Pedro Henrique Ciconello Ghiraldi Efeito de pré-tratamentos em bagaço de cana-de-açúcar: Análises de acessibilidade enzimática. CIÊNCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO Rio Claro 2016 1 PEDRO HENRIQUE CICONELLO GHIRALDI Efeito de pré-tratamentos em bagaço de cana-de-açúcar: Análises de acessibilidade enzimática. Orientador: Professor Dr. Michel Brienzo Supervisor: Professor Dr. Jonas Contiero Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. Rio Claro 2016 Ghiraldi, Pedro Henrique Ciconello Efeito de pré-tratamentos em bagaço de cana-de-açúcar : análises de acessibilidade enzimática / Pedro Henrique Ciconello Ghiraldi. - Rio Claro, 2016 40 f. : il., figs., gráfs., tabs. Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Michel Brienzo 1. Enzimas. 2. Bagaço. 3. Acessibilidade enzimática. 4. Pré-tratamento. I. Título. 547.758 G425e Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP 2 Resumo Esse trabalho foi desenvolvido com biomassa de cana-de-açúcar e pseudocaule de bananeira, os quais foram submetidos a pré-tratamentos hidrotérmicos para avaliação da acessibilidade enzimática. Esta análise possibilitou o conhecimento da acessibilidade do material à ação enzimática, etapa necessária na produção de etanol de segunda geração, referente à quebra de celulose em glicose. O uso de tratamentos hidrotérmicos, com adição de ácido (H2SO4) e álcali (NaOH), foi responsável pela desestruturação do material lignocelulósico, permitindo assim uma maior acessibilidade e consequente aumento da digestibilidade enzimática da celulose. O tratamento oxidativo, com peróxido de hidrogênio, também se mostrou eficaz na remoção/solubilização de lignina e hemicelulose, tornando assim a produção de glicose mais eficiente. Para avaliar o efeito de cada pré-tratamento foram utilizados dois corantes: o Direct Blue, de baixa massa molecular e baixa afinidade com a celulose, penetrando nos poros e estruturas internas da biomassa; e o Direct Orange, com maior massa molecular e afinidade pela celulose, adsorvendo na superfície externa da mesma. Os resultados mostraram que quanto maior a adsorção de corante, maior é a digestibilidade do material (rendimento em glicose na etapa de hidrólise enzimática). Quanto aos pré- tratamentos, foi observado que o alcalino (em ambas biomassas) foi mais eficientes na remoção da lignina, porém removeu também maior parte de hemicelulose, causando perda de material e afetando ligeiramente as condições de hidrólise enzimática. Quanto à acessibilidade enzimática, o pré-tratamento ácido se mostrou mais eficiente devido a menor perda de material durante o pré-tratamento por alterações na superfície interna do mesmo, aumentando a acessibilidade pelo aumento da porosidade. Palavras-Chave: bagaço de cana-de-açúcar, pseudocaule de bananeira, acessibilidade enzimática, pré-tratamento ácido diluído, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento oxidativo. 3 SUMÁRIO 1-INTRODUÇÃO.......................................................................................................4 1.1 – Compostos da Biomassa.................................................................................6 1.1.1 – Celulose...................................................................................................7 1.1.2 – Hemicelulose...........................................................................................7 1.1.3 – Lignina....................................................................................................8 1.2 – Pré-tratamentos.............................................................................................9 1.3 – Acessibilidade Enzimática..........................................................................10 2- OBJETIVOS.........................................................................................................11 3- MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................11 3.1- Preparo do DNS..............................................................................................11 3.2- Biomassa Lignocelulósica..............................................................................11 3.3- Pré-Tratamento alcalino..................................................................................12 3.4- Pré-tratamento ácido.......................................................................................12 3.5- Pré-tratamento com ácido diluído...................................................................12 3.6 – Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio.................................................13 3.7- Atividade enzimática de celulases totais.........................................................13 3.8-Corantes utilizados ..........................................................................................14 3.9- Caracterização química da biomassa de bananeira...........................................15 4– RESULTADOS......................................................................................................15 4.1 - Rendimento em massa dos pré-tratamentos......................................................15 4.2– Rendimento em massa dos pré-tratamentos (bananeira)...................................16 4.3–Hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar............................................16 4.4– Hidrólise enzimática da biomassa de bananeira ...............................................18 4.5- Acessibilidade - adsorção de corantes nos materiais pré-tratados em meio ácido, alcalino e oxidativo.............................................................................................20 4.6– Caracterização química da biomassa de bananeira...........................................27 5-Discussão...................................................................................................................28 5.1 – Rendimento em massa e caracterização da biomassa.......................................28 5.2 – Hidrólise enzimática: rendimento de glicose....................................................29 5.3 – Acessibilidade – adsorção de corantes..............................................................31 6 – Conclusões..............................................................................................................32 7 – Referências.............................................................................................................34 8- Anexos......................................................................................................................36 4 1-Introdução As pesquisas relacionadas ao etanol de segunda geração vêm aumentando exponencialmente devido à maior demanda por este produto, cuja produção tende a aprimorar a sustentabilidade e diminuir os prejuízos gerados ao meio ambiente com o mercado exploratório que existe atualmente. Define-se por etanol de primeira geração aquele produzido através do uso da sacarose ou amido, e etanol de segunda geração (2G), que é o foco desse trabalho, aquele realizado com os resíduos da biomassa, como bagaço e palha, que atualmente são utilizados na geração de energia através da queima. A biomassa estudada para a produção do etanol de segunda geração consiste em material lignocelulósico de cana-de-açúcar, que é composto por três moléculas principais: lignina, celulose e hemicelulose. No Brasil, a produção de etanol é realizada a partir da fração líquida da moagem da cana-de-açúcar, podendo assim destinar porções como o bagaço remanescente e a palha, que antes eram utilizadas para o abastecimento energético da própria usina (através da queima) para a produção de etanol de segunda geração, que tem como objetivo se tornar viável e rentável com o desenvolvimento tecnológico. Além da biomassa derivada da cana-de-açúcar, diversos tipos de biomassa podem ser empregados na produção de etanol 2G. Um dos mais abundantes resíduos agropecuários que pode ser destinado a essa finalidade é o pseudocaule de bananeira, utilizado nesse trabalho em comparação ao bagaço da cana-de-açúcar. O pseudocaule de bananeira, além de possuir grande oferta de mercado, devido à grande produção do pseudofruto e baixo aproveitamento dos seus resíduos, possui em sua composição grande proporção de celulose (aproximadamente 80%) e baixa proporção de lignina (aproximadamente 10 %) [1] o que torna o material viável para a produção de etanol. Um dos principais problemas encontrados para a autossuficiência energética através do etanol 2G são os altos custos para o processamento da biomassa, uma vez que os açúcares do material lignocelulósico, alvo de hidrólises para a obtenção de monossacarídeos fermentáveis, (matéria-prima para a fermentação) se encontram na forma de polissacarídeos (celulose e hemicelulose). O grande desafio é que estes polissacarídeos estão envoltos por uma macromolécula aromática complexa (lignina) provendo resistência a microfibrila celulósica e assim a parede celular vegetal, o que dificulta a desestruturação da mesma para a hidrólise dos polissacarídeos em monossacarídeos. Outra grande dificuldade é a baixa acessibilidade enzimática a celulose, que confere condições de baixa digestibilidade enzimática [2]. Cada material possui uma porosidade que caracteriza a acessibilidade de acordo com suas frações [3] e pode ser desestruturado com tratamentos físicos e químicos. Entende-se por acessibilidade enzimática, o poder de 5 penetração e adesão das enzimas responsáveis pela hidrólise da biomassa. Devido ao alto grau de complexidade dos cristais de celulose, fortificados pela ação estrutural da lignina, a acessibilidade in natura desses materiais se mostra baixa, sendo necessário o uso de pré- tratamentos para desorganizar a estrutura do material. Tanto o pré-tratamento por meios ácidos quando por meios básicos tem por finalidade a desestruturação da biomassa, aumentando a superfície de contato e assim melhorando o rendimento em glicose pela ação de enzimas hidrolíticas. O aumento na acessibilidade resulta em maior quantidade de açúcar fermentável e assim maior produção de etanol. A acessibilidade é medida através de estudos de adsorção de corantes, onde se quantifica o total de corante adsorvido na biomassa pré- tratada. Para isso são utilizados corantes com diferentes massas moleculares, permitindo a quantificação de material adsorvido internamente à celulose, o que mostra o potencial de ação enzimático, e externamente, medindo a superfície de contato entre a celulose que pode ser alcançada por enzimas para hidrólise. Os corantes mais utilizados para essa função, são os mesmos utilizados nesse trabalho; são eles o Direct Blue e o Direct Orange; O Direct Blue possui uma fórmula conhecida (figura 1), peso molecular de 992,82. Sua molécula ocupa uma área de 3,6 nm² (o que equivale a 1 mm de diâmetro). O corante Direct Orange é um produto condensado do ácido 5-nitro-o- toluenosulfônico em solução aquosa alcalina. Essa condensação forma um polímero complexo (figura 1) de fórmula e estrutura não totalmente definidas. Apesar do corante laranja possuir moléculas de diversos tamanhos, sabe-se que todos os seus componentes são maiores do que o corante azul, permitindo assim analisar a acessibilidade conferida pela superfície interna (Direct Blue) e externa (Direct Orange). Normalmente, se usa como estimativa da acessibilidade a soma da adsorção de Direct Orange e Blue. 6 Figura 1: Estrutura química dos corantes Direct Blue e Direct Orange.[4] 1.1 Composição da biomassa lignocelulósica A biomassa utilizada para o estudo é o bagaço de cana de açúcar e o pseudocaule de bananeira, os quais são materiais lignocelulósicos composto por três frações (celulose, hemicelulose, lignina) que constituem aproximadamente 90% do material [5]. Esse material é alvo de estudos para que futuramente possa ser utilizado na produção de etanol de segunda geração (2G) em larga escala. Na figura 2 está demonstrada a estrutura de cristais de celulose, intermeadas por moléculas de lignina, que confere resistência ao conjunto. Figura 2 – esquema estrutural simplificado de uma fibrila lignocelulósica [6] 7 1.1.1 – Celulose A celulose é um homopolissacarídeo mais abundante da parede celular vegetal, e pode atingir um valor de até 60% da composição da biomassa geral [5]. A celulose é composta por D-glicoses unidas por ligações glicosídicas. Sua estruturação linear na molécula permite a formação de agregados, o que confere resistência a degradação e tensão à mesma [7]. A figura 3 representa uma molécula de celulose (polissacarídeo), que pode ser hidrolisada em moléculas de glicose (monossacarídeo). Figura 3 – representação das cadeias lineares da celulose, formadas por unidades de celobiose [8]. 1.1.2 – Hemicelulose A hemicelulose é um heteropolissacarídeo complexo formado por açúcares como pentoses (xilose, ramnose e arabinose), hexoses (glicose, manose e galactose) e ácidos urônicos (ácidos 4-O-metil-glucurônico e galacturônico). A hemicelulose apresenta cadeias laterais ou ramificações, que promovem maior interação com as moléculas de celulose e lignina, e confere flexibilidade e ao mesmo tempo estabilidade a parede vegetal [9]. Na estrutura lignocelulósica, a hemicelulose representa uma proporção de 15-30% do total de matéria seca e age como estrutura de ligação entre as moléculas de celulose, conferindo estabilidade a molécula como um todo. O exemplo mais comum de hemicelulose encontrado na maioria dos materiais lignocelulósicos é a xilana, que corresponde a aproximadamente um terço da fonte de material de energia renovável do planeta [10]. Esta é a hemicelulose característica de gramíneas (bagaço de-cana-de-açúcar). A Hemicelulose característica do pseudocaule de bananeira possui frações de hemicelulose composta em sua maior proporção por xilana, com porção de monômeros de glicose [8]. Abaixo, na figura 4, estão presentes os principais componentes da hemicelulose. 8 Figura 4: Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. D-glicose (1), D-galactose (2), L- arabinose (3), Dxilose (4), D-manose (5), 4-O-metil-D-glucurônico (6), L-ramnose (7) [8]. 1.1.3– Lignina A lignina é uma macromolécula complexa formada pela polimerização radicalar de unidades de fenil-propano e constitui a maior fração das substâncias não polissacarídicas presente no material lignocelulósico [5]. Constituinte de aproximadamente 15-35% do material, a lignina confere enrijecimento e assim proteção e estruturação para a planta, e consequentemente para o material lignocelulósico [7]. Logo, sabe-se que a retirada total ou parcial da lignina aumenta a taxa de digestibilidade enzimática [11], permitindo que o processo de hidrólise/quebra dos polissacarídeos em monossacarídeos seja aprimorado. Figura 5- Estrutura da lignina de Fagus sp [12]. 9 1.2- Pré-tratamentos A produção do etanol de segunda geração através do material in natura é inviável devido a alta carga enzimática necessária para as conversões da celulose. Um dos modos de contornar a situação é utilizando pré-tratamentos que desestruturam o material lignocelulósica mudando a sua organização, estrutura e morfologia. O pré-tratamento pode ser conduzido por estratégias variadas, mas todos têm os mesmos objetivos, que é a retirada total ou parcial da hemicelulose e/ou lignina (ou sua modificação), aumentar a área superfície e diminuir o grau de polimerização e cristalinidade da celulose aumentando assim a eficiência do processo devido a uma maior digestibilidade pelo aumento da acessibilidade enzimática [5]. O sucesso na etapa de pré-tratamento permite maximização nas etapas seguintes: hidrólise enzimática, liberação de açúcares fermentáveis, e na fermentação para produzir o etanol. Para superar a baixa porosidade e alta resistência do material, podem ser usados pré- tratamentos químicos (ácidos e básicos) com o intuito de solubilizar/modificar a lignina e/ou parte da hemicelulose, aumentando assim a porosidade da matriz celular. Pré-tratamentos físicos, como a moagem são efetivos para diminuir a cristalização estrutural da molécula de celulose e assim aumentar a área de atividade em que a ação enzimática vai ocorrer. Entretanto, apresentam alto consumo de energia o que inviabiliza a aplicação industrial. Idealmente, um pré-tratamento ótimo deve: proporcionar máxima digestibilidade enzimática ao material pré-tratado, minimizar a perda de açúcares, minimizar a produção de subprodutos, minimizar o uso de energia, reagente e equipamentos e permitir escalonamento para planta industrial [5]. Figura 6 – Esquema de pré-tratamento para desestruturação da biomassa seguido por hidrólise enzimática da celulose para liberação de glicose [5]. 10 1.3- Acessibilidade enzimática Um fator muito importante para a conversão eficiente de celulose é a facilidade com que os complexos enzimáticos conseguem chegar a fibra de celulose. Esta fibra apresenta uma área superficial, não só externa, mas também interna, onde a enzima age para quebrar os polissacarídeos em monossacarídeos fermentáveis. A tal fato, se dá o nome de acessibilidade enzimática, ou seja, a capacidade de penetração e adesão das enzimas utilizadas para a hidrólise na biomassa [2]. A estrutura físico-química da biomassa, no entanto, dificulta o acesso das enzimas aos seus polissacarídeos. Isso ocorre devido a formação de cristais compactos de celulose envolvidos por hemicelulose e lignina, que conferem rigidez à biomassa. Essa compactação estrutural interfere na eficiência do processo hidrolítico, gerando menos produtos para a fermentação [2,3]. Outro fator determinante para a acessibilidade é a porosidade do material, ou seja, o tamanho dos poros contidos na biomassa determina o tamanho das enzimas que serão eficientes em sua quebra. Geralmente, devido a estrutura química envolta por lignina, os poros não possuem tamanho grande suficiente para a penetração da enzima, sendo necessário a ação dos pré-tratamentos físicos e químicos (como o tratamento ácido e alcalino) para modificar o material quanto a sua estrutura e natureza, removendo as moléculas de lignina e assim aumentando a porosidade e superfície de contato acessível as enzimas. Os melhores resultados aparecem quando grande quantidade de enzima consegue penetrar na biomassa e realizar a quebra das moléculas de polissacarídeo, não excluindo o mesmo processo na superfície externa do material. Um dos métodos mais utilizados para calcular a acessibilidade enzimática é o método de adsorção de corantes [13], onde a biomassa pré-tratada ou in natura é incubada com dois corantes de peso moleculares e afinidades diferentes (um azul de baixo peso molecular, que penetra na superfície interna (poros), e um laranja de alto peso molecular e alta afinidade com a celulose, o qual adsorve na sua superfície, assim atingindo a superfície externa do material [14]). A quantidade de corante adsorvido é utilizado para estimar a superfície interna (azul) e externa (laranja) do material, normalmente expresso como superfície total, ou relação ou taxa externa/interna. Essa análise permite determinar qual a quantidade de material que realmente conseguiriam de forma efetiva ser acessado por enzimas, influenciado de acordo com cada pré-tratamento ou suas condições. Outro método bastante utilizado para aferir a acessibilidade enzimática é o método de porosidade por Mercúrio ou por gás Nitrogênio [12], onde a 11 biomassa é seca e sua pressão interna avaliada, e é irradiada com mercúrio ou nitrogênio. Após a contaminação da amostra com essas substâncias, a diferença de pressão é calculada, e pode-se obter a quantidade de material adsorvido pela biomassa, quantificando assim o total de mercúrio ou nitrogênio que foi capaz de passar pelos poros, o que indiretamente leva a quantidade e tamanho dos poros presentes. 2-Objetivos Esse trabalho tem como objetivo principal avaliar a acessibilidade enzimática em biomassa vegetal (cana-de-açúcar e pseudocaule de bananeira) submetidos a diferentes pré- tratamentos (ácido, alcalino e oxidativo). 3-Materiais e Métodos 3.1- Preparo do DNS Para obtenção do reagente de DNS, foram utilizados os seguintes materiais e protocolo [15]: Foram dissolvidos 10,6 gramas de ácido 3,5-dinitrosalisílico, 19,8 gramas de hidróxido de sódio, 306 gramas de tartarato de sódio e potássio e 8,3 gramas de bissulfito de sódio em 1 litro de água deionizada, que foi deixado em agitação por 40 minutos para dissolução total dos reagentes. Após isso, foram adicionados 7,6 mL de fenol na solução e o volume foi completado para 1,4 litros de água. 3.2 – Biomassa lignocelulósica A biomassa de cana-de-açúcar, o bagaço, foi obtida no Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) em Piracicaba – SP. As amostras foram previamente lavadas, moídas para a extração do suco e seccionadas obtendo o entrenó livre de epiderme. Após isso foram colocadas em uma estufa a 50°C para a secagem completa do material. O último passo foi realizar a moagem para a obtenção de fragmentos selecionados em peneira de 20 mesh. A biomassa de bananeira (pseudocaule - Biomassa 2) foi coletada nos arredores da cidade de Rio Claro e processada como descrito para o bagaço. 12 3.3 – Pré-tratamento alcalino O pré-tratamento alcalino foi realizado com hidróxido de sódio (NaOH). Primeiramente, foram utilizados frascos de 500 mL, cada um contendo 5 gramas de biomassa. Os frascos foram separados de acordo com as concentrações estipuladas (5%, 10%, 20% e 30% massa/massa). As quantidades de NaOH utilizadas foram relacionadas com a massa de material, por isso a concentração foi obtida em m/m. Para cada concentração, foram utilizados 6 frascos. Após essa etapa, foram colocados 50 mL de água deionizada em cada frasco, para que o substrato sólido fosse suspenso. Após homogeneização os frascos foram levados a uma autoclave vertical, nas condições de 121°C, por 30 minutos à pressão de 1 atm. Ao fim do tempo de reação, os meios foram filtrados em papel de filtro, e lavados com água deionizada. A lavagem ocorreu até que o pH se ajustasse ao pH da água deionizada (entre 4 e 5). O material sólido obtido foi colocado em estufa a 40°C para a secagem. 3.4- Pré-tratamento ácido O pré-tratamento foi utilizado para a desagregação/modificação da lignina por processos químicos da biomassa de bananeira, a fim de analisar o seu efeito na acessibilidade enzimática. O pré-tratamento foi realizado com ácido sulfúrico. Primeiramente, foram utilizados 24 frascos de 500 mL cada um contendo 5 gramas de biomassa. Os tubos foram separados de acordo com as concentrações estipuladas (5%, 15%, 20% e 25% massa/massa). As quantidades de ácido que foram utilizadas foram relacionadas com a massa de material, com a intenção de obter as concentrações em m/m. Para cada concentração, foram utilizados 6 frascos com100 mL de água deionizada, para que o substrato sólido fosse diluído. Após a diluição os frascos foram levados a uma autoclave vertical, nas condições de 121°C, por 30 minutos à pressão de 1 atm. Ao fim do tempo de reação, os meios foram filtrados em papel de filtro, e lavados com água deionizada. A lavagem ocorreu até que o pH se ajustasse ao neutro. O material sólido obtido foi colocado em estufa a 40°C para a secagem. 3.5- Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio O presente pré-tratamento foi realizado através da ação do peróxido de hidrogênio (H202). Primeiramente, foram utilizados 24 frascos de 500 mL, cada um contendo 5 gramas de biomassa (no caso de bananeira). Os tubos foram separados de acordo com as concentrações estipuladas (2%, 4%, 6% e 8% massa/massa). As quantidades de H202 que foram utilizadas foram relacionadas com a massa de material, por isso concentração foi obtida em m/m. Para cada concentração, foram utilizados 6 frascos, totalizando 24 amostras com 100 mL de água 13 deionizada em cada frasco, para que o substrato sólido fosse suspenso. Após a diluição os frascos foram aquecidos a 50°C, por 30 minutos. Ao fim do tempo de reação, os meios foram filtrados em papel de filtro, e lavados com água deionizada. A lavagem ocorreu até que o pH se ajustasse ao neutro. O material sólido obtido foi colocado em estufa a 40°C para a secagem. 3.6- Pré-tratamento com clorito de sódio O bagaço foi pré-tratado com clorito de sódio e ácido acético por 3 horas e a reação foi observada da seguinte forma: para cada grama de material moído, foram utilizadas 0,3 gramas de clorito de sódio (0,93%, m/v), 0,1 mL de ácido acético anidro (0,31% v/v) e 32 mL de água. O experimento foi realizado em frascos de 1 L, cada um contendo 15 g de substrato e mantidos em banho maria a 70°C. Para resultados mais efetivos para o processo de deslignificação, uma adição da carga de clorito foi realizada a cada hora da reação. Sabendo disso, a cada hora, um dos frascos foi retirado do banho maria e a mesma quantidade de clorito de sódio e ácido acético adicionados aos outros frascos que continuaram em reação. Esse procedimento foi repetido por 3 horas, gerando assim diferentes níveis de ação do pré- tratamento. A ordem de retirada dos frascos obedeceu a seguinte cronologia: o 1º frasco foi retirado após 30 minutos de reação; o 2º frasco foi retirado após 1 hora de reação; o 3º frasco foi retirado após 2 horas de reação e finalmente o 4º frasco foi retirado após 3 horas de reação. Após todos os frascos serem retirados, e a reação interrompida, os materiais obtidos foram filtrados e lavados com cerca de 1 L de água para neutralização do pH. As partes sólidas foram removidas e colocadas em estufas a 40°C para secarem. 3.7- Atividade enzimática de Celulases totais A atividade enzimática de celulases totais foi determinada pelo método descrito por Ghose [16] que consiste em realizar hidrólises enzimáticas tendo como substrato tiras de papel de filtro Whatman nº 1 e determinar a quantidade de açúcares redutores através de método de DNS [16]. Para tal, foram cortadas tiras de papel de filtro Whatman com dimensões de 1x6 cm (o que equivale a 50 mg de substrato) e cada tira foi inserida em um tubo de ensaio junto com 1 mL de tampão acetato de sódio (50 mM com pH igual a 4,8) e 0,5 mL de extrato enzimático comercial (Novozymes). Os tubos foram incubados a 50 °C por 60 minutos e após isso, a reação enzimática foi interrompida por 3 mL de DNS. Os tubos foram colocados em banho térmico a 100 °C por 5 minutos e em seguida diluídos com adição de 20 mL de água deionizada, para então ter a sua absorbância lida em um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 540 nm. Para zerar o aparelho foi utilizado uma amostra contendo 14 apenas tampão e DNS; Para cada concentração foi realizado um ensaio controle adicionando a solução de DNS antes do extrato enzimático (não permitindo assim o início da ação enzimática) para descontar possíveis erros de açúcares não produzidos durante a ação enzimática. A solução padrão utilizada foi a solução de glicose (Merck). 3.8- Adsorção de corantes - acessibilidade Para determinar a acessibilidade enzimática proveniente de cada pré-tratamento, foram utilizados 2 corantes: o Direct Blue (Azul) e o Direct Orange 15 (laranja) [4]. O corante azul foi diluído em 100 mL de água e armazenado pois já apresentava as características desejadas. O corante laranja foi diluído em 200 mL de água deionizada e filtrado a vácuo para a obtenção de moléculas de alta massa, descartando assim a solução resultante da filtração. Ambos os corantes foram preparados na concentração de 10 mg de corante por mL de água deionizada. O experimento de adsorção de corante foi montado com 6 tubos contendo 50 mg de biomassa previamente pesada em cada tubo, seguida da adição dos corantes para formar 6 concentrações diferentes (0,06; 0,25; 0,37; 0,5; 0,75 e 1 mL de corante azul e vermelho) para cada amostra. O experimento foi realizado tanto para a cana-de-açúcar quanto para o material de bananeira. Foram adicionados 1 mL de tampão fosfato de sódio em cada tubo, a fim de manter o pH ideal (pH = 6) para a adsorção ocorrer e o volume foi completado para 5 mL de solução com água deionizada. As amostras foram levadas a um shaker e mantidas por 6 horas a 70°C com rotação de aproximadamente 120 rpm. Após o tempo, os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos para a separação da fase sólidas e líquidas. A fase sólida foi descartada e a fase líquida teve sua absorbância determinada a 455 e 624 nm. A acessibilidade enzimática foi analisada de acordo com a quantidade de corante adsorvida na superfície interna e externa do material lignocelulósico, sendo calculada a partir da absorbância obtida para calcular a concentração do corante restante em solução. A fórmula utilizada para o cálculo de concentração dos corantes é [17]: A455nm = EO/455LCO + EB/455LCB A624nm = EO/624 LCO + EB/624 LCB Onde: A é a leitura obtida nos comprimentos de onda de 455 e 624 nm; L é o comprimento do percurso percorrido pela luz (nesse caso é 1cm); EO/455, EO/624, EB/455 e EB/624 são dados pré-obtidos através de uma leitura padrão (dos corantes sem a biomassa) efetuada nessas faixas do espectrofotômetro. EO/455 = 35,63 L g-1cm-1. 15 EO/624 = 0,19 L g-1 cm-1. EB/455 = 2.59 L g-1 cm-1. EB/624 = 15.64 L g-1 cm-1. Após a obtenção da concentração restante, bastou subtrair o valor da concentração inicial, previamente obtida para saber a quantidade de corante adsorvida. A proporção de corante absorvido foi diretamente relacionada com os dados de digestibilidade enzimática, baseado no rendimento em glicose. Após o cálculo da absortividade relativa final, os seguintes passos foram realizados para o cálculo de absortividade máxima: - O resultado de concentração foi multiplicado pelo valor de diluição de cada amostra (10, 10, 20, 25,30 e 45 vezes respectivamente dos tubos 1 ao 6); - multiplicado o valor pelo volume de reação (5 mL) para obter a massa do corante absorvido; - dividir os valores obtidos pela massa de material utilizados, para obtermos o valor de miligrama de corante por grama de material; - linearizar os dados (1/valor) e obter um gráfico para cada tratamento e concentrações, obtendo assim uma equação de reta, onde o coeficiente angular foi utilizado para o cálculo de absortividade máxima (1/coeficiente angular). 3.9- Caracterização química da biomassa de bananeira Para a realização da caracterização química da biomassa de bananeira, foram utilizados os materiais pré-tratados com as seguintes proporções em porcentagem: H2SO4 (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 %) NaOH (5, 10, 15, 20, 25 e 30 %) e H2O2 (2,4,6 e 8 %); A caracterização foi feita através de um HPLC, onde foram estimados em porcentagem, os valores de cada fração da biomassa (Celulose, Hemicelulose e Lignina). 4 - Resultados 4.1- Rendimento em massa dos pré-tratamentos alcalino e com clorito de sódio com biomassa de cana-de-açúcar. Após a realização dos pré-tratamentos, foi quantificado a biomassa resultante após a extração de parte da lignina e da hemicelulose através das ações de cada pré-tratamento. Para inferir os resultados, foi usado a seguinte expressão matemática: R = (MFS/MIS) x 100, onde R é o rendimento em porcentagem; MSF é a massa final do substrato; MIS é a massa inicial do substrato. Os dados obtidos foram alocados na seguinte tabela (Tabela 1). 16 Tratamento Amostra Rendimento (%) NAOH (%) 5 60.57 10 58.20 20 53.30 30 46.90 Clorito (carga) 30/1 54.53 60/1 48.66 120/2 47.53 180/3 44.26 Tabela 1: Rendimento em porcentagem nos pré-tratamentos por NaOH e Clorito em biomassa de cana-de-açúcar. Nota-se na tabela 1 que o rendimento do material pré-tratado com NaOH é maior quando a concentração do reagente é menor. Foi obtido uma diferença de mais de 40% entre as concentrações mínimas e máximas do mesmo (5% e 30%). Isso demonstra, que devido a agressividade do pré-tratamento, uma maior porção de lignina e hemicelulose foram extraídos, podendo haver grande perda também de celulose (objeto de estudo), visto que a quantidade final das amostras foram menores. Nota-se ainda que a amostra com maior rendimento de massa foi a que empregou menor concentração do reagente. Entretanto, a eficiência com o aumento da concentração não foi tão brusca quanto no pré-tratamento anterior, visto que a diferença em proporção do rendimento obtido com a menor concentração para a maior foi de apenas 10%. Isso também pode demonstrar menor perda de material alvo (celulose); 4.2– Rendimento em massa dos pré-tratamentos com a biomassa de bananeira Na tabela 2, nota-se que os tratamentos foram mais eficientes de acordo com as maiores concentrações de reagente, em todos os casos indicando assim grande remoção principalmente da lignina. 17 Tratamento Amostra Rendimento (%) H2SO4 (%) 5 60.57 10 58.20 15 53.30 20 46.90 25 44.90 30 30.30 35 31.20 40 32.10 NaOH (%) 5 46.00 10 43.50 15 33.80 20 29.20 25 27.60 30 25.00 H2O2 (%) 2 48.60 4 42.70 6 39.90 8 32.40 Tabela 2: Rendimento de massa em porcentagem da biomassa de bananeira No tratamento alcalino, houve maior eficiência em menor concentração do que nos outros tratamentos, enquanto o tratamento ácido foi o de maior divergência do tratamento menos severo (5 % de ácido rendeu 60,57% da massa inicial) com o mais severo (40 % de ácido resultou em 32,1% da massa inicial), com aproximadamente 30% de diferença. 4.3– Hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar Como demonstrado na tabela, em comparação com o grupo de controle, a concentração de glicose no pré-tratamento com clorito foi totalmente dependente do tempo de reação uma vez que no primeiro teste, com a carga por 30 minutos, os índices de glicose obtidos foram mais baixos do que os índices do grupo controle, aumentando gradativamente nas reações realizadas por mais tempo. O pré-tratamento alcalino se mostrou bastante eficiente e dependente da concentração do reagente utilizado. Na menor concentração já foram obtidos índices de glicose maiores do 18 que no grupo controle, aumentando gradativamente conforme a quantidade de reagente utilizado. Amostra Absorbância Concentração de glicose (mg/mL) Controle 1 0,61 2,14 Controle 2 0,59 2,10 Clorito 30 minutos 0,41 1,60 Clorito 30 minutos 0,38 1,51 Clorito 1 hora 0,67 2,31 Clorito 1 hora 0,66 2,27 Clorito 2 horas 0,82 2,71 Clorito 2 horas 0,78 2,61 Clorito 3 horas 0,82 2,73 Clorito 3 horas 1,11 3,54 NaOH [5%] 0,75 2,53 NaOH [5%] 0,61 2,15 NaOH [10%] 1,21 3,81 NaOH [10%] 1,17 3,69 NaOH [20%] 1,02 3,28 NaOH [20%] 1,18 3,70 NaOH [30%] 1,22 3,83 NaOH [30%] 1,23 3,85 Tabela 3: Efeitos dos pré-tratamentos na hidrólise enzimática 4.4– Hidrólise enzimática da biomassa de bananeira Para cada pré-tratamento realizado com a biomassa de bananeira, foi demonstrado a cinética de hidrólise enzimática, sendo o desvio padrão calculado e utilizado para cada um dos resultados. Na figura 7, pode ser observado que todas as concentrações de ácido utilizadas foram eficientes no tratamento e mostraram índices de glicose obtidas notavelmente maiores do que no grupo controle, chegando próximo dos 80% de rendimento de massa total em glicose nas concentrações de 20 a 35 % (m/m) de reagente sobre amostra. Nesse caso a concentração de reagente se mostrou tão importante quanto o tempo de reação para melhores resultados. 19 Figura 7: Cinética de hidrólise enzimática (rendimento de glicose) da biomassa de bananeira com pré-tratamento ácido (H2S04). Na figura 8 pode-se observar que o tratamento alcalino foi eficiente e totalmente dependente da concentração de reagente utilizada uma vez que quanto maior a concentração, mais eficiente foi o rendimento de glicose (%). Nota-se que em todas as concentrações o tratamento mostrou melhores resultados do que os obtidos no grupo controle. 20 Figura 8: Cinética de hidrólise enzimática (rendimento de glicose) da biomassa de bananeira com pré-tratamento alcalino (NaOH). A figura 9 nos indica que o tratamento oxidativo foi eficiente em ambas as concentrações de reagentes, porém o fator crucial para os melhores resultados foi o tempo de reação. Os resultados obtidos nas concentrações de 2 a 6% foram semelhantes, enquanto os resultados obtidos na concentração de 8% foi ligeiramente menos eficiente. Figura 9: Cinética de hidrólise enzimática (rendimento de glicose) da biomassa de bananeira com pré-tratamento oxidativo (H2O2). 4.5– Acessibilidade - adsorção de corantes nos materiais pré-tratados em meio ácido, alcalino e oxidativo Para cada solução, foram construídos gráficos das diferentes concentrações das quais as absorbâncias tanto do corante azul quanto do laranja geraram equações de retas, e no final foram comparadas entre si para análise de eficiência dos tratamentos como mostrado nos gráficos e tabelas a seguir. De modo geral, os resultados de absorbância das diferentes concentrações aumentam gradativamente até atingir um patamar, representando estabilização da adsorção de corantes. Trabalha-se apenas com a parte crescente, pois é a fase onde obtém- se a máxima absortividade de corante. Da linearização determina-se a equação da reta, após ajustar os pontos a uma reta, buscando um coeficiente de correlação maior possível, sendo 21 aceitável superior a 0,8. Para determinação da equação tem-se como fundamento trabalhar com a parte linear de adsorção, independentemente do número de pontos que se ajustam a reta. Os resultados de adsorção de corante no material in natura foram introduzidos nos gráficos de pré-tratamento como controle. Figura 10: Linearização dos dados de adsorção de corante, expresso em miligrama de corante por grama de material do grupo controle. Os demais dados de linearização dos materiais pré- tratados foram apresentados como anexo. O material in natura, não pré-tratado, ou denominado de controle, apresenta baixa adsorção de corantes quando comparado ao material pré-tratado. A baixa adsorção de corantes indica pouca acessibilidade, e por consequência baixo rendimento em glicose na hidrólise enzimática (Figuras 7, 8 e 9). O pré-tratamento modifica a estrutura da biomassa, criando poros, e assim permitindo a penetração dos corantes (e também da enzima, o que é relacionado com a adsorção do corante) [3]. Os pré-tratamentos apresentam efeito característico na biomassa: o ácido modifica a lignina e remove parcialmente a hemicelulose; o alcalino remove lignina e hemicelulose; e o oxidativo remove hemicelulose e lignina, e quebra a estrutura da lignina; o clorito de sódio é agente deslignificante [17]. Assim, material com características diferente pode ser obtido aplicando estes pré-tratamentos em diferente severidade. O efeito principal quantificado nesse trabalho, a acessibilidade, mostra o quanto a celulose está exposta, o que ocorre pela ação do 22 pré-tratamentos em remover/modificar hemicelulose e lignina. De modo geral, a acessibilidade foi diretamente proporcional ao rendimento em glicose na hidrólise enzimática. Este resultado era esperado, e está de acordo com a literatura [1,2,3,4,9,13,14]. O pré-tratamento com clorito de sódio apresentou aumento na adsorção de corantes com o aumento da concentração de reagente empregado (Figura 11). Este pré-tratamento levou ao mais alto índice de adsorção de corante, quando comparado com os demais pré- tratamentos. Esse resultado pode ser explicado devido ao seu efeito especifico na remoção de lignina. O pré-tratamento alcalino, de modo semelhante, apresentou aumento na adsorção de corantes com o aumento da concentração de hidróxido de sódio empregado (Figura 12). Destaca-se que com concentrações maiores que 20% de hidróxido de sódio ocorreu predomínio da superfície interna, quantificada pelo corante azul. Porém, esse comportamento não foi observado para biomassa de bananeira. A adsorção de corantes diminuiu nas altas concentrações de hidróxido de sódio (Figura 12). Para esta biomassa, tais concentrações podem ter levado a perda de celulose, o que ocorre devido reações indesejáveis, que clivam a cadeia de celulose [17]. O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio apresentou comportamento semelhante aos demais pré-tratamentos quanto a adsorção de corantes. Porém, destaca-se a predominância inicial da superfície interna, quantificada pelo corante azul (Figura 14). Para a concentração de 8% de peróxido de hidrogênio, a predominância foi da superfície externa, determinado pelo corante laranja. O pré-tratamento ácido, por outro lado, iniciou com predomínio da superfície externa até a concentração de 20% de ácido (m/m) (Figura 15). Na concentração de 25 % (m/m), houve maior adsorção de corante azul, indicando predomínio da superfície interna. Os pré-tratamentos apresentam efeitos diferentes nas propriedades do material, aumentando a acessibilidade a celulose (Figura 16 – que compara todos os resultados). Essa acessibilidade é um indicativo da digestibilidade do material, quantificada pelo rendimento em glicose liberado na hidrólise enzimática (Figuras 7, 8 e 9). Assim, a conversão do material em etanol de segunda geração pode ser estimada através do rendimento em glicose na hidrólise enzimática, a qual pode ser estimada pela sua acessibilidade ou adsorção de corantes. 23 Figura 11: Absortividade máxima (em mg/g) dos corantes em diferentes concentrações no pré-tratamento com clorito de sódio da biomassa de cana-de-açúcar. Figura 12: Absortividade máxima (em mg/g) dos corantes em diferentes concentrações no pré-tratamento com NaOH da biomassa de cana-de-açúcar. 24 Figura 13: Absortividade máxima (mg/g) dos corantes em diferentes concentrações no pré- tratamento com NaOH na biomassa de bananeira. Figura 14: Absortividade máxima (em mg/g) dos corantes em diferentes concentrações no pré- tratamento com H2O2 na biomassa de bananeira. 25 Figura 15: Absortividade máxima (em mg/g) de corantes em diferentes concentrações no pré- tratamento com H2SO4 na biomassa de bananeira. 26 Figura 16 – Comparativo de adsorção dos corantes entre os pré-tratamentos em meio ácido, alcalino e oxidativo 27 4.6 – Caracterização química da biomassa de bananeira Através de análises químicas, notou-se algumas diferenças na estrutura química que compõem a biomassa devido as ações dos pré-tratamentos. Os dados obtidos podem ser encontrados na próxima tabela (tabela 4). O aumento na concentração de catalisador (ácido, álcali e oxidativo) provoca modificação na composição química do material. Composição (% massa seca) Pré-tratamento Amostra Celulose Hemicelulose Lignina Controle In Natura 60.84 (1.34) 19.62 (0.53) 17.26 (0.31) 60.84 (1.34) 19.62 (0.53) 17.26 (0.31) H2SO4 (%) 5 59.68 (1.14) 12.57 (0.53) 26.28 (0.37) 10 61.62 (1.26) 11.66 (1.99) 25.66 (2.06) 15 63.76 (1.23) 8.29 (2.45) 29.16 (1.54) 20 63.37 (1.71) 4.13 (0.10) 30.08 (0.63) 25 66.28 (0.68) 3.97 (0.50) 31.15 (2.99) 30 65.11 (1.68) - 36.22 (1.15) 35 62.26 (0.89) - 36.47 (2.07) 40 60.76 (1.32) - 39.99 (2.35) NaOH (%) 5 59.65 (2.76) 14.02 (1.02) 17.11 (2.36) 10 64.32 (1.59) 12.31 (0.49) 13.10 (1.18) 15 61.63 (3.94) 11.47 (1.05) 11.09 (1.08) 20 70.01 (3.83) 9.68 (2.55) 10.78 (1.67) 25 76.52 (1.61) 5.35 (0.56) 6.24 (0.83) 30 75.48 (1.89) 4.38 (0.36) 7.65 (0.97) H2O2 (%) 2 61.77 (3.02) 15.93 (1.03) 14.19 (2.17) 4 66.91 (2.39) 14.17 (1.68) 10.49 (0.70) 6 70.99 (1.99) 11.31 (1.54) 9.29 (1.24) 8 74.37 (2.57) 8.68 (0.77) 7.17 (0.48) Tabela 4: Análise química da composição do material de bananeira pré-tratado. Os números entre parênteses representam o desvio padrão. (-) não detectado. 28 5– Discussão 5.1 – Rendimento em massa dos pré-tratamentos e caracterização da biomassa Em relação aos dados demonstrados nas tabelas 1 e 2, nota-se um padrão de eficiência elevada em todos os pré-tratamentos com notáveis diferenças entre os mesmos. Em relação ao pré-tratamento alcalino realizado com a biomassa de cana-de-açúcar, pode-se inferir que o rendimento de massa disponível ao final do mesmo é menor em maiores concentrações do reagente. Comparativamente, a menor concentração (5%) rendeu uma quantidade de massa de 64.53% da massa inicial, enquanto a maior concentração (30%) rendeu aproximadamente 23% da massa final, mostrando uma diferença de mais de 40% na eficiência do tratamento devido a maior agressividade, resultando assim em uma maior remoção da lignina. Segundo Chang et al. [18] a principal função do hidróxido de sódio é a remoção da lignina do material, exatamente o que os dados obtidos indicam. Na tabela de composição química observa-se redução na porcentagem de hemicelulose e lignina. Comparando os resultados da cana-de-açúcar com o pseudocaule de bananeira, verificou-se que já nas concentrações menores (5%) o resultado é mais eficiente (46% da massa inicial) e isso é mantido até nas maiores concentrações do reagente (30%) em que o rendimento foi de 25% da massa inicial. Isso pode ser explicado pela conformação físico- química da biomassa, que facilita o acesso do reagente ao material a ser pré-tratado e como pode ser visto na tabela 4, a composição da biomassa tem um acréscimo esperado na concentração de celulose e diminuição na concentração de lignina, com uma porcentagem relativamente baixa de perda de hemicelulose. Quanto ao pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar com o clorito de sódio, também pode-se notar uma maior eficiência conforme aumentou-se a concentração de reagente. Segundo os dados obtidos, a menor concentração de clorito, foram obtidos 54,53% da massa inicial e a maior concentração rendeu aproximadamente 44,25% da massa inicial tratada. De modo geral, o comportamento foi o mesmo para as diferentes biomassas, porém com diferente resposta as condições de pré-tratamento. Conforme mostrado por Brienzo, et al [3], o material se mostrou menos susceptível do que o esperado. Isso pode ser explicado por grandes divergências de estruturais da biomassa utilizada, o que seria comprovado mediante a uma caracterização química da mesma. Todavia, o tratamento alcalino não só corroborou com os resultados do trabalho citado, como se 29 mostrou ainda mais eficiente em relação a deslignificação, principalmente na palha da cana- de-açúcar. Conforme a tabela 2, os tratamentos ácido e oxidativo com a biomassa de bananeira também foram bastante eficientes. Ocorreu uma diferença de quase 30% entre as concentrações mínimas e máximas de H2SO4 (60,57% de biomassa obtida com a menor concentração e 32.1 % de biomassa resultante com a maior concentração). Porém, como observado na tabela 4, não houveram mudanças significativas na concentração de celulose e ao contrário do desejado, houve grande acréscimo na concentração de lignina. A fração de hemicelulose foi reduzida a valores insignificantes, o que mostra que esse não é o pré- tratamento mais indicado para esse tipo de material. O pré-tratamento oxidativo se mostrou o menos eficiente em termos de quantidade de biomassa obtida, sendo a diferença entre as maiores e menores concentrações (2% e 8%) de aproximadamente 16% (48.60% e 32.4% respectivamente). Entretanto, a caracterização do material mostra que o pré-tratamento pode ser utilizado para um bom rendimento das frações, pois foi observado um aumento significativo na concentração de celulose e um decréscimo na concentração de lignina. A hemicelulose teve sua concentração alterada, mas os valores obtidos não chegaram a ser pouco significativos como no tratamento alcalino (aproximadamente 8% no pré-tratamento oxidativo). Os resultados da caracterização da biomassa de bananeira podem ser comparados com os dados sobre cana-de-açúcar obtidos por Pietrobon et al. [19] onde as concentrações foram semelhantes aos três componentes no material in natura, porém nos materiais pré-tratados em meios ácido e alcalino se mostram menos eficiente na cana-de-açúcar do que na bananeira, se tratando na remoção da lignina. Isso demonstra que a bananeira é mais susceptível a tratamentos mais severos do que a cana-de-açúcar 5.2 – Hidrólise enzimática: rendimento de glicose A cinética enzimática, com rendimento em glicose permitiu análises comparativas entre os materiais pré-tratados e o controle, podendo assim inferir a eficiência na proporção de glicose obtida através da hidrólise enzimática (com enzimas hidrolíticas CTEC). Com a biomassa de cana-de-açúcar foi utilizado o método de linearização por DNS, onde os valores de absorbâncias obtidos foram transformados em concentrações (mg/mL) de glicose, como demonstrados na tabela 3. A biomassa de bananeira, após os pré-tratamentos foram hidrolisadas por diferentes tempos e foram analisados por cromatografia líquida para 30 quantificação das frações de glicose e xiloses como demonstrados nas curvas de rendimento (figuras 7,8 e 9). Os pré-tratamentos tem por objetivo a retirada/modificação da lignina e parte da hemicelulose para que ocorra melhor a hidrólise enzimática (ÖHGREN et al). Isso ocorre devido ao fato da lignina atuar fisicamente como um bloqueio as enzimas, assim realizando grande adsorção das mesmas, que não realizam a hidrólise do material e diminuem a concentração de glicose resultante (PALONEN et al.). A propriedade responsável pelo sucesso da hidrólise enzimática é a acessibilidade [9]. Durante os experimentos, verificou-se eficiência nos pré-tratamentos, em especial o alcalino, que resultou em altas concentrações de glicose obtidas mesmo nas baixas concentrações de reagente no pré-tratamento. Diferentemente, o clorito de sódio, nos menores tempos de reação, resultou em valores de glicose abaixo do grupo controle. Duas interpretações são possíveis: No caso do clorito de sódio, o tempo de reação foi um fator crucial para a hidrólise ocorrer, pois como observado, no tratamento de 30 minutos, a média de miligrama de glicose por mL ficou em 1,55 e no tempo máximo de reação (180 minutos) a média ficou em torno de 3,1 o que é muito acima do grupo controle; A outra observação é que a concentração de NaOH foi determinante para a hidrólise, uma vez que na menor concentração a média ficou em torno de 2,3 mg/mL, o que já é mais alto do que o controle, comprovando assim sua eficiência e na maior concentração a média de glicose foi de 3,84 mg/ml. Isso indica que ambos os tratamentos são eficientes, porém, mais uma vez o pré- tratamento alcalino superou o ácido. Na biomassa de bananeira, podemos observar em todos os pré-tratamentos uma grande eficiência na liberação de glicose. Podemos notar que nos pré-tratamentos ácido e alcalino, tanto o tempo quanto a concentração dos reagentes foram fatores de extrema importância para melhores resultados de hidrólise. Observa-se que até o tempo de reação de 24 horas ambos possuem grandes aumentos em suas concentrações de glicose, e após isso a concentração sobe de maneira mais branda, tornando principalmente a concentração de reagente responsável pelo fim da hidrólise. Esse comportamento é explicado devido a recalcitrância do material que aumenta durante a hidrólise enzimática. Ao mesmo tempo que a celulose é removida por ação de enzimas, a lignina aumenta em porcentagem, originando um material mais resistente [20]. No tratamento oxidativo, apesar das concentrações serem diferentes até o tempo de reação de 18 horas, todas as amostras renderam quantidade de glicose semelhantes, tornando então o tempo de reação o principal responsável pelas concentrações obtidas. Enquanto nos tratamentos alcalino e ácido as menores concentrações resultaram em menores valores de 31 rendimento de glicose, no tratamento oxidativo as menores concentrações de H2O2 agiram de forma mais eficientes do que a maior concentração (8%). Isso demonstra que a agressividade do tratamento pode inferir de forma negativa nos resultados, modificando a estrutura da biomassa de maneira a deixar muita hemicelulose, o que aparenta ser prejudicial para o rendimento enquanto nos dois primeiros tratamentos a maior agressividade e assim maior remoção de hemicelulose e lignina acarretam em melhores resultados referentes a concentração de glicose obtidas. Tratamentos severos, com alta concentração de reagentes pode afetar as propriedades físico-químicas do material, melhorando a digestibilidade, mas pode levar a perda de celulose [9]. 5.3 – Acessibilidade – adsorção de corantes Nas análises de absortividade máxima, podemos comparar tanto as condições de pré- tratamento, quanto os materiais analisados. Em relação ao bagaço de cana-de-açúcar, ambos os tratamentos foram eficientes em aumentar a acessibilidade, porém o tratamento com clorito durante 180 minutos foi o que levou a maior acessibilidade, o que indica a possibilidade de ocorrer maior ação enzimática, tornando assim o processo mais eficiente. Nota-se que os tratamentos por clorito a 60 e 120 minutos são praticamente indiferentes, o que nos mostra que o tempo de reação é crucial. O clorito de sódio é um reagente especifico para remoção de lignina, e foi utilizado nesse trabalho como parâmetro para os demais pré-tratamentos. Assim, seu uso é para fins analíticos, diferente dos pré-tratamentos ácido diluído, alcalino e oxidativo. O tratamento com hidróxido de sódio, na menor concentração (5%), a ação do pré- tratamento foi imparcial, enquanto que com maiores concentrações o tratamento se mostrou bastante efetivo, o que demonstra, assim como na hidrólise enzimática, que a concentração do reagente é o principal fator para uma melhor acessibilidade. Quanto maior a concentração de reagentes, maior a adsorção de corantes, que indica maior acessibilidade e por consequência maior o rendimento de glicose na hidrólise enzimática. Esse comportamento é o esperado quando se trabalha com diferente severidade, por exemplo, diferentes concentrações de ácido ou base [2,3]. Para amostras de bananeira, em todos os casos os pré-tratamentos foram efetivos e renderam bons resultados de adsorção de corantes, ou seja, acessibilidade. As amostras pré- tratadas com hidróxido de sódio mostraram um melhor resultado com uma concentração de 25% do que com a de 30% e isso provavelmente se explica pelo fato que alta severidade pode levar a perda de celulose. Seria esperado que quanto mais severo o pré-tratamento, mais poros ou desestruturação do material, e por consequência maior acessibilidade. Por outro lado, 32 componentes da biomassa podem ser degradados. Assim, deve existir um equilíbrio em maximizar a acessibilidade para melhor digestibilidade, com a perda de componentes da biomassa (Tabela 4). Em todos os pré-tratamentos pode-se inferir que a menor concentração de reagente é a menos viável pois demonstra resultados praticamente indiferentes do material sem pré- tratamento. No pré-tratamento oxidativo, temos uma maior quantidade de corante laranja adsorvido, o que demonstra maior potencial de ação enzimática superficial, enquanto no material pré-tratado por meio ácido, inferimos uma maior quantidade de corante azul adsorvida, o que mostra maior potencial enzimático de ação interna ao material. No bagaço de cana-de-açúcar, os resultados mais satisfatórios mostram um maior potencial de ação enzimático interno ao material (maior concentração de corante azul adsorvido) como o esperado, conferindo maior acessibilidade enzimática ao material. Comparando os materiais analisados, os resultados foram melhores para bagaço de cana-de-açúcar em ambos pré- tratamentos. Isso pode ter ocorrido devido as diferentes características dos materiais, como propriedades físico-químicas e composição [2]. Como observado por Pietrobon et al. [19] em comparação a esse trabalho, a cana de açúcar apresenta menor porcentagem de lignina em sua composição do que a bananeira, o que pode facilitar a remoção da mesma pelos tratamentos e a ação enzimática. 6 – Conclusões  Os pré-tratamentos aplicados resultaram em bons rendimentos, tanto em massa, quanto digestibilidade enzimática (rendimento em glicose na etapa de hidrólise enzimática) para ambos os materiais estudados. Ainda, a concentração de reagente (ácido, álcali e oxidativo) foi claramente um fator fundamental, e proporcional ao efeito provocados na biomassa.  Comparativamente, os resultados em rendimento de massa foram semelhantes em relação aos pré-tratamentos, visto que a biomassa de cana-de-açúcar quando pré- tratada com NaOH, foi a mais deslignificada, com cerca de 22% de massa inicial obtido, seguido pela biomassa de bananeira pré-tratada por NaOH, que chegou a 25% de massa inicial resultante. Isso indica que para a deslignificação, o pré- tratamento alcalino nas condições aplicadas nesse trabalho foi o mais eficiente. 33  Em relação a atividade hidrolítica, apesar da grande semelhança entre os resultados obtidos entre os pré-tratamentos ácido e alcalino (o pré-tratamento oxidativo na bananeira foi ligeiramente menos eficiente) os resultados do tratamento alcalino se mostrou mais uma vez mais eficazes do que os resultados do pré-tratamento ácido. Esse comportamento foi observado para ambos os materiais analisados.  Os resultados de rendimento de glicose foram mais altos e semelhantes nos pré- tratamentos com hidróxido de sódio do que no pré-tratamento com clorito de sódio, em ambos os materiais, o que mais uma vez demonstra a melhor eficiência do pré-tratamento alcalino.  Em relação a acessibilidade, o pré-tratamento de maior eficácia foi o ácido em ambos os materiais, por ter provocado maior acessibilidade para ambos os corantes. Destaca-se maior efeito na estrutura interna da biomassa, devido maior adsorção do corante azul. Sendo assim, quando o objetivo de menor perda de material, e maior acessibilidade, o melhor pré-tratamento foi o ácido diluído.  De modo geral, o pré-tratamento alcalino se mostrou eficiente, apresentando maior proporção de celulose na biomassa de bananeira e boa deslignificação. Todavia o tratamento ácido se mostrou mais eficiente para a melhoria de acessibilidade enzimática à celulose. Todos aos pré-tratamentos apresentam pontos positivos, e seu uso pode ser definido em função das condições de reação, maximizando assim o efeito desejado sobre o material. 34 7- Referências: [1] Chittibabu, S., Rajendran, K., Santhanmuthu, M., & Saseetharan, M. (2011). Optimization of microwave assisted alkali pretreatment and enzymatic hydrolysis of banana pseudostem for bioethanol production. Int. J. Environ. Sci. Technol, 67-71. [2] Brienzo, M., Tyhoda, L., Benjamin, Y., & Görgens, J. (2015). 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Anexo 2 – Linearização dos dados de adsorção de corantes na cana-de-açúcar pré-tratada por Clorito 37 Anexo 3: Linearização dos dados de adsorção na cana-de-açúcar pré-tratada por NaOH Anexo 4: Linearização dos dados de adsorção de corantes na biomassa de bananeira pré-tratada por NaOH 38 Anexo 5: Linearização dos dados de adsorção de corantes na bananeira pré-tratada por H2O2 Anexo 6: Linearização dos dados de adsorção de corantes na bananeira pré tratada por H2SO4 39 Rio Claro, ____ de ______________ de ________. ________________________________________ Pedro Henrique Ciconello Ghiraldi De acordo ____/____/_____. _______________________________________ Prof. Dr. Michel Brienzo De acordo ____/____/_____. _______________________________________ Prof. Dr. Jonas Contiero