Trabalho de Formatura Curso de Graduação em Engenharia Ambiental RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS DA BANANA APLICADOS NAS GERAÇÕES DE BIOCOMBUSTÍVEIS: AVALIAÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO TÉRMICO EM HIDRÓLISE ÁCIDA Isadora Caroline Barbosa Prof(a).Dr(a). Sandra Imaculada Maintinguer Rio Claro (SP) 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Instituto de Geociências e Ciências Exatas Câmpus de Rio Claro ISADORA CAROLINE BARBOSA RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS DA BANANA APLICADOS NAS GERAÇÕES DE BIOCOMBUSTÍVEIS: AVALIAÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO TÉRMICO EM HIDRÓLISE ÁCIDA Trabalho de Formatura apresentado ao Instituto de Geociências e Ciências Exatas - Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, para obtenção do grau de Engenheiro Ambiental. Rio Claro - SP 2024 ISADORA CAROLINE BARBOSA RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS DA BANANA APLICADOS NAS GERAÇÕES DE BIOCOMBUSTÍVEIS: AVALIAÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO TÉRMICO EM HIDRÓLISE ÁCIDA Trabalho de Formatura apresentado ao Instituto de Geociências e Ciências Exatas - Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, para obtenção do grau de Engenheiro Ambiental. Comissão Examinadora Sandra Imaculada Maintinguer Marcus Cesar Avezum Alves de Castro Danieli Fernanda Canaver Marin Rio Claro, 27 de Novembro de 2024. Assinatura do(a) aluno(a) Assinatura do(a) orientador(a) AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer à minha orientadora, Prof(a). Dr(a). Sandra Imaculada Maintinguer pela orientação ao longo deste processo de desenvolvimento do projeto. A minha família e aos meus colegas de curso, pelo companheirismo e troca de experiências que enriqueceram minha formação. A amizade e o apoio de vocês foram fundamentais para superar os desafios encontrados ao longo do caminho. Agradeço ao apoio financeiro através do Processo n° 2023/16410-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp). Aos professores do curso de Engenharia Ambiental da “Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho” de Rio Claro, pela excelência no ensino e por compartilharem seus conhecimentos e experiências, contribuindo significativamente para a minha formação. Por fim, agradeço a todos os professores e funcionários do IPBEN, colegas e instituições que forneceram apoio técnico e recursos fundamentais para a conclusão deste estudo e a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. A cada um de vocês, minha eterna gratidão. RESUMO O Brasil é o quarto maior produtor de banana do mundo, com 6,6 milhões de toneladas produzidas em 455 mil hectares. Durante o processamento dessa fruta uma grande quantidade de resíduos é gerada, sendo eles responsáveis por elevarem os custos de produção. Um dos métodos de reaproveitamento desse resíduo para as indústrias pode ser a sua aplicação no aproveitamento desses resíduos para a produção de biogás a partir de processos biológicos anaeróbios. A produção de biogás a partir de resíduos da fruticultura nacional pode se mostrar mais eficiente após o pré-tratamento térmico e ácido onde açucares podem ser liberados. Com isso, o presente projeto avaliou a eficiência do pré-tratamento térmico com adição de ácido acético em resíduos do processamento da banana codigeridos com esgoto sanitário objetivando a liberação de açucares e assim elevar a geração de biogás em reatores anaeróbios em batelada. Foram realizados ensaios de produção de hidrogênio e de metano em 2 etapas integradas, visando o aproveitamento total da matéria orgânica contida em tais resíduos. Inicialmente foi realizada a caracterização do substrato e foi verificado 257,67 g DQO total/ L ,186,67 g DQO solúvel/L, sólidos totais (2,75g/L), sólidos fixos totais (0,52g/L), sólidos voláteis totais (2,23g/L) e carboidratos totais (134,0 g/L). O inóculo foi caracterizado em análises de sólidos totais (0,95g/L), sólidos fixos totais (0,11g/L) e sólidos voláteis totais (0,84g/L). Inicialmente o inóculo foi pré-tratado termicamente e a seguir enriquecido em meio de cultivo especifico para a fermentação para ser utilizado nos reatores acidogênicos. De modo similar, o lodo granular foi enriquecido previamente, em meio de cultivo específico para a metanogênese, para ser inoculado nos reatores metanogênicos. A seguir, foram testados pré-tratamento térmico e ácido no resíduo industrial da banana, em adições nas proporções de 5%, 7% e 10% de ácido acético, separadamente. A partir da hidrolise dos resíduos o ensaio da co-digestão anaeróbia foi realizado em triplicata de reatores anaeróbios em batelada (1L), na proporção de 20g DQO/L de substrato, 20% de inóculo pré-tratado enriquecido, em condições de anaerobiose, headspace (0,3L) preenchido com N2 99,99%, sob fluxo constante, por 10 minutos. Também foram montados reatores controle (substrato sem pré-tratamento térmico e ácido) e reator endógeno (sem adição de substrato). Para o tamponamento, adicionou-se 3,5 g/L de NaHCO3. O pH inicial foi ajustado para 5,5 para os reatores acidogênicos e 7,0 para os reatores metanogênicos. Os reatores foram mantidos em incubadora a 37ºC, sob agitação constante de 120 rpm, durante 7 dias, para os reatores acidogênicos e, 18 dias para os reatores metanogênicos. Durante a operação dos reatores foram realizadas coletas de amostras para quantificação de biogás e remoções de matéria orgânica. Os reatores acidogênicos com substrato pré-tratado em 5%, 7%, 10% de CH3COOH e controle apresentaram remoções de carboidratos (88,54%; 87,37%; 88,92% e 67,37%), com gerações máximas de hidrogênio de 1279,00; 2588,73; 1421,77 e 783,47 ml/L, respectivamente. Os reatores metanogênicos, com o efluente dos reatores acidogênicos, apresentaram remoções de DQO total (93,91; 92,09; 96,21 e 80,66%), carboidratos (76,58; 66,81; 63,06 e 74,84%) e gerações máximas de metano de 6485,27; 4959,5, 4348,07 e 2893,8 ml, respectivamente. Análise metagenômico em larga escala com amostras do inóculo in natura, inóculo enriquecido em meios de cultivo fermentativo, metanogênico e com pré-tratamento de 7% de ácido acético revelou a diversidade de gêneros de bactérias e arqueias envolvidos na digestão anaeróbia. Dentre elas o gênero Clostridium desempenhou um papel crucial na hidrólise e geração de hidrogênio, enquanto o gênero Methanothrix foi abundante em reatores pré-tratados e na geração de metano. Pré- tratamentos térmicos e ácidos elevam a liberação de açúcares e podem ser aplicados em resíduos agroindustriais para maior geração de biogás, sendo a concentração de 5% de ácido acético o que obteve melhores resultados. Palavras-chave: pré-tratamento, digestão anaeróbia, ácido, biocombustíveis, celulose, banana. ABSTRACT Brazil is the fourth largest banana producer in the world, with 6.6 million tons produced on 455 thousand hectares. During the processing of this fruit, a large amount of waste is generated, which is responsible for increasing production costs. One of the methods for reusing this waste for industries could be its application in the use of this waste for the production of biogas from anaerobic biological processes. The production of biogas from waste from national fruit farming may prove more efficient after thermal and acid pretreatment, where sugars can be released. Therefore, this project evaluated the efficiency of thermal pretreatment with the addition of acetic acid in banana processing waste co-digested with sanitary sewage, aiming at the release of sugars and thus increasing the generation of biogas in anaerobic batch reactors. Hydrogen and methane production tests were carried out in 2 integrated stages, aiming at the full use of the organic matter contained in such waste. Initially, the substrate was characterized and 257.67 g total COD/L, 186.67 g soluble COD/L, total solids (2.75 g/L), total fixed solids (0.52 g/L), total volatile solids (2.23 g/L) and total carbohydrates (134.0 g/L) were verified. The inoculum was characterized in analyses of total solids (0.95 g/L), total fixed solids (0.11 g/L) and total volatile solids (0.84 g/L). Initially, the inoculum was heat-pretreated and then enriched in a specific culture medium for fermentation to be used in the acidogenic reactors. Similarly, the granular sludge was previously enriched in a specific culture medium for methanogenesis to be inoculated in the methanogenic reactors. Next, thermal and acid pretreatment were tested on the industrial banana residue, in additions in the proportions of 5%, 7% and 10% of acetic acid, separately. From the hydrolysis of the residues, the anaerobic co-digestion test was performed in triplicate of anaerobic batch reactors (1 L), in the proportion of 20 g COD/L of substrate, 20% of enriched pretreated inoculum, under anaerobic conditions, headspace (0.3 L) filled with N2 99.99%, under constant flow, for 10 minutes. Control reactors (substrate without thermal and acid pretreatment) and an endogenous reactor (without addition of substrate) were also assembled. For buffering, 3.5 g/L of NaHCO3 was added. The initial pH was adjusted to 5.5 for the acidogenic reactors and 7.0 for the methanogenic reactors. The reactors were kept in an incubator at 37ºC, under constant agitation of 120 rpm, for 7 days for the acidogenic reactors and 18 days for the methanogenic reactors. During the operation of the reactors, samples were collected to quantify biogas and organic matter removal. The acidogenic reactors with substrate pretreated in 5%, 7%, 10% CH3COOH and control showed carbohydrate removals (88.54%; 87.37%; 88.92% and 67.37%), with maximum hydrogen generations of 1279.00; 2588.73; 1421.77 and 783.47 ml/L, respectively. The methanogenic reactors, with the effluent from the acidogenic reactors, presented removals of total COD (93.91; 92.09; 96.21 and 80.66%), carbohydrates (76.58; 66.81; 63.06 and 74.84%) and maximum methane generations of 6485.27; 4959.5, 4348.07 and 2893.8 ml, respectively. Large-scale metagenomic analysis with samples of the in natura inoculum, inoculum enriched in fermentative culture media, methanogenic and with pretreatment of 7% acetic acid revealed the diversity of bacterial and archaeal genera involved in anaerobic digestion. Among them, the genus Clostridium played a crucial role in hydrolysis and hydrogen generation, while the genus Methanothrix was abundant in pretreated reactors and in methane generation. Thermal and acid pretreatments increase the release of sugars and can be applied to agro-industrial waste to generate more biogas, with a concentration of 5% acetic acid yielding the best results. Keywords: pretreatment, anaerobic digestion, acid, biofuels, cellulose, banana. LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura do material lignocelulósico ....................................................................... 17 Figura 2: Efeito do pré-tratamento nos materiais lignocelulósicos ......................................... 20 Figura 3: Fluxograma da metodologia ..................................................................................... 24 Figura 4: Deslocamento Volumétrico ...................................................................................... 30 Figura 5: Liberação de carboidratos nos reatores com pré-tratamento térmico e ácido .......... 37 Figura 6: Remoção Carboidratos (em %) para tipos de pré-tratamento usando CH3COOH ... 40 Figura 7:Volume acumulado de hidrogênio nos reatores anaeróbios por tempo ..................... 41 Figura 8:Remoção de DQO Solúvel, DQO Total e Carboidratos (em %) para tipos de pré- tratamento usando CH3COOH ................................................................................................. 46 Figura 9: Volume acumulado de metano nos reatores anaeróbios por tempo ......................... 48 Figura 10: Perspectiva de Reuso Energético (PRE) dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 7% de ácido acético ............................................................................................................... 51 Figura 11: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para o lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG; Controle e 7% de ácido acético adicionado nos reatores de hidrogênio em (a) gráfico de barra e (b) Diagrama de Circus .............................. 53 Figura 12: Abundância relativa dos principais gêneros do Domínio Bacteria para o Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores metanogênicos: (a) gráfico de barra e (b) diagrama de Circus ................................................ 57 Figura 13: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Archaea para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano: (a) gráfico de barra e (b) diagrama de Circus ........................................................ 60 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Composição do esgoto doméstico sintético ............................................................. 26 Tabela 2: Composição do Meio PYG ...................................................................................... 26 Tabela 3: Composição do substrato adicionado ao meio de cultivo Del Nery ........................ 27 Tabela 4: Composição do meio Del Nery com vitamina B12 ................................................. 27 Tabela 5: Caracterização do Substrato e do Inóculo ................................................................ 36 Tabela 6: Teste de ANOVA e Tukey para a liberação de carboidratos ................................... 38 Tabela 7: Concentração de fenóis e furfurais nos reatores antes e depois do pré-tratamento térmico e ácido e no final do ensaio......................................................................................... 39 Tabela 8: Teste de ANOVA e Tukey para a remoção de carboidratos .................................... 40 Tabela 9: Teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de hidrogênio ................... 42 Tabela 10: Produção acumulada, potencial de produção e taxa máxima de produção nos reatores pré-tratados com CH3COOH ..................................................................................... 43 Tabela 11: Concentrações (em mg/L) de ácidos orgânicos antes e após a operação dos reatores de hidrogênio .............................................................................................................. 44 Tabela 12: Teste de ANOVA e Tukey para as remoções de Carboidratos, DQO Total e DQO Solúvel ..................................................................................................................................... 47 Tabela 13: Teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de metano ...................... 48 Tabela 14: Produção acumulada, potencial de produção e taxa máxima de produção nos reatores pré-tratados com CH3COOH ...................................................................................... 50 Tabela 15: Cálculo do T80 para os reatores de Hidrogênio e Metano ..................................... 51 Tabela 16: Teste de ANOVA e Tukey para o Potencial de Reuso Energético Total dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 7% de Ácido Acético ................................................ 52 Tabela 17: Liberação de carboidratos nos reatores com pré-tratamento térmico e ácido ........ 71 Tabela 18: Remoção Carboidratos (em %) para tipos de pré-tratamento usando CH3COOH 72 Tabela 19: Remoção de DQO Solúvel, DQO Total e Carboidratos (em %) para tipos de pré- tratamento usando CH3COOH ................................................................................................. 73 Tabela 20: Volume acumulado de hidrogênio nos reatores anaeróbios por tempo ................. 74 Tabela 21: Volume acumulado de metano nos reatores anaeróbios por tempo ....................... 75 Tabela 22: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG, Reator Controle e pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de hidrogênio .......................................................... 76 Tabela 23: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG e Reator pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano .............................................................................. 77 Tabela 24: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Archaea para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG e Reator pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano .............................................................................. 78 Tabela 25: Especificações Ácido Acético ................................................................................ 79 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 13 2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 15 2.1 GERAL .......................................................................................................................... 15 2.2 ESPECÍFICOS ........................................................................................................ 15 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 16 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 24 4.1 SUBSTRATO ................................................................................................................ 25 4.2 INÓCULO ..................................................................................................................... 25 4.3 CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO E INÓCULO ......................................... 28 4.4 PRÉ TRATAMENTO TÉRMICO COM ADIÇÕES DE ÁCIDO ACÉTICO ....... 28 4.5 OPERAÇÃO DOS REATORES ANAERÓBIOS EM BATELADA ...................... 29 4.6 MÉTODOS ANALÍTICOS ......................................................................................... 29 4.7 ANÁLISE DE FENÓIS E FURFURAIS .................................................................... 31 4.8 MODELAGEM E ESTATÍSTICA DOS DADOS EXPERIMENTAIS OBTIDOS .............................................................................................................................................. 31 4.9 NORMALIZAÇÃO DOS RESULTADOS DE VOLUME ACUMULADO DE HIDROGÊNIO E METANO ............................................................................................ 32 4.10 TESTE DE ANOVA E TUKEY ................................................................................ 33 4.11 Cálculo de T80 ............................................................................................................ 34 4.12 Cálculo de Perspectiva de Reuso Energético (PRE) ................................................ 34 4.13 ANÁLISE DA DIVERSIDADE MICROBIANA EM LARGA ESCALA ............ 34 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 36 5.1 CARACTERIZAÇÃO SUBSTRATO E INÓCULO ................................................ 36 5.2 LIBERAÇÃO DE CARBOIDRATO COM O PRÉ-TRATAMENTO ................... 36 5.2.1 GERAÇÃO DE FENÓIS E FURFURAIS ........................................................... 38 5.3 REATORES ACIDOGÊNICOS GERADORES DE HIDROGÊNIO ................... 39 5.3.1 ANÁLISE DE ÁCIDOS PRESENTES NOS REATORES ACIDOGÊNICOS ... 43 5.4 REATORES METANOGÊNICOS............................................................................. 45 6. T80 e PERSPECTIVA DE REUSO ENERGÉTICO (PRE) ................................... 50 7. ANÁLISE DA DIVERSIDADE MICROBIANA EM LARGA ESCALA ............. 52 7.1 REATORES ACIDOGÊNICOS ................................................................................. 52 7.2 REATORES METANOGÊNICOS............................................................................. 56 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 63 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 65 Anexo 1 .................................................................................................................................... 71 Anexo 2 .................................................................................................................................... 72 Anexo 3 .................................................................................................................................... 73 Anexo 4 .................................................................................................................................... 74 Tabela 20: Volume acumulado de hidrogênio nos reatores anaeróbios por tempo .............. 74 Anexo 5 .................................................................................................................................... 75 Tabela 21: Volume acumulado de metano nos reatores anaeróbios por tempo ................... 75 Anexo 6 .................................................................................................................................... 76 Tabela 22: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG, Reator Controle e pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de hidrogênio ................................................ 76 Anexo 7 .................................................................................................................................... 77 Tabela 23: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG e Reator pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano ................................................................. 77 Anexo 8 .................................................................................................................................... 78 Tabela 24: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Archaea para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG e Reator pré-tratado com adição de 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano ................................................................. 78 Anexo 9 .................................................................................................................................... 79 Tabela 25: Especificações Ácido Acético ............................................................................ 79 13 1. INTRODUÇÃO De acordo com a Associação brasileira dos produtores e exportadores de frutas e derivados (Abrafrutas), o Brasil é o terceiro maior produtor de frutas no mundo, com uma produção média de 45 milhões de toneladas por ano. A banana é a fruta fresca mais consumida no mundo. Além de maior consumidor mundial, o Brasil é o quarto maior produtor segundo a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa, 2023), com 6,6 milhões de toneladas produzidas em aproximadamente 455 mil hectares, sendo metade originária da agricultura familiar. O setor fatura cerca de R$ 13,8 bilhões por ano e gera 500 mil empregos diretos. O processamento da banana nas indústrias que a utilizam para a produção de doces e sucos acarreta a geração de resíduos sólidos orgânicos ricos em celulose e lignina, presentes nas cascas e na fruta, que constituem uma barreira na liberação de açúcares como glicose e frutose e em sua consequente degradação por processos biológicos anaeróbios responsáveis pela geração de gases de valor agregado. Além disso, quando descartados de maneira incorreta, esses resíduos são responsáveis por diversos impactos ambientais, como a volatilização de gases, geração de mau cheiro e lixiviado, atração de vetores de doenças, que podem atingir as populações locais, dentre outros. A quantidade de resíduos de origem vegetal que são rejeitados, descartados ou dispostos de modo inadequado possui um valor expressivo, em especial aqueles oriundos de processos agroindustriais de frutas como a banana e seus derivados (PEREIRA NETO, et al., 2007). Essas destinações finais inadequadas não apenas são prejudiciais para o meio ambiente, mas também representam um desperdício e a perda de um material com potencial econômico para as empresas, como sua utilização para geração de biogás por meio da digestão anaeróbia. Ao longo do tempo, a matriz energética das sociedades humanas passou por diversas mudanças, principalmente depois da revolução industrial, quando as fontes de energia se tornaram mais diversificadas devido ao aumento da demanda. O combustível mais usado nos dias atuais são o carvão mineral e o petróleo, porém, como consequência dos elevados níveis de consumo desses recursos, diversos impactos ambientais vem sendo cada vez mais perceptíveis (PEREIRA NETO, et al., 2007). Nesse cenário o biogás se apresenta como uma fonte renovável, relativamente limpa e sustentável que vem recebendo cada vez mais atenção 14 e atuando como objeto de diversos estudos para seu melhor aproveitamento como fonte de combustível, possuindo vantagens como conservação de energia e redução da emissão de gases de efeito estufa (Lora & Andrade, 2009). Os resíduos orgânicos da agroindústria, como a banana, podem ser utilizados na digestão anaeróbia como forma de obtenção de biogás hidrogênio e metano (GAO et al., 2019). Entretanto possuem em sua casca a celulose e a lignina, que dificultam a liberação dos açucares como a glicose e a frutose. Com isso, para garantir uma melhor eficiência do processo de produção de biogás, métodos como hidrólise ácida se apresentam muito promissores para que ocorra a quebra da hemicelulose e da celulose, facilitando a liberação, de açucares fermentáveis na forma de hexoses e pentoses (ALZATE; TORO, 2006). Além disso, tal processo garante uma melhoria na eficiência do processo de digestão anaeróbia e a longo prazo representa uma redução dos custos totais de produção (MIRAHMADI et al., 2010). 15 2. OBJETIVOS 2.1 GERAL Testar o pré-tratamento térmico em hidrólise ácida em resíduos agroindustriais, mais especificamente da banana para a produção de biogás, hidrogênio e metano, em 2 etapas integradas, em reatores anaeróbios em batelada, co-digeridos em esgoto sanitário sintético e lodo granular anaeróbio. 2.2 ESPECÍFICOS • Avaliar a liberação de açucares através do pré-tratamento térmico em hidrólise ácida, em resíduos do processamento da banana; • Avaliar os consumos de carboidratos totais na operação dos reatores; • Avaliar os consumos de matéria orgânica através de análises de DQO (Demanda Bioquímica de Oxigênio) e; • Comparar a produção de biogás hidrogênio e metano, durante a operação, em reatores anaeróbios alimentados com resíduos da banana pré-tratados. • Avaliar as alterações na diversidade de bactérias fermentativas e arqueias metanogênicas durante a operação dos reatores anaeróbios em 2 etapas. 16 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA (1) Resíduos agroindustriais de frutas A banana é a fruta fresca mais consumida no mundo. O Brasil, além de quarto maior produtor, é também o maior consumidor mundial. O setor fatura cerca de R$ 13,8 bilhões por ano e gera 500 mil empregos diretos (Embrapa, 2023). O processamento da banana nas indústrias que a utilizam para a produção de doces e sucos acarreta a geração de resíduos sólidos orgânicos que, quando descartados de maneira incorreta, são responsáveis por diversos impactos ambientais, como a volatilização de gases, geração de mau cheiro e lixiviado, atração de vetores de doenças, que podem atingir as populações locais, dentre outros (PEREIRA NETO, et al., 2007). O processamento das frutas é uma atividade econômica importante. Todavia, parte da fruta é rejeitada ao longo de seu processamento, como polpas, cascas, caroços e sementes, os resíduos produzidos, com carga orgânica elevada que, quando não tratados, geram um passivo ambiental, que por sua vez acabam dispostos em aterros sanitários ou descartados em lugares inadequados (DE CARVALHO JÚNIOR; MAINTINGER 2022). (2) Resíduo lignocelulósico Os resíduos advindos do processamento, devido a sua composição, são ricos em lignina, hemicelulose e celulose que apresentam estrutura molecular altamente recalcitrante e se tornam que empecilhos aos processos fermentativos (CANILHA et al., 2011). Devido a sua estrutura morfológica e química, a lignocelulose demonstra grande eficiência na proteção de seus carboidratos contra a ação de microrganismos ou de suas enzimas, sendo possível a necessidade de 100 vezes mais enzimas no resíduo para que a sua liberação (VINZANT et al., 2005). Dessa forma, pré-tratamentos físicos, químicos, biológicos e combinados têm sido os mais utilizados em tais resíduos lignocelulósicos sendo aplicados com o objetivo de otimizar a produção de metano via digestão anaeróbia (DINIZ GUERI et al., 2021). 17 Figura 1: Estrutura do material lignocelulósico Fonte: KONDO (1997). 18 (3) Digestão anaeróbia A geração de biogás tem sido aplicada a partir de resíduos orgânicos por digestão anaeróbia onde são convertidos substratos orgânicos em metano e dióxido de carbono. Esta atividade é decorrente da ação de microrganismos na ausência de oxigênio, dividida em 4 fases: hidrólise, acidogênese, acetogênese e metanogênese. Na hidrólise, os polímeros complexos são repartidos em moléculas dissolvidas menores, que assim podem atravessar a parede celular dos microrganismos fermentativos para seus metabolismos. Dessa forma são transformados lipídios em ácidos graxos, proteínas em aminoácidos, além de polissacarídeos em açúcares menores. A hidrólise dos polímeros geralmente ocorre lentamente em condições anaeróbias, e a taxa na qual o substrato é hidrolisado é afetado por vários fatores, como a temperatura do reator, tempo e composição do substrato no reator, pH do meio, tamanho das partículas e concentração de produtos da hidrólise (VON SPERLING; CHERNICARO, 2005). Em seguida, na acidogênese, os produtos solúveis oriundos da hidrólise são metabolizados e convertidos em diversos compostos mais simples, que então foram excretados pelas células, a exemplo dos ácidos graxos, álcoois, ácido lático, dióxido de carbono, hidrogênio, amônia e sulfato de hidrogênio, que são posteriormente excretados. A seguir, na acetogênese ocorre a oxidação dos produtos gerados na fase acidogênicas em substrato apropriado para as arqueias metanogênicas, como o acetato, hidrogênio e dióxido de carbono (VON SPERLING; CHERNICARO, 2005). Finalmente, na metanogênese os compostos orgânicos (acetato, gás carbônico e hidrogênio) são sintetizados em metano, através da ação das arqueias metanogênicas, sendo mais conhecidas as arqueias pertencentes aos gêneros Methanosaeta e Methanosarcina (VON SPERLING; CHERNICARO, 2005). As arqueias metanogênicas acetoclásticas, que utilizam o ácido acético como substrato para a produção de metano, são mais predominantes na digestão anaeróbia, sendo responsáveis por pelo menos 60% de todo o metano que é produzido durante o processo e, dessa forma, são consideradas as mais versáteis dentre os microrganismos metanogênicos. No processo também estão presentes arqueias hidrogenotróficas, que utilizam o hidrogênio como substrato para produzir metano. Uma alternativa promissora para redução de resíduos organicos agroindustriais seria sua utilização em processos biológicos anaeróbios visando à produção de biogás (hidrogênio e 19 metano) em 2 etapas integradas; fermentação com geração de hidrogenio, acidos graxos volatéis e alcoois, onde o efluente dessa etapa possa seguir para reatores metanogenicos com consumo total da materia orgânica e consequente geração de metano. (4) Lodo granular Dentro do processo de digestão anaeróbia, é preciso escolher o tipo de inóculo que será usado e definir a quantidade ideal a ser usada, é de grande ajuda para que haja o bom desempenho nos consumos de substrato e gerações de biogás. O inóculo adequado contribui na operação de reatores e evita inibição dos processos almejados, além de favorecer a operação (CREMONEZ et al., 2021). O lodo granular anaeróbio proveniente de reatores UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket – reator anaeróbio de manta de lodo de fluxo ascendente) apresenta grande eficiência na aplicação em tratamento de efluentes e resíduos. Após o processo de formação do grânulo, as bactérias hidrolíticas e acidófilas colonizam as camadas externas. Por sua vez, as arqueias metanogênicas se limitam à parte central dos grânulos, os quais possuem cavidades com função de canal de transporte de gases, substratos e metabólitos (LIM; KIM, 2014). (5) Pré-tratamentos aplicados em resíduos lignocelulósicos As interações complexas entre hemicelulose e celulose que se apresentam nas paredes celulares dos resíduos de origem vegetal e a interação entre os polissacarídeos e ligninas impedem a liberação de carboidratos presentes. Pré-tratamentos desses resíduos vegetais representa uma etapa importante para a produção de metano, pois possibilitam a separação da matriz de lignina, reduzem a cristalinidade da celulose, solubilizam a hemicelulose, fazendo a separação entre o hidrolisado e a celulose para que se tornem mais acessível às hidrólises biológicas e químicas (SARKAR et. al., 2012). (Figura 2) 20 Figura 2: Efeito do pré-tratamento nos materiais lignocelulósicos Fonte: BALAT (2010) Nesse sentido, a eficiência de pré-tratamentos nessas matrizes deve ser capaz de diminuir o grau de polimerização das moléculas de celulose, de forma a torná-las mais acessíveis ao processo de hidrólise. Segundo Montgomery e Bochmann (2014), o pré-tratamento no resíduo vegetal torna o processo de digestão anaeróbia mais rápida, além de incrementar a produção de biogás hidrogênio e metano, também podem reduzir problemas como flotação de material no interior do biodigestor, sendo traduzido em menores custos com eletricidade para equipamentos de misturas dos reatores. Vários pré-tratamentos têm sido aplicados em resíduos lignocelulósicos tais como os físicos que podem ser de forma mecânica ou por irradiação; Químicos: ácidos, alcalinos, oxidativos e solventes orgânicos; Físico-químicos: explosão de vapor, extrusão e hidrotérmico; Biológico: microbiológico e enzimático. Apesar da quantidade variada de métodos, o pré- tratamento a ser aplicado deve levar em consideração as características do resíduo, dependendo de sua estrutura lignocelulósico (ACHINAS et al., 2017). Entretanto, os pré-tratamentos de térmico com adições de diferentes ácidos têm sido aplicados com sucesso em resíduos vegetais, principalmente pelo rendimento elevado na liberação de carboidratos causado pela solubilização parcial ou total da lignina, diminuição da cristalinidade da celulose, aumento da área superficial da biomassa e diminuição do grau de polimerização da celulose (SANTOS et al., 2012), conforme descrito a seguir. 21 (5.1) Térmico Pré-tratamentos térmicos aplicados tanto em diferentes tipos de biomassas como em microalgas têm sido eficazes na promoção da ruptura da parede celular rígida, principalmente, de celulose, hemicelulose e biopolímeros, moléculas que são extremamente resistentes ao ataque enzimático bacteriano (MUSSGNUNG et al. 2010; RAS et al. 2011). Tratamentos prévios aplicados em biomassas podem tornar o procedimento de digestão anaeróbia mais eficaz na obtenção de um balanço energético positivo em comparação à biomassa bruta (HENDRIKS e ZEEMAN, 2009). O pré-tratamento térmico apresenta vantagens por não gerar reagentes tóxicos para o seu funcionamento. Entretanto, sua eficiência aumenta de forma significativa quando aplicado juntamente com adições de diferentes ácidos. (5.2) Ácido O pré-tratamento ácido no material lignocelulósico é responsável por modificar a sua estrutura para melhorar a hidrólise enzimática. A eficiência desse processo depende de fatores como a concentração do ácido, a temperatura e a razão entre sólido e líquido (BEHERA et al., 2014). Dentre os ácidos que são utilizados com maior frequência podemos citar os ácidos acético, fosfórico, sulfúrico e clorídrico (ASGHER et al., 2013; AGUILAR et al., 2002). Os ácidos apresentam vantagens quando comparados à processos alcalinos por apresentarem características como reatividade e eficiências elevadas na conversão da hemicelulose em carboidratos, maior taxa de hidrólise da celulose, além do custo financeiro mais reduzido. Porém, os processos relacionados acabam por gerar subprodutos que são indesejáveis como componentes fenólicos e furfurais (MOSIER et al., 2005; PEREIRA Jr et al., 2008; KUMAR, et al., 2009). Para a realização do pré-tratamento podem ser usados tanto ácidos concentrados como os diluídos. Os ácidos concentrados se demonstram eficientes para hidrólise da biomassa, porém são tóxicos, corrosivos e perigosos, tornando necessário equipamentos próprios ao manuseio, os 22 quais elevam muito o custo financeiro (KUMAR et al., 2009). Além disso, concentrações muito elevadas são prejudiciais à digestão anaeróbia, uma vez que arqueias metanogênicas responsáveis pela geração de metano são sensíveis às condições ambientais, principalmente alterações de pH (VON SPERLING; CHERNICARO, 2005). Em vários estudos, a hidrólise com ácido diluído, tem mostrado sua eficiência em pré- tratamento de resíduos lignocelulósicos. O método consiste na adição de concentrações reduzidas do ácido em temperatura elevada para romper as paredes da hemicelulose, facilitando o acesso da celulose na etapa de hidrólise ácida ou enzimática (ALVIRA et al., 2010). A celulose tende a não ser fortemente afetada pelo pré-tratamento ácido. Entretanto, quando a celulose é exposta a concentrações e temperaturas muito elevadas, além de longo tempo de reação as perdas podem chegar de 2 a 20 % (TRAJANO et al., 2013). A lignina possui em sua estrutura aromática uma maior quantidade de carbono e menor quantidade de oxigênio em comparação a celulose, além de ser mais hidrofóbica (GUSTAFSSON et al., 2003; ZHANG et al., 2007). Dessa forma, traz consigo estruturas que impedem a ligação das suas enzimas de forma eficiente, ocorrendo uma baixa digestão da celulose. Além disso, a quebra da estrutura da lignina é fundamental para diminuir a resistência do material. Ainda existem outros fatores além da lignina que contribuem para a resistência como o tipo de célula e a composição química (BRIENZO et al., 2017). (6) Biogás O biogás é o resultado do processo de decomposição anaeróbia de materiais orgânicos na ausência de oxigênio, sendo composto em sua maior parte por metano (CH4) e dióxido de carbono (CO2), monóxido de carbono (CO), pequenas quantidades de vapor de água (H2O vapor), ácido sulfídrico (H2S), nitrogênio (N2), oxigênio (O2), hidrogênio (H2) e amônia (NH3). O biogás é gerado por fenômenos naturais como pântanos, oceanos e água doce e por fontes antropogênicas como plantações de arroz alagadas, sistemas de tratamento de efluentes e em aterros sanitários (CASSINI, 2003). Os elementos presentes no biogás variam de acordo com o material orgânico que sofreu a decomposição e do processo que o gerou. Existem diversos fatores que também podem influênciar a composição do biogás, como o tipo de reator, a atividade metanogênica da biomassa, o tempo 23 de residência celular, a presença de substâncias inibidoras e ou limitantes do próprio processo, a presença de substâncias tóxicas às bactérias e as variações nos parâmetros quantitativos operacionais do reator, tais como a vazão, a carga, o tempo de detenção hidráulica (TDH) e a velocidade do fluxo (CHERNICHARO, 2007). O biogás apresenta potencial de geração de energia elétrica e térmica através do uso como combustível veicular (biometano) ou para injeção em redes de gás. A eficiência no processo de produção do biogás pode ser aumentada por meio da codigestão anaeróbia, aliando outros resíduos orgânicos de fácil digestão, a fim de diluí-lo e assim amenizar o efeito nocivo de seus contaminantes. Nesse cenário, o esgoto sanitário se apresenta como outro resíduo promissor, em virtude de ser um bom diluente, além de conter nutrientes essenciais nos processos biológicos de geração de biogás. O objetivo principal do trabalho foi avaliar a utilização de resíduos da banana descartados em varejões como substrato para a obtenção de bioprodutos utilizando reatores em batelada em 2 etapas para a geração de hidrogênio, metano e outros bioprodutos de valor agregado. 24 4. MATERIAIS E MÉTODOS O projeto foi desenvolvido no Laboratório de Biossistemas e Bioenergia no Instituto de Pesquisa em Bioenergia (IPBEN) – Unesp de Rio Claro. A realização do projeto foi feita de acordo com o fluxograma experimental (Figura 3). Figura 3: Fluxograma da metodologia Fonte: elaborado pelo autor (2024) A primeira etapa consistiu na caracterização do resíduo e do inóculo que foram utilizados para um prévio conhecimento de suas características, em análises de sólidos totais voláteis e fixos e Demanda Química de Oxigênio (DQO), pH e temperatura, conforme descrito a seguir. Inicialmente, o lodo foi pré-tratado à quente, mantido a temperatura de 100°C por 15 minutos e, posteriormente, colocado em banho de gelo, até atingir a temperatura de 25oC. A seguir, o lodo pré-tratado foi enriquecido em meio de cultivo especifico para a fermentação. O substrato (resíduo da banana) foi pré-tratado termicamente em hidrólise ácida, para liberação de açucares e, em seguida, foram montados reatores acidogênicos, com 20g de DQO 25 substrato/L, contendo o lodo pré-tratado e esgoto sanitário sintético. Após a operação dos reatores acidogênicos, a água residuária obtida (efluente) foi filtrada e usada para a montagem dos reatores metanogênicos que receberam, como inóculo, um novo lodo enriquecido com meio de cultivo especifico para a metanogênese. 4.1 SUBSTRATO Foram utilizados 2 substratos, conforme descrito a seguir. 1. Resíduos da banana como fonte de carbono. Tais resíduos (cascas+ polpa) eram advindos de varejões locais (Rio Claro – SP), sendo estas frutas que seriam descartadas . Os resíduos foram picados previamente homogeneizados em um liquidificador para se obter uma pasta e mantidos a -20oC até sua utilização. 2. Esgoto sanitário sintético segundo Martín et al. (2010), cuja composição está descrita na Tabela 1. O substrato 2 foi utilizado como diluente em processos de co-digestão, na montagem de reatores anaeróbios em batelada. 4.2 INÓCULO - Inóculo “in natura”: lodo granular mesofílico de reator UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket), proveniente do tratamento de água residuária de abatedouro de aves, cedido pela avícola DACAR, localizada na cidade de Tietê – SP - Inóculo pré-tratado: inóculo “in natura” previamente pré-tratado quente, mantido à 100°C por 15 minutos para que ocorresse a inibição dos microrganismos produtores de metano. Após isso, o inóculo foi enriquecido em meio de cultivo especifico para a fermentação (PYG - Peptone, Yeast Extract, Glucose) para a operação dos reatores acidogênicos da etapa 1, conforme descrito a seguir (Tabela 2): 26 Tabela 1: Composição do esgoto doméstico sintético Solução de Macronutrientes Solução de Micronutrientes Composto Fonte (mg/L) Composto (mg/L) Glicose Albumina Ureia KH2PO4 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KCL NaHCO3 Extrato de Levedura Micronutrientes C-Carboidrato C-Proteína N P Ca Mg K Na 200 21 13,0 5,26 22,05 0,43 21,3 8,76 100 1,0* FeCl3.4H2O CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O CuCl2.2H2O ZnCl2 H3BO3 (NH4)6MO7O24.4H2O NaSeO3.H2O NiCl2.6H2O EDTA HCL 36% 1000 1000 250 15 25 25 45 50 35 500 1 (1) (1) Quantidade expressa em mg/L (Fonte: Martín et al., 2010) Tabela 2: Composição do Meio PYG Composto Quantidade Peptona 5g Extrato de Carne 5g Extrato de Levedura 5g Glicose 10g (1) Para 1L de água destilada Fonte: elaborado pelo autor 27 O inóculo “in natura” foi enriquecido em meio de cultivo Del Nery, de acordo com Maintinguer et al (2008). Previamente ao preparo do meio de cultivo, foram adicionadas fontes de carbono preferenciais para a metanogênese (Tabela 3, Tabela 4). Tabela 3: Composição do substrato adicionado ao meio de cultivo Del Nery Composto Quantidade Peptona A 2,0 g Acetato de Sódio 1,6 g Lactato de Sódio 1,6 g Extrato de Levedura 2,0 g Glicose anidra 1,6 g Solução Del Nery A, B, C e D 5 mL Vitamina B12 1 mL (1) Para 1L de água destilada Fonte: elaborado pelo autor Tabela 4: Composição do meio Del Nery com vitamina B12 Reagente Concentração g/l Vitamina B12 40 Solução A (NiSO4.6H2O) 0,50 Sulfato Ferroso (FeSO4.7H20) 2,50 Cloreto Férrico (FeCl3.6H20) 0,25 Cloreto de Cobalto (CoCl2) 0,04 Solução B Cloreto de Cálcio (CaCl2) 2,06 Solução C Óxido de Selênio (SeO2) 0,14 Solução D Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) 5,36 Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) 1,30 Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4.7H2O) 2,76 Fonte: adaptado de Del Nery (1987); Widdel e Pfenning (1984). 28 4.3 CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO E INÓCULO Foi realizada a caracterização dos substratos antes do início da operação dos reatores, de acordo com parâmetros de demanda química de oxigênio (DQO), sólidos totais (ST) e sólidos voláteis totais (SV), pH e carboidratos totais. O resíduo agroindustrial banana continha (g/L): DQO total (257,67), DQO solúvel (186,67). Foram pesados 15,22 gramas do resíduo, dos quais foram obtidos: sólidos totais (2,75g – 18,06%), sólidos fixos totais (0,52g – 3,39%), sólidos voláteis totais (2,23g – 14,67%; que representou 81,09% em relação ao sólidos totais) e uma umidade de 63,89%, além de: carboidratos totais (134,00) e pH 5,6. Foi pesado 15,02 gramas de inóculo, o qual continha: sólidos totais (0,85g – 1,16%), sólidos fixos totais (0,11g – 0,13%) e sólidos voláteis totais (0,84 – 1,03%; o que representou 88,42% em relação aos sólidos totais) e uma umidade de 97,68. 4.4 PRÉ TRATAMENTO TÉRMICO COM ADIÇÕES DE ÁCIDO ACÉTICO Pré-tratamentos térmicos e ácido foram aplicados no resíduo industrial da banana com adição de 5%, 7% e 10% de ácido acético em relação a quantidade de resíduo adicionada aos reatores, de acordo com resultados promissores testados com resíduos sólidos agroindustriais da goiaba aplicados na geração de biometano (Processo Fapesp: 2022/14261-0). O pré- tratamento térmico do resíduo industrial da banana foi realizado em autoclave vertical (marca Phoenix, linha 50 litros, pressão máxima de 3 kgf/cm²). A autoclavagem foi conduzida com garrafas de boro-silicato com volume total de 1 L, contendo 700 ml de solução dos resíduos do processamento industrial da banana arranjados em triplicatas, na autoclave vertical, à temperatura de 120ºC por 45 minutos e pressão de 1 kgf/cm². A partir da hidrólise dos resíduos foram montados reatores anaeróbios em batelada co- digeridos com esgoto sanitário sintético, objetivando-se a geração de hidrogênio através do consumo do resíduo. 29 4.5 OPERAÇÃO DOS REATORES ANAERÓBIOS EM BATELADA Etapa 1: Reatores Acidogênicos O ensaio da co-digestão anaeróbia foi realizado em triplicata em condições de anaerobiose e os reatores operados em batelada (1 L), com headspace (0,30L) na proporção S/I (substrato/inoculo) de 1,0, fixando 20g DQO/L e preenchido com N2 99,99%, sob fluxo constante, por 10 minutos. Foram montados reatores controle (com substrato sem pré- tratamento) e endógeno (sem substrato). Para o tamponamento, foram adicionados 5 g/L de NaHCO3 (ANGELIDAKI et al., 2009). O pH inicial foi de 5,5 e os reatores foram mantidos em incubadora sem agitação à 37ºC. Etapa 2: Reatores Metanogênicos O efluente gerado dos reatores acidogênicos foi filtrado previamente e usado como substrato para a operação dos reatores metanogênicos. Os reatores foram montados nas mesmas condições descritas anteriormente, porém o pH inicial foi ajustado para 7,0 e os reatores foram mantidos em estufa a 1200 rpm à 37°C. 4.6 MÉTODOS ANALÍTICOS A análise dos parâmetros utilizados foi feita de acordo com as metodologias descritas a seguir: DQO: Colorimétrico (APHA, 2023) - Esse método consiste em uma análise baseada na comparação de cores produzidas por uma reação química com uma cor padrão. Carboidratos: Colorimétrico (Dubois et al., 1956). Sólidos: Gravimétrico (APHA, 2023) - método analítico quantitativo que isola e realiza a pesagem de um elemento ou composto definido em sua forma mais pura que é separado de uma quantidade ou amostra previamente conhecida. pH: Potenciométrico (APHA, 2023) - baseiam-se na medida da diferença de potencial de uma célula eletroquímica na ausência de corrente. 30 Quantificação do biogás: Deslocamento volumétrico (Aquino et al., 2007). O método de deslocamento volumétrico de biogás é uma técnica empregada para determinar o volume de biogás produzido em reatores anaeróbios em batelada. Esse método consiste na utilização de duas colunas de NaOH e uma de água. As colunas de NaOH são responsáveis por realizar uma lavagem do biogás, com captura do CO2. O volume de água deslocada é equivalente ao volume de biogás (hidrogênio e metano) produzidos. Figura 4: Deslocamento Volumétrico Fonte: autor Composição do biogás: Cromatográfico (Maintinguer et al., 2008) - Processo de separação de mistura complexas, realizado em cromatógrafo a gás Shimadzu® (GC-2014) equipado com detector de condutividade térmica (DTC) e coluna Carboxen 1010 PLOT. O fluxo da coluna foi de 5,0 mL min-1 com argônio ultrapuro como gás de arraste. As temperaturas do injetor e do detector foram 220 °C e 230 °C, respectivamente. A rampa de temperatura da coluna foi de 120 °C (1 min), 40 °C/min até 200 °C (3 min) e 50 °C/min até 230 °C (0,5 min), com um tempo total de execução de 7,1 minutos (MAINTINGUER et al., 2008). 31 Ácidos graxos voláteis e álcoois: Cromatográfico (Adorno et al. 2014) – A concentração de alguns produtos de fermentação gerados nos reatores, como ácido acético (HAc), ácido butírico (HBu), ácido propiônico (HPr), ácido isobutírico (HIsob), ácido isovalérico (HIsov), etanol e metanol, foi determinada por um cromatógrafo gasoso (GC 2030, Shimadzu®), equipado com um detector de ionização de chama (FID) com um amostrador automático (AOC 6000 plus), uma coluna capilar HP-INNOWAX (30 m x 0,250 mm x 0,25 μm) e usando nitrogênio como gás transportador. Lactato: Cromatografia líquida (Perimenis et al. 2018) – HPLC. O detector de índice de refração (Waters 2014) foi mantido a 40 °C. A coluna analítica SHODEX SH-1011 COL (300 × 7,8 mm) foi mantida a 50 °C com uma vazão de 0,6 mL/min, usando ácido sulfúrico 0,005 mol/L como fase móvel. Os fatores estequiométricos de DQO assumidos para a determinação dos Produtos Metabólicos Solúveis (SMPs) totais foram: 1,24 g DQO/ácido_gláctico, 2,087 g DQO/etanol, 1,066 g DQO/ácido_gacético, 1,514 g DQO/ ácido_propiônico, 1,818 g DQO/ácido_gbutírico e 2,036 g DQO/ácido_giso-valérico (Perimenis et al, 2018). 4.7 ANÁLISE DE FENÓIS E FURFURAIS Para determinação do furfural e hidrolismetilfurfural (HMF) (formulação média após crescimento de microrganismos) foi utilizada uma coluna XBridge C18 de 3,5μm (4,6 x 50mm) em Cromatografia Líquida de Ultra Performance (UPLC – Waters Equipment). As condições utilizadas foram: temperatura de 35 ºC; fluxo de 0,8 mL/min de água/acetonitrilo (8:1) com ácido acético a 1% e detetor de PDA a 274 nm. 4.8 MODELAGEM E ESTATÍSTICA DOS DADOS EXPERIMENTAIS OBTIDOS Os dados experimentais obtidos durante todos os ensaios foram ajustados para os valores médios obtidos das triplicatas dos reatores em batelada, utilizando o software Statistica® (versão 8.0). A taxa máxima de produção de biogás foi obtida por ajuste sigmoidal 32 não linear da função Gompertz modificada (LAY; LI; NOIKE, 1998), de acordo com a equação (1). (1) Onde: P é o potencial de produção de biogás (mmol L-1 cultura); Rm é a taxa máxima de produção de biogás (mmol L-1 cultura. h); λ é a duração da fase de início de produção do biogás (h) e; 𝑒 vale 2,718281828. Foram realizadas análises estatísticas dos valores médios obtidos em todas as tabelas comparativas por meio do Anova e Teste de Tukey a 5%, considerando-se o delineamento inteiramente casualizado, com tratamentos para os ensaios com reatores que receberam os pré- tratamentos ácidos. 4.9 NORMALIZAÇÃO DOS RESULTADOS DE VOLUME ACUMULADO DE HIDROGÊNIO E METANO A normalização dos resultados de volume acumulado de metano ocorre a fim de transformar o volume da condição na qual as medidas foram realizadas no volume em condição padrão de temperatura (0ºC ou 273,15 K) e pressão (1 atm). A fórmula para esta conversão é descrita a seguir (equação 2). (2) 33 Onde: • VN: volume de metano em condições normais (NmL) • V: volume de metano medido (mL) • P: pressão na qual o volume foi medido (em atm) • T: temperatura na qual o volume foi medido (em Kelvin) • PN: pressão em condições normais (1 atm) • TN: temperatura em condições normais (273,15 K) 4.10 TESTE DE ANOVA E TUKEY O teste de Tukey tem como base a DMS (diferença mínima significativa) (Silva et. al, 2021), sendo usado para testar toda e qualquer diferença entre duas médias de tratamento, representada no geral por ∆ e calculada pela seguinte equação (3): (3) Onde: q∆ = é o valor da amplitude estudentizada, cujo o valor é encontrado em tabelas, em função do número de tratamentos e do número de grau de liberdade do resíduo, ao nível α de probabilidade (em geral 5%); s = é a estimativa do desvio padrão residual (erro experimental); r = número de repetições. 34 O teste ANOVA (Silva et. al, 2021) funciona testando a hipótese nula de que as médias populacionais dos grupos são iguais. Dessa forma, ela decompõe a variância total da amostra em variância entre grupos e variância dentro dos grupos. 4.11 Cálculo de T80 O T80 é um indicador técnico utilizado para descrever o tempo necessário para produzir 80% do hidrogênio (H2) e do metano (CH₄) total durante o período de incubação em reatores de digestão anaeróbia. Segundo Camarena-Martínez et al. (2020), o T80 é calculado como o período de operação dos reatores no qual se alcançou 80% da produção total de metano. 4.12 Cálculo de Perspectiva de Reuso Energético (PRE) Foram avaliadas as Perspectivas de Reuso Energético (PRE) dos ensaios com adição de 5 e 7% de ácido acético. Os valores de PRE foram calculados de acordo com as equações (4) e (5), considerando que o conteúdo energético de H2 é 284 kJ mol-1 e o de CH4 é 882,2 kJ mol- 1, respectivamente (RODRIGUES et al., 2020b). PRE (H2) = (𝑚𝑜𝑙 𝐻2 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑜 / 𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ) 𝑥 (284,0 𝑘𝐽 / 𝑚𝑜𝑙 ) (4) PRE (CH4) = (𝑚𝑜𝑙 C𝐻4 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑜 / 𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ) 𝑥 (882,2 𝑘𝐽 / 𝑚𝑜𝑙 ) (5) 4.13 ANÁLISE DA DIVERSIDADE MICROBIANA EM LARGA ESCALA Foram coletadas amostras do inóculo in natura, inóculo enriquecido com Meio Del Nery e inóculo enriquecido com Meio PYG. Também foram coletadas amostras de inóculo da mistura de cada triplicata dos reatores com concentração de 5, 7 e 10% de CH3COOH e do controle, no final da operação dos reatores, separadamente e armazenados a -80°C em solução 35 de glicerina a 50%. A seguir foi realizada a extração do DNA genômico com o kit FastDNA® SPIN for Soil (MP BiomedicalsTM, que foi posteriormente quantificado (ng.μL−1) em espectrofotômetro Nanodrop 2000 (ThermoFisher Scientific®) de 1,80–2,00 (260/280 nm). (Camargo et. al., 2021) Após as extrações, as amostras foram enviadas para a empresa NGS Soluções Genômicas para serviços de sequenciamento utilizando Plataforma Ilumina e análises de bioinformática. 36 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 CARACTERIZAÇÃO SUBSTRATO E INÓCULO O resíduo agroindustrial banana continha (g/L): DQO total (257,67), DQO solúvel (186,67). Foram pesados 15,22 gramas do resíduo, dos quais foram obtidos: sólidos totais (2,75g/L – 18,06%), sólidos fixos totais (0,52g/L – 3,39%), sólidos voláteis totais (2,23g/L – 14,67%; que representou 81,09% em relação ao sólidos totais) e uma umidade de 63,89%, além de: carboidratos totais (134,00) e pH 5,6. Foi pesado 15,02 gramas de inóculo, o qual continha (g/L): sólidos totais (0,85g/L – 1,16%), sólidos fixos totais (0,11g/L – 0,13%) e sólidos voláteis totais (0,84g/L – 1,03%; o que representou 88,42% em relação aos sólidos totais) e uma umidade de 97,68g/L. Tabela 5: Caracterização do Substrato e do Inóculo Matéria Orgânica Substrato (g/L) Inóculo (g/L) DQO total DQO solúvel Carboidratos 257,67 186,67 134,00 _ _ _ Sólidos Substrato Inóculo Sólidos totais Sólidos fixos totais Sólidos voláteis totais 2,75g/L (18,06%) 0,52g/L (3,39%) 2,23g/L (14,67%) 0,85g/L (1,16%) 0,11g/L (0,13%) 0,84g/L (1,03%) Umidade 63,89% 97,68% pH 5,6 _ Fonte: elaborado pelo autor 5.2 LIBERAÇÃO DE CARBOIDRATO COM O PRÉ-TRATAMENTO Durante o ensaio foi possível observar que ocorreu uma liberação considerável de carboidratos nos reatores que receberam o pré-tratamento térmico e com adição de 5, 7 e 10% de 37 ácido acético (aumento de 41,22%; 75,20% e 197,21%, respectivamente após o pré-tratamento). Além disso, foi verificado que a liberação de carboidratos foi diretamente proporcional à quantidade de ácido adicionada. Ou seja; quanto mais ácido foi adicionado ao pré-tratamento térmico maior foi a quantidade de carboidratos liberados (Figura 5). Dessa forma o reator que recebeu o substrato pré-tratado com 10% de CH3COOH apresentou a maior liberação de carboidratos. Os resíduos advindos do processamento de frutas, devido a sua composição, são ricos em lignina, hemicelulose e celulose que apresentam estrutura molecular altamente recalcitrante e se tornam empecilhos aos processos fermentativos (CANILHA et al., 2011). O pré-tratamento ácido é um dos mais utilizados para a quebra da estrutura dos resíduos lignocelulósicos e consequente liberação de carboidratos (ASGHER et al., 2013; AGUILAR et al., 2002). Figura 5: Liberação de carboidratos nos reatores com pré-tratamento térmico e ácido Fonte: elaborado pelo autor Para o reator pré-tratado com 5% de ácido acético não houve diferença significativa entre a quantidade de carboidratos antes e após o pré-tratamento, nos testes ANOVA e Tukey para a liberação de carboidratos. Já para os reatores com pré-tratamento de 7% e 10% de ácido acético 0,00 2000,00 4000,00 6000,00 8000,00 10000,00 12000,00 14000,00 5% Ácido Acético 7% Ácido Acético 10% Ácido Acético m g /L Sem pré-tratamento Com pré-tratamento 38 foi verificada diferença significativa antes e após o pré-tratamento, porém não apresentaram diferença entre si (Tabela 5). Tabela 6: Teste de ANOVA e Tukey para a liberação de carboidratos Teste de Tukey a 5% Sem pré-tratamento (mg/L) Com pré-tratamento (mg/L) 5% CH3COOH 7% CH3COOH 10% CH3COOH 4650,00 b 5510,00 b 3826,67 b 6566,67 b 9653,33 a 11373,33 a Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias Fonte: Elaborado pelo autor 5.2.1 GERAÇÃO DE FENÓIS E FURFURAIS A análise de cromatografia líquida (Perimenis et al. 2018) demonstrou a liberação de compostos fenólicos nos reatores pré-tratados com 5%, 7% e 10% de ácido acético. O aumento nas proporções do ácido acético adicionado durante os pré-tratamentos foi diretamente proporcional às gerações de fenóis. Além disso não foram gerados furfurais. Os processos relacionados a pré-tratamentos térmicos e ácidos acabam por gerar subprodutos que são indesejáveis, como componentes fenólicos e furfurais, que causam um efeito inibidor para os microrganismos, por se tratar de um componente tóxicos para eles. A elevada concentração desses compostos no meio dificulta o crescimento das bactérias e arqueias produtoras de biogás, o que acarreta em uma menor geração de hidrogênio e metano (MOSIER et al., 2005; PEREIRA Jr et al., 2008; KUMAR, et al., 2009). (Tabela 6). 39 Tabela 7: Concentração de fenóis e furfurais nos reatores antes e depois do pré-tratamento térmico e ácido e no final do ensaio Reator Fenóis (mg/L) Furfurais (mg/L) Sem pré- tratamento Com pré- tratamento Sem pré- tratamento Com pré- tratamento 5% CH3COOH 7% CH3COOH 10% CH3COOH Controle Endógeno - - - - - 1,06 2,65 3,26 - - - - - - - - - - - - Fonte: elaborado pelo autor É possível observar que o volume de compostos fenólicos nos reatores aumentou conforme o aumento da quantidade de ácido adicionada nos reatores. Os compostos fenólicos são conhecidos por seu efeito inibidor na produção de metano durante a digestão anaeróbia. Sua alta toxicidade e baixa biodegradabilidade podem comprometer a atividade microbiana essencial para a produção de metano (Inácio et al, 2009). Em altas concentrações, esses compostos podem reduzir a eficiência da digestão anaeróbia, resultando em uma menor produção de biogás e criando um ambiente desfavorável para os microrganismos metanogênicos. 5.3 REATORES ACIDOGÊNICOS GERADORES DE HIDROGÊNIO As proporções das remoções de carboidratos foram de 88,54%; 87,37%; 88,92% e 67,37%, respectivamente nos reatores pré-tratados termicamente com adições de 5%, 7% e 10% de CH3COOH e Controle (Figura 6). Ou seja, ocorreu uma remoção maior nos que foram alimentados com resíduos pré-tratados em relação ao reator controle, demonstrando uma maior atividade dos organismos responsáveis pela produção de biogás, provavelmente devido às ofertas mais elevadas de carboidratos. 40 Figura 6: Remoção Carboidratos (em %) para tipos de pré-tratamento usando CH3COOH Fonte: elaborado pelo autor Foi feito o teste de ANOVA e Tukey para as taxas de remoção de carboidratos. Ocorreu um aumento nas taxas de remoções nos reatores com pré-tratamento de 5%, 7% e 10% de CH3COOH em relação ao controle, porém estes não apresentaram diferença significativa entre si. Dessa forma, pré-tratamento com adições mais reduzidas de ácido acético se demonstraram eficientes (tabela 7). Tabela 8: Teste de ANOVA e Tukey para a remoção de carboidratos Teste de Tukey a 5% Controle 5% de CH3COOH 7% de CH3COOH 10% de CH3COOH 67,37% b 88,54% a 87,37% a 88,92% a Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% 100,00% Controle 5% Ácido Acético 7% Ácido Acético 10% Ácido Acético Carboidratos 41 Foi verificada diferença significativa na produção acumulada de hidrogênio entre os reatores com pré-tratamento e o controle.  Ou seja, os reatores operados com pré-tratamento ácido e térmico (5%, 7% e 10% de CH3COOH) apresentaram um rendimento elevado de produção de hidrogênio, sendo estes superiores ao reator controle. Dentre as três concentrações testadas, a concentração de 7% de CH3COOH se mostrou muito eficiente na liberação de carboidratos e consequente produção de hidrogênio, obtendo a maior quantidade de geração desse biogás. Em todos os reatores não houve a fase lag de início de produção do biogás. Ou seja, a produção de biogás foi imediata. Provavelmente o enriquecimento prévio do inóculo em meio de cultivo PYG favoreceu a atividade dos microrganismos fermentativos nos reatores, demonstrada pela produção imediata de hidrogênio (De Carvalho Júnior, 2022). Em todos os reatores foram obtidos valores negativos para λ na aplicação de Gompertz, tal fato ocorre devido à falta da necessidade de adaptação dos microrganismos nos reatores, demonstrando a adaptação dos microrganismos nos reatores pelo uso de lodo granular UASB reativado e carboidratos disponíveis, com produção imediata de hidrogênio (Ribeiro, 2022). Figura 7:Volume acumulado de hidrogênio nos reatores anaeróbios por tempo Fonte: elaborado pelo autor 0,00 500,00 1000,00 1500,00 2000,00 2500,00 3000,00 3500,00 0 1 2 3 4 5 6 7 V o lu m e A cu m u la d o d e H id ro gê n io p o r V o lu m e d e R ea to r (m L H 2 /L r) Tempo (dias) Endógeno Controle 5% Ácido Acético 7% Ácido Acético 10% Ácido Acético 42 O teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de hidrogênio demonstrou o mesmo comportamento das taxas de remoções (Tabela 8). Os reatores com 5%, 7% e 10% de ácido acético obtiveram maiores produções em relação ao reator Controle (sem pré-tratamento) e ao reator Endógeno (sem resíduo). Porém, nesse caso já foi possível observar uma diferença significativa entre os reatores pré-tratados. Dessa forma, a produção acumulada de hidrogênio foi mais elevada no pré-tratamento com adições de 7% de CH3COOH (Figura 7). Com o uso da análise do gráfico ajustado com a função Gompertz modificada e do teste de ANOVA e Tukey, foi possível verificar que o reator onde ocorreram pré-tratamento tiveram uma estabilidade mais tardia, apresentando mais dias de produção de hidrogênio, quando comparados ao reator controle. Tabela 9: Teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de hidrogênio Teste de Tukey a 5% Endógeno Controle 5% CH3COOH 7% CH3COOH 10% CH3COOH 28,60 (mL H2/Lr) d 783,47 (mL H2/Lr) c 1279,00 (mL H2/Lr) b 2588,73 (mL H2/Lr) a 1421,77 (mL H2/Lr) b Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor Foram realizadas análises cromatográficas após 24 horas de operação dos reatores com produções de H2, CH4 e CO2 para os reatores que receberam resíduo pré-tratado com ácido acético (5%, 7% e 10%) respectivamente (%): H2 (84,63; 94,19; 87,13), CH4 (5,40; 2,59; 4,22) e CO2 (9,97; 3,22; 8,65). Para os reatores Controle e Endógeno as produções de H2, N2 e CO2 foram respectivamente (%): H2 (66,56), N2 (23,70) e CO2 (8,97) e; H2 (10,63), N2 (71,66) e CO2 (17,71). A baixa quantidade de metano gerado comprova a eficiência do tratamento à quente no inóculo, com a finalidade de inibir o crescimento de microrganismos consumidores de hidrogênio, como as arqueias metanogênicas hidrogenotróficas. 43 O parâmetro de potencial de produção de biogás indica a capacidade máxima do resíduo de banana em gerar biogás sob condições ideais de digestão. Este parâmetro fornece uma medida direta do potencial energético do substrato, refletindo sua eficiência. Os valores observados para este parâmetro (Tabela 9) foram semelhantes aos da produção acumulada, com o reator pré- tratado com 7% de CH3COOH apresentando a maior eficiência para a produção de hidrogênio, dentro todos os reatores. Tabela 10: Produção acumulada, potencial de produção e taxa máxima de produção nos reatores pré-tratados com CH3COOH Reator Produção acumulada (mL H2/Lr) Potencial de produção (mL H2/Lr) Rendimento (mL H2/ g DQO consumida/ L de reator) Taxa máxima de produção de biogás (mL H LR-1 d-1) Duração início da produção de biogás (h) 5% de CH3COOH 7% de CH3COOH 10% de CH3COOH Endógeno Controle Nível de significância 1279,00 b 2588,73 a 1421,77 b 28,60 b 783,47 b ** 1204,47 b 2428,65 a 1329,94 b 28,60 b 773,30 b ** 101,54 b 210,72 a 113,66 b 20,32 c 67,03 bc ** 2219,45 3223,72 2266,935 841,54 2616,10 ** 0 0 0 0 0 ** Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor 5.3.1 ANÁLISE DE ÁCIDOS PRESENTES NOS REATORES ACIDOGÊNICOS Durante a acidogênese, bactérias fermentativas convertem compostos orgânicos como bicarbonato, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido lático, etanol e outros 44 ácidos em menores quantidade em compostos mais simples. Em seguida, na fase de acetogênese, compostos orgânicos reduzidos, como ácido propiônico, butírico e lático, são oxidados resultando em hidrogênio e dióxido de carbono, que são formados por organismos formadores de hidrogênio e acetato. O gênero mais comum de bactéria presente nessa etapa é o Clostridium (BITTON, 2005). O acetato também pode ser gerado pela rota do H2/CO2 são formados por arqueias metanogênicas, que utilizam substratos como H2 e CO2, acetato e compostos metilados. A produção elevada de hidrogênio está associada com a mistura dos produtos da fermentação, como ácido acético e ácido butírico. Em contra partida, a baixa produção de hidrogênio está associada à formação de ácido propiônico, álcoois e ácido lático (Maintinguer et al, 2008). Foi realizado a análise dos ácidos orgânicos presentes nos reatores de hidrogênio no início e no final da operação destes reatores (Tabela 10). Tabela 11: Concentrações (em mg/L) de ácidos orgânicos antes e após a operação dos reatores de hidrogênio Ácido Endógeno Controle 5% de 7% de 10% de Inicial Final Inicial Final Inicial Final Inicial Final Inicial Final Acetona 6,95 2,70 8,39 5,30 6,95 5,37 2,94 9,3 3,30 - Metanol 40,81 54,97 15,63 46,39 13,69 12,70 53,36 - 53,81 38,04 Etanol 137,44 148,17 18,44 201,83 57,28 445,16 8,27 904,47 56,60 600,42 n-Butanol 11,60 11,64 13,95 11,68 10,51 10,43 13,63 - 10,91 10,82 Ác. Acético 10,03 202,30 8,58 225,40 55,19 231,36 39,11 261,36 64,82 225,35 Ác. Láctico - - 1900 7210 170 2780 210 3560 250 4520 Ác. Propiônico 15,06 12,92 7,14 9,53 15,94 15,01 10,70 14,97 15,98 15,92 Ác. Isobutírico 3,71 7,90 10,20 12,37 11,58 5,10 8,38 14,13 9,76 9,73 Ác. Butírico 5,44 37,96 10,40 174,84 12,10 105,03 13,62 108,83 10,65 109,94 Ác. Isovalérico 1,99 1,23 4,47 1,00 0,91 0,99 1,69 1,32 1,05 0,97 Ác. Valérico 2,51 1,98 1,85 3,02 1,11 3,81 - 1,47 3,33 - Ac. Capróico 6,85 3,30 1,49 6,12 2,25 4,36 2,84 1,68 2,87 3,21 Fonte: elaborado pelo autor 45 A elevada produção de etanol observada nos reatores com pré-tratamento indica uma rota metabólica voltada para a produção de etanol. Além disso, houve um aumento na quantidade de ácido acético e butírico gerados, que são as rotas principais para produções de hidrogênio a partir de açucares como glicose e frutose que estão presentes nos resíduos da banana. Freire et al 2023 comparou performance de inoculo autóctone e alóctone com resíduos sólidos da banana (casca + polpa) e obteve produções elevadas de ácido acético e etanol, como verificado no presente estudo. O ácido lático é um subproduto comum da fermentação anaeróbia em reatores que utilizam carboidratos como fonte de carbono. Durante a fermentação, a glicose é convertida em ácido lático, que pode ser posteriormente utilizado por microrganismos para produzir hidrogênio (Wang et al., 2018). Como é possível observar na Tabela 10, ocorreu o aumento da concentração de ácido láctico em todos os reatores, principalmente no reator controle. O ácido lático possui um alto valor agregado nas indústrias devido às suas múltiplas aplicações. Ele é utilizado na indústria de alimentos, farmacêutica, cosmética e até na agricultura. Na área farmacêutica, o ácido lático é essencial em formulações de medicamentos e produtos de cuidados com a saúde, graças às suas propriedades antimicrobianas e capacidade de regular o pH. Além disso, é bem conhecido por seus benefícios para a pele, sendo um componente frequente em produtos de cuidados pessoais e cosméticos. Uma das utilizações mais inovadoras do ácido lático é na produção de bioplásticos, como o poliácido láctico (PLA), que são biodegradáveis e sustentáveis. Na agricultura, o ácido lático pode ser utilizado como aditivo em rações animais para melhorar a digestibilidade e promover a saúde dos animais. Também é empregado em produtos de limpeza e desinfecção nas práticas agrícolas (CASTRO, 2024). É importante destacar que altas concentrações de ácido lático podem levar à acidose, o que prejudica o desempenho do reator e a produção de biogás. Esses ácidos desempenham um papel crucial na produção de hidrogênio em reatores anaeróbios, servindo como substratos para diferentes grupos de bactérias que convertem esses compostos em hidrogênio, conforme verificado no presente estudo. 5.4 REATORES METANOGÊNICOS 46 As proporções das remoções de Carboidratos, sendo estes remanescentes da etapa de produção de hidrogênio, foram de 76,58%; 66,81%; 63,06% e 74,84% respectivamente no reator pré-tratado termicamente com adições de 5%, 7% e 10% de CH3COOH e Controle. Foram verificados os consumos de DQO total em todos os reatores operados e as proporções das remoções foram de 93,91%; 92,09%; 96,21% e 80,66%, respectivamente nos reatores pré-tratados termicamente com adições de 5%, 7% e 10% de ácido acético e Controle. O consumo de DQO solúvel apresentou o mesmo comportamento da remoção de DQO total em todos os reatores, onde foi observado um consumo significativo nos reatores com 5%, 7% e 10% de CH3COOH (97,21%; 94,69%; 98,16%), enquanto o controle apresentou uma remoção de 77,95%. A Figura 6 apresenta as porcentagens de remoções de carboidratos, DQO total e DQO solúvel nos reatores controle e nos reatores com adição de ácido acético. As taxas de remoção de carboidratos e DQO total aumentaram com o volume de ácido adicionado nos pré-tratamentos realizados. Dessa forma, os reatores pré-tratados com ácido acético adicionados apresentaram as melhores taxas de remoção de DQO nas três variáveis analisadas, em relação ao controle. Porém não apresentaram diferença significativa entre si. Figura 8:Remoção de DQO Solúvel, DQO Total e Carboidratos (em %) para tipos de pré- tratamento usando CH3COOH Fonte: elaborado pelo autor 0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% 100,00% Controle 5% Ácido Acético 7% Ácido Acético 10% Ácido Acético Carboidratos DQO Total DQO Solúvel 47 Em todos os reatores não houve a fase lag de início de produção do biogás. Ou seja, a produção de biogás foi imediata. Provavelmente o enriquecimento prévio do inóculo em meio de cultivo Del Nery favoreceu a atividade dos microrganismos nos reatores, demonstrada pela produção imediata de CH4 (De Carvalho Júnior, 2022). Foram verificadas remoções de matéria orgânica expressas em DQO total nos reatores com pré-tratamentos térmicos e adições 5%, 7% e 10% de ácido acético, inversamente proporcional à produção acumulada de metano (Tabela 11). Os reatores metanogênicos também apresentaram uma diferença significativa na produção acumulada de metano entre o pré-tratamento e o controle.  Ou seja, os reatores operados com efluente advindo do pré-tratamento ácido e térmico (5%, 7% e 10% de CH3COOH) apresentaram um rendimento maior de produção de metano, sendo estes superiores ao reator controle. Tabela 12: Teste de ANOVA e Tukey para as remoções de Carboidratos, DQO Total e DQO Solúvel Teste de Tukey a 5% Reator Carboidratos DQO Total DQO Solúvel Controle 5% CH3COOH 7% CH3COOH 10% CH3COOH 74,84% a 76,58% a 66,81% a 63,06% a 80,66% b 93,91% a 92,09% a 96,21% a 77,95% b 97,21% a 94,69% a 98,16% a Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor Por fim, o teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de metano demonstrou o mesmo comportamento nas taxas de remoções (Tabela 12). Nos reatores operados com resíduo pré-tratado com 5%, 7% e 10% de ácido acético foi verificada a maior produção em relação ao reator Controle (efluente sem-tratamento) e ao reator Endógeno (sem resíduo). 48 Tabela 13: Teste de ANOVA e Tukey para a produção acumulada de metano Teste de Tukey a 5% Endógeno Controle 5% CH3COOH 7% CH3COOH 10% CH3COOH 1090,27 (mL CH4/Lr) c 2893,80 (mL CH4/Lr) b 6485,27 (mL CH4/Lr) a 4959,50 (mL CH4/Lr) b 4348,07 (mL CH4/Lr) b Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor Dessa forma, a produção acumulada de metano foi mais elevada no pré-tratamento com adições de 5% de CH3COOH. Nesse reator foi possível verificar os melhores potenciais de produção de metano dentre os demais experimentos realizados (Figura 9). Figura 9: Volume acumulado de metano nos reatores anaeróbios por tempo Fonte: elaborado pelo autor 0,00 1000,00 2000,00 3000,00 4000,00 5000,00 6000,00 7000,00 8000,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 C u m u la ti ve V o lu m e o f M et h an e p er R ea ct o r V o lu m e (m L C H 4 /L r) Time (days) Endógeno Controle 5% Ácido Acético 7% Ácido Acético 10% Ácido Acético 49 Novamente, em todos os reatores foram obtidos valores negativos para λ na aplicação de Gompertz, demonstrando adaptação dos microrganismos ao substrato adicionado nos reatores (Ribeiro, 2022). Foram realizadas análises cromatográficas após 24 horas de operação dos reatores com produções de CH4, CO2 e H2 (%): CH4 (59,13; 60,28; 66,75; 77,67 e 61,97); CO2 (38,70; 38,33; 23,15 ; 18,49 e 24,39) e; H2 (2,17; 1,39; 10,10 ;3,84 e 13,06), respectivamente nos reatores Controle, Endógeno e pré-tratado termicamente com 5%, 7% e 10% de ácido acético. Com o uso da análise do gráfico ajustado com a função Gompertz modificada e do teste de ANOVA e Tukey, foi possível verificar que o reator onde ocorreram pré-tratamento tiveram uma estabilidade mais tardia, apresentando mais dias de produção de metano, quando comparados ao reator controle (Figura 9). O parâmetro de potencial de produção de biogás indica a capacidade máxima do resíduo de banana em gerar biogás sob condições ideais de digestão. Este parâmetro fornece uma medida direta do potencial energético do substrato, refletindo sua eficiência. Os valores observados para este parâmetro (Tabela 13) foram semelhantes aos da produção acumulada, com o reator pré- tratado com 5% de CH3COOH seguido pelo reator pré-tratado com 7% de CH3COOH apresentando a maior eficiência para a produção de metano dentro todos os reatores. Além disso, a taxa máxima de produção de metano demonstra a facilidade do processo de digestão anaeróbia, ou seja, um valor elevado sugere que o substrato está sendo rapidamente decomposto. 50 Tabela 14: Produção acumulada, potencial de produção e taxa máxima de produção nos reatores pré-tratados com CH3COOH Reator Produção acumulada (mL CH4/Lr) Potencial de produção (mL CH4/Lr) Rendimento (mL CH4/ g DQO consumida/ L de reator) Taxa máxima de produção de biogás (mL CH4 LR-1 d-1) Duração início da produção de biogás (h) 5% de CH3COOH 7% de CH3COOH 10% de CH3COOH Endógeno Controle Nível de significância 6485,27 a 4959,50 b 4348,07 b 1090,27 c 4126,20 b ** 6326,00 a 5634,51 a 4221,24 b 973,25 c 4826,53 b ** 549,59 a 407,80 ab 347,38 b 95,19 c 422,07 ab ** 999,95 459,28 646,66 273,92 329,95 ** 0 1,31 0 0 0,18 ** Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: Elaborado pelo autor 6. T80 e PERSPECTIVA DE REUSO ENERGÉTICO (PRE) O T80 é um parâmetro técnico utilizado para descrever o tempo necessário para produzir 80% do hidrogênio (H₂) e do metano (CH₄) total durante o período de incubação em reatores de digestão anaeróbia.. Este parâmetro é crucial para avaliar a eficiência e o desempenho dos processos de digestão anaeróbia, permitindo otimizar o tempo de retenção e a operação dos reatores. O T80 calculado para os reatores acidogênicos foram: 6 horas – 0,25 dias; 12 horas – 0,5 dias; 62 horas – 2,58 dias e 18 horas – 0,75 dias, para os reatores Controle e pré-tratados com adição de 5, 7 e 10% de ácido acético respectivamente. 51 O T80 calculado para os reatores metanogênicos foram: 230 horas – 9,58 dias; 159 horas – 6,63 dias; 240 horas – 10 dias e 159 horas – 6,63 dias, para os reatores Controle e pré- tratados com adição de 5, 7 e 10% de ácido acético respectivamente. Tabela 15: Cálculo do T80 para os reatores de Hidrogênio e Metano T80 Hidrogênio T80 Metano Controle 5% de CH3COOH 7% de CH3COOH 10% de CH3COOH 6 horas (0,25 dias) 12 horas (0,5 dias) 62 horas (2,58 dias) 18 horas (0,75 dias) 230 horas (9,58 dias) 159 horas (6,63 dias) 240 horas (10 dias) 159 horas (6,63 dias) Fonte: elaborado pelo autor A Perspectiva de Reuso Energético (PRE) envolve a adoção de fontes de energia renováveis e o uso de tecnologias sustentáveis com o objetivo de diminuir a dependência de combustíveis fósseis e reduzir os impactos ambientais (ELSEVIER, 2019). Figura 10: Perspectiva de Reuso Energético (PRE) dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 7% de ácido acético Fonte: elaborado pelo autor 297,95 603,75 331,93 4700,84 3595,05 3151,93 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5% 7% 10% KJ Mol^(-1) Hidrogênio Metano 52 Dessa forma a Perspectiva de Reuso Energético Total dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 7% de CH3COOH foram, respectivamente, 3918,98 e 3361,57 KJ Mol -1. Assim o reator com 5% de ácido acético apresentou uma melhor eficiência energética. Foi realizado o teste de ANOVA e Tukey para verificar se ocorria uma diferença significativa entre os valores de PRE obtidos, cujo resultado pode ser encontrado na tabela 14. Tabela 16: Teste de ANOVA e Tukey para o Potencial de Reuso Energético Total dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 7% de Ácido Acético Reator Perspectiva de Reuso Energético Total 5% CH3COOH 4998,79 kJ mol -1 a 7% CH3COOH 4198,80 kJ mol -1 b 10% CH3COOH 3483,69 kJ mol -1 c Letras iguais na mesma coluna indicam que, no nível de 5% de significância, não há diferença entre as médias. Fonte: elaborado pelo autor 7. ANÁLISE DA DIVERSIDADE MICROBIANA EM LARGA ESCALA Por fim, foi realizada a extração e análise de DNA do lodo in natura, lodo enriquecido com meio PYG, lodo enriquecido com meio Del Nery, Controle e do reator pré-tratado com 7% de ácido acético adicionado. Entretanto, a diversidade microbiana dos reatores pré-tratados com adição de 5 e 10% ainda não foram quantificados. O avanço das técnicas de sequenciamento metagenômico permitiu uma melhor compreensão da comunidade do microbiana de lodos e dos microrganismos responsáveis pela conversão da matéria orgânica em metano. O sequenciamento das amostras para identificação dos microrganismos presentes nos reatores permitiu uma avaliação da abundância relativa destes nos reatores operados. Com isso, as abundâncias relativas dos gêneros de bactérias e arqueias encontradas nas análises efetuadas estão apresentadas a seguir. 7.1 REATORES ACIDOGÊNICOS 53 A abundância relativa dos principais gêneros dos Domínios Bacteria e Archaea para o lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG; reator Controle e reator que recebeu resíduo pré- tratado com 7% de ácido acético está ilustrada na Figura 11 e foram identificados os gêneros Smithella, Sporolactobacillus, Candidatus Nitrosoarchaeum, Incertae Sedis, Sporanaerobacter, Fonticella, Methanothrix, Clostridium e Paraclostridium. Smithella é um gênero de bactérias anaeróbias facultativas caracterizadas por oxidantes de propionato e sintróficos (Kuever, 2014). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas na amostra do lodo in natura (8%). Figura 11: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Bactéria para o lodo in natura; Lodo enriquecido com meio PYG; Controle e 7% de ácido acético adicionado nos reatores de hidrogênio em (a) gráfico de barra e (b) Diagrama de Circus (a) 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Lodo in natura Lodo enriquecido com Meio PYG Controle 7% de Ácido Acético Paraclostridium Clostridium NA Fonticella Methanothrix Sporanaerobacter Smithella Incertae Sedis Candidatus Nitrosoarchaeum Sporolactobacillus 54 (b) Fonte: elaborado pelo autor Sporolactobacillus é um gênero de bactérias anaeróbias, formadoras de endósporos, gram- positivas, móveis e em forma de bacilo que produzem ácido lático (Huang et. al, 2007). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do reator pré-tratado com 7% de ácido acético (6%), não sendo observada nas demais amostras. Candidatus Nitrosoarchaeum é um gênero de arqueias oxidantes de amônia que desempenham um papel crucial no ciclo do nitrogênio. Essas arqueias convertem amônia em nitrito, uma etapa essencial no processo de nitrificação (Zhalnina etl al, 2014). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do lodo in natura (6%), não sendo observada nas demais amostras. 55 O gênero Incertae Sedis encontrado nessa fase faz parte da família Symbiobacteraceae. A fermentação anaeróbia usa vários microrganismos para converter materiais orgânicos em hidrogênio e outros subprodutos. Embora não haja muitas informações específicas sobre bactérias da família Symbiobacteraceae na produção de hidrogênio, sua capacidade de viver em simbiose com outros microrganismos pode ser explorada em sistemas fermentativos complexos (Cabrol et al, 2017). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do lodo enriquecido com meio PYG (7%), não sendo observada nas demais amostras. Sporanaerobacter é um gênero de bactéria estritamente anaeróbias e ocorrem na forma de bacilos (bastonetes) que podem ser encontrados sozinhos ou em pares. Eles são móveis graças a alguns flagelos laterais e têm uma parede celular Gram-positiva (Midas Field Guide, 2024). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do lodo enriquecido com meio PYG (9%) não sendo observada nas demais amostras. Fonticella é um género de bactérias estritamente anaeróbia, moderadamente termofílica, halotolerante e não móvel. Essas bactérias são interessantes por sua capacidade de sobreviver em condições extremas (Im et. al, 2023). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do lodo enriquecido com meio PYG (9%) não sendo observada nas demais amostras. O gênero de arqueia Methanothrix (também conhecida como Methanosaeta) é especializada em metanogênese acetoclástica que utiliza o acetato como principal fonte de carbono e energia para produção (Jiang et al., 2023). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo in natura e nos reatores controle e com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (3%; 7% e 1%, respectivamente) não sendo observada na amostra do lodo enriquecido com meio PYG. O gênero Clostridium é um dos principais gêneros de bactérias que realiza a etapa de hidrólise que consiste na conversão de partículas em materiais dissolvidos mais simples que conseguem passar pela parede celular das bactérias fermentativas para seus metabolismos (De Carvalho Júnior, 2022). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo enriquecido com meio PYG e nos reatores controle e com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (19%; 13% e 33%, respectivamente) não sendo observada na amostra do lodo in natura. 56 O gênero Paraclostridium está presente em resíduos lignocelulósicos utilizados para a produção de hidrogênio (Rabelo et al., 2020). Elas também foram identificadas em lodo anaeróbio de esgoto doméstico, observando sua dominância frequentemente associada à alta produção de hidrogênio em reatores anaeróbios, juntamente com a produção de ácido acético (Yang et al., 2019). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo enriquecido com meio PYG e nos reatores controle e com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (8%; 78% e 48%, respectivamente) não sendo observada na amostra do lodo in natura. O gênero Smithella foi identificado exclusivamente no lodo in natura, destacando seu papel específico como oxidante de propionato. Já o gênero Sporolactobacillus foi verificado apenas nos reatores pré-tratados com 7% de ácido acético, demonstrando a sua resistência no pré-tratamento. As arqueias do gênero Candidatus Nitrosoarchaeum foram observadas no lodo in natura, evidenciando sua importância no ciclo do nitrogênio. A presença de Incertae Sedis da família Symbiobacteraceae no lodo enriquecido com meio PYG sugere uma possível simbiose com outros microrganismos durante a fermentação anaeróbia. Os gêneros Sporanaerobacter e Fonticella foram predominantes nas amostras de lodo enriquecido com meio PYG, ressaltando suas capacidades de sobreviver em condições específicas e extremas. Methanothrix, uma arqueia especializada em metanogênese acetoclástica, variou em sua presença dependendo do tratamento aplicado, sendo mais abundante nos reatores com pré-tratamento. Por fim, os gêneros Clostridium e Paraclostridium mostraram diferentes níveis de abundância conforme o meio e o tratamento. O gênero Clostridium teve um papel importante na hidrólise, enquanto Paraclostridium se associou à produção de hidrogênio em condições específicas. Esses resultados destacam a importância da caracterização microbiana para compreender os processos de digestão anaeróbia e a eficiência na produção de biogás. 7.2 REATORES METANOGÊNICOS A abundância relativa dos principais gêneros do Domínio Bacteria para o Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores metanogênicos está ilustrada na Figura 12. 57 Figura 12: Abundância relativa dos principais gêneros do Domínio Bacteria para o Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores metanogênicos: (a) gráfico de barra e (b) diagrama de Circus (a) (b) Fonte: elaborado pelo autor 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Lodo in natura Lodo enriquecido com Meio Del Nery 7% de Ácido Acético Incertae Sedis Incertae Sedis Macellibacteroides Petrimonas Smithella Candidatus Cloacimonas Candidatus Nitrosoarchaeum Incertae Sedis #N/A 58 O gênero Petrimonas pode desempenhar um papel importante nos reatores de biogás, apesar de não ser tipicamente associada à produção de metano. Nesses sistemas, o gênero Petrimonas pode contribuir para a degradação de material orgânico, auxiliando indiretamente na produção de metano (Maus et. al, 2020). Abundâncias relativas desse gênero foram verificadas nas amostras do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (2% e 7%, respectivamente), não estando presente na amostra do lodo in natura. Bactérias das famílias Fermentibactereraceae, Anaerolineaceae, Bacteroidetes e bactérias do gênero Macellibacteroides podem desempenhar um papel nos estágios iniciais da digestão anaeróbia, degradando a matéria orgânica complexa, que pode ser processada por arqueias metanogênicas para produzir metano (McIlroy et. al, 2017). Abundâncias relativas dessas famílias foram verificadas nas amostras do lodo in natura, do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético, sendo 3%, 4% e 2% respectivamente para a família Fermentibactereraceae, 2%, 5% e 8% respectivamente para a família Anaerolineaceae e 0%, 3% e 6% respectivamente para o gênero Macellibacteroides. Candidatus Cloacimonas é um gênero de bactérias que pertence ao filo Candidatus Cloacimonadota; produzem hidrogênio e estão envolvidos na oxidação do propionato em acetato e CO2 (Pelletier et al., 2008). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo in natura, do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (4%, 5% e 3%, respectivamente). Candidatus Nitrosoarchaeum é um gênero de arqueias oxidantes de amônia que desempenham um papel crucial no ciclo do nitrogênio. Essas aqueias convertem amônia em nitrito; uma etapa essencial no processo de nitrificação (Zhalnina etl al, 2014). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo in natura, do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (6%, 4% e 3%, respectivamente). Smithella é um gênero de bactérias anaeróbias facultativas oxidantes de propionato, conforme descrito anteriormente (Kuever, 2014). Abundâncias relativas desse gênero foram verificadas nas amostras do lodo in natura, do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (8%, 6% e 2%, respectivamente). 59 A família Bacteroidetes-vadinHA17 são conhecidas por fermentar glicose em acetato e hidrogênio/dióxido de carbono. Elas desempenham um papel significativo nas etapas iniciais da digestão anaeróbia, decompondo a matéria orgânica complexa, que pode ser processada por arqueias metanogênicas para produzir metano (Gao et. al, 2024). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado nas amostras do lodo in natura, do lodo enriquecido com meio Del Nery e no reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (3%, 8% e 9%, respectivamente). A análise metagenômico das amostras evidenciou a diversidade de vários gêneros de bactérias e arqueias nos diferentes estágios da digestão anaeróbia. Embora o gênero Petrimonas não seja tipicamente associada à produção de metano, estudos apontam seu papel na decomposição do material orgânico, facilitando a ação dos metanogênicos. As abundâncias desse gênero foram maiores no lodo enriquecido em meio Del Nery e no pré-tratamento com 7% de ácido acético. As bactérias das famílias Fermentibactereraceae, Anaerolineaceae, Bacteroidetes e do gênero Macellibacteroides desempenham papéis cruciais na quebra de matéria orgânica complexa, criando condições favoráveis para a produção de metano. A presença de Candidatus Cloacimonas e Candidatus Nitrosoarchaeum destaca suas funções na oxidação do propionato e na nitrificação, respectivamente. As arqueias do gênero Methanothrix são fundamentais para a metanogênese acetoclástica, utilizando acetato como fonte principal de carbono e energia. Smithella e Bacteroidetes-vadinHA17 também são essenciais para a digestão anaeróbia, atuando como oxidantes de propionato e fermentadores de glicose. A abundância relativa dos principais gêneros do Domínio Archaea para o Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores metanogênicos está ilustrada na Figura 13. 60 Figura 13: Abundância relativa dos principais gêneros para o Domínio Archaea para Lodo in natura; Lodo enriquecido com meio Del Nery e 7% de ácido acético adicionado nos reatores de metano: (a) gráfico de barra e (b) diagrama de Circus (a) (b) Fonte: elaborado pelo autor 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Lodo in natura Lodo enriquecido com Meio Del Nery 7% de Ácido Acético Methanothrix Methanoregula Candidatus Methanofastidiosum Incertae Sedis Incertae Sedis LCB-4 Incertae Sedis Methanobacterium Candidatus Methanomethylicus Methanomassiliicoccus #N/A Hadarchaeum 61 Arqueias do gênero Methanosarcina são conhecidas por produzir metano usando todas as três vias metabólicas para metanogênese (hidrogenotrófica, acetogênica e metilotrófica) (Galagan et al., 2002). Tal gênero possui arqueias que favorecem o consumo de metabólitos a partir da acidogênese, contribuindo para a manutenção do pH (Rodrigues et al., 2023). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado apenas nas amostras do reator com pré-tratamento com adição de 7% de ácido acético (9%), não sendo verificada nos demais reatores. Methanospirillum é um dos principais gêneros de arqueias acetoclásticas que metabolizam acetato e transformam em metano e CO2. Porém, também podem produzir metano pela via hidrogenotrófica, que metabolizam CO2 e H2 e transformam em metano (CHERNICHARO, 2007). Abundâncias relativas desse gênero foi verificado