UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP 

CÂMPUS DE JABOTICABAL 

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM TESTE DE 

DIAGNÓSTICO PARA MONITORAMENTO DA 

RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM REBANHOS 

OVINOS 

Yousmel Alemán Gainza 

Orientador: Profª. Dra. Ana Carolina de Souza Chagas 

 

Tese apresentada à Faculdade de Ciências 
Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de 
Jaboticabal, como parte das exigências para a 
obtenção do título de Doutor em Medicina 
Veterinária (área: Medicina Veterinária 
Preventiva). 

 
 
 
 
 
 

 

2020 



 
 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP 

CÂMPUS DE JABOTICABAL 

 

 

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM TESTE DE 

DIAGNÓSTICO PARA MONITORAMENTO DA RESISTÊNCIA 

ANTI-HELMÍNTICA EM REBANHOS OVINOS 

Yousmel Alemán Gainza 

Médico Veterinário e Zootecnista 

 
 
 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

2020 



G143d
Gainza, Yousmel Alemán

    Desenvolvimento e validação de um teste de diagnóstico para

monitoramento da resistência anti-helmíntica em rebanhos ovinos. /

Yousmel Alemán Gainza. -- Jaboticabal, 2020

    106 p. : il., tabs.

    Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp),

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal

    Orientadora: Ana Carolina de Souza Chagas

    1. Diagnóstico. 2. RESISTA-Test. 3. Resistência anti-helmíntica. 4.

Nematoides gastrintestinais. 5. Ovinos. I. Título.

Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pelo autor(a).

Essa ficha não pode ser modificada.



 
 

 



 
 

DADOS CURRICULARES DO AUTOR 

 Yousmel Alemán Gainza nasceu na cidade de Havana, Cuba, no dia 11 de maio 

de 1983. Em setembro de 2003 iniciou sua graduação na Faculdade de Veterinária da 

“Universidad Agraria de la Habana” - UNAH, obtendo o título de Médico Veterinário e 

Zootecnista em julho de 2008. Em setembro de 2008 ingressou no “Centro Nacional 

de Sanidad Agropecuaria” – CENSA, onde foi pesquisador assistente no laboratório 

de parasitologia veterinária até dezembro de 2015. Iniciou os estudos de pós-

graduação no Programa de Pós-graduação em Medicina Preventiva Veterinária 

(Saúde Animal) pela UNAH, obtendo o título de mestre em outubro de 2014. Parte das 

pesquisas de mestrado foram desenvolvidas no Laboratório de Parasitologia 

Veterinária na Embrapa Pecuária Sudeste, de agosto de 2013 a maio de 2014, por 

meio do projeto de cooperação internacional Brasil/Cuba, pela chamada 

CAPES/MESCUBA: "Diagnóstico da resistência anti-helmíntica e fitofármacos: 

contribuição ao controle integrado de nematoides gastrintestinais em pequenos 

ruminantes” (processo n°. 147/12). Foi professor assistente das disciplinas de 

Fisiologia Animal e Fisiologia Animal Aplicada pela faculdade de Medicina Veterinária 

da UNAH, no período de janeiro a julho de 2016. Em agosto de 2016 iniciou o 

doutorado pelo programa de pós-graduação em Medicina Veterinária (Medicina 

Veterinária Preventiva) pela Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” 

– campus de Jaboticabal, desenvolvendo a parte experimental de seu projeto na 

Embrapa Pecuária Sudeste, com bolsa outorgada pela FAPESP (Processo No 

2016/07132-8). 



 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
Dedico 

Aos meus pais Lina Gainza Buzón e Jesús Alemán Marrero, 

ao meu irmão Yordennys Alemán Gainza por todo amor, carinho 

e confiança depositados em mim, porque estando longe de vocês, 

estiveram e estão sempre presentes em meu coração. 



 
 

 
 

AGRADECIMENTOS 

À Mase, presente em todos os momentos e por ter me concedido força, humildade e  

sabedoria nos momentos difíceis. 

 

À minha família pelo apoio incondicional em minhas decisões. Vocês são minha base, 

meu alicerce. Todos os valores que hoje eu tanto prezo vieram de vocês. 

 

À minha família de Brasil, Ane Lisye e Edvaldo, pela força e apoio em todo momento. 

 

À Yolanda Emilia Suarez, que desde Cuba ficou sempre me apoiando e salientando 

como pessoa e como profissional.  

 

À minha orientadora Professora Dra. Ana Carolina de Souza Chagas, pelos 

ensinamentos durante o mestrado e agora no doutorado, e eficiência na orientação 

desta pesquisa. 

 

Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Medicina Veterinária 

Preventiva da Universidade Estadual Paulista – UNESP. 

 

À Dra. Lea Chapaval Andri, pela especial ajuda e socorro em momentos difíceis. 

 

Ao Dr. Sérgio Novita Esteves por conceder total apoio e estrutura de pesquisa para 

realização das avaliações a campo. 

 

À minha irmã brasileira Rafaela Regina Fantatto, pessoa especial em todo momento, 

sabendo me aconselhar, acalmar e dar força moral para seguir nos momentos fracos. 

Você foi luz no meu caminho. 

 

Aos colegas e amigos do Laboratório de Parasitologia Veterinária (LPV): Louyse 

Gabriele, Giovanna Cruvinel, Matheus H. Grego, Caroline Valerio, Luciana Giraldelo, 

João Toscano, Amanda Figueiredo e Leonardo A. Lima. 

 



 
 

 
 

Especial agradecimento à Isabella Barbosa, colega e amiga de laboratório, pela 

enorme paciência e apoio incondicional em todo o desenvolvimento dos experimentos 

da tese. Sem você não teria dado tempo terminar a tese!   

À EMBRAPA PECUÁRIA SUDESTE por concederem estrutura de pesquisa para a 

realização dos experimentos. 

 

Ao pesquisador, colega e amigo Waldomiro Barioni-Júnior pelos ensinamentos de 

estatística e pela valiosa ajuda nas análises estatísticas realizadas nessa pesquisa. 

 

Aos irmãos da República Xicreti: Cícero, Fabricio, Felipe Bardela, Danilo, Vitor, Vitor 

Bardela, João Pedro, João, Rafael, Luis e Marcos Felix pelos bons momentos vividos 

nessa irmandade 

 

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho. 

 

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo 

financiamento da minha bolsa de Doutorado. 

 



i 

 
 

SUMÁRIO 

Página 

Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais …………………………... iii 

RESUMO ……………………………………………………………………………... iv 

ABSTRACT …………………………………………………………………………... vi 

LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………………… viii 

LISTA DE TABELAS ………………………………………………………………… ix 

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ……………………………………. 1 

1.1 Introdução ………………………………………………………………………... 1 

1.2 REVISÃO DE LITERATURA …………………………………………………… 3 

1.2.1 Aspectos epidemiológicos dos nematoides gastrintestinais no Brasil …. 3 

1.2.2 A resistência parasitária aos anti-helmínticos ………………………….. 4 

1.2.2.1 Resistência aos anti-helmínticos na América do Sul ……………….. 4 

1.2.2.2 Resistência aos anti-helmínticos na América do Norte …………….. 5 

1.2.2.3 Resistência aos anti-helmínticos na África ………………………… 6 

1.2.2.4 Resistência aos anti-helmínticos na Ásia ………………………….. 7 

1.2.2.5 Resistência aos anti-helmínticos na Austrália …………………….. 8 

1.2.2.6 Resistência aos anti-helmínticos na Europa ………………………. 8 

1.2.3 Consequências da resistência anti-helmíntica …………………………. 9 

1.2.4 Estratégias para retardar a resistência aos anti-helmínticos ……………. 11 

1.2.5 Diagnóstico da resistência anti-helmíntica por testes in vitro …………… 12 

1.2.5.1 Teste de eclosão de ovos – TEO ……….........………………………. 14 

1.2.5.2 Testes de desenvolvimento larvar– TDL …………………………... 14 

1.2.5.3 Teste de motilidade e migração larvar – TML ……………………….. 15 

1.2.5.4 Testes moleculares …………………………………………………... 16 

1.2.6 Diagnóstico da resistência anti-helmíntica por testes in vivo …………. 17 

1.3 REFÊRENCIAS …………………………………………………………………. 19 

CAPÍTULO 2 – Improvement of an in vitro test (RESISTA-Test) for Haemonchus 

contortus resistance diagnosis in small ruminant……………. 

 

36 

2.1 Abstract …………………………………………………………………………... 36 

2.2 Introduction ………………………………………………………………………. 38 

2.3 Material and methods …………………………………………………………… 40 



ii 

 
 

2.3.1 Anthelmintics ……………………………………………………………….. 40 

2.3.2 GIN evaluation ……………………………………………………………… 41 

2.3.3 Egg recovery ……………………………………………………………….. 41 

2.3.4 Larval development test (LDT) …………………………………………… 42 

2.3.5 Statistical analysis …………………………………………………………. 43 

2.4 Results ……………………………………………………………………………. 43 

2.4.1 Echevarria1991 and Botucatu isolates ………………………………….. 43 

2.4.2 GINs from flocks …………………………………………………………… 49 

2.5 Discussion ……………………………………………………………………….. 58 

2.6 Conclusion ………………………………………………………………………… 61 

2.7 References ………………………………………………………………………. 62 

CAPÍTULO 3 – Anthelmintic resistance of Haemonchus contortus from sheep 

flocks in Brazil: concordance of in vivo and in vitro (RESISTA-

Test) methods …………………………………………………….. 

 

 

69 

3.1 Abstract ………………………………………………………………………….. 69 

3.2 Introduction ………………………………………………………………………. 70 

3.3 Material and Methods …………………………………………………………… 72 

3.3.1 Sampling procedures for FECRT ………………………………………… 72 

3.3.2 Sampling procedures for LDT ……………………………………………. 73 

3.3.3 FECRT and LDT analysis and resistance determination ……………… 74 

3.3.4 Statistical analysis …………………………………………………………. 74 

3.4 Results ……………………………………………………………………………. 75 

3.5 Discussion ………………………………………………………………………. 80 

3.6 Conclusion ………………………………………………………………………… 82 

3.7 References ………………………………………………………………………. 83 

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ……………………………………… 88 

 
 



iii 

 
 

CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS

 
 



iv 

 
 

Desenvolvimento e validação de um teste de diagnóstico para monitoramento 

da resistência anti-helmíntica em rebanhos ovinos 

 

RESUMO – O teste de desenvolvimento larvar (TDL) pode ser uma ferramenta de 

diagnóstico da resistência anti-helmíntica de rebanhos, permitindo seu monitoramento 

e ajustes de manejo. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um teste de 

diagnóstico in vitro da resistência de Haemonchus contortus a anti-helmínticos 

comerciais e validar os resultados a campo. A eficácia do tiabendazol (TBZ), levamisol 

(LEV), ivermectina-monossacárida (IVM-M), monepantel (MPT) e Zolvix® (ZLV) foi 

avaliada no TDL em isolados de H. contortus susceptível (Echevarria1991-HcEc91) e 

resistente (Botucatu-HcBot), em placas de cultura de 24 e 96 poços. Testes 

complementares foram posteriormente realizados com a ivermectina aglicona (IVM-

A). Para validação do TDL, realizou-se o teste de redução da contagem de ovos nas 

fezes (TRCOF) em cinco rebanhos ovinos com anti-helmínticos comerciais dos 

mesmos grupos químicos (grupos de 7 animais com OPG ≥ 200). TDL e coproculturas 

também foram realizadas com as amostras dos rebanhos (HcRebanhos). H. contortus 

foi o parasita majoritário em todas as fazendas (média de 74%). O fator de resistência 

(FR) definido para os isolados foi superior a 3, indicando que o teste foi capaz de 

diferenciar HcEc91 e HcBot para TBZ, LEV, MPT, ZLV, IVM-A, e de maneira menos 

consistente para IVM-M. A similaridade das curvas dose-resposta entre as placas e 

interação placa*concentração (R2 de 98,4 a 99,0% para HcEc91/HcBot e de 99,4 a 

99,0% para HcRebanhos), bem como baixas diferenças na eficácia média (0,02 a 

2,26% para HcEc91/HcBot e 0,02 a 4,90% para HcRebanhos) para todos os anti-

helmínticos, exceto para MPT, indicaram concordância confiável do TDL em ambas 

as placas, tanto para a avaliação de HcEc91/HcBot quanto para HcRebanhos. No 

último caso, a detecção de resistência pelo ZLV foi mais clara e mais estável do que 

pelo MPT. A adaptação do teste para placas de 96 poços resultou em economia de 

pelo menos 51.9%. Por meio do TRCOF, detectou-se resistência a todos os grupos 

químicos em todos os rebanhos, exceto para ZLV (40% resistentes e 20% suspeitos 

de resistência). Os resultados do TDL nos rebanhos indicaram resistência a TBZ 

(100%), LEV (80%), ZLV (20%), IVM-M (0%) e IVM-A (100%). Foi obtida concordância 

total quanto aos resultados de ambos os testes para TBZ e IVM-A (k=1,00). Já para 



v 

 
 

LEV e ZLV, apesar de haver divergência de resultados em dois rebanhos, esta não foi 

estatisticamente diferente para ambas as drogas (P= 0,077 e P= 0,197, 

respectivamente), obtendo-se concordância substancial (k= 0,8 e 0,6, 

respectivamente). Os dados do presente estudo indicam que os resultados dos dois 

testes são comparáveis, validando, portanto, esse teste como uma opção para o 

diagnóstico da resistência anti-helmíntica para produtores de pequenos ruminantes.  

 

Palavras-chave: diagnóstico, RESISTA-Test, resistência anti-helmíntica, nematoides 

gastrintestinais, ovinos. 

  



vi 

 
 

Development and validation of a diagnostic test for anthelmintic resistance 

monitoring in sheep flocks 

 

ABSTRACT – The larval development test (LDT) can be a diagnostic tool for 

anthelmintic resistance in flocks, allowing monitoring and management adjustments. 

The aim of this study was to develop and validate an in vitro diagnostic test of 

Haemonchus contortus resistance to commercial anthelmintics and to validate the 

results at the farm level. The efficacy of thiabendazole (TBZ), levamisole (LEV), 

ivermectin-monosaccharide (IVM-M), monepantel (MPT) and Zolvix® (ZLV) were 

evaluated in LDT in susceptible (Echevarria1991-HcEc91) and resistant (Botucatu-

HcBot) isolates, in 24 and 96 well culture plates. Complementary tests were 

subsequently performed with ivermectin aglycone (IVM-A). To validate the LDT, the 

fecal egg count reduction test (FECRT) was performed in five sheep flocks with 

commercial anthelmintics from the same chemical groups (groups of 7 animals with 

FEC ≥ 200). LDT and fecal cultures were also carried out with the samples of the flocks 

(HcFlocks). H. contortus was the major parasite on all farms (average of 74%). The 

resistance factor (RF) defined for the isolates was greater than 3, indicating that the 

test was able to differentiate HcEc91 and HcBot for TBZ, LEV, MPT, ZLV, IVM-A, and 

in a less consistent way for IVM-M. The similarity of the dose-response curves between 

the plates and plate*concentration interaction (R2 from 98.4 to 99.0% for 

HcEc91/HcBot and from 99.4 to 99.0% for HcFlocks), as well as low differences in 

efficacy mean (0.02 to 2.26% for HcEc91/HcBot and 0.02 to 4.90% for HcFlocks) for 

all anthelmintics, except for MPT, indicated a reliable agreement of the LDT in both 

plates, both for the evaluation of HcEc91/HcBot as for HcFlocks. In the latter case, 

resistance detection by ZLV was clearer and more stable than by MPT. The adaptation 

of the test to 96-well plates resulted in savings of at least 51.9%. Through FECRT, 

resistance to all chemical groups was detected in all flocks, except for ZLV (40% 

resistant and 20% suspected of resistance). LDT results in flocks indicated resistance 

to TBZ (100%), LEV (80%), ZLV (20%), IVM-M (0%) and IVM-A (100%). Total 

agreement was obtained regarding the results of both tests for TBZ and IVM-A (k = 

1.00). For LEV and ZLV, although there was a divergence of results in two flocks, this 

was not statistically different for both drugs (P = 0.077 and P = 0.197, respectively), 



vii 

 
 

with substantial agreement (k = 0.8 and 0.6, respectively). The data from the present 

study indicate that the results of the two tests are comparable, thus validating this test 

as an option for the diagnosis of resistance for small ruminant farmers. 

 

Keywords: diagnosis, RESISTA-Test, anthelmintic resistance, gastrointestinal 

nematodes, sheep. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



viii 

 
 

 
LISTA DE FIGURAS 

Página 

CAPÍTULO 2 

 

Figure 1. Log-dose and logit-response curves for H. contortus: Echevarria1991 

susceptible isolate in 24-well (HcEc91-24W) and 96-well (HcEc91-96W) plates, and 

Botucatu resistant isolate in 24-well (HcBot-24W)) and 96-well plates (HcBot-96W) to 

Thiabendazole-TBZ (A), Levamisole-LEV (B), Ivermectin-IVM-M (C), Monepantel-MPT 

(D) and Zolvix-ZLV (E)................................................................................................46 

 

Figure 2. Percentage of nematode genre in fecal culture from flocks (Flock 1 to Flock 

5) on days 0 and 14.....................................................................................................49 

 

  



ix 

 
 

LISTA DE TABELAS 

 

Página 

CAPÍTULO 2 

 

Table 1. Results of the larval development inhibition of H. contortus isolates 

Echevarria1991 (HcEc91) and Botucatu (HcBot), in 24 and 96-well plates, for 

thiabendazole -TBZ, levamisole - LEV, ivermectin monosaccharide - IVM-M, 

monepantel - MPT and Zolvix® - ZLV...........................................................................45 

Table 2. Lethal concentrations LCs, confidence limits (95%, μg/mL) and resistance 

factors (*RFs) in LDT to Haemonchus contortus susceptible (Echevarria1991-HcEc91) 

and resistant (Botucatu-HcBot) isolates, in 24- and 96-well plates, for thiabendazole -

TBZ, levamisole - LEV, ivermectin monosaccharide - IVM-M, monepantel - MPT and 

Zolvix® - ZLV...............................................................................................................48 

Table 3. Results of the inhibition of H. contortus larval development by flock (HcFlocks 

1 to 5), in 24- and 96-well plates, on days 0 and 14, for thiabendazole -TBZ, levamisole 

- LEV, ivermectin monosaccharide - IVM-M, monepantel - MPT and Zolvix® - ZLV......50 

Table 4. Lethal concentrations LC50 and confidence limits (95%, μg/mL) in LDT for 

HcFlocks in 24 and 96-well plates, on collection days zero (D0) and fourteen (D14), for 

thiabendazole -TBZ, levamisole - LEV, ivermectin monosaccharide - IVM-M, 

monepantel - MPT and Zolvix® - ZLV...........................................................................56 

Table 5. Resistance factors (*RFs) in LDT in 24 and 96-well plates, on different 

collection days (D0 and D14), for thiabendazole -TBZ, levamisole - LEV, ivermectin 

monosaccharide - IVM-M, monepantel - MPT and Zolvix® - ZLV.................................57 

Table 6. Lethal concentrations LC50, confidence limits (95%, μg/mL) and resistance 

factors (RFs) for ivermectin monosaccharide - IVM-M and aglycone - IVM-A in LDT to 

Haemonchus contortus susceptible (Echevarria1991-HcEc91) and resistant 

(Botucatu-HcBot) isolates, in 96-well plates................................................................58 

 

  



x 

 
 

CAPÍTULO 3 

 

Table 1. The arithmetic means of fecal egg counts on day 14 after treatment (FEC 

D14), fecal egg count reduction percentages (R%) and the lower and upper 95% 

confidence intervals (CI), in sheep flocks (N=49, 7 animals per group) tested for the 

anthelmintics (AH) benzimidazole (BZ), levamisole (LEV), closantel (CLO), ivermectin 

(IVM), moxidectin (MOX), and zolvix (ZLV), including an untreated control group 

(C)...............................................................................................................................77 

Table 2. Comparison of the efficacy obtained in the fecal egg count reduction test 

(FECRT) and the critical cut-off points obtained in the larval development test (LDT) 

for benzimidazole (BZs), levamisole (LEV), ivermectin (IVM), and Zolvix (ZLV). Results 

were reported as resistant (R), suspected of resistance (SR) or susceptible 

(S)...............................................................................................................................79 

 



1 

 
 

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS  

 

1 INTRODUÇÃO 

O Brasil possui rebanho ovino de aproximadamente 18 milhões de cabeças. 

(ANUALPEC 2018). Os pequenos ruminantes desempenham importante papel na 

agricultura familiar e possuem potencial para os mercados emergentes. Em 

comparação aos bovinos, os ovinos e caprinos são amplamente adaptados a 

diferentes condições climáticas, além de consumirem menor quantidade de alimentos 

em razão do menor tamanho corporal (Silanikove, 2000; Markos, 2006). Esses fatores 

permitem fácil integração dos pequenos ruminantes a diversos sistemas de produção.  

O principal problema sanitário na criação de pequenos ruminantes no Brasil é 

causado pelos nematoides gastrintestinais (NGI). Os animais sofrem redução no 

ganho de peso, diminuição na taxa de fertilidade, levando a gastos com 

medicamentos e aumento na mortalidade, causando significativas perdas 

econômicas (Sczesny-Moraes et al., 2010; Nova et al., 2014). Parasitas como 

Haemonchus e Trichostrongylus acarretam milhões em perdas econômicas a cada 

ano à cadeia de produção ovina. Em levantamento realizado na região sul do Rio 

Grande do Sul, as perdas econômicas geradas por esses parasitas foram estimadas 

em R$ 2.016.000/ano (Oliveira et al., 2017). Como forma de minimizar os prejuízos, 

o controle de parasitas tem sido amplamente realizado por meio de anti-helmínticos, 

mas a excessiva dependência nessas substâncias tem levado ao desenvolvimento 

de resistência anti-helmíntica (RA) múltipla e, portanto, essa abordagem não tem 

sido considerada sustentável para o controle de NGI (Sutherland e Leathwick, 2011; 

Van Wyk e Reynecke, 2011). 

 A resistência dos NGI aos anti-helmínticos em animais de produção continua a 

aumentar globalmente em gravidade. Houve muitos avanços na pesquisa de 

resistência nos últimos 50 anos, incluindo diagnósticos, descobertas fisiológicas e 

genéticas importantes, além do desenvolvimento de modelos e ferramentas 

matemáticas preditivas para ajudar os agricultores a gerenciar a resistência (Kotze 

et al., 2014a). Entretanto, uma questão fundamental que ainda requer resolução é o 

uso de técnicas de diagnóstico que estimam a presença de resistência anti-

helmíntica em rebanhos ovinos. 



2 

 
 

O estabelecimento de medidas racionais para prevenir e controlar NGI em 

pequenos ruminantes é um grande desafio, especialmente em regiões tropicais, 

onde a espécie predominante é Haemonchus contortus, causador de intensa anemia 

(Amarante et al., 2004). O conhecimento precoce do status de resistência nas 

propriedades é importante para a manutenção da atividade dos grupos químicos de 

anti-helmínticos que ainda são eficazes. Portanto, a validação de técnicas para 

monitorar e controlar a RA em rebanhos é extremamente importante, pois conduz ao 

manejo sanitário mais racional e permite a orientação de ações futuras para o 

controle parasitário em cada propriedade.  

Desta forma, o presente estudo teve por objetivo desenvolver um teste de 

diagnóstico in vitro do status de resistência de H. contortus a anti-helmínticos 

comerciais e validar os resultados a campo.  

  



3 

 
 

1.2 REVISÃO DE LITERATURA 

 

1.2.1 Aspectos epidemiológicos dos nematoides gastrintestinais no Brasil 

Várias espécies de NGI já foram identificadas em ovinos no Brasil. A 

diversidade de espécies que parasitam os animais é influenciada pela frequência de 

tratamentos anti-helmínticos, pelo manejo e pelas condições ambientais. No Sul do 

Brasil, por exemplo, as temperaturas baixas do inverno favorecem a ocorrência de 

Teladorsagia circumcincta, espécie que não tem sido registrada em ovinos criados em 

outras regiões do país (Amarante, 2014). Além dessa espécie, ainda é comum a 

ocorrência de Nematodirus spp. e Oesophagostomum venulosum (Ramos et al., 

2004). Porém, no Rio Grande do Sul, a exemplo dos demais estados brasileiros, H. 

contortus é a espécie predominante, especialmente nos meses de verão, enquanto 

que Trichostrongylus spp. e T. circumcincta predominam nos períodos com baixas 

temperaturas, nos meses de inverno e primavera, quando causam problemas clínicos 

e redução na produtividade dos ovinos (Echevarria et al., 1996). 

No estado de São Paulo, Vieira et al. (1989) realizaram estudos 

epidemiológicos nos quais 100% das infecções correspondeu a H. contortus seguido 

por 85% Trichostrongylus colubriformis, 69% Oesophagostomum columbianum, 50% 

Cooperia punctata, 12% Cooperia pectinata e 3,8% Trichuris ovis. Amarante e 

Barbosa (1995) constataram que em Botucatu, SP, os gêneros de helmintos de maior 

ocorrência foram Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Cooperia spp., 

Oesophagostomum spp. e Strongyloides papillosus, acometendo bovinos e ovinos 

adultos, e Haemonchus spp., Oesophagostomum spp. e Trichostrongylus spp. em 

cordeiros antes do desmama. Bassetto et al. (2009), durante o período de novembro 

de 2007 a julho de 2008, verificaram que na pastagem da região de Botucatu, 

predominavam larvas de Haemonchus spp., Trichostrongylus spp. e 

Oesophagostomum spp. Rocha et al. (2008) citam H. contortus e T. colubriformis 

como as espécies mais prevalentes na região de Tupi Paulista. 

 
  



4 

 
 

1.2.2 A resistência parasitária aos anti-helmínticos 

As helmintoses em pequenos ruminantes continuam em aumento devido aos 

altos níveis de resistência anti-helmíntica (RA), atual cenário em quase todos os 

países do mundo com grande número de ovinos (Kaplan e Vidyashankar, 2012). A 

resistência desenvolve-se quando os parasitas sobrevivem ao tratamento e 

transmitem genes associados à resistência aos seus descendentes. Com a seleção e 

reprodução adicionais, estes genes aumentam em frequência na população. Para que 

a resistência se desenvolva em uma espécie, parasitas com genes de resistência 

devem sobreviver ao tratamento, continuar a se reproduzir e seus descendentes 

serem transmitidos para o hospedeiro seguinte (Sangster et al., 2018). 

O primeiro relato de resistência ocorreu em 1957 (Drudge et al., 1957a, b). 

Detectou-se resistência de H. contortus aos benzimidazóis (BZs) em ovinos e foi o 

primeiro registro de uma droga moderna em animais de produção. A resistência ocorre 

em várias espécies de NGI, porém H. contortus demonstrou maior capacidade de 

desenvolver RA (Gilleard, 2013). Em muitos casos, a resistência apareceu menos de 

10 anos após a introdução de uma nova classe de medicamentos (Waller, 1994). As 

populações de campo desta espécie agora mostram resistência a todas as classes de 

drogas anti-helmínticas (Gilleard, 2013). Essa situação, associada ao aparecimento 

precoce de resistência ao monepantel, ameaçam a sustentabilidade dos sistemas de 

produção de ovinos e caprinos em todo o mundo (Kotze e Prichard, 2016). 

O desenvolvimento de RA ocorreu globalmente, mas os padrões diferem de 

região para região. É provável que essa variação esteja ligada a fatores conhecidos 

que aumentam a resistência, tais como padrões de uso de anti-helmínticos (por 

exemplo, maior número de tratamentos por intervalo de tempo), decisões de manejo 

(por exemplo, usando drogas de uma única classe), raças (por exemplo, raças com 

baixa imunidade podem exigir mais tratamentos), além da perda da proporção de 

vermes na população que não são expostos às drogas (Sangster et al., 2018). 

 

1.2.2.1 Resistência aos anti-helmínticos na América do Sul 

No final da década de 90, a América do Sul registrou indiscutivelmente os níveis 

mais altos e espacialmente mais difundidos de RA em criações de pequenos 



5 

 
 

ruminantes no mundo (Waller, 1997). Levantamentos realizados no norte da Argentina 

(Eddi et al., 1996), sul do Brasil (Echevarria et al., 1996), Paraguai (Maciel et al., 1996) 

e Uruguai (Nari et al., 1996) indicaram que os BZs e imidazotiazóis haviam quase 

alcançado o fim de sua vida terapêutica nesses países, o que continua até os tempos 

atuais (Kaplan e Vidyashanka, 2012; Salgado e Santos, 2016). 

Após o primeiro relato de RA em ovinos no Brasil (Dos Santos e Gonçalves, 

1967), multiplicaram-se os relatos de nematoides resistentes a todos os fármacos 

comercialmente utilizados. Na região Sul, a resistência foi detectada no Paraná 

(Thomaz-Soccol et al., 2004), Santa Catarina (Ramos et al., 2004) e novamente no 

Rio Grande do Sul (Echevarria e Trindade, 1989; Echevarria et al., 1996). Na região 

Sudeste foram observados relatos em São Paulo (Verissímo et al., 2002). No 

Nordeste, suspeitou-se de nematoides resistentes inicialmente em caprinos no Ceará 

(Vieira et al., 1989) e posteriormente outros relatos em caprinos e ovinos ocorreram 

(Vieira e Cavalcante, 1999; Melo, 2001). Ainda no Ceará, foi observada a presença 

de H. contortus resistente em ovinos provenientes do Paraná e Rio Grande do Sul 

(Vieira et al., 1992), o que facilitou a disseminação da resistência para todo o país. 

Estudos também indicaram RA em Pernambuco, Bahia e Alagoas (Charles et al., 

1989; Barreto e Silva, 1999; Bispo et al., 2002). 

No Brasil, muitos produtos contendo combinações de diferentes anti-

helmínticos mostraram-se quase ineficazes como resultado da disseminação da RA 

(Da Cruz et al., 2010; Molento et al., 2011). Estudos conduzidos por Almeida et al. 

(2010) e Cezar et al. (2010) identificaram populações de Haemonchus spp. e 

Trichostrongylus spp. com RA a múltiplas drogas, como IVM e moxidectina por 

exemplo, resultando em eficácia aproximada de 1% para ambas drogas. 

Baixa eficácia do MPT em H. contortus foi detectada no Uruguai por Mederos 

et al. (2014) e no Brasil (Martins, 2016; Albuquerque et al., 2017; Mallman Junior et 

al., 2018; Ramos et al., 2018). 

 

1.2.2.2 Resistência aos anti-helmínticos na América do Norte  

Na América do Norte, embora a ovinocaprinocultura não fosse muito 

representativa, pesquisas conduzidas na década de 1990 indicaram elevada RA para 

os BZs (Uhlinger et al., 1992). Nos estados do sul de Louisiana e Flórida detectaram 



6 

 
 

RA para todos os anti-helmínticos. A criação de raças importadas de ovinos se tornou 

difícil de manter por causa das mortalidades devidas a H. contortus (Waller, 1997).   

No sudeste dos Estados Unidos, um estudo de prevalência de RA em fazendas 

de ovinos e caprinos mostrou populações de H. contortus resistentes a BZs, levamisol 

(LEV), IVM e moxidectina (Howell et al., 2008; Tsukahara et al., 2017). Esses achados 

corroboram relatos anteriores de RA múltipla em ovinos e caprinos por Zajac e Gipson 

(2000) e Terrill et al. (2001), o que levou à fundação do grupo multidisciplinar ACSRPC 

(Consórcio Americano para Pequenos Ruminantes para Controle de Parasitas), 

dedicado ao desenvolvimento de sistemas sustentáveis de manejo de NGI, 

recomendando o uso do método FAMACHA© e de pastagens com propriedades anti-

helmínticas. 

Relatos em Ontário, Canadá, mostraram inicialmente que a RA era baixa em 

rebanhos ovinos, como consequência de: (1) Baixa necessidade de tratamento devido 

às temperaturas extremas, que geralmente limitam o desenvolvimento de larvas; (2) 

Diversidade nas práticas de manejo; (3) Uso menos frequente de anti-helmínticos em 

comparação com outros países; e (4) Menor quantidade de fazendas e de animais 

nos rebanhos comparado a outros países (Guthrie et al., 2010). Entretanto, um estudo 

recente de Falzon et al. (2013), também em Ontário, registrou falha na eficácia de 

ivermectina em 88% das 39 fazendas estudadas. Além disso, uma investigação 

subsequente nas mesmas propriedades indicou 97% (28/29), 95% (19/20) e 6% (1/17) 

de resistência à IVM, fenbendazol e LEV, respectivamente, em H. contortus (espécie 

majoritária identificada nas coproculturas pós-tratamento). 

 

1.2.2.3 Resistência aos anti-helmínticos na África  

Os estudos de monitoramento de RA na África, embora poucos, sugerem 

motivo de preocupação (Vatta e Lindberg, 2006). No Quênia, 50% das 42 fazendas 

de pequenos ruminantes pesquisadas mostraram RA (Wanyangu et al., 1996). Em um 

estudo realizado em fazendas comerciais de ovelhas no Zâmbia, a RA ao albendazol 

foi encontrada em cinco das seis propriedades avaliadas (Gabriel et al., 2001). Um 

dos grandes problemas na África foi o rápido desenvolvimento de RA para o 

monepantel (MPT), que ocorreu praticamente tão rapidamente quanto para a 

ivermectina (IVM) (Scott et al., 2013; Love, 2014). 



7 

 
 

Na África do Sul, o primeiro registro de RA está entre os primeiros para o 

continente (Berger, 1975) e, desde então, tem se manifestado de forma variada e 

rápida (van Wyk et al., 1998). Assim como em outros países, a RA foi considerada 

uma situação de crise, pois envolveu praticamente todos os anti-helmínticos 

disponíveis na época (van Wyk et al., 1999; van Wyk, 2001). As espécies de NGI nas 

quais se verificou RA foram H. contortus (Berger, 1975; van Wyk e Malan, 1988), T. 

colubriformis (van Wyk et al., 1990), T. circumcincta (van Schalkwyk et al., 1983) e 

Moniezia expansa (Visser et al, 1987).   

Ocorreram relatos RA em H. contortus na África do Sul para as lactonas 

macrocíclicas (IVM), salicilanilidas (ambos rafoxanida e closantel) e substitutos 

fenólicos (nitroxinil e dinitrofenol) (van Wyk e Geber, 1980; van Wyk et al., 1982; 

Carmichael et al., 1987; van Wyk e Malan, 1988; van Wyk et al., 1997). No caso das 

lactonas macrocíclicas (LMs), duas populações diferentes de H. contortus foram 

relatadas como resistentes à IVM três anos após o medicamento ter sido registrado 

para uso em ovelhas na África do Sul (Carmichael et al., 1987; van Wyk e Malan, 

1988; van Wyk et al., 1989). Isto levou a uma hipótese de resistência cruzada entre 

grupos anti-helmínticos por van Wyk et al. (1989), sendo os BZs o candidato mais 

provável em relação às LMs (Mottier e Prichard, 2008). Por outro lado, Leathwick et 

al. (2009) e Bartram et al. (2012) consideraram que não há uma indicação clara da 

ocorrência de resistência cruzada. 

 

1.2.2.4 Resistência aos anti-helmínticos na Ásia 

Em todas as regiões do sudeste da Ásia e do Pacífico Sul, devido ao rápido 

desenvolvimento e intensificação das indústrias de pequenos ruminantes, o uso 

intensivo de anti-helmínticos para o controle de nematoides resultou em aumento na 

prevalência e no nível de RA (Waller, 1997). Levantamentos diagnosticaram RA para 

BZ e LEV em Fiji, RA emergente para IVM (Le Jambre, 1994), e situação semelhante 

na Malásia (Dorny et al., 1994; Chandrawathani et al., 2011). Na Índia RA múltipla em 

NGI foi detectada para BZs, IVM e LEV (Gill, 1993; Easwaran et al., 2009). 

 

  



8 

 
 

1.2.2.5 Resistência aos anti-helmínticos na Austrália 

A RA também é um problema sério na Austrália. Duas décadas atrás pesquisas 

regionais mostravam que aproximadamente 80% das populações de NGI nas 

fazendas tinham RA tanto para BZs como para imidazotiazóis (Waller et al., 1995). A 

resistência amplamente disseminada de H. contortus à salicilanilida e ao closantel foi 

documentada por Rolfe (1993), possivelmente devido ao seu uso extensivo durante o 

programa “WormKill” (Dash et al., 1985) nas regiões chuvosas da Austrália (van Wyk, 

2001, 2006).  

Um estudo atual de resistência, após um período de quase 20 anos, revelou 

níveis inesperadamente altos e crescentes de resistência aos ativos mais amplamente 

utilizados: 54% para moxidectina e 96% para BZs e LEV (Playford et al., 2014). É 

preocupante que o primeiro caso de resistência ao MPT, lançado na Austrália na 

primavera de 2010, também já tenha sido confirmado (Love, 2014; Constantinoiu et 

al., 2015). 

Na Nova Zelândia, RA para os BZs, imidazotiazóis e LMs está amplamente 

difundida em fazendas de ovinos (Hughes et al., 2005; 2007; Waghorn et al., 2014) e 

mais grave em fazendas de caprinos (West et al., 2004). O primeiro caso de RA para 

o MPT foi registrado em T. colubriformis e T. circumcincta, poucos anos após o seu 

lançamento (Scott et al., 2013). 

 

1.2.2.6 Resistência aos anti-helmínticos na Europa 

Numerosos países europeus diagnosticaram RA, principalmente aos BZs e aos 

imidazotiazóis, e subsequentemente, um número crescente de casos de resistência 

às LMs (Papadopoulos, 2008; Papadopoulos et al., 2012).  

No Reino Unido, RA foi documentada para os BZs (Mitchell et al., 2011) e o 

mecanismo de seleção para a resistência foi recentemente caracterizado por Morrison 

et al. (2014), tanto genotipicamente como fenotipicamente. Também há relatos de 

resistência múltipla ao BZ, LEV e avermectina em T. circumcincta (Sargison et al., 

2010a).  

Na Escócia, a resistência a BZs, imidazotiazóis e LMs, separadamente e em 

combinação, foi diagnosticada (Sargison et al., 2010b), enquanto no País de Gales, 



9 

 
 

100 das 122 fazendas pesquisadas foram positivas para RA a BZs, LEV ou ambos 

(Mitchell et al., 2010). Em rebanho irlandês de ovelhas comerciais, Good et al. (2012) 

relataram RA em populações de NGI tanto para BZs (>88% do rebanho) quanto para 

LEV (>39% do rebanho), enquanto para LMs suspeitou-se de resistência em 11% das 

fazendas. 

No nordeste da Espanha, de 107 fazendas de ovelhas pesquisadas, 11% foram 

resistentes aos BZs (Calavia et al., 2011). Em outro estudo, também na Espanha, a 

falha do tratamento foi documentada em 40,8%, 20,8% e 9,6% das fazendas para 

LEV, IVM e BZs, respectivamente (Martínez-Valladares et al., 2011).  

Cernansta et al. (2006) encontraram RA em 4% e 23% das fazendas testadas 

na Eslováquia para BZs e IVM, respectivamente, enquanto na Holanda, Borgsteede 

et al. (1997; 2007; 2010) relataram RA para BZs, IVM e doramectina em fazendas de 

ovinos e posteriormente para moxidectina e MPT (van den Brom et al., 2013, 2015).  

Na Itália, a resistência ao LEV e à IVM foi registrada (Traversa et al., 2007). No 

oeste da França, RA aos BZs foram detectadas em 83% das fazendas. Em 50% das 

fazendas ocorreu RA para o LEV, afetando principalmente Teladorsagia, 

Trichostrongylus e Cooperia spp (Chartier et al.,1998). Na Grécia, Papadopoulos et 

al. (2001), utilizando testes in vitro, encontraram populações de Teladorsagia sp. 

resistentes ao BZ, enquanto que, no mesmo país, Gallidis et al. (2011) relataram a 

presença de populações de H. contortus 100% homozigóticas, resistentes ao BZ em 

rebanhos ovinos de leite.  

Embora as investigações sobre RA na União Europeia tinham como foco 

principal os NGI de pequenos ruminantes, problemas também foram registrados em 

bovinos (Stafford e Coles, 1999; Demeler et al., 2009; Kleinschmidt et al., 2010; Taylor, 

2010; Rose et al., 2015). 

 

1.2.3 Consequências da resistência anti-helmíntica  

Outra preocupação com o fenômeno da resistência aos anti-helmínticos está 

relacionada aos danos ambientais dos resíduos (Morgan et al., 2019). Seu impacto no 

meio ambiente pode ser detectado na fauna não-alvo (Cooke et al., 2017). Os efeitos 

no ambiente e nos sistemas de agricultura agroecológica, precisam ser bem 

compreendidos em relação aos benefícios do tratamento anti-helmíntico (Verdú et al., 



10 

 
 

2018). Os prejuízos diretos da RA incluem o custo do medicamento, o uso intenso de 

mão-de-obra na administração do medicamento (usualmente ineficaz) e a redução da 

produção de carne e leite por hectare e por animal. No entanto, é provável que haja 

muitos outros prejuízos econômicos e ambientais indiretos, uma vez que serão 

necessários mais animais para produzir a mesma quantidade de alimentos (Herrero 

et al., 2015). Gerar essas percepções e integrá-las em estruturas econômicas tem 

grande potencial para apoiar programas sustentáveis de controle de helmintos nos 

níveis agrícola, regional e nacional. A valorização da sustentabilidade e os benefícios 

econômicos do controle dos helmintos nos sistemas agrícolas menos rentabilizados 

continuam a ser um desafio (Perry e Randolph, 1999). 

A elevada frequência de tratamentos anti-helmínticos, muitas vezes 

desnecessária, leva a um risco crescente de resíduos nos alimentos, aumento da 

resistência e diminuição dos medicamentos úteis disponíveis (Kinsella et al., 2008). 

Podem ocorrer resíduos de BZs nos tecidos dos animais devido a vários 

fatores: produtos inadequados para aquela espécie animal, uso de dose não 

recomendada, período de carência não observado ou consomo de ração contaminada 

pelos animais (Danaher et al., 2007). Os resíduos dependem da droga utilizada, via 

de administração, tecido alvo ou tempo decorrido desde o tratamento. Os limites 

máximos de resíduos (LMR) para medicamentos relacionados aos BZs foram 

estabelecidos em 100 µg/Kg para leite, músculo e gordura, 500 µg/Kg para rim, e 1000 

µg/Kg para o fígado nas espécies bovina e ovina (EEC, 1990). O mebendazol e o 

triclabendazol são os BZs identificados como os mais persistentes em tecidos animais. 

Em estudos realizados em ovelhas tratadas com uma dose oral de febendazol (5 

mg/Kg PV) detectou-se valores acima do LMR 7 dias após o tratamento (EMEA, 

1997a, b). 

O metabolismo das LMs em tecidos animais é bem descrito. Foi demonstrado 

que os medicamentos deste grupo químico utilizados por vias parentais são os 

principais resíduos encontrados nos tecidos dos animais (Danaher et al., 2006). 

Verificou-se que os resíduos de LMs ocorrem no fígado e nos tecidos gordurosos em 

níveis mais altos do que nos tecidos renais e musculares. Campbell et al. (1985) 

mostraram que a IVM não é extensivamente metabolizada em mamíferos e 90% da 

dose é excretada nas fezes. O medicamento é responsável por pelo menos 50% do 



11 

 
 

total de resíduos nos tecidos de bovinos, ovinos, suínos e ratos até 14, 5, 7 e 3 dias 

após o tratamento, respectivamente. Os principais metabólitos da IVM no fígado de 

bovinos, ovelhas e ratos foram identificados como 24-hidroximetil-H2B1α e o 

monossacarídeo 24-hidroximetil-H2B1α (Campbell et al., 1985; Danaher et al., 2006). 

Em ovelhas tratadas com doramectina via parental o medicamento representou 67-

92% do total de resíduos na gordura, fígado, rim e músculo, 14 dias após o tratamento 

(EMEA, 1997c). Afzal et al. (1997) descobriram que a moxidectina representava 91, 

51, 52 e 92% do total de resíduos nos tecidos adiposo, hepático, renal e muscular de 

ovelhas, respectivamente. A IVM não é licenciada para uso em espécies em lactação 

na união europeia, entretanto, Alvinerie et al. (1993) e Cerkvenik et al. (2002) 

constataram que os níveis de IVM (200 µg/Kg PV) atingiram uma concentração 

máxima de 23 µg/Kg no leite de ovelha 1,3 dias após o tratamento e os resíduos foram 

detectáveis 23 dias após o tratamento. 

 

1.2.4 Estratégias para retardar a resistência aos anti-helmínticos  

Na atualidade existem diferentes estratégias de manejo com o objetivo de 

prevenir a infecção e/ou reduzir a pressão de seleção dos anti-helmínticos. Isso inclui 

manejo de pastagens e abrigo e quarentena para animais recém-introduzidos em 

rebanho. O objetivo geral é reduzir a necessidade de anti-helmínticos e, 

consequentemente, retardar o desenvolvimento de resistência.  

Uso correto dos anti-helmínticos: as recomendações de uso racional atualmente 

estabelecidas são geralmente baseadas em uma compreensão profunda da 

epidemiologia parasitária (Sargison, 2011). Têm como objetivo geral direcionar o 

tratamento de modo a reduzir a exposição desnecessária (tratamento seletivo) e, 

assim, limitar o risco de resistência. A sub-dosagem e/ou o uso frequente de anti-

helmínticos pertencentes à mesma classe aumentarão o risco de seleção de 

resistência. Recomenda-se que os anti-helmínticos de ação prolongada sejam 

aplicados apenas em situações em que a estação de pastejo é mais longa do que a 

duração do efeito (Rathbone e McDowell, 2012). A manutenção da refugia através da 

implementação de rotinas adequadas de tratamento anti-helmíntico e gestão de 

pastagens é importante para diminuir a pressão de seleção e reduzir o risco de 

desenvolvimento de resistência (Muchiut et al., 2018). 



12 

 
 

Refugia: visa manter proporção baixa de NGI resistentes dentro da população e, 

portanto, é defendida como uma ferramenta para retardar o avanço da resistência anti-

helmíntica (Van Wyk, 2001; Sargison, 2011; Muchiut et al., 2018; Forbes, 2019). 

Parasitas em refugia são aqueles que não foram expostos a um anti-helmíntico, 

incluindo aqueles presentes como estágios de vida livre no ambiente, indivíduos não 

tratados, e aqueles em qualquer fase do ciclo de vida no hospedeiro que não são 

afetados pelo tratamento anti-helmíntico. O conceito de refugia é amplamente aceito, 

mas ainda está cercado por várias suposições, como a dependência do nível de 

refugia às circunstâncias prevalecentes (por exemplo, climáticas) (Cornelius et al., 

2016). A refugia como conceito tem sido aplicado principalmente aos NGI, mas seu 

papel no manejo da resistência em outros helmintos requer mais pesquisas 

(Hodgkinson et al., 2019; Morgan et al., 2019). Além disso, não está claro seu papel 

na inversão da RA (Leathwick et al., 2015), assim como seu uso nas estratégias de 

substituição de populações parasitárias para recuperar a suscetibilidade anti-

helmíntica nas propriedades (Kenyon et al., 2013; Muchiut et al., 2018).  

Uso de produtos anti-helmínticos de ação múltipla: ainda está em discussão se os 

produtos que contêm duas ou mais substâncias ativas direcionadas para o mesmo 

helminto, mas com diferentes modos de ação, podem ser vantajosos no que diz 

respeito a desacelerar o surgimento de resistência. Estudos de modelagem e alguns 

dados de campo indicaram que tais produtos podem retardar o desenvolvimento de 

resistência a novas substâncias ativas (Learmount et al., 2012; Leathwick, 2012; 

Leathwick et al., 2012) ou retardar o desenvolvimento de resistência anti-helmíntica a 

classes de anti-helmínticos existentes (Leathwick e Hosking, 2009; Leathwick et al., 

2015). No entanto, o uso de anti-helmínticos de ação múltipla também pode selecionar 

RA múltipla (Leathwick e Besier, 2014). Se esses produtos oferecem um benefício em 

relação ao desenvolvimento de RA, que superaria o risco de promover RA múltipla, 

isso deve ser mais fundamentado.  

1.2.5 Diagnóstico da resistência anti-helmíntica por testes in vitro 

Há um consenso na comunidade científica de que os programas de controle de 

nematoides e o retardo da RA dependem da disponibilidade de testes sensíveis e 

eficazes para a detecção da resistência (Taylor et al., 2002). Neste contexto, o 



13 

 
 

conhecimento prematuro do status de resistência nas propriedades é importante para 

a manutenção da atividade dos grupos químicos que ainda são eficazes. Já que o 

diagnóstico da resistência é possível de ser estimado in vitro, a caracterização de 

isolados é imperativa para o estabelecimento de valores de referência e para que esse 

diagnóstico se torne menos dependente dos experimentos in vivo (Chagas et al., 

2013).  

Como os criadores necessitam de uma medida confiável do grau de resistência 

presente em seus rebanhos, o desenho experimental apropriado do teste para os 

gêneros de NGI que infectam os animais será importante. O monitoramento do status 

de resistência anti-helmíntica e a adoção de recomendações racionais para prevenir 

o estabelecimento da resistência a determinado grupo químico, podem ser 

consideradas ferramentas extremamente úteis. Assim, o monitoramento da 

resistência anti-helmíntica é uma chave para atrasar o desenvolvimento de 

resistência, preservar classes anti-helmínticas e talvez promover a reversão em 

direção à susceptibilidade, o que pode ser considerado de grande interesse para a 

indústria de drogas veterinárias.  

Há uma grande necessidade de ampliar nosso conhecimento sobre as forças 

motrizes do desenvolvimento da RA, para estabelecer ferramentas de detecção de 

resistência aplicáveis e significativas no campo e, assim, fornecer informações mais 

atualizadas e confiáveis sobre a ocorrência da RA (Morgan et al., 2019). Em uma era 

de revolução de tecnologia nas indústrias de diagnóstico, melhorias dos testes ou, 

eventualmente, automação, têm grande potencial para permitir diagnóstico mais 

rápido, eficiente e precoce. 

O uso de bioensaios in vitro com os estágios de vida livre dos nematoides 

representa uma alternativa para medir a sensibilidade a anti-helmínticos e, portanto, 

detectar que a resistência está surgindo. Esses bioensaios são muito mais baratos 

que os ensaios in vivo, relativamente rápidos, evitam quaisquer efeitos de animais 

hospedeiros e algumas das imprecisões associadas ao Teste de redução da 

contagem de ovos nas fezes (TRCOF). Além disso, tais testes podem usar uma gama 

de concentrações do fármaco a fim de verificar seu efeito na população de NGI, por 

exemplo, a concentração que mata 50% da população exposta (valores CL50). 

 



14 

 
 

1.2.5.1 Teste de eclosão de ovos – TEO 

Esse método foi inicialmente descrito por Le Jambre (1976) para detectar RA 

aos BZs em H. contortus e T. circumcincta. Posteriormente, um protocolo padronizado 

foi adotado pela WAAVP (Coles et al., 1992). O TEO mede o efeito dos BZs na inibição 

da embriogênese e na eclosão das larvas. O tiabendazol foi elencado para o ensaio 

devido à sua maior solubilidade em meio aquoso em comparação com alguns outros 

compostos do grupo dos BZs. Posteriormente, Dobson et al. (1986) adaptaram o 

ensaio para detectar resistência ao LEV.  

A utilização do TEO para detecção de resistência a BZ em isolados a campo 

foi descrita por Coles et al. (1992). Mais tarde estabeleceu-se a dose discriminante 

como a dose da droga que inibe a eclosão de 99% dos ovos susceptíveis. As doses 

discriminantes foram estabelecidas usando isolados susceptíveis de H. contortus, T. 

circumcincta e Trichostrongylus colubriformis (Coles et al., 2006). Os dados atuais 

sugerem que uma dose de 0,1 µg/mL de tiabendazol pode inibir a eclosão dos ovos 

em 99% dessas espécies (Coles et al., 2006).  

Em estudo de padronização entre laboratórios da Europa foi proposto um 

protocolo padrão para a detecção de resistência aos BZs (von Samson-Himmelstjerna 

et al., 2009a). A maioria dos estudos que avaliaram o uso do TEO para a detecção de 

nematoides resistentes aos BZs mostrou uma boa concordância com os resultados 

obtidos com o TRCOF em ovinos (Díez-Baños et al., 2008) e bovinos (Demeler et al., 

2012). 

 

1.2.5.2 Testes de desenvolvimento larvar– TDL 

O teste de desenvolvimento larvar (TDL) mede os efeitos de diferentes drogas 

anti-helmínticas no desenvolvimento de ovos a larvas infectantes de terceiro estágio 

(L3) (Hubert e Kerboeuf, 1992). Várias adaptações já foram descritas, mas geralmente 

o cultivo ocorre em meio líquido (Taylor, 1990; Hubert e Kerboeuf, 1992) ou em ágar 

1 % (Gill et al., 1995; Coles et al., 2006; Dolinská et al., 2012).  

Vários estudos mostraram que o ensaio é capaz de discriminar entre isolados 

de H. contortus que são susceptíveis ou resistentes às principais classes de anti-

helmínticos (Gill et al., 1995; Dolinska et al., 2013; Kotze et al., 2014b, 2018). O TDL 



15 

 
 

também é capaz de detectar resistência das larvas ao organofosforado naftalofós 

(Kotze et al., 1999). Recentemente, Raza et al. (2016) demonstraram que o TDL 

também permite a diferenciação entre isolados susceptíveis e resistentes ao MPT. 

O TDL é considerado sensível e prático, permitindo a avaliação da eficácia de 

mais de um grupo químico ao mesmo tempo, e não depende de ovos embrionados 

(Kaplan et al., 2007). Os resultados podem ser comparados com isolados de 

referência (susceptíveis e resistentes), de modo que é possível determinar a CL50 e 

anular a interferência inter-ensaios (Craven et al., 1999). Muitos estudos 

demonstraram boa correlação entre o TRCOF e a CL50 discriminatória para a 

resistência obtida in vitro (Várady et al., 2006; Kaplan et al., 2007; Díez-Baños et al., 

2008; Taylor et al., 2009).  

Gill et al. (1995) adaptaram o TDL para detectar RA às avermectinas e 

milbemicinas, o que levou ao lançamento de um teste hoje disponível no mercado, 

DrenchRite®. O teste é eficaz para BZs, levamisole e lactonas macrocíclicas em H. 

contortus e as outras espécies importantes na Austrália, no entanto, teve um 

desempenho muito ruim para a última classe de medicamentos em T. circumcincta. 

Assim, ele foi retirado do mercado na Austrália porque não era aplicável a outras 

espécies (Kotze e Prichard, 2016).  

 

1.2.5.3 Teste de motilidade e migração larvar – TML 

Os testes de motilidade e migração larvar podem ser usados para avaliar o 

efeito dos anti-helmínticos que causam paralisia na musculatura somática dos 

parasitas. A motilidade de larvas pode ser determinada por meio de observação visual, 

detectores eletrônicos (instrumentos que medem o grau de refração da luz e fornecem 

um índice de motilidade) ou migração através de peneiras. Estes ensaios são 

frequentemente usados como ferramentas de triagem em programas de descoberta 

de novas drogas, além de serem também aplicados para a detecção de RA (Gill e 

Lacey, 1998; d’Assonville et al., 1996; Molento e Prichard, 2001; Kotze et al., 2006; 

Fortes et al., 2013; Kotze e Prichard, 2016), visto que os testes a campo têm uso 

limitado. Por isso, muitas variações de protocolo foram descritas.  

Em comparação ao TDL, o TML é um teste fácil e simples, possível de ser 

realizado na maioria dos laboratórios. Além disso, requer larvas de terceiro estágio, 



16 

 
 

que podem ser facilmente obtidas a partir de coproculturas, e mantidas em geladeira 

(Demeler et al., 2010a). O uso deste teste para detecção de resistência às LMs foi 

padronizado para diferentes espécies de nematoides, com amostras coletadas em 

ovinos e bovinos (Demeler et al., 2010b). Entretanto, sua utilidade para detecção de 

níveis baixos de resistência permanece desconhecida.  

 

1.2.5.4 Testes moleculares 

Os avanços na compreensão da base molecular da resistência de H. contortus 

a determinados anti-helmínticos levaram ao desenvolvimento de testes para o 

diagnóstico molecular de RA. Esta área de pesquisa tem sido foco do grupo de 

pesquisadores do Consórcio de Resistência e Susceptibilidade Anti-Helmíntica 

(CARS), e o progresso em direção ao desenvolvimento de marcadores moleculares 

tem sido descrito em vários artigos do grupo (Gilleard e Beech, 2007; Prichard et al., 

2007; von Samson-Himmelstjerna et al., 2007; Beech et al., 2011; Kotze et al., 2014a). 

 As possibilidades para o desenvolvimento de tais testes em curto prazo são, no 

entanto, bastante diferentes para as classes químicas, devido ao nível de 

compreensão da natureza molecular dos vários tipos de resistência. Para os BZs, o 

desenvolvimento de testes moleculares foi bem-sucedido, já que é a base química 

mais bem compreendida em nível molecular. Para os outros grupos de fármacos, no 

entanto, a incerteza sobre a natureza específica dos mecanismos de resistência em 

isolados de campo e o fato de que as mudanças moleculares relatadas para alguns 

isolados não ocorreram em outros isolados, atrasaram o desenvolvimento de 

diagnósticos moleculares (Kotze e Prichard, 2016). 

O primeiro fenótipo de resistência descrito vem da evidência de que frações 

enriquecidas com tubulina de NGI resistentes aos BZ ligam menos compostos 

radioativos BZ em comparação com NGI susceptíveis (Sangster et al., 1985), o que 

definiu a tubulina como o local de ação. O segundo foi a demonstração de que NGI 

resistentes a LEV requeria concentrações in vitro mais elevadas para alcançar o 

mesmo efeito na contração muscular (Sangster et al., 1991). Esses NGI também eram 

resistentes ao neurotransmissor acetilcolina, o que indica que a resistência 

provavelmente se deve a mudanças na farmacologia do receptor. Apesar das 

descrições da sequência da subunidade do receptor e das diferenças de transcrição, 



17 

 
 

falta evidência convincente de um genótipo para a resistência ao LEV (Kotze et al., 

2014a) 

Coles et al. (2006) descreveram uma PCR alelo-específica para a detecção de 

polimorfismos únicos de nucleotídeos (SNPs- single nucleotide polymorphism) F200Y 

associado à resistência a BZ em H. contortus usando DNA extraído de larvas L3. 

Outros métodos moleculares também foram descritos para a detecção e quantificação 

deste SNP, assim como os outros dois associados à resistência a BZ (F167Y, E198A), 

incluindo PCR-RFLP (Tiwari et al., 2006; Ghisi et al., 2007), PCR em tempo real 

(Alvarez-Sanchez et al., 2005; Walsh et al., 2007; von Samson-Himmelstjerna et al., 

2009b) e pirosequenciamento (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009b).  

Este último estudo descreveu ensaios de pirosequenciamento para os códons 

de H. contortus 167, 198 e 200 dos isotipos 1 e 2 de β-tubulina (Arafa et al., 2016). O 

método mostrou-se capaz de avaliar o status de resistência a BZ de vários isolados 

de H. contortus, indicando que pode ser adequado para o diagnóstico de rotina de 

resistência nesta espécie. Uma comparação de dados moleculares com dados de 

eclosão de ovos mostrou que o teste molecular nem sempre foi correlacionado com o 

grau de resistência; no entanto, foi capaz de discriminar isolados resistentes e 

susceptíveis. Curiosamente, os SNPs observados nas regiões 200 e 198 (para os 

BZs) também estão associados à resistência à lactonas macrocíclicas (Kotze et al., 

2014a). 

 

1.2.6 Diagnóstico da resistência anti-helmíntica por testes in vivo  

A eficácia dos anti-helmínticos pode ser determinada por testes envolvendo 

contagem de NGI pós-morte, após o tratamento anti-helmíntico, comparando-se 

animais tratados e não tratados (Wood et al., 1995). No entanto, tal procedimento 

requer abate de animais e seu custo é alto, por isso não é amplamente utilizado 

(Fortes e Molento, 2013). O método padrão e mais frequentemente usado para 

estimar a eficácia dos anti-helmínticos contra NGI, incluindo H. contortus, é o TRCOF.   

No TRCOF, populações de parasitas são consideradas susceptíveis quando a 

eficácia do medicamento excede 95%. Por outro lado, a resistência está presente 

quando a eficácia é < 95% (Coles et al., 1992). O ponto de corte de 95% é mais 

complexo do que parece, porque algumas drogas têm eficácia muito alta (99,9%) 



18 

 
 

contra algumas espécies de parasitas, mas menores (95%) para outros no mesmo 

hospedeiro. Portanto, reduções na eficácia requerem interpretação à luz de diferentes 

situações. 

O TRCOF, no entanto, apresenta diversas restrições em termos de 

sensibilidade entre espécies animais, variações individuais e presença de infecções 

múltiplas (Levecke et al., 2012; Traversa e von Samson-Himmelstjerna, 2016; George 

et al., 2017; Wang et al., 2017). Isso ocorre especialmente quando espécies com 

baixas taxas de fecundidade, como por exemplo Trichostrongylus spp., estão 

envolvidas em infecções naturais de ovinos descritas como resistentes aos fármacos 

(Palcy et al., 2010).  

Algumas drogas podem causar uma supressão temporária na postura dos 

ovos, levando a uma superestimativa da eficácia anti-helmíntica, se avaliada nesse 

período. Uma redução superior a 95% no TRCOF indica eficácia do anti-helmíntico, 

mas uma pequena porcentagem de vermes sobreviventes pode indicar resistência, 

que pode aumentar com tratamentos subsequentes (Coles et al., 2006).  

Outras considerações são que as contagens de ovos nas fezes: (1) se 

relacionam com infecções patentes, mas não pré-patentes (Thienpont et al., 1986), 

(2) não fornecem nenhuma informação sobre NGI machos ou imaturos que possam 

estar presentes (McKenna, 1981), e (3) pode ser influenciada pela variação na 

excreção de ovos por NGI adultos (Villanua et al., 2006), idade da população de NGI 

e imunidade, sexo e idade do hospedeiro (Thienpont et al., 1986).  

O TRCOF é considerado um teste laborioso e demorado e, portanto, ensaios 

in vitro têm sido desenvolvidos para a avaliação da RA a diferentes classes de drogas 

(Babják et al., 2018). 

Os próximos capítulos se referem à descrição da otimização do Teste de 

Desenvolvimento Larvar com isolados de H. contortus (Capítulo 2) e à sua validação 

para a detecção da resistência em H. contortus oriundos de rebanhos do estado de 

São Paulo (Capítulo 3). 

 

 

 

 



19 

 
 

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