HELEN CRISTINA FÁVERO LISBOA Fungos endofíticos: prospecção de atividade biocatalítica e aplicação biotecnológica Orientadora: Profa. Dra. Daniela Alonso Bocchini Martins Araraquara 2015 Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia SÚMULA CURRICULAR Helen Cristina Fávero Lisboa _________________________________________________________________ Dados pessoais Endereço profissional Universidade Federal de Mato Grosso, ICEN/CUR/ENFERMAGEM Rodovia Rondonópolis / Guiratinga Km 06 Sagrada Família - Rondonópolis 78.735-901, MT - Brasil Telefone: (66) 3410- 4122 / (66) 3410-4092 Endereço eletrônico E-mail para contato: helcrisiq@yahoo.com.br __________________________________________________________________ Formação acadêmica/titulação 2013 Doutorado em Biotecnologia, conclusão em 06/2015. UNESP / Instituto de Química / Araquara / SP Título: Fungos endofíticos: prospecção de atividade biocatalítica e aplicação biotecnológica Orientador: Profa. Dra. Daniela Alonso Bocchini Martins 2001 - 2003 Mestrado em Biotecnologia, conclusão em 11/2003. UNESP / Instituto de Química / Araraquara / SP Título: Influência das condições de cultivo na produção de pigmento melanina pelo fungo Aspergillus nidulans Orientador: Profa Dra. Sandra Regina Pombeiro Sponchiado 1996 - 2000 Graduação em Farmácia Bioquímica / Análises Clínicas e Toxicológicas, conclusão em 01/2001. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP / FCF / Araraquara / SP mailto:helcrisiq@yahoo.com.br __________________________________________________________________ Atuação profissional 1. Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT __________________________________________________________ Vínculo institucional 2008 - Atual Enquadramento funcional: Professor Adjunto I, Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva 2007 - 2008 Vínculo: Servidor público, Enquadramento funcional: Professor substituto, Carga horária: 40, Regime: Integral 2. Universidade Paulista - UNIP ___________________________________________________________ Vínculo institucional 2005 - 2007 Vínculo: professor assistente, Enquadramento funcional: professor, Regime: Parcial 3. Fundação Educacional de Fernandópolis - FEF ___________________________________________________________ Vínculo institucional 2008 - 2008 Vínculo: Colaborador, Enquadramento funcional: Professor, Carga horária: 20, Regime: Parcial 4. Faculdades Santa Giulia - FASG ___________________________________________________________ Vínculo institucional 2003 - 2004 Vínculo: professor assistente, Enquadramento funcional: professor, Regime: Parcial ___________________________________________________________________ Linhas de pesquisa 1. Enzimologia, Biocatálise, Microbiologia, Objetivos: Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos, com possibilidade futura de aplicação biotecnológica. 2. Epidemiologia de doenças infecciosas e parasitárias Objetivos: Avaliar o perfil epidemiológico de doenças infecciosas e parasitárias _______________________________________________________________ Áreas de atuação 1. Enzimologia 2. Bioquímica 4. Microbiologia ___________________________________________________________________ Projetos 2012 - Atual Isolamento, screening e caracterização de lipases de fungos endofíticos. Projetos de pesquisa 2013 - 2014 Avaliação da adesão vacinal de uma comunidade acadêmica. Projetos de pesquisa 2012 - 2014 Avaliação do uso de medicamentos por gestantes. Projetos de pesquisa 2011 - 2012 Caracterização dos casos de hanseníase no município de Rondonópolis. Projetos de pesquisa 2011 - 2012 Avaliação dos casos de infecção do trato urinário por sondagem vesical de demora em pacientes da unidade de terapia intensiva. Projetos de pesquisa 2011 - 2013 Perfil epidemiológico dos usuários de fitoterápicos e plantas medicinais e avaliação do conhecimento dos profissionais da saúde sobre os riscos e benefícios do uso dos produtos naturais. Projetos de pesquisa 2009 - 2011 Bioprospecção em plantas nativas do Cerrado de Mato Grosso: estudo de proteínas vegetais, metabólitos secundários de fungos endofíticos associados e atividade biocatalítica. Projetos de pesquisa Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa; Angela Regina Araújo; Helder Lopes Teles (Responsável); Cláudio Miguel Costa-Neto; Paulo Teixeira de Sousa Júnior; Vanderlan da Silva Bolzani; Norlene Regina Bueno Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso-FAPEMAT 2008 - 2012 Triagem de atividade biocatalítica em fungos endofíticos do Cerrado de Mato Grosso. Projetos de pesquisa 2008 - 2012 Prospecção de metabólitos secundários bioativos e atividade biocatalítica em fungos endofíticos associados a espécies vegetais nativas do Cerrado de Mato Grosso. Projetos de pesquisa Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa; Angela Regina Araújo; Helder Lopes Teles (Responsável); Cláudio Miguel Costa-Neto; Paulo Teixeira de Sousa Júnior Financiador(es): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso-FAPEMAT, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq 2004 - 2009 Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofiticos do Cerrado e Mata Atlântica de São Paulo. Projetos de pesquisa Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa; Henrique Celso Trevisan (Responsável); João Batista Medeiros; Angela Regina Araújo; Carolina Rabal Biasetto; Dulce Helena Siqueira Silva Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP 2001 - 2003 Influência de condições de cultivo na produção de pigmento tipo-melanina em Aspergillus nidulans. Projetos de pesquisa Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa (Executora); Sandra Regina Pombeiro Sponchiado (Responsável) Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES 1997 - 2000 Estudo do pigmento tipo-melanina no fungo Aspergillus nidulans: avaliação da resistência a condições ambientais adversas. Projetos de pesquisa Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa (Executora); Sandra Regina Pombeiro Sponchiado (Responsável) Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq 2012 - 2013 Bioconferências. Projeto de extensão Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa (Colaboradora); Helder Lopes Teles (Responsável) 2011 - 2011 Orientação a funcionários de UBSs (Unidades Básica de Saúde) de Rondonópolis-MT sobre métodos de limpeza, desinfecção e esterelização do local e materiais utilizados. Projeto de extensão Integrantes: Helen Cristina Fávero Lisboa (Colaboradora); Milene Moreno Ferro; Andréa Regina Spinetti (Responsável) ___________________________________________________________________ Prêmios e títulos 2014 Prêmio de Melhor Trabalho de Iniciação Científica "Professor Severino Meirelles", Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT. “Avaliação da capacidade de lipase de fungo endofítico na biorremediação de solo contaminado com óleo de soja” In: XXII Seminário de Iniciação Científica da UFMT, 2014, Cuiabá. OLIVEIRA NETO, A. P., FERRO, M. M., BARBOSA, D. S., SOUZA, P. O., OLIVEIRA, L. M. P., ASSIS, L. G. R., FONSECA, K. N., GOMES, A. L. S., LISBOA, H. C. F., TELES, H. L. __________________________________________________________________ Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. LISBOA, H. C. F.; BIASETTO, C. R.; MEDEIROS, J. B. de; ARAÚJO, Â. R.; SILVA, D. H. S.; TELES, H. L.; TREVISAN, H. C. Endophytic fungi producing of esterases: evaluation in vitro of the enzymatic activity using pH indicator. Brazilian Journal of Microbiology, v. 44, p. 923-926, 2013. 2. TREVISAN, H. C.; MEDEIROS, J. B. de; LISBOA, H. C. F. Extração de esterase de fígado suíno (PLE). Química Nova, v. 29, p. 865-867, 2006. 3. GONÇALVES, R. C. R.; LISBOA, H. C. F.; POMBEIRO-SPONCHIADO, S. R. Characterization of melanin pigment produced by Aspergillus nidulans. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 28, p.1467-1474, 2012. 4. ALVES, K. L.; SOARES, R. P.; DIAS, L. J. S.; PRATAVIEIRA, T. R. S.; FERRO, M. M.; CORREA, C. R. A.; LISBOA, H. C. F.; GOULART, L. S. Enteroparasitismo e características socioambientais de crianças de uma creche de Mato Grosso. Revista Brasileira de Pesquisa em Saúde, v.15, p. 63-65, 2013. 5. RUPOLO, D. J.; GONÇALVES, K. G.; LISBOA, H. C. F. Infecções do trato urinário associadas ao uso de sonda vesical de demora: prevalência e susceptibilidade microbiana. Revista Eletrônica Gestão & Saúde, v. 5, p. 992-995, 2014. Capítulos de livros publicados 1. LISBOA, H. C. F.; GOULART, L. S. Educação em Saúde para Promoção do Uso Racional de Medicamentos In: Enfermagem na Educação em Saúde. 1 ed.Curitiba: Editora Apris, 2013, v.1, p. 219-246. Trabalhos publicados em anais de eventos (completo) 1. LISBOA, H. C. F., FERRO, M. M., XAVIER, A. A. D. O., TELES, H .L. Caracterização parcial de lipase de fungo endofítico In: XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos; X Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassas, 2013, Foz do Iguaçu. XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos; X Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassas, 2013. 2. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Prospecção de atividades lipase e esterase em fungos endofíticos pelo método da adrenalina. In: XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2007, Curitiba. XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2007. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. OLIVEIRA NETO, A. P., FERRO, M. M., BARBOSA, D. S., SOUZA, P. O., OLIVEIRA, L. M. P., ASSIS, L. G. R., FONSECA, K. N., GOMES, A. L. S., LISBOA, H. C. F., TELES, H.L.,. Avaliação da capacidade de lipase de fungo endofítico na biorremediação de solo contaminado com óleo de soja In: XXII SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UFMT, 2014, Cuiabá. XXII Seminário de Iniciação Científica da UFMT, 2014. 2. GOULART, L. S., RAMON, J. L., LISBOA, H. C. F. Suscetibilidade a antifúngicos e atividade de fosfolipase em C. albicans isoladas de infecção e colonização vulvovaginal In: 27o Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2013, Natal. 27o Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2013. 3. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., TELES, H. L., ARAÚJO, A. R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H. C. Avaliação da atividade nitrilase em fungos endofíticos In: 31a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. 31a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008. 4. BIASETTO, C. R., LISBOA, H. C. F., MEDEIROS, J. M.,TELES, H. L., ARAÚJO, A. R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H. C., MARCHETTO, R. Screening of Baeyer- Villiger Monooxygenase Biocatalitic Activity in Endophytic Fungi In: 37a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2008, Águas de Lindóia. 37a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), 2008. 5. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., ARAÚJO, A. R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H. C. Avaliação da atividade esterase em fungos endofiticos In: 30a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007, Água de Lindóia. 30a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007. 6. BIASETTO, C. R., LISBOA, H. C. F., MEDEIROS, J. M., SILVA, D. H. S., ARAÚJO, A. R., Trevisan, H. C. Prospecção de atividade esterase em fungos endofiticos com indicador de pH In: 30a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007, Águas de Lindóia. 30a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007. 7. TOLEDO, P. R. A. B., LISBOA, H. C. F., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Prospecção de atividade antimicrobiana e biocatalitica em fungos endofiticos In: 29a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Águas de Lindóia. 29a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006. 8. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. Influência das fontes de carbono, nitrogênio, pH e temperatura no crescimento e produção de pigmento tipo-melanina no fungo Aspergillus nidulans. In: XII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2000, São José do Rio Preto. XII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2000. 9. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. Influência do pigmento tipo-melanina na viabilidade dos esporos do fungo Aspergillus nidulans In: XII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 1999, Botucatu. XII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 1999. 10. LISBOA, H. C. F., PAHOR, Giuliana, SPONCHIADO, SPONCHIADO, S. R. P. Estudo do pigmento tipo-melanina no fungo Aspegillus nidulans In: IX Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 1997, Jaboticabal. IX Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 1997. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido) 1. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. The effect of pH and temperature on the malanin-like pigment production by Aspergilus nidulans In: XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2003, Caxambu. XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular., 2003. Apresentação de trabalho e palestra 1. LISBOA, H. C. F., XAVIER, A. A. D. O., FERRO, M. M., TELES, H. L. Caracterização parcial de lipase de fungo endofítico, 2013. (Simpósio, Apresentação de Trabalho) 2. BRITTES, A. F. N., CORREA, C. R. A., SOUSA, E. T. P., LISBOA, H. C. F., ASSUNCAO, K. W. C., GOULART, L. S., FERRO, M. M., SOARES, R. P. Prevenção e Detecção de Enteroparasitoses em crianças que frequentam creches públicas no município de Rondonópolis, 2011. (Seminário, Apresentação de Trabalho) 3. LISBOA, H. C. F, RUPOLO, D. J. Triagem de atividade biocatalítica em fungos endofíticos de espécies do cerrado de Mato Grosso, 2011. (Seminário, Apresentação de Trabalho) 4. LEMOS, V .L. J., SILVA, J. M., PALMEIRA, S. M., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F. Avaliação de atividade epóxido-hidrolase em fungos endofíticos associados às folhas e sementes de Ingá, 2010. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 5. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., SILVA, J .M., LEMOS, V .L. J., TELES, H. L., ARAÚJO, A .R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H .C. Fungos endofíticos produtores de esterases: avaliação in vitro da atividade enzimática utilizando indicador de pH, 2010. (Outra, Apresentação de Trabalho) 6. BUENO, N. R., CARDOSO, P., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F., CAMPOS, É. P. de. Investigação de Proteínas de Angico (Anadenanthera Peregrina) e Inga (Inga edulis Mart.) de um Fragmento do Cerrado de Rondonópolis-MT, 2010. (Simpósio, Apresentação de Trabalho) 7. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., SILVA, J. M., LEMOS, V. L. J., TELES, H. L., ARAÚJO, A. R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H. C. Perfil biocatalítico de fungos endofíticos de espécies vegetais do Cerrado e Mata Atlântica, 2010. (Outra, Apresentação de Trabalho) 8. RUPOLO, D. J., PAZ, K. M. R., SILVA, J. M., LEMOS, V. L. J., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F. Perfil da Produção Enzimática por Fungos Endofíticos de Espécies Vegetais do Cerrada, 2010. (Outra, Apresentação de Trabalho) 9. PAZ, K. M. R., RUPOLO, D. J., SILVA, J. M., LEMOS, V. L. J., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F Prospecção de Atividades Liapase/Esterase em Fungos Endofíticos de Folhas e Sementes de Inga edulis e Inga laurina, 2010. (Outra, Apresentação de Trabalho) 10. PAZ, K. M. R., RUPOLO, D. J., LEMOS, V. L. J., SILVA, J. M., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F. Prospecção de atividades lipase/esterase em fungos endofíticos de folhas e sementes de Ingá edulis e Ingá laurina, 2010. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 11. PAZ, K. M. R., RUPOLO, D.J., LISBOA, H. C. F. Avaliação do uso de medicamentos em Idosos, 2009. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 12. LISBOA, H. C. F. Seminários Avançados em Construção do Conhecimento em Enfermagem, 2009. (Palestra) 13. NÓBREGA, P. M. F., TELES, H. L., LISBOA, H. C. F, BUENO, N. R., LEMOS, V. L. J., SILVA, J. M., ÉRICA, P. C., PALMEIRA, S. M. Triagem da atividade antibacteriana de extratos de fungos endofíticos isolados de Ingá edulis Mart., 2009. (Simpósio, Apresentação de Trabalho) 14. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., TELES, H. L., SILVA, D. H. S., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Avaliação da atividade nitrilase em fungos endofíticos, 2008. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 15. LISBOA, H. C. F. Biotecnologia - Avanços e Aplicações, 2008. (Palestra) 17. LISBOA, H. C. F. Uso racional de antibióticos, 2008. (Palestra) 18. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., ARAÚJO, A. R., SILVA, D. H. S., TREVISAN, H. C. Avaliação da atividade esterase em fungos endofíticos, 2007. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 19. MEDEIROS, J. M., BIASETTO, C. R., LISBOA, H. C. F., TREVISAN, H. C. Imobilização de esterase de fígado suíno em sílica e caracterização do imobilizado, 2007. (Outra, Apresentação de Trabalho) 20. BIASETTO, C. R., LISBOA, H. C. F., MEDEIROS, J. M., SILVA, D. H. S., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Prospecção de atividade esterase em fungos endofíticos com indicador de pH, 2007. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 21. LISBOA, H. C. F., BIASETTO, C. R., MEDEIROS, J. M., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Prospecção de atividade Lipase e esterase em fungos endofíticos pelo método da adrenalina, 2007. (Simpósio, Apresentação de Trabalho) 22. TOLEDO, P. R. A .B., LISBOA, H. C. F., ARAÚJO, A. R., TREVISAN, H. C. Prospecção de atividade antimicrobiana e biocatalítica em fungos endofíticos, 2006. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 23. CAVALLIERI, A. A., LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. Evaluation of Tyrosinase Activity in Highly Melanized Strain of Aspergillus nidulans, 2005. (Comunicação, Apresentação de Trabalho) 24. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. The effect of pH and temperature on the melanin-like pigment production by Aspergillus nidulans, 2003. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 25. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. A influência de fontes de carbono e nitrogênio na produção de pigmento tipo-melanina, 2000. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 26. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. A influência do pigmento melanina na viabilidade dos esporos do fungo Aspergillus nidulans, 1999. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 27. LISBOA, H. C. F., SPONCHIADO, S. R. P. Estudo do pigmento melanina no fungo Aspergillus nidulans, 1997. (Congresso, Apresentação de Trabalho) Produção técnica Demais produções técnicas 1. LISBOA, H. C. F. Introdução à Farmacologia, 2010. (Curso de curta duração ministrado) 3. LISBOA, H. C. F., PAZ, K. M. R. Práticas de Microbiologia para Ciência da Saúde, 2009. (Desenvolvimento de material didático ou instrucional) 4. LISBOA, H. C. F., SIMONINI, G. M., MALAVAZI, I., NOZAKI, P. N. Métodos Cirúrgicos de Contracepção, 1998. (Desenvolvimento de material didático ou instrucional) Orientações e supervisões concluídas Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. LOURENÇO RIBEIRO DA CRUZ NETO. Caracterização dos casos de hanseníase no município de Rondonópolis. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 2. TONY JOSÉ DE SOUZA. Caracterização dos casos de hanseníase no municipio de rondonópolis. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 3. PATRÍCIA STOCCO. Avaliacão do uso de produtos naturais na prática do profissional de saúde. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 4. VANESSA A. MENDES. Avaliacão do uso de produtos naturais na prática do profissional de saúde. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 5. ANA CAROLINE DE LARA. Avaliação do consumo de produtos naturais por usuários das estratégias de saúde da família do município de Rondonópolis – MT. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 6. CRISTIANE MELO DE OLIVEIRA. Avaliação do consumo de produtos naturais por usuários das estratégias de saúde da família do município de Rondonópolis – MT. 2012. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 7. KARINA GONDOLO GONÇALVES. Avaliação dos casos de infecção do trato urinário por sondagem vesical de demora em pacientes da unidade de terapia intensiva. 2010. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 8. DENIZE JUSSARA RUPOLO. Avaliação dos casos de infecção do trato urinário por sondagem vesical de demora em pacientes da unidade de terapia intensiva. 2010. Curso (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso Orientação de iniciação científica 1. LUIZ GUILHERME REGADOS DE ASSIS. Isolamento, Screening e Caracterização de lipases de Fungos Endofíticos. 2014. Iniciação científica (Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Mato Grosso 2. KAUAN NUNES FONSECA. Isolamento, Screening e Caracterização de lipases de Fungos Endofíticos. 2014. Iniciação científica (Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Mato Grosso 3. PATRÍCIA DE OLIVEIRA SOUZA. Isolamento, Screening e Caracterização de lipases de Fungos Endofíticos. 2014. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 4. AUREA MIRANDA DO NASCIMENTO. Avaliação do Uso de Medicamentos por Gestantes. 2013. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 5. RITIELLY EDUARDA LOPES MENDONÇA GONÇALVES. Avaliação do Uso de Medicamentos por Gestantes. 2013. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 6. ADÃO PEREIRA DE OLIVEIRA NETO. Isolamento, Screening e Caracterização de lipases de Fungos Endofíticos. 2013. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 7. AMANDA DE OLIVEIRA DELFINO. Avaliação da adesão vacinal de uma comunidade acadêmica. 2014. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 8. DELMA RIANE REBOUÇAS Batista. Avaliação da adesão vacinal de uma comunidade acadêmica. 2014. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 9. ANA AURÉLIA DIAS DE OLIVEIRA XAVIER. Triagem de atividade biocatalítica em fungos endofíticos de espécies do cerrado de Mato Grosso. 2010. Iniciação científica (Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Mato Grosso 10. VIVIA LUCIA JUVINO DE LEMOS. Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos do Cerrado de Mato Grosso. 2011. Iniciação científica (Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Mato Grosso 11. DENIZE JUSSARA RUPOLO. Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos do Cerrado de Mato Grosso. 2011. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 12. KÉSIA MARISLA RODRIGUES DA PAZ. Triagem de Atividade Biocatalítica em Fungos Endofíticos de Espécies do Cerrado de Mato Grosso. 2009. Iniciação científica (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 13. JAILTON MARQUES DA SILVA. Triagem de Atividade Biocatalítica em Fungos Endofíticos de Espécies do Cerrado de Mato Grosso. 2008. Iniciação científica (Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Mato Grosso 14. CAROLINA RABAL BIASETTO. Prospecção de Atividade Biocatalítica e Antimicrobiana em Fungos Endofíticos. 2008. Iniciação científica (Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Co-orientação) 15. PAULO ROBERTO APARECIDO BUENO DE TOLEDO. Prospecção de Atividade Biocatalítica e Antimicrobiana em Fungos endofíticos. 2006. Iniciação científica (Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Co- orientação) Orientação de outra natureza 1. CAIO VINÍCIUS SBALCHIERO SILVA. Monitoria Bioquímica. 2012. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 2. DOANE KALLY MARTINS LEITE. Monitoria Bioquímica. 2012. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 3. ELIZETE PAULA DE MELO. Monitoria Microbiologia / Imunologia. 2012. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 4. AUREA MIRANDA DO NASCIMENTO. Monitoria Microbiologia / Imunologia. 2012 (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 5. KATIELLE WEBER CAVALCANTE Assunçao. Monitoria em Microbiologia Humana. 2011. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 6. VANESSA ALVES MENDES. Monitoria em Microbiologia. 2011. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 7. SUELEN CRISTINA DE SOUZA CARVALHO. Bolsista Permanência. 2010. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 8. ENIKEM TCHELLES PEREIRA SOUSA. Bolsista Permanência. 2010. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 9. ANA CAROLINE DE LARA. Bolsista permanência. 2010. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 10. BRUNA CRISTINA DA SILVA SANTOS. Monitoria de Microbiologia Humana. 2010. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 11. ANA CAROLINA BRITO MATOS. Monitoria Imunologia Humana. 2008. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 12. DENIZE JUSSARA RUPOLO. Monitoria Imunologia Humana. 2008. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 13. VINICIUS DE MELLO BERGAMO. Monitoria Microbiologia Humana. 2008. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso 14. KÉSIA MARISLA RODRIGUES DA PAZ. Monitoria Microbiologia Humana. 2008. (Enfermagem) - Universidade Federal de Mato Grosso Eventos Participação em eventos 1. Apresentação de Poster / Painel no(a) XIX Simpósio Nacional de Bioprocessos; X Simpósio de Hidrólise Enzimática de Biomassas, 2013. Caracterização parcial de lipases de fungo endofítico. 3. Apresentação de Poster / Painel no(a) 31 Reunião da Sociedade Brasileira de Química, 2008. Avaliação da atividade nitrilase em fungos endofíticos. 4. Conferencista no(a) XV Semana de Biologia, 2008. Biotecnologia: avanços e aplicações. 5. Conferencista no evento Estudos Avançados em Enfermagem, 2008. Uso Racional de Antimicrobianos. 6. Apresentação de Poster / Painel no(a) 30 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2007. Avaliação da etividade esterase em fungos endofíticos. 7. Apresentação de Poster / Painel no(a) XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, 2007. Prospecção de Atividades Lipase e Esterase em Fungos Endofíticos pelo Método da Adrenalina. 8. Conferencista na Jornada Farmacêutica da Universidade Paulista - UNIP, 2006. O papel do farmacêutico nas análises clínicas. 9. Apresentação de Poster / Painel no(a) XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2003. The effect of pH and temperature on the melanin-like pigment production by Aspergillus nidulans. 10. 49 Jornada Farmacêutica da Unesp, 2002. 11. Apresentação de Poster / Painel no(a) XII Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2000. Influência de fontes de carbono e nitrogênio na produção de pigmento tipo-melanina no fungo Aspergillus nidulans. 12. Apresentação de Poster / Painel no(a) XI Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 1999. Influência do pigmento tipo-melanina na viabilidade dos esporos do fungo Aspergillus nidulans. 13. 46ª JornadaFarmacêutica da UNESP, 1999. 14. Simpósio de Lei dos Medicamentos Genéricos, 1999. 15. 45 Jornada Farmacêutica da Unesp e Seminários em Toxicologia, 1998. 16. IV Mesa Redonda de Ex-Alunos, 1998. 17. Apresentação de Poster / Painel no(a) IX Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 1997. Estudo do pigmento melanina no fungo Aspergillus nidulans. 18. XX Encontro Nacional dos Estudantes de Farmácia, IV Congresso Brasileiro dos Estudantes de Farmácia, 1997. Bancas Participação em banca de trabalhos de conclusão Graduação 1. MEDEIROS, R. M. K., LISBOA, H. C. F., GIMENES, L. C. V., MENDES, V. A. Participação em banca de Ritielly Eduarda Lopes Mendonça Gonçalves. Avaliação do uso de medicamentos por gestantes, 2014. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 2. MEDEIROS, R. M. K., LISBOA, H. C. F., GIMENES, L. C. V., MENDES, V. A. Participação em banca de Aurea Miranda do Nascimento. Avaliação do uso de medicamentos por gestantes, 2014. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 3. GOULART, L. S., LISBOA, H. C. F., VERONESI, C. L. Participação em banca de Jeany Keila Dota. Frequência e atividade de fosfolipase em isolados vaginais de Candida spp, 2013. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 4. GOULART, L. S., LISBOA, H. C. F., VERONESI, C. L. Participação em banca de Alessandro Silva Macedo. Frequencia e atividade de fosfolipase em isolados vaginais de Candida spp, 2013. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 5. FLORIANO, L. A., MEDEIROS, R. M. K., LISBOA, H. C. F. Participação em banca de Késia Marisla Rodrigues da Paz. Acidentes com materiais perfurocortantes: percepção da equipe de enfermagem, 2011. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 6. FLORIANO, L. A., MEDEIROS, R. M. K., LISBOA, H. C. F. Participação em banca de Valdeci Silva Mendes. Acidentes com materiais perfurocortantes: percepção da equipe de enfermagem, 2011. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 7. LETICIA, S. G., LISBOA, H. C. F., FAVRETTO, D.O. Participação em banca de Karine Lopes Alves. Enteroparasitismo em crianças matriculadas na escola municipal de educação infantil Rubens Alves de Souza, Rondonópolis, MT, 2011. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 8. LETICIA, S. G., FAVRETTO, D.O., LISBOA, H. C. F. Participação em banca de Roseli Pereira Soares. Enteroparasitismo em crianças matriculadas na escola municipal de educação infantil Rubens Alves de Souza, Rondonópolis, MT, 2011. (Enfermagem) Universidade Federal de Mato Grosso 9. REGIS, D. L. S., GUIMARÃES, S. L., LISBOA, H. C. F. Participação em banca de Daiane Laura Souza Régis. Seleção preliminar de estirpes de Azospirillum spp para inoculação em arroz de Terras Altas, 2011. (Engenharia Agrícola e Ambiental) Universidade Federal de Mato Grosso. Participação em banca de comissões julgadoras Concurso público 1. Membro titular do teste seletivo para contratação de professor substituto do curso de Zootecnia do Campus de Rondonópolis na área de química geral, química orgânica e química analítica, 2012. Universidade Federal de Mato Grosso 2. Membro titular do teste seletivo para contratação de professor substituto do curso de Zootecnia do Campus de Rondonópolis na área de química geral, química orgânica e química analítica, 2012. Universidade Federal de Mato Grosso 3. Membro Titular da Comissão de Seleção de Professor Substituto para o Curso de Enfermagem, 2011. Universidade Federal de Mato Grosso 4. Membro suplente da comissão de seleção para professor substituto, na área de conhecimento em práticas do cuidar, I, II e III do curso de Enfermagem - ICEN/CUR/UFMT, 2008. Universidade Federal de Mato Grosso 5. Membro suplente do teste seletivo para contratação de professor substituto na área de Libras - Linguagem Brasileira de Sinais, 2008. Universidade Federal de Mato Grosso 6. Membro titular de comissão do curso de enfermagem para realização do processo de preenchimento de vagas por tranferência e matrícula de portadores de diploma de curso superior, 2008. Universidade Federal de Mato Grosso 7. Membro titular do teste seletivo para contratação de professor substituto de Química Geral e Orgânica, 2008. Universidade Federal de Mato Grosso 8. Membro titular do teste seletivo para contratação de professor substituto de Parasitologia Humana, Citologia e Histologia, Genética, Fisiologia Humana, Anatomia Humana, Embriologia, Processos Patológicos, 2008. Universidade Federal de Mato Grosso 9. Membro titular de comissão do curso de enfermagem para realização do processo de preenchimento de vagas por tranferência e matrícula de portadores de diploma de curso superior, 2007. Universidade Federal de Mato Grosso DEDICATÓRIA À DEUS, Senhor de minha vida. “Tudo posso n’ Aquele que me fortalece (Fil 4,13) Ã MINHA FAMÍLIA, Meu amado esposo Helder, meu braço forte. Se esse dia chegou, foi porque fui pacientemente trazida até aqui pelos seus braços. Sua confiança em mim me fez crescer, e me tornou forte para seguir em frente. Obrigada pelo amor, carinho, paciência e por estar ao meu lado em todos os momentos. À minha preciosa filha Giovana, o milagre de sua vida me fez entender que nada material vale a pena, sem o sagrado dom a vida. Me faz compreender que a beleza do amor de mãe procede do coração de Deus: Amor sem limites. Amo vocês!! “Obrigada meu Deus por esse presente tão especial, obrigada por essa família tão linda e abençoada”. AO QUERIDO ORIENTADOR E AMIGO, “IN MEMORIAM”, PROF. DR. HENRIQUE CELSO TREVISAN, Agradeço a Deus pela oportunidade de ter sido sua orientada. Exemplo de sabedoria, conhecimento, profissionalismo, aliado ao respeito, amizade e humildade. Eis aqui o fruto da semente que você plantou ainda em vida: a minha tese. AGRADECIMENTOS De maneira especial agradeço aos meus pais: Paulo e Lourdes, e irmãos: Naira, Glauce e Fernando, pelo incentivo de sempre, carinho, amor, orações em tantos momentos... Vocês são realmente uma grande benção em minha vida. Amo vocês! À família de meu esposo, aos que torceram pelo bom êxito desse trabalho. Obrigada! A Profa. Dra. Daniela Alonso Bocchini Martins, não tenho palavras para agradecer o que fizera por mim. Serei eternamente grata por ter me dado a oportunidade de finalizar esse trabalho, obrigada pela confiança. Muito, muito obrigada! Ao Prof. Dr. Helder Lopes Teles (UFMT), um formal agradecimento pela contribuição e valiosa co-orientação. Sua participação efetiva foi indispensável para que eu chegasse ao fim desse trabalho. Obrigada pelo apoio, confiança e incansável dedicação no decorrer desses anos. Querido, muito obrigada . Ao Prof. Dr. Domingos Sávio Barbosa (UFMT), pela atenção, amizade, pela fundamental contribuição e co-orientação nesse trabalho. Sua ajuda foi essencial para a finalização dessa tese. Muito obrigada. Ao Prof. Dr. Rubens Monti (UNESP/FCF), por alguns poucos meses de orientação formal na ausência do Prof. Henrique. Agradeço porque mesmo indiretamente, sempre esteve presente com valiosas contribuições nesse trabalho e pela pronta disposição em sempre me ajudar. Obrigada pela confiança e incentivo. Obrigada por tudo. À Profa. Dra. Roberta da Silva Bussamara Rodrigues (UERGS) pelas importantes contribuições no desenvolvimento dessa tese. Muito obrigada. À Profa. Dra. Dra. Angela Regina Araújo (UNESP/IQ), sempre disposta a ajudar... Seu apoio foi essencial para a continuidade desse trabalho. Muito obrigada. À Profa. Dra. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli (UNICAMP), pelo acolhimento no laboratório, pelo fornecimento das sondas fluorescentes utilizadas nesse trabalho e pela valiosa contribuição. Obrigada. A amiga Carolina Rabal Biasetto, pela amizade, cumplicidade, incentivo e pela ajuda de sempre. Amiga e irmã do coração desde quando trabalhamos juntas com o Prof. Henrique. Obrigada por tudo! Á amiga Milene Moreno Ferro Hein (Técnica/UFMT), pela valiosa ajuda em todos os momentos, pela amizade, e por contribuir de maneira tão preciosa nesse trabalho. Muito obrigada! A minha querida amiga e “mãezinha” Maria de Fátima Marcos Camacho (Técnica – IQ/UNESP), pelo carinho e incentivo. Muito obrigada! Aos amigos da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) onde trabalho, aos que sempre me incentivaram a finalizar essa tese. Aos amigos do curso de Enfermagem onde sou lotada, e aos demais departamentos onde tenho grandes amigos que hoje considero minha família em Rondonópolis\MT.Um agradecimento especial à Profa. Dra Letícia Silveira Goulart e Profa. Doutoranda Michele Salles. Obrigada pela amizade e incentivo. A todos meus queridos alunos de iniciação científica (UFMT) que muito me ensinaram, me fizeram crescer como professora, como pesquisadora. Obrigada pela confiança e contribuição. À todos da Seção Técnica de pós, e da Biblioteca pela prestatividade, atenção e cordialidade em todas as situações. Obrigada. À CAPES pela bolsa concedida. A FAPESP pelo apoio financeiro. Foram muitas as pessoas que participaram desse trabalho de alguma forma. Professores de diferentes universidades, alunos e técnicos. Estaria sendo injusta citar nomes, pois poderia entre tantos, esquecer de alguns deles. Então, agradeço carinhosamente a todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho e construíram uma parte desse “quebra-cabeça” que se uniu para transformar um sonho em realidade, para se transformar nessa tese. “Para tudo há um tempo, para cada coisa há um momento debaixo dos céus: tempo para nascer, e tempo para morrer; tempo para plantar, e tempo para arrancar o que foi plantado; tempo para matar, e tempo para curar; tempo para destruir, e tempo para construir; Tempo para chorar, e tempo para rir; tempo para lamentar, e tempo para dançar; tempo para espalhar pedras, e tempo para ajuntá-las; tempo para abraçar, e tempo para apartar-se. tempo para procurar, e tempo para perder; tempo para guardar, e tempo para jogar fora; tempo para rasgar, e tempo para costurar; tempo para calar, e tempo para falar; Tempo para amar, e tempo para odiar; tempo para a guerra, e tempo para a paz. Eu disse no meu coração: Deus julgará o justo e o ímpio; porque há um tempo para todo o propósito e para toda a obra”. (Eclesiastes 3,1-8,17) http://www.bibliaonline.com.br/acf/ec/3/1-22 RESUMO Os fungos endofíticos são micro-organismos que vivem nos espaços intercelulares das plantas e são reconhecidos por seu potencial na produção de importantes produtos de interesse biotecnológico, tal como as enzimas. Estas vem sendo amplamente utilizadas nos setor industrial pois catalisam reações com maior especificidade que as formas convencionais de reações químicas, fazendo assim dos fungos endofíticos uma alternativa promissora na produção desses biocatalisadores. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a prospecção de enzimas de interesse biotecnológico como lipase, esterase, epóxido-hidrolase, nitrilase, acilase, protease e amidase em fungos endofíticos e a avaliação da sua aplicação biotecnológica, com enfoque na utilização do extrato bruto contendo lipase em processos de biorremediação e transesterificação. Setenta e cinco fungos endofíticos foram submetidos à prospecção de atividade biocatalítica, onde 66 apresentaram atividade lipases/ esterases, 16 epóxido hidrolase, 24 acilases, 50 proteases, 10 nitrilase e 64 amidase. Foram encontrados fungos com satisfatória atividade biocatalítica frente a diferentes metodologias e substratos, mostrando a grande versatilidade dos endófitos na produção de enzimas. O fungo Mycosphaerella coacervata foi selecionado para avaliação da atividade e caracterização parcial da lipase extracelular em extrato bruto. O micro-organismo apresentou produção máxima da enzima quando cultivado por 48 horas a 28oC (486 U/L), e se manteve estável até 6 meses estocada a – 2oC. O extrato bruto contendo a enzima apresentou atividade máxima a 37oC em pH 8,0. A estabilidade térmica foi observada na faixa de 30 a 60oC (atividade residual acima de 80%) e sua estabilidade ao pH entre 6,0 e 9,0.(atividade residual superior a 80%). A enzima se manteve estável (atividade residual acima de 90%) na presença de acetona, metanol, etanol, isopropanol e hexano nas concentrações de 20 e 50%. Foi observada uma boa estabilidade também em relação a diferentes sais e detergentes, mantendo uma atividade residual acima de 80% em BaCl2, CaCl2, MgCl2, KCl e EDTA. No entanto, em Tween 80 a atividade reduziu em torno 80% e em SDS 90%. A enzima mostrou significativa preferência pelo substrato de cadeia longa palmitato de p-nitrofenila (C16), não apresentando atividade mediante ao substrato de cadeia curta acetato de p-nitrofenila (C2). A lipase produzida por M. coacervata apresentou promissora capacidade de aplicação em processos de biorremediação de solo contaminado com óleo de soja (até 10%). Quando aplicada em solo contaminado, ocorreu a redução da fitotoxicidade mediante ao aumento de 95% na germinação das sementes de Lactuca sativa, equiparando-se ao controle. A lipase estudada também foi capaz de promover, ainda que com baixo rendimento (2,70%), a transesterificação metílica do óleo de soja, mostrando dessa forma que a enzima produzida por este endófito é promissora para a aplicação em processos de biorremediação de ambientes contaminados com óleo de soja e na transesterificação visando a produção de biocombustíveis. Palavras-chave: fungos endofíticos, enzimas, lipases, transesterificação, biorremediação ABSTRACT The endophytic fungi are microorganisms that live in the intercellular spaces of plants and are known for their potential for the production of important products of biotechnological interest, such as enzymes. These have been widely used in industry because they catalyze reactions with greater specificity than conventional forms of chemical reactions, thereby making the endophytic fungus a promising alternative to produce these biocatalysts. Thus, this study aimed to prospect for enzymes of biotechnological interest as lipase, esterase, epoxide hydrolase, nitrilase, acylase, amidase and protease in endophytic fungi and evaluate their biotechnological applications, focusing on the use of the crude extract containing lipase in the transesterification process and bioremediation. Seventy five endophytic fungi were submitted to prospecting biocatalytic activity, where 66 showed lipase / esterase activity, 16 epoxide hydrolase, 24 acylases, 50 proteases, 10 nitrilase and 64 amidase. Fungi with satisfactory biocatalytic activity against different methodologies and substrates were found, showing the versatility of endophytes in the production of enzymes. The fungi Mycosphaerella coacervata was selected to evaluate the activity and partial characterization of extracellular lipase crude extract. The microorganism showed maximum enzyme production when grown for 48 hours at 28°C (486 U / L), and remained stable up to 6 months stored at -2°C. The crude extract containing the enzyme showed maximum activity at 37°C at pH 8.0. The thermal stability was observed in the range of 30 to 60°C (residual activity above 80%) and its stability at the pH between 6.0 and 9.0 (residual activity exceeding 80%). The enzyme was stable (residual activity above 90%) in the presence of acetone, methanol, ethanol, isopropanol and hexane at concentrations of 20 and 50%. Good stability was observed also in relation to different salts and detergents, maintaining a residual activity higher than 80% by BaCl2, CaCl2, MgCl2, KCl and EDTA. However, in Tween 80 activity was reduced in about 80% and 90% SDS. The enzyme showed significant preference for long palmitate chain substrate p-nitrophenyl (C16), showing significant no activity with the short chain substrate p-nitrophenyl acetate (C2). The lipase produced by M. coacervata showed promising application capacity in bioremediation processes on soil contaminated with soybean oil (up to 10%). When applied to contaminated soil, the phytotoxicity was reduced, which caused a 95% increase in germination of seeds Lactuca sativa, which can be compared to the control. The studied lipase was also able to promote, albeit with low efficiency (2.70%), the methyl transesterification of soybean oil, thus showing that the enzyme produced by this endophyte is promising for application to bioremediation environments contaminated with soybean oil and transesterification in order to produce biofuels. Keywords: endophytic fungi, enzymes, lipases, transesterification, bioremediation A Absorbância ACN Acetonitrila AQA Araraquara BDA Batata Dextrose Ágar BDC Batata Dextrose Caldo BSA Soro Albumina Bovino Butironit. Butironitrila CCDC Cromatrografia em Camada Delgada Comparativa CEANC Central Analítica de Combustíveis CG Cromatrografia Gasosa CR Capacidade de retenção D Diluição EH Epóxido-hidrolase EP1 7-(3,4-di-epóxi-butóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona EP2 7-(3,4-di-epóxi-hexilóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona ES1 7-(3,4-di-acetato-butóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona ES2 7-(3,4-di-propionato-butóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona F Absortividade Molar Ga Média do no de sementes que germinaram na amostra Galac-Ac Galactose acetilada Gc Média do no de sementes que germinaram no controle Glic-Ac Glicose acetila GRa Média do comprimento das raízes na amostra GRc Média do comprimento das raízes no controle IG Índice de germinação IQ Instituto de Química LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ISO International Organization for Standardization L Litro L. sativa Lactuca sativa LIP 7-(3,4-di-octanoato-butóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona M. coacervata Mycosphaerella coacervata mL Mililitro min. Minutos Mss Massa de solo seco Msu Massa de solo úmido NE Não ensaiado NuBBE Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais PA-03 Mycosphaerella coacervata PEP1 7-(3,4-di-hidróxi-butoxi)-2H-1-benzopiran-2-ona PEP2 7-(3,4-di-hidróxi-hexilóxi)-2H-1-benzopiran-2-ona p-NPA Acetato de p-nitrofenila p-NPP Palmitato de p-nitrofenila Rf Fator de retenção rpm Rotações por minuto T Tempo Tr Tempo de retenção UFMT Universidade Federal de Mato Grosso V ou v Volume v/v Volume por volume  Somatória 3-ciano 3-cianopiridina Figura 1- Formas de infecção da planta hospedeira pelo fungo endofítico.. 46 Figura 2 - Uso de enzimas em síntese orgânica de acordo com a classe.... 54 Figura 3 - Equação da reação de hidrólise promovida por acilase............... 58 Figura 4 - Equação da reação geral das proteases: hidrólise catalítica de uma ligação peptídica................................................................... 58 Figura 5 - Equação da resolução enzimática de um alquil epóxido.............. 60 Figura 6 - Equação da reação de hidrólise promovida por nitrilase.............. 61 Figura 7 - Equação da reação de hidrólise enzimática de nitrilas................. 62 Figura 8 - Equação da reação de hidrólise por amidase.............................. 63 Figura 9 - Reações catalisadas por lipases.................................................. 64 Figura 10 - Estrutura tridimensional da lipase de Candida antarctica........... 66 Figura 11 - Equação geral de transesterificação de óleo vegetal................. 70 Figura 12 - Representação esquemática da reação de transesterificação catalisada por lipases................................................................. 72 Figura 13 - Princípio do método da adrenalina para triagem de lipase / esterase...................................................................................... 82 Figura 14 - Princípio do método da adrenalina para triagem de epóxido- hidrolase..................................................................................... 83 Figura 15 - Desenvolvimento do método da adrenalina............................... 84 Figura 16 - Princípio do método com indicador de pH para triagem de esterase...................................................................................... 85 LISTA DE FIGURAS Figura 17 - Desenvolvimento do método com indicador de pH para triagem de esterases................................................................... 86 Figura 18 - Princípio do método utilizando sondas fluorescentes derivadas de umbeliferona para triagem para triagem de lipase, esterase e epóxido-hidrolase..................................................................... 88 Figura 19 - Desenvolvimento do método utilizando sondas fluorescentes derivadas de umbeliferona para a triagem de lipase, esterase e epóxido-hidrolase..................................................................... 89 Figura 20 - Princípio do método utilizando sensor calceína-cobre para triagem de protease e acilase ................................................. 90 Figura 21 - Desenvolvimento do método com sensor calceína-cobre para triagem de acilase e protease..................................................... 91 Figura 22 - Princípio do método utilizando cloreto de cobalto para triagem de nitrilase................................................................................... 92 Figura 23 - Desenvolvimento do método utilizando cloreto de cobalto para triagem de nitrilase...................................................................... 93 Figura 24 - Princípio do método com indicador de pH para triagem de nitrilase................................................................................... 94 Figura 25 - Desenvolvimento do método com indicador de pH para triagem de nitrilase...................................................................... 95 Figura 26 - Princípio do método fluorimétrico para triagem de nitrilase........ 96 Figura 27 - Desenvolvimento do método fluorimétrico para triagem de nitrilase........................................................................................ 97 Figura 28 - Príncípio do método colorimétrico para determinação de amidase...................................................................................... 98 Figura 29 - Desenvolvimento do método para triagem de amidase............. 99 Figura 30 - Desenvolvimento do método para determinação da atividade lipase........................................................................................... 103 Figura 31 - Desenvolvimento do método para determinação da atividade protease................................................................................... 105 Figura 32 - Desenvolvimento do método para determinação de proteínas.. 107 Figura 33 - Preparo da Placa de Petri para seleção das sementes de L. sativa........................................................................................... 113 Figura 34 - Metodologia para determinação da Capacidade de Retenção do solo (CR)................................................................................ 116 Figura 35 - Avaliação do desenvolvimento de L. sativa............................... 119 Figura 36 - Atividade da lipase produzida por M. coacervata em diferentes tempos de cultivo....................................................................... 160 Figura 37 - Efeito do pH na atividade da lipase produzida por M. coacervata............................................................................. 161 Figura 38 - Efeito da temperatura na atividade da lipase produzida pelo por M. coacervata....................................................................... 162 Figura 39 - Efeito do pH na estabilidade da lipase produzida por M. coacervata.................................................................................. 163 Figura 40 - Efeito do temperatura na estabilidade da lipase produzida por M. coacervata............................................................................. 165 Figura 41 - Fitotoxicidade do óleo de soja: índice de germinação (IG) das sementes de L. sativa em função da concentração de óleo de soja (%)...................................................................................... 178 Figura 42 - Fitotoxicidade do óleo de soja: comprimento radicular (mm) e de hipocótilo (mm) de L. sativa em função da concentração de óleo de soja (%).......................................................................... 179 Figura 43 - Fitotoxicidade do óleo de soja: percentual de germinação das sementes de L. sativa em função da concentração de óleo de soja (%)....................................................................................... 179 Figura 44 - Fitotoxicidade do óleo de soja: germinações das sementes...... 180 Figura 45 - Redução de fitotoxicidade: percentual de germinação das sementes de L. sativa em função dos diferentes tratamentos do solo....................................................................................... 182 Figura 46 - Redução de fitotoxicidade: comprimento radicular (mm) e de hipocótilo (mm) de L. sativa em função dos diferentes tratamentos do solo ................................................................... 182 Figura 47 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa..................... 187 Figura 48 - Cromatograma CG da amostra “A” (Biodiesel)........................... 189 Figura 49 - Cromatograma CG da amostra “2” (Extrato bruto contendo a lipase extracelular produzida pela levedura Pseudozyma Hubeiensis strain HB85A).......................................................... 190 Figura 50 - Cromatograma CG da amostra “B” (Óleo de Soja) – Padrão interno......................................................................................... 190 Figura 51 - Cromatograma CG da amostra 4 (extrato bruto enzimático proveniente do cultivo do fungo M. coacervata em meio indutor - com óleo de soja - relação de massa extrato/óleo: 1,32%)...... 191 Figura 52 - Cromatograma CG da amostra 5 (extrato bruto enzimático proveniente do cultivo do fungo M. coacervata em meio indutor - com óleo de soja - relação de massa extrato/óleo: 2,61%).......................................................................................... 191 Figura 53 - Cromatograma CG da amostra 6 (extrato proveniente do cultivo do fungo M. coacervata em meio sem indutor - sem óleo )........................................................................................... 192 Figura 54 - Cromatograma CG da amostra 8 (meio de cultura sem óleo e sem crescimento fúngico)......................................................... 192 Figura 55 - Cromatograma CG da amostra 9 (Controle sem extrato).......... 193 Tabela 1 - Exemplos de compostos de importância industrial produzidos por fungos .................................................................................. 43 Tabela 2 - Exemplos de compostos bioativos isolados de fungos endofíticos.................................................................................... 47 Tabela 3 - Exemplos de enzimas de fungos endofíticos com aplicação industrial...................................................................................... 50 Tabela 4 - Classificação das enzimas de acordo com a IUB........................ 53 Tabela 5 – Espécies vegetais e os fungos endofíticos isolados................... 77 Tabela 6 - Relação quantitativa dos reagentes no processo de transesterificação enzimática...................................................... 122 Tabela 7 - Atividade esterase usando diferentes substratos......................... 129 Tabela 8 - Atividade lipase/esterase segundo o método da adrenalina........ 131 Tabela 9 - Atividade esterase segundo o método com indicador de pH....... 134 Tabela 10 - Atividade lipase/esterase pelo método fluorimétrico.................. 136 Tabela 11 - Atividade epóxido-hidrolase....................................................... 138 Tabela 12 - Atividade acilase e protease ..................................................... 141 Tabela 13 - Atividade nitrilase....................................................................... 144 Tabela 14 - Atividade amidase...................................................................... 148 Tabela 15 - Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos.... 151 LISTA DE TABELAS Tabela 16 - Atividade lipase dos fungos endofíticos pré-selecionados à partir de ensaios preliminares...................................................... 156 Tabela 17 - Efeito de detergentes e íons na atividade da lipase produzida por M. coacervata....................................................................... 167 Tabela 18 - Efeito de solventes orgânicos na atividade da lipase produzida por M. coacervata...................................................................... 169 Tabela 19 - Atividade da lipase produzida por M. coacervata em diferentes ésteres de p-nitrofenila.............................................................. 170 Tabela 20 - Estabilidade da lipase produzida por M. coacervata à estocagem................................................................................. 171 Tabela 21 - Teste de viabilidade das sementes, em placa, usando meio de cultivo do fungo M. coacervata.................................................. 174 Tabela 22 - Teste de viabilidade das sementes de L. sativa em solo tratado com o meio de cultura do fungo M. coacervata............ 175 Tabela 23 - Viabilidade de crescimento das sementes de L. sativa em solo com diferentes concentrações de óleo de soja.......................... 178 Tabela 24 - Redução de fitotoxicidade: viabilidade de crescimento das sementes de L. sativa em solo contaminado com 10% óleo de soja e tratado com lipase de M. coacervata............................. 181 Tabela 25 - Concentração total e individual (%) de ésteres metílicos de ácidos graxos formados na reação de transesterificação do óleo de soja................................................................................ 188 1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 41 1.1. Fungos: uma visão geral............................................................................ 42 1.2. Fungos Endofíticos..................................................................................... 44 1.3. Considerações gerais sobre as enzimas.................................................. 51 1.4. Considerações gerais sobre biocatálise e métodos de prospecção de biocatalisadores.......................................................................................... 55 1.5. Atividades enzimáticas............................................................................... 57 1.5.1. Acilases e Proteases.................................................................................. 57 1.5.2. Epóxido-Hidrolases.................................................................................... 59 1.5.3. Nitrilases..................................................................................................... 60 1.5.4. Amidases.................................................................................................... 62 1.5.5. Lipases e Esterases................................................................................... 63 1.6. Aplicação biotecnológica de lipases........................................................ 67 1.6.1. Biorremediação.......................................................................................... 67 1.6.2. Transesterificação...................................................................................... 69 2. OBJETIVOS.................................................................................................... 73 3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. 75 3.1. Espécies vegetais e fungos endofíticos isolados................................... 76 3.2. Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos.............. 80 3.2.1. Manutenção e reativação das linhagens.................................................... 81 3.2.2. Cultivo dos fungos para os ensaios de triagem biocatalítica..................... 81 3.2.3. Ensaios para a triagem de atividades biocatalíticas.................................. 81 SUMÁRIO 3.2.3.1. Método da adrenalina para lipase/esterese e epóxido-hidrolase......... 81 3.2.3.2. Método com indicador de pH para esterase.......................................... 85 3.2.3.3. Método com sondas fluorescentes derivadas de umbeliferona para lipases, esterases e epóxido-hidrolases................................................... 87 3.2.3.4. Método com sensor calceína-cobre para acilases e proteases.............. 90 3.2.3.5. Método com cloreto de cobalto para nitrilase......................................... 91 3.2.3.6. Método com indicador de pH para nitrilase............................................. 94 3.2.3.7. Método fluorimétrico para nitrilase.......................................................... 96 3.2.3.8. Método da acrilamida / hidroxilamina para amidase............................... 98 3.3. Seleção do fungo endofítico com melhor produção de lipase e caracterização parcial da enzima no extrato bruto.................................. 100 3.3.1. Meios de cultura......................................................................................... 101 3.3.1.1. Agar Batata Dextrose.............................................................................. 101 3.3.1.2. Meio indutor de lipase............................................................................. 101 3.3.2. Condições de cultivo.................................................................................. 102 3.3.3. Determinação da atividade lipase.............................................................. 102 3.3.4. Determinação da atividade protease......................................................... 104 3.3.5. Determinação de proteínas........................................................................ 105 3.3.6. Determinação do melhor tempo de cultivo para a produção máxima da lipase produzida por M. coacervata.......................................................... 107 3.3.7. Determinação do pH ótimo da lipase produzida por M. coacervata........ 108 3.3.8. Determinação da temperatura ótima da lipase produzida por M. coacervata................................................................................................. 108 3.3.9. Efeito do pH na estabilidade da lipase produzida por M. coacervata....... 108 3.3.10. Efeito da temperatura na estabilidade da lipase produzida por M. coacervata............................................................................................... 109 3.3.11. Efeito de detergentes e íons na atividade da lipase produzida por M. coacervata............................................................................................... 109 3.3.12. Efeito de solventes orgânicos na atividade da lipase produzida por M. coacervata............................................................................................... 109 3.3.13. Atividade da lipase produzida por M. coacervata em diferentes ésteres de p-nitrofenila........................................................................................ 110 3.3.14. Estabilidade da lipase produzida por M. coacervata à estocagem.......... 110 3.4. Avaliação do potencial para aplicação biotecnológica: biorremediação.......................................................................................... 111 3.4.1. Seleção das sementes alface (L. sativa)................................................... 112 3.4.2. Avaliação da viabilidade das sementes na presença do meio de cultivo do fungo: teste em placa........................................................................... 114 3.4.3. Avaliação da viabilidade das sementes na presença do meio de cultivo do fungo: teste em solo............................................................................. 114 3.4.4. Determinação da capacidade de retenção do solo.................................... 115 3.4.5. Avaliação da concentração tóxica de óleo de soja para sementes de alface (L. sativa)........................................................................................ 117 3.4.6. Ensaio de redução de fitotoxicidade: biorremediação............................... 117 3.4.7. Determinação do índice de germinação.................................................... 118 3.4.8. Avaliação do desenvolvimento de L.sativa ............................................... 118 3.5. Avaliação do potencial para aplicação biotecnológica: transesterificação...................................................................................... 120 3.5.1. Transesterificação com lipase de M. coacervata....................................... 121 3.5.2. Análise através de Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)...................................................................................................... 123 3.5.3. Análise através de Cromatografia Gasosa (CG)........................................ 123 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................................... 125 4.1. Prospecção de atividade biocatalítica em fungos endofíticos............. 126 4.1.1. Atividades Biocatalíticas........................................................................... 127 4.1.1.1. Atividade lipase / esterase..................................................................... 128 4.1.1.2. Atividade Epóxido-Hidrolase.................................................................. 137 4.1.1.3. Atividades Acilase e Protease................................................................ 140 4.1.1.4. Atividade Nitrilase................................................................................... 143 4.1.1.5. Atividade Amidase.................................................................................. 147 4.1.2. Prospecção de atividades biocatalíticas................................................... 150 4.2. Seleção de fungo endofítico com potencial atividade lipase e caracterização parcial da enzima em extrato bruto.............................. 155 4.2.1. Seleção de fungos com potencial atividade lipase.................................... 156 4.2.2. Caracterização da lipase produzida por M. Coacervata .......................... 158 4.2.2.1. Determinação da atividade protease no fungo M. coacervata.............. 158 4.2.2.2. Determinação do melhor tempo de cultivo para a produção máxima de lipase pelo fungo M. coacervata........................................................ 158 4.2.2.3. Determinação do pH ótimo da lipase de M. coacervata........................ 160 4.2.2.4. Determinação da temperatura ótima da lipase de M. coacervata.......... 161 4.2.2.5. Efeito do pH na estabilidade de lipase de M. coacervata...................... 162 4.2.2.6. Efeito da temperatura na estabilidade da lipase de M. coacervata...... 163 4.2.2.7. Efeito de detergentes e íons na atividade lipase de M. coacervata ...... 165 4.2.2.8. Efeito de solventes orgânicos na atividade lipase de M. coacervata..... 168 4.2.2.9. Atividade de lipase de M. coacervata em diferentes ésteres de p- nitrofenila............................................................................................... 170 4.2.2.10. Estabilidade da lipase de M. coacervata à estocagem....................... 171 4. 3. Avaliação da capacidade de aplicação biotecnológica: biorremediação......................................................................................... 172 4.3.1. Avaliação da viabilidade das sementes na presença do meio de cultivo do fungo..................................................................................................... 173 4.3.2. Avaliação da concentração tóxica de óleo de soja para sementes de L. sativa......................................................................................................... 176 4.3.3. Biorremediação de solo contaminado com óleo de soja utilizando lipase de M. Coacervata: ensaio de redução de fitotoxicidade........................... 181 4.4. Avaliação da capacidade de aplicação biotecnológica: Transesterificação...................................................................................... 185 4.4.1. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) .................... 186 4.4.2. Cromatografia Gasosa (CG).................................................................... 187 5. CONCLUSÃO................................................................................................. 196 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 199 ANEXOS.............................................................................................................. 221 INTRODUÇÃO I N T R O D U Ç Ã O | 42 1.1. Fungos: uma visão geral Ao longo da história, plantas, animais e micro-organismos têm sido conhecidos como fontes naturais de compostos que abrangem da alimentação ao campo da medicina popular e clínica, proporcionando uma série de benefícios à humanidade. Dentre tais organismos, os fungos destacam-se por produzir uma extensa variedade de metabólitos, com amplo campo de aplicações (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010). Os fungos são organismos muito importantes, não somente pelo seu papel vital no ecossistema, como pela sua influência nos seres humanos e em atividades relacionadas, sendo responsáveis pela produção de fármacos, enzimas de interesse industrial, controle biológico de pragas-insetos na agricultura entre outros. São seres eucarióticos, heterotróficos, altamente eficientes na degradação de uma ampla variedade de substratos. Sua nutrição é realizada por absorção, mediante a produção de enzimas usadas para a degradação dos nutrientes (MUELLER; SCHMIT, 2007; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010). Os fungos apresentam uma grande diversidade ecológica, fisiológica e morfológica, tornando difícil generalizar suas características. Constituem o grande e heterogêneo Reino Fungi, no qual são reconhecidos três grupos distintos: fungos filamentosos, leveduras e cogumelos, e podem ser encontrados em qualquer nicho ecológico. Excluindo os insetos, os fungos constituem os mais numerosos seres vivos existentes, sendo estimado cerca de 1,5 milhões de espécies (ARCHER et al., 2008; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010;). Os fungos filamentosos possuem a habilidade de crescer em substratos com poucos nutrientes e de baixo custo, além da capacidade histórica de produzir metabólitos especiais (secundários) com ampla atividade biológica, promovendo o seu interesse para uso em biotecnologia (MEYER, 2008). Dessa forma, são explorados comercialmente para a produção de enzimas e de uma grande variedade de metabólitos bioativos (ARCHER et al., 2008; SUN et al., 2010). A tabela 1 apresenta alguns exemplos de fungos filamentosos e os compostos de importância industrial por eles produzidos. I N T R O D U Ç Ã O | 43 O potencial dos fungos na produção de metabólitos bioativos começou a ser explorado na década de 40, com o amplo uso terapêutico da penicilina. Com essa descoberta, se deu início na década seguinte à programas de triagens biológicas, realizados pelas principais indústrias farmacêuticas, possibilitando o isolamento de uma série de compostos com aplicações terapêuticas (DREYFUSS; CHAPELA, 1994; SUN et al., 2010). Tabela 1 - Exemplos de compostos de importância industrial produzidos por fungos Fungo Composto produzido Principal área de aplicação Metabólitos Primários Aspergillus niger Ácido cítrico Indústria de alimentos e de bebidas A. terreus Ácido itacônico Indústria de polímeros A. niger, A. oryzae Amilase Processamento de amido e industria de alimentos A. niger Quimosina Indústria de alimentos Trichoderma viridae, T. reesei, Humicola insolens, Penicillium funiculosum Celulase Indústria têxtil e de papel A. niger, A.oryzae Lipase Indústria de alimentos e de detergentes A.niger, A.oryzae, A. melleus, Rhizopus delemar Protease Indústria de alimentos e de detergentes Mucor miehei, M. pusillus Renina Indústria de alimentos Metabólitos Secundários Claviceps purpúrea Alcalóides ergot Indústria farmacêutica Acremonium chrysogenum Cefalosporina Indústria farmacêutica Tolypocladium nivenum Ciclosporina Indústria farmacêutica Fusarium moniliforme Giberelina Indústria agronômica Penicillium griseofulvum Griseofulvina Indústria farmacêutica Monascus ruber, A. terreus Lovastatina Indústria farmacêutica Penicillium chrysogenum Penicilina Indústria farmacêutica Fonte: MEYER, 2008; JIANG; NA, 2000; ABREU; ROVIDA; PAMPHILE, 2015 I N T R O D U Ç Ã O | 44 Ainda que muitos dos compostos produzidos pelos fungos já sejam aplicados na indústria, a diversidade metabólica, produzida pelos fungos filamentosos ainda é muito pequena e pouco explorada (SCHNEIDER et al., 2008). Devido às condições relativamente simples requeridas para o crescimento, os fungos são encontrados em diferentes ecossistemas, tais como água, solo, ar, animais e plantas, desde que haja matéria orgânica disponível. São denominados, segundo seu habitat e/ou hospedeiro, como micoparasitas, de água doce, marinhos, termofílicos, epifíticos e endofíticos, entre outros, sendo os endofíticos uma excelente e recente fonte de substâncias bioativas e biocatalíticas a ser explorada (HAWKSWORTH, 2001). 1.2. Fungos endofíticos Os fungos endofíticos são micro-organismos que habitam os tecidos das plantas vivendo sistematicamente no seu interior, entre as células vegetais, sem provocar qualquer prejuízo imediato à planta hospedeira (AZEVEDO; ARAÚJO, 2007). Com a evolução das espécies, estes se especializaram em invadir espaços celulares dos tecidos vegetais (ANDREWS, 1991; STROBEL, 2003) através das raízes do hospedeiro e aberturas naturais, como estômatos e através de feridas causadas por choques mecânicos, insetos e fungos patogênicos. Uma vez instalado, o endófito pode habitar a planta por toda sua vida, sendo transmitido, em alguns casos, para futuras gerações através da semente do hospedeiro (AZEVEDO; ARAÚJO, 2007). A diversidade e a frequência dos fungos endofíticos nos hospedeiros pode variar com diferentes fatores, tais como umidade ambiental, distribuição geográfica do vegetal, altura da planta em relação ao solo, idade, parte da planta, disposição na folha, dentre outros (SAIKKONEN et al., 1998; STROBEL, 2003; NAIR; PADMAVATHY, 2014). Além disso, a população de endófitos varia de planta para planta e de espécie para espécie. Dentro da mesma espécie, além de variar de região para região, também pode diferir com a mudança nas condições climáticas dentro da mesma região (NAIR; PADMAVATHY, 2014). I N T R O D U Ç Ã O | 45 Podem ser encontrados em toda superfície terrestre, nas comunidades naturais e antrópicas, colonizando plantas no Ártico, Antártica, solos geotérmicos, desertos, oceanos, florestas tropicais, mangues e florestas costeiras (JALGAONWALA et al., 2011), habitando quase todas as plantas vasculares, algas marinhas, musgos e samambaias, estudadas até o momento. Normalmente, centenas de espécies de endófitos podem ser isoladas de uma única planta, sendo que ao menos uma é específica ao hospedeiro (TAN et al., 2001). A maioria dos endófitos é transmitida horizontalmente através de esporos de plantas para planta, crescimento das raízes, aberturas naturais, como estômatos, e artificiais, como injúrias causadas por práticas agrícolas, ou verticalmente através das sementes da planta infectada (Figura 1), sendo a transmissão horizontal a forma que parece ser predominante (SAIKKONEN et al., 2004; ALY et al., 2011). São estudadas diversas funções ecológicas relacionadas aos endofíticos tais como a decomposição de tecidos vegetais mortos (KUMARESAN; SURYANARAYANAN, 2002; OSES et al., 2008), a atividade repelente contra insetos (AKELLO et al., 2007), a proteção da planta hospedeira contra patologias (ARNOLD et al., 2000), o aumento da tolerância a estresse abiótico (REDMAN et al., 2002; BAE et al., 2009) e a produção de fito hormônios, toxinas e outras substâncias de interesse biotecnológico. Por outro lado, a planta hospedeira pode fornecer proteção e nutrientes aos endófitos nela residentes (STROBEL; DAISY, 2003; KOGEL et al., 2006). Os fungos são os micro-organismos endofíticos isolados com maior frequência (STROBEL; DAYSE, 2003), sendo a maioria Ascomycota e seus anamorfos (ARNOLD et al., 2000; HUANG et al., 2001). Os estudos desses endófitos ganharam destaque a partir da descoberta que Taxomyces andreanae, isolado do vegetal Taxus brevifolia (Taxaceae), produz o diterpeno paclitaxel, um dos agentes anticâncer mais utilizado no tratamento clínico. Essa co-produção tem potencializado as pesquisas com fungos endofíticos como fonte de substâncias bioativas (KNIGTH et al., 2003). I N T R O D U Ç Ã O | 46 Figura 1 - Formas de infecção da planta hospedeira pelo fungo endofítico Fonte: SAIKKONEN et al., 2004 Muitas propriedades bioativas inicialmente atribuídas às plantas podem, na realidade, serem moléculas bioativas sintetizadas por micro-organismos endofíticos (STROBEL, 2003). Um exemplo é a espécie vegetal Kennedia nigriscans, utilizada pelas tribos aborígenes australianas para o tratamento de feridas, cortes e infecções. As propriedades cicatrizantes atribuídas ao vegetal, na realidade, são relacionadas à produção de peptídeos com ação antibacteriana sintetizados pelo endófito Streptomyces NRRL 30562 (PURI et al., 2006). Outro exemplo de substância bioativa extraída de plantas (do gênero Podophyllum) e produzida por fungos endofíticos é a podofilotoxina, que apresenta atividades antitumoral, antiviral, antibacteriana e imunoestimulante (PURI et al., 2006). Desde sua descoberta em 1866, quando os fungos endofíticos foram definidos como assintomáticos, as pesquisas têm proporcionado significativas mudanças no papel destes micro-organismos, fortalecendo o conhecimento sobre seu potencial na produção de fármacos, toxinas, e muitos outros produtos bioativos de interesse biotecnológico (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010). Neste contexto, diversos compostos bioativos foram isolados de fungos endofíticos ao longo dos anos, alguns destes estão mostrados na tabela 2. I N T R O D U Ç Ã O | 47 Tabela 2 - Exemplos de compostos bioativos isolados de fungos endofíticos Fungo endofítico Planta hospedeira Composto bioativo isolado Atividade biológica Refer. Fusarium subglutinans Tripterygium wilfordii Subglutinol-A Imunossu- pressora LEE et al., 1995 Geniculosporium sp Teucrium scorodonia Geniculol Algicida KONIG et al., 1999 Pestalotiopsis microspora Terminalia morobensis Isopestacina Antimicrobiana e Antioxidante HARPER et al., 2003 Phomopsis phaseoli Betula pendula Ácido 3-hidroxipropiônico Nematicida SCHWARZ et al., 2004 O H H H H O O OH HO OH O O O O H H O OH HO H O OH O OH HO (continua) I N T R O D U Ç Ã O | 48 Fungo endofítico Planta hospedeira Composto bioativo isolado Atividade biológica Refer. Xylaria sp Abies holophylla Griseofulvina Antifúngica PARK et al., 2005 Taxomyces andreanae Taxus brevifolia Taxol (paclitaxel) Antitumoral STROBEL; STIERLE; STIELE, 1993 Entrophospora infrequens Nothapodytes foetida Camptotecina Citotóxica PURI et al., 2005 Penicillium chrysogenum (Trichocomaceae) Cistanche deserticola (Orobanchacea e) crisogenamida A Neuroprotetora LIN et al., 2008 Edenia sp (Pleosporaceae) Petrea volubilis (Verbenaceae) palmarumicina CP17 Antiparasitária MARTINEZ et al., 2008 O O HO N N O HN O NH N O O O OH O OH (continuação) O O O Cl O O O NH O O OH O O O OO O O O O OH OH I N T R O D U Ç Ã O | 49 (conclusão) Fungo endofítico Planta hospedeira Composto bioativo isolado Atividade biológica Refer. Phoma (species ZJWCF006) Arisaema erubescens Tricodemina Antimicrobiana WANG et al., 2012 A capacidade destes organismos em produzir enzimas associadas ao ataque das paredes celulares, em razão da necessidade de colonização do hospedeiro, também já foi estabelecida (GARCIA et al., 2000). Considerando que os fungos endofíticos ainda são um nicho de micro-organismos em potencial, podem ser considerados fontes potenciais de atividades biocatalíticas, da mesma forma que têm sido para produtos naturais bioativos (STROBEL et al., 2004; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010 ). Na relação simbiótica entre endófito e planta hospedeira está a produção de enzimas extracelulares, como proteases, lipases, entre outras, que podem ser aplicadas em diferentes áreas (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010) Estas enzimas apresentam grande importância para indústrias no processamento de alimentos, bebidas, formulação de medicamentos e detergentes, amaciamento de carnes, indústria têxtil e de couro (FOUKIS et al., 2012). Alguns exemplos estão destacados na tabela 3. O O O O I N T R O D U Ç Ã O | 50 Tabela 3 - Exemplos de enzimas de fungos endofíticos com aplicação industrial (continua) Fungo endofítico Planta hospedeira Enzima Refer. Alternaria sp. Eremophilia longifolia amilase ZHANG et al., 2010 Acrimonium terrícola Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae) celulase, protease, xilanase BEZERRA et al., 2012 A. japonicus Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae) celulase, pectinase, protease, xilanase BEZERRA et al., 2012 Acremonio zeae Zea mays xilanase BISCHOFF et al., 2009 Acremonium sp. Acrostichum aureum amilase, celulase, lipase MARIA et al., 2005 Alternaria chlamydosporus Acanthus ilicifolius celulase, lipase, protease MARIA et al., 2005 Aspergillus sp. Acrostichum aureum celulase, lipase, protease MARIA et al., 2005 Discosia sp. Calophyllum inophyllum amilase HEGDE et al., 2011 Penicillium sp. Centella asiatica celulase DEVI et al., 2012 Preussia minima Eremophilia longifolia amilase ZHANG et al., 2005 Cladosporium cladosporioides Costus igneus, Lawsonia inerims amilase, celulase AMIRITA et al., 2012 Curvularia brachyspora Adathoda vasica amylase, lacase, lipase AMIRITA et al., 2012 Curvularia vermiformis Coleus aromaticus celulase, lipase, protease AMIRITA et al., 2012 Drechslera hawaiiensis Adathoda vasica amilase, lipase, protease AMIRITA et al., 2012 I N T R O D U Ç Ã O | 51 (conclusão) Fungo endofítico Planta hospedeira Enzima Refer. Colletotrichum falctum Lawsonia inerims lipase, protease AMIRITA et al., 2012 Phyllosticta sp. Adathoda vasica, Lawsonia inerims amilase, lipase AMIRITA et al., 2012 Xylaria sp. Coleus aromaticus amilase, lacase, protease AMIRITA et al., 2012 Penicillium sp. Camellia caduca celulase, lipase, protease, xilanase BHAGOBATY et al., 2012 Chaetominum globosum Glinus lotoides lacase EL-ZAYAT, 2008 Bjerkandera sp. Drimys winteri celulase, fenoloxidase OSES et al., 2006 Fusarium verticillioides Glycine max (L.) Merril fitase MARLIDA, et al., 2010 1.3. Considerações gerais sobre as enzimas As enzimas, são formadas por longas cadeias de aminoácidos ligadas através de ligações peptídicas. São proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, atuando de modo seletivo, rápido e em condições brandas de reação (SUAN; SARDIMI, 2004). Chamadas industrialmente de biocatalisadores, são substâncias capazes de acelerar as reações bioquímicas, ao diminuírem a energia de ativação, tornando uma reação 1012 a 1017 vezes mais rápida do que uma não catalisada. Além disso, as enzimas são capazes de atuar com eficiência em pequenas quantidades, uma grande vantagem frente aos catalisadores químicos (MUSSATTO; FERNANDES; MILAGRES, 2007; COELHO et al., 2008). I N T R O D U Ç Ã O | 52 Algumas enzimas requerem a participação de moléculas menores de natureza não proteica. Tais moléculas, chamadas de cofatores, são divididas em duas porções: metais e coenzimas e são necessárias para a atividade catalítica (COELHO et al., 2008). No entanto, algumas enzimas podem atuar na ausência de cofatores, como é o caso das lipases, uma das características que as tornam bastante atrativas (TORRES et al., 2006; SUAN; SARDIMI, 2004). As enzimas são biocatalisadores versáteis que apresentam propriedades indispensáveis para a biotecnologia, principalmente pela sua capacidade de atuar em condições brandas de reação, sendo uma vantagem no mercado industrial (MUSSATTO; FERNANDES; MILAGRES, 2007). Além da capacidade de promover em alguns casos, reações assimétricas gerando produtos finais com maior valor agregado (JOHNSON et al., 1998) A atividade enzimática está relacionada à estrutura terciária ou quaternária da molécula, e assim, qualquer modificação que altere a estrutura do sítio ativo da enzima irá alterar a propriedade catalítica. Já a velocidade da reação enzimática é influenciada por vários fatores como a concentração da enzima, a concentração de substrato, a presença de inibidores e cofatores, a temperatura e o pH (TORRES et al., 2006). As enzimas são classificadas conforme as reações que catalisam. De acordo com a Enzyme Commission (EC) da International Union of Biochemistry (IUB), as enzimas são divididas em seis grandes grupos (Tabela 4). Dentre as classes de enzimas com maior aplicação em síntese orgânica, estão as hidrolases, que possuem a vantagem de não dependerem de cofatores além de catalisarem reações com alta quimio-, régio- e enantiosseletividade. (OLIVEIRA; MANTOVANI, 2009). Dentre as hidrolases, as lipases, esterases, proteases, amidases, nitrilases, nitrila hidratases e epóxido-hidrolases são as mais comumente aplicadas na obtenção de blocos de construção quirais a partir de misturas racêmicas via resolução cinética (KUMAR; NAIDU; GUPTA, 2007), compostos pró-quirais (DRAUZ; WALDMANN, 2002) e misturas diastereoisoméricas (KOELLER; WONG, 2001) (Figura 2). Dentre as diversas fontes de enzimas disponíveis, os micro-organismos compõem um grupo representativo de destaque. Muitas espécies tem sido alvo para I N T R O D U Ç Ã O | 53 investigação da potencialidade industrial, principalmente como fontes de amilases, celulases e proteases, que possuem especial uso no processamento de alimentos e detergentes (OYELEKE et al., 2010). Tabela 4 - Classificação das enzimas de acordo com a IUB Número Classe Tipo de reação catalisada Classe 1 Oxidoredutases Catalisam reações de oxidação e redução. Atuam em CH-OH; C=O, C=O-, CH-NH2, CH-NH-, NADH, NADPH Hidrogenases, oxidases, peroxidases, etc. 2 Transferases Transferência de grupos químicos de uma molécula para outra (grupo acil, açúcares, fosforil, aldeídos, cetonas, etc), Transaldolases, transcetolases, etc. 3 Hidrolases Catalisam reações de hidrólise e formação de glicosídeos, anidridos e ésteres, bem como amidas, peptídeos. Esterases, lipases, peptidases, fosfatases, etc 4 Isomerases Catalisam a transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros. Racemases, epimerases, oxirredutases, mutases, etc. 5 Liases Catalisam as reações diretas e inversas de adição, usualmente de HX, às duplas ligações como C=C, C=N, e C=O. Descarboxilases, cetoácidoliases, hidroliases 6 Ligases São também chamadas sintetases e mediam a formação ligações C-C, C- O, C-S, C-N através da quebra de ATP. Sintetase Fonte: SANT’ANNA, 2001 I N T R O D U Ç Ã O | 54 Figura 2 - Uso de enzimas em síntese orgânica de acordo com a classe Fonte: OLIVEIRA; MANTOVANI, 2009 (Adaptado) A aplicação de enzimas, como as microbianas, como catalisadores em processos industriais, mostra-se vantajosa, pois são específicas, naturais e geralmente não apresentam toxicidade, sendo essas características importantes tanto para a indústria quanto para o meio ambiente. Dentre as enzimas microbianas, aquelas produzidas por fungos estão em expansão de uso em diversos processos (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010). Nesse aspecto, considerando as vantagens citadas, os ensaios enzimáticos tornam-se indispensáveis para a descoberta de novas enzimas e/ou seleção daquelas mais eficientes em grandes coleções de micro-organismos. Essa abordagem tem contribuído para a descoberta de biocatalisadores eficientes, intensificando a utilização de enzimas microbianas na produção biotecnológica (SCHMID et al., 2001). 62%26% 5% 1% 5% 1% HIDROLASES OXIREDUTASES TRANSFERASES LIGASES LIASES ISOMERASE I N T R O D U Ç Ã O | 55 1.4. Considerações gerais sobre biocatálise e métodos de prospecção de biocatalisadores Em resposta à necessidade da indústria farmacêutica por novas moléculas, enantiomericamente puras, as empresas de química fina estão assumindo novas tecnologias de manufatura, visando produzir compostos que satisfaçam estas especificações. O desenvolvimento na biocatálise, combinado com os avanços na engenharia de processos, têm oferecido métodos melhorados para a produção de intermediários químicos valiosos (HUISMAN; GRAY, 2002). A aplicação de enzimas e micro-organismos para síntese orgânica em larga escala está atraindo bastante atenção. A descoberta de novas enzimas microbianas, através de bioprospecção extensiva e contínua, tem gerado muitas rotas novas e simples para processos de síntese. O uso destas novas enzimas em reações químicas e enzimáticas tem também criado possíveis caminhos para a solução de problemas ambientais (OGAWA; SHIMIZU, 2002). Reações catalisadas por enzimas ou sistemas enzimáticos mostram maior especificidade que as formas convencionais de reações químicas. Em consequência, o uso industrial de enzimas tem se desenvolvido rapidamente (KOELLER; WONG, 2001; ESPOSITO; AZEVEDO, 2010) e por esta razão, a prospecção é constantemente requerida. Uma das maneiras de descobrir novas enzimas é através da busca em micro-organismos, devido às suas características particulares e à grande diversidade. Em geral, quando se procura uma atividade enzimática específica, os micro-organismos são isolados de locais onde existam fontes do substrato para a enzima alvo. Esta é uma maneira de guiar a prospecção para que seja mais produtiva. No caso de fungos endofíticos, existe ainda a possibilidade de orientar a prospecção de enzimas através da análise dos metabólitos secundários produzidos pela planta hospedeira ou pelo próprio endófito. De maneira geral, qualquer ensaio utilizado para verificar se uma amostra biológica catalisa a conversão de um determinado substrato pode ser considerado como método de prospecção. Entretanto, em termos práticos, é desejado que o I N T R O D U Ç Ã O | 56 método possa ser aplicado a um grande número de amostras, cuja dimensão dependerá de fatores específicos e das condições de automação disponíveis. Os métodos mais simples para prospecção de biocatalisadores são baseados no monitoramento da reação de interesse através de medidas colorimétricas ou fluorimétricas, visualmente ou através de equipamentos adequados (WHALER; REYMOND, 2001) e envolvem moléculas reativas que podem gerar uma coloração ou emitir fluorescência em resposta a uma atividade enzimática (REYMOND, 2004). A maioria dos ensaios enzimáticos utiliza substratos fluorogênicos ou cromogênicos, ou sensores capazes de revelar uma determinada atividade catalítica. Dessa maneira, esses ensaios podem ser classificados em dois grandes grupos: ensaios com substratos marcados e ensaios com substratos não modificados (GODDARD; REYMOND, 2004). Nos ensaios com substratos marcados, encontram-se: os substratos fluorogênicos ou cromogênicos associados à reação de -eliminação, substratos associados à transferência de energia de ressonância de fluorescência, substratos com marcação isotópica e outros substratos com marcação fluorescente para detecção indireta (GODDARD; REYMOND, 2004). Esses ensaios oferecem conexão direta entre a atividade enzimática e o sinal observado. O uso de sondas cromogênicas ou fluorogênicas apresenta o inconveniente de necessitar de substratos modificados, sendo assim, torna-se preferível a aplicação direta dos substratos não modificados. Estes se baseiam na utilização de quimiossensores que respondem à formação do produto, tornando desnecessária a marcação do substrato. Outros ensaios indiretos utilizam sensores capazes de detectar o progresso da reação, como exemplo, a medição de mudança de temperatura ou detecção de íons metálicos, e também sensores fluorescentes que respondam a um reconhecimento seletivo do produto (MARSAIOLI; PORTO, 2010). Os ensaios espectrofotométricos apresentam a vantagem de serem realizados em microplacas ou em papel de filtro, permitindo processar maior número de amostras e em pequenos volumes (THOLEY; HEINZLE, 2002). O uso de substratos cromogênicos é geralmente mais conveniente que os fluorogênicos, pois I N T R O D U Ç Ã O | 57 suas reações podem ser detectadas visualmente, demonstrando serem apropriados para um trabalho de rotina sem o uso de equipamentos, e quando necessário, os espectrofotômetros UV são mais disponíveis que fluorímetros (GROGNUX et al., 2004). Ensaios para detecção da fluorescência se apresentam como uma das tecnologias chaves em screening, sendo a alta sensibilidade a principal vantagem deste método. A detecção fluorogênica é aproximadamente 100 vezes mais sensível que a detecção por absorção, permitindo o uso de pequenas concentrações de substratos, minimizando problemas de baixa solubilidade (THOLEY; HEINZLE, 2002). 1.5. Atividades enzimáticas 1.5.1. Acilases e Proteases A acilase (N-acil-L-aminoacido amidoidrolase, E.C. 3.5.1.14) catalisa a hidrólise enantioespecífica de N-acetil-DL-aminoácidos, fornecendo como produtos o respectivo L-aminoácido livre e o N-acetil–D-aminoácido não hidrolisado (Figura 3) (CHENAULT et al., 1989; YOUSHKO et al., 2001). Também conhecida como aminoacilase ou acilase I, é uma enzima prontamente disponível, de custo acessível e é utilizada na produção industrial de L-aminoácidos enantiopuros a partir de seu derivado N-acilado (BOMMARIUS et al., 1992). Até o momento, toda aplicação industrial e laboratorial da aminoacilase explora a habilidade destas enzimas para clivar ou sintetizar o ligante N-acil, sendo usada em escala industrial para produção de L-aminoácidos (YOUSHKO et al., 2001) I N T R O D U Ç Ã O | 58 Figura 3 - Equação da reação de hidrólise promovida por acilase N-acil-DL-aminoácido + H2O L- aminoácido + N-acil-D-aminoácido As proteases (E.C. 3.4), pertencentes à classe das hidrolases, quebram ligações peptídicas nas proteínas e fragmentos de proteínas levando à formação de grupos amínicos e carboxílicos, originando pequenos peptídeos e/ou aminoácidos livres. A hidrólise de uma ligação peptídica ocorre por adição de uma molécula de água (Figura 4), e apesar de ser termodinamicamente favorável, apresenta uma cinética muito lenta na ausência de um catalisador (BARRETT et al., 2001). Figura 4 - Equação da reação geral das proteases: hidrólise catalítica de uma ligação peptídica Essas enzimas possuem grande variedade de funções fisiológicas de grande complexidade e são importantes na manutenção e regulação de várias vias metabólicas, estando presentes em todos os seres vivos. Além de sua importância fisiológica, existe um grande interesse por estas enzimas devido à possibilidade de aplicação industrial, sendo que sua abrangência catalítica possibilita sua utilização nos segmentos de alimentos, detergentes, rações, couros, farmacêuticas dentre outros (MAHAJAN; BADGUJAR, 2010). Como catalisadores biológicos oferecem R1 N H R2 OCO2H R1 NH3 + COO- + R1 N H R2 OCO2H Acilase I P r o t e a s e R N H R ' O + H 2 O R O O + R ' N H 3 http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acids http://en.wikipedia.org/wiki/Water http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acids I N T R O D U Ç Ã O | 59 vantagens em relação ao uso de catalisadores químicos devido à sua alta atividade catalítica, alta especificidade e disponibilidade em quantidades economicamente viáveis. São encontradas em várias classes de micro-organismos, como vírus, bactérias e fungos, podendo ser extra ou intracelulares, ligadas ou não à membrana. A impossibilidade das proteases de plantas e animais atenderem a demanda mundial de enzimas, tem levado a um interesse cada vez maior pelas proteases de origem microbiana (MAHAJAN; BADGUJAR, 2010). As proteases microbianas representam uma parcela relevante no mercado mundial de consumo de enzimas, e são preferidas às enzimas de outras fontes, uma vez que possuem a maioria das características desejáveis para aplicação biotecnológica, e seu custo de produção é menor quando comparado às enzimas de origem animal e vegetal. As proteases de origem fúngica aparecem em maior variedade, pois o mesmo fungo pode produzir proteases ácidas, neutras e alcalinas, as quais atuam em uma ampla faixa de pH (4 – 11) (BARRETT et al., 2001). 1.5.2. Epóxido-Hidrolases As epóxido-hidrolases (E.C. 3.3.2.3) são enzimas hidrolíticas que catalisam a adição de uma molécula de águ