UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO - UNESP FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO ÁCIDO FÓLICO EM PREVENIR O APARECIMENTO DE FENDA PALATINA TERATOGENICAMENTE INDUZIDA PELA DEXAMETASONA EM RATOS ODILON GUARIZA FILHO ARARAQUARA 2006 Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas – área de Ortodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutor em Ortodontia. Orientador: Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho 2 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO ÁCIDO FÓLICO EM PREVENIR O APARECIMENTO DE FENDA PALATINA TERATOGENICAMENTE INDUZIDA PELA DEXAMETASONA EM RATOS. ODILON GUARIZA FILHO Tese apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista UNESP – Araraquara, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Odontologia (Ortodontia). Comissão Examinadora: Presidente: Profa. Dra. Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho. 2o Examinador: Prof. Dr. Dirceu Barnabé Raveli. 3o Examinador: Prof. Dr. Paulo Sergio Cerri. 4o Examinador: Profa Dra. Ana Maria Trindade Grégio. 5o Examinador: Prof. Dr. Gerson Luiz Ulema Ribeiro. Suplentes: 1o suplente: Profa. Dra. Lídia Parsekian Martins. 2o suplente: Prof. Dr. Luiz Gonzaga Gandini Junior. Araraquara, 28 de agosto de 2006. 3 DADOS CURRICULARES ODILON GUARIZA FILHO Nascimento 10 de dezembro de 1966 Filiação Odilon Guariza Maria Lúcia Kantor Guariza 1987 – 1991 Curso de Graduação em Odontologia pela Pontifícia Universidade Católica do Paraná – PUCPR 1992 – 1997 Curso de Pós-graduação em Ciências Odontológicas - Área de Concentração Ortodontia – Nível de Mestrado – Universidade de São Paulo – USP. 4 “Filho meu, não te esqueças da minha lei, e o teu coração guarde os meus mandamentos. Porque eles aumentarão os teus dias, e te acrescentarão anos de vida e paz. Não te desamparem a benignidade e a fidelidade, atam-nas ao teu pescoço, escreve-as na tábua do teu coração. E acharás graça e bom entendimento aos olhos de Deus e dos homens. Confia no Senhor de todo o teu coração, e não te estribes no teu próprio entendimento. Reconhece-o em todos os teus caminhos, e ele endireitará as tuas veredas. Não seja sábio a teus próprios olhos, teme ao Senhor e aparta-te do mal. Isto será remédio para o teu umbigo, e medula para teus ossos. Honra ao Senhor com a tua fazenda, e com as primícias de toda a tua renda; E se encherão os teus celeiros abundantemente, e transbordarão de mosto os teus lagares. Filho meu, não rejeitas a correção do Senhor, nem te enojes da sua repreensão. Porque o Senhor repreende aquele a quem ama, assim como o pai ao filho a quem quer bem” Provérbio de Salomão, Filho de Davi, Rei de Israel (Cap. 3, 1-12) 5 DEDICATÓRIA À DEUS Senhor Meu Deus, eu Te amo de todo o meu coração, de toda a minha alma, de todo o meu entendimento e com todas as minhas forças. AOS MEUS PAIS Pai e Mãe, obrigado pelo amor incondicional que me deram, por terem me ensinado a viver com dignidade e por me incentivarem a sempre buscar meus sonhos. Obrigado pela formação que me proporcionaram e por estarem junto a mim. AO MEU FILHO Guilherme, meu filho, o teu nascimento foi o evento mais importante na minha vida. A tua presença nestes três anos tem sido maravilhosa. Te amo. 6 AGRADECIMENTO ESPECIAL À Professora Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho, pelo amor à arte e à ciência, aliado, este, ao dom inato para transmitir com sabedoria os seus conhecimentos com segurança, franqueza e honestidade. Pelo apoio familiar nas horas mais difíceis de minha vida, pela confiança em mim depositada, pela orientação firme e segura, sobretudo, pela oportunidade concedida, fatores que permitiram a realização deste trabalho. Obrigado. Muito obrigado, Doutora Lizeti. 7 AGRADECIMENTOS Aos Docentes do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista (FOAR- UNESP): Ary dos Santos Pinto, Dirceu Barnabé Raveli, João Roberto Gonçalves, Lídia Parsekian Martins, Luiz Gonzaga Gandini Júnior, Maurício Tatsuei Sakima e Tatsuko Sakima. Pelo apoio, amizade e profundos ensinamentos a nós transmitidos. Aos Professores do Departamento da Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista (FOAR- UNESP): Lourdes dos Santos Pinto e Rita de Cássia Loiola Cordeiro, pelo exemplo de dedicação ao ensino e a pesquisa. Aos colegas do Doutorado, Evandro da Silva Bronzi, Gustavo Mattos Barreto, Halissa Simplício, Karina Santos Mundstock, Luciane Hahn, Luciane Quadros Closs, Patrícia Panizzi Gimenes, Ricardo Lombardi de Farias, Sérgio Milton Martins de Oliveira Penido, Thais Cristina dos Santos Dinelli Esperança, pela agradável convivência. Ao amigo Hermes Pretel, pela sua colaboração na hora que mais precisei. À professora Ana Maria Trindade Grégio, por colaborar intensamente neste trabalho. 8 Ao Pedro Sérgio Simões (Pedrinho), pelo carinho e profissionalismo demonstrados durante a realização da parte experimental e da tramitação laboratorial. Ao professor Sergio Aparecido Ignácio, pelo auxílio na elaboração da análise estatística. Aos funcionários do Serviço de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAR-UNESP), Flávia Sousa de Jesus, José Alexandre Garcia, Rosângela Silva dos Santos e Mara Cândida Munhoz do Amaral, pelo modo especial como sempre me trataram. Aos Funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara – Unesp: Maria Helena Matsumoto Komasti Leves, Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Marley Cristina Chiusoli Montagnoli e Odete Aparecido Camilo, pela amizade e auxílios prestados. Aos professores de Ortodontia da PUCPR, Orlando Tanaka, Hiroshi Maruo, Elisa Souza Camargo e José Henrique Gonzaga de Oliveira, pelo apoio, a amizade e compreensão. Aos professores Monir Tacla, Diretor do Curso de Odontologia da PUCPR e Sergio Roberto Vieira, Decano Adjunto do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da PUCPR, por estimular e apoiar a minha formação acadêmica. 9 Aos professores Gerson Luiz Ulema Ribeiro e Arno Locks pelo apoio e a amizade. À todos aqueles que tem sido exemplos vivos do verdadeiro significado da palavra amigo, em todos os momentos. Aos animais utilizados neste trabalho, meu profundo respeito e gratidão. 10 SUMÁRIO Lista de figuras..............................................................................................................10 Lista de gráficos.............................................................................................................13 Lista de abreviaturas......................................................................................................14 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................15 2 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................18 2.1 Corticosteróides...........................................................................................44 2.2 Agentes Anti-teratogênicos..........................................................................64 3 PROPOSIÇÃO...................................................................................................88 4 MATERIAL E MÉTODO.....................................................................................90 4.1 Material permanente....................................................................................90 4.2 Drogas e reagentes.....................................................................................90 4.2.1 Preparação da solução do corticosteróides....................................91 4.2.2 Preparação da solução do ácido fólico...........................................92 4.3 Metodologia..................................................................................................92 4.3.1 Aprovação do protocolo de pesquisa..............................................92 4.3.2 População........................................................................................92 4.3.3 Amostra............................................................................................93 4.3.3.1 Grupo I.......................................................................................93 4.3.3.2 Grupo II......................................................................................93 4.3.3.3 Grupo III.....................................................................................94 4.3.3.4 Grupo IV.....................................................................................94 4.3.4 Método de concepção.........................................................................94 4.3.5 Obtenção dos espécimes para observação.........................................97 4.3.6 Avaliação dos resultados obtidos.......................................................100 4.3.7 Análise estatística...............................................................................100 5 RESULTADO.......................................................................................................102 5.1. Resultados clínicos......................................................................................102 5.1.1 Peso total, comprimento total, comprimento da cabeça do feto.........103 5.1.2 Ação preventiva do ácido fólico nas fendas palatinas........................106 5.1.3 Presença de fenda palatina completa e incompleta...........................108 5.2 Resultados histológicos................................................................................110 5.2.1 Grupo I................................................................................................110 5.2.2 Grupo II...............................................................................................114 5.2.3 Grupo III..............................................................................................118 5.2.4 Grupo IV..............................................................................................123 6 DISCUSSÃO........................................................................................................127 7 CONCLUSÃO......................................................................................................140 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................144 ANEXOS...................................................................................................................141 RESUMO..................................................................................................................142 ABSTRACT...............................................................................................................143 11 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Dexametasona administrada via intramuscular.....................91. FIGURA 2. Ácido Fólico administrado por gavagem................................92. FIGURA 3. Ratos do tipo Holtzmam.........................................................93 FIGURA 4. Presença de espermatozóide.................................................96 FIGURA 5. Laparotomia das gestantes.....................................................97 FIGURA 6. Extremidade cefálica separada do resto do corpo..................98 FIGURA 7. Palato sem fenda palatina......................................................99 FIGURA 8. Palato com fenda palatina.....................................................99 FIGURA 9. Fotografias de fetos em vista de perfil do GRUPO I, com 19 dias de idade. Alterações anatômicas ocorridas na face e nas patas dianteiras e traseiras. .............................................................................103 FIIGURA 10. Fotografias oclusais dos fetos com 19 dias de idade. a) e b) ausência de fenda palatina; c) e d) presença de fenda palatina completa; e) e f) presença de fenda palatina incompleta........................................109 FIGURA 11. Fina e reduzida formação óssea com aspecto de rede....110 FIGURA 12. Ausência de formação glandular e muscular......................110 FIGURA 13. Fenda labial bilateral com união entre os epitélios.............111 FIGURA 14. Epitélio íntegro e ausência de mesodermização...............111 12 FIGURA 15. Processo de fechamento das cristas palatinas..................111 FIGURA 16. Cristas em posição horizontal muito distantes uma da outra........................................................................................................112 FIGURA 17. Condensação das células mesenquimais junto ao epitélio.....................................................................................................112 FIGURA 18. Comunicação entre as cavidades oral e nasal...................113 FIGURA 19. Vascularização reduzida....................................................113 FIGURA 20. Sulco nasolabial bilateral....................................................114 FIGURA 21. Ausência de formação óssea..............................................114 FIGURA 22. Palato fechado com restos epiteliais no mesênquima........115 FIGURA 23. Falta de fusão na porção medial, corte horizontal..............115 FIGURA 24. Fenda na região anterior do palato....................................115. FIGURA 25. Fenda labial bilateral com epitélio recoberto por queratina.................................................................................................116 FIGURA 26. Poucos capilares e ausência de formação óssea...............116 FIGURA 27. Fenda labial bilateral...........................................................117 FIGURA 28. Cristas palatinas posicionadas obliquamente.....................118 FIGURA 29. Epitélio íntegro, sem queratina e não há sinais de mesodermização.....................................................................................119 13 FIGURA 30. Células mesenquimais e não há sinais de início de diferenciação...........................................................................................119 FIGURA 31. Fenda labial bilateral – lábio leporino.................................120 FIGURA 32. Mesodermização e ausência de formação óssea...............120 FIGURA 33. Início de formação óssea....................................................120 FIGURA 34. Abertura nasal anterior e manutenção do sulco naso-lacrimal local.........................................................................................................121 FIGURA 35. Processo fronto-nasal interposto entre as cristas...............122 FIGURA 36. Cristas palatinas Encurtadas com ausência de formação óssea.......................................................................................................122 FIGURA 37. Falta de migração das cristas palatinas em direção medial..................................................................................................... 123 FIGURA 38. Processo fronto-nasal entre as cristas palatinas................124 FIGURA 39. Tecido epitelial estratificado...............................................124 FIGURA 40. Delicada malha óssea no mesenquima da crista palatina.124 FIGURA 41. Ausência de formação da abertura nasal anterior..............125 FIGURA 42. Tecido ósseo contornando o septo nasal...........................126 FIGURA 43. Processo fronto-nasal separado das cristas palatinas.......126 FIGURA 44. Cristas palatinas separadas e horizontalizadas..................126 14 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1. Peso médio dos fetos segundo grupos.............................104. GRÁFICO 2. Comprimento total médio dos fetos segundo grupos.........105 GRÁFICO 3. Comprimento médio da cabeça dos fetos segundo grupos......................................................................................................105 GRÁFICO 4. Comportamento da variável fenda segundo os grupos....107 15 LISTA DE ABREVIATURAS Dexa – dexametasona. A.F. – ácido fólico. V.i.u. – vida intra – uterina. D.T.N. – defeitos no tubo neural. 16 1 INTRODUÇÃO As más formações de lábio e ou palato situam-se entre as mais freqüentes no complexo cabeça e pescoço. Em média apresentam uma incidência na população em geral de 1 para cada 650 nascidos vivos no Brasil além de poder estar presente em 154 síndromes conhecidas (COHEN, 1978). Especificamente a fenda isolada de palato ocorre em média em 1 para cada 2000 nascidos vivos (HABIB, 1978). Esta incidência varia de modo crescente de indivíduos melanodermas para os xantodermas, passando pelos leucodermas. O grau de envolvimento das estruturas do lábio e palato pode variar bastante de acordo com o tipo de fissura presente. Assim pode-se ter desde uma fibrose cicatricial na região do lábio até a completa falta de fusão entre a pré-maxila, os processos palatinos e o processo vomerino. Partindo deste fato percebe-se que igualmente a amplo leque de seqüelas poderá estar relacionado à presença desta deformidade. Problemas relacionados ao crescimento facial, desenvolvimento da oclusão, fonação, mastigação, estética facial, além do trauma psicológico poderão estar presentes. As fendas são de etiologia mutifatorial, tendo sido constatado que cerca de 80% dos casos de fenda palatina isolada, resultam de fatores ambientais. Portanto, o conhecimento do processo normal de 17 palatogênese e dos mecanismos pelos quais a fenda palatina pode ser experimentalmente induzida evidencia o pré-requisito necessário para a compreensão da etiologia desta alteração. Contudo, a pesquisa de qualquer processo, ou deformidade, de desenvolvimento no homem, em geral, é severamente limitada pela falta de material, ou ainda, de informações relevantes sobre o material disponível. Além disto, há muitas situações onde a ética, moral e considerações legais tornam esses estudos científicos impossíveis. Nesse aspecto, é largamente aceitável que o desenvolvimento facial inicial de todos os embriões de vertebrados seja similar (BHASKAR, 1989), ocorrendo inúmeros eventos que conduzem a todos eles, à uma maturação progressiva das estruturas. Assim sendo, o desenvolvimento embrionário da face do rato é essencialmente semelhante ao da face humana. (FERGUSON, 1977) O rato é o animal de laboratório comumente empregado, cerca de 20% dos experimentos com propósitos científicos (CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE, 1980), possuindo características anatômicas e fisiológicas que o tornam de particular valor como modelo animal de pesquisa, especialmente em estudos toxicológicos, teratológicos, cardiovasculares, dentários, assim como oncologia experimental, gerontologia experimental, imunologia, imunogenética e parasitologia. As pesquisas sobre os possíveis mecanismos dos defeitos induzidos por corticóides já estão bem definidas. Em estudos sobre a 18 palatogênese normal e teratogenicamente alterada pela dexametasona em ratos wistar fêmeas grávidas (BITTENCOURT e BOLOGNESE 2000), a sua ação teratogênica foi verificada em 100% dos animais, não provocando diminuição no número de fetos da prole nem efeito eletivo quanto ao sexo. O ácido fólico é usado profilaticamente em indivíduos com risco de desenvolvimento de deficiência de folato como, por exemplo: - gestantes (principalmente quando existe risco de defeitos congênitos); - crianças prematuras e pacientes com anemias hemolíticas crônicas graves, inclusive hemoglobinopatias (anemia falciforme). Apesar do uso bastante difundido do ácido fólico em mulheres grávidas, no começo da gestação, essa aplicabilidade é bastante empírica sem embasamento científico.(SCHUBERT, 2002). Neste sentido, propõe-se a investigar os mecanismos do ácido fólico na prevenção do aparecimento de fenda palatina teratogenicamente induzida pela dexametasona em ratos Holtzman. 19 2 REVISÃO DA LITERATURA Blandau e Money, em 1944, estudou cinqüenta e oito ratas fêmeas após inseminação nos intervalos de 15, 30, 45 e 60 minutos respectivamente e e relacionou a presença de espermatozóides com as áreas reprodutivas. Os espermatozóides tinham migrado para os segmentos uterinos em 42% dos 24 ovidutos examinados 15 minutos depois da ejaculação. Depois de 30 minutos da ejaculação, os espermatozóides foram encontrados no segmento uterino em 88% dos 42 ovidutos examinados. Em 62% dos 42 ovidutos, os espermatozóides tinham chegado nos segmentos ovarianos. Após 45 minutos da ejaculação, os espermatozóides tinham migrado para os segmentos ovarianos em 86% dos ovidutos examinados. Os vinte ovidutos examinados 1 hora depois da ejaculação apresentaram-se completos de espermatozóides. Em 1952, McEvitt estudou a correlação das idades dos pais com a formação das fendas labiais e deformidades palatinas. Ele citou que a maioria das perguntas feitas pelos futuros pais são: a) Uma mãe jovem que já tem um bebê com fenda labial, pode atrever-se em ter outro filho?; b) Esta deformidade é a punição por ter me casado com um homem com o dobro da minha idade?; c) A presença de fenda palatina em um primo de terceiro grau é motivo de preocupação?; d)O que devo fazer no futuro quando a minha filha com fenda labial/palatina chegar na idade de casar? O referido autor menciona que no Hospital de Chicago, um número 20 bastante grande de crianças com deformidades de palato e fendas labiais foram nascidas de mães “mais velhas”. Entretanto, quando foi averiguado em Hospital da Dinamarca, não foi encontrado diferença significativa. O autor ainda observa que dentro da sua clínica, nos últimos 3 anos, as crianças que nasceram de pais (pai e mãe) com mais de 35 anos de idade, houve a porcentagem de 45% de incidência da presença de deformidades palatinas e fendas labiais. Sabendo-se que o acasalamento de ratos não acontece com uma freqüência igual durante as 4 primeiras noites depois de colocá-los em contato, Whitten, em 1956, apresentou um método novo com o objetivo de maximizar este processo de acasalamento. O autor descobriu que o acasalamento ocorre mais freqüentemente já na primeira noite depois de colocá-los juntos, o macho e a fêmea, isto se o macho for colocado no recipiente de acasalamento 2 dias antes pois o ciclo estral da fêmea é modificado pela presença do macho ou de suas excreções. Contudo, a incidência de procriação é alterada colocando as fêmeas no recipiente recentemente contaminado pelos machos. Strean e Peer, em 1956, investigaram 228 mães de crianças com fendas labiais e palatinas, através de questionário, com o objetivo de determinar qualquer relacionamento entre os seus históricos médicos, particularmente no primeiro trimestre de gravidez, com a incidência de anormalidades congênitas. 21 O estresse, caracterizado por um conjunto de reações fisiopatológicas resultantes de estímulos externos, e que convergem para o aumento da secreção de hormônios da supra-renal pode se associar com malformação do terço médio da face, sobretudo, com fendas labiopalatinas. Mazaheri, em 1958, analisou 661 pacientes da Lancaster Cleft Palate Clinic, e demonstrou a tendência de maior proporção de nascimentos de crianças com fissura de lábio / palato conforme aumenta a idade da mãe. Com relação à idade do pai não foi encontrada nenhuma alteração. Na avaliação da incidência com relação ao sexo, foi relatado um maior número de casos no sexo masculino, mas as fissuras mais severas apareceram em maior número no sexo feminino. Verificando os dados referentes à hereditariedade, os casos de fissura de lábio e ou palato em filhos de pais fissurados foram freqüentes. Quanto à ordem de nascimento o estudo demonstrou o maior número de casos de fissura de lábio / palato em nascimentos mais tardios na família. Töndury, em 1958, apresentou trabalho sobre o desenvolvimento da face humana que continha a origem de fendas labiais e palatinas. Ele afirmou que a alteração de desenvolvimento de cavidade nasal no lado da fenda é comum mantendo lábio leporino ou fenda de lábio. Sua origem está relacionada com a substituição da parede epitelial por mesênquima. A fenda labial completa surge se a fusão epitelial do aumento limitado da bolsa nasal não acontece. A parede epitelial não é formada, a qual é 22 observada no 12o dia de prenhez em embriões de camundongos. A formação de fenda primária tem origem do crescimento defeituoso do aumento lateral nasal. Entretanto, a formação de fenda secundária tem origem da ruptura do cisto da fenda labial o qual repousa na parede epitelial. Uma fenda labial simples é desenvolvida se houve interrupção precoce da fusão dos processos epiteliais, e a parede epitelial entram na cavidade oral muito curta. A maxila e a protuberância medial nasal possui uma separação na região anterior com diferentes graus de intensidade. Em estudo morfológico sobre fechamento e fusão do palato em ratos do tipo Sprague-Dawler, Zeiler et al. em 1964, demonstraram que a idade cronológica não pode ser considerada preceptor do estado de fechamento do palato. Dos aspectos morfológicos investigados, as medidas do desenvolvimento da pata dianteira apresentaram vantagens sobre a idade cronológica na predição do desenvolvimento do palato. Outro resultado importante deste estudo, a mandíbula sofreu surto de crescimento diferencial antes do fechamento e fusão do palato. Ingalls et al., em 1964, realizaram estudo epidemiológico das características de 99 mães que deram à luz a 100 bebês com fenda labial e palatal ou ambas. Avaliaram os nascimentos ocorridos durante 2 anos e 10 meses. Não encontraram diferença nos 3 tipos de malformação devido a alterações sazonais. As fendas de lábio ou palato e combinadas foram encontradas em 30% e 54% dos casos respectivamente. As de lábio e combinadas ocorreram mais em indivíduos do sexo masculino e as de 23 palato no sexo feminino. A incidência de lábio e palato fissurado foi maior na raça leucoderma (84 indivíduos) que na melanoderma (16 indivíduos); anomalias associadas ocorreram com mais frequência nos casos com palato fissurado (50%) que nos demais. O peso dos bebês recém- nascidos não variou, comparando-os com o de crianças normais, bem como a porcentagem de prematuridade. Conway e Wagner (1965), analisaram os dados do Departamento de Saúde de Nova York, onde foram registradas todas as anomalias das crianças nascidas em Nova York desde 1950. Os dados encontrados mostraram a fenda de lábio e palato como a terceira anomalia mais freqüente, e o sexo masculino possuiu a maior representatividade dos casos. A ocorrência dos casos de fenda de lábio e palato foi duas vezes maior em indivíduos leucodermas quando comparados aos melanodermas. Verificou-se também que as mães muito novas, antes dos 20 anos de idade, e mães com idade acima de 35 anos de idade mostraram grande incidência de anomalias congênitas em seus filhos. A prevalência da fenda palatina isoladamente pode variar de 1 em 2500 nascimentos vivos nas populações caucasianas, sendo um pouco maior nos orientais e um pouco menor nos negros. No Brasil, acredita-se que 1 em cada 650 nascimentos vivos apresentam o problema. Estimativas da mortalidade pré e pós-natal de indivíduos portadores de fendas faciais variam entre 17 a 25 % (Drillien et al., 1966). 24 A fenda palatina e lábio leporino ocorrem na proporção de 1 para cada 1000 nascimentos vivos. Fendas do lábio e da região anterior do palato são mais comuns no sexo masculino na proporção 2:1. Todavia, fendas isoladas do palato são mais freqüentes no sexo feminino. O tratamento destas anormalidades de desenvolvimento facial tem sido realizados por métodos cirúrgicos apropriados que se tornaram freqüente envolvendo multi-disciplinaridade entre dentista, médico e fonoaudiólogos. Tem sido demonstrado que crianças filhas de mães acima de 40 anos são três vezes mais susceptíveis à estas anormalidades de desenvolvimento que as crianças nascidas de mães com menos de 30 anos (Scott, 1966). Com o intuito de esclarecer o crescimento pré-natal do palato de ratos, Hughes et al., em 1967, estudaram as cabeças de fetos com 16, 17, 18, 19 e 21 dias de vida intra-uterina.i.u. de 7 fêmeas da raça Holtzman. Os autores observaram que: as cristas palatinas de fetos com 16 dias de v.i.u. apresentaram-se em posição vertical em cada lado da língua. A elevação e fusão destas cristas palatinas foram completadas no 17o dia de v.i.u. e a degeneração da lâmina epitelial da linha média palatina começou logo após a fusão. Alguns remanescentes epiteliais foram observados somente em um feto no 18o dia, e nenhum remanescente epitelial foi encontrado em fetos no 19o dia. Osteogênese intra-membranosa começou nas superfícies laterais do palato no 17o dia e alcançou a região média do palato no 21o dia de v.i.u.. 25 Asling e Wagenen, em 1967, descreveram sucintamente o desenvolvimento do palato secundário em macacos Rhesus. Este estudo foi realizado com 5 embriões de macacos com 40, 46, 65, 74 e 85 dias de v.i.u., os quais se mostravam todas as evidências externas de normalidade. O estágio de formação do palato aconteceu a partir do 40o dia. O embrião do rhesus mostrou claramente que os processos palatinos estão dispostos numa direção ventro-medial, com a presença da língua entre eles. Esta fase é muito parecida com a fase de 41o dia de v.i.u. no humano normal. No 46o dia, os processos palatinos se horizontalizaram em forma de bico e se fusionaram na região média. Este evento mostra também uma fusão posterior incompleta, bem parecida num embrião humano normal de 48-54 dias de v.i.u.. No 65o dia de concepção, a fusão palatina está completa em toda sua extensão, e as rugas proeminentes se estendendo lateralmente partindo da sutura. Os fetos no 74o e 85o dia de v.i.u. também mostraram esta união palatina. Esta condição é também apresentada em embriões humanos a partir do 54o dia de v.i.u.. Os autores finalizam sugerindo estudos sobre fenda labiais e palatinas em embriões de macacos rhesus com idade aproximada de 5 semanas de v.i.u.. Em 1968, Nagen Filho et al. propuseram-se a investigar a prevalência das lesões lábio-palatais na população escolar da Bauru e procurar, também, testar a influência de alguns fatores no aparecimento destas lesões. Foram examinados 13.249 alunos de 31 grupos escolares 26 situados no Município de Bauru, no interior de São Paulo. O método foi de exame visual direto de todos os alunos presentes no dia do levantamento. Registrou os casos encontrados em fichas específicas onde os resultados foram os seguintes: Nos grupos escolares estudados, somente 20 alunos apresentaram anomalias congênitas lábio-palatais nos seus diversos tipos. Analisando mais profundamente os resultados, os autores chegaram às algumas conclusões: a) a prevalência encontrada nos escolares examinados foi de 1:650 crianças; b) do total de casos, observou-se que as anomalias ocorreram com freqüência de ¼ na relação branco / não branco; c) as lesões lábio- palatais de maior gravidade foram significativamente mais freqüentes no sexo feminino; d) não houve diferença significante entre o grupo branco e o negro, quanto à prevalência; e) a raça amarela apresentou proporção significantemente menor do que as outras raças reunidas; f) as fendas labiais unilaterais esquerdas predominaram no sexo masculino e foram mais comuns do que as fendas unilaterais direitas ou as fendas bilaterais e g) com relação à idade da mãe, a maior freqüência de anomalias ocorreu em gestações estabelecidas após o 25o aniversário da mãe. Usando embriões de camundongos albinos do tipo CD1 com 15,5 dias de v.i.u. de ratos do tipo Holtzman com 16,5 dias de v.i.u., Deangelis e Nalbadian, em 1968, estudaram a formação do palato secundário durante o crescimento craniofacial. Afirmaram que a formação do palato secundário pela união dos dois processos palatinos ou projeções envolve 27 uma série de rápidas mudanças nos componentes epiteliais e mesenquimais das cristas palatinas. As cristas palatinas exibem uma irregular plasmalema epitelial externo que se torna mais regular um pouco antes do contato. Forma desmossomos na superfície de contato da projeção e aparece para unir os dois processos até que a união mesenquimal aconteça. A mais nova parede epitelial estabelecida gradualmente começa a ser destruída, provavelmente por um processo auto-lítico. Estruturas parecidas com lisossomos são evidentes dentro do citoplasma da célula epitelial. A lâmina basal separando o epitélio do mesenquima intacto remanescente e as células mesenquimais fundamentais estão imutáveis até a desintegração final da célula epitelial. A fusão é evidente em algumas áreas da parede epitelial, particularmente na região do palato mole, que após o desaparecimento da parede epitelial, acontece o reparo da lâmina basal transversalmente, deixando nas projeções uma depressão no jovem palato secundário. Concomitantemente hemi-desmossomos aparecem na lâmina basal formada. Borden, em 1969, publicou artigo sobre um estudo que realizou em relação ao desenvolvimento do controle neural e função motora na musculatura fetal da língua de ratos. Realizou-se estudo histológico do aspecto e diferenciação do 12o nervo da língua e também sobre a função de respostas da musculatura da língua. Todos os resultados foram associados ao fechamento do palato secundário. As ratas prenhes 28 (Holtzman) produziram 16 ninhadas de 120 fetos; com a idade de 14 a 21 dias. Verificou-se que: histologicamente, os nervos lingual e hipoglosso já estavam bem representados na língua dos fetos com 14 dias de vida. Finas mio-fibrilas não estriadas também foram encontradas nestes fetos na área dos músculos hioglosso e genioglosso. As línguas dos fetos foram estimuladas eletricamente com eletrodos, e verificaram que já nos fetos com 14 dias de idade, produziram respostas rápidas, indicando retorno sensorial e atividade motora dos neurônios do músculo hipoglosso. Portanto o autor concluiu que o músculo da língua tem a capacidade motora antes do fechamento do palato secundário. Estes achados fortalecem a teoria que a língua é um componente ativo no mecanismo de fechamento do palato secundário. Com um estudo sobre morfogênese do palato em coelhos, Walker, em 1971a, afirmou que a mudança de posição das cristas palatinas da posição vertical para a horizontal é a fase crítica do desenvolvimento do palato. Foi observado também que a porção final das cristas palatinas estavam numa posição horizontal, enquanto que a porção mais caudal ainda estava vertical e lateral à língua, portanto, isto suporta a hipótese de que a retração ativa da língua ajuda no mecanismo do fechamento palatal. O autor também não encontrou nenhuma diferença entre os embriões de machos e fêmeas no desenvolvimento palatino. Com um método de determinação de síntese de colágeno no palato de ratos Pratt e King em 1971, concluíram que o colágeno está 29 presente e é ativamente sintetizado no palato de ratos antes e durante o tempo de fechamento do palato. A quantidade relativa de colágeno no palato entre o 14o e 16o dia foi aproximadamente a mesma que observada em todo o feto. Este aumento inicial foi seguido de um rápido aumento entre o 16o e 19o dia, o qual provavelmente reflete a formação de osso das cristas palatinas, que começa logo após o fechamento do palato do rato. Com o objetivo de fazer uma revisão da literatura sobre a formação do palato secundário, Smiley em 1972, comentou que os tipos mais comuns de fenda do palato secundário são: 1) fenda completa e parcial dos palatos duro e mole; 2) fenda parcial do palato mole e 3) fenda submucosa. As fendas atípicas do palato secundário podem também acontecer enquanto o palato primário permanece intacto. O autor ilustrou neste artigo a fenda atípica do palato secundário de um cachorro, a qual seções histológicas do palato primário e do palato mole demonstraram a morfologia normal. Com exceção da presença de fenda palatina na região anterior, o palato duro estava normal. Este tipo de fenda pode ser devido a ruptura do cisto palatino ou à reabertura das cristas palatinas já fechadas. Isto pode ter ocorrido pela presença de células programadas para morrer as quais normalmente estão ao longo da margem medial do processo palatino. A adesão epitelial é um dos primeiros estágios que deve ocorrer após ter acontecido o contato epitelial, portanto a degeneração celular pode acontecer antes deste contato epitelial e assim 30 inibir a aderência epitelial. O autor também comentou sobre o elemento tempo, citando o estudo cefalométrico em ratos de Smiley, Vanek e Dixon, que mostrou que existe platô no crescimento de largura do arco maxilar na época do fechamento palatino – enquanto a largura do arco maxilar continua aumentando durante esta mesma época nos fetos com presença de fendas formadas espontaneamente. Indubitavelmente, a presença deste platô pode ser crítica na época da aderência e do contato epitelial normal. Saxén, em 1974, estudou 590 crianças com fenda labial/palatina, registradas num período entre os anos de 1967 e 1971 na Finlândia, que foram analisadas com o objetivo de encontrar os efeitos etiológicos da fenda lábio-palatal. Diversos fatores foram correlacionados, entretanto os que foram significantemente associados ao nascimento destas crianças com defeitos lábio palatinos foram: idade dos pais; posição sócia econômica; gravidez com presença de ameaças de abortos espontâneos; exames radiográficos na região pélvica durante a gravidez e fatores emocionais. O autor concluiu que os fatores são etiologicamente variados tanto para a formação de fenda labial e fenda palatina. Goss, em 1975, investigou a fusão palatal estudando fetos humanos. Os fetos foram obtidos através de aborto terapêutico do Hospital de Adelaide, no Sul da Austrália. Os fetos foram mantidos em meio de cultura, que possibilitou a estimulação da fusão palatina in vitro, formação de pérola epitelial in vitro, e investigar alguns aspectos da 31 ruptura pós-fusão. O autor descreveu 5 casos de fetos mantidos com sucesso em cultura. Caso I - demonstrou que fusão do palato humano in vitro realmente ocorre. A área fusionada mostrou rápida penetração mesenquimal, isto é contrário aos achados em roedores. No desenvolvimento normal humano, a junção epitelial persiste por algumas semanas. Caso II – A morfologia geral do palato foi mantida. A quantidade de epitélio vista foi menor que o normal. Caso III e IV demonstraram que se o palato intacto é rompido, então o restabelecimento é através de cobertura epitelial de mesenquima exposto. O caso V mostra que é possível estudar os restos epiteliais na região mediana. Melsen, em 1975, estudou o crescimento pós-natal do palato duro com histologia convencional e micro-radiografia em material de autópsia de 22 meninos e 27 meninas com idade de 0 a 18 anos. Os achados indicaram que o crescimento em comprimento do palato duro até os 13 e 15 anos foi devido ao crescimento da sutura transversa e de aposição da margem posterior do palato. Depois desta idade, o crescimento sutural foi interrompido, considerando que a aposição pareceu continuar por alguns anos. Durante o crescimento pós- natal, a morfologia da sutura transversa mudou. No nascimento, a sutura estava ampla e levemente sinuosa, depois é desenvolvida numa típica sutura escamosa, parte do palato cobrindo parte da maxila. Durante a puberdade, a sutura voltou a ficar levemente sinuosa. A importância desta mudança no crescimento vertical do palato duro foi discutida. Foi 32 chamada a atenção para abaixamento da parte posterior do palato. O crescimento transversal da sutura palatina mediana continuou até os 16 anos nas meninas e até os 18 anos nos meninos. Baseando-se na morfologia, o desenvolvimento da sutura mediana pôde ser dividido em três estágios: no primeiro estágio a sutura é curta, larga e em forma de Y; no segundo estágio a sutura está mais sinuosa e no terceiro, a inter- digitação estava tão forte que a separação das duas cristas palatinas poderia não acontecer numa fratura dos processos inter-digitados. Com o objetivo de aplicar o método analítico para avaliar dimensões e padrões de crescimento regionais na cavidade oronasal, Diewert, em 1979, estudou embriões de ratos Sprague-Dawley. Das ninhadas de 8 ou mais embriões foram coletadas em cada uma das 5 seguintes idades: 15 dias e 5 horas; 16 dias e 0, 4 e 8 horas; 17 dias e 5 horas. Das 9 ninhadas coletadas até o 160 dia de gestação e 0 horas, todos os fetos tinham o palato aberto. Das 3 ninhadas coletadas com 16 dias e 4 horas, produziram 32 fetos com ambos os estágios, palato aberto ou fechado (41% com os processos palatinos vertical, 24% com um processo palatino vertical e o outro horizontal, e 34% com os processos palatinos horizontais). Com 16 dias e 8 horas, 80% dos fetos tinham ambos os processos palatinos elevados na região do palato duro. Os fetos com 17 dias de idade, os processos palatinos estendiam-se medialmente da base do processo maxilar na região do palato duro, e ventralmente na região do palato mole. Nos estágios mais avançados do 33 desenvolvimento do palato, o local de fixação da língua se tornou mais anteriorizada em relação ao palato. Em todos os estágios, incluindo nos estágios de abertura, a superfície dorsal da língua estava em contato com o palato primário nas regiões anteriores do palato secundário. A autora concluiu que antes da elevação, houve um rápido aumento de volume na cavidade oro-nasal e dos processos palato-maxilares que ocorreram simultaneamente. A posição anterior da língua e da mandíbula relativa ao palato primário sugeriu que o rápido aumento do volume da cavidade oro- nasal é provavelmente o resultado do deslocamento da língua e mandíbula. A posição dos processos palatinos lateralmente à língua sugeriu que os processos não empurraram pra baixo a língua, mas pressionou medialmente a língua que contribuiu para seu deslocamento. Nos embriões de ratos e camundongos, a capacidade intrínseca de direcionar verticalmente os processos para alcançar a posição horizontal é maior que nas outras espécies. Em 1978, Taylor estudou o crescimento crânio-facial pré-natal de embriões de hamster. Foram estudados 170 embriões os quais foram pesados individualmente e suas cabeças foram preparadas para estudos histológicos. No hamster, a elevação dos processos palatinos aconteceu entre o 11o dia e o 12o dia de prenhez. Esta elevação aconteceu rapidamente, envolvendo a movimentação das bases dos processos palatinos em direção à linha média. O relacionamento entre a mandíbula e base craniana posterior mantiveram-se constante durante a referida 34 elevação. Os comprimentos da língua, da mandíbula e da região naso- basal cresceram completamente durante todo o tempo estudado. Beaudoin, em 1980, mencionou que o início do estro na fêmea de ratos pode ser determinado pela demonstração de lordose característica em resposta ao estímulo manual. Isto é um sinal de predisposição para a cópula e marca o início da atração sexual que dura em média 13 horas. A ovulação ocorreu aproximadamente 10 horas após o início do aquecimento. No ano seguinte, Bertholet (1981) aperfeiçoou o método de acasalamento, que produz a avaliação exata do tempo de procriação dos ratos, colocando machos e fêmeas somente por duas horas em contato na manhã do dia do estro. A referida avaliação é determinada com observação da presença de espermatozóide no material coletado na vagina das fêmeas com microscopia ótica. A porcentagem de prenhez obtida pelo método foi igual ao método tradicional o qual deixa o casal de ratos em contato durante a noite inteira. Moore, em 1986 descreveu que o palato forma-se a partir de dois primórdios: o palato primário e o palato secundário. Embora a palatogênese se inicie no fim da 5a semana de v.i.u., seu desenvolvimento só vai se completar na 12a semana. Seu período crítico de desenvolvimento nos seres humanos está compreendido entre o fim da 6a e o começo da 9a semana. O palato primário ou processo palatino mediano começa a se desenvolver no início da 6a semana a partir da 35 parte profunda do segmento inter-maxilar. O palato primário forma a parte pré-maxilar da maxila. Ele representa apenas a pequena parte do palato duro adulto (a parte anterior ao forame incisivo que aloja os dentes incisivos). O palato secundário é o que se forma primeiro dos pares duro e mole do palato que se estendem posteriormente desde o forame incisivo. O palato secundário começa a desenvolver-se na sexta semana, a partir de duas projeções mesenquimais que se estendem na porção interna das proeminências maxilares. Inicialmente, estas estruturas em forma de cristas, chamadas processos laterais do palato, projetam-se ínfero- medialmente de ambos os lados da língua. Com o desenvolvimento dos maxilares, a língua fica relativamente menor e se desloca inferiormente. Com o prosseguimento da palatogênese ao longo da sétima e oitava semanas, os processos laterais do palato alongam-se e se movem para a posição superior à língua. Gradualmente, estes processos aproximam-se um do outro e se fundem no plano médio. Eles também se fundem com o septo nasal e a parte posterior do palato primário. O tecido ósseo surge de forma gradual no palato primário, constituindo a parte pré-maxilar, que aloja os dentes incisivos. Ao mesmo tempo, ocorrem extensões ósseas, partindo dos ossos maxilares e palatinos para os processos laterais do palato, formando o palato duro. As partes posteriores destes processos não chegam a se ossificar. Elas estendem-se em sentido posterior para além do septo nasal e fundem-se para formar o palato mole e sua projeção cônica, denominada úvula. A rafe do palato indica, de modo 36 permanente, a linha de fusão dos processos laterais do palato durante o período compreendido entre a sexta e a décima segunda semana de v.i.u.. Um pequeno canal naso-palatino persiste na linha média do palato entre a parte pré-maxilar e os processos palatinos dos maxilares. Este canal é representado no palato duro do adulto pelo forame dos incisivos. Sutura irregular corre do forame dos incisivos até o processo alveolar da maxila, entre os dentes incisivos e caninos de ambos os lados, o que é visível na região anterior do palato de pessoas jovens. Esta sutura indica onde os palatos primário e secundário embrionários se fundiram e onde as fendas do palato anterior ocorrem. A base embriológica da fenda do palato é a falta de união das massas mesenquimais dos processos palatinos laterais e de uma com a outra, com o septo nasal e/ou com a margem posterior do processo medial do palato. Fendas do palato anterior ou primário (fendas anteriores ao forame incisivo) decorrem do não encontro das massas mesenquimais dos processos palatinos laterais e da ausência da fusão com o mesênquima do palato primário. Fendas do palato posterior ou secundário (fendas posteriores ao forame incisivo) resultam da falta de união e de fusão das massas mesenquimais dos processos laterais do palato com o mesênquima do palato primário e com o septo nasal. Fendas das partes anterior e posterior do palato (fendas envolvendo os palatos primário e secundário) resultam da não-união e da não-fusão das massas mesenquimais dos processos palatinos laterais entre si, com o mesênquima do palato primário com o septo nasal. 37 Young et al., em 1991, fizeram estudo com o objetivo de examinar se a língua tinha papel determinante no desenvolvimento fundamental das cristas palatinas na direção vertical em Hamster Golden Syrian. Eles dividiram o estudo em dois grupos, que são: controle e o grupo em que os embriões foram tratados com 6-mercaptopurina, os quais foram examinados com microscopia eletrônica e técnicas histológicas para averiguar o relacionamento espaço-temporal do desenvolvimento do palato, língua e mandíbula. A síntese de DNA, medida pela incorporação H-Timidina, foi usada como um índice de crescimento. Os resultados indicaram que no grupo controle, o desenvolvimento vertical do palato começou na metade anterior do teto da cavidade oro-nasal, e os abaulamentos da língua e o processo mandibular se desenvolveram na metade posterior da cavidade oro-nasal. Houve o surto de síntese de DNA que ocorreu no palato e na mandíbula, mas não na língua. Já no grupo em que os fetos foram tratados com 6-mercaptopurina, apesar da aparência cronológica inicial de todas as três estruturas, a síntese de DNA foi inibida em todas as três estruturas. A recuperação da síntese de DNA, embora parcial, foi mais rápida no palato e na mandíbula do que na língua. Portanto, baseando-se nas observações deste estudo, os autores sugeriram que o desenvolvimento da língua pode não desenvolver papel determinante na direção de desenvolvimento palatal. Com o objetivo de explorar os possíveis mecanismos de formação de fendas tanto em humanos como também em animais, Kitamura, em 38 1991, examinou fendas labiais e palatinas de 19 embriões humanos, 152 embriões de camundongos. Também estudou como grupo controle 60 embriões humanos e 440 de embriões de camundongos sem fendas. O autor chegou à conclusão que algumas fendas de palato e de lábio aparecem a partir de uma ruptura depois da fusão. Ele descobriu que na 18o semana de v.i.u., as cristas palatinas dos embriões humanos foram encontradas verticais, mas os remanescentes epiteliais foram encontrados consistentemente em somente uma das cristas palatinas. A ruptura começou na região posterior à junção do palato primário com o secundário e estendeu-se posteriormente ao final do palato mole. O ducto naso-palatino foi formado, sugerindo que a fusão palatina ocorreu, e o palato rompeu mais tarde, e as cristas palatinas afetadas desprenderam- se. Se a fenda foi o resultado da falha de elevação das cristas palatinas, nem os remanescentes epiteliais e nem os ductos naso-palatinos deveriam estar formados. Foram administradas testosterona e cortisona durante as prenhes de ratas, com o objetivo de avaliar a capacidade destes hormônios de causar mudanças nos fetos. O hormônio foi administrado durante a última semana de prenhez, na qual o stress maternal altera a secreção de testosterona nos fetos. Kjaer, em 1992, investigou o estágio de maturação esquelético na base do crânio na época do fechamento palatino. O material que ele estudou consistiu de 62 embriões humanos que pertenciam ao Hospital Universidade de Copenhagen, do Departamento de Medicina Legal. 39 Todos os espécimes não tinham nenhum tipo de má-formação. O registro da maturação esquelética da maxila e da base do crânio foi realizado na exposição de radiografias de acordo com o método já descrito pelo próprio autor em 1989. O estágio de desenvolvimento ósseo da maxila foi estimado pela radiografia axial, e o estágio de desenvolvimento da base do crânio pela radiografia lateral. Concluiu-se que a elevação e fusão dos processos palatinos aconteceram quando a maturidade esquelética dos ossos da linha média da base do crânio é caracterizada pela ausência de estruturas óssea do occipital, esfenóide, etmóide e frontal. Também encontrou que os estágios de maturação óssea da base do crânio e da maxila foram correlacionados com a maturação das mãos e pés. Concluiu-se que a elevação e fusão das cristas palatinas aconteceram quando os primeiros ossos dos dedos da mão – falange distal – se tornaram visíveis, enquanto que os ossos do pé não tiveram sido ainda reconhecidos radiograficamente. Segundo Amwayi (1993), cerca de 80% das fendas orofaciais são causadas por fatores ambientais. Em países desenvolvidos, os hábitos alimentares têm mudado, verificando-se o aumento do consumo de alimentos industrializados que contém conservantes, alguns dos quais podendo ser teratogênicos quando ingeridos em grande quantidade por indivíduos susceptíveis. Além disso, medicações tomadas em surtos febris e especialmente na gravidez tanto quanto a poluição ambiental podem constituir fatores etiológicos nas anomalias orofaciais. Portanto, é 40 evidente que o homem é o único modelo morfologicamente adequado para o estudo do palato. Entretanto o uso apropriado de animais de laboratório consiste na construção de modelos teóricos, os quais são válidos para o homem. Ten Cate, em 1994, salientou a importância de observar o momento crítico no qual os fatores ambientais exercem seus efeitos. Se um agente teratogênico age durante as primeiras quatro semanas de desenvolvimento, quando o embrião está evoluindo rapidamente, ele, geralmente, danifica tantas células que acaba ocorrendo a morte do mesmo. Por outro lado, se apenas algumas células são lesadas, a proliferação normal é suficientemente intensa para eliminar facilmente as pequenas injúrias. Durante o estágio seguinte do desenvolvimento, entre quatro e oito semanas, quando a diferenciação dos tecidos e órgãos está ocorrendo, os agentes teratogênicos são mais efetivos na produção de muitos tipos de malformação, pois é o período no qual está havendo a histodiferenciação e a morfogênese no embrião. A fase subseqüente de crescimento não é suscetível a agentes teratogênicos. Proffit e Fields, em 1995, comentam que o defeito congênito mais comum envolvendo a face e os maxilares, é a fenda do lábio, palato e, menos comumente, outras estruturas faciais. Os autores citam também que elas surgem durante o 4o estágio de desenvolvimento exatamente no local determinado onde a fusão de vários processos faciais não ocorreu, e isto, por sua vez, é influenciado durante o tempo de vida embrionário 41 quando ocorreu alguma interferência com o desenvolvimento. Em relação ao fechamento do palato secundário, Proffit e Fields afirmaram que é acompanhada pelo palato primário em aproximadamente 2 semanas, o que significa que a interferência com a formação do lábio que ainda está presente pode afetar o palato. Cerca de 60% dos indivíduos com fenda no lábio também tem uma fenda palatal. A fenda isolada do palato secundário é o resultado do problema que surge depois que a formação do lábio está completa. A incompleta fusão do palato secundário que produz o sulco na sua extensão posterior indica o aparecimento tardio da interferência com a fusão. Carreirão et al., em 1995, relataram que a embriogênese pode ser alterada por agentes físicos, químicos e biológicos. A combinação da ação deletéria destes fatores ou a intensificação da atividade de um deles pode trazer modificações irreversíveis no comportamento das células da crista neural e, por conseguinte, no mesênquima facial, trazendo como resultado final o nascimento do indivíduo portador de fenda labiopalatina. As alterações da morfogênese que culminam com uma fenda labiopalatina têm o mecanismo etiopatogênico ligado a herança multifatorial. Na verdade identificou-se o fator genético em 35% dos portadores da malformação. Nos demais, 65% apresentaram a patologia em associação aos chamados fatores ambientais. Estes fatores foram identificados por informação familiar e alguns deles, comprovaram sua eficaz ação deletéria em teratologia laboratorial. Estes fatores são: 42 Materno fetais: estudos conduzidos em mães diabéticas que tiveram filhos com fendas atestaram a presença de um fator anti insulina no soro destas mulheres. Tal fator diminui o aporte nutricional das células que tem por via de conseqüência, seu comportamento modificado, determinando alterações na morfogênese. O hipotiroidismo é outro fator endocrinológico associado ao nascimento de portadores de fendas labiopalatinas. Estudos reproduziram o cretinismo em ratas, que, uma vez prenhes, tiveram crias portadoras de deformidades. Os mesmos animais em gestações subseqüentes, porém sob terapêutica com tiroxina, tiveram crias normais. O autores também citaram que algumas viroses com neutrofismo podem atacar a placa neural comprometendo o desenvolvimento do mesênquima e a conseqüente alteração da embriogênese. A rubéola, se contraída pela mulher no início da gravidez, pode acometer o embrião. Parece que o vírus da gripe teria ação sobre o desenvolvimento embrionário, podendo determinar o aparecimento de portador de fissura. Rodriguez-Pinilla e Martinez-Frias, em 1998, apresentaram os resultados de estudo de controle de caso, sobre o relacionamento do uso de corticosteróides durante a gravidez e fendas orofaciais em recém- nascidos. Os dados vieram do Spanish Collaborativa Study of Congenital Malformation. A amostra continha 1184 recém nascidos com fendas orofaciais. Nesta amostra foram retirados casos de grávidas fumantes, mães submetidas a tratamentos com antiepiléticos, benzodiazepínicos, metronidazol ou hormônios sexuais durante o primeiro trimestre de 43 gravidez. Os resultados mostraram o relacionamento bastante grande entre a exposição de corticosteróides durante o primeiro trimestre da gravidez e aumento do risco de aparecimento de fenda orofacial nos recém nascidos. 44 2.1 CORTICOSTERÓIDES Com o objetivo de descrever o crescimento craniofacial pré-natal e o aparecimento das anomalias anatômicas do feto de camundongo durante o desenvolvimento, Reed em 1933, fez a investigação profunda embriológica e concluiu: a) As fendas palatinas não produzem dentes supranumerários, pois no momento em que a fenda aparece pela primeira vez, as estruturas relacionadas não são afetadas pelo número de dentes os quais vão aparecer mais tarde; b) Falha no abaixamento da língua que está posicionada entre as cristas palatinas, e isto pode ser a causa de fendas palatinas. c) Nutrição deficiente pode ser um dos motivos da formação de fendas palatinas e labiais. e) A principal causa da falha na união dos processos palatinos é o atraso do crescimento da região dos processos maxilares, que pode ser o resultado de uma formação genética. Sabendo-se que a freqüência da presença de fendas palatinas em fetos, quando a cortisona é administrada em ratas prenhes depende de alguns fatores que são: a) da composição genética do animal tratado; b) dose do hormônio, pois se for pequena, será ineficiente na produção de anomalias, entretanto se for em excesso, poderá causar a eliminação de toda a ninhada e c) o tempo de duração da administração da droga 45 durante a prenhez, Kalter, em 1954 estudou a relação da composição genética e a susceptibilidade de ratos, com efeitos teratogênicos da cortisona. Os animais usados foram do tipo A/Jax e C57BL/6Jax. Sabia-se previamente que a raça do tipo C57BL/Jax é resistente à cortisona. As ratas prenhes foram submetidas à cortisona durante 5 dias suscetíveis desde o 15o dia de prenhes. Os resultados mostraram que a cortisona realmente induziu às fendas palatinas nos dois grupos, entretanto, a incidência de anomalias foi maior no grupo de ratas do tipo A/Jax quando comparado com as do grupo do tipo C57BL/Jax. Quando houve o cruzamento de animais entre os dois tipos referidos, formando um terceiro grupo, a incidência do defeito palatino, ficou intermediado entre as duas raças, ou seja, o número de fetos com defeito foi igual quando a mãe era da família da raça mais suscetível. Entretanto, a incidência foi menor no grupo em que a mãe era originada da raça resistente. Walker e Fraser (1957) comentaram que a forma pela qual o tratamento com a cortisona interfere nos movimentos das cristas palatinas tem sido questionada. Sugeriram que poderia haver a inibição direta na força intrínseca das cristas ou o aumento na resistência da língua em ser deslocada, porém experimentos realizados mostraram a reduzida potencialidade no movimento das cristas, mesmo quando a língua foi removida. Há possibilidade da diminuição no tamanho das cristas, com redução do conteúdo da matriz extracelular e do número de células, além da redução na extensão do contato entre as cristas. 46 É conhecida a capacidade da cortisona em reduzir a produção das fibras elásticas e a fibrilogênese no tecido conjuntivo durante a cicatrização de ferimentos e, já que o tecido conjuntivo das cristas palatinas sofre metacromasia e reage com o corante de Gomori para tecido elástico, parece que a cortisona inibe o crescimento das fibras ou a consistência da substância fundamental. Peer et al., em 1958, estudaram a indução de fendas palatinas em fetos de camundongos durante o crescimento pré-natal com a administração de cortisona e a diminuição do aparecimento das referidas fendas através do uso de Vitaminas. As fêmeas prenhes receberam tratamento diário a partir do décimo primeiro dia de prenhez com administração via intramuscular. O estudo foi dividido nos seguintes grupos: a) solução salina (0,2 ml) e cortisona (2,5mg); b) solução salina e vitamina B6 (10mg); c) cortisona e vitamina B6; d) solução salina e ácido fólico (10mg); e) cortisona e ácido fólico e f) cortisona, vitamina B6 e ácido fólico. Os achados foram surpreendentes na época: 1) Não foram encontrados fetos com fendas palatinas nos grupos que as mães foram tratadas com solução salina e ácido fólico (grupo d) e solução salina e vitamina B6 (grupo b); 2) O grupo com solução salina e cortisona (grupo a) causou 85% de fendas palatinas; 47 3) A incidência de fenda palatina diminuiu em 43% quando foi administrada vitamina B6 juntamente com cortisona; 4) Diminuiu para 26% quando o ácido fólico foi administrado com a cortisona e 5) Quando a vitamina B6 e o ácido fólico foram combinadas com o tratamento com a cortisona, houve redução para 15% de ocorrências de fendas palatinas. Larsson, no ano de 1962, estudou a ação teratogênica da Cortisona em camundongos. O autor usou 97 ratas grávidas, divididas em 7 grupos experimentais: 1) Acetato de Cortisona (1,25 mg/Kg); 2) Acetato de Cortisona (1,25 mg/Kg) + Metil androstenediol (1,25mg/Kg) 3) Metil androstenediol (1,25mg/Kg); 4) Metil androstenediol (2,5mg/Kg); 5) Metil androstenediol free vehicle (0,1mg/Kg); 6) Acetato de Cortisona (1,25 mg/Kg) + Vitamina B6 (0,1 mg/Kg) e 7) Acetato de Cortisona (1,25 mg/Kg) + Vitamina B12 (0,025 mg/Kg). Todas as soluções foram administradas entre o 11o e 14o dia de gestação, e foi interrompida a gravidez no 18o dia de gestação. Os 48 resultados mostraram o seguinte: no grupo 1) ocorreu incidência de 100% de fenda palatina sem fenda labial; no grupo 2) todos os embriões foram reabsorvidos; nos grupos 3) e 4) somente 8 embriões do total de 130, tiveram fenda palatina sem fenda labial; no grupo 5) houve incidência de 8,1% embriões reabsorvidos; no grupo 6) somente 1 embrião do total de 240 embriões, tinha palato fechado e (estatisticamente igual ao grupo 1) e no grupo 7) fenda palatina foi induzida em 100% dos embriões com índice de 19,6% de embriões reabsorvidos. Com o objetivo de examinar o efeito teratogênico do glicocorticóide em relação aos outros agentes teratogênicos, na produção de fendas palatinas. Nanda et al., em 1970 dividiram o experimento com ratos Wistar em 4 grupos, que foram formados assim: 1o grupo controle com 8 ratas prenhes formando 71 embriões; 2o grupo formado por 10 ratas prenhes, nas quais foram administrados 5 mg de acetato de cortisona entre o 8o dia e 13o de prenhes, formando 86 embriões; 30 grupo que foi formado por 10 ratas prenhes, nas quais foram administrados 0,5 mg de (dexa) também entre o 8o e 13o dia de gravidez, formando 79 embriões e o 4o grupo que continha 10 ratas prenhes, nas quais foram administrados 40.000 UI de vitamina A, entre o 9o e 12o dia de gravidez, formando 77 embriões. Os resultados foram os seguintes: No grupo controle e no grupo que foi utilizado o acetato de cortisona não nasceu nenhum embrião com deformidades de fendas labial e palatal. Já no grupo que foi utilizado a (dexa) apareceu uma incidência de 82% de 49 fendas palatinas, e no grupo da vitamina A aconteceu 77% de fendas palatinas. Portanto os autores concluíram que a diferença de resultados entre os grupos da cortisona e (dexa), mostrou o alto efeito teratogênico da (dexa) em produzir defeitos de fendas labiais e palatinas. Walker, em 1971b empregou o método injetando drogas anti- inflamatórias por via subcutânea em ratas prenhez Holtzman, do 120 ao 150 dia de gestação. A utilização de 0,1mg a 0,8mg por dia de triancinolona, betametasona e dexametasona produziu uma significante freqüência de fenda palatina. Porém, a utilização de metilprednisolona, prednisolona e cortisona, com doses diárias entre 8 mg e 75 mg, não levou à indução de fenda palatina. Com o intuito de estudar a morfogênese do palato em fetos de hamster normais e tratados com hidrocortisona, Shah e Travill, em 1975 determinaram 8 estágios de desenvolvimento normal, e os estágios de desenvolvimento nos fetos tratados com cortisona, confirmados com observações histológicas. Os estágios de desenvolvimento normal encontrados foram: Estágio I. As cristas palatinas secundárias projetaram-se verticalmente à lateral da língua. A região inferior da língua estava alargada dentro da cavidade oral. Estágio II. As cristas palatinas mudaram da posição vertical para horizontal acima da língua. Esta reorientação começou aproximadamente 50 no terço intermediário do palato duro secundário e a partir daí prosseguiu posteriormente e anteriormente. A reorientação das cristas palatinas começou quando a protuberância mesenquimal horizontal apareceu na superfície medial da projeção vertical. A língua recolheu-se da sua posição entre as projeções para próximo do assoalho da cavidade bucal. Estágio III. As cristas palatinas estenderam-se horizontalmente acima da língua. Estágio IV. As cristas palatinas opostas aproximaram-se para formar o terço médio do palato duro secundário. Estágio V. As cristas palatinas opostas fusionaram-se no terço médio do palato duro secundário. A fusão deixou uma abertura triangular no terço anterior do palato secundário. A abertura ficou limitada anteriormente pelo palato primário e posteriormente pelas projeções do palato secundário. Estágio VI. A aproximação e fusão das cristas palatinas foram completadas no terço posterior do palato duro secundário. Esta fusão resultou uma formação numa abertura na região posterior em forma de diamante, o qual foi formado pelas duas projeções do palato mole com a parede posterior da faringe. Estágio VII. A abertura posterior em forma de diamante foi obliterada pela fusão das projeções do palato mole. 51 Estágio VIII. A abertura triangular anterior foi fechada pela movimentação no sentido oposto das cristas palatinas juntamente com o crescimento do septo nasal. No final deste estágio o palato secundário ficou formado. O desenvolvimento do palato secundário seguido com tratamento com hidrocortisona apresentou estas características: Com a administração de hidrocortisona os estágios de I – IV da palatogênese não demonstraram diferenças do desenvolvimento normal, ou seja, inicialmente as cristas palatinas estavam verticalizadas com a língua se interpondo entre elas. No Estágio II as cristas palatinas mudaram para a posição mais horizontalizada e a língua já desceu para o assoalho da cavidade bucal, e conseqüentemente as projeções se estenderam por cima da língua. O Estágio IV foi reconhecido com a aproximação das cristas palatinas opostas. Entretanto, depois disto, não houve fusão das projeções do palato secundário. Em relação aos pesos corporais dos fetos, os autores tentaram relacionar o peso dos fetos com o estágio de desenvolvimento palatal. No grupo com desenvolvimento normal, pôde-se observar que nos Estágios II e III de desenvolvimento palatal os fetos apresentaram um peso médio de 300 mg. No Estágio IV a maioria chegou nos 350 mg. Nos Estágios V, VI e VII quase todos chegaram a pesar 400 mg e finalmente no Estágio VIII os fetos apresentaram 500 mg. Já no grupo tratado com Hidrocortisona, a maioria dos fetos pesou 300 mg nos Estágios II e III, entretanto somente 40% dos fetos pesaram 52 350 mg no Estágio IV e os pesos maiores aconteceram nos Estágios III e IV. Shah e Travill, em 1976, descreveram que o componente genético faz parte da susceptibilidade à fenda palatina induzida por glicocorticóides, pois diferentes espécies de camundongos exibiram diferentes graus de resposta ao tratamento com o mesmo. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar essas diferentes respostas à ação teratogênica dos corticóides, sugerindo-se a relação com o momento de elevação das projeções. As cristas palatinas, durante o desenvolvimento normal, se tornam horizontais mais tardiamente em uma espécie que na outra e esta diferença parece tornar a primeira mais susceptível à cortisona que a última. Outras explicações possíveis são as diferenças de metabolismo, diferenças no nível de esteróides endógenos, distribuição diferencial de esteróides nos tecidos maternos e fetais e diferenças na sensibilidade das células constituintes das estruturas faciais embrionárias. Os corticóides podem atravessar a barreira placentária sem serem metabolizados. Quando administrados em doses farmacológicas nas ratas prenhez, uma fração alcança o embrião e parecem funcionar como agente teratogênico ativo. Estudos morfológicos sobre indução de fenda palatina com cortisona, mostraram um atraso na rotação das cristas palatinas do plano sagital para o plano transversal. A cortisona também reduz os movimentos musculares fetais, o que pode explicar o porquê do 53 deslocamento da língua entre as cristas palatinas se torna atrasada. Alguns trabalhos sobre desenvolvimento extra-uterino de fetos de ratos demonstraram que os maiores obstáculos da rotação das cristas palatinas são as membranas fetais e a língua. Sabendo-se disto Walker e Patterson, em 1978, resolveram avaliar o desenvolvimento do palato após a remoção da língua e liberação das membranas fetais num procedimento extra-uterino de fetos de ratos da raça CD-1. Este trabalho consistia de 2 grupos de estudos de fetos tratados com dose diária de 2,5 mg de acetato de cortisona durante 3 dias a partir do décimo primeiro dia de prenhez. O primeiro grupo tinha 10 ninhadas com 114 fetos coletados no décimo sétimo dia de gravidez com o objetivo de avaliar a freqüência de fenda palatina produzida com a referida dose. E o segundo grupo com os fetos tratados com a mesma dose diária, mas com a remoção das membranas fetais e da língua no décimo terceiro dia de gravidez. Os resultados indicaram o seguinte: No grupo que as mães foram tratadas com acetato de cortisona e os fetos foram coletados no décimo sétimo dia de gravidez a porcentagem de palato fusionado foi de 4 %; no grupo de fetos que foram retirados das membranas fetais a fusão palatal foi de 21% e no grupo que a língua foi removida durante o desenvolvimento extra- uterino, a freqüência de fusão palatal aumentou em 61%. Portanto os autores concluíram que as fendas palatinas induzidas pela cortisona houve interferência na rotação das cristas palatinas. 54 Com o objetivo de entender o mecanismo de indução da fenda palatina, crescimento crânio-facial e desenvolvimento palatal, Diewert em 1979 estudou em ratos (Sprague-Dawley) depois de tratamento com 6- aminonicotinamida no 15o dia de gestação. A menor dose teratogênica (8mg/Kg), produziu pequena retrognatismo mandibular no dia 160 dia da gestação com uma pequena fenda no palato secundário. Com a dose média (8mg/Kg) com FASTING, produziu retrognatismo mandibular mais severo e resultou em 37% de fendas palatinas completas e 63% de fendas palatinas parciais. E por fim, com a maior dose teratogênica (16mg/Kg), produziu retrognatismo mandibular severo com 100% de fendas palatinas completas. O autor concluiu que o tratamento com 6- Aminonicotinamida produz anormalidade nas células epiteliais do palato, dos germes dentários e no septo nasal. Os germes dentários dos molares e incisivos eram pequenos e malformados, e as superfícies epiteliais do palato e do tecido mole do septo nasal não se fusionaram. Diewert e Pratt, em 1981, realizaram uma análise morfométrica do desenvolvimento palatal de 2 grupos de fetos de ratos. O primeiro grupo era o controle e, o segundo, proveniente de ratas nas quais foi administrada cortisona do 11o ao 14o dias de gestação. Os fetos do grupo tratado com cortisona tinham dimensões verticais menores na região anterior da cavidade oronasal, cristas palatinas menores e no décimo quinto dia, antes da elevação completa da crista, apresentavam a maxila mais larga que o grupo controle. O potencial de contato entre as cristas 55 palatinas nos fetos com cortisona foi de 4% em relação ao grupo controle. Pode-se concluir que a não elevação das cristas palatinas e a falta de contato extenso entre elas foi o principal fator que causou a fenda nos ratos, e não a falta de fusão das mesmas após o contato, uma vez que o epitélio era semelhante nos dois, e que em um dos fetos tratados com cortisona no décimo sexto dia ocorreu a fusão palatal. Com dúvida de qual tecido é primeiramente afetado por um agente teratogênico, o tecido epitelial ou mesenquimal, Shah, 1986, estudou os aspectos celulares da fendas palatinas induzidas teratogenicamente e correlaciona as anormalidades morfológicas, celulares e bioquímicas. O autor teve como objetivo, estudar três agentes teratogênicos: 1) hadacin, que afeta o desenvolvimento vertical das cristas palatinas e impede sua reorientação; 2) 5-fluorouracil (5-FU), o qual retarda a reorientação e 3) hidrocortisona, que impede a fusão. O hadacin foi injetado antes do aparecimento inicial do palato, porque num momento anterior a droga não é efetiva na formação de fenda palatina. Já a hidrocortisona e o 5-fluorouracil, foram injetados no décimo primeiro dia de gestação quando as cristas palatinas verticais já estariam desenvolvidas. No tratamento com hadacin, mudanças apareceram primeiramente nas células mesenquimais. Em algumas dessas células mesenquimais, 12 horas depois do tratamento, a membrana nuclear estava inchada e 56 acumulada com cromatina o qual foi espalhado por todo o nucleoplasma. Outras células mesenquimais estavam com aparência normal. Dezoito horas depois, estas células mesenquimais mostraram desenvolvimento de lisossomas. O aparecimento de lisossomos nas células mesenquimais é anormal nesta hora. Depois, alterações foram vistas na lâmina basal. Em algumas áreas do espaço da lâmina lúcida estava aumentada, e a lâmina densa estava separada do epitélio. Em outras áreas, a lâmina densa apareceu duplicada ou multiplicada. Entretanto, a lâmina densa sempre esteve contínua. Subseqüentemente, a atividade dos lisossomos foi gradualmente desaparecendo, primeiro do epitélio, e depois das células mesenquimais. A lâmina basal recuperou a sua forma normal. Estas observações indicam que o efeito do hadacin foi observado primeiro no mesenquima, antes do aparecimento das cristas palatinas. Parece que o aparecimento cronologicamente anormal dos lisossomos nas células mesenquimais pode ter afetado na proliferação celular e/ou no comportamento migratório antes da formação das projeções. Conseqüentemente, quando as cristas palatinas desenvolvem-se, o número de células mesenquimais do início do palato eram insuficientes ou sua diferenciação foi afetada. Uma interrupção tão precoce pode afetar a massa crítica de tecido necessária para sustentar o desenvolvimento vertical das projeções. 57 Em contraste com a hadacin, 5-FU retarda a reorientação das cristas palatinas. Logo após o tratamento da 5-FU, mudanças foram vistas primeiramente nas células precursoras MEE das cristas palatinas. Seis horas depois, pela primeira vez, os lisossomos apareceram nas células epiteliais, e depois nas mesenquimais. Com o passar do tempo, a maioria das células epiteliais mostraram atividade dos lisossomos, mas esta atividade é predominante no mesenquima. Dezoito horas depois, as atividades dos lisossomos diminuíram. A lâmina basal perdeu-se ou fragmentou-se. Trinta horas depois, tanto as células epiteliais como as mesenquimais, e a lâmina basal, tornaram-se normais na posição vertical das projeções verticais. Estas observações indicam que os danos nas células epiteliais e mesenquimais foram tão severas que alteraram o padrão de diferenciação. Em comparação com o grupo de animais controle, as cristas palatinas estavam ou horizontais ou fusionadas. A presença de lisossomo depois do tratamento 5-FU tem diferentes implicações que as observadas depois do tratamento de hadacin. Diferentemente do hadacin e 5-FU, a hidrocortisona impede a fusão das cristas palatinas. O efeito inicial da hidrocortisona foi no núcleo das células epiteliais basais do desenvolvimento vertical das projeções e foi caracterizado pelo acúmulo de cromatina e redução de densidade de elétrons no nucleoplasma. Tudo isto seguido por alterações citoplasmáticas caracterizadas por redução de polirribossomos e inchaço de RER e mitocôndria. Estas alterações foram interpretadas como 58 mudanças degenerativas irreversíveis. As mudanças epiteliais basais, foram seguidas por destruição de lâmina basal das projeções verticais. Quando a projeção palatina se torna horizontal, mais células basais mostram-se degeneradas. Com o objetivo de estudar as diferenças entre os gêneros masculino e feminino de embriões de ratos, considerando a velocidade e ritmo da formação do palato durante a prenhez, Watanabe e Endo, em 1989 avaliaram os embriões no 14o dia de v.i.u.. Foi encontrado que o peso corporal médio dos fetos masculinos era maior que os femininos e a formação do palato nos fetos femininos foram encontrados mais adiantados que dos masculinos quando comparados com o peso corporal. Portanto, concluíram que as mães quando expostas à algum agente teratogênico, pode produzir diferenças quanto ao gênero na incidência de defeitos na formação do palato. Haynes (1991) cita que análogos sintéticos biologicamente ativos dos adrenocorticosteróides são substâncias capazes de alterar o padrão de secreção do córtex supra-renal através da inibição de algumas reações de biossíntese. Comenta também que há conceitos de dois tipos de hormônios córtico-supra-renais: os mineralocorticóides, regulando primariamente a homeostasia dos eletrólitos e os glicocorticóides, que são hormônios envolvidos no metabolismo dos carboidratos. Os efeitos dos corticosteróides são numerosos e disseminados. Aparecem como importantes reguladores do metabolismo dos 59 carboidratos, das proteínas e lipídios, do equilíbrio eletrolítico e das funções do sistema cardiovascular, rins, músculos esqueléticos, sistema nervoso e outros órgãos e tecidos. Além disso, os corticosteróides conferem ao organismo a capacidade de resistir a numerosos tipos de estímulos nocivos e a alterações ambientais. Os corticosteróides, como outros hormônios esteróides, participam da síntese das proteínas. Eles reagem com proteínas receptoras no citoplasma das células sensíveis, formando um complexo esteróide- receptor. São observadas duas categorias de efeitos tóxicos no uso terapêutico dos corticósteróides: os resultantes da suspensão do fármaco e os oriundos do uso contínuo de grandes doses. A miopatia, caracterizada por fraqueza da musculatura proximal dos braços e das pernas e dos músculos associados dos ombros e músculos pélvicos, ocorre ocasionalmente em pacientes que recebem grandes doses. Trata- se de uma complicação grave e de uma indicação para a suspensão do tratamento. Os distúrbios comportamentais podem assumir várias formas, incluindo nervosismo, insônia, alterações do humor ou da psique e psicopatias do tipo maníaco-depressiva ou esquizofrênica. Foi relatado a ocorrência de cataratas subcapsulares posteriores em crianças submetidas à terapia com costicosteróides. McCoy e Shirley (1992) descobriram que a administração de testosterona foi mais perniciosa no desenvolvimento e subseqüentemente 60 na função reprodutiva na prole do que a administração da cortisona. Sugere o autor também que as mudanças que ocorrem em respostas ao stress materno ou à administração de hormônio adrenocorticotrópico durante a prenhez, são mais pelo resultado de aumento de testosterona do que aumento de secreção de glicocorticóides. Melby, em 1974, relacionou as indicações clínicas principais e mais comuns de uso dos corticosteróides que são: Na Reumatologia: artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, doença reumática, esclerodermia, vasculites, polimiosite; Na Neurologia: esclerose múlitpla, edema cerebral, miastemia gravis, coréia, convulsão, tumor cerebral ou metastático, neurite; Pneumologia: asma, bronquite, bronquiolite, aspergilose pulmonar, hemossiderose, sacoidose; Alergia – Imunologia: rinite, anafilaxia, urticária, dermatites, edema angioneurótico, reações medicamentosas, picada de insetos; Endocrinologia: insuficiência adrenal, hiperplasia adrenal congênita, crise tireotóxica, tireoidite subaguda, hipoglicemias, hipercalcemias; Hematologia: púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica auto-imune, anemia aplástica, neutropenia auto- imune, trombocitopenia, reações transfusionais; 61 Oncologia: linfomas, leucemias; na Gastroenterologia: retocolite ulcerativa, hepatite crônica, necrose hepática subaguda, hepatite alcoólica; na Infectologia: meningite bacteriana, tuberculose; Nefrologia: síndrome nefrótica, nefrite; Cardiovascular: cardite reumática, miocardite, pericardite, hemagioma, choque hemodinâmico, choque endotóxico, artrite temporal; Dermatologia: eczema, dermatite, neurodermite, pênfigo, alopecia areata, líquem plano, micose fungóide, necrose epidérmica tóxica, psoríase, lúpus discóide, granuloma anular; Oftalmologia: conjuntivite, uveíte, discinesia ocular, endoftalmite, ceratie, úlcera marginal, coroidite, oftalmia, retinite, irite, iridociclite; Otorrinolaringologia: rinite, otite, sinusite, epiglote, laringite, estenose traqueal, polipose; Ortopedia: bursite, sinovite, tendinite, osteartrite, osteartorse, espondilite anquilosante, coccidínea, lumbago, torcicolo, ciática, fascite, exostose, artrite; Transplantes: de rim, fígado, coração, pulmão, medula óssea e outros; Ginecologia – Obstetrícia: prevenção da síndrome de angústia respiratória. 62 Bittencourt e Bolognese, em 2000, estudaram o mecanismo normal e anormal da formação do palato em ratos da linhagem Wistar. Os embriões e fetos dos grupos controle e experimental foram avaliados macroscopicamente e através da microscopia ótica, eletrônica de varredura e de transmissão. Foi também estabelecida uma correlação entre a incidência de fenda palatina e o sexo do embrião. No grupo controle, antes de assumirem a posição horizontal, as cristas palatinas se apresentavam cobertas por epitélio com várias camadas de células cubóides, especialmente na crista medial, que aparecia separado do mesênquima subjacente por uma lâmina basal contínua. À medida que as cristas cresciam em direção à linha média, o epitélio mais fino e a crista medial passaram a ser coberta por apenas uma camada de células, a qual se uniu com sua contraparte anatômica por meio de desmossomos. Não foi verificada nenhuma evidência de morte ou transformação das células epiteliais. No grupo experimental, houve um retardo na mudança de posição das cristas para a direção horizontal, as quais apareciam cobertas por uma fina camada de células epiteliais, separadas do mesênquima subjacente por uma membrana basal descontínua. As cristas horizontais não entraram em contato uma com a outra e as células epiteliais da crista medial sofreram estratificação e queratinização. A fenda palatina induzida experimentalmente ocorreu em todos os fetos, machos e fêmeas, obtendo-se uma incidência de 100%. Deste modo, tornou-se impossível 63 evidenciar qualquer tipo de imunidade conferida pelo sexo na determinação desta malformação congênita. 64 2.2 AGENTES ANTI-TERATOGÊNICOS Com o propósito de verificar se a Vitamina B6 previne fendas palatinas induzidas pela cortisona em fetos de camundongos SWR/NIH, Yoneda e Pratt, em 1982, administraram 125 mg/kg de acetato de cortisona via subcutânea no décimo primeiro dia de gestação nas fêmeas. Neste grupo foi induzido 68% de fendas palatinas nos fetos formados. No outro grupo a incidência de fenda palatina diminuiu para 26% quando as ratas prenhes receberam água com 100ug/ml de Vitamina B6. Com o objetivo de averiguar a eficiência do uso durante a gravidez do ácido fólico em relação a prevenção de D.T.N., Milunsky et al., em 1989, entrevistaram 23.491 grávidas. As entrevistas foram feitas com questionário sobre dieta alimentar realizada durante o 10 trimestre de gravidez. Os resultados mostraram que prevalência de DTN foi de 3,5% entre as mulheres que nunca usaram suplementação multivitamínica nem antes da concepção nem durante os 3 primeiros meses de gestação. Já no grupo de mulheres que fizeram uso de suplementação multivitamínica incluindo o ácido fólico durante a primeiras 6 semanas de gravidez, a prevalência caiu para 0,9% de DTN. Entretanto, nas mulheres que fizeram uso de suplementação multivitamínica sem a presença do ácido fólico, durante as 6 primeiras semanas de gravidez e mulheres que começaram a fazer uso da suplementação multivitamínica com ácido fólico a partir da 7a semana de 65 gravidez ou mais tarde, a prevalência foi igual das não usuárias de suplementação multivitamínica com (A. F.) nas primeiras 6 semanas de gravidez. Em 1991, Hansen e Grafton estudaram o potencial do (A. F.) em prevenir o aparecimento de defeitos primários do tubo neural induzida teratogenicamente pelo Ácido Valpróico em fetos de ratos. Este estudo foi conduzido de tal maneira que foi testado várias concentrações tanto do (A. F.) como também do Ácido Valpróico Os autores concluíram que o acréscimo de (A. F.): a) não alterou a circulação sanguínea no cordão umbilical; b) não houve diferença significante em relação ao crescimento e desenvolvimento pré-natal e c) não diminuiu as ocorrências de alterações no tubo neural. Com o objetivo de determinar se a ingestão de complemento vitamínico antes da concepção, pode reduzir o incidência da primeira ocorrência dos D.T.N., Czeizel e Dudás (1992) estudaram 4753 mulheres que estavam programando as suas gestações. Elas receberam dois tipos de complementos vitamínicos: grupo 1, Complemento vitamínico (12 vitaminas, incluindo 0,8mg de (A. F.), 4 minerais, e 3 “traces” elementos) e o 2o grupo Trace-elemento complemento (cobre, magnésio, zinco e uma dose bem pequena de vitamina C) diariamente durante pelo menos um mês antes da concepção até a data do segundo mês sem menstruação. 66 Os resultados mostraram que: foram confirmadas as gestações de 2104 mulheres que receberam o complemento vitamínico e 2052 que receberam o trace-element complemento. O número de mal-formações congênitas foram significantemente maior no grupo que recebeu somente o trace-element complemento. Houve seis casos de defeitos do Tubo- Neural no grupo que recebeu o complemento trace-element, comparado com nenhum caso do grupo que recebeu o complemento vitamínico completo. A incidência de fenda labial com ou sem fenda palatina não foi reduzida com o complemento vitamínico pré-concepção. Os autores concluíram que a ingestão de complemento vitamínico pré-concepção reduz a incidência da primeira ocorrência de D.T.N.. Sabe-se que a droga antiepilética (ácido valpróico) está associada com um aumento de incidência de problemas com mal formação do tubo neural, quando é administrada no começo de gravidez. Sato et al. (1995) estudaram a ação do ácido pantotênico na diminuição da indução teratogênica desta droga. Injetaram via subcutânea no 8o dia de gestação de camundongos solução de 5 mL/Kg de ácido valpróico. O ácido pantotênico foi dissolvido em água e injetado intra-peritoneal (10m/Kg). Concluíram que o ácido pantotênico não foi capaz de diminuir a incidência de defeitos de formação do tubo neural quando induzidos pela ação do ácido valpróico. Afirmaram também que a suplementação do ácido pantotênico com folato, durante a gravidez pode determinar uma proteção adicional contra mal formações congênitas induzidas pelo ácido valpróico. 67 Com o objetivo de estudar os efeitos da suplementação multi- vitamínica e do (A. F.) durante a concepção, em relação a recorrência a fenda labial com ou sem fenda palatina, Talarova e Harris (1995) avaliaram 221 grávidas com riscos de ter uma crianças com fenda labial e palatina. O protocolo de suplementação vitamínica incluiu vitaminas (A, B1, B2, B6, C, D3, E, nicotinamida, cálcio pantotênico) e (A. F.) com dose de 10mg/dia, começando 2 meses antes da concepção, continuando até o terceiro mês de gravidez. Este grupo foi comparado com o grupo controle que tinha 1901 mulheres que não receberam nenhuma suplementação vitamínica durante a gravidez e que deram a luz no mesmo período que o grupo teste. No grupo teste que possuía 221, apareceram somente 3 casos de crianças com fendas labiais e palatinas. Dos 3 casos, uma menina teve fenda completa bilateral labial e palatina. Ela era a segunda filha da mãe que tem fenda completa bilateral labial e palatina. Esta mãe tinha tido febre e tomou anti histamínico junto com a suplementação multi- vitamínica. Outra menina, a qual teve fenda labial e palatina unilateral, seu pai tinha fenda labial e palatina bilateral. E no terceiro caso, ocorreu fenda labial unilateral num menino o qual a mãe tinha fenda labial e palatina. Portanto, a freqüência de fenda em recém nascidos foi menor entre as mães que receberam suplementação vitamínica, representando uma diminuição de 65,4%. Quando o grupo teste foi subdivido em sexo, o sexo masculino apresentou grande diferença, ou seja, bem menor 68 quantidade de fenda em relação ao sexo feminino. Agora quando o grupo teste foi dividido em severidade de fenda (unilateral e bilateral), a fenda unilateral mostrou bem menor quantidade. Sendo o ácido valpróico uma droga anticonvulsivante conhecida que causa espinha bífida em humanos, Hansen et al., em 1995 resolveram investigar a habilidade do (A. F.) em diminuir a incidência de defeitos neurais causados pela ação do ácido valpróico. Experimento 1: No 8o dia de gestação, os camundongos foram tratados com ácido folínico dissolvidos em água e aplicado com uma injeção de 4mg/Kg via intraperitoneal. Estas aplicações eram feitas uma hora antes da administração de injeção subctânea de ácido valpróico com dosagem de 600mg/Kg. No 17o dia de gestação os animais eram sacrificados e o conteúdo uterino era examinado. Experimento 2: No 7o dia de gestação, mini bombas osmóticas contendo ácido folínico dissolvidos em água foram implantados subcutâneamente no dorso dos camundongos. A administração do ácido valpróico era feita 12 horas depois da implantação das mini bombas nos 8o dia de gestação. A dose do ácido valpróico era de 500 mg/Kg. Os animais foram sacrificados no 17o dia de gestação e o conteúdo uterino foi examinado. Experimento 3: Os camundongos eram alimentados por comida que continha 12 mg/Kg de (A. F.) antes e durante a gravidez. No 8o dia de 69 gestação, a metade do grupo de camundongos eram tratados com injeções subcutâneas de ácido valpróico com dosagem de 600 mg/Kg. E outra metade do grupo recebia água destilada por injeção subcutânea. Os camundongos eram sacrificados no 12o dia de gestação e o conteúdo uterino era examinado. Os autores concluíram que o ácido valpróico é um agente embriotóxico nos camundongos e nos embriões. A administração do (A. F.) ou uma dieta acrescentada com (A. F.) não altera a embriotoxicidade do anticonvulsivante. Estudos sobre a suplementação de (A. F.) antes e durante a gravidez confirmam a redução da ocorrência de defeitos do D.T.N.. Sabendo disto, Czeizel et al., em 1996, estudaram 30.663 mulheres grávidas em um Hospital Húngaro entre os anos de 1980 e 1991. Neste período estudado, 54,9% das mães tiveram bebês saudáveis cujas as mães receberam altas doses de (A. F.). Naquelas 17.300 mulheres que tiveram filhos com anormalidades congênitas, a média de uso do ácido fólico foi 50,4%. Estes dados mostram que a suplementação de (A. F.) durante a gravidez mostrou significante proteção no aparecimento de problemas cardíacos, D.T.N. e formação de fendas orofaciais. Eskes, em 1998, afirma que quando há uma suplementação de (A. F.) no período pré-concepção, diminui sensivelmente a ocorrência e recorrência de D.T.N. Ele afirma também que a redução da atividade do ciclo do folato metilado parece ser uma hipótese interessante na etiologia 70 dos DTN. O autor chegou à algumas conclusões importantes: a) o Folato não é importante somente no tratamento da anemia megaloblástica, ou seja, o A. F. associado ao Ferro ajuda na recuperação de anemias especialmente na gravidez, pois o Folato é necessário na recuperação funcional celular; b) o Tubo Neural do ser humano se fecha na 4a semana de gravidez, e a maioria dos casos (92%) de casos de D.T.N. tem origem multifatorial. O grupo com síndromes ou múltiplos D.T.N. incluem as aberrações cromossômicas (trissomia 18), mutações genéticas (Síndrome Meckel) e uso de medicações teratogênicas (ácido valproico); c) o (A. F.) é muito importante no metabolismo do carbono; d) o uso de tabletes multivitamínicos com (A. F.) reduz não somente a taxa de ocorrência de D.T.N., mas também a maioria das anomalias congênitas sindrômicas não genéticas. e) o consumo extra de alimentos que contém folato é muito menos efetivo do que realizar um tratamento suplementar com A. F.. O mesmo autor em 1998 comenta sobre a campanha do uso de (A. F.) nos Países Baixos (Netherlands). Esta campanha foi estabelecida depois que o Governo consultou o National Health Council e Nutrition Council. A campanha consistia numa suplementação nutricional diária com o consumo de um tablete de 0,5 mg de (A. F.), desde de 4 semanas antes da concepção até 8 semanas depois, em mulheres que estavam planejando gravidez. O autor salienta ainda que esta suplementação é muito importante, porque a nossa nutrição diária não é ótima e não possui a quantidade mínima necessária de (A. F.), apesar de encontrá-la 71 facilmente em vegetais não cozidos, pães, leite, derivados do leite, batata e frutas. Também argumenta que o (A. F.) sintético (em tabletes) é muito melhor absorvido. Por fim, o autor comenta que existe uma assistência internacional na prevenção de D.T.N. com (A. F.). Nos USA, Irlanda e Inglaterra existem campanhas para enriquecimento da alimentação diária com (A. F.), como também em outros países tais como: Alemanha, Austrália, Canadá, China, Hungria, Nova Zelândia e África do Sul, acontecem outros tipos de campanhas que contém o (A. F.). O autor termina o seu artigo citando o pesquisador Oakley em um editorial publicado em 1993 com o título: “Folic Acid - preventable spina bífida and anencephaly.” no J. Am. Méd., que escreve o seguinte: “Uma das mais notáveis descobertas médicas da última parte do século 20 é o ácido fólico. Uma simples, extremamente acessível vitamina hidrossolúvel, que pode prevenir Spina Bífida e anencephaly. Nós podemos comparar esta descoberta com o surgimento da vacina para Rubéola 30 anos atrás, pela oportunidade da prevenção primária e tão fácil de defeitos neonatais sérios”. Paros e Beck, em 1999, estudaram o efeito do (A. F.) em um grupo de camundongos da raça A/WySn os quais apresentavam fenda labial e palatina espontânea de 25 a 25% com tamanho de ninhada reduzida (aproximadamente seis filhotes). Este estudo foi formado por 3 grupos: 1) controle; 2) administrado 0,9% de NaCl com mini bombas por via osmótica e o grupo 3) (A. F.) em água destilada administrada também 72 com mini bombas por via osmótica. O (A. F.) começou a ser administrado a partir do oitavo dia de gestação, sendo dissolvido 12mg em água. As mini bombas foram implantadas subcutâneamente na região escapular. Os fetos foram removidos no décimo oitavo dia de gravidez e foram examinados com o objetivo de averiguar o número de mortes, freqüência de fenda labial e outras más formações. Os resultados mostraram que o grupo tratado com (A. F.) produziu uma quantidade significante menor de fendas labiais/palatinas (10,2%) em relação ao grupo não tratado (40%) e ao grupo tratado com NaCl (28%). Entre os fetos que apresentaram fenda labial, não houve diferença na proporção de animais com fenda palatina. Em relação ao peso corporal médio dos fetos, não houve diferença estatística entre os grupos, sendo que no grupo 1) o peso corporal médio foi de 9,82 g; no grupo 2) 10,74g e no grupo 3) 10,55g. Hartridge et al., em 1999, revisaram a literatura com o objetivo de descrever a função da suplementação de (A. F.) durante a gravidez e avaliar o potencial em prevenir as anormalidades no desenvolvimento do tubo neural. Os autores recomendam que toda mulher que planeja uma gravidez, deve acrescentar à sua dieta alimentar uma suplementação de (A. F.) com o objetivo de prevenir anomalias no desenvolvimento do tubo neural, particularmente se já existe alguma história de gravidez conturbada. Existem forte evidências que a suplementação com (A. F.), reduz a incidência de fendas palatinas. 73 Sabendo-se que uma grande quantidade de D.T.N. podem ser pr