UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL PROPAGAÇÃO, VARIABILIDADE GENÉTICA E QUÍMICA DE Zeyheria montana Mart BIANCA WALÉRIA BERTONI Química Industrial Jaboticabal – São Paulo – Brasil UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL PROPAGAÇÃO, VARIABILIDADE GENÉTICA E QUÍMICA DE Zeyheria montana Mart BIANCA WALÉRIA BERTONI Orientador: Prof. Dr. Carlos Ferreira Damião Filho Co-Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria Soares Pereira Jaboticabal – São Paulo – Brasil 2003 Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de DOUTOR EM AGRONOMIA – Área de Concentração Genética e Melhoramento de Plantas. Bertoni, Bianca Waléria B547p Propagação, variabilidade genética e química de Zeyheria montana Mart. / Bianca Waléria Bertoni. – – Jaboticabal, 2003 ix, 165 f.:il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2003 Orientador: Carlos Ferreira Damião Filho Banca examinadora: José Roberto Môro, Muracy Belo, Suzelei de Castro Franca, José Odair Pereira Bibliografia 1. Banco de germoplasma. 2. Micropropagação. 3. RAPD. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 575:631.53 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação. ii DADOS CURRICULARES DO AUTOR BIANCA WALÉRIA BERTONI - São José do Rio Preto, 12 de fevereiro de 1967. Graduada em Ciências com licenciatura plena em química pela Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de São José do Rio Preto. Graduada em Química Industrial pela Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP. Mestre em Agronomia pela Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal. Docente da Unidade de Biotecnologia da UNAERP, onde participa de projetos de cultura de tecido de plantas medicinais visando a conservação de recursos genéticos. Participou do projeto GENOMA ONSA – Sequênciamento do genoma da Xyllela fastidiosa FAPESP e do GENOMA SUCEST – Genoma da Cana, Sequencing – FAPESP. Atualmente é membro da equipe responsável pela implantação do banco de germoplasma in vitro de plantas medicinais do Cerrado. Projeto FAPESP temático-Biota intitulado “Monitoramento e ampliação do banco de germoplasma de plantas medicinais do Cerrado”. iii AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Suzelei de Castro França, pela preciosa convivência e eterna confiança. À Profa. Dra. Ana Maria Soares Pereira, pelo exemplo de coragem e perseverança e principalmente pelo companheirismo. Ao Prof. Dr. Carlos Ferreira Damião Filho, pela liberdade de escolha. À Rosane de Castro França, pelo enorme carinho e paciência com que sempre me acolheu. A todos os meus amigos da Unidade de Biotecnologia Vegetal da UNAERP, por terem de alguma maneira contribuído para este trabalho. À UNAERP e FAPESP, pelo apoio financeiro. i SUMÁRIO Página CAPÍTULO – 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 1.1.Introdução.................................................................... 1 1.2.Revisão de Literatura................................................... 3 1.3.Referências.................................................................. 10 CAPÍTULO – 2 PROPAGAÇÃO SEXUADA: AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Zeyheria montana MART. COLETADAS EM TRÊS ESTADOS BRASILEIROS RESUMO.......................................................................... 16 ABSTRACT....................................................................... 16 2.1.Introdução............................................................... .... 17 2.2.Material e Métodos...................................................... 19 2.3.Resultados e Discussão.............................................. 21 2.4.Conclusões.......................................................... ....... 25 2.5.Referências.................................................................. 25 CAPÍTULO – 3 PROPAGAÇÃO ASSEXUADA: ESTABELECIMENTO DO PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO DE Zeyheria montana MART RESUMO........................................................................... 27 ABSTRACT........................................................................ 27 3.1.Introdução.................................................................... 28 3.2.Material e Métodos....................................................... 30 3.3.Resultados e Discussão................................... .......... 32 3.4.Conclusões.................................................................. 40 3.5.Referências.................................................................. 40 CAPÍTULO - 4 SISTEMA REPRODUTIVO: DETERMINAÇÃO DO SISTEMA REPRODUTIVO RESUMO.......................................................................... 43 ABSTRACT....................................................................... 43 4.1.Introdução................................................................... 44 4.2.Material e Métodos...................................................... 46 4.3.Resultados e Discussão.............................................. 47 4.4.Conclusões.................................................................. 48 4.5.Referências.................................................................. 49 ii CAPÍTULO - 5 COLETAS E MAPEAMENTO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO ESTADO DE SÃO PAULO RESUNO........................................................................... 51 ABSTRACT........................................................................ 51 5.1.Introdução.................................................................... 52 5.2.Material e Métodos...................................................... 53 5.3.Resultados e Discussão............................................... 54 5.4.Conclusões................................................................... 93 5.5.Referências.................................................................. 93 CAPÍTULO - 6 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR RAPD DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana LOCALIZADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO. RESUMO........................................................................... 95 ABSTRACT........................................................................ 96 6.1.Introdução.................................................................... 97 6.2.Material e Métodos....................................................... 98 6.3.Resultados e Discussão............................................... 101 6.4.Conclusões.................................................................. 108 6.5.Referências.................................................................. 108 CAPÍTULO - 7 MONITORAMENTO QUÍMICO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO CERRADO DO ESTADO DE SÃO PAULO RESUMO.......................................................................... 111 ABSTRACT....................................................................... 111 7.1.Introdução................................................................... 112 7.2.Material e Métodos...................................................... 113 7.3.Resultados e Discussão.............................................. 114 7.4.Conclusões.................................................................. 159 7.5.Referências.................................................................. 159 CAPÍTULO - 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................... 164 iii Abreviaturas AIA Ácido indolilacético AFLP Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados ANA Ácido naftalenoacético AMOVA Análise de variância molecular AVA Autovalores AVE Autoverores Bap Benzilaminopurina Bet Ácido betulínico CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CP Componentes principais CTAB Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide Flav Flavonóide GPS Sistema de posicionamento global 2ip Isopentelaminopurina IBA Ácido indolbutílico Ole Ácido oleanólico RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso RFLP Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição TDZ Thidiazuron TMF 6-hidroxi-5,7,8 - Trimetoxiflavona WP Woodo Plant Urs Ácido ursólico iv LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO - 2 PROPAGAÇÃO SEXUADA: AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Zeyheria montana Mart COLETADAS EM TRÊS ESTADOS BRASILEIROS Figura 1 - Planta adulta de Zeyheria montana................................. 18 Figura 2 - Semente de Zeyhria montana.......................................... 19 CAPÍTULO - 5 COLETAS E MAPEAMENTO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO ESTADO DE SÃO PAULO Figura 1 - Localização das áreas de coleta e suas coordenadas.... 91 Figura 2 - Localização das áreas de coleta de Zeyheria montana no Estado de são Paulo................................................... 92 CAPÍTULO - 6 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR RAPD DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana LOCALIZADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO Figura 1 - Análiese eletroforética dos produtos de amplificação do DNA de alguns indivíduos de Zeyheria montana com o primer 8 (ACA ACG CCT C)............................................ 104 Figura 2 - Dendograma de todos os acessos coletados em diferentes municípios do Estado de São Paulo............... 105 Figura 3 - Dendograma baseado nas distâncias euclidianas médias inter-populacionais derivadas da AMOVA.......... 106 Figura 4 - Escalonamento multidirecional não métrico..................... 107 CAPÍTULO - 7 MONITORAMENTO QUÍMICO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO CERRADO DO ESTADO DE SÃO PAULO Figura 1- Estruturas do flavonoide e triperpenos isolados de Zeyheria montana............................................................ 119 Figura 2 - Dendograma obtido com base nas distâncias genéticas entre 20 indivíduos de Zeyheria Montana com alto e baixo teor de 6-hidroxi 5,7, 8- trimetoxiflavona................ 120 v Figura 3 - Dispersão dos acessos de Zeyheria montana em relação aos dois primeiros componentes principais CP1 (flavonóide e ácido ursólico) e CP2 (ácido betulínico) obtidos na análise de quantificação química................... 151 Figura 4 - Dendograma dos acessos do grupo 1 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 153 Figura 5 - Dendograma dos acessos do grupo 2 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 154 Figura 6 - Dendograma dos acessos do grupo 3 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 154 Figura 7 - Dendograma dos acessos do grupo 4 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 155 Figura 8 - Dendograma dos acessos do grupo 5 mostrado no gráfico de componentes principais.................................. 156 Figura 9 - Dendograma dos acessos do grupo 6 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 157 Figura 10 - Dendograma dos acessos do grupo 7 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 157 Figura 11 - Dendograma dos acessos do grupo 8 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 158 Figura 12 - Dendograma dos acessos do grupo 9 mostrado no gráfico de componentes principais................................... 158 vi LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO - 2 PROPAGAÇÃO SEXUADA: AVALIAÇÃO DO ÍNDICE DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Zeyheria montana MART. COLETADAS EM TRÊS ESTADOS BRASILEIROS. Tabela 1 - Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana coletadas em diferentes Estados Brasileiros....... 23 Tabela 2 - Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana armazenada por 30, 120 e 180 dias sob condição ambiente.............................................................. 24 Tabela 3 - Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana sob condições controladas de temperatura e luminosidade na presença e ausência de expansão alada................................................................................... 24 Tabela 4 - Conteúdo de umidade inicial e porcentagem de germinação de semente de Zeyheria montana antes e após exposição a –20ºC e –196ºC.................................... 25 CAPÍTULO 3- PROPAGAÇÃO ASSEXUADA: ESTABELECIMENTO DO PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO DE Zeyheria montana MART Tabela 1 - Traramento de assepsia utilizados para a descontaminação de sementes de Zeyheria montana....... 34 Tabela 2 - Efeito da assepsia na descontaminação de sementes de Zeyheria montana............................................................... 35 Tabela 3 - Antibiograma realizado com Pseudomonas isolada de Zeyheria Montana............................................................... 36 Tabela 4- Efeito do tipo e concentração de citocinina nos segmentos nodais de Zeyheria montana inoculados em meio WP............................................................................. 37 Tabela 5 - Efeito do TDZ e da associação TDZ e AIA nos segmentos nodais de Zeyhria montana inoculados em meio WP......... 38 Tabela 6 - Efeito do tipo e concentração de auxinas no enraizamento de Zeyheria montana................................... 39 Tabela 7 - Efeito do substrato na aclimatação de Zeyheria montana.. 40 CAPÍTULO 4 - SISTEMA REPRODUTIVO: DETERMINAÇÃO DO SISTEMA REPRODUTIVO Tabela 1 - Determinação do número de pólen e óvulos por flor de Zeyheria montana vii Zeyheria montana............................................................... 47 CAPÍTULO 5 - COLETAS E MAPEAMENTO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO ESTADO DE SÃO PAULO Tabela 1 - Acessos de Zeyheria montana coletadas dentro e fora do Estado de São Paulo.......................................................... 56 Tabela 2 - Localização geográfica da população A de Zeyheria montana.............................................................................. 58 Tabela 3 - Localização geográfica da população B de Zeyheria montana.............................................................................. 60 Tabela 4 - Localização geográfica da população C de Zeyheria montana.............................................................................. 61 Tabela 5 - Localização geográfica da população D de Zeyheria montana.............................................................................. 62 Tabela 6 - Localização geográfica da população E de Zeyheria montana.............................................................................. 64 Tabela 7 - Localização geográfica da população F de Zeyheria montana.............................................................................. 65 Tabela 8 - Localização geográfica da população G de Zeyheria montana.............................................................................. 66 Tabela 9 - Localização geográfica da população H de Zeyheria montana.............................................................................. 67 Tabela 10 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população A........................................................ 69 Tabela 11 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população B........................................................ 72 Tabela 12 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população C........................................................ 73 Tabela 13 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população D........................................................ 74 Tabela 14 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população E........................................................ 78 Tabela 15 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população F........................................................ 80 Tabela 16 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população G....................................................... 81 Tabela 17 - Distância em Km entre as plantas de Zeyheria montana dentro da população H........................................................ 82 Tabela 18 - Distancia média entre as diferentes populações de Zeyheria montana............................................................... 90 CAPÍTULO 6 - AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR RAPD DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana LOCALIZADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO.. viii montana LOCALIZADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO.. Tabela 1 - Primers utilizados................................................................ 101 CAPÍTULO 7 - MONITORAMENTO QUÍMICO DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana NO CERRADO DO ESTADO DE SÃO PAULO. Tabela 1 - Teor de 6-hidroxi 5,7,8-trimetoxiflavona em acessos de Zeyheria montana coletados em diferentes localidades..... 121 Tabela 2 - Média dos teores de 6-hidroxi 5,7,8-trimetoxiflavona (TMF) e triterpenos (mg/gps) em Zeyheria montana calculada dentro das subpopulações.................................. 126 Tabela 3 - Médias dos teores de 6-hidroxi-5,7,8-trimetoxiflavona (TMF) e triterpenos (mg/gps) em Zeyheria montana calculada entre as populações........................................... 127 Tabela 4 - Teor de ácido oleanólico em acessos de Zeyheria montana.............................................................................. 127 Tabela 5 - Teor de ácido ursólico em acessos de Zeyheria Montana.............................................................................. 132 Tabela 6 - Teor de ácido betulínico em acessos de Zeyheria montana.............................................................................. 137 Tabela 7 - Estimativa das variâncias (autovetores-AVA), associados aos componentes principais (CP) e respectivos coeficientes de ponderação (autovetores AVE) das características teores de flavonóide (Flav) acido ursólico (Urs), betulínco (Bet) e oleanólico (Olé)............................ 145 Tabela 8 - Estimativa das variâncias (autovetores-AVA) associado aos componentes principais (CP) e respectivos coeficientes de ponderação (autovetores AVE) das características teores de flavonóide (Flav), ácido urspolico (Urs) e betulínico (Bet)........................................ 145 Tabela 9 - Escores relativos aos 167 acessos de Zeyheria Montana, obtidos em relação aos componentes principais (CP) correspondentes às variáveis teor de flavonóide, ácido ursólico e betulínicol.......................................................... 145 Tabela 10 - Agrupamento de acessos de Zeyheria Montana pelo método de Tocher realizado a partir dos dados de análise química do flavonóide, ácido ursólico e betulínico.............. 150 Tabela 11 - Relação dos indivíduos que foram selecionados para a conservção em banco de germoplasma e suas localizaçãoes...................................................................... . 152 ix LISTA DE QUADRO Página CAPÍTULO 6 - AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA POR RAPD DE RECURSOS GENÉTICOS DE Zeyheria montana LOCALIZADOS NO ESTADO DE SÃO PAULO Quadro 1 - Diversidade genética de populações de Zeyheria montana calculada pelo índice de Shannon.............................................................. 102 Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1.Introdução Muitas espécies da família Bignoniaceae são conceituadas por seu valor medicinal. Entre elas podemos citar as do gênero Tabebuia, Tecoma, Catalpa e Zeyheria, tendo esse último apenas dois representantes no Brasil: Zeyheria montana e Zeyheria tuberculosa (Bureau & Schumann, 1997) . Z. montana Mart. é conhecida no Brasil como bolsa de pastor, o extrato aquoso de suas raízes é indicado, pela medicina popular, no combate de doenças da pele e como agente anti-tumoral. As raízes e caules dessa espécie contêm várias naftoquinonas e a substância majoritária com 0,011% é o lapachol. Esse valor representa 19 vezes o teor de lapachol encontrado em Tabebuia avellanedae que tem sido considerada a principal fonte dessa substância (Jácome et al, 1999). A essa naftoquinona têm sido atribuídas as atividades anti-inflamatórias (Almeida et al 1990), anti-úlcera gástrica (Goel et al, 1987), anti-neoplásica (Fávaro et al, 1990) e anti-microbiana (Ali et al, 1998; Oliveira et al, 2001). As folhas contêm principalmente triterpenos e flavonóides. O extrativismo constante de plantas medicinais, em regiões endêmicas, tem comprometido as populações naturais de espécies nativas o que tem levado à extinção muitos grupos de plantas cuja atividade farmacológica já está preconizada assim como também comprometidas e extinguidas aquelas em que os estudos fitoquímicos e farmacológicos ainda são insipientes ou inexistentes. Atualmente, os trabalhos realizados na área de conservação têm contado com o recurso da tecnologia do Sistema de Posicionamento Global (GPS) que, ao plotar dados de localização geográfica em mapas, permite correlacionar indivíduos, populações, ecossistemas, biomas com dados de topografia, geologia, pedologia, geomorfologia, hidrografia etc. A análise Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 2 desses dados associados ao teor de metabólitos secundários, pode fornecer informações importantes quanto à influência desse fatores no metabolismo da planta e, até mesmo, na atividade biológica dela. Além disso o sistema de geoprocessamento permite mapear áreas onde se encontra a maior diversidade de uma espécie sendo uma ferramenta útil e atualmente indispensável em programas de conservação in sito e ex sito. No mundo todo há vários programas de conservação in situ e ex situ de recursos genéticos de plantas cultivadas e não domesticadas, cuja meta principal é proteger o patrimônio genético de espécies potencialmente úteis. Segundo Villalobos & Engelmann (1995), de todo material vegetal do mundo conservados em coleções ex situ as plantas medicinais representam apenas 0,07%. Uma das principais questões relacionadas com essa baixa porcentagem de coleção de plantas medicinais é o alto custo de manutenção dos bancos de germoplasmas. Atualmente, a utilização de marcadores moleculares tem representado uma alternativa viável de redução desse custo, uma vez que permite caracterizar os acessos e, com isso, apenas os indivíduos que realmente representam a diversidade da espécie, são conservados. Técnicas de cultura de tecidos têm sido apontadas como ferramentas úteis na conservação e propagação de plantas medicinais (Hannweg et al,1996; Ajith et al, 1998; Rao et al 1998; McCartan & Van Staden, 1998; McCartan & Van Staden, 1999;). As plantas medicinais alógamas produzidas por sementes, em geral apresentam grande variabilidade genética, portanto, geram quimiotipos com teores de princípios ativos variáveis e ação biológica diversa. A micropropagação tem sido usada como uma das técnicas mais viáveis para a produção de clones elites com características superiores quanto o teor de metabólito secundário e atividade biológica. A conservação de recurso genético através de bancos de germoplasma, por meio de coleções de sementes, indivíduos adultos ou cultura de tecido é atualmente a medida mais viável para preservar espécies silvestres potencialmente úteis. Conservar esses materiais é uma necessidade premente tendo em vista a velocidade com que os habitats vêm sendo destruídos ou Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 3 transformados pelas diversas atividades humanas. As conseqüências disso são a redução drástica da viabilidade genética ou mesmo extinção de espécies, a subdivisão de habitats, a formação de novos ambientes, o aumento das condições de estresse, a mistura de conjuntos gênicos antes isolados, a intensificação da hibridação introgressiva e mesmo a origem de novos taxa. Considerando as informações acima expostas, o presente trabalho teve por objetivo fazer um estudo multidisciplinar com Z. montana vizando a conservação dessa espécie. A diversidade genética foi avaliada por meio do marcador molecular RAPD. Foram realizados estudos de propagação sexuadada e assexuada (micropropagação) e, também, a quantificação de metabólitos secundários de interesse. Com as informações geradas por esse trabalho consideramos estar de alguma forma, dando uma pequena contribuição para o que foi estabelecido e preconizado no Brasil, em 1992, na Eco 92, com os acordos da Agenda 21 e Convenção sobre a diversidade biológica. 1.2. Revisão de Literatura O aumento da população do mundo, assim como a necessária elevação da qualidade de vida de seus habitantes, particularmente nos países em desenvolvimento, está gerando um aumento considerável na demanda de produto agrícola, seja em relação a alimentos ou mesmo a fitoterápicos. Essa demanda tem estimulado a expansão de áreas cultivadas para habitats silvestres o que tem comprometido a biodiversidade de grandes biomas. Essa realidade mostra para todas as nações a necessidade urgente de se investir recursos financeiros e humanos no desenvolvimento de tecnologia e conhecimento sobre a conservação de recursos genéticos. A biotecnologia, em seu sentido amplo, é o conjunto de técnicas que utiliza os seres vivos e suas propriedades para a produção de bens, e nos últimos anos, tem permitido, através da biologia molecular, com as diversas técnicas de marcadores moleculares, associada à cultura de células, tecidos e Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 4 órgãos in vitro, o desenvolvimento de técnicas eficientes de conservação de espécies vegetais potencialmente úteis (Toribio & Celestino,2000). As plantas produzem substâncias destinadas ao seu crescimento a exemplo dos polissacarídeos, açúcares e proteínas, os quais são considerados compostos do metabolismo primário. Elas sintetizam, também, compostos especiais, denominados metabólitos secundários, que são produzidos por diferentes rotas metabólicas gerando uma imensa diversidade de estruturas químicas dentro da classe dos alcalóides, flavonóides, cumarinas, terpenóides etc. Os metabólitos secundários exercem importantes papéis de proteção contra microorganismos, herbívoros, intempéries ambientais, além de interferirem em processos simbióticos e atração de polinizadores (Briskin, 2000). São também fontes armazenadoras de carbono e nitrogênio que retornam ao metabolismo primário quando isso é requerido pela planta. O balanço entre a atividade do metabolismo primário e secundário da planta é dinâmico e pode ser consideravelmente afetado pelo crescimento da planta, diferenciação dos tecidos, fase vegetativa e estresse ambiental. Mais de 100.000 compostos secundários de plantas já foram isolados e identificados e, a cada ano, centenas de novas descobertas têm aumentado esse número (Verpoorte et al., 1998). Muitos desses compostos são consumidos, diariamente, por nós na forma de dentifrícios, sabonetes, perfumes ou mesmo ingeridos de alguns alimentos, condimentos, chás, xaropes etc. O consumo de cosméticos e medicamentos, elaborados a partir de produtos naturais, tem crescido nos últimos anos e isso tem estimulado empresas como a Merck a investir 10% de seus recursos financeiros em pesquisas com novas substâncias de origem vegetal (Nader & Mateo, 1998). Apesar do grande consumo direto ou indireto e, também, do investimento financeiro de muitas empresas em produtos naturais esses, sem dúvida alguma, têm sido pouco estudados em relação ao seu potencial farmacológico. Especialistas em mercado financeiro estimam que as vendas, no varejo, de produtos derivados de plantas medicinais situam-se na ordem de US$ 15 bilhões por ano. Destes, US$ 7 bilhões são gerados na Europa, US$ 3 bilhões Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 5 nos Estados Unidos, US$ 1 bilhão na América Latina e os restantes US$ 4 bilhões na Ásia e na África. Estima-se, ainda, que o volume de vendas irá triplicar nos próximos dez anos. O maior crescimento é esperado nos Estados Unidos seguido da América Latina e da Europa (Grunwald, 1997; Calixto, 2001). A eficácia e segurança de muitas plantas medicinais já foram comprovadas cientificamente o que as legitimizam como recurso terapêutico benéfico e indispensável à humanidade. Entretanto, há problemas de vários níveis que limitam seu uso. Entre eles podemos citar: • Dificuldade de identificação botânica, muitas plantas possuem semelhanças morfológicas que só podem ser distinguidas por especialista. • Algumas espécies sintetizam os metabólitos secundários em concentrações muito baixas, o que exige processos de extração dispendiosos e elaboração de fomulações farmacêuticas complexas. Os exemplos mais importantes são os das substâncias com atividade anti-câncer. • Algumas espécies apresentam enorme variabilidade genética com alterações quanti e qualitativas nos metabólitos secundários o que dificulta a obtenção de droga padronizada. • Muitas espécies estão sob forte pressão antrópica, expostas à erosão genética e redução drástica de populações endêmicas o que dificulta sua utilização em larga escala. A cultura de células e tecidos pode ser empregada no sentido de resolver ou minimizar alguns dos pontos citados acima, seja na multiplicação sistematizada de plântulas elites, pelo processo de micropropagação ou seja na produção de metabólitos secundários que tenham relevância do ponto de vista terapêutico e que por algum tipo de impedimento não podem ser produzidos por síntese. A produção de células e tecidos vegetais por meio de cultura de calos, de raízes, de plântulas, de células em suspensão, fusão de protoplasto etc. são estabelecidas a partir dos objetivos que se pretende alcançar. Várias técnicas podem, por exemplo, auxiliar na seleção de sementes ou propágulos para domesticação e multilplicação de plantas. Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 6 A grande maioria das plantas medicinais são coletadas em hatitat natural e por maior que seja o número de indivíduos numa localidade, não são suficientes para atender a uma demanda constante e ininterrupta, principalmente, quando a espécie tem multi-usos. Apenas o cultivo sistematizado pode garantir produção regular e em larga escala. Para se estabelecer sistemas de cultivo adequados se faz necessário material propagativo como sementes, tubérculos, estolões, enfim, algum tipo de estrutura que permita a multiplicação da planta alvo. Muitas espécies mecidinais apresentam problemas com as sementes ou com partes vegetativas que limitam a sua multiplicação em escala. É para essas espécies que as técnicas de cultivo in vitro são indicadas. Exemplos importantes são: espécies de Dioscorea, Digitalis, Chlorophytum, Pysichotria ipecacuanha, Commiphora wightii, Taxus brevifolia, Cinchona etc. A germinação de sementes, de algumas espécies medicinais, pode aumentar muito quando são utilizados procedimrntos de cultura de tecidos, principalmente quando as sementes apresentam dormência, endosperma reduzido, ou grande infestação de microorganismos (Fay, 1992). A micropropagação é a técnica de maior aplicabilidade da cultura de tecido e tem sido utilizada para multiplicar centenas de espécies medicinais. Essa técnica é usada rotineiramente para multiplicar genótipos selecionados, ou para substituir acessos que tenham adquirido caracteres indesejáveis como baixa produtividade e susceptibilidade à doenças. Plantas que são cultivadas em larga escala, fora de seu centro de origem, também têm sido micropropagadas como, por exemplo, a Atropa belladonna, Rauwolfia serpentina, Dioscorea floribunda, varias espécies de Mentha etc. O declínio no teor de princípios ativos ou de óleos essenciais, em plantas medicinais, é comum quando estas são cultivadas por longos períodos e submetidas a vários cortes. Nesses casos, renovação e reintrodução de plantas são necessárias quando se deseja manter alta produtividade desses constituintes ativos para a manutenção de programas de cultivo viáveis economicamente. Espécies de Mentha, Citronella e Cymbopogon têm sido micropropagadas em larga escala para atender a esses programas. Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 7 Eclipta alba (L) Hassk. é uma Asteraceae cosmopolita, possui atividade anti-hepatotóxica que é atribuída a dois cumestanos: wedelolactona e demetilwedelolactona. As sementes dessa espécie apresentam boa germinação, entretanto o estabelecimento de um cultivo em escala, a partir de sementes, visando à produção de extratos é inviável, uma vez que apresenta diferentes quimiotipos com produção irregular dos compostos de interesse. França et al (1995) desenvolveram a micropropagação a partir de segmentos nodais dessas espécies e estabeleceram um protocolo eficiente para produção em escala de E. alba. Esse tipo de propagação promove o desenvolvimento de estruturas morfologicamente pré-existentes e a exposição de segmentos nodais a concentrações adequadas de fitoreguladores e nutrientes estimula a quebra de dormência das gemas axilares promovendo uma rápida multiplicação de novas plântulas. Protocolos de micropropagação de Maytenus aquifolia e Maytenus ilicifolia, espécies que também apresentam quimio e morfotipos, foram desenvolvidos nos laboratórios da Unidade de Biotecnologia da UNAERP visando ao cultivo em escala. Plantas micropropagadas apresentaram a mesma produtividade em fitomassa e o mesmo perfil químico das matrizes doadoras de explantes (Pereira et al, 1994; Pereira et al 1995). A mesma metodologia de propagação in vitro foi desenvolvida com o Stryphnodendron polyphythum (barbatimão) cuja atividade cicatrizante é atribuída aos taninos presentes na casca da árvore (França et al, 1995). Pothomorphe umbellata, uma espécie medicinal também conhecida como caapeba ou pariparoba, está inscrita na farmacopéia brasileira devido à sua ação anti-úlcera, colagoga e anti-hepatotóxica. Recentemente, foi isolado dessa espécie um composto denominado N-benzoilmescalina que tem atividade bactericida contra Helicobacter pylori (Isobe, et al 2002). Micropropagação via organogênese direta a partir de segmento de folha foi estabelecida com objetivo de se obter plântulas em escala para cultivo convencional, uma vez que as sementes apresentam graves problemas com a germinação (Pereira et al, 2000). Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 8 Atualmente, as técnicas de biologia molecular com marcadores do tipo RAPD, AFLP, RFLP e microsatelite têm permitido conferir a fidelidade genética dos clones obtidos a partir da micropropagação. Estudos realizados com Angelica acutiloba e Angelica sinensis cultivadas na Ásia, utilizando marcadores do tipo RAPD e RFLP, mostraram a proximidade genética existente entre as plantas avaliadas e, os acessos que foram micropropagados a partir de Angelica acutiloba, quando comparados à planta matriz, não apresentaram bandas polimórficas (Watanabe et al, 1998). Angelica sinensis, espécie extremamente popular na China, contém ligustilido como componente majoritário do óleo essencial e a planta é utilizada por mulheres para regular a menstruação, e também, para prevenir doenças vasculares. Achillea millefolium é uma espécie medicinal utilizada em vários países da Europa e América e consta nas principais farmacopéias do mundo devido sua ação anti-inflamatória atribuída ao azuleno e ação espasmódica devido a presença de flavonóides. Entretanto, há quimiotipos nessa espécie que apresentam substâncias alergênicas, o que compromete a questão de eficácia e segurança da droga. Além disso, espécies denominadas Achillea asplenifolia, A. roseoalba e A. collina são quase sempre confundidas com A. millefolium devido à semelhança morfológica. Wallner et at, (1996) desenvolveram um protocolo de micropropagação de Achillea e avaliaram a proximidade genética de todas essas plantas com objetivo de encontrar uma metodologia adequada para avaliar diferentes acessos de Achillea. Os resultados obtidos, com marcadores do tipo RAPD e RFLP, apontaram variações intra e interespecíficas nos materiais avaliados e num dos clones foi registrado uma mutação, o que permitiu constatar variabilidade criada sob condições in vitro. Gavidia et al. (1996) selecionaram 15 plantas de Digitalis obscura, espécie medicinal que produz cardenolídeo e, após quantificarem esse composto em todos os acessos selecionaram a planta que apresentou maior teor da droga e a micropropagaram por dois anos consecutivos. Após esse período, compararam o perfil genético do clone e da matriz, concluindo que o protocolo de micropropagação utilizado preservou a integridade genética do material estudado e esse resultado foi corroborado pelas análises realizadas Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 9 em CLAE (cromatografia liquida de alta eficiência) cujos cromatogramas mostraram similaridade entre o clone e a matriz. Estudos realizados sobre fidelidade genética usando RAPD também foram conduzidos com plantas micropropagadas de Zingiber officinales e os resultados foram semelhantes aos obtidos com Digitalis obscura, ou seja dos quinze “primers” utilizados todos promoveram bandas monomórficas confirmando a fidelidade genética entre clones e plantas doadoras de explante (Rout et al, 1998). Uma importante aplicabilidade da cultura de tecidos é a conservação de germoplasma in vitro. Segundo Villalobos & Engelmann (1995) de todo material vegetal do mundo conservado em coleções ex situ as plantas medicinais representam apenas 0,07%. As coleções in vitro, além de conservarem acessos que sejam representativos da diversidade genética das populações naturais, permitem fornecer um fluxo constante de explantes e plântulas com excelentes condições fitossanitárias . A conservação de germoplasma in vitro pode ser realizada com sementes sintéticas, fragmentos de tecidos e órgãos, assim como a partir aglomerados celulares. Os diferentes tipos de estruturas vegetais podem ser conservados sob dois diferentes sistemas: o primeiro é conservado por curto ou médio tempo sob condições de temperatura que variam de 12 a 18°C e o meio de cultura é suplementado com compostos promotores de estresse osmótico e substâncias que retardam o crescimento; o segundo sistema é realizado à temperatura de -196°C em nitrogênio líquido e é denominado criopreservação. Diferentes sistemas de criopreservação têm sido desenvolvidos para preservar gemas apicais, embriões zigóticos e somáticos, calos e células em suspensão. Mannonen et al. (1990) trabalharam com células de Catharanthus roseus e Panax ginseng com o objetivo de estudarem a conservação dessas células em dois diferentes sistemas. Células de P. ginseng, com teor de 37,22 mg/g de ginsenosídeo, foram preservadas em óleo mineral e também criopreservadas. Após a regeneração das células, no primeiro sistema houve redução drástica no teor de ginsenosídeo (0,89 mg/g) enquanto o material Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 10 criopreservado se manteve com o mesmo teor (37,22mg/g), resposta semelhante foi obtida com os teores de ajmalicina e catharantina em células de C. roseus. Tubérculos de Diocorea são fontes de saponinas esteroidais e a diosgenina é considerada, sob o ponto de vista econômico, a mais importante substância dessa classe por ser matéria prima para a indústria farmacêutica que a converte em derivados esteroidais. Malaurie et al. (1993) estabeleceram, no centro ORSTOM, em Montpellier na França, um banco de germoplasma in vitro de Dioscorea, com acessos de 11 espécies coletados em diferentes países, inclusive no Brasil. Esses autores determinaram que 12 indivíduos por clone, com duas replicatas, é o número adequado para garantir que o material introduzido no banco de germoplasma esteja assegurado do ponto de vista da conservação dos acessos. Na Unidade de Biotecnologia Vegetal várias espécies de plantas medicinais estão sendo introduzidas no Banco de Germoplasma de Plantas Medicinais do Cerrado (UNAERP), onde os protocolos de conservação in vitro foram estabelecidos como parte de um projeto temático dentro do programa Biota/Fapesp. O Biota é um programa que tem como objetivo inventariar e caracterizar a biodiversidade do Estado de São Paulo, definindo os mecanismos para sua conservação, seu potencial econômico e sua utilização sustentável. 1.3..Referências Ajith, A.; Rao, C.S.; Latha, R.; Josekutty, P.C; Balakrishna, P. 1998.Micropropagation of Uraria picta, a medicinal plant through axillary bud culture and callus regeneration. In-Vitro cellular and developmental biology- Plant.,34(2): 136-140 Ali, R.M.; Houghton,P.J..;Hoo,T.S. 1998.Antifungal activity of some bignoniaceae found in Malaysia. Phytotherapy Research, vol 12, 331-334. Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 11 Almeida, E.R.; Silva, Filho,A.A.; Santos,E.R.; Lopes,C.A. 1990. Antiinflamatory action of lapachol. J. Ethnopharmacol 29 (2): 239-241. Briskin, D. Medicinal Plant and Phytomedicines. Linking Plant Biochemistry and Physiology to Human Health. Plant Physiology, 124: 507-514. 2000. Bureau. E.; Schumann,C.;. Bignoniaceae. In Flora Brasiliensis( C.F.P von Martius, A. G. Eichler and I. Urbans, eds), vol 8, part 2. Verlag von J. Cramer, Weinheim. P. 352-355,1897. Fay, M.F. Conservation of rare and endangered plant using in vitro methods. In Vitro Cell. Dev. Biol. 28P:1- 4, 1992. Fávaro, O.C.N.;Oliveira,M.M.;Rossini,M.A.A.; Kamakura,C.R.; Pinto, A.V.;Pinto, M.C.F.R.1900 Seleção por peio de célula KB de substâncias e extrato potencialmente ativo em quimioterapia do câncer.An. Acad. Bras. Cien. 62(3) 217-224. França, S.C; Duarte, IB; Cerdeira, R.M.M; Pereira, A.M.S. Micropagation of Stryphnodendron polyphythum (Barbatimão). Plant, Cell, tissue & Organ Culture. 42: 291- 293,1995. França, S.C.; Bertoni, B.W.; Pereira, A.M.S. Antihepatotoxic agent in micropropagated plantles of Eclipta alba. Plant Cell Tissue & Organ Culture, 40: 297-299,1995. Gavidia, I.; Agudo, L.C.; Pérez-Bermúdez, P. Selection and long-term cultures of high-yelding Digitalis obscura plants: RAPD markers for analisis of genetic stability. Plant Science,121: 197-205, 1996. Grunwald, J. The market situation and marketing of Herbal Medicinal Products (HMP) in Europe. In: II World Congress on Medicinal and Aromatic Plants Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 12 for Human Welfare. 1997. ICMAP/ISHS/SAIPA: Buenos Aires.., Mendoza (Argentina), 10-15 nov. L. 33 Goel, R.K. Pathaak,N.K.; Biswas, M.;Pandey,V.B. Sanyal,A.K. 1987. Effect on lapachol, a naphtaquinone isolated from Tectona grandis on experimental on experimental pectic ulcer and gastric secretion. J. Pharm Pharmacol 39(2) 138-140. Hannweg, K..; Watt, M.P.; Berjak, 1996 P. A simple method for the micropropagation of Bowiea volubilis from inflorescence explants. Bot. Bull. Acad. Sin. 37: 213-218 Isobe, T,: Ohsaki, A.; Nagata, K. Antibacterial constituents against Helicobarter pylori of Brasilian medicinal plant, Pariparoba. Yakugaku Zasshi, 122 (4) 291-294, 2002. Jácome L. R. P.; Oliveira, A. B.; Raslan,D.; Muller, A.; Wagner,H. 1999. Análise de naftoquinonas em extratos brutos de raízes de Zeyheria montana M. (bolsa de pastor). Quimica Nova, 22(2) 175-177. Jácome L. R. P.; Oliveira, A. B.; Raslan,D.; Muller, A.; Wagner,H. 1999. Análise de naftoquinonas em extratos brutos de raízes de Zeyheria montana M. (bolsa de pastor). Quimica Nova, 22(2) 175-177. McCartan, S.A.; Van Staden, J. 1998. Micropropagation of the medicinal plant, Scilla natalensis Planch. Plant Growth Regulation 25: 177-180. McCartan, S.A.; Van Staden, J. 1999. Micropropagation of members of the Hyacinthaceae with medicinal and ornamental potential - A review. South African Journal of Botany, 65: 361-369 Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 13 Malaurie, B. Pungu,O.; Dumont,R.; Trouslot, M,F. The creation of na in vitro germoplasm collection of yam ( Dioscorea spp.) for genetic resources preservation. Euphytica, 65:113-122,1993 Mannonem,L. Toivonen, L.; Kauppinen,V. Effects long-term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell cultures. Plant Cell Reports , 9: 173-177, 1990. Nader, W & Mateo,. Biodiversity-resource for new products, development and self reliance. In: Barthlott, W. & Winiger, M. Biodiversity – A challenge for development research and policy. Springer, Berlin, 1998. p121-126. Oliveira, C.G.T.; Miranda, F.F.; Ferreira, V.F.; Freitas,C.C.; Rabello,R. F. Carballido, J.M. Corrêa, L.C.D. 2001.Synthesis and Antimicrobiol Evaluation of 3-Hydrazino-Naphthoquinones as Analogs of Lapachol. J.Braz.Chem.Soc.12(3):339-345. Pereira A.M.S., Câmara F.L.A., França S.C. Vegetative propagation in Mikania glomerata: Micropropagation and Cuttings. Acta Hortculturae. Vol.3. (502), 357-362,1999. Pereira, A.M.S; Moro, J.R; Cerdeira, R.M.M; França, S.C. Micropropagation of Maytenus aquilolia . Journal of Herbs, Spices & Medicinal plants 2(3):11- 19,1994. Pereira, A.M.S; Moro, J.R; Cerdeira, R.M.M; França, S.C.Effect of phytoregulatiors and physiologia characteristics of the explants on micropropagation of Maytenus ilicifolia. Plant, Cell, tissue & Organ Culture. 42: 295-297,1995. Pereira, A.M.S.; Bertoni, B. W.; Apezzato-da-Gloria, B.; Araújo, A.R.B.; Januário, A.H.; Lourenço,M.V.; França,S.C. Micropropagation of Capítulo 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 14 Pothomorphe umbellata via direct organogenesis from leaf explants. Plant Cell Tissue and Organ Culture 60: 47-53, 2000. Rout, G.R.; Das, P.; Goel,S.; Raina, S.N. Determination of genetic stability of micropropagated plant of ginger using Random Amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Bot. Bull.Acad. Sin, 39: 23-27, 1998. Toribio, M. Celestino, C.El uso de la biotecnologia em la conservación de recursos genéticos forestales. Invest. Agric.Sist. Recur. For 2000. (2):p249- 260. Verpoorte R, van der Heijden, Hoopen HH J G and Memelink J. Metabolic engineering for the improvement of plant secondary metabolite production. Plant Tissue Culture and biotecnology . p.4:3-20. 1998. Villalabos, V.M. ; Engelmann, F. Ex situ conservation of plant germplasm using biotechnology. Wold Journal od Microbiology & biotechnology, 11, 375-382, 1995. Wallner, E.; Weisising, K.; Rompf, R.; Kahl, G.; Kopp, B. Oligonucleotide fingerprinting and RAPD analisis of Achillea species: Characterization and long-term monitoring of micropropagated clone Plant Cell Report, 15: 647- 652, 1996. Watanabe, A.; Araki, S.; Kobari, H.; Sudo, H.; Tsuchida, T.; Uno, T.; Kosaka, N.; Shimomura,K.; Yamazaki,M.; Kazuki, S. In vitro propagation, restriction fragment length polymorphism, and random amplified polymorphic DNA analyses of Angelica plant. Plant Cell Reports, 18: 187-192. 1998. Capítulo 2 – Propagação Sexuada Propagação Sexuada, Assexuada e Determinação do sistema reprodutivo. Capítulo 2 – Propagação Sexuada 16 CAPÍTULO 2 - Propagação Sexuada Avaliação do índice de germinação de sementes de Zeyheria montana Mart. coletadas em três Estados brasileiros RESUMO: Zeyheria montana é uma espécie arbustiva conhecida no Brasil como bolsa de pastor. Tintura das raízes tem sido popularmente utilizada para eliminar tumores e, as folhas para combater inflamações de modo geral. Neste trabalho, foram avaliados índices de germinação de sementes de Z montana coletadas nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Goiás e também a influência do período de armazenamento das sementes e incidência de luz na germinação. Foi constatado que os índices de geminação das sementes coletadas nos diferentes estados Brasileiros diferem entre si, provavelmente em decorrência da variabilidade genética existente entre os acessos estudados ou devido aos distintos graus de maturação e ou qualidade fisiológica. A incidência de luz não interferiu na germinação. A exposição das sementes à temperaturas sub-zero mostrou comportamento ortodoxo, porém elas não são longévoas. Palavras chave: conservação, fotoblastia, propagação sexuada CHAPTER 2 – Sexual Propagation: Germination ratio of Zeyheria montana Mart. Seeds collected in three different States of Brazil ABSTRACT: Root extracts of Zeyheria montana a shrub species well known in Brazil as bolsa de pastor, have been popularly used to eliminate tumors and leaf extracts to combat general inflammations. In this work, seeds of Z. montana Capítulo 2 – Propagação Sexuada 17 collected in the states of São Paulo, Minas Gerais and Goiás were evaluated for germination and influence of the period of storage and light incidence. It was verified that germination rates of the seeds collected in the different states of Brazil varied significantly, probably due to the genetic diversity existent among the studied accesses or to different stages of maturation and physiologic quality. Light didn't interfere on germination. Seeds exposed to sub-zero temperatures showed orthodox behavior, but they are not longevous. Keywords: conservation, photoblasty, sexual propagation, 2.1.Introdução Zeyheria montana (Figura 1) é descrita, botanicamente, como arbusto medindo de 1 a 3 m de altura, flores andróginas, folhas de disposição oposta, compostas, pecioladas, geralmente com 5 folíolos. Possui inflorescencia do tipo panícula terminal e flores tubulusas, de coloração amarela. Seu fruto , considerado cápsula loculicida bivalvar, abre-se ao atingir a maturidade, espalhando grande quantidade de sementes (Figura 2) suborbiculares com 3,5 cm de diâmetro. A distribuição é restrita ao Cerrado brasileiro ocorrendo em locais cuja altitude está entre 350 a 1000 m de elevação em relação ao nível do mar (Flora NeoTropica, 1992). No Brasil é conhecida como bolsa de pastor e as populações que habitam o Cerrado utilizam a tintura das raizes para eliminar tumores e as folhas de Z. montana para combater inflamações de modo geral. Devido à coleta indiscriminada de Z. montana e à devastação do Cerrado, área de ocorrência natural, esta espécie está sob forte pressão antrópica e com elevado risco de extinção. Para que o potencial de muitas espécies do Cerrado venha a ser descoberto e utilizado, justificando investimentos significativos em preservação e manejo sustentado, é fundamental que estudos de fenologia dessas Capítulo 2 – Propagação Sexuada 18 espécies sejam realizados o mais rápido possível. A revisão de literatura especializada mostra que o número de trabalhos a respeito de fisiologia da germinação de plantas endêmicas do Cerrado é extremadamente reduzido frente ao manancial de no mínimo 7 mil espécies que aguardam estudos básicos de propagação. Os objetivos deste trabalho foram verificar o índice de germinação de sementes de Z. montana coletadas nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Goiás bem como a influência do período de armazenamento das sementes e incidência de luz na germinação. Figura 1. Planta adulta de Zeyheria montana Mart. Capítulo 2 – Propagação Sexuada 19 2.2. Material e Métodos Todas as sementes utilizadas foram submetidas a tratamento prévio de descontaminação com solução de benomil 0.5% (p/v) por 24 horas sob agitação. Experimento 1 Sementes foram coletadas nos Estados de: São Paulo, no município de Pedregulho no dia 15 de junho de 2000 (Lat. 20° 17’ 06’’, Long. 47° 26’12’’, Alt.968 m); de Minas Gerais, no município de Araxá no dia 19 de junho de 2000, em três locais diferentes (1Hp- Lat. 19° 36’ 39’’, Long. 47° 11’ 46’’, Alt.920 m; 2Re - Lat. 19° 36’ 30’’, Long. 47° 12’ 460’, Alt.850 m; 3Br- Lat. 19° 37’ 32’’, Long. 47° 10’ 42’’, Alt.820 m) e de Goiás, no município de Rio Verde no dia 20 de julho de 2000 (Lat. 18° 08’ 39’’, Long. 49° 57’ 33’’, Alt.523 m). Uma semana após a coleta, as sementes provenientes dos três diferentes Estados, apresentando expansão alada, foram colocadas para germinar em caxilhos de isopor contendo substrato solo e areia 50% e mantidas em casa de vegetação com regas diárias. Os dados de germinação foram coletados 40 dias após o plantio das sementes. O experimento foi realizado com 40 replicatas e repetido 3 vezes. Para a comparação das médias foi utilizado o teste de Tukey (p≤0,05). Experimento 2 Figura 2. Semente de Zeyheria montana Mart. 1 cm Capítulo 2 – Propagação Sexuada 20 Sementes com expansão alada, coletadas no município de Pedregulho no dia 25 de maio de 2001(SP), foram armazenadas em sacos de papel e mantidas em condição ambiente. Após diferentes períodos de armazenagem (30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias) as sementes foram colocadas para germinar em papel de filtro umedecido e acondicionado em saco plástico, na sala de crescimento com temperatura de 23ºC (±2) e fotoperíodo de 16 horas/luz onde permaneceram por 30 dias. O experimento foi realizado com 30 replicatas e repetido 3 vezes. Para a comparação das médias foi utilizado o teste de Tukey (p≤0,05). Experimento 3 Sementes com e sem expansão alada, coletadas no município de Pedregulho no dia 25 de maio de 2001, SP, foram colocadas para germinar sobre papel de filtro umedecido em água e mantidas a 25°C, no escuro, sob luz contínua ou sob fotoperíodo de 16 horas/dia. Os dados de germinação foram coletados em intervalos de 10, 20, 30 e 40 dias. O experimento foi realizado com 40 replicatas e repetido 6 vezes. Para a comparação das médias foi utilizado o teste de Tukey (p≤0,05). Experimento 4 Trinta dias após a coleta, sementes provenientes do Município de Pedregulho, SP, foram enviadas ao laboratório de Controle de Qualidade da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia onde foi determinado o conteúdo umidade inicial das sementes, pelo método de estufa a 105ºC por 48 h, com três repetições de cinco sementes. Os resultados foram expressos em porcentagens médias, com base no peso fresco. Testes de germinação foram conduzidos à temperatura de incubação de 25ºC, substrato rolo de papel, antes e após a exposição das sementes por 24 horas às temperaturas de –20ºC e –196ºC (nitrogênio líquido), com quatro Capítulo 2 – Propagação Sexuada 21 repetições de 20 sementes cada. Os dados de germinação foram submetidos ao teste de análise de variância (ANOVA), P ≥ 0,5%. 2.3. Resultados e Discussão Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que o índice de germinação de sementes coletadas, nos diferentes Estados brasileiros, diferem entre si. Isso pode ser em decorrência da variabilidade genética existente entre os acessos estudados, ou de distintos graus de maturação ou qualidade fisiológia das sementes, características estas próprias de plantas não domesticadas. O armazenamento das sementes por 6 meses sob condições ambientais, afetou a porcentagem de germinação das sementes (Tabela 2), revelando que esse material, quando armazenado por período maior que trinta dias apresenta prejuízo para a germinação. Esses resultados foram semelhantes aos obtidos por Joly & Felippe (1979) que demonstraram que 50 dias após a colheita, a germinação das sementes de Z. montana diminuiu para 37% e após 125 dias de armazenamento as sementes não germinaram. A incidência ou ausência de luz, assim como a condição de fotoperíodo não interferiram na germinação das sementes de Z. montana. Contudo, diante dos dados obtidos (Tabela 3), é possível afirmar que embora não tenha sido registrada diferença estatística entre os tratamentos, esta espécie apresenta tendência a ser fotoblástica negativa. Esses resultados estão coerentes com os relatados por Joy & Felippe (1978) em trabalho conduzido com Z. digitalis (sinônima de Z. montana). A retirada da expansão alada foi fundamental para a germinação das sementes que foram inoculadas em papel sob condições controladas de temperatura e luminosidade. A expansão alada não interferiu na germinação das sementes que foram plantadas em substrato solo e areia. Este fato está provavelmente relacionado ao tipo de substrato utilizado. Certamente, a presença da espansão alada e a alta umidade favoreceram o aparecimento de Capítulo 2 – Propagação Sexuada 22 fungos que interferiram e prejudicaram a germinação das sementes de Z montana. Os resultados observados após a exposição das sementes às temperaturas sub-zero, indicam que essa espécie possui sementes de comportamento ortodoxo. Apesar de não ter havido diferença estatística entre as porcentagens de germinação, antes e após tratamentos, houve redução das porcentagens finais de geminação de sementes expostas às temperaturas de – 20ºC e –196ºC. É possível que o conteúdo de umidade das sementes (5,5%) tenha influenciado nos resultados obtidos após os tratamentos (Tabela 4). Um dado relevante sobre as sementes de Z. Montana, que convém ser ressaltado nesse trabalho, é que a produção anual de sementes foi inconstante, sendo observada grande incidência de sementes no campo, no ano de 2000, o que não ocorreu em 2001. Segundo Felippe & Silva (1984) trabalhos com plantas do Cerrado são dificultados principalmente pela questão de coleta e obtenção de sementes de espécies que frutificam num determinado ano e podem passar longos períodos sem florescer e sem frutificar. Capítulo 2 – Propagação Sexuada 23 Tabela 1. Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana coletadas em diferentes estados Brasileiros. Local de coleta da semente % de geminação Município de Araxá Hp (MG) 33,33 b Município de Araxá Re (MG) 61,33 a Município de Araxá Br (MG) 38,16 ab Município de Pedregulho (SP) 49,66 ab Município de Rio Verde (GO) 31,33 b Cv% 32,97 As médias acompanhadas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (0,5%). Cv%=coeficiente de variação. Capítulo 2 – Propagação Sexuada 24 Tabela 2. Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana armazenadas de 30 a 180 dias sob condição ambiente (28±2). Tempo de armazenamento (dias) % de germinação 30 90,2 a 60 66,6 ab 90 50,0 bc 120 50,2 bc 150 33,3 c 180 30,5 c Cv% 34,00 As médias acompanhadas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (0,5%). Cv% = coeficiente de variação. Tabela 3. Porcentagem de germinação de sementes de Zeyheria montana sob condições controladas de temperatura e luminosidade na presença e ausência de expansão alada. Tempo (dias) Escuro Sem EA Com EA Fotoperíodo Sem EA Com EA Luz continua Sem EA Com EA 10 56,25 aA 0 56,25 aA 0 56,25 aA 0 20 68,75 aA 6,00 a 75,00 aA 0 56,25 aA 7, 21 a 30 75,00 aA 25,01 a 75,00 aA 25,00 a 56,00 aA 25, 40a 40 75,00 aA 25,55 a 81,25 aA 38,00 a 50,00 aA 25, 91a Cv% 28,75 44,41 30,95 48,99 22,22 54,54 As médias acompanhadas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (0,5%). Letras minúsculas são comparação entre médias na mesma coluna e maiúsculas comparação entre linhas. EA = expansão alada Cv% = coeficiente de variação Capítulo 2 – Propagação Sexuada 25 Tabela 4. Conteúdo de umidade inicial e porcentagens de germinação de sementes de Zeyheria montana antes e após exposição a −20ºC e − 196°C Germinação (%) Conteúdo de umidade (%) testemunha −20ºC −196ºC 5,5 95a 89a 88a 2.4. Conclusões Diante dos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que as sementes de Z. montana são ortodoxas, o que possibilita seu armazenamento sob condições especiais em baixas temperaturas e, ao mesmo tempo não são longévoas o que dificulta sua conservação sob condições ambientais assim como a produção de mudas a partir de sementes colhidas em tempo superior a trinta dias. 2.5. Referências Felippe, G. M.; Silva, J. C. S. 1984. Estudo de germinação em espécies do Cerrado. Revista Brasileira de Botânica, 7 (2): 157-163. Flora Neotropica –Monograph 25(II) 1992 .Organization for Flora Neotropica By the New York Botanical Garden 293-297. Hayashi, K.; Hayashi, T.; Otsuka, H.; Takeda, Y. 1997 Antiviral activity of 5,6,7- trimethoxyflavone and its potentiation of the antiherpes activity of acyclovir. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 39: 821-824. Joly, C. A.; Pelippe, G. M. 1978. Fenologia e germinação de Rapanea guianensis e Zeyheria digitalis. Ciência e Cultura, 30 (supl.): 418. Capítulo 2 – Propagação Sexuada 26 Joly, C. A.; Pelippe, G. M. 1979. Germinação e fenologia de Zeyheria digitalis. Hoehnea, 8: 35-40. Kutney, J. P.; Hanssen, H. W. H. 1971. 5,6,7-trimethoxyflavone and 5,6,7,8- tetramethoxyflavone from Zeyheria tuberculosa. Phytochemistry, 10: 3298- 302. Capítulo 3 - Propagação Assexuada 27 CAPÍTULO 3 - Propagação Assexuada Estabelecimento do Protocolo de Micropropagação de Zeyheria montana Mart RESUMO: Zeyheria montana é uma planta medicinal endêmica do cerrado conhecida no Brasil como bolsa de pastor. O extrato aquoso de raízes é usado na medicina popular para doenças de pele e como agente antitumoral. Um protocolo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas axilares advindas de plântulas germinadas in vitro. Neste trabalho foi constatado que as sementes de Z. montana apresentam elevado índice de contaminação endógena que pode ser controlada com a retirada parcial da expansão alada da semente antes do inicio do processo de assepsia. O meio basal WP suplementado com 0,1mg/l de TDZ produzindo 4 gemas por haste e foi considerado o meio mais adequado para a multiplicação de Z. montana. O enraizamento in vitro ocorreu em meio WP/2 suplementado com 1mg/L de ANA e também foi obtido enraizamento das plântulas sob condições ex vitro em casa de vegetação. Palavras chave: bignoniaceae, cultura de tecido, planta medicinal CHAPTER 3 – Asexual Propagation Establishment of the micropropagation protocol of Zeyheria montana Mart. ABSTRACT: Zeyheria montana an endemic medicinal plant of the cerrado known in Brazil as bolsa de pastor. Z. montana aqueous root extract is popularly used in the folk medicine for skin diseases and as an anti-tumor Capítulo 3 - Propagação Assexuada 28 agent. A micropropagation protocol was developed using axillary buds harvested from plantletscultured in vitro. In this work was evidenced that Z. montana seeds present high index of endogenous contamination that may be controlled with the partial retreat of the winged expansion of the seed before starting surface sterilization. Basal WP medium supplemented with 0.1 mg/l TDZ, increased shoot proliferation, 4 buds per stem. Rooting was achieved in vitro using WP/2 medium supplemented with 1mg/L ANA and ex vitro inside a greenhouse. Keywords: bignoniaceae, medicinal plant , tissue culture 3.1. Introdução A propagação vegetativa in vitro denominada de micropropagação, devido ao tamanho dos propágulos, é a aplicação mais concreta e de maior impacto da cultura de tecido. Diferentes tipos de meios de cultura basais, com diversas variações nas concentrações de micro e macronutrientes, podem ser empregados para a abtenção de plântulas sob condição in vitro. Em geral são adicionados também ao meio de cultura fitorreguladores para suprir deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões produtoras na planta matriz; além de estimular respostas ao crescimento e elongamento das partes aéreas, de acordo com o estado fisiológico dos explantes e estado geral da planta matriz (Grattapaglia & Machado, 1998). O crescimento e a morfogênese de tecidos cultivados in vitro dependem de diferentes fatores: genéticos, físicos, químicos e fisiológicos que determinam a viabilidade, ou não, da conservação do genótipo de interesse. Uma das alternativas para amenizar o impacto da destruição da biodiversidade, principalmente das plantas medicinais, é o desenvolvimento de pesquisa na área de conservação ex situ onde espécies vegetais de alto valor Capítulo 3 - Propagação Assexuada 29 econômico ou cultural podem ser conservadas em coleções no campo, em câmara fria, ou in vitro. A conservação de germoplasma in vitro engloba dois tipos de coleções, de acordo com o IBPGR (Internacional Board for Plant Genetic Resources) (Fao,1982 ): conservação de germoplasma a longo prazo através de criopreservação e coleção ativa in vitro em que o germoplasma é mantido em crescimento mínimo sob condições controladas. A manutenção in vitro, de espécies medicinais, atende a duas questões importantes: a preservação de genótipos elites sob condições controladas e, ao mesmo tempo, permite a multiplicação em larga escala através da repicagem de plântulas conservadas. A conservação de plantas medicinais do Cerrado em banco de germoplasma é fundamental como estratégia para garantir a sua sobrevivência e manter a variabilidade genética, possibilitando futuros trabalhos de prospecção gênica e de metabólitos secundários. Assim, qualquer esforço no sentido de utilizar espécies medicinais provenientes do Cerrado, passa pelo processo de estudo sobre a sua conservação e caracterização. No que se refere a ações de conservação de plantas medicinais, a adoção de técnicas biotecnológicas é quesito essencial. (Nodari & Guerra, 1999). De acordo com Schumacher (1991), o desenvolvimento de protocolos de micropropagação são particularmente úteis em programas de conservação quando não é conhecida a forma de propagação da espécime em estudo, ou quando as sementes são recalcitrantes, possuem baixa viabilidade ou a perdem em curto período de tempo Centenas de plantas medicinais têm sido micropropagadas com objetivo de preservação e multiplicação em grande escala: Atropa belladona (Schumacher,1991), Catharantus roseus, (Hirata, et al 1994), Maytenus ilicifolia (Pereira, et al 1995), Dioscorea composita (Alizedehs, 1998), Podophyllum peltatum (Cerdeira, et al 1998), Mikania glomerata (Pereira, et al 1999). Além dessas, espécies que crescem no Cerrado também têm sido micropropragadas com vistas à preservação e, entre elas, podemos citar Gomphrena officinalis (Mercier et al 1992), Stryphnodendron pollyphythum (França et al, 1995) e Hancornia speciosa (Pereira Neto 1996) Capítulo 3 - Propagação Assexuada 30 O objetivo do presente estudo foi desenvolver um protocolo de micropropagação de Zeyheria montana visando futuros trabalhos de conservação in vitro. 3.2. Material e Métodos A coleta de sementes e material botânico para confecção de exsicatas foi realizada no município de Pedregulho, SP, e a exsicata foi depositada no Herbário de Plantas Medicinais da Unidade de Biotecnologia Vegetal da UNAERP com registro HPM-063. Assepsia: A assepsia das sementes foi realizada com diferentes agentes antimicrobianos e a expansão alada foi mantida, retirada de forma parcial, manualmente, antes da assepsia e, retirada totalmente após a mesma (tabela 1). Depois do procedimento de assepsia as sementes foram inoculas em meios WP (Wood Plant) (Smith &McCown,1983) basal e foram avaliadas quanto à contaminação em períodos de 30 e 60 dias. Todos os tratamentos de assepsia foram realizados com três repetições contendo 40 replicatas cada. A bactéria presente nas sementes, que sobreviveu ao processo de assepsia foi submetida a ensaio anti-biograma no laboratório de análises clinicas da UNAERP, com intuito de identificar a espécie e, ao mesmo tempo, encontrar um antibiótico eficiente para conter a contaminação dos explantes. As sementes germinadas in vitro e que não apresentaram contaminação, forneceram segmentos nodais axênicos de 0,5 cm de altura e foram inoculados em meio de cultura WP suplementado com Bap (benzilaminopurina, sigma), cinetina, sigma e 2ip (isopentenilaminopurina, sigma) nas concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 3,0 e 5,0mg/l e, também, inoculados em meio de cultura WP suplementado com 0,1; 1,0; 3,0; e 5,0 mg/l de TDZ(thidiazuron, sigma). Um Capítulo 3 - Propagação Assexuada 31 outro experimento foi realizado com as concentrações 1,0; 3,0 e 5,0 mg/L de TDZ associadas a 0,1 mg/l de AIA (ácido indolilacético , sigma). As avaliações quanto ao múmero de brotos por explante, número de gemas por haste, altura da plântula, porcentagem de calos na base, porcentagem de vitrificação e índice de sobrevivência foram realizadas após 40 dias da inoculação do explante. Plântulas com um par de folhas medindo 1,0 cm de comprimento foram transferidas para meio de enraizamento, ou seja, WP e WP/2 suplementados com IBA(ácido indolbutílico, , sigma) ou ANA (ácido naftalenoacético, , sigma) nas concentrações de 0,1 e 1,0 mg/l. Após 60 dias foram avaliadas as porcentagens de plantas enraizadas, o número de raízes, altura da plântula, porcentagem de calos na base e porcentagem de sobrevivência. Posteriormente, as plantas enraizadas in vitro foram transferidas para caixilhos de isopor com 72 compartimentos em forma de cone, com abertura superior 4 x 4 cm contendo substrato terra/areia 1:1,ou areia ou plantimax, onde permaneceram em casa de vegetação cobertos com um frasco de 5,5 X 8,5 cm por 30 dias e a avaliação, quanto à porcentagem de sobrevivência, foi realizada após 60 dias. Plântulas sem raiz com 2 cm de altura também foram transferidas para caixilhos de isopor sob as mesmas condições descritas acima. Após 60 dias foi realizada a porcentagem de sobrevivência das plântulas. O delineamento experimental adotado nos experimentos foi o inteiramente casualizado. Os tratamentos realizados com segmentos nodais e plântulas foram repetidos três vezes, sendo 10 explantes por repetição e, para a comparação das médias dos tratamentos, foi utilizado o teste de Tukey ao nível de 5%. Capítulo 3 - Propagação Assexuada 32 3.3. Resultados e Discussão Plantas lenhosas, normalmente, apresentam maior dificuldade para o estabelecimento do protocolo de micropropagação do que as plantas herbáceas as primeiras principalmente por apresentarem crescimento lento e elevada contaminação microbiana endógena e exógena. Essas contaminações são difíceis de serem controladas, ou eliminadas sem causar danos ou morte ao tecido vegetal (Skirvin, 1981; Bonga, 1982). Ensaios preliminares realizados in vitro na Unidade de Biotecnologia vegetal - UNAERP, com Zeyheria montana, mostraram elevados níveis de contaminação por fungo e bactéria nos explantes advindos diretamente do campo o que inviabilizou em primeira instância, o trabalho de micropropagação, por essa razão, optamos por trabalhar com plântulas germinadas sob condição in vitro. Os protocolos de assepsia Nº 1 e Nº 2 foram ineficientes na descontaminação das sementes introduzidas in vitro (Tab.2). Foi observada uma contaminação generalizada por bactéria constatada, de forma mais pronunciada, após 2 meses de cultivo in vitro. Algumas bactérias endógenas se mantêm em estado latente dentro do explante devido, principalmente, à alta concentração de sais e sacarose nos meios de cultura. Com o desenvolvimento e nutrição dos explantes há redução natural da concentração desses elementos, o que promove em alguns casos condições nutricionais ideais para o desenvolvimento de determinados tipos de microorganismos endógenos. Experimentos de identificação de microorganismo revelaram que a bactéria isolada dos explantes de Z. montana é uma Pseudomonas sp. O antibiograma realizado com cepas da bactéria isolada mostrou que três antibióticos foram eficientes na inibição do seu crescimento dela (Tab.3). O protocolo de assepsia Nº 3 não foi eficiente para conter ou eliminar a contaminação bacteriana, apesar de se ter utilizada solução de Cloranfenicol, um dos antibiótico indicados como eficiente no ensaio antibiograma. Esse problema só foi solucionado de maneira efetiva quando a expansão alada foi Capítulo 3 - Propagação Assexuada 33 removida de forma parcial antes da assepsia, resultando em 96% de eficiência ou com a remoção total da expansão alada após o procedimento de desinfecção com 99% de explantes sem contaminação (protocolos Nº 4 e Nº 5). Esse resultado mostra que a expansão alada é uma estrutura propícia para o desenvolvimento de microrganismo na espécie em estudo e que sua retirada é fundamental para o sucesso da desinfecção dos explantes de Z. montana. Grandes perdas de material clonal, cultivado in vitro têm sido registradas, em vários laboratórios comerciais e de pesquisa, devido à contaminação de plântulas por bactérias endógenas (Cassells 1986; Boxus & Terzi 1987; Cassells 1990 ) e esta questão é limitante no desenvolvimento de protocolos de micropropagação. Os experimentos realizados com BAP, cinetina e 2 ip apresentaram, em geral, um baixo índice de proliferação de brotos (m=1,0), altura reduzida dos mesmos ( 1,3 cm), alta incidência de calos na base (tabela 4) além de apresentarem elevada mortalidade de plântulas. As concentrações 3,0 ou 5,0 mg/l de 2ip apesar de não apresentarem respostas diferenciadas, quanto a análise estatística em relação aos outros tratamentos, foram consideradas as concentrações mais adequadas dentro desse grupo de experimentos por não apresentarem mortalidade dos explantes. A utilização de 0,1 ml/L TDZ aumentou a altura das plântulas (2 cm) e promoveu em média 4,1 gemas por haste (Tab 5). Esta concentração foi a única que não apresentou vitrificação e também não provocou mortalidade nos explantes. O TDZ estimulou a produção de calos na base dos explantes em 100% das plântulas, porém isso não interferiu no desenvolvimento das mesmas. A associação de TDZ com 0,1 mg/l de AIA demonstrou não ser eficiente para melhorar o desenvolvimento das brotaçãos in vitro desta espécie. O enraizamento foi obtido em todos os meios testados, sendo que o mais eficiente foi o meio WP/2 suplementado com 1,0 mg/l de ANA onde foi constatado 70% de plântulas enraizadas (Tab 6). A presença de calos na base Capítulo 3 - Propagação Assexuada 34 das plântulas enraizadas não foi prejudicial à aclimatação, isso porque as raízes se formaram a partir do caule e não dos calos. O substrato Plantimax apresentou os melhores resultados, com 73% de sobrevivência para plântulas enraizadas in vitro e 53 % para plântulas que foram aclimatadas sem o sistema radicular (Tab 7). Esse resultado mostra que é possível desenvolver o sistema radicular de Z. montana sob condições ex vitro e que a opção de sistema in vitro ou ex vitro para o enraizamento vai depender da análise dos custos e produção e do, fluxo de caixa. Com esses resultados podemos propor que, para o desenvolvimento do protocolo de micropropagação de Z. montana a expansão alada das sementes deve ser retirada manual e parcialmente antes do processo de assepsia e, os segmentos nodais advindos das sementes cultivadas in vitro devem ser inoculados em meio WP suplementado com 0,1mg/l de TDZ. O enraizamento pode ser realizado tanto in vitro como ex vitro. Tabela 1.Tratamentos de assepsia utilizados para a descontaminação de sementes de Z. montana. Tratamentos Com expansão alada Sem expansão alada Benomil (0,5%) 24 horas Hipoclorito de cálcio (0,5%) 30 min 50 min Cloranfenicol (5%) 1 X X X 2 X X x 3 x X X x 4* X X x 5** x x x *Antes do procedimento de assepsia a expansão alada foi retirada parcialmente. **Após o procedimento de assepsia a expansão alada foi retirada integralmente dentro do fluxo laminar. Capítulo 3 - Propagação Assexuada 35 Tabela 2. Efeito da assepsia na descontaminação de sementes de Z. montana. % de explantes contaminados (dias) Tratamento (30) (60) 1 36,33 a 90,00 a 2 36,33 a 86,66 a (CV%) 9,87 9,24 3 - 79,00 a 4 - 4,00 b 5 - 1.00 b (CV%) 18.28 As médias foram comparadas entre linhas e aquelas seguidas das mesmas letras não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (0,5%). Capítulo 3 - Propagação Assexuada 36 Tabela 3. Antibiograma realizado com Pseudomonas isolada de Z. montana. Antibiótico Resposta Amicacina Resistente Cefotaxima Intermediário Ceftazidina Sensível Ciprofloxacina Sensível Cloranfenicol Sensível Gentamicina Resistente Tobramicina Resistente Capítulo 3 - Propagação Assexuada 37 Tabela 4. Efeito do tipo e concentração de citocininas nos segmentos nodais de Z. montana inoculados em meio WP. BAP concentação mg/L Nºbrotos Altura (cm) % calos % mortalidade 0 1,0a 1,3ab - 40a 0,1 1,0a 1,0b 93a 53a 0,5 1,0a 1,0b 100a 26a 1,0 1,0a 1,0b 100a 43a 3,0 1,0a 1,4a 100a 26a 5,0 1,0a 1,1ab 100a 86a Cv% 4,66 10,60 5,23 50,36 CINETINA 0,1 1,0b 1,2a 86a 46a 0,5 1,0b 1,3a 80a 66a 1,0 1,0b 1,1a 86a 73a 3,0 1,4a 1,2a 100a 45a 5,0 1,3ab 1,6a 100a 60a Cv% 12,90 17,30 18,89 47,00 2 IP 0,1 1,0c 1,2a 100a 15a 0,5 1,0c 1,3a 100a 52a 1,0 1,1bc 1,1a 100a 40a 3,0 1,3ab 1,3a 100a - 5,0 1,5a 1,5a 100a - Cv% 10,09 15,16 62,61 Médias seguidas das mesmas letras não diferem significativamente entre si na coluna pelo teste de Tukey (0,5%). Capítulo 3 - Propagação Assexuada 38 Tabela 5. Efeito do TDZ e da associação TDZ e AIA nos segmentos nodais de Z. montana inoculados em meio WP. TDZ Concentração mg/l Nº brotos Nº gemas Altura (cm) % calos % mortalidade % vitrificaçã o 0 1,0b 1,0b 1,3ab - 40a - 0,1 1,3ab 4,1a 2,0a 100a - - 1,0 1,6a 3,8a 1,6ab 100a 71a 46a 3,0 1,3ab 3,5a 1,7ab 100a 38a 57a 5,0 1,2ab 1,7b 1,1b 100a 81a 65a Cv% 15,88 22,69 22,65 37,49 45,05 TDZ + 0,1 mg/l AIA 1,0 1,0a 2,0ab 1,3a 100a 38a 38a 3,0 1,2a 2,3a 1,3a 100a 65a 38a 5,0 1,0a 1,0b 1,0a 100a 57a - Cv% 8,25 28,48 10,34 38,39 36,60 Médias seguidas das mesmas letras não diferem significativamente entre si na coluna pelo teste de Tukey (0,5%). Capítulo 3 - Propagação Assexuada 39 Tabela 6. Efeito do tipo e concentração de auxinas no enraizamento de Z. montana. Concentração mg/L % raiz Nº raiz Altura (cm) % calos % mortalidade WP 43a 1,1a 1,5a 0 29a WP/2 29a 1,0a 1,2a 47a 13a Cv% 54,12 11,66 11,80 40,02 WP+0,1 ANA 44a 1,6a 1,5b 55a 31a WP+1,0 ANA 60a 1,1a 2,2a 60a 26a Cv% 33,10 39,01 4,93 57,32 37,70 WP+0,1 IBA 53a 1,8a 1,6a 93a 14a WP+1,0 IBA 33a 2,6a 1,5a 86a 62a Cv% 42,13 48,86 23,06 12,83 56,40 WP/2+0,1 ANA 29a 0,6a 1,8a 35a 35a WP/2+1,0 ANA 70a 1,0a 1,4a 66a 0 Cv% 48,87 48,04 16,39 91,28 WP/2+0,1 IBA 53a 1,4a 1,2a 93a 14a WP/2+1,0 IBA 50a 1,5a 1,7a 33b - Médias seguidas das mesmas letras não diferem significativamente entre si na coluna pelo teste de Tukey (0,5%). Capítulo 3 - Propagação Assexuada 40 Tabela 7. Efeito do substrato na aclimatação de Z. montana. Tipo de substrato Plântula com raiz %sobrevivência Plântula sem raiz %sobrevivência Terra/areia 1:1 67a 33a Areia 40a 33a Plantimax 73a 53a Cv% 41,57 28,87 Médias seguidas das mesmas letras não diferem significativamente entre si na coluna pelo teste de Tukey (0,5%). 3.4. Conclusões Podemos concluir que os resultados apresentados na micropropagação são satisfatórios, entretanto sugerimos que a fase de multiplicação seja otimizada para que se possa obter brotações múltiplas, o que representará uma maior eficiênia no protocolo. Esse foi o primerio estudo realizado in vitro com essa espécie. 3.5. Referências Alizedehs, A; Mantell, S.H; Viana, A.M. In vitro shoot culture and microtuber induction in the steroid yam Dioscorea composita Hemsl. Plant Cell Tissue and Organ Culture v.53, p. 107-112, 1998. Bonga, J. M. Tissue culture tecniques. In:Bonga,J.M.; Durzan,D. J. Tissue culture in forestry. The Hague:Nijhoff, 1982. p.4-35. Capítulo 3 - Propagação Assexuada 41 Cassells A.C. Production of healthy plants. In: Alderson PG& Dullforce WM (eds) Micropropagation in Horticulture. University of Nottingham, Trent Print Unit, Nottingham. 1986. p.53-71 Cassells A.C.. Problems in tissue culture: culture contamination. In: Debergh P.C. & Zimmerman R.H (Eds) Micropropagation. Kluwer Dordrecht. 1990. p. 31-44. Cerdeira, R.M.M.; Burandt Jr, C.L.; Bastos,J.K.; Nanayakkara,N.P.D.; McChesney,J.D.. In vitro of Podofhyllum peltatum, Planta Medica,v. 64. p.42- 45. 1998. França, S.C. Duarte, I.B.; Moraes, R.M. Pereira A.M.S.. Micropropagação de Stryphnodendron polyphythum (barbatimão). Plant Cell Tissue and Organ Culture v.42. p. 291-293. 1995. Grattapaglia, D.;Machado, M.A. Micropropagação. In Torres, A.C.; Caldas,L.S.; Buso, J.A.; Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasilia: EMBRAPA-CNPH,1998. p. 183-260. Hirata, K.; Miyamoto,K.; Miura, Y. Catharanthus roseus L. (periwinkle): Production of vindoline and catharanthine in multiple shoot cultures In: Biotechnology in Agriculture and Forest Medicinal and Aromatic Plant VI (ed. By Y.P.S. Bajaj) Springer-Verlag Berlin Heidelberg,, 1994. v. 26. p.46-54. Nodari, R.O.; Guerra, M.P. Aspectos genéticos e moleculares da produção vegetal. In: Farmacognosia da planta ao medicamento: Org.Simões et al. Ed. Universidade/UFRGS/Ed. Da UFSC. 1999. p.29-30. Capítulo 3 - Propagação Assexuada 42 Mercier, H.; Vieira C.C..J. ; Figueiredo-Ribeiro R.C.L.Tissue culture and plant propagation of Gomphrena officinalis a Brazilian medicinal plant. Plant Cell Tissue and Organ Culture 28: 249-254. 1992. Pereira A.M.S., Câmara F.L.A., França S.C. Vegetative propagation in Mikania glomerata: Micropropagation and Cuttings. Acta Hortculturae WOCMAP II Proceedings 502, p.347-352. 1999. Pereira Neto, A.B. In vitro propagation of Hancornia speciosa, a tropical fruit tree. In Vitro Cell. Dev. Biol. 32: 253-256. 1996. Pereira, A.M.S; Moro, J.R; Cerdeira, R.M.M; França, S.C..Effect of phytoregulatiors and physiologia characteristics of the explants on micropropagation of Maytenus ilicifolia. Plant, Cell, tissue & Organ Culture. 42: 295-297. 1995. Schumacher, H.M. Biotechnology in the production and conservation of medicial plant. In: The consevation of Medicinal plant (Eds. Akerele,O.; Heywood.H.; Synge, H.). Cambridge University Press, 1991.p.179-198. Skirvin, R.M. Frut. crops. In: Conger, B.V. Cloning agricultural plant via in vitro techniques. Boca Raton: CRC Press. 1981.p.51-139. Smith, M.A.L.; McCown,B.H. A comparison of source tissue for protoplast isolation from three wood plant species. Plant Science Letters, 28(2). p. 149- 56. 1983. Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 43 CAPÍTILO 4 - SISTEMA REPRODUTIVO Determinação do Sistema Reprodutivo RESUMO: A relação Polén/Óvulo de Zeyheria Montana, foi determinada visando conhecer o seu sistema reprodutivo. Bolsa de pastor, como é popularmente conhecida, é uma espécie endêmica do Cerrado utilizada como agente antitumoral e antiinflamatório. Nos experimentos foram utilizados 30 botões de uma população do município de Sacramento, MG. Cada teca foi esmagada sobre lâmina de microscopia e corada com carmim propiônico. Todos os grãos de pólen foram contados com o auxílio de microscópio, utilizando aumento de 100 x. O ovário foi aberto e todos os óvulos foram contados. Foram encontrados em média 45 ± 6,7 óvulos e 8.560 ± 781,0 polens por teca. A relação P/O indicou que esta espécie é alógama facultativa. Todavia, novos estudos específicos são necessários para elucidar outros aspectos da biologia reprodutiva de Z montana. Palavras chave: alogamia, , flor, pólen, CHAPTER 4 – Productive System Determination of the reproductive System ABSTRACT: Zeyheria montana or bolsa de pastor as it is popularly called in Brazil is an endemic species from the cerrado used in folk medicine as anti- tumor and anti-inflammatory agent. Attempting to understand the reproductive system of Z. montana a pollen/ovule (P/O) relationship was established. Buttons (30) from a population collected in Sacramento, MG were used. Each teca was squashed on microscopy sheet and colored with carmim propionic. Every pollen grain was counted with the aid of a microscope, zoom range 100 Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 44 x. The ovary was opened and the ova counted. Approximately 45 ± 6,7 ova were counted and the average of pollen by teca ranged 8.560 ± 781,0. The P/O relationship indicated that this species is alogamous. Moreover, specific studies remain necessary to elucidate other aspects of the reproductive biology of Z. montana. Keywords: flower, pollen, xenogamy 4.1. Introdução A compreensão acerca do sistema reprodutivo é de fundamental importância para se tentar entender melhor como ocorre a dinâmica dos alelos nas populações vegetais. As plantas possuem uma notável flexibilidade sexual que parece ser evolutivamente conduzida por três importantes restrições na sua história de vida: o custo energético da reprodução, a necessidade de produzir progênie geneticamente variável e a falta de mobilidade das plantas (Bock & Linhart, 1989). Basicamente, o sistema reprodutivo pode ser sexuado e assexuado (apomítico), sendo que nas plantas que se reproduzem sexualmente podemos observar a exogamia e a autogamia, e nas que se reproduzem assexualmente a reprodução vegetativa e a agamospermia (Richards 1990). É freqüente a presença numa espécie dos dois tipos de reprodução uma vez que a apomixia sozinha significa, a longo prazo, um suicídio devido à falta de variabilidade genética e ao acúmulo de mutações. O sistema reprodutivo é influenciado pelo sistema de cruzamento que por sua vez é determinado pela morfologia floral. Pode-se encontrar na natureza espécies de plantas hermafroditas, monóicas ou dióicas. Estas estruturas florais aliadas a outras estratégias adaptativas irão dirigir o modo de reprodução da espécie, determinando, assim, diferentes estruturas genéticas populacionais. A Morfologia floral é um fator que está intimamente ligado ao sistema reprodutivo, como por exemplo a autogamia, que ocorre somente em plantas Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 45 hermafroditas ou monóicas. Espécies dióicas e com heterostilia devem ser de fecundação cruzada e, deste modo, as áreas dos grupos de vizinhança são grandes, ocorrendo uma diferenciação menos pronunciada nas populações ( Loveless &Hamrick,1984). Os sistemas de cruzamento determinam o padrão de transmissão genética e influem na organização da variação genética numa população. A autogamia restringe a heterozigose, reduzindo a variação dentro de populações e aumentando a variação entre populações. Em contraste, a alogamia favorece o fluxo de genes e reduz a probabilidade de diferenciação microgeográfica e subestruturamento de populações. Mesmo em populações alógamas, alguma autofecundação combinada com cruzamentos entre indivíduos aparentados e dispersão de sementes restrita pode levar ao isolamento reprodutivo e à formação de subpopulações. O estudo dos padrões de transmissão de genes, em populações naturais, é importante para se entender a evolução e a manutenção da autofecundação, da dioicia e de sistemas de cruzamento que restringem o número de reprodutores disponíveis. Há cinco tipos básicos de sistemas de cruzamento: (a) predominantemente autógama; (b) predominantemente alógama; (c) sistema misto; (d) parcialmente apomítica; e (e) autogamia parcial de gametófitos (KEARNS & INOUYE, 1993). Sistemas de cruzamento são influenciados por fatores ambientais e, por serem regulados por genes, são afetados pela seleção. Conseqüentemente, o sistema de cruzamento pode variar entre populações. Mesmo dentro de populações, pode haver diferenças entre indivíduos na taxa de fecundação cruzada. Por exemplo, as plantas que florescem na extremidade fenológica da floração podem ser predominantemente autógamas, enquanto as do pico de floração, predominantemente alógamas. As plantas no centro de populações densas podem ser predominantemente alógamas, enquanto as das margens, predominantemente, autógamas. Populações onde os polinizadores são abundantes podem apresentar padrões distintos daquelas onde os polinizadores são raros. Num mesmo indivíduo, as flores localizadas nas partes mais baixas da copa podem ter maior taxa de autofecundação do que as das partes mais altas. O modo de polinização, a complexidade arquitetônica das Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 46 flores e das plantas, bem como o tamanho e a densidade das populações interagem com o controle genético do grau de auto-incompatibilidade para determinar a taxa de fecundação cruzada. (KEARNS & INOUYE, 1993; BROWN et al, 1989). 4.2. Material e Métodos O sistema reprodutivo da Zeyheria montana foi determinado pela relação pólen/óvulo (P/O), segundo metodologia desenvolvida por Cruden (1977). Para essa determinação foram coletados botões florais em estádio próximo à antese, com grãos de pólen completamente formados. Foram utilizadas 30 botões de uma população do município de Sacramento. Os botões foram coletados no mês de novembro de 2002 e permaneceram em etanol 70%, em refrigerador, até a análise. Foi utilizado microscópio estereoscópico para a determinação do número de óvulos e, a seguir, foi retirada uma teca da antera e esmagada sobre lâmina de microscopia, sendo adicionado o corante carmim propiônico e água para finalizar a montagem da lâmina. Todos os grãos de pólen de cada antera foram contados com auxílio de microscópio Marca Nikon, utilizando aumento 100x. A relação P/O foi estabelecida utilizando-se a expressão: (número de grãos de pólen em uma antera) x (número de anteras por flor) P/O =___________________________________________________________ (número total de óvulos) Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 47 4.3. Resultados e Discussão Nas determinações do número de grão de pólen por antera foram observados em média 45 ± 6,7 óvulos e 8.560 ± 781,0 pólens por teca .O número de anteras foi sempre 4 contendo cada uma 2 tecas. A determinação da P/O foi de 1.506,40 ± 183,20 e o log de P/O de 3,17 ± 0,5(Quadro 1) portanto, essa espécie se enquadra na faixa que compreende espécies com alogamia facultativa (P/O 796,6 ± 87,7 a 5859,2 ± 936,5 e o log P/O 2,81 ± 05 a 3,65 ± 0,6), de acordo com os resultados de Cruden (1977). O conhecimento do sistema reprodutivo é de extrema relevância uma vez que interfere no nível de variabilidade genética de uma espécie, e determina as interações ecológicas que favorecem a dispersão de pólen ou semente. O fato dessa espécie ser alógama facultativa pode explicar alguns dados obtidos na análise genética por RAPD, principalmente a questão da variabilidade encontrada dentro das populações estudadas. O resultado obtido nesse estudo contribuem significativamente na elucidação da biologia reprodutiva da espécie, entretanto trabalhos mais específicos serão necessários para elucidar outros aspectos da biologia reprodutiva de Z. Montana Tabela 1. Determinação do numero de pólem e óvulo por flor de Z. montana. Flor Nº óvulos por flor Nºpólem por flor Nºpólem/óvulos 1 48 58.864 1.226,33 2 40 35.728 893,20 3 70 47.512 678,74 4 56 23.760 424,28 5 41 81.912 1.997,85 6 50 59.736 1.194,72 7 60 98.544 1.642,40 8 38 77.264 2.033,26 Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 48 9 66 91.280 1.383,03 10 57 92.992 1.631,43 11 55 22.512 409,30 12 28 48.848 1.744,57 13 48 90.032 1.875,66 14 49 32.840 670,20 15 37 89.776 2.426,37 16 44 68.112 1.458,00 17 42 100.872 2.401,71 18 52 57.440 1.104,61 17 36 51.840 1.162,22 20 40 80.352 2.008,80 21 37 71.432 1.930,59 22 39 42.376 1.086,56 23 47 72.960 1.552,34 24 25 51.600 2.064,00 25 40 96.528 2.413,20 26 40 91.672 2.291,80 27 54 104.960 1.943,70 28 34 55.744 1.639,52 29 52 122.568 2.357,07 30 28 44.208 1.578,85 Média P/O 1.506,40 4.4.Conclusões Com esse trabalho podemos concluir que a espécie Zeyheria montana é umaplanta que se reproduz por alogamia facultativa, entretanto mais estudos serão necessários. Capítilo 4 - Sistema Reprodutivo 49 4.5.Referências Bock, J.H.; Linhart,Y.B.. The evolutionary ecology of plant. Boulder, Westview, 1989. 600p.. Brown, A. H. D.; Burdon, J. J.; Jarosz, A. M. Isozyme analysis of plant mating systems. In: SOLTIS, D. E.; SOLTIS, P. S. (Ed.) Isozymes in plant biology. Portland: Dioscorides Press. 1989. p. 73-86. Cruden, R.W.. Pollen-ovule rations: a conservative indicator of breeding systems in flowering plants. Evolution, 31:32-46. 1977. Kearns, C. A.; Inouye, D. W. Techniques for pollination biologists. Colorado: University Press of Colorado. 1993. p. 217-262. Loveless,M.D.; Hamrick,J.L.. Ecological determinants of genetic struture in plant populations. Am.Ver.Ecol. Syst., 15:65-95. 1984. Richard, A.J. Plant Breeding Systems. Cambridge, University Press. 1990. 529p. capítulo 5 - Coletas e mapeamento de recursos genéticos de Zeyheria montana por sistema de posicionamento global (GPS). 50 Coletas e mapeamento de recursos genético de Zeyheria Montana do Estado de São Paulo capítulo 5 - Coletas e mapeamento de recursos genéticos de Zeyheria montana por sistema de posicionamento global (GPS). 51 CAPÍTULO 5 - Coletas e mapeamento de recursos genéticos de Zeyheria montana por sistema de posicionamento global (GPS). RESUMO: A localização e o mapeamento dos recursos biológicos do estado de São Paulo de modo sistematizado, era praticamente inexistente até o ano de 1999. Atualmente, com o desenvolvimento do programa BIOTA/FAPESP vem sendo criada uma base cartográfica digital de qualidade reunindo informações obtidas por pesquisadores ligados ao programa. O objetivo deste trabalho foi explorar o potencial do geoprocessamento através da técnica de coleta utilizando o GPS para monitoramento dos recursos genéticos de Zeyheria montana no estado de São Paulo, visando a bioprospecção e a conservação in vitro dessa espécie. Foram coletados 167 indivíduos dentro do estado de São Paulo e a partir dessas coletas foram calculadas as distâncias entre os acessos dentro e entre cada população. Com este trabalho foi possível verificar que a incidência desta espécie nas áreas de conservação é reduzida e que nas outras áreas a espécie tem um comportamento ruderal, o que representa grande risco de extinção para a espécie. Palavras chave:conservação, geoprocessmento, recursos biológicos. CHAPTER 5 – Collection and mapping of the biologial resources of the Zeyheria montana in the State of São Paulo ABSTRACT: Systematic location and mapping of the biological resources of the state of São Paulo were practically nonexistent until the year of 1999. Now, with the advent of the BIOTA/FAPESP program, it is being possible to structure a digital cartographic base of quality compiling information obtained by researchers joining the program. The objective of this work was to explore the potential of the geoprocessing using the GPS technique for monitoring genetic resources of Zeyheria montana in the state of São Paulo, aiming the bioprospection and the conservation of this species in vitro. Individuals (167) capítulo 5 - Coletas e mapeamento de recursos genéticos de Zeyheria montana por sistema de posicionamento global (GPS). 52 were collected in different areas in the state of São Paulo and the distance among each access inter and intra population was calculated. With this work it was possible to verify that the incidence of this species inside conservation areas is reduced and that in the other areas this species has a ruderal behavior, what indicates a great extinction risk for the species. Key words: biological resources, conservation, geoprocessing, 5.1. Introdução O primeiro passo a ser dado quando se planeja uma expedição de coleta é definir, para a espécie em estudo, quais as áreas a serem visitadas. Um dos maiores problemas enfrentados ao se programar expedições de coleta é a falta de dados , quase generalizada, sobre distribuição geográfica. Grande número de plantas silvestres e não domesticadas estão depositadas em herbários mas as anotações sobre a localização são quase sempre imprecisas. A localização e o ma