i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL RELAÇÃO BORO E SILÍCIO EM PLANTAS DE ALGODÃO CULTIVADAS SOB DEFICIÊNCIA DE BORO Jonas Pereira de Souza Júnior Mestre em Agronomia (Ciência do Solo) 2021 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL RELAÇÃO BORO E SILÍCIO EM PLANTAS DE ALGODÃO CULTIVADAS SOB DEFICIÊNCIA DE BORO Discente: Jonas Pereira de Souza Júnior Orientador: Prof. Dr. Renato de Mello Prado Coorientador: Prof. Dr. Cid Naudi Silva Campos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia (Ciência do Solo) 2021 iii iv v DADOS CURRICULARES DO AUTOR Jonas Pereira de Souza Júnior, nascido em Bebedouro – SP, Brasil, em 03 de julho de 1991, filho de Ilda Raimunda e Jonas Pereira de Souza. Possui curso técnico em produção agropecuária com ênfase em plasticultura (2009) pela Escola Técnica Estadual “Prof. Matheus Leite de Abreu”, Mirassol – SP. Iniciou em 2010 o curso de graduação em Engenharia Agronômica pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) Câmpus de Jaboticabal concluindo em 2016. No primeiro ano da graduação ingressou no Grupo de Estudos em Nutrição de Plantas da UNESP (Genplant), realizando pesquisas relacionadas à ciclagem de nutrientes, adubação com micronutrientes e adubação potássica da cana-de-açúcar em sistemas de colheita mecanizada. Neste mesmo ano foi bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, no período de 2010 a 2012, na modalidade ITI – A – Iniciação Tecnológica e Industrial para o desenvolvimento do projeto de pesquisa “Uso eficiente da adubação em cana-de-açúcar para produção de etanol: potássio”. Em 2012, foi representante discente do Conselho do Departamento de Solos e Adubos FCAV/UNESP. Em 2013, foi bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, no programa “Inglês sem Fronteiras”, realizando missão de estudo da língua inglesa na Universidade La Trobe – Victória - Austrália durante seis meses e no ano seguinte foi bolsista da CAPES programa “Ciência sem Fronteira”, em graduação sandwiche Brasil – na Austrália, na mesma Universidade. Em 2016 Ingressou no curso de mestrado no Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Ciência do Solo) da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal. Realizou período de intercambio nacional em missão de pesquisa na UFMS Câmpus de Chapadão do Sul a partir do Programa Nacional de Cooperação Acadêmica (PROCAD) da CAPES. Concluiu o curso de Mestrado no ano de 2018 com a apresentação da dissertação “Silício como mitigador de deficiência e toxicidade de boro na cultura do algodão cultivada em solução nutritiva”. Atualmente é ingressante no curso de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Ciência do Solo) da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal e integrante do Genplant, atuando em pesquisas na área de nutrição de plantas, trabalhando com o uso do silício como mitigador de desordem nutricional e tendo publicado 27 artigos em periódicos científicos indexados na Web of Science (Thomson Reuters) e 4 capítulos de livros. vi “Nós “tá” aqui por cada bicha com a vida interrompida, por causa de homofobia, ódio e intolerância. Resistimos no dia a dia para poder chegar o dia que prevaleça respeito, igualdade e esperança”. Murillo Zyess (Quebrada Queer) vii Aos meus pais Jonas Pereira de Souza (in memorian) e Ilda Raimunda; e a minha irmã Yara Luana Pereira de Souza, pelo apoio incondicional, pelos ensinamentos e por nunca desistirem de mim. Dedico viii AGRADECIMENTOS Agradeço inicialmente a Deus, ao universo, a energias positivas, ao acaso ou a qualquer definição de um agente que atua para manter as coisas fluindo em constante harmonia sendo frequentemente incompreendido, mas que me possibilitou atingir este objetivo. Ao meu pai, Jonas Pereira de Souza (in memorian), por sempre ter incentivado meus sonhos, por maiores que pudessem parecer, e me incentivar a não desistir, mesmo quando as coisas não fluem da maneira esperada. A minha mãe, Ilda Raimunda, por toda dedicação, por compartilhar os momentos de preocupação e dividi-las deixando-as mais leve e por sempre ser meu porto seguro, para onde sempre posso retornar para recuperar as energias e então seguir adiante. A minha irmã, Yara Luana Pereira de Souza, por todo companheirismo e apoio, pelos conselhos e por me incentivar e compartilhar todas as alegrias e conquistas deixando a jornada da vida mais feliz. Ao meu namorado Leonardo Henrique da Silva por toda cumplicidade e por estar comigo disponível para todas as minhas ideias e aventuras. Por me ensinar com amor o verdadeiro significado de companheirismo e por compartilhar todos os momentos comigo neste final de ciclo. Ao meu orientador Prof. Dr. Renato de Mello Prado que me aceitou para estágio em março do meu primeiro ano de graduação (2010) e que me ofereceu muitas oportunidades para crescimento e desenvolvimento da minha carreira na área acadêmica. Ao meu coorientador Prof. Dr. Cid Naudi Silva Campos por todo apoio para a execução deste estudo e por todas as oportunidades de parcerias em projetos que temos desenvolvido. A minha psicóloga Claubia Regina Ramos Nogueira por todo apoio e por me auxiliar, em todos esses anos, a manter minha saúde mental com muita paciência, dedicação e carinho e sempre me ajudar a perceber quais são os melhores caminhos. ix Aos meus melhores amigos Bianca Godoi de Sá Carvalho, Gabriela de Oliveira Brack, Gabriele Lima Costa, Edlara Santos Gomes, Luan Veloso de Chagas Prais e Victor de Lima Triveloni pelos anos de convivência e companheirismo, pelos momentos felizes e por, mesmo à distância, permanecerem comigo sendo parte de quem eu sou. A minha amiga e técnica do laboratório Claudia Campos Dela Marta, por todos os “puxões de orelha” e conselhos no início da minha formação e por todos os bons momentos e risadas durante o meu doutorado. Ao Grupo de Estudo em Nutrição de Plantas da UNESP (Genplant) por ter me recebido de braços abertos e sempre me proporcionarem oportunidades de aprendizado e crescimento pessoal e profissional. Ao meu amigo Leonardo Henrique Sória por compartilhar comigo as dificuldades da vida acadêmica e me aliviar das angustias e frustrações através de momentos de reflexão e descontração sempre muito válidos. Aos meus amigos Thiago Henrique Fachini e Jéssica Maria Pereira Matos por terem me acolhido e me refugiado em momento importante para a execução desse trabalho, me ajudando a limpar a mente e relaxar para seguir adiante com os desafios desta pesquisa. Aos meus amigos Kevein Ruas de Oliveira e Gilmar da Silveira Sousa Junior e a Profa. Priscila Lupino Gratão pela oportunidade de desenvolver os estudos apresentados neste trabalho e em outros projetos, pelo aprendizado e por todo apoio nesta pesquisa. Ao Prof. Eduardo Custódio Gasparino por possibilitar o estudo dos grãos de pólen apresentado neste trabalho e pelo ensinamento e disponibilidade de seu laboratório. Por fim, gostaria de agradecer a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho e para meu desenvolvimento pessoal e profissional. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 x SUMÁRIO Página RESUMO.................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................. v CAPÍTULO 1 – Considerações gerais ...................................................................... 1 1. Introdução ........................................................................................................... 1 2. Revisão de literatura ............................................................................................ 5 2.1 A função do boro no desenvolvimento reprodutivo vegetal .......................... 5 2.2 A relação boro e silício no desenvolvimento reprodutivo das plantas .......... 8 2.3 A função do boro e do silício no sistema antioxidante em plantas de algodão .................................................................................................................................... 9 2.4 A função do boro e do silício na produtividade e na qualidade de fibras do algodoeiro .............................................................................................................................. 11 3. Referências ........................................................................................................ 13 CAPÍTULO 2 – A adição de silício na aplicação foliar boratada no algodoeiro modula o sistema antioxidante atenuando a deficiência e a toxicidade de boro .................................................................................................................................. 22 Resumo .................................................................................................................. 22 1. Introdução. ......................................................................................................... 24 2. Material e Métodos ............................................................................................. 26 2.1 Condições de crescimento ......................................................................... 26 2.2 Delineamento experimental e tratamentos ................................................. 28 2.3 Índice de turbidez da calda B associada a Si ............................................. 28 2.4 Coleta da parte aérea ................................................................................. 30 2.5 Avaliação do estresse oxidativo, prolina e glicina-betaína ......................... 30 2.6 Análise nutricional de B, acúmulo de Si e produção de massa seca da parte aérea ....................................................................................................................................... 32 2.7 Análise estatística....................................................................................... 33 3. Resultado e Discussão ....................................................................................... 33 3.1 Controle x Fatorial ...................................................................................... 33 3.2 Teste de turbidez da calda e acúmulo foliar de B e Si ....................................... 34 3.3 Estresse oxidativo, prolina e glicina-betaína nas folhas de algodoeiro ........ 39 3.4 Produção de massa seca .......................................................................................... 42 4. Conclusão ......................................................................................................... 43 5. Referências ....................................................................................................... 44 i xi CAPÍTULO 3 – Adição de Si à calda boratada para aplicação foliar incrementa a eficiência de uso de boro pela flor e aumenta a produção de grãos de pólen .. 49 Resumo .................................................................................................................. 49 1. Introdução. ......................................................................................................... 50 2. Material e Métodos ............................................................................................. 52 2.1 Condições de crescimento ......................................................................... 52 2.2 Delineamento, parcela experimental e aplicação dos tratamentos............. 53 2.3 Coleta das flores e avaliação da quantidade de grãos de pólen .................... 53 2.4 Massa seca, teor e acúmulo de B e Si, teor de carboidratos e eficiência de uso do B nas flores ............................................................................................................. 53 2.5 Análise estatística....................................................................................... 54 3. Resultado e Discussão ....................................................................................... 55 3.1 Acúmulo de B e Si, teor de carboidratos, produção de massa seca e eficiência de uso de boro nas flores de algodoeiro .................................................. 55 3.Produção de grãos de pólen nas flores de algodoeiro .......................................... 58 4. Conclusão ......................................................................................................... 59 5. Referências ....................................................................................................... 59 CAPÍTULO 4 – Silício via foliar na fase reprodutiva do algodoeiro contribui com o boro para aumentar a produtividade e a qualidade da fibra ............................ 63 Resumo .................................................................................................................. 63 1. Introdução. ......................................................................................................... 65 2. Material e Métodos ............................................................................................. 67 2.1 Localização e características da área experimental ................................... 67 2.2 Delineamento, parcela experimental e aplicação dos tratamentos............. 69 2.3 Teste de homogeneidade da solução boro associado a silício .................. 70 2.4 Manejo fitossanitário ................................................................................... 71 2.5 Avaliações fisiológicas ................................................................................ 72 2.6 Amostragem e análise foliar do teor de Si e de B ...................................... 73 2.7 Produtividade, teor de Si e de B nas plumas e avaliação da qualidade da fibra ......................................................................................................................................... 74 2.8 Análise estatística....................................................................................... 74 3. Resultado e Discussão ....................................................................................... 74 3.1 Estabilidade da mistura B associado a Si e teor de B e de Si no algodoeiro .................................................................................................................................................. 74 3.2 Concentração interna de CO2, fotossíntese e eficiência do uso da água em plantas de algodão ............................................................................................................. 79 ii xii 3.3 Produtividade e qualidade da fibra ........................................................................... 81 4. Conclusão ......................................................................................................... 85 5. Referências ....................................................................................................... 85 CAPÍTULO 5 – Considerações finais ..................................................................... 90 iii xiii RELAÇÃO BORO E SILÍCIO EM PLANTAS DE ALGODÃO DEFICIENTES EM BORO RESUMO - A maior exigência do boro (B) na fase reprodutiva do algodoeiro e baixa disponibilidade no solo é conhecida, implicando no fornecimento deste elemento à cultura, principalmente, via pulverização foliar, embora estudos sejam restritos. Há relatos indicando que o silício (Si) aumenta a produtividade do algodoeiro e outros constatando alto conteúdo de Si na flor e durante o desenvolvimento da fibra do algodão. Isso induziu alguns questionamentos, se o Si poderia auxiliar o B durante o desenvolvimento reprodutivo e se as associações desses elementos poderiam ampliar os seus efeitos benéficos. Para verificar esta interação entre B e Si, realizou-se a presente pesquisa, objetivando-se avaliar o efeito da aplicação foliar de B e de Si, isolados ou associados em algodoeiro, cultivado sob deficiência de B. Este estudo ratificou a importância da aplicação foliar de B no algodoeiro, especialmente por favorecer aspectos fisiológicos, incrementando a produção e viabilidade de grãos de pólen suficiente para aumentar a produtividade e a qualidade da fibra. Os resultados indicaram que o algodoeiro na fase reprodutiva é sensível a deficiência de boro e que é possível melhorar a eficácia da aplicação foliar de B na cultura com adição de Si na calda ao incrementar a eficiência de uso do B da flor, a produção de grãos de pólen. O fornecimento foliar de B também é eficaz em atenuar os efeitos deletérios da deficiência do micronutriente, e a adição de Si à calda boratada incrementou a produção de prolina e de glicina-betaína e reduziu a produção de H2O2 e MDA nas folhas. A aplicação foliar de B e de Si, isolados, na fase reprodutiva do algodoeiro têm efeito semelhante nas trocas gasosas, na produtividade e na qualidade da fibra mas a aplicação da mistura B associado a Si teve efeito somatório na qualidade da produção por incrementar a resistência a ruptura e diminuindo o índice de fibras curtas do algodoeiro. Palavras-chave: Adubação boratada, elemento benéfico, estresse oxidativo, pulverização foliar, qualidade de fibra, viabilidade de grãos de pólen iv xiv BORON AND SILICON RELATIONSHIP IN COTTON PLANTS UNDER BORON DEFICIENCY ABSTRACT - It is known worldwide that boron (B) is an important nutrient during the reproductive stage of cotton plants (flowering and boll development). This implies in the exogenous supply of this element to the crop, mainly through foliar spraying. Although studies are relatively scarce in the literature, some reports indicate that silicon (Si) could increase the productivity of cotton, other studies indicate that a high Si content is usually found in cotton flower and fiber. This has led to some enquiries, whether Si could be similar to B, playing a similar role, and whether the association of these elements could increase their beneficial effects during the reproductive stage of cotton plants. To verify the interaction between B and Si, this study was carried out aiming to evaluate the positive effects of B and Si foliar applications, associated or not, in cotton plants grown under B deficiency. This study has confirmed the importance of foliar B applied to cotton plants, improving physiological aspects and increasing the production and viability of pollen grains, leading to high productivity and high-quality fiber. Our results indicate that cotton plants, during the reproductive stage, are sensitive to B deficiency, and that it is possible to improve the efficiency of B foliar applications with Si addition, favoring plant efficiency in the use of B in the flowers, increasing the production and the viability of pollen. The foliar supply of B is also efficient in attenuating the deleterious effects of this micronutrient deficiency, and the addition of Si to the borate solution increased the production of proline and glycine- betaine, and reduced the production of H2O2 and MDA in leaves. Therefore, foliar applications of B and Si, isolated, in the reproductive stage of cotton plants, both had a similar effect on gas exchange, as well as fiber productivity and quality. However, the application of B associated with Si (B+Si) had a summatory effect on fiber production and quality by increasing the resistance to rupture and decreasing the cotton short fiber index. Key words: Borated fertilization, beneficial element, oxidative stress, leaf spray, fiber quality, pollen grains productivity v 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1. Introdução O baixo teor de boro (B) é um problema comum em regiões produtoras de algodão e ocorre principalmente, em solos ácidos, com textura arenosa e com baixo teor de matéria orgânica (Atique-Ur-Rehman et al., 2020). Esta desordem nutricional causa prejuízos importantes na produção e na qualidade de fibra da cultura (Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Khan et al., 2020; Wahid et al., 2020). Para solucionar este problema, a aplicação foliar do micronutriente é pratica comum realizada pelos produtores de algodão, mas existe riscos para garantir alta eficiência pois a diferença entre a concentração adequada e a tóxica de B é pequena (Rahman et al., 2019; Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Brdar-Jokanović, 2020), sendo possível verificar fitotoxicidade desse elemento na cultura do algodão, quando aplicado, em altas concentrações (Wahid et al., 2020). Nesse cenário de desordem nutricional por deficiência ou toxicidade de B, a aplicação do elemento benéfico silício (Si) tem se evidenciado promissora em plantas algodão (Souza Junior et al., 2019). Alguns estudos indicam haver uma possível relação benéfica entre o B e o Si, pois, há respostas do algodoeiro à aplicação foliar de Si em solos com baixo teor de B, havendo incremento da produção de massa seca das plantas cultivadas em condições controladas (Souza Junior et al., 2019) e da produtividade em condição de campo (Barros et al., 2019). Em adição, o Si pode incrementar a absorção de B (Souza Junior et al., 2019), e a produção de massa seca das plantas, contribuindo para aumentar a eficiência de uso do micronutriente. O benefício agronômico do B se destaca na fase reprodutiva das plantas (Leonard et al., 2014). Durante o estádio reprodutivo, as plantas apresentam maior exigência de B, comparado ao estádio vegetativo (Prado, 2021). Isso ocorre, pois nessa fase, durante a formação dos grãos de pólen, são utilizadas pectinas para a formação da parede celular (Golaszweska e Bednarska, 1999; Aouali et al., 2001), e, em caso de deficiência de B, a rigidez da parede celular é comprometida, modificando o formato e diminuindo a viabilidade dos grãos de pólen (Nyomora et 2 al., 2000; Iwai et al., 2006); além de diminuir o transporte de fotoassimilados das folhas para flores e frutos, e promover danos à formação da flor, das sementes e dos frutos (Oosterhuis e Zhao, 2001). Na fase reprodutiva, o Si pode contribuir com a formação de pectinas presentes na estrutura da parede celular dos grãos de pólen, como observado em em Lychnis alba (Crang e May, 1974) e em algodão (Boylston et al., 1990), favorecendo a resistência física da parede celular (Kido et al., 2015), a formação da flor e a produção e viabilidade dos grãos de pólen (Polster et al., 1978). Além disso, a desordem nutricional causada pela carência ou excesso de B pode ocasionar aumento na produção das espécies reativas de oxigênio (ERO), causando danos oxidativos nas células, como observado em Beta vulgaris (Song et al., 2019) e Pisum sativum (Oliveira et al., 2020). O fornecimento adequado de B atenua os danos causados pelo estresse oxidativo, estimulando os primeiros mecanismos enzimáticos de defesa da planta (Aydin et al., 2019). Apesar de estes mecanismos serem conhecidos em plantas de algodão cultivadas sob estresse abiótico (Bharwana et al., 2013; Farooq et al., 2013; Moldes et al., 2013), os estudos relacionados ao sistema de defesa antioxidante não enzimático são escassos em plantas de algodão. No entanto, estes mecanismos de defesa das plantas devem ser considerados devido à sua importância, principalmente aqueles relacionados à ação da prolina (Hua et al., 2020) e da glicina-betaína (GB) (Ahmed et al., 2020; Sun et al., 2020). A prolina é um dos mais comuns osmólitos presentes nas plantas relacionado à tolerância a vários estresses abióticos (Gill e Tuteja, 2010) e também a neutralização de 1O2 e •OH, atenuando os danos da peroxidação lipídica (Das e Roychoudhury, 2014). Semelhante à prolina, a GB possui função osmótica e antioxidante, relacionada à sua contribuição na manutenção da integridade estrutural e funcional celular, possível, devido à interação entre a GB e domínios hidrofílicos e hidrofóbicos de complexos proteicos e membranosos nas células (Sun et al., 2020). A desordem nutricional de B pode prejudicar também a produtividade e a qualidade de fibra de plantas de algodão (Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Khan et al., 2020; Wahid et al., 2020). A aplicação de Si pode mitigar estes efeitos deletérios, pois, durante o processo de formação de fibra, este elemento é 3 importante por produzir complexo com pectinas, caloses, taninos e amidos (Boylston et al., 1990), dado que, a concentração desse elemento é alta na fibra do algodão especialmente durante a sua fase de alongamento (aproximadamente do 1º ao 21º dia após a antese) (Boylston, 1988). Dessa forma, é possível indicar, de modo hipotético, que os efeitos da aplicação foliar de B e de Si, de forma isolada na fase reprodutiva do algodoeiro, têm efeitos semelhantes no desenvolvimento reprodutivo, ao incrementar a produção e a viabilidade de grãos de pólen, favorecendo a produção de massa seca e diminuindo o estresse oxidativo nas folhas de algodoeiro. Havendo esse efeito semelhante do Si e do B na planta, a mistura desses elementos, na calda, para aplicação foliar, tenha efeito somatório no desenvolvimento reprodutivo do algodoeiro, reduzindo o estresse oxidativo nas folhas e incrementando a produção e viabilidade de grãos de pólen, bem como a produtividade e a qualidade da fibra (Figura 1). Para a formulação da mistura B associado ao Si, no entanto, é conhecido que existe risco da polimerização do Si em solução aquosa, que produz polímeros do elemento, com forma química diferente da absorvida (H4SiO4) pelas plantas (H4SiO4) (Birchall, 1995; Zhuravlev, 2000). O processo de polimerização do Si em solução aquosa é afetado pelo valor do pH, pela concentração de Si na solução (Haynes, 2019) e pela presença de estabilizantes (Souza Junior et al., 2020). O uso do sorbitol promove estabilidade do Si em solução, na forma monomérica (H4SiO4), diminuindo a taxa de polimerização desse elemento benéfico, favorecendo a sua absorção, quando aplicado via foliar. Tal efeito pode ser verificado em plantas de Gossypium hirsutum (Souza Junior et al., 2019, 2020), Helianthus annus (Flores et al., 2019; Peixoto et al., 2020); Pisium sativum (Oliveira et al., 2020) e Solanum lycopersicum (Moraes et al., 2020), mas, sem adição de B na calda de pulverização. 4 Figura 1. Esquema hipotético do efeito da aplicação foliar de água (controle), de boro (B), de silício (Si) e da mistura boro + silício (B+Si) na folha (sistema enzimático e estresse oxidativo); na flor (produção e viabilidade de grãos de pólen); e na fibra (Produtividade e qualidade da fibra) de plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B. Figura criada com o BioRender.com 5 As informações sobre as concentrações adequadas de B e Si para a mistura em calda, que sejam estáveis, são incipientes, constituindo um fator preocupante, pois, as respostas das culturas dependem da forma química disponível dos elementos em solução, para garantir a absorção foliar. 2. Revisão de Literatura 2.1 A função do boro no desenvolvimento reprodutivo vegetal Durante o estádio reprodutivo, as plantas apresentam maior exigência nutricional de B, comparado ao estádio vegetativo (Prado, 2021). Isso é indicado pela alta concentração do micronutriente no pistilo e no estame, em comparação à raiz, folha, caule e flor (Dell e Huang, 1997; Rerkasem et al., 2020). A deficiência de B pode afetar vários estágios do processo reprodutivo, como a germinação do grão de pólen, o crescimento do tubo polínico e o processo de polinização (Dell e Huang, 1997). Apesar da importância da fase reprodutiva das plantas, estudos sobre os efeitos do B no desenvolvimento floral, e na viabilidade e produção de grãos de pólen em plantas de algodão são escassos. O B possui papel fundamental na formação dos grãos de pólen (O’neill et al., 2004; Voxeur e Fry 2014; Fang et al., 2019), que ocorre nas anteras, em um processo dependente da diferenciação e da interação dos microsporócitos e do “tapete” formado pelas células somáticas (Clément et al., 1998). Os microsporócitos originam os micrósporos, enquanto as células do “tapete” são importantes para maturação dos micrósporos, fornecendo materiais para a construção da parede celular do grão de pólen, composta, principalmente, por pectina, calose e esporopolenina (Clément et al., 1998). Conforme o pólen se desenvolve, a pectina é secretada das células do “tapete” para o espaço das anteras, sendo usada para construir as paredes do grão de pólen (Golaszweska e Bednarska, 1999; Aouali et al., 2001). Nesse processo, o B forma complexos boratos com diversos compostos polihidroxi, incluindo pectina e ramnogalacturonas-II (O’neill et al., 2004; Voxeur e Fry, 2014; Fang et al., 2019), e atua regulando a porosidade e a rigidez da parede imatura dos grãos de pólen em desenvolvimento (Willats et al., 2001; Iwai et al., 6 2006;). Na deficiência de B, a pectina formada com ramnogalacturonas-II, sem complexo borato, pode ser liberada das paredes do ápice dos tubos polínicos, porém sem formação de rede de polissacarídeo rígida, induzindo à má formação dos grãos de pólen (Nyomora et al., 2000; Iwai et al., 2006;). O aumento do estresse oxidativo, que pode ocorrer devido à deficiência ou toxicidade de B, também prejudica o desenvolvimento de grãos de pólen (Fu et al., 2011; Jia et al., 2017; Ren et al., 2019). Isso ocorre, quando há um desbalanço entre a produção de ERO e o sistema de defesa antioxidante presente na planta, ocasionando danos oxidativos, sendo comum em plantas cultivadas sob estresse biótico e abiótico (Foyer e Noctor, 2000). Existem estudos em plantas cultivadas sob estresse (déficit hídrico), os quais afirmam que, o aumento na esterilidade dos grãos de pólen está associado à elevação do estresse oxidativo (Fu et al., 2011). Resultados semelhantes, também foram relatados por Ren et al. (2019) e por Jia et al. (2017), ao estudarem a deterioração de grãos de pólen de diversas espécies ornamentais após armazenamento criogênico, que atua como estresse abiótico, aumentando a produção de ERO que desnaturalizam proteínas, decompõem os ácidos nucleicos e destroem a integridade de membrana celular das células que compõem o pólen, deteriorando os grãos de pólen. Os efeitos do estresse oxidativo na produção e viabilidade de grãos de pólen em plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B não são conhecidos. Contudo, em outras espécies, é relatado que o aumento do sistema de defesa antioxidante diminui as ERO, e, consequentemente, favorecem a produção e viabilidade de grãos de pólen (Fu et al., 2011; Jia et al., 2017; Ren et al., 2019). O fornecimento adequado de B atenua o estresse oxidativo, estimulando os mecanismos de respostas das plantas ao estresse (Aydin et al., 2019). A pulverização foliar de B, aplicada no início do estágio reprodutivo das plantas, é eficiente em fornecer o micronutriente para as culturas, aumentando a produção e a viabilidade de grãos de pólen, bem como a manutenção da florada e o desenvolvimento dos frutos, como observado em Malus domestica (Nyomora et al., 2000) e Olea europaea (Perica et al., 2001). Os autores atribuem o efeito benéfico 7 da aplicação foliar do B, ao importante papel do micronutriente no desenvolvimento e no crescimento do tubo polínico. O tubo polínico é formado por uma camada externa de pectocelulose e uma camada interna de calose (Cai et al., 2011). Este é formado, principalmente, por pectinas, secretadas pelo complexo de Golgi (Hasegawa et al., 1998), sendo ausente na camada calósica (Hao et al., 2013). A parede do apíce dos tubos polínicos consistem de substâncias pécticas (Kim et al., 2000) e a ramnogalacturonas-II também está presente nos tubos polínicos em crescimento (Matoh et al., 2000). O crescimento do tubo polínico é um processo dependente de citoesqueletos de actina (Guan et al., 2013; Rounds e Bezanilla, 2013; Gao et al., 2016;) que estão localizados ao longo do tubo polínico, como cabos de actina longitudinais; na região subapical como filamentos curtos e densos; e no ápice do tubo polínico, como filamentos de actina altamente dinâmicos (Cheung e Wu, 2008). A função do B no crescimento do tubo polínico está associada à estrutura dos citoesqueletos, aumentando as proteínas de actina e contribuindo para a manutenção no arranjo dos filamentos de actina na região subapical dos tubos polínicos (Fang et al., 2019). A deficiência de B causa inibição da germinação do grão de pólen e retardo do crescimento do tubo polínico (Nyomora et al., 2000; Fang et al., 2019; Sharafi e Raina, 2020), formando calosidades nas pontas do tubo polínico, o que ocasiona enrijecimento, com consequente diminuição do crescimento dos tubos polínicos, como observado em Lilium longiflorum (Li et al., 1996) e em Picea meveri (Wang et al., 2003). Além disto, a deficiência de B, também promove alterações na morfologia do tubo polínico (Dickinson, 1978; Polster et al., 1978; Fang et al., 2019), contribuindo para diminuição na fecundação das flores. O crescimento do tubo polínico é processo fundamental para que ocorra a fertilização. Para a fertilização da flor, o tubo polínico cresce e penetra, a partir do tecido transmissor do estilete, no óvulo presente no ovário (Sharafi e Raina, 2020). Posteriormente, inicia-se a formação de frutos, sendo um dos estágios mais críticos no ciclo de vida de uma planta com flor (Raina e Kaul, 2019). 8 2.2 A relação boro e silício no desenvolvimento reprodutivo das plantas Em estudo clássico sobre a relação B e Si no desenvolvimento floral em Lilium longiflorum (Thunb), Polster et al., (1978) inferiram que o Si possui ação sinérgica ao B, estimulando a produção e a germinação dos grãos de pólen. Estudos em Gerbera jamesonii (Savvas et al., 2002; Kamenidou et al., 2010); em Rosa damascena (Farahani et al., 2020); em Solanum lycopersicum (Miyake e Takahashi, 1978) e em Triticun spp. (Maghsoudi et al., 2015) evidenciaram a importância do Si para o desenvolvimento reprodutivo, incrementando a viabilidade e a germinação dos grãos de pólen, assim como o crescimento do tubo polínico. No entanto, nesses trabalhos, os mecanismos biológicos do Si não estão bem claros, e o papel do Si para o desenvolvimento de flores e para a produção e viabilidade de grãos de pólen em plantas de algodão permanece desconhecido. O fornecimento de Si via foliar favorece o crescimento floral, incrementando o diâmetro e a altura de flores de Zinnia elegans e Gerbera jamesonii (Kamenidou et al., 2010). Após absorvido pela planta, o elemento pode se ligar a compostos orgânicos (Neu et al., 2017; Klotzbücher et al., 2018; Mantovani et al., 2018; Frazão et al., 2020) especialmente componentes da parede celular, como a hemicelulose (He et al., 2015). Este efeito do Si pode gerar estratégia de “energia a baixo custo”, pois a sua ligação com compostos orgânicos da parede celular teria baixo custo energético para a planta, e com isso a planta pouparia energia, ao diminuir a necessidade da síntese de compostos estruturais como lignina, que tem alta demanda de energia para sua síntese (Raven, 1983; Neu et al., 2001). Deste modo, o elemento benéfico favorece o crescimento floral por incrementar a eficiência de uso do boro neste órgão, ao favorecer o metabolismo vegetal, especialmente os processos ligados à parede celular. Nas estruturas reprodutivas, o Si pode contribuir com o B em sua função estrutural, pois esse elemento benéfico é destacado como um dos componentes elementares presentes na estrutura da parede dos grãos de pólen (Crang e May, 1974). Durante o metabolismo do Si, pode ocorrer a formação de complexos com pectinas, caloses, taninos e amidos (Boylston et al., 1990), que são compostos utilizados para a formação da parede dos grãos de pólen (Golaszweska e 9 Bednarska, 1999; Aouali et al., 2001). Em adição, pode ocorrer a formação de ligações mistas de Si com (1;3,1;4)-β-D-glucano, aumentando a resistência física da parede celular dos grãos de pólen (Kido et al., 2015), que, em caso de deficiência de B, tem sua rigidez comprometida (Nyomora et al., 2000; Iwai et al., 2006). O Si também pode contribuir com o B para o crescimento do tubo polínico. A função direta do Si no crescimento do tubo polínico é pouco relatada na literatura. Contudo, há indícios de que, durante o desenvolvimento da parede celular do tubo polínico, o Si fica preso nos poros da matriz dessa parede, em um processo de auto condensação (Leroux et al., 2013). Nesse processo, o Si reage com grupos hidroxilas na parede celular e aumenta a sua plasticidade, facilitando a expansão celular (Boylston et al., 1990), como observado durante o alongamento de células foliares de arroz (Hossain et al., 2002, 2007) e em fibras de algodão (Boylston et al., 1990). 2.3 A função do boro e do silício no sistema antioxidante em plantas de algodão A toxicidade de B ocasiona aumento das ERO, provocando danos oxidativos nas células de plantas de algodão (Hua et al., 2020). Durante a redução de O2 para H2O no processo fotossintético pode haver transferência de energia para o O2, formando o oxigênio singlet (1O2), que possui alta reatividade comparado ao O2. Pode, ainda, ocorrer a transferência de um, dois ou três elétrons para O2 e formar as ERO, superóxido (O2 •), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (•OH), respectivamente, que podem ocasionar danos, devido à peroxidação lipídica (Gratão et al., 2005). Os principais mecanismos de eliminação de ERO das plantas incluem enzimas, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a ascorbato peroxidase (APX) e a glutationa peroxidase (GPX). A SOD atua na dismutase do O2 • em H2O2 enquanto a CAT, a APX e a GPX na desintoxicação de H2O2 transformando-o em H2O (Gratâo et al., 2005; Hua et al., 2020). O fornecimento adequado de B atenua estresses oxidativos, estimulando os primeiros mecanismos de respostas ao estresse, favorecendo a ativação de 10 enzimas como a APX e a GPX (Aydin et al., 2019). A deficiência do micronutriente, no entanto, reduz o sistema antioxidante, por diminuir as vias metabólicas para a biossíntese destas enzimas (Cakmak e Römheld, 1997; Brown et al., 2002). O papel do Si no sistema antioxidante enzimático nas folhas é bastante relatado na literatura em plantas de algodão cultivadas sob estresses abióticos (Bharwana et al., 2013; Farooq et al., 2013; Moldes et al., 2013). O fornecimento de Si em plantas cultivadas sob estresse diminui os danos oxidativos, por diminuir o conteúdo de H2O2, a peroxidação lipídica e o extravasamento de eletrólitos (Moldes et al., 2013). Por extensão, o elemento benéfico possui importante função na modulação de enzimas antioxidantes, havendo aumento na transcrição de genes envolvidos como resposta de defesa das plantas em diversas espécies (Liang et al., 2007; Khandekar e Leinzer, 2011; Moldes et al., 2013). A função do B e do Si no sistema antioxidante enzimático nas folhas é bastante explorada e discutida na literatura. Apesar disso, o sistema antioxidante não enzimático deve ser considerado, sendo ausentes estudos com este foco em plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B. Em revisão sobre toxicidade de B, Hua et al. (2020) indicaram que o processo antioxidante não enzimático é meritório para regular a neutralização de ERO nas células das plantas. Dentre os compostos enzimáticos antioxidantes, os autores destacam a prolina e a glicina- betaína (GB). A prolina é um dos mais comuns osmólitos presentes nas plantas relacionado à tolerância a vários estresses abióticos (Gill e Tuteja, 2010) e também a neutralização de 1O2 e •OH, atenuando os danos da peroxidação lipídica (Das e Roychoudhury, 2014). Semelhante à prolina, a GB possui função osmótica e antioxidante, relacionada à sua contribuição na manutenção da integridade estrutural e funcional celular, possível, devido à interação entre a GB e domínios hidrofílicos e hidrofóbicos de complexos proteicos e membranosos nas células (Sun et al., 2020). O fornecimento adequado de B contribui para manutenção da integridade da membrana celular, diminuindo o extravasamento de eletrólitos em plantas de algodão (Ahmed et al., 2014). Estudo clássico evidencia a relevância do B na função estrutural e na funcionalidade das biomembranas, principalmente, da membrana plasmática (Cakmak e Römheld, 1997) devido à sua capacidade de 11 formar complexos boratos, com diferentes compostos polihidroxi, incluindo pectina, glicosilinositol, fosforilceramidas e ramnogalacturonas (O’neill et al., 2004; Voxeur e Fry, 2014). O fornecimento de Si para as plantas, também, contribui para aumentar a integridade física da membrana, rareando o extravasamento de eletrólitos ocasionados pela peroxidação lipídica, pois, após absorvido, o elemento benéfico se deposita na forma de opala nos espaços extracelulares e na parede celular, podendo aumentar a resistência das células (Zargar et al., 2019). Estudos evidenciam a eficiência da aplicação de Si e B, isolados (Aydin et al., 2019; Farooq et al., 2019; Oliveira et al., 2020) ou associados (CHEN et al., 2019), como agentes mitigadores do estresse oxidativo em diversas espécies cultivadas sob estresse abiótico, porém, o efeito da aplicação foliar de B e Si, isolados ou associados, no estresse oxidativo e no sistema antioxidante não enzimático em plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B, permanece desconhecido. 2.4 A função do boro e do silício na produtividade e na qualidade de fibras do algodoeiro A deficiência de B reduz a produtividade e a qualidade da fibra do algodoeiro, sendo problema comum em regiões produtoras desta cultura, especialmente, em solos ácidos, textura arenosa e com baixo teor de matéria orgânica (Ahmed et al., 2020; Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Wahid et al., 2020). A função do B na produção de fibra de algodoeiro pode ser relacionada ao importante papel do micronutriente na reprodução das plantas, onde sua deficiência promove danos à formação da flor, germinação de grãos de pólen e até na formação de sementes e de frutos, como relatado anteriormente. Em adição, a desordem nutricional por deficiência de B deforma os feixes vasculares do xilema, reduzindo o transporte de água e de nutrientes pelo floema (Li et al., 2017), diminuindo a redistribuição de fotoassimilados das folhas para os frutos, em plantas de algodão (Oosterhuis e Zhao, 2001; Zhao e Oosterhuis, 2003), com consequente acúmulo de amido nas folhas. O excesso de amido acumulado destrói, fisicamente, a estrutura dos cloroplastos (Cave et al., 1981) e o acúmulo de hexoses pode 12 suprimir as expressões gênicas que codificam enzimas fotossintéticas, reduzindo a taxa de fotossíntese (Jeannette et al., 2000; Moore et al., 2003; Han et al., 2008), com consequente diminuição da produtividade. Outro prejuízo advindo da deficiência de B no algodoeiro seria na qualidade da produção, pois, esse micronutriente participa da biossíntese de lignina, pectina, celulose e hemicelulose presentes na fibra (O’neill et al., 2004) e, consequentemente, sua falta diminui a resistência à ruptura, o comprimento e a fineza das fibras e aumenta o índice de fibras curtas (Atique-Ur-Rehman et al., 2020) depreciando a qualidade da fibra. Descobertas recentes indicaram que a aplicação foliar de Si em algodoeiro deficiente em B incrementa a produção de massa seca das plantas de algodão cultivadas em condição controlada (Souza Junior et al., 2019, 2020) e a sua produtividade em condição de campo (Barros et al., 2019). O Si, semelhante ao B, contribui para manutenção dos feixes vasculares das plantas e fluxo contínuo de água e nutriente pelos vasos do xilema (Javaid et al., 2019). Após absorvido, o Si é depositado nas células da epiderme na forma de uma camada dupla Si-Cutícula- Si (Kim et al., 2002), nas células guardas (Vandegeer et al., 2020), ou em células especializadas em armazenar Si, como os fitólitos (Kumar et al., 2017, 2019). Em adição, o Si compõe as pectinas, as caloses e os taninos, os quais também conferem maior resistência física celular (Schwarz, 1973; Waterkeyn, 1981; Boylston et al., 1990). Durante a fase de alongamento da fibra de algodão, a concentração de Si é alta nas fibras (Boylston, 1988), evidenciando a importância desse elemento benéfico na formação da fibra (Boylston et al., 1990). Por conseguinte, é possível que, a aplicação foliar de Si na fase reprodutiva da cultura tenha acréscimo da concentração de Si na fibra e possa afetar sua formação e favorecer os seus atributos qualitativos, mas, esses efeitos, ainda são desconhecidos. A melhoria das características tecnológicas da fibra de algodão, como o índice de fibras curtas, comprimento, resistência à ruptura e micronaire tem implicação agroeconômica importante, pois, determinam a qualidade do produto e seu valor no mercado. 13 3. Referências Ahmed N, Ali MA, Hussain S, Hassan W, Ahmad F, Danish S (2020) Essential micronutrients for cotton production. In.: Ahad S, Hasanuzzaman M (Eds.) Cotton production and uses. Singapura: Springer, p. 105–117. Aouali N, Laporte P, Clément C (2001) Pectin secretion and distribution in the anther during pollen development in Lilium. Planta 213:71–79. Atique-Ur-Rehman QR, Hussain A, Sardar H, Sarwar N, Javeed HMR, Maqbool A, Hussain M (2020) Soil applied boron (B) improves growth, yield and fiber quality traits of cotton grown on calcareous saline soil. Plos One 15:e0231805. 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Para isso, realizou-se essa pesquisa objetivando-se avaliar o efeito da aplicação foliar de concentrações crescentes de B no algodoeiro para verificar se o Si adicionado à calda promove melhorias no metabolismo oxidativo. O experimento foi desenvolvido em casa de vegetação em sistema de cultivo sem solo com uso de solução nutritiva deficiente em B. Os tratamentos foram delineados em blocos inteiramente casualizados em esquema fatorial 5x2+1, sendo: cinco concentrações de B foliar (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,5 g L-1 de B), na ausência e na presença de Si (1,00 g L-1); e um tratamento controle (sem deficiência de B). Quatro aplicações foliares foram realizadas, iniciando em B1 (primeiro botão floral completamente desenvolvido) com intervalo de quatro dias. A homogeneidade da solução silicatada foi determinada a partir de duas avaliações do índice de turbidez da calda com a mistura B+Si. Três semanas após a quarta aplicação foliar da mistura B+Si, todas as folhas foram coletadas para as avaliações do teor de B, de Si, de peróxido de hidrogênio (H2O2), de malondialdeído (MDA), de prolina e de GB. A produção de massa seca da parte aérea foi mensurada e a eficiência de uso de B na parte aérea foi calculada. A adição de 1,00 g L-1 de Si à calda boratada não incrementou o índice de turbidez da calda. A aplicação foliar de B, isolado ou associado ao Si incrementou o teor foliar de B e a massa seca; e reduziu a produção de H2O2, de MDA, de prolina e de GB, quando em concentração adequada. A aplicação de B na concentração mais elevada (2,5 g L-1) ocasionou fitotoxidade, aumentando o estresse oxidativo das plantas. Por outro lado, a adição de Si à calda boratada 23 favoreceu o mecanismo de defesa antioxidante não enzimático e, consequentemente, o desenvolvimento das plantas de algodão. Palavras-chave: Estresse oxidativo. Glicina-Betaína. Prolina. 24 1. INTRODUÇÃO A aplicação foliar de boro (B) é uma prática comum realizada pelos produtores de algodão em diversas regiões do mundo devido a natural deficiência de B nos solos (Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Khan et al., 2020; Wahid et al., 2020), especialmente em regiões tropicais. No entanto, a diferença entre a concentração adequada e a toxica de B é pequena (Rahman et al., 2019; Atique-Ur-Rehman et al., 2020; Brdar-Jokanovic, 2020), sendo possível verificar efeito tóxico deste elemento na cultura do algodão, quando aplicado via foliar em altas concentrações (Wahid et al., 2020). A desordem nutricional de B, seja deficiência ou toxicidade, pode ocasionar aumento na produção das espécies reativas de oxigênio (ERO), causando danos oxidativos nas células, como observado em Beta vulgaris (Song et al., 2019), e Pisum sativum (Oliveira et al., 2020). O estresse oxidativo ocorre quando há um desbalanço entre a produção de ERO e o sistema antioxidante de defesa (enzimático e não enzimático), ocasionando os danos oxidativos (Kim et al., 2017; Fryzova et al., 2018). Entretanto este efeito da desordem nutricional de B no estresse oxidativo, em plantas de algodão, ainda permanece desconhecido. Apesar dos mecanismos antioxidantes enzimáticos serem bastante conhecidos em plantas de algodão cultivadas sob estresse (Bharwana et al., 2013; Farooq et al., 2013; Moldes et al., 2013), os estudos voltados para o sistema de defesa antioxidante não enzimático são escassos, principalmente aqueles relacionados à ação da prolina (Hua et al., 2020) e da glicina-betaína (GB) (Ahmad et al., 2020; Hamani et al., 2020; Sun et al., 2020) em plantas de algodão. Os danos oxidativos nas folhas das plantas também podem ser atenuados pelo fornecimento do elemento benéfico silício (Si), amplamente relatado em plantas de algodão cultivadas sob estresses abióticos (Bharwana et al., 2013; Farooq et al., 2013; Moldes et al., 2013). É possível que o benefício do Si em atenuar a deficiência de B se deve ao aumento do teor de clorofila e da eficiência fotossintética (Souza Júnior et al., 2019) ocasionado pela melhoria no sistema de defesa antioxidante da planta, visto em outras espécies (Liang et al., 2007; Moldes et al., 2013; Rady et al., 2019; Singh et al., 2019; Carneiro-Carvalho et al., 2020). 25 No entanto, faltam informações em plantas de algodão indicando se o Si via foliar é suficiente para atenuar a deficiência e, também, a toxicidade do boro. Nesse contexto surge uma questão importante e inédita sobre a possibilidade de ampliar a eficiência da aplicação foliar de B para atenuar os efeitos deletérios da deficiência ou da toxicidade deste nutriente a partir da inclusão do Si à calda de pulverização, embora seja necessário haver compatibilidade química destes elementos em solução. Para isso, o risco de polimerização do Si em solução aquosa deve ser considerado. É importante testar a hipótese que o incremento na concentração de B na calda, reduza o estresse oxidativo com consequente incremento no desenvolvimento de plantas de algodão. No entanto, o fornecimento de baixa ou alta concentração de B prejudica o desenvolvimento das plantas por incrementar a síntese de ERO e, consequentemente, o dano oxidativo. Com o efeito da pulverização foliar de B nas plantas de algodão, é possível que a adição de Si à calda boratada para pulverização foliar tenha efeito somatório (efeito do micronutriente e do elemento benéfico) em atenuar o estresse oxidativo e incrementar o desenvolvimento das plantas, principalmente sob concentrações sub ou supra ótimas de B (Figura 1). Neste contexto, realizou-se essa pesquisa objetivando avaliar o efeito da aplicação foliar de concentrações crescentes de B no algodoeiro para verificar se o Si adicionado à calda promove ganhos para a correção da deficiência e da toxicidade do micronutriente por diminuir o estresse oxidativo a partir da síntese de prolina e de GB, aumentando a produção de massa seca da planta. 26 Figura 1. Esquema hipotético do efeito da adição de Si à calda boratada aplicado via foliar em plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B no estresse oxidativo e na produção de prolina, glicina-betaína e de massa seca das folhas. Figura criada com o BioRender.com 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Condições de crescimento O experimento com algodão (Cultivar 954 GLT) foi desenvolvido no período de janeiro a maio de 2019, em casa de vegetação da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Jaboticabal, Brasil, cultivado em sistema de cultivo sem solo. A umidade relativa do ar (78,4 ± 4,4%), temperatura máxima (35,1 ± 6,3°C) e a temperatura mínima (22,0 ± 3,2°C) foram registradas com termo-higrômetro no interior da casa de vegetação durante o período experimental (Figura 2). 27 Figura 2. Temperatura máxima (T Max) e mínima (T Min) e umidade relativa do ar (URA) no interior da casa de vegetação durante o período experimental. As sementes de algodão foram semeadas em bandejas, contendo areia, previamente lavada com água e solução HCL (0,3 M). Após a germinação, quatro plântulas foram transplantadas para vaso plástico com capacidade de 7 dm³ (diâmetro superior: 16 cm; diâmetro inferior: 11 cm; altura: 33 cm) preenchidos com 6 dm³ de areia. Foi realizado desbaste com as plantas em estádio vegetativo F2 (duas folhas completamente desenvolvidas), mantendo uma planta por vaso que constituiu a unidade experimental. Com as plantas em estádio vegetativo F4 (quatro folhas completamente desenvolvidas), iniciou-se a aplicação de solução nutritiva completa (Hoagland e Arnon, 1950) com modificações referentes à fonte de ferro, a qual utilizou a Fe- EDDHMA; e redução apenas na concentração de B de 46,2 para 33,7 µmol L-1, de modo a ocasionar deficiência moderada do micronutriente para plantas de algodão cultivadas em sistema de cultivo sem solo (Souza Junior et al., 2019). A solução nutritiva foi mantida em valor pH entre 5,5 e 6,5, ajustado com uso de solução NaOH (1 M) ou HCl (1 M). Inicialmente, a solução nutritiva foi aplicada, por um período de sete dias, a 20% da concentração indicada por Hoagland e Arnon (1950). Após este período, a Janeiro Fevereiro Março Abril Maio T e m p e ra tu ra ( °C ) 15 20 25 30 35 40 45 U m id a d e re la tiv a d o a r (% ) 45 55 65 75 85 T Max T Min URA 28 concentração da solução foi incrementada para 40% por uma semana e, transcorrido então, para 60%, a qual foi mantida até o final do período experimental. A drenagem do substrato para eliminação do excesso de sais foi realizada uma vez por semana. Para isso, foi adicionado ao substrato 700 mL de água deionizada a cada vaso, induzindo a drenagem da solução nutritiva, a qual foi descartada. Após 2 h, nova solução nutritiva foi aplicada para as plantas durante o período experimental. 2.2 Delineamento experimental e tratamentos O experimento foi delineado em blocos inteiramente casualizados em esquema fatorial 5x2+1 com quatro repetições. Os tratamentos foram: cinco concentrações de B via foliar (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,5 g L-1 de B), na ausência e na presença de Si (1,00 g L-1) em plantas cultivadas sob deficiência de B (33,7 µmol L-1; e um tratamento controle sem deficiência do micronutriente aplicando-se 46,2 µmol L-1 de B na solução nutritiva durante todo período experimental. As concentrações de B na calda foram proporcionais a 0%; 33%; 66%; 100% e 166% da concentração recomendada por Görmus (2005), onde o autor indica a aplicação de 1,5 g L-1 de B via foliar para o algodoeiro. A concentração de Si a ser misturada com B, por sua vez, foi definida a partir da avaliação visual da calda para evitar usá-la com indício de polimerização, mensurada a partir do índice de turbidez. 2.3 Índice de turbidez da calda B associada a Si Para o preparo da calda, o ácido bórico (B: 175 g kg-1; densidade: 1,43 g cm- 3; solubilidade em água a 20°C: 47,2 g L-1) foi utilizado como fonte de boro, sendo o valor pH da calda boratada ajustado para 9,0 com uso da solução NaOH (1M). Como fonte de Si foi utilizado o silicato de potássio estabilizado com sorbitol (SiKE; Si: 115 g L-1; K2O: 113,85 g L-1; sorbitol: 100 mL L-1; pH:12,0). Foi também preparado calda potássica com 47 mg L-1 de K, na forma de KCl, para equilibrar o macronutriente entre os tratamentos. 29 Duas avaliações do índice de turbidez de calda da mistura B+Si foram realizadas para determinar a homogeneidade da solução silicatada, pois o aumento deste valor na solução seria indicativo do avanço da polimerização do Si. Para este teste, a concentração de B da solução teve valor fixo igual a 2,5 g L-1, sendo a maior concentração do micronutriente estudada neste experimento. A avaliação I consistiu em adicionar à solução boratada (2,5 g L-1) o silício em concentrações iguais a 1,00; 1,25 e 1,50 g L-1 de Si; a avaliação II foi utilizada a mistura B (2,5 g L- 1) com intervalos menores entre as concentrações de Si, iguais a 1,00; 1,05; 1,10; 1,15; 1,20 e 1,25 g L-1 de Si para aumentar a precisão da concentração do elemento benéfico na calda para uso na pulverização foliar. Em ambas as avaliações, foram utilizados SiKE como fonte de Si e H3BO3 como fonte de B para compor a solução com volume final de 50 mL, pH ajustado em 9,05 ± 0,02 com solução de HCl (1 M) ou NaOH (1 M) à temperatura de 20°C, e em três repetições. Após preparo da calda, o índice de turbidez foi mensurado com uso do aparelho turbdímetro microprocessado Tecnopon® (modelo TB1000) aos 0; 30; 60; 90; 120; 180; 240; 300 e 360 minutos, sendo também realizado registros fotográficos nesse período. Para os registros fotográficos, uma câmera com 64 MP resolução 9238 x 6928 pixels foi utilizada. Os béqueres com as soluções foram acondicionados em bancada forrada com tecido de algodão na cor preta, sendo então fotografados. As imagens foram ajustadas com auxílio do Adobe Photoshop® para melhorar o contraste com o fundo preto sem alteração na coloração da solução. A calda a ser utilizada foi preparada com os diferentes tratamentos e imediatamente aplicadas às plantas com pulverizador manual, visando à cobertura de todas as folhas da parte aérea. O volume de calda aplicado foi de 5,0 mL de solução por vaso. As pulverizações foram realizadas no período da manhã entre 7 e 8 h iniciando-se nas plantas de algodão com estádio reprodutivo B1 (primeiro botão floral completamente desenvolvido) sendo realizadas quatro aplicações foliares com intervalo de quatro dias. A temperatura e umidade relativa do ar foram observadas com o uso de termo-higrômetro durante as pulverizações foliares estando a temperatura entre 20 e 23°C e a umidade relativa do ar acima de 85%; sendo favoráveis para aplicação foliar (Prado, 2021). 30 Durante as aplicações foliares, a superfície do substrato foi coberta com algodão para evitar escorrimento da solução pulverizada para o substrato, de modo a garantir que a absorção dos elementos fosse totalmente via foliar. 2.4 Coleta da parte aérea Três semanas após a quarta aplicação foliar da mistura B+Si, todas as folhas foram coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, sendo posteriormente armazenadas em freezer a -80°C para avaliação do estresse oxidativo. O restante da parte aérea (galhos e caule) foi coletado, lavado com água, solução detergente (0,1%), solução HCl (0,1 %) e água deionizada e então armazenado em estufa de circulação forçada de ar a 65 ± 5°C até obtenção de massa constante. Posteriormente os galhos e caules foram pesados, moídos em moinho tipo Wiley e então armazenados para em seguida realizar as avaliações. 2.5 Avaliações do estresse oxidativo, prolina e glicina-betaína Para avaliação do estresse oxidativo, a produção de malondialdeído (MDA) e de peróxido de hidrogênio (H2O2) foram determinadas. Inicialmente foram pesadas 0,4 grama de material vegetal congelado, armazenado a -80°C, e moídos com 20% (m/v) de polivililpirolidona e 0,1% de ácido tricloroacético (TCA). O material foi centrifugado a 11.000 rotações por minuto e 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi separado em tubos eppendorff contendo solução TCA a 20% e ácido triobarbutirico (TBA) a 5%. As amostras foram incubadas em banho maria por 30 minutos a 95°C, e, após este período, transferidas para banho em gelo por 10 minutos, para parar as reações, e então novamente centrifugadas a 11.000 rotações por minutos e 4°C por 10 minutos. Posteriormente foram realizadas as leituras das amostras em espectrofotômetro nos comprimentos de onda entre 535 e 600 nanômetros e o cálculo do MDA usando o coeficiente de extinção de 1,55 10-5 mol-1 cm-1 (Gratão et al., 2012). 31 O conteúdo de H2O2 foi determinado a partir da homogeneização dos tecidos vegetais moídos e congelados com TBA a 0,1% seguido por centrifugação a 11.000 rotações por minuto e 4°C por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubos eppendorff contendo solução tampão (pH 7,5) e iodeto de potássio, sendo então incubados por uma hora em recipiente com gelo. Após este período foi realizado leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 390 nm, conforme metodologia descrita por Alexieva et al. (2001). O teor de prolina foi determinado segundo método de Bates et al. (1973). O material vegetal foi descongelado à temperatura ambiente e 0,5 g de massa fresca foi previamente macerados em nitrogênio líquido, e posteriormente em 2 mL de ácido sulfossalicílico, com adição de mais 8 mL do mesmo reagente. O material macerado foi duplamente filtrado a partir de um funil de vidro com papel de filtro. Após a filtragem, foram pipetados em um tubo de ensaio de vidro de 1 mL de ácido acético glacial, 1 mL de ácido nihidrina e 1 mL do extrato vegetal. Os tubos foram então agitados e dispostos em banho-maria a 100°C por 1 hora e, após banho- maria, colocados em gelo para cessar a reação sendo adicionado a eles 2 mL de tolueno com posterior agitação de 20 segundos. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 520 nm, adicionando-se 0,5 mL do sobrenadante em uma cubeta de quartzo. A determinação do teor de glicina-betaína foi realizada de acordo com a metodologia de Grieve e Grattan (1983). Para tanto, 1 g de material vegetal congelado foi acondicionada em sacos de papel e levadas para secagem em estufa de circulação forçada de ar a 80ºC durante quatro dias, sendo posteriormente maceradas em cadinho de forma manual. Foram preparados extratos com adição de 5 mL de água deionizada para 0,125 g de material moído, os quais permaneceram sob agitação por 24 horas a 25 ºC. Os extratos foram misturados na proporção de 1:1 com H2SO4 (2 M), sendo em seguida mantidos em recipiente com gelo por 1 hora. Após isso, foi adicionado 0,1 mL de KI-I2 aos tubos, que foram então agitados e mantidos a 4º C durante 16 horas. A solução de KI-I2 foi preparada previamente através da diluição de 15,7g de iodo e 20g de K em 100 ml de água destilada. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 3500 rotações por minuto por 15 minutos à 0ºC. O sobrenadante foi descartado, permanecendo cristais de 32 periodato no tubo, os quais foram dissolvidos em 4,5 mL de 1,2-dicloroetano. 2 horas e 30 minutos depois foi realizada a leitura da absorbância no comprimento de onda de 365 nm no espectrofotômetro Beckman DU 640 e calculado o teor de glicina-betaína. 2.6 Análise nutricional de B, acúmulo de Si e produção de massa seca da parte aérea Após análise de estresse oxidativo e compostos antioxidantes não enzimáticos, as folhas foram descongeladas à temperatura ambiente e então lavados com água, solução detergente neutra (0,1%), solução HCl (0,1%) e água deionizada. Após descontaminação, as folhas foram armazenadas em estufa de circulação forçada de ar a 65 ± 5°C até obtenção de massa constante e então pesadas. Posteriormente, as folhas foram maceradas em cadinho de forma manual e misturadas com as respectivas amostras moídas de parte aérea (galhos e caules), coletadas anteriormente. A massa seca da parte aérea foi composta pela massa seca das folhas restante das análises e da massa seca dos galhos e caules coletados inicialmente. Após mistura do material vegetal, o teor de B foi determinado a partir da digestão das amostras via seca, por queima em mufla a 400°C seguida por reação colorimétrica com azometina-H e determinação por leitura em espectrofotômetro colorimétrico (Bataglia et al., 1983). O teor de Si foi determinado a partir da digestão alcalina do material vegetal com H2O2 e NaOH em estufa a 90°C durante 4 h (Kraska e Breitenbeck, 2010), seguida por reação colorimétrica com molibdato de amônia em meio ácido (ácido oxálico e ácido clorídrico), sendo a determinação realizada por leitura em espectrofotômetro colorimétrico (Kondörfer et al., 2004). O acúmulo de B e de Si foi calculado como sendo o produto entre o teor de B ou Si e a massa seca da parte aérea. Também, foi calculado a eficiência de uso de B a partir da razão entre o quadrado da massa seca da parte aérea e o conteúdo de B na parte aérea, conforme descrito por Siddiqi e Glass (1981). 33 2.7 Análise estatística Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (teste F), e quando significativo, ao estudo de regressão polinomial ou crescimento exponencial. Para o estudo de polimerização foi utilizado modelo de crescimento exponencial. Modelos singulares, com um ou dois parâmetros foram testados, sendo aplicados os modelos com melhor ajuste dos dados, indicados pelo maior coeficiente de regressão a 5% pelo teste T. As demais variáveis foram submetidas ao estudo polinomial, sendo testados os modelos matemáticos lineares e quadráticos, e aplicados os modelos que obtiveram os melhores ajustes aos dados. Para tanto, como critério de escolha do modelo, foi adotada a magnitude dos coeficientes de regressão polinomial significativos a 5% de probabilidade pelo teste T. Quando significativos, os pontos máximos e mínimos foram obtidos, por meio da derivação das equações. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Sisvar® (Ferreira, 2014) e os gráficos formulados com utilização do Sigmaplot®. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Controle x Fatorial As plantas de algodão cultivadas sem deficiência de B (Controle) apresentaram maior acúmulo de B, maior produção de massa seca da parte aérea e menor eficiência de uso do B, em comparação às plantas do tratamento fatorial (Tabela 1). 34 Tabela 1. Análise de variância entre controle e tratamentos para acúmulo foliar de B e Si, peróxido de hidrogênio (H2O2), malondialdeído (MDA), prolina, glicino-betaína, massa seca e eficiência de uso do B na parte aérea de plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B. Acúmulo Boro Silício ------------------- mg por planta ------------------- Test F 257,1** 48,3** Controle 754,1 6,9 Fatorial 376,2 14,1 CV (%) 9,47 10,6 H2O2 MDA Prolina Glicino-betaína µmol g-1 g g-1 µmol g-1 µg g-1 Test F 173,20** 198,87** 120,02** 12,59** Controle 328,36 2,03 23,33 4,54 Fatorial 484,96 3,44 61,66 5,89 CV (%) 4,17 4,98 9,93 10,91 Massa seca Eficiência de uso de boro g mg g-1 Test F 78,82** 38,68** Controle 6,50 0,04 Fatorial 4,78 0,10 CV (%) 6,46 10,4 ** - significativo a 1% de probabilidade pelo teste F. Aditivamente, o acúmulo de Si, o estresse oxidativo, mensurado pela produção de H2O2 e MDA, e a indução do sistema antioxidante não enzimático prolina e de GB foram menores nas plantas do tratamento controle (Tabela 1) 3.2 Teste de turbidez da calda e acúmulo foliar de B e Si A adição de 1,00 g L-1 de Si na forma de SiKE à calda boratada (2,50 g L- 1), não incrementou o índice de turbidez da calda, com valor médio de 0,80 NDU (Figura 3a). A adição de 1,25 g L-1 de Si à calda boratada (2,50 g L-1) incrementou, exponencialmente, o índice de turbidez, atingindo 1,73 NDU aos 360 minutos, após preparo da calda (Figura 3a). O aumento da concentração de Si para 1,50 g L-1 resultou em polimerização imediata da calda, não sendo possível leitura do índice de turbidez. Portanto, notou-se que, a concentração de Si adequada na calda possa estar na faixa de 1,00 a 1,25 g L-1. 35 Figura 3. Índice de turbidez da mistura boro (2,5 g L-1) e diferentes concentrações (C) de silício (1,00 e 1,25 g L-1) (a); e boro (2,5 g L-1) e diferentes concentrações (C) de Si (1,00; 1,05; 1,10; 1,15; 1,20 e 1,25 g L-1) em função do tempo (T) após preparo da calda. Para melhorar a acurácia da concentração de Si na calda, realizou-se a segunda avaliação, indicando que, a concentração limite para adição deste elemento na forma de SiKE, à solução boratada (2,50 g L-1 de B) é de 1,00 g L-1 de Si, sem alteração no índice de turbidez com valor médio de 0,80 NDU (Figura 3b). O aumento da concentração de 1,05 a 1,25 g L-1 de Si incrementou, com ajuste exponencial, o índice de turbidez com máximo de 1,51; 1,55; 1,8; 1,69 e 1,73 NDU, após 360 minutos, para as concentrações de 1,05; 1,10; 1,15; 1,20 e 1,25 g L-1 de Si, respectivamente. Quanto à coloração da solução, a mistura 1,00 g L-1 de Si e 2,50 g L-1 de B, não apresentou mudanças visíveis durante o período avaliado (Figura 4). 36 Figura 4. Avaliação da modificação colorimétrica visual na mistura boro (2,50 g L-1) + silício (1,00; 1,25 e 1,50 g L-1) imediatamente (a) e após 360 min (b) do preparo da calda; e boro (2,50 g L-1) + silício (1,00; 1,05; 1,10; 1,15; 1,20 e 1,25 g L-1) aos 0 (c); 60 (d); 120 (e); 180 (f); 300 (g) e 360 (h) min do preparo da calda. A adição de 1,25 g L-1 de Si resultou na formação de polímeros, imediatamente, seguido do preparo da calda (Figura 4a), evoluindo para coloração turva e esbranquiçada da calda e aspecto gelatinoso, após 360 min (Figura 4b). A adição de 1,50 g L-1 de Si à calda boratada (2,50 g L-1 de B) resultou em polimerização imediata da solução boratada, formando um gel, imediatamente, após o preparo da calda (Figura 4a) e aos 360 minutos (Figura 4b). A segunda avaliação do índice de turbidez da calda, com maior número de concentrações de Si, permitiu observar que, não ocorreu modificação na coloração da calda boratada (2,50 g L-1) com a adição de Si entre 1,00 a 1,25 g L-1, com 37 exceção da formação de polímeros na concentração de 1,25 g L-1, nos primeiros 60 min, após preparo da calda (Figura 4c, d). Aos 120 minutos, depois do preparo da calda (Figura 4e), o acréscimo de 1,25 e 1,20 g L-1 de Si à calda boratada modificou a coloração da solução, apresentando aspecto esbranquiçado. Aos 180 minutos (Figura 4f), após preparo da calda, a partir da solução boratada com acréscimo de 1,25 g L-1 de Si iniciou processo de gelatinização; aos 300 minutos (Figura 4g) verificou-se aspecto gelatinoso na solução boratada, com acréscimo de 1,20 g L-1 de Si e modificação na coloração das soluções, com acréscimo de 1,15 e 1,10 g L-1 de Si. Ao final do período de avaliação visual (360 minutos) da solução boratada com acréscimo de 1,25 e 1,20 g L-1 de Si apresentaram aspecto gelatinoso espesso, as soluções com 1,15 e 1,10 g L-1 apresentaram coloração esbranquiçada e a concentração de 1,05 g L-1 de Si apresentou pequena modificação na coloração, indicando início da polimerização visível (Figura 4h). O principal problema do Si em solução é a polimerização, que tem enorme implicação prática, pois, se houver esse processo, forma-se a sílica (SiO2) insolúvel, comprometendo a absorção do elemento pelas plantas. Durante o processo de polimerização e de condensação do ácido monossilícico, são formados grupos silanol. Em seguida, a solução supersaturada do ácido é convertida em sua forma polimérica, constituindo partículas coloidais esféricas insolúveis (Zhuravlev, 2000) e a agregação dessas partículas formam cadeias longas no molde de redes, induzindo alteração visível da tonalidade da solução de translúcida para opaca ou turva (Figura 4). A avaliação do índice de turbidez possibilitou detectar a mudança da tonalidade da solução silicatada, antes da fase do visível (Figura 3). Ficou evidenciado que, mesmo na alta concentração de B (2,5 g L-1 de B) é possível sua associação com Si na concentração máxima de 1,00 g L-1, sem ocorrência importante da polimerização. A estabilidade dessa solução silicatada deve ter recebido contribuição do estabilizante sorbitol presente no produto para garantir sucesso da aplicação foliar de Si (Souza Junior et al., 2020). Isso porque, a adição de estabilizantes constituiu uma alternativa eficiente para redução do processo de polimerização da calda 38 silicatada, incrementando a absorção foliar de Si em diversas culturas (Moraes et al., 2020; Oliveira et al., 2020; Peixoto et al., 2020), inclusive em plantas de algodão (Souza Junior et al., 2019; 2020). A baixa polimerização do Si presente na calda boratada (2,50 g L-1 de B) pode ser confirmada neste trabalho pela eficiência da aplicação foliar, pois ficou claro o incremento do teor foliar do micronutriente na parte aérea (Figura 5a) e na flor (Figura 5b) e do elemento benéfico na parte aérea (Figura 5c) e na flor (Figura 5d) das plantas de algodão. Em adição, o sorbitol tem outro efeito no processo de absorção foliar de Si, pois ele diminui o ponto de deliquescência da gota depositada na superfície foliar diminuindo a velocidade de evaporação da água (Kubicki e Heaney, 2003), favorecendo absorção foliar (Prado, 2021). Figura 5. Acúmulo de boro na parte aérea (a) e na flor (b) e de silício na parte aérea (b) e na flor (c) de plantas de algodão cultivadas sob deficiência de B, em função de diferentes concentrações de boro (B) e silício (Si) aplicados via foliar. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 A c ú m u lo d e B ( m g p o r p la n ta ) 0 200 400 600 800 1000 1200 Com Si y=332,2x+37,12; F=53,8** R²=0,92 Sem Si y=338,8x-22,79; F=31,8** R²=0,95 B** Si** BxSi* 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 A c ú m u lo d e S i (m g p o r p la n ta ) 0 10 20 30 40 50 Com Si y=-8,0x²+32,7x+5,7; F=23,4** R²=0,92 Sem Si y=2,1ns Bns Si** BxSins aa a b a b a a aa Concentração de B (g L-1) a) c) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 A c ú m u lo B ( g p o r fl o r) 0 100 200 300 Com Si y=-60,2x²+230,8x+45,5; F=64,3** R²=0,96 Sem Si y=-69,5x²+256,8x+8,2; F=85,6** R²=0,94 B** Si** BxSi* a a a b a b a a a b 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 A c ú m u lo d e S i ( g p o r fl o r) 0 15 30 45 60 Com Si y=19,6+11,3x; F=10,17* R²=0,88 Sem Si y=6,00ns B** Si** BxSins b) d) 39 3.3 Estresse oxidativo, prolina e glicina-betaína nas folhas de algodoeiro A desordem nutricional boratada por deficiência (0,0 e 0,5 g L-1 de B) ou toxicidade (2,5 g L-1 de B) aumentou a produção de H2O2 (Figura 6a) e de MDA (Figura 6b). Figura 6. Produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) (a), malondialdeído (MDA) (b), prolina (c) e glicino-betaína (d) em folhas de algodão cultivadas sob deficiência de B, em função de diferentes concentrações de boro (B) e silício (Si) aplicados via foliar. O teor de H2O2 decresceu em função do aumento das concentrações de B aplicado via foliar, com ponto mínimo nas concentrações de 1,37 e 1,49 g L-1 de B na presença e na ausência de Si, respectivamente, para H2O2 (Figura 6a); e nas concentrações de 1,66 e 1,50 g L-1 de B na presença e na ausência de Si, respectivamente, para MDA (Figura 6b). A deficiência de B apresentou maior destaque na produção de H2O2 (Figura 6a) e MDA (Figura 6b), em comparação à 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 H 2 O 2 ( m o l g -1 ) 0 400 600 800 Com Si y=91,8x²-252,5x+527,9; F=26,7* R²=0,98 Sem Si y=161,0x²-480,4x+755,0; F=81,7** R²=0,99 B** Si** BxSi* a) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 M D A ( g g -1 ) 0 2 3 4 5 6 Com Si y=0,6x²-2,0x+4,1; F=16,3** R²=0,97 Sem Si y=1,1-3,3+5,3; F=5,44* R²=0,91 B** Si** BxSi* b) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 P ro li n a ( m o l g -1 ) 0 20 40 60 80 100 120 Com Si y= 34,5x²-79,0x+87,8; F=10,33** R²=0,95 Sem Si y=20,6x²-42,6x+61,7; F=5,35* R²=0,91 B** Si** BxSi** c) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,5 G li c in a -b e ta ín a ( g g -1 ) 0 5 6 7 Com Si y=0,7x²-1,4x+5,9; F=9,6* R²=0,95 Sem Si y=0,5x²-1,3x+6,4; F=15,4** R²=0,97 B** Si** BxSi** d) a a a a a a b a b b a a a a b b a b a a a a a a a a b b b b a a a aa a a b b b Concentração de B (g L-1) 40 toxicidade do micronutriente. No tratamento controle de B (0,0 g L-1 de B), foi observado produção de 539,1 e 767,3 µmol g-1 de H2O2, para presença e ausência de Si, respectivamente. Estes valores representam aumento de 15% e 38% no teor de H2O2 produzido pelas plantas cultivadas sob toxicidade de B (2,5 g L-1), as quais apresentaram valor de 467,3 e 555,4 µmol g-1, para presença e ausência de Si, respectivamente (Figura 6a). No mesmo tratamento (0,0 g L-1 de B) houve destaque, tendo alta produção de MDA iguais a 4,2 e 5,1 g g-1, representando incremento de 50 e 30%, em relação ao tratamento 2,5 g L-1 de B, o qual produziu 2,8 e 3,9 g g-1 de MDA, para presença e ausência de Si, respectivamente (Figura 6b). A produção de prolina (Figura 6c) e GB (Figura 6d) decresceu com ajuste quadrático em função do aumento na concentração de B. Os pontos mínimos, para prolina, foram observados com o fo