Édio Moscardi Júnior Presença de Salmonella spp. na cadeia produtiva da carne bovina: estudo das fontes de contaminação para novilhos criados sob confinamento experimental Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, UNESP, campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, Área de Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar. Orientador: Prof. Ass. Dr. José Paes de A. Nogueira Pinto Botucatu – SP 2005 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Moscardi Júnior, Edio. Presença de Salmonella spp. na cadeia produtiva da carne bovina: estudo das fontes de contaminação para novilhos criados sob confinamento experimental / Édio Moscardi Júnior . – Botucatu : [s.n.], 2005. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária E Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2005. Orientador: Prof. Ass. Dr. José Paes de A. Nogueira Pinto Assunto CAPES: 50502050 1. Salmonela. 2. Bovino de corte – Carcaças. 3. Confinamento (Animais). CDD 636.213 Palavras chave: Carcaça; Confinamento; Novilhos; Salmonella; Superprecoce. PARA: Édio, Vilma, Sylvia, Wegmann e Felipe minha adorável família... Pelo carinho, apoio e patrocínio na conquista de mais essa etapa. Especialmente à Médica Veterinária Salésia M. Prodócimo, minha noiva... Pelo auxílio na correção dessa dissertação... Pelo apoio técnico nas atividades desse experimento... Pelo amparo nos momentos das decisões mais difíceis... Por integrar completamente mais esse projeto de nossas vidas... Pelo imensurável carinho e amor dispensados a nossa convivência... AGRADECIMENTOS A Deus, pela oportunidade da vida. Ao Prof. José Paes de Almeida Nogueira Pinto pela possibilidade de realização desse curso de mestrado, por sua orientação, amizade, compreensão e paciência ao longo de nossos trabalhos. Ao amigo e companheiro de trabalho Ricardo I. Sakate pela comunhão nos esforços exigidos nesse projeto. Aos funcionários e amigos do Laboratório de Inspeção da UNESP - Botucatu: Silvia Helena Gotardi, Karina Basso, Karina Amaral Ferreira, Gilda Pinto do Amaral, Otávio Augusto Martins, Agnaldo Rogério Marquez, Rafael Bianchi, Carlos Eduardo Espadoto Gatin, Wanderlei Forlin, Dª Neusa Gatin e Dª Luzia Helena Maimone, por contribuírem na solução de todas as necessidades surgidas no decorrer do curso e também pela harmonia e companheirismo de todos, fazendo do ambiente de trabalho uma segunda casa para mim. Aos professores Dirceu Rodrigues Meira, Aristides Cunha Rudge, Paulo Francisco Domingues, Germano Francisco Biondi, Roberto de Oliveira Roça e Luiz Carlos de Souza pela convivência e conhecimentos adquiridos. Ao professor Mário Debene Arrigoni e aos funcionários do confinamento da FMVZ - Fazenda Lajeado: Sidnei do Império e Desidério Machado, pela colaboração na contenção dos animais durante a coleta de amostras. À Médica Veterinária e amiga Luciana Cristina de Souza Mena pela confecção desse Abstract. Ao Médico Veterinário e amigo Francisco Marcos Dias Thomazella companheiro de aula, pelos conselhos e amizade ao longo do curso. À Dra. Sueli Aparecida Fernandes do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, pela sorotipagem das cepas de Salmonella spp. Aos amigos da Casa da Agricultura de Botucatu, em especial a Alfredo Chaguri Júnior, Francisco Pereira Neto e Adolfo Egídeo de Barros Just (inestimável amigo) que indiretamente foram grandes contribuintes nessa caminhada. Às amigas da pós-graduação: Maria, Regina e Denise, sempre prontas ao esclarecimento de eventuais dúvidas sobre o curso. À FAPESP pela concessão da bolsa e apoio financeiro do projeto. A TODOS, MUITO OBRIGADO!!! “Uma longa viagem começa com um único passo” Lao-Tsé SUMARIO LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... I LISTA DE FIGURAS..................................................................................................... II RESUMO ....................................................................................................................... III ABSTRACT ................................................................................................................... IV 1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1 2. OBJETIVOS............................................................................................................... 14 3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................... 15 4. RESUTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 25 5. CONCLUSÕES...........................................................................................................41 6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 42 I LISTA DE TABELAS TABELA 1. Coleta das amostras ao longo do período de confinamento...........18 TABELA 2. Distribuição sazonal dos isolamentos de Salmonella spp..............37 II LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Protocolo de análise de Salmonella spp. nas amostras de alimentos, água, fezes, roedores, insetos, carcaças e ambientes, segundo metodologia preconizada por Andrews et al. (1998)..............................................................24 III RESUMO Sessenta novilhos com seis meses de vida foram acompanhados durante um período de confinamento com o objetivo de se determinar a prevalência de Salmonella spp. durante a fase de engorda e também na etapa de abate. Os trabalhos foram desenvolvidos na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu, SP. Durante os seis meses de confinamento foram analisadas: 15 amostras das instalações pré-chegada dos lotes, 1 amostra de insetos, 1 amostra de conteúdo intestinal de um roedor, 10 de fezes de conjunto obtidas 24 h após a chegada de cada grupo animal, 83 de alimentos e água de dessedentação, 322 de fezes individuais coletadas da ampola retal de cada novilho, 60 amostras de carcaças obtidas na indústria frigorífica após o abate e 30 amostras do ambiente frigorífico (paredes, instalações, instrumentais). Isolou-se Salmonella spp. de amostras de dois alimentos (caroço de algodão e concentrado – 2/83, 2,4%), de amostras de fezes individuais de quatro animais (4/232, 1,3%) e de duas carcaças (2/60, 2,33%). Foram identificados dois sorotipos: Salmonella Mbandaka (caroço de algodão) e Salmonella Tennessee (concentrado, fezes individuais e carcaças). Conclui-se que a prevalência do patógeno durante o confinamento bem como nas carcaças abatidas foi baixa, sendo que o encontro de Salmonella em alguns constituintes da ração pode ter se refletido no aparecimento de carcaças contaminadas, por falhas ocorridas durante as operações de abate. IV ABSTRACT Sixty steers six months old were monitored during a period of feedlot to determine the prevalence of Salmonella spp. during the fattening phases and slaughtering stage. The activities were developed in the Veterinary Medicine and Zootecnist College, UNESP, at Botucatu, SP. During the ten months of feedlot were analyzed: 15 samples of the facilities before the animal loots arrive, 1 sample of the insects, 1 sample of mice intestinal contents, 10 samples of steers mixed feces obtained 24 h after the arrival of each animal group, 83 of feed and drinkable water, 322 of individual feces collected from rectum flask of each steer, 60 samples from bovine carcasses and 30 samples of environment obtained from slaughterhouse (walls, facilities and instrumentals). Salmonella spp. were identified in two samples of feed (cotton seed, protein and mineral mix , 2/83 = 2,4%), samples of individual feces from four animals (4/322 = 1,3%) and from two carcasses (2/60 = 2,33%). Two serotypes were identified: Salmonella Mbandaka (cotton seed) and Salmonella Tennessee (protein and mineral mix, individual feces and carcasses). It follows that the prevalence of the pathogen during the feedlot and in the slaughtered carcasses was low, while the isolation of Salmonella in some ingredients may have influenced the occurrence of contaminated carcasses because of faults occurred during slaughter procedures. Introdução 1 1. INTRODUÇÃO O setor de produção de alimentos vive um desafio nesse início de século 21: produzi-los em quantidade suficiente para suprir a demanda mundial, certificando-se que os mesmos sejam seguros, isto é, inócuos para o consumidor. Em 1999 a população mundial ultrapassou a marca de 6 bilhões de habitantes, sendo que destes calcula-se que 2 bilhões sejam mal nutridos e 840 milhões estejam passando fome. A menos que sejam tomadas medidas para corrigir e adequar os sistemas de produção e distribuição de alimentos, esse quadro tende a se agravar, já que estima-se que a demanda por produtos de origem animal, por exemplo, triplique ou até mesmo quadruplique nos próximos 30 anos (D’SILVA, 2000). No entanto, esse cenário poderia ainda ser pior, se a produção de alimentos não houvesse aumentado nos últimos anos. Nos países em desenvolvimento, por exemplo, nas últimas duas décadas observou-se um aumento de 127% na produção de carne e 331% na de ovos. Mesmo assim, somente 22% da proteína da dieta é de origem animal, enquanto que nos países desenvolvidos esse valor é de 60% (FRESCO & STEINFELD, 1997 apud D’SILVA, 2000). Portanto, fica patente a necessidade de aumentar essa cifra, especialmente nos países em desenvolvimento. A introdução de sistemas intensivos de criação animal tem sido apontada como uma alternativa para aumentar a produção de proteína animal. Nos países desenvolvidos tais sistemas já predominam e sua implantação vem Introdução 2 se dando rapidamente naqueles em desenvolvimento, especialmente na Índia e China (D’SILVA, 2000). Estes sistemas, no entanto, possuem alguns inconvenientes, especialmente no que se refere à poluição do ambiente e à disseminação de bactérias patogênicas nos animais confinados, os quais, embora na maioria das vezes não manifestem qualquer sintomatologia clínica, passam a albergar o agente, que pode vir a contaminar as carcaças durante as operações de abate. A criação intensiva de animais tem sido inclusive apontada como uma das causas do aumento da incidência no número de casos de enfermidades transmitidas por alimentos, as chamadas ETA’s (MOTARJEMI & KÄFERSTEIN, 1999). Mesmo com tais inconvenientes, a Food and Agriculture Organisation of the United Nations (FAO) tem estimulado a sua implantação, considerando-a inclusive, uma medida inevitável (FRESCO & STEINFELD, 1997 apud D’SILVA,2000). No Brasil, sistemas de criação intensiva já são amplamente empregados para suínos e aves. No caso dos bovinos de corte, ao contrário, a sua produção é feita basicamente de maneira extensiva. Segundo dados da Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ), dos 33 milhões de cabeças abatidas anualmente em nosso país, somente 1,5 milhão provém de animais confinados (ABCZ, 2001). Na criação extensiva em nosso país, mesmo com a intensa seleção a que foi submetido parte do rebanho zebuíno brasileiro, o abate dos animais sempre é tardio, nunca ocorrendo antes dos 24 meses de idade (ARRIGONI, 2001). Para buscar alternativas a esse modelo, é que foi idealizado e implantado pelo Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal da Introdução 3 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Unesp, campus de Botucatu, o projeto de produção do Novilho Superprecoce. O novilho superprecoce é resultante da associação do potencial genético das linhagens ou dos produtos de cruzamento com a manipulação de fatores ambientais, notadamente a alimentação, para se conseguir a melhoria do desempenho animal (ARRIGONI, 2001). Novilhos superprecoces, portanto, são animais que imediatamente após o desmame, serão terminados em regime de confinamento e abatidos antes dos 15 meses de idade, eliminando-se com isso a recria dos mesmos, que no sistema extensivo dura cerca de 37 meses (ARRIGONI,2001; FILGUEIRAS,2000). Deve-se salientar que os novilhos superprecoces atingem 450Kg, peso de abate, sem a utilização de qualquer tipo de promotor de crescimento. A exemplo de outros sistemas de confinamento, a criação do novilho superprecoce também pode favorecer a disseminação de bactérias patogênicas entre os animais do rebanho estabulado, sendo que no Brasil nenhum estudo nesse sentido já foi realizado. É importante enfatizar que para obtenção de um alimento seguro, os cuidados devem ter início na fase primária de produção. Dentro deste contexto, o sistema de Análise de Perigos e Controle de Pontos Críticos (sistema HACCP) apresenta-se como uma alternativa a ser empregada já na produção primária, pois tem como fundamento a prevenção dos perigos químicos, físicos e biológicos. Nos países desenvolvidos já há uma mentalidade voltada para sua adaptação e implantação nas fazendas através de programas do tipo “from farm to fork”, que numa tradução livre seria a produção de alimentos seguros envolvendo todas Introdução 4 as etapas de produção, isto é, “da fazenda ao garfo do consumidor” (CULLOR, 1995; JOHNSTON, 2000). Esse tipo de abordagem começa a ser, também, manifestada em nosso país (SAKATE et al., 1999). Com o sucesso do empreendimento de Botucatu, onde 12.000 animais já foram engordados e abatidos e com o crescente interesse em sua implantação por parte de produtores de bovinos de corte, torna-se importante desenvolver um trabalho que estude a ocorrência e a disseminação nos animais confinados e posteriormente nas carcaças abatidas, de algumas bactérias de destaque na etiologia das ETA’s. Para tanto, entre elas, Salmonella spp. foi escolhida, dada a sua importância como agente etiológico dessas enfermidades. Salmonella spp. As bactérias desse gênero, isoladas e identificadas a partir do final do século XIX, continuam a desempenhar um papel importante como agentes etiológicos de enfermidades tanto em animais como no homem (D’AOUST et al., 2001). Constituído por mais de 2500 sorotipos, o gênero é responsável por perdas econômicas consideráveis nos plantéis animais e, no homem, é considerado um dos principais agentes etiológicos das enfermidades transmitidas por alimentos – ETA’s (EKPERIFIN, NAGARAJA, 1998; D’AOUST et al., 2001; POPOFF et al., 2004) Mais de 95% das salmoneloses humanas são de origem alimentar e, entre os alimentos envolvidos na transmissão do agente ao homem, os de origem animal possuem um papel de destaque (JACKSON et al., 1991). A existência de muitas espécies animais que podem atuar como reservatórios da Introdução 5 bactéria, a inespecificidade da grande maioria dos sorotipos, o que permite a sua disseminação entre as diversas espécies e os sistemas intensivos de criação cada vez mais empregados no caso de animais de importância econômica, são alguns dos fatores que podem explicar essa participação importante dos alimentos de origem animal na epidemiologia dos surtos de ETA’s causados por Salmonella spp. (D’AOUST et al., 2001). A compreensão de que os patógenos alimentares estão disseminados dentro das unidades primárias de produção dos alimentos é o primeiro passo para se buscar o controle e a redução dos riscos a que está exposta à saúde pública (DAVIS et al., 2003). Vários são os microrganismos causadores de enfermidades transmitidas por alimentos e sua origem nas unidades de produção animal é bem conhecida. No entanto, muito pouco se sabe sobre a ecologia desses agentes, principalmente no interior de unidades de confinamento (SMITH et al., 1997; BARKOCY-GALLAGHER et al., 2002). Tais unidades, por suas características próprias de reunir animais de várias regiões em um mesmo local e provê-los de diversos tipos de alimentos, pode abrigar fontes potenciais de contaminação do rebanho com diferentes patógenos (BARHAM et al., 2002). Nos Estados Unidos, onde a criação de bovinos de corte é feita basicamente em regimes intensivos, a preocupação com a prevalência de Salmonella spp. nas unidades de confinamento tem sido uma constante. Em 1994 o Departamento de Agricultura Norte-Americano (USDA) realizou um levantamento envolvendo 100 dessas unidades, sendo que em 38 delas (38%), o agente foi isolado. Das 200 baias pesquisadas nesse estudo, 52 delas (26%) mostraram-se positivas para Salmonella sp. e, em um total de 4997 amostras Introdução 6 de fezes recolhidas nas 100 unidades de confinamento, em 273 delas (5,5%) conseguiu-se isolar o agente (FEDORKA - CRAY et al.,1998). Segundo Griffin et al. (1998), é muito difícil estimar a prevalência real de Salmonella nos rebanhos confinados, embora relate-se que a porcentagem de animais portadores assintomáticos do agente alcance valores de cerca de 8% nesse tipo de gado. Levantamentos mais recentes realizados nos Estados Unidos no entanto, apontam para valores bem mais elevados. Beach et al. (2002b), por exemplo, ao pesquisarem o patógeno em bovinos confinados encontraram uma prevalência de 22,3%, sendo que no gado criado extensivamente ela foi ainda maior, ou seja, de 31,4%.Estes dados mostram claramente que no tocante à contaminação, também não deve ser subestimada a importância assumida por animais criados de modo extensivo. O tempo de permanência dos animais em confinamento tem se mostrado um fator importante, estando associado com a positividade das amostras, já que no caso dos bovinos estabulados por um período menor de tempo, a porcentagem de amostras de fezes positivas foi de 3,5% (88/2482), enquanto que para animais estabulados por períodos maiores, ela foi de 7,4% (185/2495), diferença essa significativa (p<0,05), (FEDORKA-CRAY et al.,1998). Esses resultados contrastam com aqueles obtidos anteriormente por Frost et al. (1988) que observaram um decréscimo no número de amostras positivas para Salmonella no gado estabulado por períodos maiores que 80 dias. Para Fedorka-Cray et al. (1998) essa diferença pode ser atribuída aos diferentes sorotipos encontrados nos dois estudos, já que dos 14 identificados por Frost et al. (1988), somente três eram comuns a ambas as pesquisas. Introdução 7 O isolamento de diversos sorotipos nas várias pesquisas realizadas, bem como a participação dos mesmos como possíveis agentes etiológicos das salmoneloses em humanos, têm sido um importante ponto de discussão nos trabalhos publicados. No levantamento realizado por Fedorka-Cray et al. (1998), 26 diferentes sorotipos foram identificados, sendo os mais comuns: S. Anatun (27,9%), S. Montevideo (12,9%), S. Muenster (11,8%), S. Kentucky (8,2%) e S. Newington (4,3%). Segundo os autores, dos 10 sorotipos mais comumente associados com a doença em humanos, somente 1, S. Typhimurium, estava entre os 10 principais sorotipos presentes nas fezes dos bovinos nas unidades de confinamento. Para os autores, tais dados não devem ser tomados como indicativos de que os bovinos não são importantes na disseminação de salmonelas patogênicas a humanos. Ao contrário, para Fedorka-Cray et al. (1998) é de suma importância a continuidade do monitoramento dos diversos sorotipos nas criações animais, já que os mesmos podem vir a emergir como patógenos potenciais ao homem. É o caso, por exemplo, de Salmonella Enteritidis, sorotipo pouco implicado em doenças em animais e no homem no passado, mas que a partir da segunda metade da década de oitenta, passou a ser o principal agente das salmoneloses humanas em vários países do mundo, inclusive o Brasil (TAVECHIO et al., 1996; D’AOUST et al., 2001). Outro exemplo é o da Salmonella Typhimurium DT 104, cujo isolamento a partir de animais e humanos com quadro clínico de salmonelose tem aumentado muito nos últimos Introdução 8 anos em vários países como Inglaterra, Estados Unidos e Canadá (POPPE et al., 1998). Dargatz et al. (2000) ao analisarem fezes de conjunto de gado confinado, relataram uma maior prevalência de sorotipos do Grupo C1 (33,3%) como Salmonella Mbandaka e Salmonella Montevideo. Segundo os autores, é possível que esse sorogrupo esteja tornando-se melhor adaptado à espécie bovina ou que suas fontes de contaminação se apresentem em maior freqüência nos sistemas de confinamento. Beach et al. (2002b) trabalhando com rebanhos confinados e rebanhos criados de forma extensiva, ambos aparentemente sadios, encontraram esses mesmos sorotipos contaminando fezes, couro bovino, alimentos e o ambiente de criação dos animais. Destacaram também o isolamento de dois sorotipos em gado confinado e quatro na criação extensiva, todos despontando entre os dez mais implicados em surtos alimentares humanos. Esses dados reforçam a preocupação expressa por Fedorka-Cray et al. (1998) já que demonstram a possibilidade de uma estreita relação entre o consumo de carne bovina e a contaminação por Salmonella spp. no homem. Em termos gerais, portanto, o rebanho bovino pode carrear patógenos em suas fezes mesmo na ausência de sintomatologia clínica, o que traz a necessidade de maior atenção para as contaminações cruzadas nas linhas frigoríficas (Mc EVOY et al., 2003). O isolamento de Salmonella spp. das fezes de animais doentes tem sido documentado por vários autores. Contudo são escassas as informações sobre animais clinicamente saudáveis, fato que negligenciado no abate, etapa final de produção da carne bovina, pode ser Introdução 9 muito importante do ponto de vista de contaminação de carcaças (DARGATZ et al., 2000). Ressalta-se com isso, a importância em se monitorar animais clinicamente sadios, criados extensivamente ou sob estabulação, para que sorotipos emergentes e fontes diversas de contaminação possam ser identificados e controlados. A influência da época do ano sobre a prevalência do patógeno nos rebanhos também tem sido objeto de vários estudos. Os autores de uma maneira geral têm observado uma maior prevalência do agente durante os meses quentes do ano ou ainda, naquelas regiões mais quentes durante uma mesma estação (FEDORKA – CRAY et al., 1998; LOSINGER et al., 1997; PUYALTO et al., 1997; DONKERSGOED et al., 1999; DARGATZ et al., 2000; BACON et al., 2002; BARKOCY-GALLAGHER et al., 2003; McEVOY et al., 2003; RIVERA-BETANCOURT et al., 2004). A alimentação oferecida aos animais durante o processo de confinamento é outro ponto estudado como possível fonte de contaminação por Salmonella spp. Beach et al. (2002a, 2002b) citam que a dieta a que são submetidos os bovinos estabulados (altamente protéica e energética), em conseqüência da produção de grandes quantidades de ácidos graxos, poderia tornar o rúmen desses animais menos favorável ao desenvolvimento de Salmonella spp. devido a variações de pH intra-ruminal, fato que ocorreria em menor escala na criação extensiva. Resultados semelhantes foram encontrados por Mc Evoy et al. (2003) que verificaram melhor recuperação de Salmonella spp. das amostras de Introdução 10 conteúdo ruminal de animais submetidos à privação de alimento, havendo com isso uma menor acidificação do pH do rúmen. O isolamento de Salmonella spp. em amostras de alimentos antes do seu fornecimento aos animais é um indicativo do risco a que esse grupo está sujeito, uma vez que as quantidades amostradas são ínfimas quando comparadas aos grandes silos de estoque de alimentos (DAVIS et al., 2003). A verificação da qualidade higiênico-sanitária da ração animal é medida de controle na veiculação de patógenos, já que ela se constitui em parte integrante da cadeia alimentar, estendendo-se do sistema de produção até o consumidor (DOS SANTOS et al., 2000). Durand et al. (1990) identificaram Salmonella spp. em farinhas de origem animal (carne, ossos, carcaças, peixes e sangue) em porcentagens que variaram de 6,85% a 14,62 %.Fato semelhante foi observado no trabalho de Losinger et al. (1997) que verificaram uma associação estatisticamente significativa entre o isolamento de Salmonella spp. nas fezes e o tipo de alimento oferecido aos animais no período de sete dias antes da colheita de amostras para análise (p < 0,05). Caroço de algodão, casca de algodão e sebo bovino foram os alimentos implicados (LOSINGER et al., 1997). Tais resultados reforçam a importante participação que a alimentação, seja ela de origem animal ou vegetal, possui como fonte de infecção para os rebanhos, criados tanto intensiva como extensivamente, como já demonstrado em trabalhos anteriores (BERCHIERI et al., 1984; DURAND et al., 1990). Importância ainda maior assumem aqueles patógenos que requerem um número pequeno de células para desencadearem infecção e estão sendo Introdução 11 isolados de quantidades pouco representativas de determinadas amostras de alimentos. (DAVIS et al., 2003). Cabe salientar que a inoculação oral de Salmonella Typhimurium em gado confinado mostrou que a disseminação do agente ocorre de maneira rápida no rebanho e que parte dos animais permaneceu excretando-o pelas fezes por até 71 dias após o início do experimento (CLINTON et al., 1981). A participação de animais que atuam como vetores na disseminação do agente em ambientes de criação também é outro fator importante a ser considerado. Na cadeia produtiva de frangos de corte, por exemplo, Jones et al. (1991) pesquisaram o agente em insetos e roedores capturados em diferentes locais, isto é, avozeiros, incubatórios, galpões de criação, tendo isolado Salmonella spp. em 13% dos insetos e 5,3% dos roedores. Dados semelhantes foram citados por Letellier et al. (1999) que verificaram a presença do patógeno em instalações de suínos no Canadá. Em relação a instalações destinadas a bovinos de corte, não dispomos de tais dados, mas as condições que propiciam o aparecimento de tais animais no caso das aves e suínos são muito semelhantes às encontradas nas dos bovinos. Outro ponto relevante relacionado à contaminação dos lotes de animais por Salmonella refere-se ao estresse sofrido pelos mesmos durante o transporte em caminhões, no trajeto das fazendas de criação até o frigorífico, tendo sido observado um aumento da eliminação do patógeno por portadores assintomáticos, contribuindo para a contaminação do couro dos demais indivíduos do lote (PUYALTO et al., 1997; BACON et al., 2002; BARHAM et al., 2002; BEACH et al., 2002 a ; SORENSEN et. al., 2002). Introdução 12 Barkocy-Gallagher et al. (2003) analisando amostras de couro, fezes e carcaças, encontraram uma positividade de 71,0 % para Salmonella spp. em 1066 amostras de couro pré-abate, havendo maior correlação entre o couro e as carcaças contaminadas em comparação ao couro e amostras de fezes positivas. Esses mesmos autores sugerem o couro bovino como fonte principal de disseminação de patógenos para a carcaça no momento da esfola. De acordo com Rivera-Betancourt et al. (2004) a superfície de cobertura muscular dos animais abatidos é normalmente estéril, podendo tornar-se contaminada através do contato com o couro durante sua remoção. Para Bacon et al. (2002) a determinação da prevalência de Salmonella spp. nas superfícies do couro bovino antes de sua entrada nos estabelecimentos frigoríficos serviria de indicativo da potencial contaminação a que as demais carcaças, já esfoladas, estariam sujeitas. Dessa maneira, a participação do couro bovino na contaminação cruzada de carcaças durante o processo de esfola, tem sido uma das fontes mais importantes relatadas (DONKERSGOED et al., 1999; BACON et al., 2002; REID et al., 2002; McEVOY et al., 2003). Como observado, várias são as fontes e os fatores que podem levar à contaminação dos bovinos de corte por Salmonella e, posteriormente, de suas carcaças durante o processo de abate. Neste sentido, medidas devem ser tomadas em todos os elos da cadeia de produção da carne para que o produto chegue ao mercado consumidor livre deste importante patógeno. No Brasil poucos são os dados sobre a prevalência deste microrganismo em bovinos, tanto aqueles criados extensivamente, que constituem a grande Introdução 13 maioria, como os submetidos a regimes de confinamento. Com a implementação desses novos sistemas de criação, que possibilitam o abate precoce dos animais, parte dos quais destinados à exportação, torna-se de extrema importância garantir a segurança das carcaças obtidas a partir de tais técnicas zootécnicas. O estudo das possíveis fontes de contaminação dos animais para este patógeno, a disseminação deste durante o seu período de confinamento, bem como a identificação dos sorotipos envolvidos desde a chegada dos mesmos ao galpão de criação até as operações de abate, podem fornecer informações importantes e constituir ferramentas a serem empregadas no controle desse e de outros agentes etiológicos de importância do ponto de vista de saúde pública já na fase primária de produção. Objetivos 14 2. OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivos: - Realizar o levantamento epidemiológico da ocorrência de Salmonella spp. dentro de um sistema experimental de confinamento para novilhos - Traçar as possíveis rotas de disseminação desta bactéria desde o processo de criação até o abate Material e Métodos 15 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material 3.1.1 Instalações - Galpão de confinamento O trabalho foi conduzido na unidade experimental de confinamento do Novilho Superprecoce da Fazenda Lajeado, pertencente à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, campus de Botucatu, SP. O galpão destinado à manutenção dos animais durante a pesquisa apresentava estrutura de concreto armado, cobertura metálica, piso ripado em concreto e 26 baias de 30 m2 cada, individualizadas por cordoalhas de aço. Essas instalações ofereciam aos animais proteção contra a incidência direta de luz solar, chuvas e ventos dominantes. As baias encontravam-se suspensas a 1 metro de altura sobre contra- piso de concreto formando um “porão” de coleta de excretas que era higienizado duas vezes por semana apenas com água sob pressão por funcionários do local. Desta forma os novilhos ficavam isolados da maior parte das fezes e urina produzidas. 3.1.2 Grupo Teste de Animais O rebanho foi adquirido de propriedades rurais da região de Botucatu- SP e também de estados vizinhos. O lote teste era composto por 60 animais pertencentes aos seguintes grupos genéticos: Nelore, Simental, Simental ½ sangue com Nelore, Aberdeen Angus e Aberdeen Angus ½ sangue com Nelore. Os animais foram distribuídos em grupos de seis novilhos por baia, o que oferecia uma densidade populacional de 1bovino / 5m2. A média de idade Material e Métodos 16 dos grupos na chegada ao confinamento era coincidente com o desmame dos bezerros (em torno de seis meses de vida) e sua permanência no galpão variava com o tempo necessário para que cada lote adquirisse o peso desejado para abate (média de seis meses de permanência). Todos os novilhos receberam identificação numérica individual (brincos) para que fosse possível monitorá-los ao longo do confinamento até o abate. 3.1.3 Alimentação A dieta servida ao grupo era à base de silagem de milho-planta, silagem de milho úmido, caroço de algodão, feno de coast- cross , polpa cítrica, milho seco moído e núcleo mineral protéico que juntos formavam a ração final para o rebanho, sendo produzidos na própria fazenda Lajeado ou adquiridos de forma comercial. De acordo com as etapas zootécnicas de ganho de peso, esses ingredientes se alternavam ou se substituíam a fim de atingir o equilíbrio nutricional necessário. 3.1.4 Água A água servida aos animais e também utilizada para higienização das instalações era proveniente da companhia de saneamento do estado – SABESP. Havia na fazenda um reservatório exclusivo (caixa central) responsável por sua estocagem e distribuição a todo o confinamento. 3.1.5 Insetos e roedores Dada à presença desses animais no galpão de confinamento e suas proximidades, e dentro das possibilidades de sua captura, os mesmos Material e Métodos 17 constituíram-se em amostras analisadas nessa pesquisa. Ressalta-se que as instalações não possuíam controle de pragas. 3.1.6 Fezes bovinas de conjunto e individuais Com o objetivo de identificar animais portadores de Salmonella spp. previamente contaminados em suas fazendas de criação, foram analisadas amostras fecais de conjunto de cada baia (contendo 6 animais) coletadas 24 h após a chegada dos novilhos ao confinamento. A partir desse momento a coleta de fezes foi realizada mensalmente e de forma individual, a fim de possibilitar a correlação de cada animal confinado com sua respectiva carcaça no frigorífico. Material e Métodos 18 3.2 Métodos 3.2.1 Período de coleta das amostras A coleta das amostras iniciou-se previamente à chegada dos animais no galpão de confinamento (maio / 2003) estendendo-se até o abate do ultimo novilho (março / 2004) conforme ilustra a tabela 1. TABELA 1. Coleta das amostras ao longo do período de confinamento. Amostras Período de Coleta instalações Pré - chegada X - - - - - - - - - - Fezes conjunto X X X - - - - - - - - Fezes individuais X X X X X X X X X X X H2O/alimentos X X X X X X X X X X X Carcaças - - - - - - X X X X X Meses coleta Ma Jn Jl Ag St Ot Nv Dz Ja Fv Mç 2003 2004 Ma – maio; Jn – junho; Jl – julho; Ag – agosto; St – setembro; Ot – outubro; Nv – novembro; Dz – dezembro; Ja – janeiro; Fv – fevereiro; Mç – março. ( - ) = coleta não realizada ( x ) = realização de coleta 3.2.2 Coleta de amostras das instalações antes da entrada dos animais Anteriormente à entrada dos animais no galpão de confinamento foram colhidas 15 amostras ambientais de quatro baias escolhidas ao acaso (superfície do piso ripado, bebedouros e cochos de alimentação) e de dois corredores de acesso às mesmas. Cada amostra era composta por cinco sub- Material e Métodos 19 amostras, coletadas com o auxílio de um molde plástico estéril com área de 100 cm2 e uma esponja embebida em caldo Letheen, perfazendo uma área total analisada de 500 cm2 de cada local acima especificado. Cada esponja era então transferida para um frasco estéril contendo 100 ml de caldo Letheen, para análise posterior. 3.2.3 Coleta de amostras fecais As coletas de fezes iniciaram-se de forma coletiva (diretamente colhidas no porão de excretas das baias) ocorrendo dentro de 24 h após a chegada de cada lote ao galpão de confinamento. Colhiam-se amostras em cinco diferentes pontos do contra-piso sob cada uma das dez baias envolvidas no experimento. Essas 5 sub-amostras eram reunidas em um único frasco estéril seco, dando origem a uma amostra representativa de cada baia. Com isso, foram analisadas 10 amostras fecais de conjunto. Esse tipo de coleta (fezes de conjunto) ocorreu apenas na chegada dos lotes, sendo posteriormente realizada de forma individual e mensal, diretamente da ampola retal de cada um dos 60 novilhos. Para esse procedimento cada animal era contido em um tronco, procedendo-se a coleta manualmente com o auxílio de luvas de procedimento, transferindo-se o material para frascos estéreis secos. Ao longo de todo experimento foram analisadas 322 amostras de fezes individuais. 3.2.4 Coleta de água e alimentos Material e Métodos 20 Mensalmente realizavam-se coletas de amostras da dieta (ração final e seus constituintes isoladamente), da água de dessedentação disponível nas baias e da água da caixa central que alimentava o galpão totalizando 83 amostras que foram acondicionadas em recipientes estéreis secos. 3.2.5 Coleta de moscas e roedores Com o auxílio de armadilhas apropriadas a cada espécie animal, buscou-se capturar insetos e roedores eventualmente presentes nas estruturas e também nas proximidades das instalações envolvidas na pesquisa. Diariamente funcionários do galpão inspecionavam “ratoeiras” e “caça-moscas” informando, nos casos de captura, a equipe de coleta que se deslocava ate o local para o recolhimento dessas amostras. Semanalmente as iscas de cada armadilha eram substituídas objetivando manter sua atratividade. Moscas capturadas eram integralmente maceradas em cadinho estéril, pesadas e quantidade proporcional de água peptonada tamponada a 1% (APT 1 %) era então adicionada a fim de se obter uma relação de 1/9 entre o peso da amostra e o diluente. No caso dos roedores, cerca de 1g de seu conteúdo intestinal, obtido após sacrifício do animal, era transferido para tubos contendo os meios de enriquecimento seletivo, conforme esquema descrito na figura 1. Apenas uma amostra de conteúdo intestinal de um roedor foi analisada, ocorrendo o mesmo com amostras de moscas. 3.2.6 Coleta de amostras de carcaças dos animais abatidos, instrumentos e instalações da indústria frigorífica Material e Métodos 21 Finalizado o período de confinamento, os animais eram conduzidos ao matadouro-frigorífico, sob Inspeção Federal, localizado na região de Bauru, SP. Após o abate dos novilhos, as 60 carcaças foram amostradas individualmente, segundo normas recomendadas pelo Serviço de Inspeção Federal do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA, 1996), - áreas de 100 cm2 de três pontos de cada meia carcaça (peito, flanco e coxa), interna e externamente, tinham suas superfícies amostradas com uso de uma esponja hidratada em solução salina e molde estéril, perfazendo um total de 1200 cm2 analisados por animal abatido (600 cm2 / meia carcaça). Cada esponja era então transferida para frasco estéril contendo 100 ml de solução salina. Durante os trabalhos de matança na indústria, foram ainda coletadas 30 amostras entre instrumentos empregados na sala de matança (faca de corte de barbela, faca de sangria, serra de abertura de peito) bem como parede e piso dessa sala e da câmara frigorífica da indústria. Nesse caso também foram empregados moldes estéreis e esponjas embebidas em solução salina, sendo a área amostrada dependente do instrumento e / ou superfície analisada. 3.2.7 Conservação das amostras para análise Todas as amostras foram recolhidas em recipientes estéreis, sendo estes acondicionados em caixas isotérmicas com gelo reciclável e encaminhados ao laboratório de pesquisa da disciplina de Inspeção Sanitária de Alimentos de Origem Animal da FMVZ, UNESP, campus de Botucatu, para posterior análise. Material e Métodos 22 3.2.8 Pesquisa de Salmonella spp. Para a pesquisa desse patógeno, utilizou-se a metodologia preconizada por Andrews et al. (1998), esquematizada na Figura 1 e descrita a seguir: As amostras de água das baias e da caixa central (25 ml dos frascos coletores); do ambiente antes da entrada dos animais no galpão (25 ml de caldo Letheen ; das carcaças (25 ml de salina); do homogeneizado de moscas (25 ml) e da dieta (componentes e ração final, 25g cada), foram transferidas para um frasco estéril contendo 225 ml de água peptonada tamponada 1% (APT 1%), sendo este incubado a 35ºC por 24 h (etapa de pré-enriquecimento). Para as amostras de fezes bovinas e roedores, suprimiu-se essa etapa, partindo-se diretamente para o enriquecimento seletivo, utilizando-se dois caldos: Rappaport-Vassiliadis (RV) e Tetrationato (TT). Transferia-se 1g desse material para tubos com 10 ml de RV e 1 g para tubos com 10 ml de TT. Das amostras pré-enriquecidas, transferia-se 0,1 ml e 1 ml para tubos contendo 10 ml de RV e TT respectivamente. A incubação dos caldos RV e TT deu-se à 42ºC e 35ºC respectivamente, ambos por 24 h. A seguir, a partir de cada um dos caldos de enriquecimento seletivo, procedeu-se a semeadura em placas contendo ágar seletivo para Salmonella spp.: ágar BS (Sulfito de Bismuto) e ágar XLD (Xilose Lisina Desoxicolato), ambos incubados a 35ºC por 24 h. De cada placa, três a cinco colônias características para o patógeno foram repicadas para tubos médios de vidro com rosca contendo os meios sólidos TSI - Tríplice Açúcar Ferro e LIA - Lisina Ferro Agar, incubados a 35ºC por 24 h. A partir dos tubos de TSI e LIA com reações características para Salmonella sp., realizava-se a prova de soroaglutinação em lâmina, sendo empregado o anti-soro polivalente flagelar e Material e Métodos 23 somático (Probac, São Paulo). Amostras positivas nesse teste tiveram caracterização bioquímica realizada através do sistema API 20E (BioMerieux, França). As cepas identificadas como Salmonella sp. foram estocadas em ágar conservação e enviadas ao Instituto Adolfo Lutz de São Paulo para sorotipagem. Material e Métodos 24 Etapa suprimida p/ fezes Figura 1 – Protocolo de análise de Salmonella spp. nas amostras de alimentos, água, fezes, roedores, insetos, carcaças e ambientes, segundo metodologia preconizada por Andrews et al. (1998). 25g ou 25ml amostra +225ml de água peptonada Incubação 35ºC 18 – 24 1ml0,1ml ← 1g fezes → RV TT Incubação Incubação 42ºC 18-24 h 35ºC 18-24 BS XLD BS XLD Incubação BS e XLD = 35ºC, 18-24 h Colônia TSI LIA Incubação Testes Bioquímicos Sorologia PRÉ-ENRIQUECIMENTO ENRIQUECIMENTO PLAQUEAMENTO IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA 35ºC, 18-24 h Resultados e Discussões 25 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES A pesquisa estendeu-se de maio de 2003 a março de 2004. No entanto, como os grupos zootécnicos eram provenientes de diferentes propriedades ou mesmo de outros estados, não foi possível iniciar o confinamento de todos os lotes ao mesmo tempo nem tampouco abatê-los na mesma época. Com isso, o primeiro grupo foi abatido em novembro de 2003 e o último em março de 2004, sendo que a média de permanência no galpão foi de 6,0 meses para todos os animais, em iguais condições de manejo e alimentação. Foram analisadas no total 522 amostras discriminadas a seguir: - 15 amostras de ambiente (cochos, pisos de baias e corredores do galpão antes da chegada dos animais) - 83 amostras de água e alimentos - 01 amostra de moscas - 01 amostra de conteúdo intestinal de roedor - 322 amostras de fezes individuais - 10 amostras de fezes de conjunto - 60 amostras de carcaças recém abatidas -30 amostras entre instrumentos empregados na sala de matança (faca de corte de barbela, faca de sangria, serra de abertura de peito) bem como parede e piso dessa sala e da câmara frigorífica da indústria. 4.1 Amostras do galpão pré-chegada dos animais As amostras recolhidas previamente à chegada dos animais no galpão (pisos, cochos, bebedouros, caixa de água e corredores laterais) não apresentaram isolamento positivo para Salmonella spp. Essa negatividade Resultados e Discussões 26 apresentada pelas estruturas analisadas pode ser resultante do próprio manejo aplicado às instalações do confinamento onde há uma higienização imediatamente após a partida dos lotes de novilhos já terminados e outra antes da entrada de novos animais (cerca de 3 dias antes). Com isso, podemos supor que as superfícies pesquisadas encontravam-se limpas e sanificadas no momento da coleta. 4.2 Amostras de água, alimentos, moscas e roedores. Até o momento, no Brasil, eram praticamente inexistentes dados que correlacionassem a participação de alimentos, água e animais com a veiculação de Salmonella spp. em bovinos. Em nosso trabalho foram analisadas 85 amostras entre alimentos, água de dessedentação, insetos e roedores. Apenas no alimento foram identificados dois constituintes da ração final como positivos para Salmonella spp.: caroço de algodão e núcleo mineral protéico. A água de dessedentação, de cochos ou caixa central, apresentou-se negativa. Da mesma forma, de amostras de roedores e insetos também não se isolou a bactéria. A razão provável para essa negatividade da água foi o fato de o abastecimento do galpão ser realizado pela companhia de saneamento do estado – SABESP. Logo, diferentemente das condições naturais em que é criada a maioria dos bovinos no país, onde o abastecimento provém de mananciais sem tratamento e expostos a potenciais veiculadores de microrganismos patogênicos, aqui, o tratamento efetuado pela empresa pode ter assegurado aos animais o fornecimento de um produto livre de contaminantes bacterianos. Por outro lado, esse reservatório também se Resultados e Discussões 27 apresentou constantemente fechado, o que certamente impediu o acesso de possíveis vetores, evitando dessa forma, a contaminação pós-tratamento efetuado pela SABESP. A presença de piso ripado isolando os animais de suas excretas, também pode ter evitado que essas sujidades atingissem os bebedouros no interior das baias, eliminando com isso mais um potencial foco de contaminação. Há que se ressaltar que em condições de campo, Souza et. al. (1992) no Brasil, isolaram Salmonella spp. em 13,27% dos bebedouros pesquisados, confirmando a importância da água como veículo de patógenos aos animais, quando condições básicas de tratamento e conservação desse produto não são efetivadas. Em agosto de 2003, três meses após o inicio do confinamento, foi introduzido na dieta dos animais o constituinte caroço de algodão, sendo o mesmo identificado como positivo para Salmonella spp. De acordo com Losinger et al. (1997) esta semente oleaginosa possui palatabilidade capaz de atrair um importante portador de salmonelas, o roedor. Nesse trabalho, os autores também citam a semente como um excelente meio de manutenção de cepas fúngicas produtoras de toxinas imunossupressoras. Logo, uma associação sinérgica de potenciais prejuízos para o bovino, isto é, a presença não só do patógeno nas sementes, mas também de elementos imunossupressores aos animais, poderia resultar na infecção dos mesmos. A amostra positiva foi recolhida de um depósito exclusivo para o armazenamento de caroço de algodão. Embora fosse esperado que da ração balanceada com esse ingrediente também se isolasse o agente, isso não ocorreu. Talvez por tratar-se de uma contaminação pontual e pequena, esta Resultados e Discussões 28 não se refletiu ou não foi detectada no produto final oferecido aos bovinos, uma vez que o caroço de algodão participava em pequena porcentagem da ração final. Em fevereiro de 2004 outro alimento foi identificado como positivo para Salmonella spp., o núcleo mineral protéico. Comercialmente conhecido como concentrado, este constituinte da ração final é produzido a partir de vários subprodutos da indústria frigorífica transformados em farinhas (carne, ossos, sangue, vísceras, etc). Ainda que tais farináceos necessitem de altas temperaturas para sua produção (torra e moagem), inviabilizando com isso a sobrevivência de microrganismos, deve-se ressaltar que a incorreta armazenagem desses alimentos ainda na indústria produtora ou posteriormente nos locais onde os mesmos vão ser utilizados, pode facilitar seu acesso a portadores de salmonelas (BERCHIERI-JR et al., 1984 e DOS SANTOS et al., 2000). No caso específico do confinamento, as próprias características do sistema de produção, com a variada e farta quantidade de alimentos expostos no ambiente de criação, são suficientes para atrair aves, insetos e roedores que, se portadores do agente, podem vir a contaminá-los (LETELLIER et al., 1999). Com relação à participação desses potenciais veiculadores de Salmonella spp. em nosso experimento, não foi possível determinar o seu papel na contaminação dos constituintes e da própria ração final oferecida aos animais, já que as capturas de roedores por nossas armadilhas foram infrutíferas. Apenas em um único momento foi possível apreender e submeter à pesquisa de Salmonella um roedor capturado, que se apresentou negativo para o agente. No entanto, a participação desses animais na eliminação do Resultados e Discussões 29 patógeno não pode ser descartada, haja vista sua reconhecida habilidade em reconhecer armadilhas e raticidas podendo, com isso, estar presente e eliminando a bactéria no ambiente sem contudo deixar-se à mostra. O mesmo insucesso atingiu a captura de insetos nas instalações do confinamento. Certamente isso se deu pelo fato de nossas iscas apresentarem menor atração frente à vasta oferta de alimentos no local. No entanto, assim como em relação aos roedores, a presença de insetos nestas unidades não deve ser desprezada do ponto de vista higiênico-sanitário visto serem conhecidos vetores de Salmonella spp. (JONES et al., 1991). Em termos gerais, portanto, embora não tenhamos conseguido determinar a origem de sua contaminação, dois dos ingredientes empregados na alimentação dos animais mostraram-se positivos para Salmonella ao longo do experimento. Pontual, essa contaminação não foi observada na ração final, embora possa ter sido a origem das salmonelas detectadas nas carcaças, resultado a ser discutido posteriormente nessa dissertação. 4.3 Amostras de fezes de conjunto Com relação às fezes de conjunto obtidas dos porões de excretas logo após a chegada dos animais, todas foram negativas para Salmonella spp. Esse resultado difere dos encontrados na literatura, já que vários autores citam que há uma maior eliminação desse patógeno quando o animal é submetido à situações estressantes como a privação de alimento e água antes do carregamento dos animais, bem como o próprio transporte em caminhões abertos, expostos à luz solar e chuvas (PUYALTO et al. 1997; BACON et al. 2002; BARHAM et al. 2002; BEACH et al. 2002a; SORENSEN et. al. 2002). Resultados e Discussões 30 Beach et al. (2002a) acrescentam ainda que animais alimentados a pasto apresentariam um pH ruminal menos ácido que aqueles alimentados com dietas de maior nível energético e protéico, facilitando a sobrevivência e posterior eliminação da bactéria em um portador submetido ao estresse. Uma vez que todos os animais estabulados de nosso experimento vieram de fazendas de criação (alimentação a pasto) e foram transportados em caminhões conforme descrição acima, seria esperado um isolamento do agente, desde que esse estivesse presente já nas unidades de cria (previamente ao transporte). Podemos levantar a hipótese então de que não havia infecção nos novilhos em suas propriedades de origem. No entanto, a possibilidade de coleta de amostras fecais ainda nos locais de criação pré- transporte, fato que não foi possível realizarmos, certamente auxiliaria no melhor esclarecimento dessa questão. Deve-se salientar que mesmo no caso dos autores que atribuem ao estresse uma maior eliminação das salmonelas pelos animais portadores, os mecanismos pelos quais ela ocorre não estão bem estabelecidos (FEDORKA- CRAY et al. 1998; BEACH et al. 2002a e 2002b). Fatores como distância percorrida pelos animais, condições climáticas, lotação dos veículos transportadores, susceptibilidade individual, por exemplo, são algumas das variáveis que devem ser melhor avaliadas para se determinar o efeito do estresse de transporte sobre o processo de eliminação bacteriana por parte dos animais portadores. Em nosso experimento trabalhamos com bovinos jovens (média de idade de seis meses) que percorreram distâncias variáveis entre suas fazendas de origem e o confinamento, não sendo isolada Salmonella spp. em suas fezes Resultados e Discussões 31 quando de sua chegada à Fazenda Lajeado. Esses dados reforçam a hipótese de que os novilhos não eram portadores da bactéria já em suas unidades de cria ou ainda, que o estresse do transporte não tenha exercido influência sobre essa faixa etária de animais. 4.4 Amostras de fezes individuais Foram analisadas 322 amostras coletadas diretamente da ampola retal dos animais ao longo do experimento. Apenas quatro (1,30%) mostraram-se positivas para o agente pesquisado, um proveniente de um bovino Nelore e três outras da raça Aberdeen Angus. Esses dados são inferiores aqueles encontrados por Losinger et al. (1997) e Fedorka-Cray et al. (1998) que obtiveram uma positividade de 5,5% em fezes bovinas ao pesquisarem Salmonella spp. em confinamentos nos EUA. Contudo, em ambos os trabalhos a pesquisa do patógeno foi realizada sobre um número maior de amostras (cerca de 5000 amostras) e em fezes de conjunto, possibilitando o recolhimento de amostras eliminadas pelo animal em outros momentos e não apenas naquele da coleta. Talvez essas condições tenham favorecido, quantitativamente, os resultados obtidos pelos pesquisadores. Por outro lado, resultados semelhantes aos obtidos em nosso estudo foram relatados por Dargatz et al. (2000). Esses autores ao trabalharem com 5.049 amostras de fezes bovinas, também de conjunto, obtiveram uma positividade proporcionalmente semelhante a nossa: 70 amostras (1,4%) para o agente em questão. Já Mc Evoy et al., (2003) ao analisarem fezes individuais de animais recém abatidos, identificaram cinco amostras positivas (2%) dentre as 250 pesquisadas. Mesmo considerando o fator estresse, já que os animais Resultados e Discussões 32 passaram por uma situação de pré-abate, o que poderia ter contribuído para uma maior eliminação de Salmonella, ainda assim, isolaram-se apenas 2% de amostras positivas. Beach et al. (2002b) ao trabalharem com amostras de “swabs”” retais de bovinos antes do transporte ao frigorífico, identificaram oito amostras positivas (4%) dentre as 200 pesquisadas. De forma geral, portanto, verifica-se que nossos resultados mostraram- se inferiores aos encontrados na literatura. Isto talvez deva-se ao sistema de confinamento em que nosso projeto foi desenvolvido, isto é, sob condições controladas, com um menor número de animais estabulados, condições essas normalmente não encontradas em confinamentos comerciais. 4.5 Amostras de carcaças Dentre as 60 carcaças analisadas, duas (3,33%) apresentaram-se contaminadas por Salmonella spp., ambas pertencentes a um mesmo grupo zootécnico (Simental ½ sangue com Nelore) originárias de animais alojados em baias diferentes (duas baias com seis animais do mesmo grupo) e abatidas no mesmo dia. Todos esses animais haviam apresentado exame fecal negativo para a bactéria ao longo do período de confinamento. Entretanto, isso não descarta a possibilidade de terem se mantido portadores inaparentes, sem eliminação do agente durante a engorda, ou que esta contaminação ocorria por um número pequeno de bactérias, não sendo detectada pela técnica microbiológica convencional. A hipótese de que os animais encontravam-se infectados em vida é reforçada pela identificação nas carcaças do mesmo sorotipo isolado no núcleo Resultados e Discussões 33 mineral protéico (concentrado), constituinte da ração final oferecida aos animais durante o confinamento. Embora o isolamento neste constituinte (fevereiro de 2004) tenha se dado após o abate deste grupo de animais em que as carcaças mostraram-se contaminadas (novembro de 2003), podemos levantar a hipótese de que a bactéria encontrava-se no ambiente de criação não tendo, no entanto, sido detectada nas fezes deste grupo de animais. Há que se ressaltar que em quatro animais (1 Nelore e 3 Aberdeen Angus) Salmonella havia sido anteriormente isolada de amostras fecais individuais, tratando-se inclusive do mesmo sorotipo identificado no concentrado. No caso dos animais do grupo Simental ½ sangue com Nelore que deram origem às carcaças contaminadas, estes poderiam ter se contaminado com a cepa do concentrado, mantendo-se como portadores inaparentes, e, sob ação do estresse do transporte entre a fazenda em Botucatu e a cidade onde se localizava o frigorífico, terem eliminado um maior número de células do agente nas fezes. Com isso, couro e conteúdo gastrintestinal estariam potencialmente contaminados e, de forma cruzada por falhas no processo de matança, teria ocorrido a contaminação das carcaças desses bovinos. McEvoy et al. (2003) ao trabalharem com fezes, líquido ruminal e carcaças de 250 novilhos encontraram respectivamente uma positividade de 2%, 2%, e 7,6% para Salmonella spp. Para esses pesquisadores, a presença da bactéria nas fezes ou líquido ruminal é uma ameaça direta para a carcaça bovina. No entanto, a contaminação encontrada não deve ser atribuída apenas à evisceração incorreta. Segundo os autores, é possível que o processo de esfola de animais com couros contaminados (fezes e sujidades), leve essa Resultados e Discussões 34 microbiota aos utensílios da indústria, também veiculando a bactéria até as carcaças. O mesmo relataram Rivera-Betancourt et al. (2004) citando ser a carcaça animal originalmente estéril antes de sua esfola, atribuindo a sua contaminação às mesmas causas citadas por Mc Evoy et al. (2003). De modo análogo, Beach et al. (2002b) chamam a atenção para a importância assumida pelo couro bovino no papel de veiculador de patógenos para as carcaças. Trabalhando com 1050 amostras de fezes retais, couro e carcaças bovinas, esses autores identificaram uma positividade de 4,0, 37,5 e 19,0% para Salmonella spp. respectivamente. Barkocy-Gallagher et al. (2003) relatam dados onde o couro bovino apresentou uma positividade de 71% pré- esfola e as carcaças provenientes desses animais mostraram-se positivas em 12,7%. Tais resultados chamam a atenção para que medidas higiênico- sanitárias sejam tomadas a fim de reduzir a carga microbiana que os bovinos normalmente carregam para o interior da indústria. Da mesma forma, constituem-se em um alerta para que o controle de qualidade dessas empresas empregue medidas capazes de conter essa contaminação dentro da sala de matança. Uma segunda hipótese também pode ser levantada para a contaminação de algumas carcaças por Salmonella spp. em nosso trabalho. Os animais confinados foram abatidos posteriormente a outros lotes que não participaram da pesquisa. Logo, é possível que o patógeno detectado nas carcaças seja originário de um bovino não pertencente ao experimento, e que tenha chegado a estas através de contaminação cruzada durante as operações de abate. Essa hipótese, embora não possa ser descartada, não nos parece ser a explicação para a questão. Em nosso entender, a identificação do mesmo Resultados e Discussões 35 sorotipo no alimento oferecido aos animais durante o confinamento e nas carcaças resultantes, parece indicar que a contaminação teve origem no ambiente de criação de nossos lotes, tendo se refletido nas carcaças por falhas nas operações de abate. 4.6 Efeito da sazonalidade e tempo de permanência dos novilhos no galpão de confinamento sobre a recuperação de Salmonella spp. Fedorka-Cray et al. (1998), Donkersgoed et al. (1999) e Riviera- Betancourt et al. (2004) identificaram a sazonalidade interferindo positivamente em seus isolamentos. Fedorka-Cray et al. (1998), nos Estados Unidos, também observaram uma melhor recuperação de cepas de Salmonella naquelas regiões naturalmente mais quentes que outras, ainda que durante as estações mais frias do ano. Em nosso experimento houve o isolamento coincidente de todas as cepas de Salmonella spp. durante épocas quentes do ano. As amostras positivas (amostras de duas carcaças, quatro amostras fecais individuais e duas de alimentos), foram isoladas em quatro meses quentes: novembro, dezembro, fevereiro e agosto conforme pode ser verificado na Tabela 2. No caso particular do mês de agosto (inverno) deve-se recordar que o ano de 2003 praticamente não apresentou temperaturas marcantes que definissem suas diferentes estações. Naquele ano o mês de agosto foi atipicamente quente em nossa região, atingindo a temperatura máxima de 23,4 ºC (Departamento de Recursos Naturais, FCA / UNESP, Botucatu - SP) Entretanto, como o número de cepas isoladas foi muito pequeno, não é possível sustentar a hipótese de correlação entre a sazonalidade e seus efeitos Resultados e Discussões 36 sobre nossas amostras. Acreditamos, porém, que características fisiológicas do agente venham a contribuir com sua sobrevivência nessas épocas. Dentre esses atributos, o fato do agente estudado ser um microrganismo mesófilo, favorecido pelas condições de umidade e temperatura do ambiente, pode ter contribuído para sua melhor recuperação nos meses chuvosos e com temperaturas mais elevadas. O tempo de permanência dos lotes nas instalações do confinamento pode ter favorecido o isolamento do agente nas fezes dos animais. Essa hipótese é levantada uma vez que os grupos que apresentaram a bactéria em suas amostras fecais (1 Nelore e 3 Aberdeen Angus), o fizeram ao final de sua etapa de engorda (dezembro/2003). Embora não possamos descartar a possibilidade de introdução tardia da cepa na alimentação desses animais, fato que justificaria o isolamento também tardio nas fezes, deve-se considerar que dados semelhantes foram relatados for Fedorka-Cray et al. (1998) que identificaram maior prevalência de Salmonella (7,4%) nas baias de animais estabulados por períodos máximos de 180 dias quando comparados a baias onde a permanência total foi de 8 dias de confinamento com 3,5% de positividade das amostras. Concordando com esses pesquisadores, acreditamos que o maior tempo de estabulação contribuiria para uma maior exposição dos animais a vetores ou veiculadores de Salmonella spp. Reforçando essa hipótese, Fedorka-Cray et al. (1998) citaram a possibilidade de um bovino vir a se contaminar com fezes de outro bovino portador estabulado na mesma baia. Além disso, Clinton et al. (1981) ao inocularem via oral Salmonella Typhimurium em gado confinado mostraram que a disseminação do agente se deu de maneira rápida no Resultados e Discussões 37 rebanho e que parte dos animais permaneceu excretando-o pelas fezes por até 71 dias após o início do experimento. Desta forma, uma vez que a bactéria esteja presente no ambiente, o maior tempo de exposição a esse agente, certamente contribuiria com a infecção dos animais. TABELA 2: Distribuição sazonal dos isolamentos de Salmonella spp. Amostras Período de Coleta Alimentos - - - X - - - - - X - Fezes individuais - - - - - - - X - - - Carcaças - - - - - - X - - - - Ma Jn Jl Ag St Ot Nv Dz Ja Fv Mç Out. Inverno Primavera Verão Meses coleta Sazonalidade 2003/2004 2003 2004 Ma – maio; Jn – junho; Jl – julho; Ag – agosto; St – setembro; Ot – outubro; Nv – novembro; Dz – dezembro; Ja – janeiro; Fv – fevereiro; Mç – março. ( - ) = amostras negativas para Salmonella spp. ( X ) = amostras positivas para Salmonella spp. 4.7 Sorotipagem das cepas isoladas: Foram isoladas oito cepas de Salmonella spp. ao longo das diferentes fases do experimento, assim distribuídas: duas cepas em alimentos (caroço de algodão e núcleo mineral protéico) quatro cepas em fezes retais (1 Nelore e 3 Aberdeen Angus) e duas cepas em carcaças (2 carcaças Simental ½ sangue com Nelore). De acordo com a sorotipagem realizada pelo Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, foram identificados dois diferentes sorotipos: Salmonella Mbandaka e Salmonella Tennesee. O primeiro contaminando o caroço de algodão e o segundo presente no núcleo mineral protéico, fezes retais e Resultados e Discussões 38 carcaças dos novilhos. Embora não possamos estabelecer uma correlação direta entre a presença dos sorotipos encontrados nos alimentos, fezes e carcaças, visto que estas últimas não eram provenientes dos novilhos em que as fezes mostraram-se positivas para Salmonella, é fato que esses animais estavam expostos à mesma alimentação contaminada (caroço de algodão e núcleo mineral proteico). Mesmo aceitando a hipótese de ser o sorotipo identificado na carcaça originário de contaminação cruzada com outros animais abatidos e não pertencentes ao experimento, há fortes evidências de tratar-se da mesma cepa identificada no confinamento. Afinal, o sorotipo S. Tennessee foi isolado na alimentação servida ao rebanho, quatro desses animais apresentaram-no em suas fezes e dois outros em suas carcaças. A confirmação desta hipótese, no entanto, só poderá ser feita com o emprego de técnicas de biologia molecular, não previstas inicialmente nesta pesquisa, mas que agora assumem uma importância muito grande, visto que podem esclarecer a rota de disseminação da bactéria na cadeia produtiva da carne. Em relação aos sorotipos identificados, os mesmos já haviam sido isolados em nosso país por Berchieri-Jr et al. (1984), ao pesquisarem farinhas de origem animal em três fabricas do estado de São Paulo. Salmonella Mbandaka e Salmonella Tennessee foram citados contaminando farinhas de pena e carne, respectivamente. No trabalho de Dargatz et al. (2000) que analisou fezes bovinas, o sorotipo S. Mbandaka aparece em 5,1% das 78 amostras isoladas para Salmonella spp. estando presente dentre os 10 sorotipos mais frequentemente isolados a partir de fezes de bovinos doentes de acordo com o National Resultados e Discussões 39 Veterinary Services Laboratories (NVSL). Para os autores, sorotipos como esse, outrora não isolados nos bovinos, merecem atenção especial por serem potencialmente patógenos emergentes. Resultados semelhantes aos de Dargatz et al. (2000) foram obtidos por Beach et al., (2002b), já que em rebanhos bovinos confinados e naqueles criados de forma extensiva, Salmonella Mbandaka correspondeu a 7,5% e 5% dos isolamentos, respectivamente. Quanto ao sorotipo S. Tennessee, Beach relatou uma positividade de 1,9% apenas no rebanho extensivo. Ambos os sorotipos estavam entre os cinco mais isolados na pesquisa. Em nosso trabalho houve uma maior prevalência de Salmonella Tennessee (87,5%) quando comparada a Salmonella Mbandaka (12,5%). Entretanto, como o número isolado de cepas do patógeno foi muito pequeno e pontual ao longo do experimento, torna-se difícil estabelecer um padrão de comportamento destes sorotipos dentro do sistema de produção estudado. Além disso, como a literatura nacional não apresenta dados até o momento sobre levantamentos semelhantes a esse, não é possível correlacionar as informações dessa pesquisa com um provável perfil de contaminação para alimentos, fezes ou carcaças bovinas no Brasil. Contudo, Davis et al. (2003) lembram que independentemente da distribuição que os diferentes sorovares de Salmonella assumem em amostras de subprodutos ou surtos em humanos, de forma alguma essas diferenças minimizam a importância dos alimentos de origem animal na epidemiologia das salmoneloses no Homem. No Brasil isto é particularmente importante, tendo em vista ser o nosso país atualmente o principal produtor mundial de carne bovina. Paradoxalmente, são escassos os dados relativos à prevalência de Salmonella spp. em nossos Resultados e Discussões 40 rebanhos, tanto os criados extensivamente (a grande maioria) como os submetidos a regimes de confinamento. Cabe salientar que esses sistemas de criação que possibilitam o abate precoce dos animais, geralmente direcionados ao mercado externo, vêm ganhando importância em nosso país, o que torna necessária a realização de pesquisas sobre a segurança das carcaças obtidas a partir de tais manejos zootécnicos. Neste sentido, os dados obtidos no presente trabalho, embora revelem uma baixa prevalência do patógeno tanto nos animais vivos quanto nas carcaças produzidas, devem servir de base para a realização de estudos adicionais, especialmente sobre a participação de roedores na disseminação dos sorotipos de Salmonella nas unidades primárias de produção em nosso país. Conclusões 41 5. CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos, conclui-se que: 1. - A prevalência de Salmonella spp. nos novilhos confinados sob regime experimental mostrou-se baixa. 2. - Embora pontual, a contaminação pelo patógeno de alguns ingredientes da ração final pode ter se refletido no aparecimento de carcaças contaminadas, resultantes de falhas ocorridas durante o processo de abate. Referências 42 6. REFERÊNCIAS1 ANDREWS, W.H.; JUNE, G.A.; SHERROD, P.S.; HAMMAK, T.S.; AMAGUANA, R.M. Salmonella. In: FOOD AND DRUG ADMINISTRATION – Bacteriological analytical manual, 8 th ed Gaithersburg: AOAC INTERNATIONAL, 1998. p.5.01-5.020. USDA - UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE, FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE. Nationwide beef microbiological baseline data colection program: cows and bulls. 1996. 33p. ARRIGONI, M. D. Produção de novilho superprecoce. Botucatu: FMVZ, 2001. 19p. (Palestra) ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CRIADORES DE ZEBU. Disponível em < www.abcz.og.br> Acesso em 09 nov 2001. BACON, R. 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