RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 25/10/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO “Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis” Araraquara, SP 2021 RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO “Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis” Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, área de Biotecnologia, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan Coorientadora: Drª. Patricia Bento da Silva Araraquara, SP 2021 Machado, Rachel Temperani Amaral. M149e Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina) ferro (II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis / Rachel Temperani Amaral Machado. – Araraquara: [S.n.], 2021. 62 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de concentração: Biotecnologia. Orientadora: Fernando Rogério Pavan. Coorientadora: Patricia Bento da Silva. 1. Mycobacterium tuberculosis. 2. Fenantrolina. 3. Tris1. 4. 10-fenantrolina ferro(II). 5. Sistema lipídico nanoestruturado. 6. Novos antibióticos. I. Pavan, Fernando Rogério, orient. II. Silva, Patricia Bento da, coorient. III. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030081P7 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lipídico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO ORIENTADOR: FERNANDO ROGERIO PAVAN COORIENTADORA: PATRÍCIA BENTO DA SILVA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA, área: Análises Clínicas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. FERNANDO ROGERIO PAVAN (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Biologicas / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas UNESP Araraquara Prof. Dr. ROBERTO SANTANA DA SILVA (Participaçao Virtual) Departamento de Física e Química / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP - Ribeirão Preto Prof. Dr. MARLUS CHORILLI (Participaçao Virtual) Departamento de Fármacos e Medicamentos / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 25 de outubro de 2021 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. Agradecimentos Aos meus pais, Flavio e Rosangela e a minha irmã Larissa que nunca mediram esforços para me apoiar e me fazer feliz. A Camila, minha noiva. Obrigada por todo o amor, paciência, cooperação, incentivo e ativa participação em todos os momentos de minha vida. A todos os meus amigos e colegas de laboratório e da pós-graduação, pelo apoio, suporte e ensinamento. Agradeço por todos os nossos momentos compartilhados, sendo estes difíceis ou alegres. Ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan, por toda sua dedicação e pela confiança e liberdade a mim concebidos para o desenvolvimento deste trabalho. A minha coorientadora, Drª Patrícia Bento da Silva, por ser durante todos esses anos o meu “porto seguro científico”, com toda sua paciência, seu companheirismo, sua dedicação e conhecimento. Ao CNPQ (processo: 130612/2019-7) e à FAPESP (processo: 2019/10326-7) pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho, sem o qual para mim este sonho não seria possível. Ao programa de Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia de UNESP-AQA e à Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP de Araraquara, o local que com muito orgulho e honra considero minha casa. “O primeiro dever da inteligência é desconfiar dela mesma.” - Albert Einstein Resumo A tuberculose (TB), apresenta cerca de 10 milhões de casos por ano em todo o mundo. Além disso, as elevadas taxas de resistência às principais classes de antimicrobianos contribuem para que a TB se encontre entre os maiores causadores de morte por um agente infeccioso. Sendo assim, faz-se evidente a necessidade de controle e combate dessa doença que representa uma séria ameaça à saúde pública global. Para tanto, é preciso enfrentar o desafio do desenvolvimento de novos agentes ativos contra a TB. Nesse trabalho, o complexo metálico tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) ([Fe(fen)3]2+), foi selecionado para o estudo, visto que trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram que este complexo é um bom candidato contra TB. Além disso, quando incorporado a um sistema lipídico nanoestruturado (SLN) demonstrou boa biodisponibilidade oral. Diante desses fatos, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o complexo incorporado ao SLN e verificar sua atividade anti-Mycobacterium. tuberculosis. A frequência de resistência do Mycobacterium tuberculosis a [Fe(fen)3]2+ é menor do que a de outros fármacos de primeira linha para o tratamento da tuberculose, como a rifampicina. Ele se mostrou específico na inibição de micobactérias. Foi possível obter sistemas lipídicos nanoestruturados constituídos de colesterol como fase oleosa, fosfatidilcolina de soja, oleato de sódio e Eumulgin® HRE 40 [óleo de rícino de polioxil 40 hidrogenado]; na proporção de 3: 6: 8, como tensoativo e tampão-fosfato pH 7,4 como fase aquosa (SLN) e incorporar com sucesso o complexo [Fe(fen)3]2+ ao mesmo (SLN+([Fe(fen)3]2+)). A formulação de SLN+[Fe(fen)3]2+ revelou-se estável por até 90 dias a 5ºC e também se apresentam estáveis após 24h em soluções de pHs que remetem os encontrados no estômago e no sangue, e em contato com meios de cultura utilizados em outras metodologias in vitro, comprovando a integridade das partículas durante estes ensaios. O SLN mostrou uma taxa de eficiência de encapsulamento próxima a 60% de [Fe(fen)3]2+. Partículas de SLN+[Fe(fen)3]2+ mostraram-se homogêneas (PdI = 0,17), apresentando carga superficial negativa de -34,7mV e tamanho médio de 163nm, definido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e confirmado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), que também revelou sua morfologia esférica. [Fe(fen)3]2+ apresentou um valor de CIM90 de 4,17 µM na sua forma livre e 23,39 µM quando incorporado no SLN. Estudos futuros devem analisar o perfil de liberação in vitro, a atividade in vivo e segurança do SLN+[Fe(fen)3]2+ para entender se esta combinação tem potencial para prosseguir como candidato a contra a tuberculose. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, fenantrolina, tris1,10-fenantrolina ferro (II), sistema lipídico nanoestruturado, novos antibióticos. Abstract Tuberculosis (TB) presents about 10 million cases per year worldwide. In addition, the high rates of resistance to the main classes of antimicrobials contribute to TB being among the biggest killers of an infectious agent. Thus, the need to control and combat this disease, which represents a serious threat to global public health, is evident. Therefore, it is necessary to face the challenge of developing new agents active against TB. In this work, the metallic complex tris-(1,10-phenanthroline)iron(II) ([Fe(phen)3]2+) was selected for the study, as previous works by our group demonstrated that this complex is a good candidate against TB. Furthermore, when loaded into a nanostructured lipid system (NLS) it demonstrated good oral bioavailability. Given these facts, the objective of this work was to characterize the complex incorporated into NLS and verify its anti-Mycobacterium tuberculosis activity. The frequency of resistance of Mycobacterium tuberculosis to [Fe(phen)3]2+ is lower than that of other first-line drugs for the treatment of tuberculosis, such as rifampicin. It has been shown to be specific in inhibiting mycobacteria. It was possible to obtain NLS consisting of cholesterol as the oil phase, soy phosphatidylcholine, sodium oleate and Eumulgin® HRE 40 [polyoxyl 40 hydrogenated castor oil]; in a ratio of 3: 6: 8, as surfactant and phosphate-buffer pH 7.4 as aqueous phase, and successfully load the complex [Fe(phen)3]2+ to it (NLS+[Fe(phen)3]2+). The NLS+[Fe(phen)3]2+ formulation proved to be stable for up to 90 days at 5°C and are also stable after 24 hours in solutions with pHs that match those found in the stomach and blood, and in contact with means of culture used in other in vitro methodologies, proving the integrity of the particles during these assays. NLS showed a entrapment efficiency rate close to 60% of [Fe(phen)3]2+. NLS+[Fe(phen)3]2+ particles were homogeneous (PdI = 0.17), with a negative surface charge of -34.7mV and average size of 163nm, defined by the dynamic light scattering (DLS) technique and confirmed by transmission electron microscopy (TEM), which also revealed its spherical morphology. [Fe(phen)3]2+ had a MIC90 value of 4.17 µM in its free form and 23.39 µM when incorporated into NLS. Future studies must analyze the in vitro release profile, and the in vivo activity and safety of NLS+[Fe(phen)3]2+ in order to fully understand whether this combination of the [Fe(phen)3]2+ and the NLS has the potential to proceed as a drug candidate against TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis, phenanthroline, tris 1,10-phenantroline iron (II), new antibiotics Lista de Siglas e Abreviaturas [Fe(fen)3]2+ tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) [Fe(phen)3]2+ tris-(1,10-phenantrolin)iron(II) ATR Attenuated total reflectance BCG Bacilo Calmette-Guérin bipi Bipiridina CIM Concentração Inibitória Mínima COVID-19 Coronavirus disease 2019 DLS Dynamic Light Scattering DL% Drug loading capacity DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxide EE% Entrapment efficiency EMA Agência Europeia de Medicamentos ETB etambutol, ethambutol FDA Food and Drug Administration Fe Ferro, Iron fen Fenantrolina FTIR Fourier Transform Infrared HIV Vírus da imunodeficiência humana ICP-Ms Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometrometry INH isoniazida, isoniazid IPD Índice de Polidispersão LOD Limit of detection MIC Minimum inhibitory concentration NLS Nanostructured lipid system NLS+[Fe(phen)3]2+ tris-(1,10-phenantrolin)iron(II) loaded into the Nanostructured lipid system OADC Suplemento de meio de cultura, a base de ácido oleico, albumina, dextrose e catalase; oleic acid, albumin, dextrose and catalase OMS Organização Mundial da Saúde PdI Polydispersity index PNCT Programa Nacional de Controle da Tuberculose PZ Potencial Zeta PZA pirazinamida, pyrazinamide REMA Resazurin Microtiter Assay RIF rifampicina, rifampicin SARS-CoV-2 Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida SLN Sistema Lipídico Nanoestruturado TB Tuberculose, Tuberculosis TB-MDR Tuberculose multidroga resistente TB-XDR Tuberculose extensivamente resistente TEM Transmission electron microscope UFC Unidades formadoras de colônia ZP Zeta Potential Z average Mean particle size Lista de Figuras Capítulo I Figura 1. Esquema terapêutico para TB suscetível aos fármacos. ........................... 14 Figura 2. Estimativa da OMS de números de casos de tuberculose resistente aos fármacos e porcentagem de tratamento em 2019. .................................................... 16 Figura 3. Estrutura química da 1,10-fenantrolina. ..................................................... 18 Figura 4.Estrutura química de tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) - ([Fe(fen)3]2+). .......... 19 Capítulo II Figure 1.Vibrational spectra in the infrared region of the aqueous solution and freeze- dried [Fe(phen)3]2+ ........................................................ Erro! Indicador não definido. Figure 2.(I) DLS size distribution by intensity for NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+; (II) Zeta Potential for NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+. (III) TEM micrographs illustrating the size and morphology.. .......................................................... Erro! Indicador não definido. Figure 3.Values and 95% confidence interval of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at 5ºCErro! Indicador não definido. Figure 4.Values and 95% confidence interval (95% CI) of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at room temperature......... Erro! Indicador não definido. Figure 5.Values and 95% confidence interval (95% CI) of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at 37ºCErro! Indicador não definido. Figure 6. Mean particle size (Z Average), Polydispersity Index (PdI) and Zeta Potential (ZP) values of NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+, in solutions with different pHs.. ....... Erro! Indicador não definido. Figure 7.Mean particle size (Z Average), Polydispersity Index (PdI) and Zeta Potential (ZP) values of NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+, in culture medium.Erro! Indicador não definido. file:///C:/Users/Rachel%20Temperani/Desktop/Dissertação%20Rachel%20-%2014082021.docx%23_Toc82359841 Lista de Tabelas Capítulo II Table 1. Vibrational frequencies in the infrared region (cm-1) referring to the aqueous solution and freeze-dried [Fe(phen)3]2+, and their respective assignments .......... Erro! Indicador não definido. Table 2. Minimum inhibitory concentration (MIC90) of [Fe(phen)3]2+, rifampicin (RIF) and isoniazid (INH) against a variety of bacterial strains.Erro! Indicador não definido. Table 3. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC90) of tris-(1,10- phenanthroline) iron (II) complex against the sensitive strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv. ..................................................... Erro! Indicador não definido. Sumário Capítulo I ................................................................................................................... 11 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 12 1.1 Tuberculose: Dados gerais, epidemiologia e tratamento ................................. 12 1.2 Complexos Metálicos e tris-(1-10-fenantrolina)ferro(II) ................................ 17 1.3 Nanotecnologia Farmacêutica e os Sistema Lipídicos Nanoestruturados.... 19 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 23 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 23 2.2 Objetivos específicos: .................................................................................. 23 3. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 24 Capítulo II ..................................................................... Erro! Indicador não definido. Abstract ........................................................................ Erro! Indicador não definido. Introduction................................................................... Erro! Indicador não definido. Materials and Methods ................................................. Erro! Indicador não definido. 1. Compounds and anti-TB drugs ........................... Erro! Indicador não definido. 2. Bacterial culture .................................................. Erro! Indicador não definido. 3. Fourier Transform Infrared (FTIR) ...................... Erro! Indicador não definido. 4. Biological Assays ................................................... Erro! Indicador não definido. a. Evaluation of activity spectrum ........................ Erro! Indicador não definido. b. Resistance frequencies ................................... Erro! Indicador não definido. c. Anti-Mycobacterium tuberculosis analysis ....... Erro! Indicador não definido. 5. NLS obtaining and [Fe(phen)3]2+ incorporation ... Erro! Indicador não definido. 6. NLS Characterization ......................................... Erro! Indicador não definido. a. Microscopy ...................................................... Erro! Indicador não definido. b. Dynamic Light Scattering (DLS) ...................... Erro! Indicador não definido. c. Storage Stability .............................................. Erro! Indicador não definido. d. Stability in culture media and solutions with different pHs ...... Erro! Indicador não definido. e. Entrapment efficiency and Drug loading capacity ........... Erro! Indicador não definido. f. Quantification by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometrometry (ICP- MS) Erro! Indicador não definido. Results ......................................................................... Erro! Indicador não definido. 1. Fourier Transform Infrared (FTIR) ...................... Erro! Indicador não definido. 2. Biological Assays ................................................ Erro! Indicador não definido. a. Evaluation of activity spectrum ........................ Erro! Indicador não definido. b. Resistance frequencies ................................... Erro! Indicador não definido. c. Anti-Mycobacterium tuberculosis analysis ....... Erro! Indicador não definido. 3. NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ Characterization .... Erro! Indicador não definido. a. DLS data and TEM images ............................. Erro! Indicador não definido. b. Storage Stability .............................................. Erro! Indicador não definido. c. Stability in culture media and solutions with different pHs ...... Erro! Indicador não definido. d. Entrapment efficiency ...................................... Erro! Indicador não definido. Discussion .................................................................... Erro! Indicador não definido. References ................................................................... Erro! Indicador não definido. Capítulo I 12 1. INTRODUÇÃO 1.1 Tuberculose: Dados gerais, epidemiologia e tratamento A tuberculose (TB) é uma das doenças mais antigas do mundo. Evidências encontradas em múmias egípcias datadas de 2400 a.C. revelaram deformidades esqueléticas típicas da tuberculose (BARBERIS et al., 2017). Apesar de sua origem antiga, ainda hoje ela representa um grande desafio para a saúde pública mundial. É uma doença infectocontagiosa causada pelo complexo Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii e Mycobacterium canettii) (ZUMLA; NAHID; COLE, 2013). Sendo o M. tuberculosis sua principal espécie causadora, identificada pelo alemão Robert Koch, em 1882. Embora afete comumente os pulmões, também pode afetar outros órgãos sendo então denominada TB extrapulmonar (PAI et al., 2016). Em geral, a transmissão da doença ocorre quando indivíduos sadios entram em contato com gotículas (aerossóis) expelidas por indivíduos infectados pelo bacilo em sua forma ativa, através da tosse, espirros ou fala, por exemplo. Somente uma pequena taxa de indivíduos que foram expostos, cerca de 5 a 10 %, desenvolverão a doença. No entanto, a probabilidade de desenvolver TB é muito maior entre aqueles coinfectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), também é maior entre as pessoas afetadas por fatores de risco como desnutrição, diabetes, tabagismo e consumo de álcool (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). Os indivíduos expostos ao bacilo que não desenvolvem a doença apresentam resposta imune celular eficaz para conter a infecção, e então o M. tuberculosis pode assumir o estado de latência (WARD; HOYE; TALAAT, 2008). O processo de TB latente ocorre quando nos pulmões, macrófagos fagocitam os bacilos, esse processo induz uma resposta pró-inflamatória com o recrutamento de mais macrófagos, linfócitos T, plasmócitos e fibroblastos, iniciando a formação do granuloma. Nesse complexo a bactéria permanece em um estado não-replicante (dormente), considerado não infeccioso e que pode permanecer assim por anos. No entanto, à medida que a imunidade diminui, através do envelhecimento ou da imunossupressão, os bacilos dormentes podem ser reativados, o que resulta no desenvolvimento da 13 forma ativa da TB no indivíduo, que muitas vezes ocorre décadas após a infecção inicial (RUSSELL, 2007). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que houve cerca de 10 milhões de casos de TB no mundo em 2019. Deste total 1,4 milhão vieram a óbito em decorrência da doença, dos quais 208.000 mortes correspondem a coinfecções TB-HIV. As coinfecções de TB e HIV recebem grande atenção pois a interação entre as duas doenças apresenta altas taxas de morbidade e de mortalidade, chegando a ser nomeada como “dueto maldito”. Nos dias atuais outra infecção que é capaz de recordar esse dueto, junto com a TB, é a da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) causadora da COVID-19 (coronavirus disease 2019) (VISCA et al., 2021). Mais evidências são necessárias para compreender o potencial da COVID-19 em impactar na reativação de bacilos em estado de latência, por exemplo. Mas alguns autores já trazem a discussão de que a imunossupressão causada pela própria doença ou pelo uso de medicamentos durante o tratamento da COVID-19 poderão impactar futuramente neste quesito (CRISAN-DABIJA et al., 2020; SILVA et al., 2021; YANG; LU, 2020). A pandemia de COVID-19 poderá afetar drasticamente a carga global tuberculose nos próximos anos, aumentando o número de mortes em decorrência da doença já que em muitos locais os serviços de saúde apresentam-se sobrecarregados diminuindo os números de detecção e tratamentos de TB. A estimativa da OMS é de que houveram 1,8 milhões de mortes por TB em 2020 no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). O Brasil encontra-se entre os 30 países que juntos, concentram 87% dos casos da doença no mundo. Nos últimos anos o país encontra-se em uma tendência de alta no número de incidência de casos. No ano de 2019, foram notificados 96mil novos casos e 4,9 mil mortes por esta patologia, além de mais 1,8 mil mortes entre os portadores de HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). No país, geralmente a doença está relacionada com as más condições de moradia, nutrição e saneamento básico, ao uso e abuso de álcool, drogas ilícitas e às doenças imunossupressoras, como a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) afetando, principalmente, as periferias urbanas, como as favelas e as áreas degradadas dos grandes centros (MINISTÉRIO DA SAÚDE BRASIL, 2017). A única vacina licenciada para prevenção da tuberculose é a BCG ou bacilo Calmette-Guérin. A BCG foi desenvolvida há quase 100 anos e previne formas graves de TB em crianças, sendo amplamente utilizada. Atualmente, não existe uma vacina 14 eficaz na prevenção da doença em adultos, embora os resultados de um estudo de fase II do candidato M72/AS01E sejam promissores (VAN DER MEEREN et al., 2018). O tratamento de novos casos de TB suscetível no Brasil conta com um esquema terapêutico de duas fases (Figura 1), fase intensiva (Fig 1a) e fase de manutenção (Fig 1b). Segundo o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), na fase intensiva, que corresponde a um período de dois meses, são administrados por via oral a combinação de quatro fármacos de primeira-linha, rifampicina (RIF), isoniazida (INH), etambutol (ETB) e pirazinamida (PZA). Após este período, inicia-se a fase de manutenção, em que se utiliza apenas RIF e INH por mais quatro meses de tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE BRASIL, 2017; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). A Fase de manutenção pode se estender por mais 3 meses, totalizando 7 meses, em casos em que o paciente possui um maior risco de recidiva como, por exemplo, no caso de HIV positivos, imunossupressão, diabéticos insulinodependentes, fumantes etc. Os quatro fármacos utilizados no esquema terapêutico padrão desde o ano de 2009, possuem mecanismos de ação diferentes, fator que contribuiu para uma grande diminuição no tempo de tratamento, que até a década de 60 era de 18 meses de duração (RABAHI et al., 2017). Figura 1. Esquema terapêutico para TB suscetível aos fármacos. Fonte: Autora A RIF age inibindo a elongação do RNA durante o processo de transcrição impedindo a síntese de proteínas das células da micobactéria. A PZA ainda não possui seu mecanismo de ação completamente desvendado, mas sabe-se que seu 15 metábolito ativo, o àcido propiônico reduz o pH intramacrofágico impedindo o crescimento dos bacilos. Os fármacos INH e ETB inibem a formação da parede celular das células das micobacterias impedindo a formação de dois dos principais constituintes da mesma, que são os acídos micolicos e arabinogalactanos, respectivamente. A INH, fármaco específico em inibir micobacterias, é um profármaco que quando ativado pela ennzima KatG gera espécies reativas de oxigênio que impedem a formação dos ácidos micólicos. Enquanto o ETB possui como alvo a arabinosil transferase interrompendo a formação da camada de arabinogalactano (SHETYE; FRANZBLAU; CHO, 2020). Quando o tratamento de primeira-linha se mostra ineficaz devido à resistência do bacilo aos fármacos, realiza-se o tratamento com fármacos de segunda-linha por exemplo, pertencentes ao grupo de aminoglicosídeos injetáveis e ao grupo de fluoroquinolonas. A TB multidroga resistente (TB-MDR) é definida como a resistência do bacilo aos dois principais fármacos de primeira-linha, INH e RIF. Uma nova definição da Organização Mundial da Saúde, é a forma de pré resistência estendida (Pré-TB-XDR) que se caracteriza pela resistência a INH e RIF somada a qualquer uma das fluoroquinolonas. Já a forma de resistência estendida (TB-XDR) atende a definição de Pré-TB-XDR além de também ser resistente a um dos fármacos de segunda-linha, bedaquilina ou linezolida (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2021). Somente no ano de 2019 a estimativa foi de 465.000 casos com apenas 38% destes casos recebendo o tratamento adequado (figura 2), 182.000 mortes causadas por TB-MDR e o relato de TB-XDR em 128 países (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020). 16 Figura 2. Estimativa da OMS de números de casos de tuberculose resistente aos fármacos e porcentagem de tratamento em 2019. Fonte: https://www.who.int/campaigns/world-tb-day/world-tb-day-2021/campaign-materials O regime de tratamento para TB-MDR é mais longo e requer fármacos mais caros e mais tóxicos. Para a maioria dos pacientes com TB-MDR, as taxas de sucesso do tratamento são muito menores do que aqueles para a TB suscetível a fármacos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020). Em 2013, dois novos fármacos (bedaquilina e delamanida) foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA e pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA) para uso na terapia anti-TB (MAHAJAN, 2013; RYAN; LO, 2014). No entanto, eles receberam apenas uma aprovação regulatória condicional, sendo reservados para os casos de TB-MDR e utilizados na terceira linha de tratamento. Uma das maiores dificuldades encontradas na cura da TB é a baixa adesão ao tratamento, que por ser muito longo, com muitos fármacos e efeitos adversos, acaba gerando uma desistência de aproximadamente 17% das pessoas. Outro problema enfrentado é a alta resistência aos fármacos já existentes para TB. O fato de pessoas https://www.who.int/campaigns/world-tb-day/world-tb-day-2021/campaign-materials 17 não concluírem o tratamento, contribui ainda mais para o aumento da resistência bacteriana (COUTO et al., 2014; SILVA et al., 2014). Em 2017 a OMS destacou, em seu relatório anual, o M. tuberculosis como um patógeno prioritário para a pesquisa e desenvolvimento contínuo de novos antibióticos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Já que as tecnologias empregadas para prevenir, diagnosticar e tratar a TB foram desenvolvidas no século XX, e o patógeno continua a evoluir e desenvolver padrões de resistência complexos para os fármacos disponíveis na terapia, torna-se evidente a necessidade de desenvolver agentes contra a tuberculose mais novos, potentes e seguros que possuam um novo mecanismo de ação sendo capazes de inibir bacilos resistentes aos fármacos e que sejam potencialmente efetivos em bactérias intracelulares e não replicantes, otimizando o atual tratamento da TB (VASAVA et al., 2017; WELLINGTON; HUNG, 2018). 1.2 tris-(1-10-fenantrolina)ferro(II) O uso de metais e complexos metálicos como fármacos em terapias vem crescendo e se tornando cada vez mais importante ao longo das últimas décadas, além do notável sucesso de fármacos anticâncer, como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, os complexos metálicos também mostraram resultados promissores no tratamento de uma variedade de doenças como: diabetes, úlcera, artrite reumatoide, doenças inflamatórias, infecciosas, cardiovasculares etc. (BHARTI; SINGH, 2009). O ferro (Fe) está entre os elementos de transição mais abundantes na Terra e é um dos micronutrientes essenciais amplamente utilizado por quase todos os organismos vivos para realizar uma grande quantidade de processos bioquímicos. É considerado como um elemento-traço, levando esse nome por estar presente no organismo em pequenas concentrações, porém realizando um papel indispensável nos processos fisiológicos e metabólicos nos seres vivos (WADA, 2004). Esse metal possui a capacidade de formar complexos de grande estabilidade nos estados bi e trivalente (ZHANG; SEN; GIEDROC, 2020). O nitroprussiato de sódio, é um exemplo de fármaco que contém ferro, bem conhecido e estabelecido na terapia. É um sal de sódio com um complexo de fe2+ e oxido nítrico que vem sendo utilizado como um vasodilatador e regulador de pressão arterial por mais de 40 anos (HOTTINGER et al., 2014). 18 Como demonstrado em estudos anteriores, diferentes complexos com o íon Fe apresentam atividade antimicobacteriana. Em um desses estudos, complexos de Fe (II) e Fe (III) com 3-aminoquinoxalina-2-carbonitrila e dióxido como ligantes, foram sintetizados por Tarallo e colaboradores. Estes complexos foram mais ativos frente ao M. tuberculosis do que os ligantes sozinhos, apresentando valor de MIC90 de 0,78 μg/mL (TARALLO et al., 2010). Outro estudo, realizado por Campos e colaboradores, evidenciou a potencialização da atividade antimicobacteriana de um sal de piridina quando complexado ao Fe (III) passando de 7,20 μM para 1,07 μM, e inclusive inibindo cepas clínicas de TB-MDR e XDR (CAMPOS et al., 2020). Exibindo uma combinação de ótimas propriedades estruturais e químicas, ligantes como a fenantrolina (fen) e a bipiridina (bipi) tem sido extensivamente estudados por serem quimicamente versáteis. Diversas aplicações terapêuticas foram obtidas através do emprego destes tipos de ligantes em combinação com diferentes metais de transição (GAO et al., 2016). A 1,10-fenantrolina (1,10-fen), a 2,2’-bipiridina (2,2’- bipi) e seus derivados, tanto em coordenação com metais como no seu estado livre, desestruturam o funcionamento de uma grande variedade de sistemas biológicos (MCCANN et al., 2004). A molécula de 1,10-fen (Figura 3), amplamente utilizada como um ligante em química analítica e de coordenação (IDRISS et al., 1980; KOCH; ACKERMANN, 1992; LORENZO et al., 1998), é planar, rígida, hidrofóbica e heterocíclica e seus átomos de nitrogênio possuem propriedades favoráveis à ligação de cátions. Essas características estruturais determinam sua capacidade de coordenação em relação a íons metálicos (BENCINI; LIPPOLIS, 2010). Figura 3. Estrutura química da 1,10-fenantrolina. Fonte: autora Complexos de fen com íons metálicos foram apontados como bactericidas para diferentes gêneros de bactérias e alguns fungos (MCCANN et al., 2004). Em estudos 19 prévios realizados pelo Laboratório de Pesquisa em Tuberculose da UNESP, a atividade anti-M. tuberculosis de diferentes complexos metálicos foi investigada, em especial, complexos de rutênio (II) e fen, que demonstraram atividade promissora contra o M. tuberculosis in vitro, sendo observado nesses casos que o complexo como um todo mostrou-se diversas vezes mais ativo que seus ligantes livres (PAVAN et al., 2010, 2011). A formação do complexo metálico tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II), ([Fe(fen)3]2+) mostrado na figura 4, se dá pela complexação do íon de ferro (II) com moléculas de 1-10-fenantrolina. Sua esfera de coordenação é comprovada por estudo de cristalografia (UÇAR et al., 2005). O complexo [Fe(fen)3]2+ tem sido amplamente utilizado como precursor de outras reações químicas já que exibe grande potencial redox. Em relação a sua atividade biológica descrita em literatura, existem relatos de atividade antifúngica (BOTTEGA et al., 2016). Fonte: autora 1.3 Nanotecnologia Farmacêutica e os Sistema Lipídicos Nanoestruturados A nanotecnologia pode ser definida como a utilização da tecnologia em moléculas ou estruturas de escala nanométricas para aplicações práticas. O conceito dessa tecnologia foi introduzido em 1959 pelo físico Richard Feynman que descreveu sua ideia de utilizar as máquinas disponíveis para construir máquinas cada vez menores Figura 4.Estrutura química de tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) - ([Fe(fen)3]2+). 20 até a nível molecular (FEYNMAN, 1992). A nanotecnologia é elencada como uma das tecnologias mais promissoras do século 21 (BAYDA et al., 2020). Abrangendo várias áreas do conhecimento, a nanotecnologia, é uma ciência multidisciplinar que depende da comunhão do conhecimento de áreas como a física, química, biológia e engenharia para sua eficiência (FARIA-TISCHER; TISCHER, 2012). A nanobiotecnologia, surgiu da integração de conhecimentos da biologia, engenharia e da nanociência, e é utilizada para o desenvolvimento de instrumentos e aplicações em sistemas biológicos como diagnósticos, entrega de fármacos (drug delivery) e imageamento molecular (KHAN et al., 2015). Essa sub-área do conhecimento tem se intensificado e mostrado excelentes resultados (WEISSIG; PETTINGER; MURDOCK, 2014). A utilização de nanoestruturas como veículo de moléculas bioativas, vetorização e carregamento de fármacos representa um dos principais objetos de interesse da nanobiotecnologia e da nanotecnologia farmacêutica, e é considerada uma ótima alternativa para contornar propriedades indesejadas de fármacos ou substâncias candidatas, por vezes permitindo o aprimoramento dos mesmos para que possam ser lançadas no mercado ou utilizadas na terapêutica (MAINARDES et al., 2006). Dentro das sub-área destacada os sistemas nanoestruturados apresentam partículas com dimensões que variam de 10 a 1000 nm, realizando o carreamento de ativos ou fármacos (FONSECA-SANTOS; GREMIÃO; CHORILLI, 2015). Dentre os sistemas nanoestruturados estão os sistemas lipídicos nanoestruturados, que possuem em sua composição lipídios estabilizados por agentes tensoativos. São biocompatíveis e biodegradáveis apresentando estruturas altamente organizadas (OCHEKPE; OLORUNFEMI; NGWULUKA, 2009). Estes sistemas possuem elevada estabilidade, melhoria da biodisponibilidade do fármaco, e também, podem incorporar substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas (PENTENERO, 2017). Além disso, possuem a capacidade de poupar tecidos e células saudáveis, direcionando a molécula ativa ao alvo terapêutico, ofertando a proteção do fármaco contra degradação prematura gerada pelas particularidades inerentes as diferentes vias de administração, e possibilitando a redução nas frequências de dosagem (SAFARI; ZARNEGAR, 2014). Todas essas características podem proporcionar uma melhora na qualidade de vida do paciente e contribuem para a resolução de um importante obstáculo no controle da epidemia de TB que é a baixa adesão ao tratamento (NASIRUDDIN; NEYAZ; DAS, 2017). 21 Diferentes tipos de sistemas nanocarreadores são promissores para várias vias de administração, abrangendo a administração oral, ocular, parenteral, transdérmica, vaginal e retal (GUPTA; MOULIK, 2008) A via de administração mais conveniente e amplamente utilizada é a via oral devido à facilidade e aceitação dessa via por parte dos pacientes. No entanto, muitos fármacos possuem baixa dissolução no trato gastrointestinal fator que pode levar a uma redução da biodisponibilidade do mesmo. As ações das enzimas e as variações de pH no trato gastrointestinal também podem afetar o fármaco e sua biodisponibilidade (HOMAYUN; LIN; CHOI, 2019). Os sistemas do tipo microemulsionado consistem na combinação de dois líquidos imiscíveis, comumente óleo e água, que são estabilizados por tensoativos formando um filme interfacial entre os dois (ABOOFAZELI; LAWRENCE, 1993; CONSTANTINIDES et al., 1994). São sistemas termodinamicamente estáveis e isotropicamente translúcidos com partículas de escala nanométrica que possuem a capacidade de solubilização e proteção dos ativos, melhorando potencialmente a biodisponibilidade oral destes (TENJARLA, 1999). Os sistemas baseados em nanotecnologia mostraram resultados promissores no tratamento de doenças infecciosas, inclusive TB. O sistema lipídico nanosetruturado (SLN) do tipo microemulsionado utilizado neste trabalho foi desenvolvido e caracterizado em estudos anteriores, com a incorporação de complexos contendo N- óxido e complexos metálicos de rutênio e de cobre, onde resultados promissores foram encontrados no âmbito de atividade contra M. tuberculosis, diminuição de citotoxicidade dos complexos e aumento da biodisponibilidade dos mesmos. (DA SILVA et al., 2016, 2018; DE FREITAS et al., 2014; DOS SANTOS FERNANDES et al., 2017). Além disso, este mesmo sistema foi utilizado em estudo prévio realizado por Solcia et al., em projeto de mestrado realizado no nosso grupo de pesquisa no Laboratório de Pesquisa em tuberculose da UNESP, onde o complexo [Fe(fen)3]2+ mostrou-se como um promissor candidato a fármaco para o tratamento de TB, apresentando eficaz atividade contra micobactérias e quando foi incorporado ao sistema demonstrou estar biodisponível nos plasmas dos animais tratados por via oral após 2h da aplicação e apresentou pico máximo na concentração plasmática em 6h (SOLCIA et al., 2021). Dos resultados promissores deste último trabalho citado, surgiu a necessidade de estudos mais detalhados sobre o sistema formado com a incorporação do complexo 22 de ferro ao sistema lipídico em questão (SLN+[Fe(fen)3]2+), na intenção de que este possa ser aplicado de forma oral na terapia, atendendo à necessidade de adesão do paciente no tratamento da tuberculose (WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO), 2016b). 23 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Este projeto teve como objetivo avaliar o complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) quando incorporado ao sistema lipídico nanoestruturado e os possíveis efeitos do complexo de ferro frente a cepa de Mycobacterium tuberculosis, H37Rv. 2.2 Objetivos específicos: ● Verificar a frequência de resistência da cepa H37Rv de M. tuberculosis em relação ao complexo [Fe(fen)3]2+; ● Avaliar o espectro de ação do complexo [Fe(fen)3]2+ frente a outras espécies bacterianas ● Obter o sistema lipídico nanoestruturado (SLN) e incorporar o complexo [Fe(fen)3]2+ ao mesmo; ● Caracterizar o sistema formado via dispersão de luz dinâmica e Potencial Zeta; ● Avaliar a morfologia do sistema formado utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão ● Avaliar a eficiência de encapsulação do sistema lipídico nanoestruturado; ● Avaliar o complexo incorporado ao sistema SLN+[Fe(fen)3]2+ frente a cepa H37Rv de M. tuberculosis 24 3. REFERÊNCIAS ABOOFAZELI, R.; LAWRENCE, M. J. 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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO “Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis” Araraquara, SP 2021 RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO “Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis” Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, área de Biotecnologia, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan Coorientadora: Drª. Patricia Bento da Silva Araraquara, SP 2021 Machado, Rachel Temperani Amaral. M149e Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina) ferro (II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis / Rachel Temperani Amaral Machado. – Araraquara: [S.n.], 2021. 62 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de concentração: Biotecnologia. Orientadora: Fernando Rogério Pavan. Coorientadora: Patricia Bento da Silva. 1. Mycobacterium tuberculosis. 2. Fenantrolina. 3. Tris1. 4. 10-fenantrolina ferro(II). 5. Sistema lipídico nanoestruturado. 6. Novos antibióticos. I. Pavan, Fernando Rogério, orient. II. Silva, Patricia Bento da, coorient. III. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030081P7 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lipídico nanoestruturado e sua atividade anti- Mycobacterium tuberculosis TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: RACHEL TEMPERANI AMARAL MACHADO ORIENTADOR: FERNANDO ROGERIO PAVAN COORIENTADORA: PATRÍCIA BENTO DA SILVA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA, área: Análises Clínicas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. FERNANDO ROGERIO PAVAN (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Biologicas / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas UNESP Araraquara Prof. Dr. ROBERTO SANTANA DA SILVA (Participaçao Virtual) Departamento de Física e Química / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP - Ribeirão Preto Prof. Dr. MARLUS CHORILLI (Participaçao Virtual) Departamento de Fármacos e Medicamentos / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 25 de outubro de 2021 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. Agradecimentos Aos meus pais, Flavio e Rosangela e a minha irmã Larissa que nunca mediram esforços para me apoiar e me fazer feliz. A Camila, minha noiva. Obrigada por todo o amor, paciência, cooperação, incentivo e ativa participação em todos os momentos de minha vida. A todos os meus amigos e colegas de laboratório e da pós-graduação, pelo apoio, suporte e ensinamento. Agradeço por todos os nossos momentos compartilhados, sendo estes difíceis ou alegres. Ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan, por toda sua dedicação e pela confiança e liberdade a mim concebidos para o desenvolvimento deste trabalho. A minha coorientadora, Drª Patrícia Bento da Silva, por ser durante todos esses anos o meu “porto seguro científico”, com toda sua paciência, seu companheirismo, sua dedicação e conhecimento. Ao CNPQ (processo: 130612/2019-7) e à FAPESP (processo: 2019/10326-7) pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho, sem o qual para mim este sonho não seria possível. Ao programa de Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia de UNESP-AQA e à Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP de Araraquara, o local que com muito orgulho e honra considero minha casa. “O primeiro dever da inteligência é desconfiar dela mesma.” - Albert Einstein Resumo A tuberculose (TB), apresenta cerca de 10 milhões de casos por ano em todo o mundo. Além disso, as elevadas taxas de resistência às principais classes de antimicrobianos contribuem para que a TB se encontre entre os maiores causadores de morte por um agente infeccioso. Sendo assim, faz-se evidente a necessidade de controle e combate dessa doença que representa uma séria ameaça à saúde pública global. Para tanto, é preciso enfrentar o desafio do desenvolvimento de novos agentes ativos contra a TB. Nesse trabalho, o complexo metálico tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) ([Fe(fen)3]2+), foi selecionado para o estudo, visto que trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram que este complexo é um bom candidato contra TB. Além disso, quando incorporado a um sistema lipídico nanoestruturado (SLN) demonstrou boa biodisponibilidade oral. Diante desses fatos, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o complexo incorporado ao SLN e verificar sua atividade anti-Mycobacterium. tuberculosis. A frequência de resistência do Mycobacterium tuberculosis a [Fe(fen)3]2+ é menor do que a de outros fármacos de primeira linha para o tratamento da tuberculose, como a rifampicina. Ele se mostrou específico na inibição de micobactérias. Foi possível obter sistemas lipídicos nanoestruturados constituídos de colesterol como fase oleosa, fosfatidilcolina de soja, oleato de sódio e Eumulgin® HRE 40 [óleo de rícino de polioxil 40 hidrogenado]; na proporção de 3: 6: 8, como tensoativo e tampão-fosfato pH 7,4 como fase aquosa (SLN) e incorporar com sucesso o complexo [Fe(fen)3]2+ ao mesmo (SLN+([Fe(fen)3]2+)). A formulação de SLN+[Fe(fen)3]2+ revelou-se estável por até 90 dias a 5ºC e também se apresentam estáveis após 24h em soluções de pHs que remetem os encontrados no estômago e no sangue, e em contato com meios de cultura utilizados em outras metodologias in vitro, comprovando a integridade das partículas durante estes ensaios. O SLN mostrou uma taxa de eficiência de encapsulamento próxima a 60% de [Fe(fen)3]2+. Partículas de SLN+[Fe(fen)3]2+ mostraram-se homogêneas (PdI = 0,17), apresentando carga superficial negativa de -34,7mV e tamanho médio de 163nm, definido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e confirmado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), que também revelou sua morfologia esférica. [Fe(fen)3]2+ apresentou um valor de CIM90 de 4,17 µM na sua forma livre e 23,39 µM quando incorporado no SLN. Estudos futuros devem analisar o perfil de liberação in vitro, a atividade in vivo e segurança do SLN+[Fe(fen)3]2+ para entender se esta combinação tem potencial para prosseguir como candidato a contra a tuberculose. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, fenantrolina, tris1,10-fenantrolina ferro (II), sistema lipídico nanoestruturado, novos antibióticos. Abstract Tuberculosis (TB) presents about 10 million cases per year worldwide. In addition, the high rates of resistance to the main classes of antimicrobials contribute to TB being among the biggest killers of an infectious agent. Thus, the need to control and combat this disease, which represents a serious threat to global public health, is evident. Therefore, it is necessary to face the challenge of developing new agents active against TB. In this work, the metallic complex tris-(1,10-phenanthroline)iron(II) ([Fe(phen)3]2+) was selected for the study, as previous works by our group demonstrated that this complex is a good candidate against TB. Furthermore, when loaded into a nanostructured lipid system (NLS) it demonstrated good oral bioavailability. Given these facts, the objective of this work was to characterize the complex incorporated into NLS and verify its anti-Mycobacterium tuberculosis activity. The frequency of resistance of Mycobacterium tuberculosis to [Fe(phen)3]2+ is lower than that of other first-line drugs for the treatment of tuberculosis, such as rifampicin. It has been shown to be specific in inhibiting mycobacteria. It was possible to obtain NLS consisting of cholesterol as the oil phase, soy phosphatidylcholine, sodium oleate and Eumulgin® HRE 40 [polyoxyl 40 hydrogenated castor oil]; in a ratio of 3: 6: 8, as surfactant and phosphate-buffer pH 7.4 as aqueous phase, and successfully load the complex [Fe(phen)3]2+ to it (NLS+[Fe(phen)3]2+). The NLS+[Fe(phen)3]2+ formulation proved to be stable for up to 90 days at 5°C and are also stable after 24 hours in solutions with pHs that match those found in the stomach and blood, and in contact with means of culture used in other in vitro methodologies, proving the integrity of the particles during these assays. NLS showed a entrapment efficiency rate close to 60% of [Fe(phen)3]2+. NLS+[Fe(phen)3]2+ particles were homogeneous (PdI = 0.17), with a negative surface charge of -34.7mV and average size of 163nm, defined by the dynamic light scattering (DLS) technique and confirmed by transmission electron microscopy (TEM), which also revealed its spherical morphology. [Fe(phen)3]2+ had a MIC90 value of 4.17 µM in its free form and 23.39 µM when incorporated into NLS. Future studies must analyze the in vitro release profile, and the in vivo activity and safety of NLS+[Fe(phen)3]2+ in order to fully understand whether this combination of the [Fe(phen)3]2+ and the NLS has the potential to proceed as a drug candidate against TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis, phenanthroline, tris 1,10-phenantroline iron (II), new antibiotics Lista de Siglas e Abreviaturas [Fe(fen)3]2+ tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) [Fe(phen)3]2+ tris-(1,10-phenantrolin)iron(II) ATR Attenuated total reflectance BCG Bacilo Calmette-Guérin bipi Bipiridina CIM Concentração Inibitória Mínima COVID-19 Coronavirus disease 2019 DLS Dynamic Light Scattering DL% Drug loading capacity DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxide EE% Entrapment efficiency EMA Agência Europeia de Medicamentos ETB etambutol, ethambutol FDA Food and Drug Administration Fe Ferro, Iron fen Fenantrolina FTIR Fourier Transform Infrared HIV Vírus da imunodeficiência humana ICP-Ms Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometrometry INH isoniazida, isoniazid IPD Índice de Polidispersão LOD Limit of detection MIC Minimum inhibitory concentration NLS Nanostructured lipid system NLS+[Fe(phen)3]2+ tris-(1,10-phenantrolin)iron(II) loaded into the Nanostructured lipid system OADC Suplemento de meio de cultura, a base de ácido oleico, albumina, dextrose e catalase; oleic acid, albumin, dextrose and catalase OMS Organização Mundial da Saúde PdI Polydispersity index PNCT Programa Nacional de Controle da Tuberculose PZ Potencial Zeta PZA pirazinamida, pyrazinamide REMA Resazurin Microtiter Assay RIF rifampicina, rifampicin SARS-CoV-2 Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida SLN Sistema Lipídico Nanoestruturado TB Tuberculose, Tuberculosis TB-MDR Tuberculose multidroga resistente TB-XDR Tuberculose extensivamente resistente TEM Transmission electron microscope UFC Unidades formadoras de colônia ZP Zeta Potential Z average Mean particle size Lista de Figuras Capítulo I Figura 1. Esquema terapêutico para TB suscetível aos fármacos. ........................... 14 Figura 2. Estimativa da OMS de números de casos de tuberculose resistente aos fármacos e porcentagem de tratamento em 2019. .................................................... 16 Figura 3. Estrutura química da 1,10-fenantrolina. ..................................................... 18 Figura 4.Estrutura química de tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) - ([Fe(fen)3]2+). .......... 19 Capítulo II Figure 1.Vibrational spectra in the infrared region of the aqueous solution and freeze- dried [Fe(phen)3]2+ ........................................................ Erro! Indicador não definido. Figure 2.(I) DLS size distribution by intensity for NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+; (II) Zeta Potential for NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+. (III) TEM micrographs illustrating the size and morphology.. .......................................................... Erro! Indicador não definido. Figure 3.Values and 95% confidence interval of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at 5ºCErro! Indicador não definido. Figure 4.Values and 95% confidence interval (95% CI) of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at room temperature......... Erro! Indicador não definido. Figure 5.Values and 95% confidence interval (95% CI) of the Average particle size (Z Average), Zeta potential (ZP) and the polydispersity index (PdI), of the NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ formulations, over 90 days stored at 37ºCErro! Indicador não definido. Figure 6. Mean particle size (Z Average), Polydispersity Index (PdI) and Zeta Potential (ZP) values of NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+, in solutions with different pHs.. ....... Erro! Indicador não definido. Figure 7.Mean particle size (Z Average), Polydispersity Index (PdI) and Zeta Potential (ZP) values of NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+, in culture medium.Erro! Indicador não definido. file:///C:/Users/Rachel%20Temperani/Desktop/Dissertação%20Rachel%20-%2014082021.docx%23_Toc82359841 Lista de Tabelas Capítulo II Table 1. Vibrational frequencies in the infrared region (cm-1) referring to the aqueous solution and freeze-dried [Fe(phen)3]2+, and their respective assignments .......... Erro! Indicador não definido. Table 2. Minimum inhibitory concentration (MIC90) of [Fe(phen)3]2+, rifampicin (RIF) and isoniazid (INH) against a variety of bacterial strains.Erro! Indicador não definido. Table 3. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC90) of tris-(1,10- phenanthroline) iron (II) complex against the sensitive strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv. ..................................................... Erro! Indicador não definido. Sumário Capítulo I ................................................................................................................... 11 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 12 1.1 Tuberculose: Dados gerais, epidemiologia e tratamento ................................. 12 1.2 Complexos Metálicos e tris-(1-10-fenantrolina)ferro(II) ................................ 17 1.3 Nanotecnologia Farmacêutica e os Sistema Lipídicos Nanoestruturados.... 19 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 23 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 23 2.2 Objetivos específicos: .................................................................................. 23 3. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 24 Capítulo II ..................................................................... Erro! Indicador não definido. Abstract ........................................................................ Erro! Indicador não definido. Introduction................................................................... Erro! Indicador não definido. Materials and Methods ................................................. Erro! Indicador não definido. 1. Compounds and anti-TB drugs ........................... Erro! Indicador não definido. 2. Bacterial culture .................................................. Erro! Indicador não definido. 3. Fourier Transform Infrared (FTIR) ...................... Erro! Indicador não definido. 4. Biological Assays ................................................... Erro! Indicador não definido. a. Evaluation of activity spectrum ........................ Erro! Indicador não definido. b. Resistance frequencies ................................... Erro! Indicador não definido. c. Anti-Mycobacterium tuberculosis analysis ....... Erro! Indicador não definido. 5. NLS obtaining and [Fe(phen)3]2+ incorporation ... Erro! Indicador não definido. 6. NLS Characterization ......................................... Erro! Indicador não definido. a. Microscopy ...................................................... Erro! Indicador não definido. b. Dynamic Light Scattering (DLS) ...................... Erro! Indicador não definido. c. Storage Stability .............................................. Erro! Indicador não definido. d. Stability in culture media and solutions with different pHs ...... Erro! Indicador não definido. e. Entrapment efficiency and Drug loading capacity ........... Erro! Indicador não definido. f. Quantification by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometrometry (ICP- MS) Erro! Indicador não definido. Results ......................................................................... Erro! Indicador não definido. 1. Fourier Transform Infrared (FTIR) ...................... Erro! Indicador não definido. 2. Biological Assays ................................................ Erro! Indicador não definido. a. Evaluation of activity spectrum ........................ Erro! Indicador não definido. b. Resistance frequencies ................................... Erro! Indicador não definido. c. Anti-Mycobacterium tuberculosis analysis ....... Erro! Indicador não definido. 3. NLS and NLS+[Fe(phen)3]2+ Characterization .... Erro! Indicador não definido. a. DLS data and TEM images ............................. Erro! Indicador não definido. b. Storage Stability .............................................. Erro! Indicador não definido. c. Stability in culture media and solutions with different pHs ...... Erro! Indicador não definido. d. Entrapment efficiency ...................................... Erro! Indicador não definido. Discussion .................................................................... Erro! Indicador não definido. References ................................................................... Erro! Indicador não definido. Capítulo I 12 1. INTRODUÇÃO 1.1 Tuberculose: Dados gerais, epidemiologia e tratamento A tuberculose (TB) é uma das doenças mais antigas do mundo. Evidências encontradas em múmias egípcias datadas de 2400 a.C. revelaram deformidades esqueléticas típicas da tuberculose (BARBERIS et al., 2017). Apesar de sua origem antiga, ainda hoje ela representa um grande desafio para a saúde pública mundial. É uma doença infectocontagiosa causada pelo complexo Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii e Mycobacterium canettii) (ZUMLA; NAHID; COLE, 2013). Sendo o M. tuberculosis sua principal espécie causadora, identificada pelo alemão Robert Koch, em 1882. Embora afete comumente os pulmões, também pode afetar outros órgãos sendo então denominada TB extrapulmonar (PAI et al., 2016). Em geral, a transmissão da doença ocorre quando indivíduos sadios entram em contato com gotículas (aerossóis) expelidas por indivíduos infectados pelo bacilo em sua forma ativa, através da tosse, espirros ou fala, por exemplo. Somente uma pequena taxa de indivíduos que foram expostos, cerca de 5 a 10 %, desenvolverão a doença. No entanto, a probabilidade de desenvolver TB é muito maior entre aqueles coinfectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), também é maior entre as pessoas afetadas por fatores de risco como desnutrição, diabetes, tabagismo e consumo de álcool (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). Os indivíduos expostos ao bacilo que não desenvolvem a doença apresentam resposta imune celular eficaz para conter a infecção, e então o M. tuberculosis pode assumir o estado de latência (WARD; HOYE; TALAAT, 2008). O processo de TB latente ocorre quando nos pulmões, macrófagos fagocitam os bacilos, esse processo induz uma resposta pró-inflamatória com o recrutamento de mais macrófagos, linfócitos T, plasmócitos e fibroblastos, iniciando a formação do granuloma. Nesse complexo a bactéria permanece em um estado não-replicante (dormente), considerado não infeccioso e que pode permanecer assim por anos. No entanto, à medida que a imunidade diminui, através do envelhecimento ou da imunossupressão, os bacilos dormentes podem ser reativados, o que resulta no desenvolvimento da 13 forma ativa da TB no indivíduo, que muitas vezes ocorre décadas após a infecção inicial (RUSSELL, 2007). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que houve cerca de 10 milhões de casos de TB no mundo em 2019. Deste total 1,4 milhão vieram a óbito em decorrência da doença, dos quais 208.000 mortes correspondem a coinfecções TB-HIV. As coinfecções de TB e HIV recebem grande atenção pois a interação entre as duas doenças apresenta altas taxas de morbidade e de mortalidade, chegando a ser nomeada como “dueto maldito”. Nos dias atuais outra infecção que é capaz de recordar esse dueto, junto com a TB, é a da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) causadora da COVID-19 (coronavirus disease 2019) (VISCA et al., 2021). Mais evidências são necessárias para compreender o potencial da COVID-19 em impactar na reativação de bacilos em estado de latência, por exemplo. Mas alguns autores já trazem a discussão de que a imunossupressão causada pela própria doença ou pelo uso de medicamentos durante o tratamento da COVID-19 poderão impactar futuramente neste quesito (CRISAN-DABIJA et al., 2020; SILVA et al., 2021; YANG; LU, 2020). A pandemia de COVID-19 poderá afetar drasticamente a carga global tuberculose nos próximos anos, aumentando o número de mortes em decorrência da doença já que em muitos locais os serviços de saúde apresentam-se sobrecarregados diminuindo os números de detecção e tratamentos de TB. A estimativa da OMS é de que houveram 1,8 milhões de mortes por TB em 2020 no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). O Brasil encontra-se entre os 30 países que juntos, concentram 87% dos casos da doença no mundo. Nos últimos anos o país encontra-se em uma tendência de alta no número de incidência de casos. No ano de 2019, foram notificados 96mil novos casos e 4,9 mil mortes por esta patologia, além de mais 1,8 mil mortes entre os portadores de HIV (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). No país, geralmente a doença está relacionada com as más condições de moradia, nutrição e saneamento básico, ao uso e abuso de álcool, drogas ilícitas e às doenças imunossupressoras, como a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) afetando, principalmente, as periferias urbanas, como as favelas e as áreas degradadas dos grandes centros (MINISTÉRIO DA SAÚDE BRASIL, 2017). A única vacina licenciada para prevenção da tuberculose é a BCG ou bacilo Calmette-Guérin. A BCG foi desenvolvida há quase 100 anos e previne formas graves de TB em crianças, sendo amplamente utilizada. Atualmente, não existe uma vacina 14 eficaz na prevenção da doença em adultos, embora os resultados de um estudo de fase II do candidato M72/AS01E sejam promissores (VAN DER MEEREN et al., 2018). O tratamento de novos casos de TB suscetível no Brasil conta com um esquema terapêutico de duas fases (Figura 1), fase intensiva (Fig 1a) e fase de manutenção (Fig 1b). Segundo o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), na fase intensiva, que corresponde a um período de dois meses, são administrados por via oral a combinação de quatro fármacos de primeira-linha, rifampicina (RIF), isoniazida (INH), etambutol (ETB) e pirazinamida (PZA). Após este período, inicia-se a fase de manutenção, em que se utiliza apenas RIF e INH por mais quatro meses de tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE BRASIL, 2017; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). A Fase de manutenção pode se estender por mais 3 meses, totalizando 7 meses, em casos em que o paciente possui um maior risco de recidiva como, por exemplo, no caso de HIV positivos, imunossupressão, diabéticos insulinodependentes, fumantes etc. Os quatro fármacos utilizados no esquema terapêutico padrão desde o ano de 2009, possuem mecanismos de ação diferentes, fator que contribuiu para uma grande diminuição no tempo de tratamento, que até a década de 60 era de 18 meses de duração (RABAHI et al., 2017). Figura 1. Esquema terapêutico para TB suscetível aos fármacos. Fonte: Autora A RIF age inibindo a elongação do RNA durante o processo de transcrição impedindo a síntese de proteínas das células da micobactéria. A PZA ainda não possui seu mecanismo de ação completamente desvendado, mas sabe-se que seu 15 metábolito ativo, o àcido propiônico reduz o pH intramacrofágico impedindo o crescimento dos bacilos. Os fármacos INH e ETB inibem a formação da parede celular das células das micobacterias impedindo a formação de dois dos principais constituintes da mesma, que são os acídos micolicos e arabinogalactanos, respectivamente. A INH, fármaco específico em inibir micobacterias, é um profármaco que quando ativado pela ennzima KatG gera espécies reativas de oxigênio que impedem a formação dos ácidos micólicos. Enquanto o ETB possui como alvo a arabinosil transferase interrompendo a formação da camada de arabinogalactano (SHETYE; FRANZBLAU; CHO, 2020). Quando o tratamento de primeira-linha se mostra ineficaz devido à resistência do bacilo aos fármacos, realiza-se o tratamento com fármacos de segunda-linha por exemplo, pertencentes ao grupo de aminoglicosídeos injetáveis e ao grupo de fluoroquinolonas. A TB multidroga resistente (TB-MDR) é definida como a resistência do bacilo aos dois principais fármacos de primeira-linha, INH e RIF. Uma nova definição da Organização Mundial da Saúde, é a forma de pré resistência estendida (Pré-TB-XDR) que se caracteriza pela resistência a INH e RIF somada a qualquer uma das fluoroquinolonas. Já a forma de resistência estendida (TB-XDR) atende a definição de Pré-TB-XDR além de também ser resistente a um dos fármacos de segunda-linha, bedaquilina ou linezolida (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2021). Somente no ano de 2019 a estimativa foi de 465.000 casos com apenas 38% destes casos recebendo o tratamento adequado (figura 2), 182.000 mortes causadas por TB-MDR e o relato de TB-XDR em 128 países (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020). 16 Figura 2. Estimativa da OMS de números de casos de tuberculose resistente aos fármacos e porcentagem de tratamento em 2019. Fonte: https://www.who.int/campaigns/world-tb-day/world-tb-day-2021/campaign-materials O regime de tratamento para TB-MDR é mais longo e requer fármacos mais caros e mais tóxicos. Para a maioria dos pacientes com TB-MDR, as taxas de sucesso do tratamento são muito menores do que aqueles para a TB suscetível a fármacos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020). Em 2013, dois novos fármacos (bedaquilina e delamanida) foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA e pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA) para uso na terapia anti-TB (MAHAJAN, 2013; RYAN; LO, 2014). No entanto, eles receberam apenas uma aprovação regulatória condicional, sendo reservados para os casos de TB-MDR e utilizados na terceira linha de tratamento. Uma das maiores dificuldades encontradas na cura da TB é a baixa adesão ao tratamento, que por ser muito longo, com muitos fármacos e efeitos adversos, acaba gerando uma desistência de aproximadamente 17% das pessoas. Outro problema enfrentado é a alta resistência aos fármacos já existentes para TB. O fato de pessoas https://www.who.int/campaigns/world-tb-day/world-tb-day-2021/campaign-materials 17 não concluírem o tratamento, contribui ainda mais para o aumento da resistência bacteriana (COUTO et al., 2014; SILVA et al., 2014). Em 2017 a OMS destacou, em seu relatório anual, o M. tuberculosis como um patógeno prioritário para a pesquisa e desenvolvimento contínuo de novos antibióticos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Já que as tecnologias empregadas para prevenir, diagnosticar e tratar a TB foram desenvolvidas no século XX, e o patógeno continua a evoluir e desenvolver padrões de resistência complexos para os fármacos disponíveis na terapia, torna-se evidente a necessidade de desenvolver agentes contra a tuberculose mais novos, potentes e seguros que possuam um novo mecanismo de ação sendo capazes de inibir bacilos resistentes aos fármacos e que sejam potencialmente efetivos em bactérias intracelulares e não replicantes, otimizando o atual tratamento da TB (VASAVA et al., 2017; WELLINGTON; HUNG, 2018). 1.2 tris-(1-10-fenantrolina)ferro(II) O uso de metais e complexos metálicos como fármacos em terapias vem crescendo e se tornando cada vez mais importante ao longo das últimas décadas, além do notável sucesso de fármacos anticâncer, como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, os complexos metálicos também mostraram resultados promissores no tratamento de uma variedade de doenças como: diabetes, úlcera, artrite reumatoide, doenças inflamatórias, infecciosas, cardiovasculares etc. (BHARTI; SINGH, 2009). O ferro (Fe) está entre os elementos de transição mais abundantes na Terra e é um dos micronutrientes essenciais amplamente utilizado por quase todos os organismos vivos para realizar uma grande quantidade de processos bioquímicos. É considerado como um elemento-traço, levando esse nome por estar presente no organismo em pequenas concentrações, porém realizando um papel indispensável nos processos fisiológicos e metabólicos nos seres vivos (WADA, 2004). Esse metal possui a capacidade de formar complexos de grande estabilidade nos estados bi e trivalente (ZHANG; SEN; GIEDROC, 2020). O nitroprussiato de sódio, é um exemplo de fármaco que contém ferro, bem conhecido e estabelecido na terapia. É um sal de sódio com um complexo de fe2+ e oxido nítrico que vem sendo utilizado como um vasodilatador e regulador de pressão arterial por mais de 40 anos (HOTTINGER et al., 2014). 18 Como demonstrado em estudos anteriores, diferentes complexos com o íon Fe apresentam atividade antimicobacteriana. Em um desses estudos, complexos de Fe (II) e Fe (III) com 3-aminoquinoxalina-2-carbonitrila e dióxido como ligantes, foram sintetizados por Tarallo e colaboradores. Estes complexos foram mais ativos frente ao M. tuberculosis do que os ligantes sozinhos, apresentando valor de MIC90 de 0,78 μg/mL (TARALLO et al., 2010). Outro estudo, realizado por Campos e colaboradores, evidenciou a potencialização da atividade antimicobacteriana de um sal de piridina quando complexado ao Fe (III) passando de 7,20 μM para 1,07 μM, e inclusive inibindo cepas clínicas de TB-MDR e XDR (CAMPOS et al., 2020). Exibindo uma combinação de ótimas propriedades estruturais e químicas, ligantes como a fenantrolina (fen) e a bipiridina (bipi) tem sido extensivamente estudados por serem quimicamente versáteis. Diversas aplicações terapêuticas foram obtidas através do emprego destes tipos de ligantes em combinação com diferentes metais de transição (GAO et al., 2016). A 1,10-fenantrolina (1,10-fen), a 2,2’-bipiridina (2,2’- bipi) e seus derivados, tanto em coordenação com metais como no seu estado livre, desestruturam o funcionamento de uma grande variedade de sistemas biológicos (MCCANN et al., 2004). A molécula de 1,10-fen (Figura 3), amplamente utilizada como um ligante em química analítica e de coordenação (IDRISS et al., 1980; KOCH; ACKERMANN, 1992; LORENZO et al., 1998), é planar, rígida, hidrofóbica e heterocíclica e seus átomos de nitrogênio possuem propriedades favoráveis à ligação de cátions. Essas características estruturais determinam sua capacidade de coordenação em relação a íons metálicos (BENCINI; LIPPOLIS, 2010). Figura 3. Estrutura química da 1,10-fenantrolina. Fonte: autora Complexos de fen com íons metálicos foram apontados como bactericidas para diferentes gêneros de bactérias e alguns fungos (MCCANN et al., 2004). Em estudos 19 prévios realizados pelo Laboratório de Pesquisa em Tuberculose da UNESP, a atividade anti-M. tuberculosis de diferentes complexos metálicos foi investigada, em especial, complexos de rutênio (II) e fen, que demonstraram atividade promissora contra o M. tuberculosis in vitro, sendo observado nesses casos que o complexo como um todo mostrou-se diversas vezes mais ativo que seus ligantes livres (PAVAN et al., 2010, 2011). A formação do complexo metálico tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II), ([Fe(fen)3]2+) mostrado na figura 4, se dá pela complexação do íon de ferro (II) com moléculas de 1-10-fenantrolina. Sua esfera de coordenação é comprovada por estudo de cristalografia (UÇAR et al., 2005). O complexo [Fe(fen)3]2+ tem sido amplamente utilizado como precursor de outras reações químicas já que exibe grande potencial redox. Em relação a sua atividade biológica descrita em literatura, existem relatos de atividade antifúngica (BOTTEGA et al., 2016). Fonte: autora 1.3 Nanotecnologia Farmacêutica e os Sistema Lipídicos Nanoestruturados A nanotecnologia pode ser definida como a utilização da tecnologia em moléculas ou estruturas de escala nanométricas para aplicações práticas. O conceito dessa tecnologia foi introduzido em 1959 pelo físico Richard Feynman que descreveu sua ideia de utilizar as máquinas disponíveis para construir máquinas cada vez menores Figura 4.Estrutura química de tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) - ([Fe(fen)3]2+). 20 até a nível molecular (FEYNMAN, 1992). A nanotecnologia é elencada como uma das tecnologias mais promissoras do século 21 (BAYDA et al., 2020). Abrangendo várias áreas do conhecimento, a nanotecnologia, é uma ciência multidisciplinar que depende da comunhão do conhecimento de áreas como a física, química, biológia e engenharia para sua eficiência (FARIA-TISCHER; TISCHER, 2012). A nanobiotecnologia, surgiu da integração de conhecimentos da biologia, engenharia e da nanociência, e é utilizada para o desenvolvimento de instrumentos e aplicações em sistemas biológicos como diagnósticos, entrega de fármacos (drug delivery) e imageamento molecular (KHAN et al., 2015). Essa sub-área do conhecimento tem se intensificado e mostrado excelentes resultados (WEISSIG; PETTINGER; MURDOCK, 2014). A utilização de nanoestruturas como veículo de moléculas bioativas, vetorização e carregamento de fármacos representa um dos principais objetos de interesse da nanobiotecnologia e da nanotecnologia farmacêutica, e é considerada uma ótima alternativa para contornar propriedades indesejadas de fármacos ou substâncias candidatas, por vezes permitindo o aprimoramento dos mesmos para que possam ser lançadas no mercado ou utilizadas na terapêutica (MAINARDES et al., 2006). Dentro das sub-área destacada os sistemas nanoestruturados apresentam partículas com dimensões que variam de 10 a 1000 nm, realizando o carreamento de ativos ou fármacos (FONSECA-SANTOS; GREMIÃO; CHORILLI, 2015). Dentre os sistemas nanoestruturados estão os sistemas lipídicos nanoestruturados, que possuem em sua composição lipídios estabilizados por agentes tensoativos. São biocompatíveis e biodegradáveis apresentando estruturas altamente organizadas (OCHEKPE; OLORUNFEMI; NGWULUKA, 2009). Estes sistemas possuem elevada estabilidade, melhoria da biodisponibilidade do fármaco, e também, podem incorporar substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas (PENTENERO, 2017). Além disso, possuem a capacidade de poupar tecidos e células saudáveis, direcionando a molécula ativa ao alvo terapêutico, ofertando a proteção do fármaco contra degradação prematura gerada pelas particularidades inerentes as diferentes vias de administração, e possibilitando a redução nas frequências de dosagem (SAFARI; ZARNEGAR, 2014). Todas essas características podem proporcionar uma melhora na qualidade de vida do paciente e contribuem para a resolução de um importante obstáculo no controle da epidemia de TB que é a baixa adesão ao tratamento (NASIRUDDIN; NEYAZ; DAS, 2017). 21 Diferentes tipos de sistemas nanocarreadores são promissores para várias vias de administração, abrangendo a administração oral, ocular, parenteral, transdérmica, vaginal e retal (GUPTA; MOULIK, 2008) A via de administração mais conveniente e amplamente utilizada é a via oral devido à facilidade e aceitação dessa via por parte dos pacientes. No entanto, muitos fármacos possuem baixa dissolução no trato gastrointestinal fator que pode levar a uma redução da biodisponibilidade do mesmo. As ações das enzimas e as variações de pH no trato gastrointestinal também podem afetar o fármaco e sua biodisponibilidade (HOMAYUN; LIN; CHOI, 2019). Os sistemas do tipo microemulsionado consistem na combinação de dois líquidos imiscíveis, comumente óleo e água, que são estabilizados por tensoativos formando um filme interfacial entre os dois (ABOOFAZELI; LAWRENCE, 1993; CONSTANTINIDES et al., 1994). São sistemas termodinamicamente estáveis e isotropicamente translúcidos com partículas de escala nanométrica que possuem a capacidade de solubilização e proteção dos ativos, melhorando potencialmente a biodisponibilidade oral destes (TENJARLA, 1999). Os sistemas baseados em nanotecnologia mostraram resultados promissores no tratamento de doenças infecciosas, inclusive TB. O sistema lipídico nanosetruturado (SLN) do tipo microemulsionado utilizado neste trabalho foi desenvolvido e caracterizado em estudos anteriores, com a incorporação de complexos contendo N- óxido e complexos metálicos de rutênio e de cobre, onde resultados promissores foram encontrados no âmbito de atividade contra M. tuberculosis, diminuição de citotoxicidade dos complexos e aumento da biodisponibilidade dos mesmos. (DA SILVA et al., 2016, 2018; DE FREITAS et al., 2014; DOS SANTOS FERNANDES et al., 2017). Além disso, este mesmo sistema foi utilizado em estudo prévio realizado por Solcia et al., em projeto de mestrado realizado no nosso grupo de pesquisa no Laboratório de Pesquisa em tuberculose da UNESP, onde o complexo [Fe(fen)3]2+ mostrou-se como um promissor candidato a fármaco para o tratamento de TB, apresentando eficaz atividade contra micobactérias e quando foi incorporado ao sistema demonstrou estar biodisponível nos plasmas dos animais tratados por via oral após 2h da aplicação e apresentou pico máximo na concentração plasmática em 6h (SOLCIA et al., 2021). Dos resultados promissores deste último trabalho citado, surgiu a necessidade de estudos mais detalhados sobre o sistema formado com a incorporação do complexo 22 de ferro ao sistema lipídico em questão (SLN+[Fe(fen)3]2+), na intenção de que este possa ser aplicado de forma oral na terapia, atendendo à necessidade de adesão do paciente no tratamento da tuberculose (WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO), 2016b). 23 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Este projeto teve como objetivo avaliar o complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) quando incorporado ao sistema lipídico nanoestruturado e os possíveis efeitos do complexo de ferro frente a cepa de Mycobacterium tuberculosis, H37Rv. 2.2 Objetivos específicos: ● Verificar a frequência de resistência da cepa H37Rv de M. tuberculosis em relação ao complexo [Fe(fen)3]2+; ● Avaliar o espectro de ação do complexo [Fe(fen)3]2+ frente a outras espécies bacterianas ● Obter o sistema lipídico nanoestruturado (SLN) e incorporar o complexo [Fe(fen)3]2+ ao mesmo; ● Caracterizar o sistema formado via dispersão de luz dinâmica e Potencial Zeta; ● Avaliar a morfologia do sistema formado utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão ● Avaliar a eficiência de encapsulação do sistema lipídico nanoestruturado; ● Avaliar o complexo incorporado ao sistema SLN+[Fe(fen)3]2+ frente a cepa H37Rv de M. tuberculosis 24 3. REFERÊNCIAS ABOOFAZELI, R.; LAWRENCE, M. J. Investigations into the formation and characterization of phospholipid microemulsions. I. Pseudo-ternary phase diagrams of systems containing water-lecithin-alcohol-isopropyl myristate. International Journal of Pharmaceutics, v. 93, n. 1–3, p. 161–175, Maio 1993. BARBERIS, I. et al. The history of tuberculosis: from the first historical records to the isolation of Koch’s bacillus. Journal of preventive medicine and hygiene, v. 58, n. 1, p. E9–E12, Mar. 2017. BAYDA, S. et al. The history of nanoscience and nanotechnology: From chemical- physical applications to nanomedicine. Molecules, v. 25, n. 1, p. 1–15, 2020. BENCINI, A.; LIPPOLIS, V. 1,10-Phenanthroline: A versatile building block for the construction of ligands for various purposes. Coordination Chemistry Reviews, v. 254, n. 17–18, p. 2096–2180, Set. 2010. BOTTEGA, F.C.; OLIVEIRA, M.R.L.; RUBINGER, M.M.M.; BELLATO, C.R.; ARDISSON, J.D.; ZAMBOLIM, L. 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