,5 μg/mL. O gel foi submetido à eletroforese sob voltagem de 100 volts, durante 80 minutos. A visualização do produto amplificado foi realizada a um comprimento de onde de 254 nm em transiluminador de luz ultravioleta. 4.5.4 – Enzimas de restrição Os produtos amplificados dos controles positivos, pelos protocolos preconizados por SYKES et al. (1997a) e HARTLEY et al. (2001) foram submetidas à incubação com Alu I a 37o C por 1h, seguida de corrida de eletroforese em gel de agarose a 2%, em tampão TBE por 1 h. 4.6- Sequenciamento O sequenciamento das amostras positivas em estudo foi realizado com o objetivo de confirmar a similaridade das amostras detectadas na PCR com a amostra padrão de referência Chlamydophila felis e de Herpesvirus felino tipo 1. Para tanto, o sequenciamento dos produtos amplificados foi realizado por método automatizado, ou seja, com base no método da terminação da cadeia por dideoxinucleotídeo (SANGER et al., 1977). Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram os mesmos utilizados na PCR. O protocolo da reação de sequenciamento foi realizado, conforme preconizado pelo fabricante do kit big dye terminator cycle sequencing ready reaction (Perkin-Elmer Applied Biosystems), com algumas modificações. Utilizaram-se 3,5 μL do tampão 2,5 X (200mM Tris- HCl pH 9,0; 5mM MgCl2); 0,5 μL de big dye e 5 pmoles de cada oligonucleotídeo (os mesmos utilizados na PCR), 2,5 μL de água ultrapura e 1,5 μL de DNA (sendo o volume de DNA ajustado de acordo com sua concentração, mensurado em aparelho espectofotômetro (Nanodrop, Thermoscientific). As amplificações foram realizadas inicialmente no termociclador (MJ Research-Inc) a 96o C por 2 minutos e 35 ciclos de desnaturação a 96o C por 45 segundos, anelamento por 30 segundos (temperatura de anelamento ajustada segundo o protocolo de PCR de cada agente) e extensão a 60o C por 4 minutos e mantida a 4o C por tempo indeterminado. O processo de lavagem das amostras foi feito adicionando-se 80 μL de isopropanol a 75% em cada amostra. A placa foi selada com alumínio e, após incubação por 15 minutos em local escuro à temperatura ambiente, foi centrifugada a 4000 × g por 30 minutos, a 20o C. O sobrenadante foi descartado e 200 μL de etanol a 70% foram adicionados e a placa novamente centrifugada, agora por 10 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e a mesma quantidade de etanol 70% foi acrescida, repetindo o passo anterior. A placa foi centrifugada invertida (aceleração e desaceleração 1) e, em seguida, colocada na bomba de vácuo por 5 minutos para completa secagem das amostras. O sequenciamento foi conduzido no sequenciador ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems). 4.7.- Análise das Sequências As sequências de nucleotídeos obtidas foram submetidas a alinhamento e análise no Laboratório de Bioinformática do Laboratório de Biologia Molecular da FCAV- UNESP. A “trimagem” foi realizada pelo programa Phred (EWING et al., 1998), que avalia os eletroferogramas gerados nos sequenciamentos dos clones, observando-se a qualidade dos picos correspondentes à cada base sequenciada e conferindo um valor de probabilidade de erro a cada uma das amostras. O programa BLAST (BENSON et al., 2002) foi utilizado para analisar as sequências de nucleotídeos (BLASTN), com vistas à procura e comparação de sequências similares em banco de dados internacionais (GenBank), com aquelas obtidas no presente trabalho. 4.8- Detecção de anticorpos para FIV e de antígeno para FeLV Para a pesquisa de anticorpos para FIV e de antígeno (P27) para FeLV, as amostras de soros dos felinos foram submetidos à técnica de imunocromatografia, através de um kit comercial ELISA Snap-Combo® FIV-FeLV (IDEXX Laboratories), conforme as instruções do fabricante. A presença do antígeno p27 do FeLV representa o diagnóstico de infecção pelo FeLV, e a presença de anticorpos específicos do FIV indica de que o felino foi exposto ao FIV e pode apresentar uma infecção ativa pelo FIV. Das 201 amostras de soro coletadas, foram avaliadas 150 amostras, uma vez que as demais apresentaram volume insuficiente para a realização dos testes. V – RESULTADOS E DISCUSSÃO O presente estudo foi delineado com o propósito de avaliar o estado imune humoral, assim como pesquisar na conjuntiva de felinos domésticos naturalmente infectados, DNA de Chlamydophila felis. Para atingir tais objetivos foi necessário, inicialmente, estabelecer as condições ideais de uso dos testes sorológicos reação imunoenzimática - ELISA e de imunofluorescência - RIFI, para detecção da resposta imune humoral e dos métodos moleculares (reação em cadeia pela polimerase (PCR), para detecção genômica de Chlamydophila felis. Adicionalmente, por entender que o maior entrave na rotina clínica é estabelecer o diagnóstico diferencial entre a clamidiose felina e os demais agentes responsáveis por conjuntivite (complexo respiratório felino), foi também realizada a pesquisa de DNA para o HVF-1 e teste por imunocromatografia para os agentes imunossupressores virais da imunodeficiência felina (FIV) e da leucemia felina (FeLV), complementado com o sequenciamento dos produtos amplificados, com vistas a obter informações sobre a similaridade do material genético com a amostra de Chlamydophila felis e a estirpe de HVF-1. Os resultados e discussão que se seguem foram distribuídos em tópicos específicos para um melhor entendimento do assunto em questão. 5.1. Detecção de anticorpos anti-Chlamydophila O diagnóstico sorológico das Chlamydophila é baseado na pesquisa de anticorpos anti-lipopolissacarídeo (LPS), constituinte da membrana dos corpos elementares (CE) desta bactéria. Todas as bactérias da família Chlamydiaceae possuem em comum este componente antigênico, o qual tem sido amplamente utilizado no diagnóstico sorológico gênero-específico (WILLS et al., 1988; ANDERSEN, 1998; MCDONALD et al., 1998). Tal componente foi utilizado como fonte de antígeno tanto nas reações de imunofluorescência indireta (RIFI) como nas reações imunoenzimáticas (ELISA Indireto). Nas RIFIs realizadas por meio de um kit comercial (RIFI COMERCIAL), teste ouro da avaliação sorológica deste trabalho, a fonte de antígeno consistiu de uma amostra de Chlamydia trachomatis cultivada em cultura de células (L929), enquanto que nas RIFIs OVO e no teste imunoenzimático (ELISA indireto), a fonte antigênica consistiu de uma amostra de Chlamydophila abortus, propagada em saco vitelino de ovos embrionados SPF, sendo este último uma suspensão antigênica purificada. Os resultados das pesquisas de anticorpos anti-Chlamydophila realizadas nas 201 amostras de soro de felinos domésticos submetidos às RIFI (RIFI COMERCIAL, RIFI OVO) e ELISA Indireto (ELISA), encontram-se sumariados na Figura 3 e 4 e na Tabela 2. Pela RIFI COMERCIAL encontramos presença de 81% (162) de amostras sororeagentes e 19% (39) de amostras negativas (Figura 3). Dentre tais amostras, 67,3% (109/162) foram provenientes de soro de felinos colhidos no Centro de Esterilização de Caninos e Felinos (CECF), 10,5% (17/162) de soros de felinos com histórico e sinais clínicos compatíveis com clamidiose felina, colhidas em gatil situado na cidade de Jaboticabal (SP) e 22,2% (36/162) de soros de felinos colhidos na cidade de São Luís (MA) (Figura 4). Os resultados da RIFI OVO revelaram a presença de 55% (111) de soro reagentes e 45% (90) de amostras negativas (Figura 3). Dentre tais amostras, 60,4% (67/111) eram provenientes de soro de felinos colhidos no CECF, 16,2% (18/111) de soros de felinos com histórico e sinais clínicos compatíveis com clamidiose felina, colhidas em gatil situado na cidade de Jaboticabal (SP) e 23,4% (26/111) de soro de felinos colhidos na cidade de São Luís (MA) (Figura 4). Figura 3: Resultados das pesquisas de anticorpos anti-Chlamydophila realizadas nas 201 amostras de soro de felinos domésticos submetidos às RIFI (RIFI COMERCIAL, RIFI OVO) e ELISA Indireto (ELISA). Jaboticabal-SP, 2011. Por outro lado, os resultados do ELISA revelaram a presença de 31% (69/201) de sororeagentes e 69% (132/201) de amostras negativas (Figura 3). Dentre tais amostras, 59,4% (41/69) foram provenientes de soro de felinos colhidos no CECF, 20,3% (14/69) de soros de felinos com histórico e sinais clínicos compatíveis com clamidiose felina, do gatil situado na cidade de Jaboticabal, SP e 20,3% (14/69) de soros de felinos colhidos na cidade de São Luís, MA (Figura 4). Figura 4: Número de felinos domésticos reagentes nos testes sorológicos RIFI COMERCIAL (n=162), RIFI OVO (n= 111) e ELISA (n= 69), conforme o local de origem. Jaboticabal-SP, 2011. No que concerne aos resultados obtidos pela RIFI COMERCIAL e pela RIFI OVO (Figuras 3 e 4), estes confirmam os resultados de levantamentos sorológicos realizados no Reino Unido, nos quais foi detectada a presença de anticorpos anti-Chlamydophila em 45% (23/51) dos felinos domésticos mantidos em fazendas (GETTHINGS et al., 1987), em 60% de felinos com conjuntivite e em 96% de felinos com clamidiose recorrente (WILLS et al., 1988). No Brasil, verificou-se o mesmo, em 72% dos felinos domésticos (SEKI et al., 2010). Adicionalmente, outros trabalhos também revelaram uma alta ocorrência de clamidiose felina, sendo de 57,70% na Eslovênia (DOVC et al., 1998 apud DOVC et al., 2008) e de 30,20%, na Itália (DI FRANCESCO et al., 2004). Por outro lado, DOVC et al. (2008) e HOLST et al. (2006) encontraram uma baixa percentagem (16,70% e 11,00% respectivamente) na ocorrência de anticorpos anti- Chlamydophila em felinos domésticos, sem sinais clínicos compatíveis com complexo respiratório felino, à semelhança dos dados obtidos por NASISSE et al. (1993) os quais detectaram a presença de anticorpos anti-C. felis em 18% de felinos domésticos com conjuntivite. É importante ressaltar que, a presença de anticorpos indica exposição ao agente infeccioso e não necessariamente uma infecção ativa, consoante revelam WILLS et al. (1988), assertiva essa por nós compartilhados. No que diz respeito à presença de anticorpos em 31% dos felinos avaliados pelo ELISA (Figura 3), tal percentagem está perfeitamente compatível com os achados obtidos por LANG et al. (1992), os quais, utilizando-se também de C. abortus como fonte de antígeno, encontraram 22% de sororeagentes. A esse respeito, na literatura nacional e internacional consultada não foi encontrado nenhum estudo sorológico utilizando ELISA indireto para a detecção de anticorpos anti-Chlamydophila em soros de felinos domésticos, impossibilitando, dessa maneira, uma análise mais acurada sobre os resultados obtidos neste teste. Os resultados da quantificação dos títulos de anticorpos detectados nas 201 amostras de soro avaliadas revelaram títulos ≥ 512 em 33,83% (68/201) dos felinos submetidos à RIFI COMERCIAL e em 8,97% (18/201) nos submetidos à RIFI OVO (Tabela 2). Nesse sentido, felinos domésticos com títulos de anticorpos ≥ 512, embora clinicamente sadios, são considerados com infecções prévias ou crônicas por clamídia, segundo GUNN-MORE et al. (1995). Ainda, de acordo com GRUFFYDD-JONES et al. (2009), a presença de sinais clínicos da clamidiose, particularmente sinais oculares, associada a uma grande percentagem de animais com títulos de anticorpos ≥ 512 é um forte indício de que a população estudada apresenta a doença de forma endêmica; ao contrário, baixos títulos descarta a ocorrência da clamidiose no gatil. Contudo, estudos demonstram que a presença de grande percentagem de animais com títulos de anticorpos ≥ 512, ocorra devido à imunização ativa dos animais (SEKI et al., 2010). Dentro deste contexto, no presente estudo, optou-se por trabalhar com grupo experimental de felinos previamente selecionados sem histórico de vacinação. Assim sendo, a percentagem de animais com títulos de anticorpos ≥ 512 pela RIFI COMERCIAL (33,83%), da população de felinos estudada na presente pesquisa, pode ser atribuída à circulação do agente, e não a presença de anticorpos vacinais. Tabela 2: Resultados dos títulos dos soros de felinos domésticos (n=201) submetidos à detecção de anticorpos anti-Chlamydophila, pelas Reações de Imunofluorescência Indireta (RIFI COMERCIAL e RIFI OVO). Jaboticabal-SP, 2011. Títulos Percentual relativo (%) RIFI COMERCIAL RIFI OVO ≤ 128 48,8 (98/201) 84,57 (170/201) 256 17,41 (35/201) 6,46 (13/201) ≥ 512 33,83 (68/201) 8,97 (18/201) Ainda analisando a quantificação de anticorpos contra C. felis, dentre a população de animais sororeagentes avaliados por meio da RIFI COMERCIAL, 48,8% (98/201) apresentaram títulos de anticorpos inferiores a 128 e 84,57% (170/201), títulos de anticorpos nestes mesmos patamares quando avaliados pela RIFI OVO (Tabela 2). Do mesmo modo, títulos de anticorpos ≤ 128 também foram obtidos por outros estudos (HOLST et al., 2006). Segundo estes autores a grande quantidade de animais com estes títulos de anticorpos se deve ao fato da transmissão da doença ocorrer por contato direto entre animais doentes ou via fômites, com maior frequência de infecção em locais com grande concentração de animais. Na população de felinos domésticas estudada no presente trabalho, grande parte dos animais eram do CECF e da cidade de São Luís (MA), e não viviam aglomerados ou em gatis, tornando-se assim a transmissão da doença menos frequente. Avaliando-se em separado as populações de felinos domésticos sob estudo, segundo local de origem, observou-se que os soros de felinos colhidos no CECF, 109/136 (80,1%), 67/136 (49,3%) e 41/136 (30,1%) foram soro reagentes, respectivamente na RIFI COMERCIAL, RIFI OVO e ELISA. Dos 19 soros colhidos no gatil de Jaboticabal, 17/19 (89,5%), 18/19 (94,7%) e 14/19 (73,7%) foram reagentes, respectivamente frente ao RIFI COMERCIAL, RIFI OVO e ELISA. Dos 46 soros colhidos na cidade de São Luís (MA), 41 (30,1%), 14 (73,3%) e 14 (30,4%) apresentaram anticorpos, respectivamente frente à RIFI COMERCIAL, RIFI OVO e ELISA (Tabela 3). De uma forma geral, verifica-se que os anticorpos anti-Chlamydophila foram mais frequentes na população de felinos domésticos estudada no gatil de Jaboticabal. Essa elevada percentagem de felinos soropositivos certamente está relacionada ao fato destes animais conviverem em galpão, separados em subgrupos de três animais, em recintos de dois metros de comprimento por um metro de largura, cercados apenas por tela e que não tinham acesso à rua. Apesar da boa ventilação, a separação por tela entre um recinto e outro permite a passagem de aerossóis contaminados, e a eliminação de secreções contaminadas pelos espirros, favorecendo a transmissão da enfermidade (BANNASCH e FOLEY, 2005; SYKES, 2005). Já os felinos provenientes do CECF e da cidade de São Luís do Maranhão, pertenciam a proprietários que mantinham no máximo cinco felinos conviventes, com livre acesso à rua. Tabela 3: Resultados dos testes sorológicos (RIFIs e ELISA) dos felinos domésticos, conforme o local de origem. Jaboticabal-SP, 2011. LOCAL DE ORIGEM RIFI COMERCIAL RIFI OVO ELISA TOTAL + - + - + - CECF 80,1% (109/136) 19,9% (27/136) 49,3% (67/136) 60,7% (69/136) 30,1% (41/136) 69,9% (95/136) 136 Gatil- Jaboticabal-SP 89,5% (17/19) 10,5% (2/19) 94,7% (18/19) 5,3% (1/19) 73,7% (14/19) 21,3% (5/19) 19 São Luís- MA 78,3% (36/46) 11,7% (10/46) 56,5% (26/46) 4,5% (20/46) 30,4% (14/46) 69,6% (32/46) 46 TOTAL 162 39 111 90 69 132 201 Por outro lado, uma maior predisposição a doenças respiratórias em gatis está relacionada à alta rotatividade de animais, ao estresse, ao cuidado clínico- veterinário deficiente, à nutrição inadequada e a problemas clínicos recorrentes (BANNASCH e FOLEY, 2005). OHYA et al. (2010) revelam que o sorodiagnóstico não distingue felinos vacinados de naturalmente infectados. Em vista disso, no presente estudo, preconizou-se a formação de um grupo amostral composto apenas de felinos sem histórico de imunização ativa. Nestas condições, a presença de anticorpos se deve ao contato com C. felis em alguma fase da vida. A desvantagem do sorodiagnóstico é tão somente indicar exposição prévia a um agente e não necessariamente a presença de uma infecção ativa, ou seja, doença (WILLS et al., 1988). Daí, a necessidade de realização de estudos mais detalhados em animais soro reagentes para se estabelecer qual a real extensão da infecção, e se animais clinicamente sadios, porém contendo anticorpos anti-C. felis detectáveis podem carrear e disseminar o agente e, consequentemente, atuar como fonte de infecção. Em tais condições, torna-se necessário uma profunda avaliação do potencial de reativação da infecção, de manifestação de sinais clínicos e do risco de infecção a outros animais (HOLST et al., 2006). De fato, a detecção de uma infecção ativa é importante para prevenir a propagação do agente a outros felinos e monitorar a eficiência do tratamento (MCDONALD et al., 1998); para tal, o diagnóstico direto do agente é invariavelmente, o teste mais efetivo para a determinação do estado de infecção dos animais. 5.1.1.- Correlação entre os testes sorológicos Na tabela 4 encontram-se sumariados os resultados dos testes sorológicos realizados nas 201 amostras de soro de felinos domésticos avaliados, sendo a RIFI COMERCIAL, o teste de referência adotado. Os dados demonstram que houve concordância entre a presença de anticorpos anti-Chlamydophila pela RIFI COMERCIAL, RIFI OVO e ELISA em 25,9% das amostras testadas, assim como concordância na ausência de anticorpos pelos três testes em 12,4% dos felinos domésticos. Houve concordância entre pelo menos dois testes sorológicos em 30,9% das amostras positivas e em 30,8% das amostras negativas. Tabela 4: Resultados obtidos nos exames sorológicos nas amostras de soro de felinos domésticos. Jaboticabal-SP, 2011. RIFI COMERCIAL RIFI OVO ELISA Amostras + + + 25,9% (52/201) + + - 25,4% (51/201) + - + 5% (10/201) + - - 24,3% (49/201) - + + 0,5% (1/201) - - + 3% (6/201) - + - 3,5% (7/201) - - - 12,4% (25/201) A relação entre as RIFI COMERCIAL e RIFI OVO e RIFI COMERCIAL e ELISA tem sido estudada por meio da regressão linear, calculando-se o coeficiente de correlação (r) entre dois testes (Tabela 5). Da análise de tais resultados, verifica-se que a RIFI COMERCIAL é mais sensível que a RIFI OVO, havendo uma fraca correlação entre os testes conforme análise estatística kappa, cujo valor foi de 0,29 e r = 0,44. Denota-se ainda que a RIFI COMERCIAL foi mais sensível que o teste ELISA, havendo uma fraca correlação entre os testes conforme análise estatística kappa, cujo valor foi de 0,11 e r = 0,47 (Tabela 5). Tabela 5: Resultado da análise comparativa das RIFI para Chlamydiaceae (RIFI COMERCIAL), RIFI OVO e ELISA indireto (ELISA). Jaboticabal-SP, 2011. Método Testado Teste de Referência RIFI COMERCIAL Total Sensibilidade (%) Especificidade (%) kappa R + - RIFI OVO + 103 8 111 63,6 79,5 0,29 0,44 - 59 31 90 ELISA + 62 7 69 38,2 82,1 0,11 0,47 - 100 32 132 Total 162 39 201 Com efeito, em termos estatísticos, houve uma baixa correlação entre os testes realizados, corroborando com resultados de estudos realizados com ovinos (MARKEY et al., 1993) e pombos (SALINAS et al., 1993). A causa da baixa correlação, assim como da sensibilidade e especificidade entre os testes, pode ser atribuída à diferença de antígenos utilizados, assim como, à origem destes, ou seja, na RIFI COMERCIAL o antígeno foi produzido em cultura de células (L929), a partir de amostra de Chlamydia trachomatis. Enquanto o antígeno utilizado nas RIFI OVO e no ELISA, foram produzidos em ovos embrionados (SPF) de galinhas, com sete dias de incubação, inoculados com a amostra S26/3 de Chlamydophila abortus, oriunda de aborto ovino. Tais resultados estão concordes com os achados experimentais de SALINAS et al. (1993) que atribuíram a baixa correlação entre os testes sorológicos às diferenças na produção do antígeno. Dentro de tal contexto, apesar do diagnóstico sorológico das Chlamydiaceaes ser gênero-específico, uma vez que o antígeno imunodominate é o lipopolissacarídeo (LPS), a origem do antígeno parece alterar a especificidade da interação antígeno-anticorpo, provavelmente devido à presença de constituintes interferentes, nas suspensões utilizadas como antígenos, para os testes sorológicos, originários dos substratos onde a clamídia é cultivada. Nesse aspecto, consoante relatam CEVENINI et al. (1989), também pode haver ligação do anticorpo com outras proteínas presentes nas suspensões antigênicas, indicando o uso de tratamentos para o bloqueio de