Campus de São José do Rio Preto VIVIAN RIBEIRO DIAMANTINO “EFEITO DA ADIÇÃO DE AMIDO DE MILHO CEROSO EM QUEIJO MINAS FRESCAL COM TEOR REDUZIDO DE GORDURA” São José do Rio Preto 2013 VIVIAN RIBEIRO DIAMANTINO “EFEITO DA ADIÇÃO DE AMIDO DE MILHO CEROSO EM QUEIJO MINAS FRESCAL COM TEOR REDUZIDO DE GORDURA” Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Área de Concentração de Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientadora: Profª. Drª. Ana Lúcia Barretto Penna São José do Rio Preto 2013 Diamantino, Vivian Ribeiro. Efeito da adição de amido de milho ceroso em queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura / Vivian Ribeiro Diamantino. - São José do Rio Preto: [s.n.], 2013. 91 f. : il. ; 30 cm. Orientador: Ana Lúcia Barretto Penna Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Tecnologia de alimentos. 2. Queijo minas frescal - Indústria. 3. Alimentos de origem animal - Teor de gorduras. I. Penna, Ana Lúcia Barretto. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 637.352 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP VIVIAN RIBEIRO DIAMANTINO “EFEITO DA ADIÇÃO DE AMIDO DE MILHO CEROSO EM QUEIJO MINAS FRESCAL COM TEOR REDUZIDO DE GORDURA” Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Área de Concentração de Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Banca Examinadora Profª. Drª. Ana Lúcia Barretto Penna UNESP – São José do Rio Preto – S. P. Orientadora Profª. Drª. Walkiria Hanada Viotto UNICAMP – Campinas – S.P. Profª. Drª. Raquel Guttierres Gomes UEM – Maringá – P.R. São José do Rio Preto 15 de Março de 2013 “O que importa não é o que você tem na vida, mas quem você tem na vida.” (William Shakespeare) Dedico este trabalho... Aos meus pais Maria Teresa e Marcos, por serem minha eterna inspiração. AGRADECIMENTOS À professora Drª. Ana Lúcia Barretto Penna, pela oportunidade, paciência, amizade e orientação em todas as etapas do desenvolvimento deste projeto. Aos meus pais, Maria Teresa e Marcos e à minha irmã, Vanessa, por todo amor e dedicação e por estarem sempre ao meu lado, principalmente nos momentos mais difíceis, me dando força para seguir em frente e alcançar meus objetivos. Ao meu namorado, Thales pelo carinho e compreensão nos momentos de muito trabalho e pelo incentivo incondicional na busca por minha realização profissional. Aos meus amigos do laboratório, Bia, Sabrina, Luana, Aline, Janaína e Daniel e aos amigos também presentes nesta importante etapa em minha vida, Mariana, Cecília, Luana, Felipe, Jaqueline e Thaísa pela amizade, apoio e momentos de descontração que tornaram esta longa caminhada muito mais feliz e prazerosa. Em especial, às amigas que contribuíram diretamente para a realização deste trabalho: Fernanda, Tássila, Aline e Tatiane, muito obrigada pela consideração, disposição e bom humor, que foram fundamentais à realização deste projeto, sempre me encorajando à enfrentar as dificuldades do dia-dia. Muito obrigada também aos amigos de toda a vida, que mesmo longe, possuíram e ainda possuem um papel muito importante em minha vida, contribuindo de diferentes formas para que eu chegasse até aqui hoje: Augusto, Felipe, Ana Carolina, Kelly, Karen, Ivana, Tábata e Bruno. À CAPES pela disponibilização de bolsa ao Programa de Pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos; Ao Centro de Microscopia e Microanálise do IBILCE – UNESP, São José do Rio Preto – S.P., à Profª. Drª. Lilian Madi-Ravazzi pela captura das imagens no MEV (FAPESP, 95/06165-1) e à técnica Rosana pela ajuda na preparação das amostras. Aos técnicos Luiz e Ginaldo, pelo convívio diário e auxílio nas mais diferentes situações do laboratório. Às Professoras Doutoras Walkiria Hanada Viotto e Raquel Guttierres Gomes, pela atenção e pelas valiosas sugestões durante o exame geral de qualificação. Por fim, agradeço a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste projeto. RESUMO O queijo Minas frescal é um queijo tipicamente brasileiro, branco, macio e fresco e que possui ampla aceitação no mercado nacional. A redução do teor de gordura no queijo Minas frescal afeta, principalmente, o sabor, a textura e o rendimento. Uma das estratégias que vem sendo utilizadas para melhorar a qualidade de queijos com reduzido teor de gordura é a adição de substitutos de gordura. Bons resultados foram encontrados em queijos frescos que utilizaram amido como substituto. Neste trabalho, o objetivo foi estudar o efeito da redução da gordura e da adição de amido de milho ceroso nas características tecnológicas de queijo Minas frescal. Foram produzidos queijos, em três processamentos, de acordo com três tratamentos: Queijo integral (QI); queijo com teor reduzido de gordura (QL) e queijo com teor reduzido de gordura e 0,5% de amido de milho ceroso (QA). Foram realizadas análises de composição centesimal, rendimento, acidez, pH, capacidade de retenção de água, perfil de textura, microestrutura, perfil eletroforético da caseína, caracterização microbiológica e avaliação sensorial. Em geral, os tratamentos aplicados influíram nas características do queijo Minas frescal. Na composição centesimal, a redução da gordura aumentou os teores de umidade, proteínas e cinzas, enquanto que a adição de amido aumentou a umidade do queijo e promoveu, ao fim do tempo de armazenamento, maior capacidade de retenção de água (CRA), semelhante à QI, indicando que o amido, reduziu a taxa de sinérese no produto. Para todas as amostras, houve aumento da acidez, ao longo do tempo. Os queijos com baixos teores de gordura apresentaram menor rendimento que o queijo integral e a adição de amido não proporcionou aumento no rendimento. Os parâmetros de textura aumentaram com a redução do teor de gordura e não houve influência do amido na melhora destes parâmetros. Assim como não houve influência do amido na microestrutura e na proteólise dos queijos. O queijo integral apresentou uma microestrutura mais aberta e maior degradação da αS1-caseína, ao fim do armazenamento, quando comparado aos queijos light. Todas as amostras apresentaram qualidade higiênico-sanitária satisfatória, atendendo aos requisitos microbiológicos estabelecidos para queijo Minas frescal pelos Padrões Microbiológicos para Alimentos. Além disso, não houve influência do amido no aumento da aceitabilidade dos atributos sensoriais do queijo Minas frescal. De maneira geral, a redução da gordura, influenciou, principalmente, no aumento da dureza e dos teores de umidade, proteínas e cinzas e diminuiu a capacidade de retenção de água, a taxa de proteólise e o rendimento do queijo, enquanto que, a adição de 0,5% de amido de milho ceroso, aumentou a umidade e a capacidade de retenção de água do queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura. Palavras-chave: Queijos light; substituto de gordura; microestrutura; textura; avaliação sensorial. ABSTRACT Minas fresh cheese is a typical Brazilian, white, soft and fresh cheese that has wide acceptance in the national market. However, the fat reduction in Minas fresh cheese affects taste, texture and yield. An approach that has been used to improve quality of reduced fat cheeses is the addition of fat substitute. Good results were found in fresh cheeses that used starch as a substitute. In this research, the aim was to study the effect of fat reduction and waxy maize starch addition on technological characteristics of reduced fat Minas fresh cheese. Three processings were performed, according to three treatments: Full fat cheese (QI); reduced fat cheese (QL) and reduced fat cheese with 0.5 % of waxy maize starch addition (QA). Chemical composition, yield, acidity, pH, water holding capacity, texture profile, microstructure, electrophoretic profile of casein, microbiological characterization and sensory evaluation of cheeses were carried out. In general, the treatments influenced the characteristics of Minas fresh cheeses. For chemical composition, fat reduction increased moisture, protein and ash content and starch addition increased moisture and showed higher water holding capacity (WHC) at the end of storage time, similar to QI, indicating that starch reduced the rate of syneresis in the product. For all the samples, acidity increased on the storage time and pH remained constant. Reduced fat cheeses showed lower yield than full fat cheese and no increase in yield was observed with starch addition. Texture parameters increased with fat reduction. Also, no influence of starch addition on improving these parameters was observed. There was no effect of starch on cheese's microstructure and proteolysis. The full fat cheese showed a more opened microstructure and an increase in αS1-casein degradation during storage time than reduced fat cheeses. All samples showed a satisfactory sanitary quality according to the microbiological standards for Minas fresh cheese. Finally, there was no influence of waxy maize starch on improving acceptability of Minas fresh cheese sensory attributes. In general, fat reduction increased hardness, moisture, protein and ash content and reduced WHC, proteolysis rate and yield, whereas, waxy maize starch addition (0.5%) increased moisture and WHC of reduced fat Minas fresh cheese. Keywords: Reduced fat cheeses; fat substitute; microstructure; texture; sensory evaluation. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ......................................................................... 14 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 16 2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 16 2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 16 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 17 3.1 Queijo .................................................................................................................. 17 3.1.1 Queijo Minas frescal ......................................................................................... 18 3.1.1.1 Matéria-prima ................................................................................................ 19 3.1.1.2 Processamento do queijo Minas frescal ........................................................ 22 3.2 Queijos com baixo ou reduzido teor de gordura .................................................. 23 3.2.1 Estratégias para a melhoria dos queijos com reduzido teor de gordura ........... 25 3.2.1.1 Modificação no processo de produção .......................................................... 26 3.2.1.2 Adição de culturas adjuntas .......................................................................... 27 3.2.1.3 Uso de substitutos de gordura (“fat replacers”) ............................................. 28 3.3 Amido: características e propriedades como imitador de gordura ....................... 29 3.3.1 Interação entre o amido e as proteínas do leite ............................................... 33 3.3.2 Aplicação de imitadores de gordura, à base de amido, em queijos ................. 37 4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 41 4.1 Planejamento dos tratamentos experimentais ..................................................... 41 4.2 Ingredientes utilizados na fabricação do queijo Minas frescal ............................. 41 4.3 Caracterização do leite pasteurizado utilizado na fabricação dos queijos ........... 42 4.4 Preparo da cultura lática ...................................................................................... 42 4.5 Escolha do tipo de amido .................................................................................... 42 4.6 Produção dos queijos .......................................................................................... 43 4.7 Caracterização físico-química e de composição centesimal dos queijos ............ 45 4.8 Capacidade de retenção de água (CRA)............................................................. 46 4.9 Determinação do rendimento .............................................................................. 47 4.10 Caracterização do perfil de textura .................................................................... 47 4.11 Caracterização da microestrutura em microscópio eletrônico de varredura – MEV (SEM) ............................................................................................................... 47 4.12 Caracterização do perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (Urea – PAGE). ...................................................................................................................... 48 4.13 Caracterização microbiológica .......................................................................... 49 4.14 Avaliação sensorial ........................................................................................... 49 4.15 Delineamento experimental e análise estatística dos resultados ...................... 50 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 51 5.1 Composição centesimal e características físico-químicas do leite ...................... 51 5.2 Composição centesimal dos queijos ................................................................... 52 5.3 Acidez.................................................................................................................. 55 5.4 pH ........................................................................................................................ 57 5.5 Capacidade de retenção de água (CRA)............................................................. 58 5.6 Rendimento ......................................................................................................... 60 5.7 Caracterização do perfil de textura ...................................................................... 61 5.8 Caracterização da microestrutura em microscópio eletrônico de varredura – MEV (SEM) ........................................................................................................................ 64 5.9 Caracterização do perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (UREA – PAGE) ....................................................................................................................... 67 5.10 Caracterização microbiológica .......................................................................... 69 5.11 Avaliação sensorial ........................................................................................... 70 6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 73 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 74 ANEXOS ................................................................................................................... 86 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Principais substitutos de gordura utilizados em queijos light, marca comercial e propriedades funcionais ........................................................................ 29 Tabela 2 - Caracterização físico-química do leite integral e padronizado utilizados na produção dos queijos ............................................................................................... 51 Tabela 3 - Composição centesimal dos queijos ...................................................... 52 Tabela 4 - Rendimento dos queijos (kg de queijo / 100 kg de leite) ........................ 60 Tabela 5 - Perfil de textura dos queijos durante o armazenamento ........................ 62 Tabela 6 - Caracterização microbiológica dos queijos dos tratamentos QI, QL e QA ............................................................................................................................ 70 Tabela 7 - Médias dos valores para os atributos: aparência, aroma, textura, sabor e avaliação global dos queijos dos tratamentos QI, QL e QA ..................................... 71 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Perfil de formação de pasta de amido de arroz ceroso (10% p/p) em presença de proteínas do leite (10% p/p) ................................................................ 36 Figura 2 - Evolução da acidez, durante estocagem refrigerada (5 ºC), dos queijos dos tratamentos: QI - Queijo integral, QL - Queijo light e QA - Queijo light com adição de amido ................................................................................................................... 56 Figura 3 - Evolução do pH, durante estocagem refrigerada (5 ºC), dos queijos dos tratamentos: QI - Queijo integral, QL - Queijo light e QA - Queijo light com adição de amido ........................................................................................................................ 57 Figura 4 - Evolução da capacidade de retenção de água, durante estocagem refrigerada (5 ºC), dos queijos dos tratamentos: QI - Queijo integral, QL - Queijo light e QA - Queijo light com adição de amido ................................................................. 59 Figura 5 - Fotomicrografias eletrônicas de varredura de: (a) Queijo Minas frescal Integral – QI, Magnitude: 1960 x; (b) Queijo Minas frescal Integral – QI, Magnitude: 4180 x; (c) Queijo Minas frescal light – QL, Magnitude: 1420 x; (d) Queijo Minas frescal light – QL, Magnitude: 4500 x; (e) Queijo Minas frescal light com adição de amido – QA, Magnitude: 1400 x; (f) Queijo Minas frescal light com adição de amido – QA, Magnitude: 4500 x. P: Matriz proteica; G: Glóbulos de gordura; V: Espaços vazios; Fi: Filamentos proteicos; Cr: Inclusões cristalinas........................................ 65 Figura 6 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (Urea-PAGE) dos queijos Minas frescal integral (QI), light (QL) e light com adição de amido (QA) com 3, 10 e 17 dias de fabricação. (P) Padrão de caseinato de sódio ....................................... 68 14 1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA No Brasil, a produção de queijos é uma das mais importantes atividades das indústrias de laticínios. O queijo Minas frescal é um dos queijos mais consumidos no país, sendo que grande parte do elevado consumo, é atribuída ao maior rendimento de sua produção e ao baixo investimento em estocagem e conservação, que permitem sua venda a um preço mais vantajoso para o consumidor. Nos últimos anos, a busca dos consumidores por benefícios relacionados à saúde e à estética, tem aumentado a demanda de produtos com menores teores de gordura. Assim, muitas indústrias optaram por produzir queijo Minas frescal em sua variedade light, ou seja, com reduzidos teores de gordura. Porém, a remoção ou a redução da gordura afeta, principalmente, sabor, textura e rendimento dos queijos. Assim, muitas pesquisas estão sendo focadas na melhora das características dos queijos light. Três estratégias para a redução de gordura, com melhoramento da qualidade sensorial e do rendimento vêm sendo utilizadas: modificação no processo de produção, uso de culturas adjuntas e uso de repositores de gordura. Diferentes tipos de repositores de gordura estão disponíveis no mercado e sua classificação está baseada, principalmente, na natureza química e na origem do produto, juntamente com seu valor energético. Eles são tecnicamente divididos em duas classes: “imitadores de gordura”, que possuem boas propriedades gelificantes e emulsificantes, aliadas ao baixo valor energético e que compreendem os carboidratos (amido, gomas, pectina, derivados da celulose e outros hidrocoloides) e as proteínas (microparticuladas ou não, de leite, ovo e milho) e “substitutos de gordura”, que fornecem propriedades semelhantes às da gordura e são, primariamente, compostos com ligações ésteres modificadas ou ainda, gorduras naturais. Alguns trabalhos vêm sendo desenvolvidos no Laboratório de Leite e Derivados do DETA-UNESP, com a utilização de substitutos de gordura visando melhorar as características dos queijos com reduzido teor de gordura, tais como: o estudo do efeito da adição de concentrado proteico de soro (CPS) sobre a qualidade que queijo Prato com teor reduzido de gordura (MENIS, 2009), efeito da adição de colágeno hidrolisado e concentrado proteico de soro (CPS) sobre a qualidade 15 tecnológica de queijo Prato com reduzido teor de gordura (DIAMANTINO, 2011 - FAPESP 2009/03994-1) e o estudo do efeito de colágeno na qualidade do queijo Minas frescal (SILVA, 2011). Atualmente, os amidos são adicionados em diversos alimentos, principalmente produtos lácteos. Sua ação na melhora das características dos produtos com reduzidos teores de gordura está associada à sua alta capacidade de retenção de água, que aumenta a umidade, melhorando a textura e conferindo maior estabilidade ao produto final. Além disso, o amido possui a vantagem de ser um ingrediente de baixo custo e de alta disponibilidade. Relatos disponíveis na literatura indicam resultados positivos para o uso de diferentes tipos de amido, como imitadores de gordura em queijos, porém, não foram encontrados trabalhos com a aplicação de amidos em queijo Minas frescal. O amido de milho ceroso se difere dos amidos normais, que contém de 20 a 30% de amilose, por conter apenas traços de amilose. Devido a esta composição única, além de sua contribuição para o aumento da viscosidade, possui outros importantes atributos, tais como: fácil gelatinização, melhor digestibilidade e difícil retrogradação, sendo por isso muito utilizado em produtos que necessitam de armazenamento sob refrigeração, como é o caso do queijo Minas frescal. Assim, o estudo do efeito da adição de amido de milho ceroso, como imitador de gordura, nas características físico-químicas, sensoriais, de textura e microestrutura de queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura pode resultar em contribuições para a área de laticínios, pelo potencial de melhorar a qualidade dos produtos a serem desenvolvidos, principalmente em relação à redução da sinérese, melhora no rendimento e aumento da maciez. 16 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Estudar o efeito da redução do teor de gordura e da adição de amido de milho ceroso, na qualidade tecnológica de queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura. 2.2 Objetivos Específicos � Produzir queijo Minas frescal: integral, light e light com adição de amido de milho ceroso; � Verificar o efeito da remoção da gordura, assim como, o efeito da adição de 0,5% de amido de milho ceroso na composição centesimal, acidez, pH, capacidade de retenção de água, rendimento, textura, microestrutura, perfil eletroforético da caseína e análise sensorial do queijo Minas frescal. 17 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Queijo Do ponto de vista da tecnologia de alimentos, o queijo pode ser definido como um concentrado lácteo constituído de proteínas, lipídios, cálcio, fósforo e vitaminas. A coagulação é a etapa que visa concentrar a proteína do leite retendo a gordura e os outros compostos e, por isso, é considerada primordial na produção de queijos. A caseína, proteína responsável pela coagulação, representa, aproximadamente, 80% das proteínas do leite, sendo, αS1-, αS2-, ß- e κ-caseína as principais frações de caseína e encontram-se nas proporções estimadas de 45%, 12%, 35% e 8%, respectivamente. A fração “kapa”, embora em menor quantidade, exerce um importante papel protetor sobre as outras frações de caseína, pela formação de um complexo estável, denominado micela e evitando que as demais frações se precipitem em presença de cálcio solúvel. Assim, o fenômeno da coagulação do leite se deve basicamente à perda dessa estabilidade da caseína em função de vários agentes físicos e/ou químicos, dos quais a acidificação e a ação de enzimas proteolíticas são os mais interessantes (OLIVEIRA, 1986; FARRELL et al., 2004; PERRY, 2004). Basicamente, a coagulação enzimática ocorre quando enzimas proteolíticas (mais comumente a quimosina) atuam hidrolisando ligações peptídicas da caseína, transformando-a em para-caseína, que precipita em presença de íons Ca2+ formando, então a coalhada. Enquanto que, na coagulação ácida é adicionado ácido ao leite em quantidade suficiente para igualar o pH do meio ao ponto isoelétrico da proteína (pH 4,5). Neste pH as micelas de caseína se agregam e precipitam (PERRY, 2004). Embora a coagulação do leite seja semelhante, tanto na coagulação ácida como na enzimática, o coágulo resultante apresenta características físico-químicas e tecnológicas diferentes. A primeira diferença é no pH, sendo no coágulo ácido em torno de 4,6 e no coágulo enzimático próximo ao pH do leite, ou seja, na faixa de 6,0 a 6,5. A segunda diferença é na consistência do coágulo, de grande importância tecnológica. O coágulo ácido é inicialmente bastante frágil, dispersando-se facilmente em partículas finamente subdivididas. Entretanto, se for fracionado 18 cuidadosamente provocando a dessora, resulta em um precipitado ressecado e firme, porém quebradiço. O coágulo enzimático desde o início é mais firme e elástico, semelhante a uma gelatina, a qual vai se tornando cada vez mais resistente e ao ser fracionado, se contrai por sinérese, dando origem a um precipitado consistente, elástico e não quebradiço (OLIVEIRA, 1986). 3.1.1 Queijo Minas frescal O queijo Minas frescal é um dos produtos lácteos mais difundidos no Brasil e é considerado o único queijo genuinamente nacional (DORNELLAS, 1997). Possui ampla aceitação no mercado nacional, sendo o quinto queijo mais produzido no País, inferior apenas aos tipos Mussarela e Prato e aos requeijões culinário e cremoso (SEBRAE; ESPM, 2008). O elevado consumo está relacionado, em parte, ao maior rendimento obtido na elaboração deste queijo, ao seu processamento simples e ao baixo investimento em estocagem e conservação, o que possibilita um retorno rápido do investimento e, consequentemente, custos menores ao consumidor (BEHMER, 1991; FURTADO; LOURENÇO NETO, 1994). É um queijo classificado como semi-gordo e de muita alta umidade, contendo de 25 a 49% de gordura e teor de umidade maior que 55% (BRASIL, 1996; BRASIL, 1997). Geralmente apresenta coloração esbranquiçada, consistência mole e úmida, textura fechada e com poucas olhaduras mecânicas e sabor suave, levemente ácido e salgado. É produzido por coagulação enzimática de leite pasteurizado com renina e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas (CUNHA; VIOTTO; VIOTTO, 2006) e, tradicionalmente, utiliza cultura starter mesofílica acidolática do tipo O (FURTADO; LOURENÇO NETO, 1994; BURITI; ROCHA; SAAD, 2005; CUNHA; VIOTTO; VIOTTO, 2006). Por ser um produto fresco, de massa crua e de muita alta umidade deve ser consumido nos primeiros quinze dias após sua fabricação, pois é altamente perecível. Além disso, deve ser mantido sob refrigeração a fim de prevenir o desenvolvimento de micro-organismos e retardar os fenômenos bioquímicos que ocorrem durante o armazenamento. Os principais fenômenos são a proteólise e a acidificação, que influenciam diretamente na qualidade do produto final, causando alterações no produto, tais como, amarelamento da casca, maciez excessiva e sabor 19 acentuadamente ácido (BRASIL, 1996; DORNELLAS, 1997; PERRY, 2004; SANGALETTI et al., 2009). Embora o queijo Minas frescal possua um curto tempo de vida útil e não seja submetido ao processo de maturação, o alto teor de umidade deste queijo associado à utilização de coagulantes proteolíticos e cultura láctica, produzem uma proteólise acentuada (DORNELLAS, 1997). Inicialmente, as caseínas são hidrolisadas pela atividade do coagulante residual, pela plasmina e por outras enzimas endógenas proteolíticas, a uma série de grandes e médios peptídeos. Estes últimos, por sua vez, são hidrolisados a peptídeos menores e aminoácidos por proteases e peptidases de bactérias acidoláticas adicionadas e por bactérias provenientes de contaminação eventual (UPADHYAY et al., 2004). Enquanto que, a acidificação ocorre devido à transformação da lactose em ácido lático pela ação da biota natural do leite e da cultura lática, contribuindo para a conservação e a formação de sabor e textura característicos do produto. A acidez produzida durante a coagulação é baixa, em torno de 0,2%, podendo atingir aproximadamente 1,0% durante a dessora do queijo, sob armazenamento refrigerado (FURTADO; LOURENÇO NETO, 1994). 3.1.1.1 Matéria-prima a) Leite O leite utilizado na produção de queijo Minas frescal deve ser, obrigatoriamente, pasteurizado, já que este é um queijo fresco e não passa por processo de maturação. Porém, é necessário evitar tratamentos térmicos com temperaturas acima das mínimas exigidas para a pasteurização (72 °C por 15 segundos ou 63 °C por 30 minutos), a fim de não prejudicar a característica do coágulo, o qual se torna cada vez mais frágil à medida que o tratamento térmico se torna mais severo. Outros fatores atribuídos ao emprego de temperaturas elevadas ao leite são: a deficiência de cálcio solúvel e a destruição de micro-organismos láticos importantes na produção de sabor e aroma aos queijos, entretanto, ambas as deficiências podem ser corrigidas com a adição de cloreto de cálcio e o emprego de culturas láticas (OLIVEIRA, 1986). 20 Além disso, o leite deve ser de boa qualidade, sendo que, sua qualidade está diretamente relacionada a vários fatores, tais como: espécie e saúde do animal, fase de lactação, clima, estação do ano e práticas leiteiras. A principal variação observada é na relação gordura / caseína. Pelo fato dos constituintes da coalhada (gordura, sais e água), ficarem retidos no retículo caseico, o que realmente tem importância na manutenção da qualidade do queijo é a relação existente entre a gordura e a proteína. Se esta relação não se encontra definida, o queijo obtido será demasiadamente macio ou excessivamente duro (ROBINSON; WILBEY, 2002). O ideal para a produção de queijo Minas é um teor de gordura entre 3 e 4% (OLIVEIRA, 1986). Finalmente, o leite deve ser livre de contaminação bacteriana ou por agentes químicos, como antibióticos, herbicidas, pesticidas, etc. No caso dos antibióticos, se estes forem administrados ao gado, deve haver um período em que o leite não poderá ser utilizado, pois os resíduos poderão inibir o desenvolvimento da cultura starter (PERRY, 2004). b) Cultura lática Em queijos frescos, a principal ação da cultura lática é na taxa de formação de ácido no leite. A duração do processo de formação do coágulo é influenciada pela acidificação, já que, a renina é mais ativa em baixos valores de pH. Além disso, a composição do queijo, como o conteúdo de água, de fosfato de cálcio e o pH também são afetados pelo processo de acidificação (OLIVEIRA, 1986; WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006). Para o queijo Minas, a cultura lática é constituída de cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris. Cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis produzem ácido rapidamente, diminuindo desta forma, o tempo de coagulação, porém algumas cepas produzem a bacteriocina nisina, que pode afetar o desenvolvimento de outras espécies Gram-positivas presentes, enquanto que, outras cepas, podem ainda originar gosto amargo ao queijo. Cepas de Lactococcus lactis subsp. cremoris desenvolvem-se mais lentamente no leite, porém, produzem queijos com melhores sabores e aromas. Além, disso, é importante ressaltar que o uso de culturas mistas produz mais ácido que o uso de culturas baseadas em apenas uma espécie. Por isso, é muito comum o uso de uma 21 combinação de cepas adequadas de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris (ROBINSON; WILBEY, 2002; BURITI; ROCHA; SAAD, 2005). c) Cloreto de cálcio O cálcio solúvel possui um papel importante na coagulação do leite e nos processos subsequentes. O cálcio solúvel pode encontrar-se deficiente, principalmente em leites pasteurizados. Assim, é comum utilizar a relação de 25 g de cloreto de cálcio para 100 L de leite. Esta é uma pequena quantidade quando comparada à concentração natural encontrada no leite cru, de 1200 mg/L, entretanto, esta adição de cálcio ao leite pasteurizado irá promover um aumento na concentração de cálcio solúvel ionizado e uma redução do pH do leite (OLIVEIRA, 1986; FOX; COGAN, 2004). Esta redução do pH do leite é benéfica, pois, acelera a reação de hidrólise da κ-caseína, enquanto o aumento da concentração de cálcio solúvel irá reduzir o tempo de coagulação, mesmo em pH constante, e aumentar a firmeza do coágulo, principalmente pela neutralização das cargas negativas da superfície da micela e, possivelmente, pela formação de pontes de cálcio (LUCEY, 2011). d) Coalho Diversas proteinases são capazes de coagular o leite, mas, somente muito poucas são adequadas à fabricação de queijos. Tradicionalmente o coalho é extraído do tecido gástrico de ruminantes jovens, onde a principal enzima é a renina ou quimosina. Embora a quimosina extraída do estômago de bezerros ainda seja a responsável pela produção dos queijos de melhor qualidade, atualmente, encontram-se disponíveis no mercado, quimosinas produzidas por fermentação e por engenharia genética (FOX; COGAN, 2004; PERRY, 2004). O processo de coagulação é dependente da temperatura, do pH e do teor de cálcio do leite. A temperatura ótima de ação do coalho é em torno de 40 °C, mas costuma-se utilizar para a produção do queijo Minas frescal temperaturas ligeiramente mais baixas (em torno de 35 °C) para evitar que a coalhada fique muito dura (PERRY, 2004). 22 A quantidade de coalho a ser utilizada deve ser calculada para obtenção de um tempo de coagulação em torno de 45 minutos, lembrando que variações na temperatura interferem significativamente, havendo aumento na velocidade de coagulação com aumento da temperatura. Antes de ser adicionado ao leite o coalho deve ser diluído, visando facilitar a distribuição e evitar a formação de flocos de coágulo no primeiro contato do coalho concentrado com o leite. Além disso, o coalho diluído também deve ser adicionado aos poucos com agitação eficiente do leite, a fim de conseguir uma completa distribuição. Porém, essa agitação não deve demorar mais do que 2 a 3 minutos para não interferir no processo de coagulação (OLIVEIRA, 1986). 3.1.1.2 Processamento do queijo Minas frescal Após ser submetido ao processo de pasteurização, o leite é levado aos tanques de coagulação, que geralmente são de parede dupla com circulação de água quente ou vapor para a manutenção da temperatura do leite. Uma vez no tanque de coagulação e ajustada a temperatura, o leite receberá os demais ingredientes: o cloreto de cálcio, a cultura lática e o coalho. É necessário evitar qualquer agitação ou distúrbio mecânico no leite durante a coagulação, pois isso, normalmente acarreta na diminuição da consistência e elasticidade do coágulo resultante. Assim, após a adição do coalho, o leite fica em completo repouso até o ponto final da coagulação, que normalmente ocorre em 45 minutos, e é observado em função da consistência do coágulo formado, que na prática, é determinado pelo ponto de corte da massa (OLIVEIRA, 1986). O principal método empregado pelos mestres queijeiros para a visualização do ponto de corte é a introdução, de uma espátula abaixo da camada superficial do coágulo e o seu levantamento cuidadoso para que se forme uma fenda. Uma fenda retilínea e limpa, com soro esverdeado, indica uma coalhada pronta para o corte, enquanto que uma ruptura fraca e irregular, com soro esbranquiçado, indica que a coalhada está fraca e ainda não atingiu o ponto de corte (ROBINSON; WILBEY, 2002). Após atingir o ponto de corte, o coágulo deve ser então fracionado ou subdividido, visando acelerar o fenômeno da sinérese, que promoverá a dessora da 23 massa. A dessora será mais intensa quanto maior for a superfície total do coágulo, ou seja, maior subdivisão. No caso do queijo Minas, os cubos são maiores, com 1 a 1,5 cm de aresta, por ser um queijo de muita alta umidade. A execução do corte deve ser cuidadosa, evitando a fragmentação desordenada da massa, o que aumenta as perdas de massa finamente subdividida no momento da separação do soro. A fim de evitar que os grãos se compactem, dificultando a dessora é necessária a agitação dos grãos. Esta agitação deve ser lenta e cuidadosa inicialmente, tornando-se mais intensa à medida que os grãos se tornam mais firmes (OLIVEIRA, 1986; FOX; COGAN, 2004). A salga, em geral, é realizada após a prensagem, utilizando-se o método da salga seca ou por salmoura. Entretanto, tecnologicamente, o melhor momento para se realizar a salga é diretamente na massa, logo após sua separação do soro, antes da enformagem, o que permite melhor dosagem e melhor distribuição do sal, além de ser um método mais prático, pois dispensa tanques de salmoura e prateleiras para salga. Em geral, o queijo Minas contém entre 1,4 a 1,6% de sal, assim, utiliza- se cerca de 2,5 a 3% de sal, calculado em relação à massa, pois parte deste sal será perdida através da saída de soro, durante as etapas de enformagem e prensagem (OLIVEIRA, 1986; PERRY, 2004; CARVALHO; VIOTTO, KUAYE, 2007). Ao se atingir o ponto da massa, o soro é retirado e a massa é colocada nas formas. Neste tipo de queijo, a prensagem é dispensada e o queijo é compactado pelo seu próprio peso através de várias viragens. Normalmente, o queijo Minas é comercializado em embalagem a vácuo, de 300 g a 5 kg, apresentando vida de prateleira muito curta, de aproximadamente duas semanas mesmo sob refrigeração a 5 ºC (OLIVEIRA, 1986). 3.2 Queijos com baixo ou reduzido teor de gordura Em função dos benefícios à saúde e à estética, especialistas em todo o mundo tem recomendado a redução da ingestão de gordura, especialmente, das gorduras saturadas. Assim, houve um aumento na procura dos consumidores por alimentos com baixos teores de gordura (ROSENTHAL, 2003; O’CONNOR; O’BRIEN, 2011). Consequentemente, a este desejo de consumo de produtos saudáveis, a busca por queijos com baixo ou reduzido teor de gordura tem 24 aumentado consideravelmente. Por definição, o “Queijo com baixo teor de gordura” deve possuir redução de pelo menos 50% de gordura na matéria seca, quando comparada à sua variedade integral, enquanto que o “Queijo com reduzido teor de gordura” ou “light” deve possuir ao menos 25 % de redução de gordura na matéria seca. Entretanto, consumidores esperam que esses produtos possuam atributos sensoriais praticamente idênticos aos dos queijos com teor integral de gordura. Porém, estas especificações, em geral, não são alcançadas de forma consistente para a grande maioria dos queijos, especialmente para aqueles com reduções maiores que 50% (MISTRY, 2001; JOHNSON, 2002). Isso por que, além de sua contribuição energética, a gordura possui um papel fundamental na melhora da palatabilidade, textura e lubrificação dos alimentos, influenciando principalmente em sua cremosidade, aparência, aroma, odor, maciez e suculência, o que a torna um componente essencial nos alimentos. Além disso, contribui para a sensação de saciedade, após sua ingestão, e é fonte de ácidos graxos essenciais e vitaminas lipossolúveis (PINHEIRO; PENNA, 2004; O’CONNOR; O’BRIEN, 2011). Nos queijos, os principais efeitos negativos da redução do teor de gordura são observados com relação às características sensoriais, porém, essa redução também pode proporcionar consequências econômicas, tais como, baixo rendimento e maturação lenta. Com relação aos defeitos sensoriais, esses queijos, geralmente possuem aroma fraco, sabores atípicos e uma textura mais firme e elástica, descrita como “borrachenta”, sendo esses defeitos mais acentuados nas variedades maturadas (RODRÍGUEZ, 1998; PINHEIRO; PENNA; 2004). O sabor pode ser prejudicado pelo rápido crescimento da cultura adicionada, em função da maior umidade características desses queijos, acelerando a produção de ácidos, que podem culminar com o desenvolvimento de gosto amargo (ROSENTHAL, 2003). Outro fator é que o gosto amargo, assim como sabores e aromas indesejados, são mais facilmente detectados devido à baixa proporção de compostos aromáticos formados pela degradação da gordura, principalmente, ácidos graxos, tais como o butanoico e o hexanoico e metilcetonas (RODRÍGUEZ, 1998; MISTRY, 2001). A maior umidade desses queijos também pode intensificar a sinérese. A sinérese é a saída de soro que ocorre nos queijos em condição de repouso, sendo considerada um fenômeno indesejável quando relacionada à aparência dos produtos durante a comercialização (DEJMEK, WALSTRA, 2004). 25 Além disso, o rendimento é menor nos queijos com baixos teores de gordura pois, com a retirada da gordura, a relação caseína / gordura se torna muito mais alta, quando comparada aos queijos com teor integral de gordura e, em razão disto, a gordura é substituída por água e o rendimento total (kg de queijo por kg de leite) se torna baixo, já que o total de gordura removida não é igual ao de água adicionada (MISTRY, 2001). Finalmente, a textura desses queijos pode ser caracterizada como borrachenta. Em geral, os queijos com teores reduzidos de gordura são excessivamente secos e granulosos, devido a uma matriz estrutural mais densa (RODRÍGUEZ, 1998). Isto porque a gordura, mesmo sem nenhum papel na formação da rede tridimensional, ao encontrar-se, aprisionada mecanicamente na matriz, promove uma maciez típica dos queijos integrais. Dessa forma, ao ser removida, permite uma maior interação entre as proteínas e, portanto, a estrutura do queijo se torna relativamente mais firme e elástica em função do aumento e intensidade das ligações (PINHEIRO; PENNA, 2004). A matriz dos queijos pode ser visualizada e consequentemente, compreendida, através do estudo da microestrutura. A análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) é considerada uma ferramenta importante na análise da microestrutura dos queijos, pois, fornece alta resolução de imagens, proporcionando a visualização da rede proteica, onde se encontram dispersos os bolsões de soro, glóbulos de gordura e bactérias acidoláticas (IMPOCO et al., 2011). A textura dos produtos ainda pode ser avaliada pelo perfil de textura (TPA). Este método instrumental determina os parâmetros de textura, através da simulação de uma avaliação sensorial, como por exemplo, a simulação da mastigação (FAGAN et al., 2007). 3.2.1 Estratégias para a melhoria dos queijos com reduzido teor de gordura Com o intuito de melhorar os aspectos negativos dos queijos com teores reduzidos de gordura, algumas alternativas vêm sendo propostas nos últimos anos. Em geral, as estratégias mais utilizadas para a redução de gordura nos queijos são: mudanças no processo de produção, o uso de culturas adjuntas, o uso de substitutos de gordura ou o uso de novas tecnologias. Porém, nenhuma destas 26 estratégias consegue substituir totalmente todas as funções e propriedades da gordura nos alimentos (DRAKE; SWANSON, 1995; RODRÍGUEZ, 1998). 3.2.1.1 Modificação no processo de produção As modificações no processo de produção são potencialmente as formas mais simples e econômicas de se melhorar o sabor e a textura de queijos light. A maioria das modificações está focada em um dos dois parâmetros críticos da redução da gordura nesses produtos, a umidade e o teor de acidez. O aumento do teor de umidade pode proporcionar parte da lubrificação e cremosidade características da gordura. Além disso, pode auxiliar no aumento do rendimento. Muitos são os processos que promovem o aumento da umidade nesses produtos, tais como: redução do tempo de tratamento da massa, redução da temperatura de cozimento, lavagem da massa com água fria, pré-acidificação do leite, uso de temperaturas mais altas na pasteurização do leite, menor manipulação do coágulo e redução do tempo de prensagem. Entretanto, essas modificações devem ser estudadas e reguladas com precisão para evitar problemas na coagulação do leite, perdas de rendimento e defeitos na qualidade sensorial (DRAKE; SWANSON, 1995; RODRÍGUEZ, 1998). O desenvolvimento de ácido é outro parâmetro crítico nos queijos com reduzido e baixo teor de gordura. Pelo fato dos queijos possuírem maior umidade e por serem produzidos com temperaturas mais baixas, as bactérias acidoláticas podem se propagar em grande número, produzindo um excesso de ácido e de sabores desagradáveis. Desta forma, é essencial a manutenção de uma forte capacidade tamponante no queijo, com baixa taxa de acidificação, durante o processo de produção, prevenindo a intensidade do gosto ácido. Mudanças no processo como: uso de menor quantidade de culturas láticas, uso de linhagens especiais de bactérias acidoláticas, redução do tempo de maturação, redução do tempo de agitação da massa e lavagem da massa, são utilizadas para este controle na produção de acidez (DRAKE; SWANSON, 1995). Outra alternativa de modificação de processo que pode ser empregada é a homogeneização do leite, antes do processo de fabricação do queijo. Este procedimento ajuda a reduzir as perdas de gordura no soro, aumentando o 27 rendimento e melhorando a textura e o corpo dos queijos com baixos teores de gordura. Enquanto este processo não é considerado desejável na maioria dos queijos com gordura integral, algumas condições de homogeneização podem ser utilizadas em variedades de queijos com reduzidos teores de gordura. A homogeneização promove a formação de gotículas menores de gordura, proporcionando a estabilização destas gotículas em meio ao soro e às proteínas caseicas. Próximas às caseínas, as gotículas de gordura, podem se envolver na formação do gel e influenciar no desenvolvimento da matriz coagulada (RODRÍGUEZ, 1998; MISTRY, 2001; HORNE; BANKS, 2004). A ultrafiltração do leite também é uma alternativa utilizada para melhorar a qualidade dos queijos com baixos teores de gorduras e é um processo de separação em que os constituintes são fracionados de acordo com seu peso molecular. Proteína e gordura são retidas no retentado e lactose, minerais e vitaminas são divididas entre retentado e permeado. Essa técnica apresenta como principal vantagem, a inclusão das proteínas do soro do leite, que podem aumentar o rendimento e melhorar a textura do produto, tornando-o mais macio (KIKUCHI, 2008). 3.2.1.2 Adição de culturas adjuntas A adição de culturas adjuntas é outro método proposto para a melhora dos queijos com baixos teores de gordura. Basicamente, estas culturas promovem o desenvolvimento de compostos aromáticos e de sabor através do aumento da proteólise, especificamente da atividade da aminopeptidase, que reduz o amargor e aumenta as concentrações de peptídeos específicos e precursores de compostos voláteis de sabor e aroma desejáveis, respectivamente. Assim, as culturas adjuntas selecionadas para a produção de queijos com redução de gordura, devem ser capazes de sofrer autólise em baixas temperaturas e alto teor de umidade, além de possuírem baixa atividade proteolítica e alta atividade peptidolítica. As culturas mais comumente utilizadas são as espécies de Lactobacillus, tais como a mesofílica: Lactobacillus casei e as termofílicas: Lactobacillus helveticus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (DRAKE; SWANSON, 1995; RODRÍGUEZ, 1998; MISTRY, 2001; ROSENTHAL, 2003). 28 3.2.1.3 Uso de substitutos de gordura (“fat replacers”) Uma abordagem alternativa aos métodos apresentados é o uso de substitutos de gordura ou “fat replacers”. O substituto de gordura é um ingrediente que pode ser incorporado aos alimentos tradicionais, para substituição total ou parcial da gordura e que tem a função de conferir as características funcionais dos lipídios, com relação ao rendimento, características sensoriais e aceitação comercial, fornecendo, no entanto, menores calorias que a gordura. Segundo a American Dietetic Association, a maioria dos substitutos de gordura, quando usados com moderação, por adultos, é considerada segura e pode desempenhar um importante papel na redução do teor de gordura nos alimentos, contribuindo assim, com a redução do total de gordura ingerida na dieta (AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION REPORTS, 2005; O’CONNOR; O’BRIEN, 2011). Existem diversas categorias de substitutos de gordura e, muitas vezes, há confusão a respeito de como as categorias são definidas (AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION REPORTS, 2005). Cada categoria de substituto de gordura proporciona diferentes características sensoriais e funcionais aos produtos com baixos e reduzidos teores de gordura. Assim, os substitutos de gordura podem ser divididos, de acordo com sua composição, em três categorias: à base de carboidratos, como os hidrocoloides; à base de proteínas, como as proteínas microparticuladas, e à base de gorduras, como os poliésteres de sacarose. Os substitutos de gordura à base de carboidratos e proteínas são conhecidos como imitadores de gordura (“fat mimetics)”, uma vez que não conseguem substituir a funcionalidade da gordura nos alimentos, porém, promovem boa emulsificação e propriedades de gel, com baixo valor energético. Os substitutos à base de gordura são conhecidos como os “verdadeiros” substitutos de gordura (“fat substitute”) e podem substituir a gordura nos alimentos em peso por peso, promovendo propriedades similares às da gordura, com baixo ou nenhum valor energético. Não necessariamente os substitutos irão proporcionar os sabores e aromas característicos dos produtos tradicionais, uma vez que, estes atributos estão relacionados à presença coletiva de múltiplos compostos lipossolúveis no produto, sendo improvável que todos sejam repostos com um único composto: natural ou sintético. Assim, na prática, é comum o uso de uma combinação de estratégias, tais como: o uso de diferentes técnicas de modificação de processo e/ou adição de 29 culturas adjuntas, aliados ao uso dos substitutos de gordura, para a produção de produtos de boa qualidade, com reduzido teor de gordura (DRAKE; SWANSON, 1995; ROSENTHAL, 2003; PINHEIRO; PENNA, 2004). Informações mais detalhadas sobre as propriedades e aplicações de substitutos de gordura em produtos lácteos foram publicadas por Pinheiro e Penna (2004) e Diamantino e Penna (2011). Exemplos dos substitutos de gordura mais comumente utilizados em queijos light encontram-se na Tabela 1. Tabela 1 - Principais substitutos de gordura utilizados em queijos light, marca comercial e propriedades funcionais. Tipo de substituto Marca comercial Propriedade funcional À base de proteínas Proteínas de leite Dairy-Lo Melhora a textura Proteínas de ovos Simplesse Melhora a textura Proteínas de leite e ovos Trailblazer Inibe a sinérese e melhora a textura Proteínas de milho LITA Melhora a textura e a estabilidade térmica À base de carboidratos Maltodextrina Maltrin Melhora a textura Carboximetilcelulose - Melhora a textura Carragena - Melhora a textura β-glucana Nutrim Melhora a textura Amido modificado Stellar Melhora a textura, imitando a sensação de gordura na boca Gel de celulose, goma guar Novagel Melhora a textura, imitando a sensação de gordura na boca À base de gorduras sintéticas Poliéster de sacarose Olestra,Olean, Benefat, Dur-Em Melhora a textura Dialquil di-hexadecil malonato DDM Melhora a textura Fonte: Diamantino; Penna (2011). 3.3 Amido: características e propriedades como imitador de gordura O amido é o hidrocoloide alimentício mais comumente usado devido à ampla faixa de propriedades funcionais que ele pode promover em suas formas natural e modificada, e também devido ao seu baixo custo. É a fonte de reserva mais importante dos vegetais e pode ser encontrado em raízes, sementes e tubérculos. É constituído por uma mistura dos polissacarídeos: amilose e amilopectina (RIBEIRO; SERAVALLI, 2004). A amilose possui uma estrutura linear composta de unidades de 30 glicose com ligações glicosídicas α-1,4 formando assim, uma cadeia com unidades de maltose. A amilopectina possui uma estrutura ramificada, formada por cadeias de glicose, unidas por ligações glicosídicas α-1,4 na parte linear, enquanto as ramificações são unidas por ligações glicosídicas α-1,6 (BOBBIO; BOBBIO, 1992). O amido distingue-se entre os carboidratos por ocorrer na natureza na forma de partículas características denominadas grânulos. A estrutura granular dos amidos é dependente da origem botânica. Os grânulos de amido são insolúveis, hidratando- se muito pouco em água fria. Dessa forma, a capacidade do amido de aumento da viscosidade (capacidade espessante) é obtida apenas quando a suspensão de grânulos é aquecida (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; ROCHA, 2010). Durante o aquecimento de suspensões de amido em excesso de água, ocorre a gelatinização do amido, ou seja, o inchamento dos grânulos com a concomitante solubilização da amilose e da amilopectina, que induzem à perda da integridade granular do amido, com a ocorrência da formação de uma pasta viscosa (FRANCO et al., 2001). Caso ocorra o resfriamento, ou ainda, o congelamento, os polímeros do amido se reagrupam, liberando água e danificando o gel formado, sendo este fenômeno conhecido como retrogradação (SILVA et al., 2006). A amilopectina, geralmente contribui com uma consistência gomosa ou pegajosa, devido à sua solubilidade. A amilose é o componente que irá contribuir para as características de gelatinização. Assim, amidos com variados conteúdos de amilose proporcionam diferentes texturas aos alimentos (PINHEIRO; PENNA, 2004). O teor de amilose nos grânulos de amido varia de acordo com a fonte vegetal de origem, mas geralmente, encontra-se nos intervalos de 20-30% em amidos comuns de cereais. O amido de milho contém entre 25 a 28% de amilose, enquanto o de mandioca possui apenas 17%. Algumas variedades de milho, cevada e arroz, referidas pelo termo “ceroso” ("waxy") são constituídas totalmente por amilopectina, enquanto outros amidos possuem teores de amilose acima de 50% e são denominados de “high-amilose”. Estes amidos, por apresentarem diferentes teores de amilose, possuem propriedades funcionais distintas. O amido de milho comum se caracteriza pela formação de um gel consistente e é bastante utilizado em sopas desidratadas e molhos que requerem viscosidade à quente. Para produtos que necessitam de armazenamento sob refrigeração, esse amido não é muito indicado devido à sinérese, que ocorre em consequência do fenômeno da retrogradação. Nesses casos, é mais indicado o uso do amido de milho ceroso que apresenta maior 31 estabilidade em baixas temperaturas, pelo fato de praticamente não possuir amilose. Os géis obtidos com esse amido são fracos, altamente viscosos no cozimento, claros e coesivos. Os amidos “high-amilose” gelificam e formam filmes com facilidade devido ao alto conteúdo de amilose. Por isso, esses amidos são usados principalmente em produtos como nuggets, aos quais confere crocância e previne a penetração excessiva de óleo durante a fritura. Também são muito utilizados na indústria de balas de gomas, contribuindo com 25 a 50% do total de amido utilizado nas formulações (WEBER; COLLARES-QUEIROZ; CHANG, 2009). Além do teor de amilose e da fonte botânica, diversas propriedades podem ser obtidas dependendo do tipo e grau de modificação aplicado ao amido (LIMA; NASSU, 1996). Os amidos modificados são produtos obtidos a partir do amido com a finalidade de atender às necessidades específicas da indústria de alimentos. Os amidos podem ser modificados enzimaticamente, fisicamente ou quimicamente. As modificações mais comumente aplicadas são: hidrólise ácida ou enzimática, oxidação, formação de ligações cruzadas, esterificação, eterificação, adição de grupos hidrofóbicos, pré-gelatinização, atrito mecânico, microparticulação, entre outras (FRANCO et al., 2001; RIBEIRO; SERAVALLI, 2004). Os amidos nativos e os modificados possuem várias aplicações em produtos alimentícios como agentes adesivos, ligantes e formadores de filmes, além de atuarem como gelificantes, espessantes, retentores de umidade e retardadores da retrogradação de alguns alimentos (WEBER; COLLARES-QUEIROZ; CHANG, 2009). Assim, as principais propriedades do amido como imitador de gordura são resultantes da associação da água com as moléculas dos carboidratos e da solubilização das moléculas de amilose, que são lixiviadas do grânulo para a fase aquosa externa. Isso resulta em um aumento substancial da retenção de água e da viscosidade do sistema (FRANCO et al., 2001). Esse aumento no teor de umidade é fundamental para a melhora da textura e do rendimento dos queijos com reduzido e baixo teor de gordura (DRAKE; SWANSON, 1995). Amidos modificados quimicamente e/ou fisicamente demonstraram possuir um maior potencial de aplicação como imitadores de gordura (O’CONNOR; O’BRIEN, 2011). Acredita-se que amidos modificados com grânulos de diâmetro similares aos dos glóbulos de gordura (2 μm) teriam o potencial de se comportarem como a gordura, proporcionando sensação de lubrificação e melhora na viscosidade, 32 textura, palatabilidade e aumento na estabilidade, sendo esse tamanho de partícula, geralmente alcançado através de hidrólise ácida ou enzimática, atrito mecânico ou microparticulação do amido (LIMA; NASSU, 1996; PINHEIRO; PENNA, 2004). O amido octenil succinilado (amido OS) também pode ser utilizado em alimentos como substituto de gordura. É produzido pela substituição de parte do amido com anidrido octenil succínico (OSA). Atualmente, este amido modificado pode ser utilizado em vários países com um máximo permitido de 3% de substituição com OSA, em relação ao peso seco de amido. A natureza bifuncional deste amido, ao mesmo tempo hidrofílico (devido à glicose presente na cadeia do amido) e hidrofóbico (devido à porção do amido substituída por OSA), permite diversas aplicações na área de alimentos, tais como: emulsão em bebibas, encapsulação de aromas, agente de corpo, molhos para salada, cremes e coberturas (CHUNG et al., 2010). Um amido que tem se mostrado promissor na área de alimentos é o amido de milho ceroso que, devido à sua composição única (apenas traços de amilose), além de contribuir para o aumento da viscosidade, possui outros importantes atributos, tais como: fácil solubilização e espessamento, melhor digestibilidade que os amidos normais e difícil retrogradação, o que se torna uma vantagem para produtos como o queijo Minas frescal que necessitam de refrigeração (WANG et al., 2010). As soluções de amido ceroso, em geral, não desenvolvem estrutura de gel forte, pois a fase contínua das soluções de amido ceroso são essencialmente cadeias de amilopectina dissolvidas durante a gelatinização dos grânulos. Como resultado, a pasta de amido ceroso consiste em um sistema com a presença de grânulos de amido danificados integrados em uma matriz contínua de amilopectina (WANG et al., 2011). Durante a gelatinização do amido, devido ao maior número de grupos ligantes em suas cadeias ramificadas, a amilopectina se expande muito pouco quando comparada à amilose, mesmo possuindo maior capacidade de retenção de água. Isso ocorre porque a expansão da amilopectina é severamente restringida, devido às camadas de amilopectina cristalina, gerando géis fracos e adesivos (FRANCO et al., 2001). Em geral, existem vários prós e contras ao uso de imitadores à base de amido. Um fator positivo é que são geralmente baratos e facilmente disponíveis. Além disso, embora os carboidratos forneçam 4 kcal/g, os imitadores de gordura derivados do amido, utilizados em soluções de 25 a 50%, contribuem com 1 ou 2 33 kcal/g, representando uma redução significativa no consumo calórico, quando comparado com o valor energético das gorduras. Ainda, apresentam poucas restrições de ordem toxicológica, sendo ingredientes reconhecidos amplamente como seguros - GRAS. Entretanto, a estabilidade ao calor, acidez, congelamento e descongelamento e tensões de cisalhamento não é garantida em todas as aplicações. Outro ponto negativo, é que, dependendo do tipo de amido e da quantidade utilizada, pode-se mascarar, em certo grau, sabores característicos do produto, podendo haver também contribuição com leve sabor residual do amido. Porém, isto pode se tornar uma vantagem quando se mascara sabores indesejados ou quando sabores provenientes do amido auxiliam na melhora do sabor global do produto. Em geral, os imitadores de gordura à base de amido, tendem a desempenhar um bom papel em produtos com alto teor de umidade. Sendo assim, são frequentemente utilizados em produtos lácteos, tais como: iogurtes, sobremesas lácteas, sorvetes e queijos, possuindo função texturizante e espessante e conferindo maior estabilidade e cremosidade ao produto final (LUCCA; TEPPER, 1994; PINHEIRO; PENNA, 2004; O’CONNOR; O’BRIEN, 2011). 3.3.1 Interação entre o amido e as proteínas do leite Alguns aspectos devem ser considerados em sistemas que incluem proteínas do leite e hidrocoloides, como o amido. Os hidrocoloides não são os únicos polímeros presentes nos produtos lácteos. Juntamente com as proteínas do leite, caseínas e proteínas do soro, os hidrocoloides encontram-se dissolvidos em uma fase aquosa formando uma solução poli-eletrolítica. A interação entre polímeros frequentemente gera a formação de um complexo ou a separação de fases, enquanto que a simples miscibilidade ocorre raramente. As caseínas e as proteínas do soro se comportam de maneira diferente em soluções aquosas. A caseína pode existir sob diferentes formas que variam desde pequenas macromoléculas dissolvidas e enoveladas ao acaso até partículas coloidais de tamanho de 300 nm. Enquanto que, as proteínas do soro se comportam como polímeros dissolvidos de baixo peso molecular, a menos que a agregação e a geleificação sejam induzidas por processos térmicos ou que utilizam alta pressão. Nos produtos lácteos comerciais, o estado coloidal é a situação predominante, como os agregados de 34 caseína (queijo), ou ainda, pode ocorrer na forma de uma camada emulsificante na superfície dos glóbulos de gordura (SYRBE; BAUER; KLOSTERMEYER, 1998). Assim, existem hipóteses da ocorrência de interação do amido com as proteínas do leite, porém, tais interações não foram ainda extensivamente estudadas. Uma delas é o aprisionamento das cadeias laterais alquila das proteínas pela amilose em sua forma helicoidal. Estas hélices mostraram formar complexos com uma ampla variedade de moléculas, tais como álcoois alifáticos, cetonas alifáticas, ácidos graxos, aldeídos aromáticos, haletos de alquila, álcoois cíclicos, fenóis, benzeno, hidrocarbonetos alifáticos e cíclicos, tetracloreto de carbono, iodo, nitroetano, piridina, corantes, pesticidas, e muitos outros. Estas interações entre as proteínas com o amido, durante o processamento, podem visivelmente influenciar a estrutura de rede e do gel e o perfil reológico do amido (GOEL; SINGHAL; KULKARNI, 1999). Zaleska, Ring e Tomasik (2001) estudaram a interação entre o amido de batata e a caseína, e sugeriram a ocorrência da formação de um complexo caseína- amido, por meio de interações entre os grupos fosfato e hidroxil do amido com o grupo amina da caseína. Enquanto, Goel, Singhal e Kulkarni (2009) indicam a possível ocorrência de ligações cruzadas entre a caseína e o amido, uma vez que as proteínas contêm muitos grupos hidrofílicos, tais como: -OH, -NH2, -COOH e -SH nas cadeias laterais alquila, que são capazes de formar ligações cruzadas com o amido. Vu Dang e colaboradores (2009) estudaram a microestrutura de misturas de amido de milho ceroso e isolado proteico de soro (IPS) e observaram que estas misturas são compostas por grânulos de amido gelatinizados dispersos um uma fase contínua de proteína do soro. Além disso, observou-se que a fase continua de IPS era heterogênea e continha grandes agregados proteicos ao redor dos grânulos de amido, o que pode explicar a textura granulosa dos produtos que contém IPS e amido de milho ceroso. Aguilera e Rojas (1996) também observaram rompimento na rede proteica das proteínas do soro pela presença dos grânulos de amido. A rigidez do gel diminuiu com o aumento da concentração de amido (2 a 7%), sendo este resultado atribuído ao efeito de ruptura proporcionado pelos grânulos de amido na matriz continua de IPS. Fitzmons, Mulvihill e Morris (2008) estudaram géis compostos por diferentes concentrações de amido de milho ceroso e isolado proteico de soro (IPS). Em altas 35 concentrações de IPS, os géis apresentaram uma fase contínua composta por uma matriz formada pelas proteínas do soro, que continha uma fase dispersa formada pelo amido. Em baixas concentrações de IPS, foi obtida uma matriz contínua de amido, fragmentada pelo IPS após sua geleificação. O amido, em misturas proteicas, pode existir tanto sob a forma dispersa, se comportando como glóbulos de gordura (enchimento), como sob a forma de fase contínua, se comportando como uma matriz proteica. A ocorrência destas formas irá depender da concentração adicionada de amido e de condições de processamento específicas (YE; HEWITT; 2009). É possível observar também, nas misturas de proteína e amido, duas fases contínuas separadas. Alguns autores sugerem que esta mudança na estrutura do gel pode ter sido induzida por uma separação de fases entre a proteína e a amilopectina. Em misturas de proteínas e polissacarídeos, a separação de fases é influenciada pela incompatibilidade termodinâmica dos biopolímeros. Um aumento na concentração de amido resulta no aumento da incompatibilidade entre proteína e amido. Não se sabe qual é o limite de concentração necessário para que ocorra a separação de fases em sistemas de caseína e amido, porém, para ao amido de batata adicionado ao queijo processado, a concentração crítica de amido foi de aproximadamente 4% (YE; HEWITT; 2009). O efeito de amidos de milho com diferentes proporções de amilose e amilopectina em queijo processado também foi estudado. Da mesma maneira, foi constatado que, o efeito do amido nas propriedades de queijos processados é fortemente influenciado pelo comportamento das fases formadas pelas estruturas de proteína e amido. Quando baixos teores de amido são adicionados, o amido fica confinado a uma fase dispersa e então se comporta como um enchimento, resultando no aumento da firmeza do queijo processado sem a perda de sua capacidade de derretimento. Entretanto, em alta concentração, o amido adicionado forma uma malha entrelaçada que se separa da fase proteica, diminuindo a capacidade de derretimento do queijo processado (YE; HEWITT; TAYLOR, 2009). Por outro lado, Noisuwan e colaboradores (2008), que estudaram o efeito de diferentes produtos à base de proteínas do leite na gelatinização de amido de arroz comum e ceroso, sugerem ainda que a separação de fases durante a formação de pasta destas misturas ocorra em altas temperaturas. Os grânulos de amido se dissociam em amilose e amilopectina, em altas temperaturas, e com o resfriamento 36 os agregados de proteínas ficam retidos na matriz do amido gelatinizado e resfriado. A Figura 1 mostra uma representação esquemática das diferentes etapas envolvidas desde o aquecimento, com a subsequente gelatinização, até a separação de fases de uma mistura de amido de arroz ceroso e proteínas do leite. Figura 1. Perfil de formação de pasta de amido de arroz ceroso (10% p/p) em presença de proteínas do leite (10% p/p). Fonte: Adaptado de CONSIDINE et al. (2011). Além disso, as propriedades de pasta tanto do amido comum, como do amido ceroso foram afetadas pela proteína do leite. A presença das proteínas do leite afetou em maior proporção as propriedades de pasta do amido de arroz comum, pois o amido de arroz comum forma um gel mais forte devido ao seu alto teor de amilose (14%), quando comparado ao teor de amilose do amido de arroz ceroso (5%) (NOISUWAN et al., 2008). Quando dois sistemas tão complexos como o amido e determinados produtos lácteos são misturados (iogurte, queijos, entre outros) uma ampla faixa de interações e efeitos nas propriedades físico-químicas do sistema podem ocorrer e irão depender das suas concentrações relativas, de suas propriedades físico-químicas e da composição do produto lácteo. Apesar do importante progresso feito nesta área, muitos aspectos fundamentais continuam sem resposta e estes incluem a interação 37 entre as proteínas do leite e a superfície do grânulo de amido. Outro aspecto que ainda não foi completamente explorado é o efeito da cinética de gelatinização do amido em presença das proteínas do leite (CONSIDINE et al., 2011). No geral, a literatura mostra que não existe uma tendência clara em relação à viscosidade em misturas de amido e caseína. Em alguns casos, ocorre aumento da viscosidade e em outros, esta diminui. O papel dos íons e da lactose do leite também deve ser considerado, uma vez que podem influenciar nas propriedades da mistura. Quando a interação entre as proteínas do soro e o amido são estudadas, a geleificação das proteínas do soro é um fenômeno que deve ser considerado, assim como a formação de uma fase continua, composta tanto por amido quanto por proteína do soro, cuja ocorrência pode ser alcançada de acordo com as condições de processo (CONSIDINE et al., 2011). 3.3.2 Aplicação de imitadores de gordura, à base de amido, em queijos Alguns trabalhos foram desenvolvidos com o intuito de estudar os efeitos resultantes da aplicação de imitadores de gordura, à base de diferentes tipos de amidos, em queijos. A funcionalidade, como imitador de gordura, do amido de mandioca e da lecitina foi estudada em queijo Feta por Sipahioglu, Alvarez e Solano-Lopez (1999). Os queijos foram produzidos com 1% de amido de mandioca modificado, 0,2% de lecitina e a combinação de 0,5% de amido de mandioca modificado e 0,1% de lecitina. O queijo com teor reduzido de gordura adicionado de amido de mandioca obteve a maior umidade (67,6%). A combinação de amido de mandioca e lecitina melhorou o sabor, textura e aceitabilidade geral de queijos Feta com baixo e reduzido teor de gordura. A perda de rendimento e o aumento na dureza do queijo Feta com teor reduzido de gordura foram superados pela alta capacidade de absorção de água do amido e da lecitina. Além disso, a dureza dos queijos foi reduzida quando os imitadores de gordura foram utilizados, em todos os tratamentos avaliados. Aryana e Haque (2001) estudaram o efeito de repositores de gordura à base de proteínas e de carboidratos na microestrutura de queijos Cheddar com baixo teor de gordura. Os repositores proteicos utilizados foram: Dairy LoTM (1% p/v) e 38 Simplesse® (1,5% p/v), enquanto que os à base de carboidratos foram: 1,2% p/v StellarTM (amido modificado) e 0,2% p/v Novagel® (mistura de celulose e goma guar). Os substitutos comerciais Simplesse® e Novagel® conferiram textura desejável ao queijo comparado com o queijo controle com teor reduzido de gordura, pela descontinuidade da matriz de caseína. Essa descontinuidade na matriz de caseína não foi observada no caso da adição de Dairy LoTM e StellarTM, que promoveram maciez no queijo por conferirem menor número de camadas (permitindo resistência ao esmagamento) na interface proteína-gordura. Os efeitos da redução de gordura na composição, dureza e propriedades sensoriais de queijo branco em conserva (White Pickled Cheese) e a funcionalidade de estabilizantes derivados de carboidratos: Perfectamylgel MB (amido modificado de batata) em concentração de 0,5% e Satiagel ME4 (k-carragena) em concentração de 0,4% e derivados de proteínas: Dairy LOTM (proteína concentrada de soro) e Simplesse® D-100 (proteína microparticulada de leite e ovo) em concentração de 300 g/60 kg de leite, foram estudados por Kavas e colaboradores (2004). O tipo de substituto de gordura não influenciou significativamente (ao nível de 5%) o sabor dos queijos, e embora o queijo com teor integral de gordura tenha apresentado a pontuação mais alta, todos os queijos foram considerados aceitos pelos provadores, sem apresentarem sabor residual ou amargor. A adição de substitutos de gordura não foi suficiente para melhorar significativamente as características de textura desses queijos, diferenças significativas foram encontradas pelos provadores entre o queijo com adição de Simplesse® D-100 e o queijo integral, não sendo observada diferença com os demais substitutos. No geral, os resultados mostraram que os queijos com baixo teor de gordura, com adição de Dairy LOTM, Perfectamylgel MB e Satiagel ME4 foram altamente aceitáveis em comparação com o queijo com baixo teor de gordura, sem substitutos de gordura. Zisu e Shah (2005) estudaram os efeitos da combinação de pré-acidificação, imitadores de gordura (0,25%) e culturas produtoras de exopolissacarídeos (EPS) em queijo Mussarela com 6% de gordura. Foram produzidos: (1) queijo somente com adição de cultura produtora de EPS (controle); (2) queijo com cultura produtora de EPS e OptaMax® (imitador de gordura à base de amido de milho ceroso, com alto teor de amilopectina, e com comportamento mais próximo ao de um hidrocoloide); (3) queijo com pré-acidificação, cultura produtora de EPS e OptaMax® e (4) queijo com pré-acidificação, cultura produtora de EPS e Versagel® (uma 39 mistura de α–globulina, goma carragena e goma xantana). A umidade nos queijos adicionados de substitutos foi aumentada, melhorando o rendimento e a textura. A pré-acidificação do leite e o uso de OptaMax® proporcionaram maior umidade e maior rendimento. A natureza do repositor influenciou a microestrutura desses queijos, assim como o seu impacto nas características funcionais. Os queijos que continham OptaMax® apresentaram melhor derretimento e extensibilidade em comparação com os que possuíam Versagel®. Assim, constatou-se que a combinação de uso de culturas produtoras de EPS, de pré-acidificação e do substituto de gordura OptaMax® aumentaram o rendimento dos queijos com baixo teor de gordura, além de resultar em características de textura e de comportamento superiores ao dos queijos Mussarela com baixo teor de gordura, sem adição de imitadores. Hee e colaboradores (2008) estudaram a formulação de géis poliméricos com o intuito de simular a textura dos queijos franceses: Camembert e Coulommiers (ambos produzidos com leite de vaca, macios, cremosos e com capa branca aveludada de fungos) com 10 dias de maturação. Os análogos de queijo foram formulados com gelatina (formando uma matriz proteica sólida) e a adição de vários polissacarídeos, a fim de modificar suas propriedades reológicas, se aproximando das características desses queijos. As formulações testadas foram: (1) 6% p/p de gelatina, (2) 6% p/p de gelatina e 1% p/p de goma guar, (3) 6% p/p de gelatina e 3% p/p de goma karaya, (4) 6% p/p de gelatina e 3% p/p de goma xantana e (5) 6% p/p de gelatina, 20% p/p de maltodextrina e 3% p/p de amido gelatinizado. O gel polimérico formado com gelatina e adição de maltodextrina e amido gelatinizado, comparado com as gomas guar, karaya e xantana, foi considerado o mais adequado quanto à firmeza, assim, este modelo de gel foi o que mais se aproximou dos queijos Camembert e Coulommiers com 10 dias de maturação, no que diz respeito às suas características de textura. Além disso, nenhum efeito significativo de interações entre gelatina, maltodextrina e amido foi percebido nas propriedades reológicas estudadas. As pesquisas disponíveis na literatura mostram bons resultados para o uso de imitadores de gordura, à base de amidos, em queijos. De maneira geral, os amidos utilizados, proporcionaram melhora na textura, capacidade de retenção de água e rendimento e não influenciaram negativamente nas caraterísticas sensoriais dos queijos com reduzido teor de gordura. No entanto, não existem relatos do uso de 40 amido em queijo Minas frescal e, mesmo que sua aplicação neste tipo de queijo, atualmente, não seja permitida pela legislação brasileira, um estudo sobre o efeito deste imitador de gordura, em queijo Minas frescal light, pode contribuir com o desenvolvimento da indústria láctea ao avaliar uma alternativa para a melhora da qualidade dos produtos a serem lançados no mercado. 41 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Planejamento dos tratamentos experimentais Com o intuito de avaliar o efeito do amido modificado sobre as características tecnológicas de queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura, foram produzidos, em três processamentos, queijos, conforme três tratamentos: Queijo com teor integral de gordura, produzido com leite integral, com 3,5% de gordura (QI), queijo com teor reduzido de gordura, produzido com leite padronizado a 1,5% de gordura (QL) e queijo com reduzido teor de gordura (1,5%) e adição de 0,5% de amido modificado (QA). 4.2 Ingredientes utilizados na fabricação do queijo Minas frescal - Leite pasteurizado tipo A integral, marca Xandô (Xandô Laticínios Ltda., Araras – S.P., Brasil); - Leite pasteurizado tipo A desnatado, marca Xandô (Xandô Laticínios Ltda., Araras – S.P., Brasil); - Solução de cloreto de cálcio 50%, marca Synth (Labsynth Produtos para Laboratório Ltda., Diadema – SP, Brasil); - Cultura comercial mista composta por Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris liofilizada - R-704 (Christian Hansen, Horsholm, Dinamarca); - Coalho em pó Ha-la®, constituído de quimosina produzida por Aspergillus niger var. awamori (Christian Hansen, Horsholm, Dinamarca); - Cloreto de sódio comercial, marca Cisne (Refinaria Nacional do Sal – S.A., Cabo Frio – R.J., Brasil); - Embalagem plástica termo-encolhível; - Amido de milho ceroso, MIRA-MIST-662® (Tate & Lyle, Decatur - I.L., EUA). 42 4.3 Caracterização do leite pasteurizado utilizado na fabricação dos queijos A caracterização dos leites pasteurizados, tipo A, integral e desnatado, utilizados na fabricação dos queijos, foi feita em triplicata de acordo com as seguintes análises físico-químicas: - Densidade e teores de gordura, sólidos não gordurosos (SNG) e proteína: Determinados através da aplicação de ultrassom nas amostras, com a utilização do equipamento Ekomilk-M Ultrasonic Milk Analyzers (Bulteh 2000 Ltda., Stara – Zagora, Bulgária); - Acidez: Determinada por titulação com NaOH 0,11 N (Dornic) e solução de fenolftaleína como indicador, sendo expressa em ºDornic (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS, 1997). - Presença de antibióticos: Constatada com a utilização do Teste SnapTM Beta Lactam (IDEXX, Maine, Estados Unidos) (TRONCO, 1997). - Fosfatase alcalina: Realizado através de teste colorimétrico utilizando-se um kit de Fosfatase Alcalina (Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda., Pinhais-PR, Brasil). 4.4 Preparo da cultura lática A cultura lática composta por cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris (R-704), adquiridas liofilizadas, foram preparadas conforme recomendação do fabricante. O conteúdo total do envelope, de 50 g, foi suspenso em 1 L de leite integral, esterilizado e refrigerado (10 ºC). Logo após, esta suspensão foi armazenada sob congelamento, a -18 ºC, em porções de 30 mL, em tubos de ensaio com tampa rosqueável previamente esterilizados. Esta quantidade de 30 mL, segundo o fabricante, é adequada para o processamento de 15 L de leite. A cultura foi descongelada apenas no momento da fabricação dos queijos. 4.5 Escolha do tipo de amido Para a produção do queijo light com adição de amido (tratamento QA), foi selecionado o teor de amido de 0,5%, baseado em trabalhos disponíveis na 43 literatura (SIPAHIOGLU; ALVAREZ; SOLANO-LOPEZ, 1999; KAVAS et al., 2004 e ZISU; SHAH, 2005). Para a escolha do tipo de amido, foi realizado, em teste preliminar, o estudo do efeito de diferentes tipos de amido nas características físico-químicas de queijo tipo Minas frescal com teor reduzido de gordura. Foram realizados quatro tratamentos: Queijo controle com teor integral de gordura (QC) e queijos com teor reduzido de gordura, com adição de 0,5% de amido de diferentes fontes botânicas: Sta-Slim-150 (Tate & Lyle), um amido modificado de mandioca (PSC); EP 1037 (Cargill), um amido modificado de milho (CSC) e Mira-Mist-662 (Tate & Lyle), um amido de milho ceroso (WSC). Foram realizadas as análises de umidade, gordura, gordura na matéria seca, cinzas, proteína, sal, acidez e sinérese, sendo escolhido o amido que apresentasse as características mais próximas às do queijo controle com teor integral de gordura. O estudo foi apresentado no 16th World Congress of Food Science and Technology – IUFOST, e encontra-se disposto no Anexo A. 4.6 Produção dos queijos Os queijos foram produzidos, em triplicata de processamentos, com 15 L de leite pasteurizado, sendo que, o tratamento QI foi produzido com leite integral (3,5% de gordura) e os tratamentos QL e QA utilizaram leite padronizado a 1,5% de gordura. Para esta padronização, a proporção entre leite integral e leite desnatado foi calculada utilizando-se o diagrama de Pearson (TAMIME; ROBINSON, 1999), após determinação do teor de gordura das amostras de leite, através do equipamento Ekomilk-M. Para cada processamento foram utilizadas amostras de leite pasteurizado integral e desnatado de um mesmo lote, garantindo assim, a padronização da matéria prima. Após o recebimento do lote de leite, as embalagens foram lavadas e armazenadas, sob refrigeração a 4 ºC, até o momento da produção. Os queijos foram produzidos na Planta Piloto do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, IBILCE - UNESP, em um tanque mecanizado, encamisado, com capacidade para 56 L. As amostras de leite, segundo cada tratamento, foram adicionadas ao tanque e mantidas sob agitação, até que se 44 alcançasse a temperatura de 35 ºC, quando foram adicionados, os demais ingredientes, de acordo com a seguinte ordem: - 0,5% em relação ao volume total de leite, 15 L, de amido de milho ceroso (somente para o tratamento QA), previamente dissolvido em 2 L de leite e aquecido a 85 ºC para que ocorresse a solubilização do amido, antes de sua adição ao processamento (adaptado de ZISU; SHAH, 2005); - 0,5 mL/L de solução cloreto de cálcio 50%; - 30 mL da cultura lática mista, composta por Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris; - 0,375 g de coalho dissolvido em água de acordo com a relação proposta pelo fabricante de que 500 g de coalho coagulam 20.000 L de leite. Atividade do coalho foi calculada pelo tempo necessário para coagulação de 200 mL de leite em 50 minutos, obtendo-se atividade de: 1:80.000, conforme Oliveira, 1986; Após a adição do coalho, o leite foi misturado com agitação vigorosa, por 3 minutos, ficando, posteriormente, em repouso até que o leite coagulasse. O tempo de coagulação foi em torno de 50 minutos. O ponto de corte foi verificado pela introdução de uma espátula e observação da formação de uma fenda retilínea. Ao atingir-se o ponto de corte, a coalhada foi então cortada em cubos de aproximadamente 1 cm, com o uso de lira vertical e horizontal, e em seguida, procedeu-se a agitação leve da coalhada durante os primeiros 3 minutos, aumentando-se a sua intensidade nos próximos 22 minutos, totalizando 25 minutos de agitação da massa. Foi feita a dessoragem, com a eliminação de aproximadamente 75% do soro (11 L) para que pudesse ser realizada a salga direta na massa. A quantidade de sal foi calculada para 2,5% em relação à massa, considerando um rendimento de 6 L de leite por kg de queijo. O sal foi adicionado em solução e realizou-se a agitação por 2 minutos para a penetração e distribuição homogênea do sal na massa. Após a salga, a massa foi colocada em formas redondas, próprias para queijo Minas, e foi realizada a primeira viragem dos queijos após 10 min de fabricação. Os queijos foram novamente virados, após 1 h de dessora, sob refrigeração (5 ºC), e virados, pela última vez, após mais uma hora de dessora. Estes foram deixados em repouso, sob refrigeração a 5 ºC por 24 h. No dia seguinte, os queijos foram retirados das formas e imersos em solução de 10% de sorbato de potássio por 60 segundos. O sorbato de potássio é um conservante permitido pela legislação na 45 proporção de 1000 mg/Kg de queijo em ácido sórbico (BRASIL, 1996). Em seguida, os queijos permaneceram 1 h em câmara fria para a secagem final. Após a secagem, os queijos foram embalados a vácuo, em sacos plásticos termo- encolhíveis e armazenados em temperatura de 5 ºC sob refrigeração (adaptado de FURTADO; LOURENÇO NETO, 1994). 4.7 Caracterização físico-química e de composição centesimal dos queijos Foi avaliado o efeito da redução da gordura e da adição do amido na composição centesimal dos queijos, após 3 dias de fabricação. As análises foram realizadas em triplicata e os métodos encontram-se descritos a seguir: � Teor do extrato seco total (EST): Foi determinado por secagem em estufa a vácuo por 24 horas a 70 ºC (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC, 1997); � Teor de gordura (G): Foi determinado pelo método de Gerber com butirômetro para queijo (BRASIL, 2006) e o teor de gordura no extrato seco (GES): Foi calculado através da fórmula: % GES = (G / EST) x 100; � Teor de nitrogênio solúvel em pH 4,6 (NS pH 4,6) ou nitrogênio não caseico (NNC): Foi determinado pela dosagem do nitrogênio total no filtrado obtido após precipitação isoelétrica das caseínas (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC, 1997); � Relação entre NS pH 4,6 e nitrogênio total (WOLFSCHOON-POMBO, 1983); � Teor de nitrogênio solúvel em ácido tricloroacético (TCA) 12% (NS TCA) ou nitrogênio não proteico (NNP): Foi determinado pela dosagem de nitrogênio total no filtrado obtido após precipitação da totalidade das proteínas em presença de TCA 12% (AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS, 1997); � Relação entre NS TCA 12% e nitrogênio total (WOLFSCHOON-POMBO, 1983); � Teor de proteína total (PT): Primeiramente, determinou-se o teor de nitrogênio total pelo método de Kjeldahl. Assim, o teor de proteína total foi calculado multiplicando-se o valor do nitrogênio total pelo fator 6,38 (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC, 1997). 46 � Teor de cinzas: Foi determinado por incineração em mufla a 550 ºC (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC, 1997); � Teor de sal: Foi determinado pelo método de doseamento nas cinzas, utilizando- se o método de titulometria por precipitação (Argentometria) (BRASIL, 2006); Também foram realizadas, em triplicata, as análises físico-químicas de acidez e pH durante o período de armazenamento de 3, 10 e 17 dias, para avaliar o efeito da redução da gordura e da adição de amido no queijo Minas frescal, com relação ao tempo. Os métodos utilizados encontram-se descritos a seguir: � Acidez: Foi determinada por titulação com NaOH 0,1 N usando fenolftaleína como indicador (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC, 1997). Os resultados foram expressos em % de ácido lático. � pH: Obtido pela inserção direta do eletrodo de um pHmetro (Modelo PG1800 da marca Gehaka), previamente calibrado, nas amostras de queijo trituradas dispostas em béqueres. 4.8 Capacidade de retenção de água (CRA) A fim de avaliar a exsudação de soro do queijo Minas frescal, foi realizado o estudo da capacidade de retenção de água dos queijos produzidos, conforme os tratamentos QI, QL e QA, em triplicata, após 3 dias de armazenamento (Adaptado de PRUDÊNCIO, 2006; VEIGA et al., 2000; HARTE et al., 2003). Foram centrifugados 15 g de amostra, a 5700 g, em centrífuga refrigerada (8 ± 1 ºC) por 60 minutos. Após centrifugação, o soro foi exsudado e as amostras foram pesadas, sendo calculado o percentual de capacidade de retenção de água, através da Equação 1: CRA (%) = [1 − (Massa soro exsudado na centrifugação / Massa queijo)] x 100 (1) Após 10 e 17 dias de armazenamento, os queijos foram novamente submetidos à avaliação, desprezando-se o soro que foi liberado previamente durante a estocagem. 47 4.9 Determinação do rendimento O percentual de rendimento dos queijos (kg de queijo/100 kg de leite) foi calculado pela relação entre a massa de queijo obtida e a massa de leite utilizada. 4.10 Caracterização do perfil de textura Com o intuito de avaliar o efeito da redução da gordura e da adição de amido sobre a textura de queijo Minas frescal com teor reduzido de gordura, foi realizada a análise de perfil de textura (TPA), considerando-se os parâmetros: dureza, elasticidade, coesividade e mastigabilidade, após 3 e 17 dias de armazenamento, utilizando-se o texturômetro TA-XT2i (Stable Micro Systems, Surrey, Inglaterra). Foram utilizadas um total de 6 amostras dos queijos de cada tratamento, em formato cilíndrico, com as dimensões de 2,5 cm de diâmetro e 3,0 cm de altura. O procedimento adotado foi o de dupla compressão, utilizando-se um cilindro de acrílico (probe) de 4,0 cm de diâmetro, com velocidade de deslocamento de 2,0 mm/s e distância percorrida de 6,0 mm (GONZÁLEZ, GIOIELLI, OLIVEIRA, 1998; GARCIA, 2010). Os cilindros de queijo foram cortados momentos antes da análise e armazenados individualmente em embalagens de plástico, a 10 ºC. Para a obtenção de medições confiáveis do perfil de textura dos queijos, as amostras foram mantidas em refrigeração, até o momento da análise, quando cada amostra era retirada, por vez, e analisada no texturômetro. 4.11 Caracterização da microestrutura em microscópio eletrônico de varredura – MEV (SEM) Para melhor entendimento da distribuição dos glóbulos de gordura na matriz proteica e para o estudo da influência da redução da gordura e da adição de amido nesta matriz, foram realizadas análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos queijos produzidos conforme os tratamentos QI, QL e QA. A análise foi realizada nas amostras de queijo de cada tratamento, obtidas após 5 dias de 48 armazenamento, de acordo com metodologia proposta por Madi-Ravazzi (2007), no Centro de Microscopia Eletrônica do IBILCE – UNESP. As amostras foram obtidas da parte interna e central dos queijos, sendo cortadas com lâmina para obtenção de pequenos fragmentos com dimensões de, aproximadamente, 5 mm de lado e 1 mm de espessura. Após o corte, as amostras foram fixadas em solução de 2% de glutaraldeído em tampão fosfato e deixadas em repouso, sob refrigeração, até o momento da análise. Em seguida, o fixador foi descartado e foram realizados enxágues sucessivos com tampão fosfato. Posteriormente, adicionou-se às amostras 5 mL de tampão fosfato juntamente com 5 mL de tetróxido de ósmio (OsO4), sendo deixadas em repouso sob refrigeração, por 2 horas. Logo após, foram realizados enxágues sucessivos com água destilada e a desidratação com soluções de concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 80, 90 e 100%) por 10 minutos para cada concentração. Após secagem, em ponto crítico, com o equipamento EMITECH 850® (Emitech Ltda Ashford, Kent, Inglaterra), as amostras foram adicionadas nos suportes metálicos circulares (stubs) e para sua adesão, foi utilizada uma fita adesiva de cobre, dupla face, permitindo assim, melhor fluxo de elétrons. Os stubs contendo as referidas amostras foram cobertos com ouro, com a utilização do metalizador, EMITECH 550® (Emitech Ltda Ashford, Kent, Inglaterra). Após a metalização, as amostras foram analisadas no microscópio eletrônico de varredura, LEO 435 VPi (Zeiss, Cambridge, Inglaterra) utilizando-se 15 kV e uma primeira série de aumentos de 1400 x, 1420 x e 1960 x (10 μm), assim como uma segunda série de aumentos de 4180 x, 4500 x (3 μm) e 4500 x (2 μm). 4.12 Caracterização do perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (Urea – PAGE). Para avaliação do efeito da redução da gordura e da adição de amido na proteólise do queijo com teor reduzido de gordura, foi realizado o estudo das frações de caseína, dos queijos produzidos, por meio da análise de eletroforese em gel de poliacrilamida (Urea - PAGE). As amostras foram coletadas após 3, 10 e 17 dias de armazenamento e congeladas para posterior avaliação. A análise foi realizada nas amostras dos tratamentos QI, QL e QA com a utilização de uma cuba de eletroforese vertical, Mini Protean 3 Cell (Bio Rad), pelo método descrito por Shalabi e Fox (1987). Os extratos para eletroforese foram preparados dissolvendo-se 20 mg 49 de amostra em 1 mL de tampão, preparado a partir de 1,50 g de tris-hidroximetil aminometano (TRIS) e 84 g de ureia em 150 mL de água destilada, adicionado de ácido clorídrico até pH 6,7, para um volume final de 200 mL. As amostras foram aquecidas a 37 ºC por 1 hora, após, foi adicionado 5 μL de β-mercaptoetanol, seguido de aquecimento a 37 ºC por 45 minutos, e por fim, foi adicionada uma pequena quantidade de azul de bromofenol. Para a separação das frações, 10 µL das amostras e do padrão de caseinato de sódio foram aplicados no gel, utilizando- se potência de 100 V, até o corante azul de bromofenol atingir o final do gel, aproximadamente, 5 horas. Os géis foram corados com solução de Coomassie Brilliant Blue R-250, por 24 h e descorados com solução descorante (água destilada, etanol e ácido acético). Para o armazenamento dos géis, a seco e à temperatura ambiente, estes foram fixados por 24 h em papel celofane previamente molhado e devidamente esticado, para a sua secagem por completo. 4.13 Caracterização microbiológica Para determinar a qualidade microbiológica dos queijos submetidos à avaliação sensorial, foram realizadas análises microbiológicas, após 2 dias de fabricação. Segundo a Resolução RDC, nº12, de 01/01/2001, da ANVISA, sobre os Padrões Microbiológicos para Alimentos (BRASIL, 2001), para queijos de muita alta umidade, como o queijo Minas frescal, devem ser realizadas as análises de: Contagem de coliformes fecais (NMP/g); Estafilococos coagulase positiva (UFC/g); Presença de Lysteria monocytogenes e presença de Salmonella sp. A preparação das amostras para análise e as determinações analíticas foram realizadas segundo o Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (AMERICAN PUBLIC AND HEALTH ASSOCIATION - APHA, 1992) e as análises foram realizadas pelo Laboratório de Análises Microbiológicas do Instituto Adolfo Lutz, de São José do Rio Preto - SP. 4.14 Avaliação sensorial A aplicação do teste sensorial foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da UNESP (CAAE nº: 50 08530412.6.0000.5466 / Parecer nº: 123.384). A folha de rosto para pesquisa envolvendo seres humanos, o Parecer Consubstanciado do CEP e o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, encontram-se no Anexo B. Foi determinada, após 10 dias de fabricação, a aceitabilidade geral dos queijos QI, QL e QA, e, consequentemente, a influência da redução da gordura e da adição de amido na aceitabilidade do queijo com teor reduzido de gordura, utilizando-se um teste de afetividade. Uma equipe de 50 provadores não treinados realizou a avaliação dos parâmetros: Aceitabilidade geral (traduzida pelo conjunto, relativo à primeira impressão causada pelo produto como um todo, sem representar a média das notas das outras características avaliadas), aparência (aspecto visual do produto), textura (corpo do produto quando consumido), sabor e aroma. Para expressar sua opinião a respeito das amostras, os provadores utilizaram uma escala hedônica de 9 pontos, com os extremos desgostei muitíssimo (1) e gostei muitíssimo (9) (FARIA; YOTSUYANAGI, 2008). A avaliação sensorial foi realizada nos períodos da manhã (entre 9 e 11 h) e da tarde (entre 15 e 17 h) em cabines individuais, com iluminação artificial. As amostras foram codificadas com números aleatórios de três dígitos e apresentadas aos provadores de forma monádica, que receberam uma bandeja contendo a amostra, água e a ficha de avaliação (FARIA; YOTSUYANAGI, 2008). 4.15 Delineamento experimental e análise estatística dos resultados Os experimentos foram realizados em triplicata utilizando um modelo de blocos completos bal