RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 03/08/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULA ATIVA, PERTENCENTE AO GÊNERO Burkholderia, COM POTENCIAL PARA TORNAR-SE UM NOVO PRODUTO NO CONTROLE BIOLÓGICO Luis Ángel Chicoma Rojas Engenheiro Agrônomo 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULA ATIVA, PERTENCENTE AO GÊNERO Burkholderia, COM POTENCIAL PARA TORNAR-SE UM NOVO PRODUTO NO CONTROLE BIOLÓGICO Discente: Luis Ángel Chicoma Rojas Orientadora: Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Coorientador: Prof. Dr. Manoel Victor Franco Lemos Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) 2023 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Rojas, Luis Angel Chicoma R741i Identificação e caracterização de molécula ativa, pertencente ao gênero Burkholderia, com potencial para tornar-se um novo produto no controle biológico / Luis Angel Chicoma Rojas. -- Jaboticabal, 2023 87 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Coorientadora: Manoel Victor Franco Lemos 1. Controle biológico. 2. Metabolitos secundarios. 3. Spodoptera spp.. 4. Fungos fitopatogenicos. 5. Cromatografia. I. Título. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Luis Ángel Chicoma Rojas, nascido em 14 de maio de 1996 na cidade de Trujillo, Departamento de La Libertad - Peru. Iniciou o curso de Engenharia Agronômica em 2013 na Universidad Privada Antenor Orrego (UPAO), foi monitor das disciplinas de Química Geral e Fisiologia Vegetal, também foi membro do Grupo de Pesquisa em Controle Biológico e do Laboratório de Proteômica, Enzimas e Metabólitos Ativos. Realizou estágio no Laboratório de Entomologia Agrícola e no Laboratório de Fitopatologia da Faculdade de Ciências Agrárias - UPAO, além de estágio obrigatório na empresa Agorindustrial UPAO S.A.C. na área de pesquisa e desenvolvimento. Em 2018 fez estágio internacional por dois anos no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas - UNESP/FCAV, em seguida iniciou o mestrado no programa de Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), no mesmo laboratório, sob a orientação da Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos. DEDICATÓRIA Aos meus queridos pais, Marleni e Cesar, minha querida irmã Amanda e meus avós, Amanda, Pochito, Luis; (in memorian), e Amelia, aos quais certamente jamais serei capaz retribuir todo o apoio, incentivo e ensinamentos. AGRADECIMENTOS A Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, por sua orientação, gentileza, carisma e por me ensinar a seguir em frente apesar das adversidades. Eu a considero como pessoa e como cientista, e não há dúvida de que ela é um exemplo a ser seguido. Ao Prof. Dr. Manoel Victor Franco Lemos, pelo apoio em relação à redação científica e orientação em temas relacionados ao controle biológico. Ao Prof. Dr. André Gonzaga Dos Santos, por abrir as portas de seu laboratório para a realização dos estudos cromatográficos, muito obrigado pela gentileza e entusiasmo com o desenvolvimento do projeto. Ao Steven e ao Winer, por sua orientação e apoio na análise cromatográfica. Ao técnico de laboratório, Dr. João Carlos Campanharo, por seus valiosos ensinamentos relacionados à bioquímica, biologia molecular e microbiologia, e por sua grande gentileza e disposição em ajudar. A minha grande parceira Noelia, por ser um dos meus pilares e motivos de inspiração e admiração. A todos os meus grandes amigos do laboratório, Ana, Tainá, Tatiane, Elizangela, Anne, Cinara, Max, Renato, Gabriela e, em especial a, Natália, Bárbara, Pámela e minha parceira Paula, pela amizade, por compartilharem momentos felizes e pela disposição em ajudar. Vocês me proporcionaram um ambiente de trabalho muito acolhedor e familiar. Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) da FCAV/Unesp, ao corpo docente, pelo apoio, oportunidade de realização do curso e conhecimentos transmitidos. A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Unesp, Câmpus de Jaboticabal pela infraestrutura e apoio fornecidos. A todos os membros da seção de pós-graduação, por seu grande apoio, ajuda e disposição para dar orientações. A todos os meus irmãos da República Xicrete e Bell, por sua amizade e amor. Nunca me esquecerei de nossas anedotas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. E a todos os demais que, direta ou indiretamente, colaboraram para a concretização deste trabalho iii IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULA ATIVA, PERTENCENTE AO GÊNERO Burkholderia, COM POTENCIAL PARA TORNAR-SE UM NOVO PRODUTO NO CONTROLE BIOLÓGICO Resumo – O uso inadequado de produtos químicos para a proteção de cultivos tem consequências negativas, como danos a organismos benéficos, contaminação ambiental, desenvolvimento de resistência, afeta o ser humano, etc., portanto, há necessidade de novas alternativas para o controle de insetos- praga e patógenos de plantas. Assim, o objetivo do projeto foi isolar/purificar metabólitos secundários produzidos pela Burkholderia JBC02 com atividade inseticida sobre Spodoptera frugiperda, bem como estudar os mecanismos diretos de biocontrole da antibiose por meio de substâncias difusíveis e liberação de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sobre diferentes fungos fitopatogênicos. Foram usadas técnicas de cromatografia (SPE, TLC, HPLC) e monitoramento bioguiado para o isolamento de metabólitos secundários. Os ensaios de cultura dupla e de placa sobreposta foram usados para estudar o efeito inibitório das substâncias difusíveis e dos VOCs em oito fungos fitopatogênicos. A atividade antagonista do isolado bacteriano foi corroborada pela visualização das estruturas miceliais dos fungos por microscopia eletrônica de varredura (SEM). Foram obtidas por separação em HPLC oito frações com potencial atividade inseticida, sendo que a fração 2 apresentou 100% de mortalidade; em relação à atividade antagônica, todos os fungos foram inibidos, com valores acima de 50% de inibição e observou-se que os micélios estavam desidratados, com anomalias e superfícies rugosas. Os resultados demonstram que o isolado bacteriano Burkholderia JBC02 possui função multivalente e tem potencial para ser um novo agente de controle biológico e, assim, ser utilizado para o desenvolvimento de biopesticidas. Palavras-chave: controle biológico, Burkholderia, antagonismo, bioinseticida, atividade antifúngica iv Abstract – The inappropriate use of chemical products for crop protection has negative consequences, such as damage to beneficial organisms, environmental contamination, development of resistance, affects humans, etc., therefore, there is a need for new alternatives for the control of insect pests and plant pathogens. Thus, the objective of the project was to isolate/purify secondary metabolites produced by Burkholderia JBC02 with insecticidal activity on Spodoptera frugiperda, as well as to study the direct mechanisms of biocontrol of antibiosis using diffusible substances and release of volatile organic compounds (VOCs) on different phytopathogenic fungi. Chromatography techniques (SPE, TLC, HPLC) and bioguided monitoring were used for the isolation of secondary metabolites. Dual culture and overlay plate assays were used to study the inhibitory effect of diffusible substances as well as VOCs on eight phytopathogenic fungi, the antagonistic activity of the bacterial isolate was corroborated by visualizing mycelial structures of the fungi by scanning electron microscopy (SEM). Eight fractions were isolated with potential insecticidal activity, being fraction 2 the one that showed 100% mortality; about the antagonistic activity, all fungi were inhibited, registering values higher than 50% inhibition and it was observed that the mycelia were dehydrated, with anomalies and rough surface. The results show that the bacterial isolate Burkholderia JBC02 presents a multivalent function having the potential to be a new Biological Control Agent and thus be used for the development of biopesticides. Keyword: biological control, Burkholderia, antagonism, bioinsecticide, antifungal activity v 1 1. CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1.1. Introdução Os agentes de controle biológico bacteriano desempenham um papel fundamental na proteção das plantas contra insetos-praga e patógenos. Sua importância está na capacidade de suprimir com eficácia as populações de pragas e reduzir o impacto dos patógenos nas plantações. Ao contrário dos pesticidas químicos, os agentes de controle biológico são seguros para o meio ambiente e para os seres humanos, o que os torna uma alternativa sustentável e favorável à biodiversidade (He et al., 2021). Os agentes de controle biológico bacteriano usam uma variedade de mecanismos de ação para combater insetos-praga e patógenos de plantas. Algumas bactérias produzem toxinas ou compostos bioativos que são tóxicos para os insetos ou inibem o crescimento de patógenos. Outras bactérias podem competir diretamente com insetos ou patógenos por nutrientes ou espaço, limitando sua capacidade de sobreviver e se reproduzir. Além disso, as bactérias benéficas podem estimular as defesas naturais das plantas, fortalecendo sua resistência a pragas e doenças. Esses mecanismos combinados tornam os agentes de controle biológico bacteriano altamente eficazes no manejo integrado de pragas e doenças na agricultura (Köhl et al., 2019 Legein et al., 2020). Entre os gêneros bacterianos que se mostraram promissores como fonte de novas moléculas bioativas para o controle de pragas de insetos e patógenos de plantas está a Burkholderia. Esse gênero bacteriano demonstrou a capacidade de produzir uma ampla gama de compostos bioativos com atividade inseticida e antifúngica. Essas moléculas podem agir diretamente sobre os insetos, causando danos ao seu sistema nervoso ou interrompendo seus processos biológicos essenciais. Além disso, alguns compostos bioativos da Burkholderia. têm a capacidade de inibir o crescimento de patógenos de plantas, evitando assim a disseminação de doenças. O estudo da Burkholderia como fonte de novas moléculas bioativas representa uma excelente oportunidade para o desenvolvimento de estratégias de controle biológico mais eficientes e sustentáveis para a proteção de culturas agrícolas (Depoorter et al., 2016; Kunakom et al., 2019). 80 3.5. Conclusão Os resultados in vitro do confronto entre a Burkholderia JBC02 e diversos fungos fitopatogênicos sugerem que o isolado bacteriano apresenta dois mecanismos de ação, por um lado, há a produção de moléculas ativas difundidas no meio e, por outro, a liberação de compostos orgânicos voláteis (VOCs), classificando o isolado bacteriano como multivalente e tornando-se um recurso promissor para o desenvolvimento específico de bioinsumos baseados nessa cepa. 81 Referências Alam, K., Islam, M. M., Gong, K., Abbasi, M. 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