UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA BAC E AVALIAÇÃO DE MARCADORES PARA CARACTERIZAÇÃO DE REGIÕES ALVO DO GENOMA DO BÚFALO Nedenia Bonvino Stafuzza Bióloga JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Novembro de 2010 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA BAC E AVALIAÇÃO DE MARCADORES PARA CARACTERIZAÇÃO DE REGIÕES ALVO DO GENOMA DO BÚFALO Nedenia Bonvino Stafuzza Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Novembro de 2010 Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Genética e Melhoramento Animal. Stafuzza, Nedenia Bonvino S779c Construção de uma biblioteca BAC e avaliação de marcadores para caracterização de regiões alvo do genoma do búfalo / Nedenia Bonvino Stafuzza. – – Jaboticabal, 2010 ix, 142 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2010 Orientadora: Maria Elisabete Jorge Amaral Banca examinadora: Humberto Tonhati, Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis, Luciane Madureira de Almeida Bibliografia 1. Bubalus bubalis. 2. Biblioteca genômica. 3. Mapeamento. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 636.293:636.082 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Campus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DA AUTORA NEDENIA BONVINO STAFUZZA - nascida em 11 de setembro de 1980, na cidade de São José do Rio Preto - SP, Brasil, filha de Maria Celia Stafuzza e Moacir Bonvino Júnior. Iniciou em Fevereiro de 2000 o curso de Ciências Biológicas no Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto-SP (IBILCE – UNESP), onde em 29 de novembro de 2003 e em 02 de Julho de 2005 obteve os títulos de Licenciada e Bacharel em Ciências Biológicas, respectivamente. Em março de 2005 ingressou no Programa de pós-graduação em Genética (IBILCE – UNESP) como aluna de mestrado, bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), orientada pela Profa. Dra. M. Elisabete Amaral, cuja dissertação intitulada “Construção de um Mapa Comparativo Preliminar do Cromossomo 6 do búfalo de rio (Bubalus bubalis) utilizando células somáticas híbridas irradiadas” foi defendida em fevereiro de 2007. Ingressou no curso de doutorado em março de 2007, no mesmo programa de pós-graduação e com bolsa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), também sob orientação da Profa. Dra. M. Elisabete Amaral. Em dezembro de 2008, transferiu o doutorado para o Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal (FCAV – UNESP), sob a mesma orientação, onde a tese de doutorado foi concluída. Atuou como professora substituta da disciplina de Biologia Molecular no IBILCE-UNESP (Campus de São José do rio Preto-SP) nos anos de 2007 e 2008. As atividades desenvolvidas ao longo da carreira acadêmica resultaram em sete artigos publicados em revistas internacionais, além de 28 resumos publicados em anais de congressos nacionais e internacionais. Também durante o período, exerceu a co-orientação de seis alunos de iniciação científica e/ou estágio básico. “Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado para sempre à margem de nós mesmos.” Fernando Pessoa AGRADECIMENTOS Aos então coordenadores do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV-UNESP), Dra. Lúcia Galvão de Albuquerque e Dr. Humberto Tonhati, pela oportunidade de realizar o Doutorado em um programa de excelente qualidade. À FAPESP pela concessão da bolsa de estudos durante 42 meses, deixo aqui expresso meus agradecimentos. À Dra. Elisabete Amaral, por esses quase 10 anos de orientação. Tudo que aprendi na vida acadêmica teve sua participação e orientação. Obrigada por ter me ensinado a fazer Ciência, sempre com ética e responsabilidade. Agradeço sua disponibilidade irrestrita, seu modo exigente, crítico e criativo de argüir as idéias, sempre me instigando a pensar “cientificamente” para alcançar meus objetivos. Obrigada pela sua compreensão, por sua amizade, pela alegria que tem sido trabalhar ao seu lado e, principalmente, pela confiança depositada. À Dra. Vera Hossepian de Lima pela orientação/co-orientação durante a fase de transição do credenciamento da Dra. Elisabete Amaral junto ao programa de pós- graduação em Genética e Melhoramento Animal. Obrigada por ter me aceito como uma das suas “bruxas”. Jamais esquecerei o carinho e a atenção prestada. Aos professores Dr. Humberto Tonhati, Dra. Lucia Galvão de Albuquerque, Dra. Maria Inês Tiraboshi Ferro e Dra. Eliana Gertrudes Macedo Lemos pelas sugestões prestadas no Exame de Qualificação da presente Tese. Aos membros da comissão examinadora da presente tese de doutorado Dra. Luciane Madureira de Almeida, Dra. Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis, Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima e Dr. Humberto Tonhati por terem aceitado o convite de prontidão. Agradeço as valiosas sugestões e/ou correções prestadas. A participação de vocês foi de extrema importância para deixar esse trabalho mais completo. Aos professores do programa de Pós graduação em Genética e Melhoramento Animal (FCAV - UNESP) por terem auxiliado na minha formação. Aos colegas de laboratório que tive o prazer de conviver durante o doutorado, cujo tempo de convivência foi muito menor do que eu gostaria, porém o suficiente para criarmos laços de amizade: André Santana, Anelise Russo, Bruna Naressi, Carolina Stucchi, Edson Rodrigues-Filho, Larissa Fornitano, Mário Azevedo, Mariana Victoretti, Melissa Miziara e Vanderlei Pelai. A todos os colaboradores, que não foram poucos, já que essa tese é um produto coletivo, onde várias pessoas contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho chegasse ao bom termo. A todos os colaboradores, registro aqui minha eterna gratidão. Aos eternos amigos por estarem sempre comigo, mesmo distantes! Vocês fazem muita falta! Agradeço em especial a grande amiga Paola, por todos esses anos de amizade, respeito e confiança. Foram inúmeros os momentos em que exerceu a paciência, a preocupação, a tolerância e o respeito, itens que só cabem a uma pessoa de espírito iluminado! Obrigada pelos conselhos e incentivos, sempre me colocando em pé durante meus tombos! À todos os membros da família Stafuzza, em especial a minha mãe por ter me apoiado e permitido a realização de um sonho. Sem você eu não teria chegado até aqui! Ao Luciano, meu eterno namorado, por esses 10 anos de respeito, amizade e companheirismo! Obrigada a todos pelo carinho, respeito e amizade! SUMÁRIO Página CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................................ 1 Referências bibliográficas ...................................................................................... 13 CAPÍTULO 2 - CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA BAC DE BUFALO DE RIO .... 17 Resumo .................................................................................................................. 18 Introdução .............................................................................................................. 19 Objetivos ................................................................................................................ 28 Material e Métodos ................................................................................................. 29 Resultados e Discussão ......................................................................................... 46 Conclusões ............................................................................................................. 55 Referências bibliográficas ...................................................................................... 56 CAPÍTIULO 3 - AVALIAÇÃO DE MARCADORES DE DNA DO GENOMA BOVINO PARA SELEÇÃO DE CLONES DA BIBLIOTECA BAC DE BÚFALO .......................... 60 Resumo .................................................................................................................. 61 Introdução .............................................................................................................. 62 Objetivos ................................................................................................................ 77 Material e Métodos ................................................................................................. 78 Resultados e Discussão ......................................................................................... 81 Conclusões ............................................................................................................. 97 Referências bibliográficas ...................................................................................... 98 CAPÍTIULO 4 - GERAÇÃO DE MARCADORES DERIVADOS DO GENOMA DO BÚFALO PARA O GENE CSN3 ................................................................................... 107 Resumo .................................................................................................................. 108 Introdução .............................................................................................................. 109 Objetivos ................................................................................................................ 114 Material e Métodos ................................................................................................. 115 Resultados e Discussão ......................................................................................... 119 Conclusões ............................................................................................................. 126 Referências bibliográficas ...................................................................................... 127 APÊNDICES ................................................................................................................. 130 Apêndice 1 - Seqüência do Vetor pBeloBAC11....................................................... 131 Apêndice 2 - Soluções utilizadas na construção da biblioteca BAC de búfalo ....... 134 Apêndice 3 - Seqüência consenso do gene CSN3 de búfalo ................................ 137 Apêndice 4 – Alinhamento da seqüência consenso do gene CSN3 de búfalo com as seqüências do gene CSN3 bovino ........................................................................... 138 CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA BAC E AVALIAÇÃO DE MARCADORES PARA CARACTERIZAÇÃO DE REGIÕES ALVO DO GENOMA DO BÚFALO RESUMO - O crescimento da população bubalina em território brasileiro está relacionado ao interesse dos produtores nesse animal, como uma alternativa para a produção de carne, leite e seus derivados. Diante deste panorama, torna-se necessário o aprimoramento de programas de melhoramento genético, visando a seleção de animais geneticamente superiores para a reprodução. Por essa razão, o conhecimento do genoma da espécie é de extrema valia para o setor, uma vez que gera informações necessárias à identificação e avaliação de genes associados com características de interesse econômico. Desse modo, o presente trabalho envolveu a construção de uma nova ferramenta genômica para búfalo, denominada biblioteca BAC, a qual permitirá um novo direcionamento nos estudos moleculares do genoma bubalino, destacando-se a definição da estrutura e organização de genes de interesse econômico, fornecendo informações em nível de seqüência de DNA para o entendimento dos mecanismos e regulação dos mesmos. Com a disponibilidade dessa ferramenta, as primeiras regiões a serem caracterizadas serão aquelas que contêm genes de interesse econômico, as quais se destacam as regiões com genes relacionados com produção e qualidade do leite, regiões com genes relacionados com resposta imune e adaptativa, e regiões com genes da família das lipocalinas, os quais estão envolvidos com características de produção e reprodução. Porém, para que esses genes possam ser caracterizados por meio da biblioteca BAC de búfalo, há a necessidade de gerar marcadores para identificar e isolar clones específicos para esses genes. Marcadores derivados do genoma bovino têm sido utilizados com sucesso em estudos de mapeamento do genoma bubalino, os quais podem ser uma fonte importante de marcadores. Porém, para famílias gênicas, há a necessidade da geração de marcadores específicos para búfalo, uma vez que apresentam seqüências de DNA muito semelhantes. A disponibilidade de marcadores torna possível a caracterização dessas regiões-alvo no genoma do búfalo, fornecendo informações em nível de seqüência de DNA, que quando comparadas com a seqüência correspondente em outros bovídeos, podem revelar diferenças significativas de determinadas características entre as espécies. Palavras-chave: Bubalus bubalis, caseínas, lipocalinas, mapeamento, resposta imune, seqüenciamento CONSTRUCTING A BAC GENOMIC LIBRARY AND EVALUATING MARKERS TO CHARACTERIZE TARGET REGIONS OF THE BUFFALO GENOME SUMMARY - The increase of the buffalo population in Brazil is the result of the great interest of the producers as an alternative source for the production of meat, milk and dairy products. Thus, it becomes necessary genetic improvement programs more effective, in order to select genetically superior animals for breeding. The knowledge of the buffalo genome is valuable in this regard, since it generates information to identify and evaluate genes associated with economically traits. In this project we constructed a new genomic tool for buffalo - a genomic BAC library - which can be used in molecular studies of buffalo genome especially those related with the definition of the molecular structure and organization of economically important genes. Once this genomic tool is available, the first target regions of the buffalo genome to be characterized are those containing genes related to milk production, adaptive and innate immune response, and regions lipocalin genes involved in reproduction and production traits. However, to characterize these regions using the BAC library is necessary to have molecular markers to be able to identify and isolate the specific clones. Markers derived from the bovine genome have been successfully used in buffalo genome mapping studies, showing to be an important source of markers. On the another hand, for those genes found in the genome as gene families, there is a need for buffalo specific markers. The evaluation of new markers will contribute to the characterization of those target regions of the buffalo genome, providing information about the genomic architecture of this specie when compared with other bovid. Keywords: Bubalus bubalis, caseins, immune response, lipocalins, mapping, sequencing � ������ �� ��� ���� ������� � CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS A família Bovidae é a mais diversa das nove famílias da ordem Arthiodactyla, cuja subsubfamília Bovinae compreende seis gêneros: Angra, Bibos, Bison, Bos, Bubalus e Syncerus. Os búfalos estão divididos em dois gêneros: os búfalos selvagens de origem africana (Syncerus) e os búfalos de origem asiática (Bubalus). Do gênero Bubalus, são ainda encontrados em estado selvagem os búfalos Arni na Índia e Nepal (B. arnee), os búfalos Anoa das planícies e montanhas da Indonésia (B. depressicornis e B. quarlesi) e os búfalos Tamarao das Filipinas (B. mindorensis). Já os búfalos criados com objetivos econômicos (búfalos domésticos) são apenas os da espécie B. bubalis, como ilustrado na Figura 1 (LENSTRA & BRADLEY, 1999). Figura 1. Búfalos africanos (Syncerus) e asiáticos (Bubalus) com as respectivas espécies selvagens (S. caffer, B. mindorensis, B. depressicornis, B. quarlesi e B. arnee) e domesticada (B. bubalis). Búfalo de pântano Búfalos Búfalo selvagem africano (Syncerus caffer) Búfalo asiático Búfalos selvagens Búfalos domésticos (Bubalus bubalis) Arni (Bubalus arnee) Anoa (Bubalus depressicornis) (Bubalus quarlesi) Tamarao (Bubalus mindorensis) Búfalo de rio De acordo com estudos morfológicos (MACGREGOR, 1939), bioquímicos (BARKER et al., 1997a; AMANO 1983), genéticos (IANNUZZI, 1994; BERARDINO & IANNUZZI, 1981; FISCHER & ULBRICH 1968) e moleculares (LAU et al., 1998; BARKER et al., 1997b; KIKKAWA et al., 1997), os búfalos da espécie Bubalus bubalis podem ser divididos em dois grupos: os búfalos de pântano (2n=48) e os búfalos de rio (2n=50). Estimativas do tempo de divergência desses grupos dependem da calibração do relógio molecular, uma vez que extrapolações baseadas em taxas de variações de microssatélites apontam para uma divergência entre 10 e 15 mil anos (BARKER et al., 1997b), enquanto que estudos de seqüências de DNA mitocondrial revelam uma divergência entre 28 e 87 mil anos (LAU et al., 1998). Existem diversas raças de búfalo, com maior ou menor aptidão para produção de leite, carne ou para transporte de carga e tração, uma vez que este animal é considerado de tripla aptidão (GARCIA et al., 2005; OLIVEIRA, 2005; NANDA & NAKAO, 2003). O cariótipo do búfalo de rio consiste em cinco pares de cromossomos autossomos submetacêntricos, 19 cromossomos acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (X e Y), onde os cinco cromossomos submetacêntricos são resultantes de fusões entre os cromossomos acrocêntricos do genoma bovídeo ancestral (IANNUZZI, 1994). A divergência em número de cromossomos em relação ao búfalo de pântano se deu pela fusão do braço curto do cromossomo 4 com o cromossomo 9 (translocação telômero- centrômero) (IANNUZZI, 1994). A Figura 2 ilustra o ideograma do cariótipo padrão do búfalo de rio, estabelecido em 1994 por IANNUZZI. Segundo estimativas da FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), a espécie Bubalus bubalis se difundiu por todo o mundo, a partir do continente asiático, com uma população atual que ultrapassa 180 milhões de animais distribuídos em 42 países (FAO, 2008). No Brasil, os búfalos foram introduzidos no século XIX, em pequenos lotes originários da Ásia, Europa e Caribe, apresentando hoje o maior rebanho das Américas, estimado em 1,1 milhões de animais (FAO, 2008; BERNARDES, 2007). Figura 2. Ideograma dos cromossomos do genoma do búfalo de rio, representado por cinco pares de cromossomos autossomos submetacêntricos, 19 pares acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (Adaptado de IANNUZZI, 1994). Devido à maneira com que o sistema estatístico nacional coleta os dados agropecuários, os búfalos em muitas situações tem sido registrados como bovinos. Assim, acredita-se que haja uma subestimação da real dimensão do rebanho bubalino brasileiro, já que a Associação Brasileira de Criadores de Búfalos (ABCB), por levantamentos indiretos e avaliações de abate/desfrute, aponta um rebanho com cerca de 3,5 milhões de animais e um crescimento anual de 3% (BERNARDES, 2007). Resultados do Censo Agropecuário do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) mostram o rebanho brasileiro distribuído em aproximadamente 64,5% dos animais na região Norte, 12,8% na região Sul, 9,1% no Sudeste, 9,1% no Nordeste e 4,5% no Centro-Oeste (IBGE, 2006). Três raças de búfalo de rio são reconhecidas pela ABCB - Mediterrâneo, Murrah e Jafarabadi – e uma raça de búfalo de pântano, denominada Carabao (ABCB, 2010). O padrão racial estabelecido pela ABCB orienta os criadores na identificação de animais quando não há registros de origem da formação de um plantel, no julgamento e na seleção de reprodutores (machos e fêmeas), bem como no estabelecimento da aptidão produtiva de acordo com a conformação e o tipo do animal (ANDRADE & GARCIA, 2005). A adaptabilidade dos búfalos aos mais variados ambientes e sua elevada longevidade produtiva, contribuíram para o interesse dos produtores em criar os búfalos como uma alternativa para a produção de carne, leite e derivados, gerando um crescimento significativo do rebanho bubalino brasileiro (OLIVEIRA, 2005). Esse crescente aumento da bubalinocultura nacional também está relacionado com as vantagens produtivas inerentes da espécie, que elevam cada vez mais o seu desempenho econômico no cenário agropecuário brasileiro e mundial. Diante deste panorama, torna-se necessário um aprimoramento dos programas de melhoramento genético, visando maximizar a reprodução de animais geneticamente superiores por meio do uso de biotecnologias reprodutivas. Por isso, o conhecimento do genoma da espécie é de extrema valia para o setor, uma vez que gera informações necessárias à identificação e avaliação de genes associados com características economicamente importantes. O mapeamento é a área mais avançada das pesquisas da genômica animal. Genes codificantes de proteínas têm sido adicionados aos mapas dos genomas dos animais da pecuária nos últimos dez anos, os quais resultaram em uma gama de testes de DNA aplicados na avaliação de populações comerciais de bovinos e suínos, por exemplo. Os dados de mapeamento associados às seqüências dos genomas formam a base para o grande desafio do momento da pesquisa genômica, que é identificar como as variações encontradas nas seqüências de um determinado gene afetam o fenótipo e, como a rede de genes e de seus transcritos interagem. Mapas do genoma contendo genes podem ser comparados com aqueles de outras espécies para selecionar genes e/ou regiões candidatas potencialmente associadas com a segregação de características de interesse. A mais recente estratégia de mapeamento aplicada no estudo dos genomas das principais espécies de animais de interesse econômico foi descrita por GOSS e HARRIS (1975) e redescoberta no início dos anos 90 para estudos do genoma humano (COX et al., 1990). Essa estratégia de mapeamento envolve a utilização de painéis de clones celulares híbridos (painéis RH), cujas células contêm fragmentos do genoma da espécie de interesse incorporados aleatoriamente aos cromossomos de uma célula receptora sendo, no caso de mamíferos, uma célula de roedor (hamster). Para a obtenção dos clones celulares do painel, uma dose letal de radiação é aplicada nas células do genoma de interesse, com a função de quebrar, ao acaso, seus cromossomos em múltiplos fragmentos (COX et al., 1990). Estes fragmentos são posteriormente incorporados de maneira aleatória ao genoma da célula receptora mutante, por meio de um processo de fusão celular como ilustrado na Figura 3. Cada clone celular gerado a partir do processo de fusão celular contém um único conjunto de fragmentos cromossômicos da espécie de interesse incorporado ao genoma da célula receptora, atingindo estabilidade cromossômica após sucessivos processos de divisão celular. Estudos iniciados em 2004 no Laboratório de Genômica Comparativa - IBILCE/UNESP resultaram na construção de um painel RH para o genoma bubalino (BBURH5000) o qual foi utilizado com sucesso na geração de mapas RH de cromossomos específicos (STAFUZZA et al., 2009; IANELLA et al., 2008; RODRIGUES-FILHO et al., Figura 3. Processo de fusão celular, ocorrido na construção de um painel de células híbridas irradiadas. Adaptação da figura gentilmente cedida pelo Dr. James E. Womack. 2008; AMARAL et al., 2007; STAFUZZA et al., 2007; GOLDAMMER et al., 2007; MIZIARA et al., 2007), além da primeira geração de mapas de todos os cromossomos deste genoma (AMARAL et al., 2008). O painel BBURH5000 foi utilizado em conjunto com ferramentas genômicas de última geração, como os chips de DNA do genoma bovino, para um mapeamento extensivo do genoma do búfalo, onde foram mapeados quase 3000 marcadores, incluindo microssatélites, genes e SNPs (do inglês Single Nucleotide Polymorphism) derivados do genoma bovino (AMARAL et al., 2008). Esse elevado número de marcadores resultou em mapas altamente informativos do genoma bubalino, principalmente quando comparados com o genoma bovino, fornecendo resultados relevantes para ambas espécies. Além disso, a tecnologia de mapeamento RH inseriu o búfalo no panorama mundial das espécies de interesse econômico com ferramentas e informações genômicas disponíveis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/buffalo/). Os mapas de todos os cromossomos do búfalo estão disponíveis no banco de dados americano MapViewer, no endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ mapview/ map_search.cgi?taxid=89462. Grupos de pesquisa de diversos países estão se organizando para unir esforços visando o seqüenciamento do genoma do búfalo. Aproximadamente 67 mil seqüências de DNA de búfalo já estão depositadas no banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/), das quais menos de duas mil são seqüências de genes nucleares (MICHELIZZI et al., 2010). Diante dessa realidade, os mapas RH de todos os cromossomos do búfalo são de extrema importância, pois servem de orientação para organização e alinhamento das seqüências de DNA geradas. A Figura 4 ilustra uma linha do tempo com os principais trabalhos publicados sobre os estudos do genoma do búfalo. Na Figura 4 observa-se o avanço das pesquisas do genoma dessa importante espécie econômica após os estudos resultantes do uso do painel BBURH5000. Também se encontram ilustrados, os trabalhos em preparação, como por exemplo, a construção da biblioteca BAC e o mapa de alta resolução da região MHC (do inglês, Major Figura 4. Principais trabalhos publicados de estudos do genoma do búfalo, onde os trabalhos de mapeamento estão representados com os respectivos números de marcadores mapeados. Os trabalhos da construção da biblioteca BAC e do mapa de alta resolução da região MHC e da Segunda Geração de mapas RH para todos os cromossomos do genoma bubalino estão previstos para serem finalizados ainda em 2010. Já o seqüenciamento do genoma bubalino total está previsto para ser concluído em 2011. Mapa Citogenético de todos os cromossomos 64 marcadores (IANNUZZI et al., 2003) Seqüenciamento do genoma Revisão dos marcadores mapeados em todos os cromossomos 99 marcadores (EL NAHAS et al., 2001) Mapa de alta resolução da região MHC Mapa RH do cromossomo Y 19 marcadores (STAFUZZA et al., 2009) Mapa RH do cromossomo X 33 marcadores (IANELLA et al., 2008) Mapa RH do cromossomo 20 27 marcadores (KOCHAN et al., 2008) Mapa RH da região MHC 10 marcadores (RODRIGUES-FILHO et al., 2008) Mapas RH de todos os cromossomos 2621 marcadores (AMARAL et al., 2008) Mapa citogenético de todos os cromossomos 68 marcadores (DI MEO et al., 2008) Construção do painel BBURH5000 e mapa RH dos cromossomos 3 e 10 66 marcadores (AMARAL et al., 2007) Mapa RH do cromossomo 6 33 marcadores (STAFUZZA et al., 2007) Mapa RH do cromossomo1 69 marcadores (MIZIARA et al., 2007) Mapa RH do cromossomo 7 50 marcadores (GOLDAMMER et al., 2007) 2007 20102008 2009 1994 Cariótipo Padrão (IANNUZZI, 1994) 20032001 Construção da Biblioteca BAC Histocompatibility Complex), os quais estão descritos nos capítulos 2 e 3 da presente tese, respectivamente. Outra ferramenta genômica importante para os estudos do genoma bubalino é a biblioteca genômica do tipo BAC (do inglês Bacterial Artificial Chromosome), a qual recebe esta denominação devido ao tipo de vetor de clonagem utilizado. Esse tipo de ferramenta também foi construída para os principais animais de interesse econômico como suíno (LIU et al., 2010; FAHRENKRUG et al., 2001), eqüino (GODARD et al., 1998), bovino (EGGEN et al., 2001; BUITKAMP et al., 2000; WARREN et al., 2000; ZHU et al., 1999; CAI et al., 1995), caprino (SCHIBLER et al., 1998) e ovino (VAIMAN et al., 1999). A biblioteca BAC de búfalo permitirá um novo direcionamento nos estudos moleculares do genoma bubalino destacando-se: isolamento de genes e/ou grupos de genes a partir de uma região de interesse (CHIU et al., 2004); mapeamento físico de cromossomos inteiros (CHEN et al., 2004); elucidação da organização gênica (STRONG et al., 1999); clonagem posicional (DONOVAN et al., 2000); seqüenciamento e re- seqüenciamento do genoma ou de regiões-alvo do mesmo e, identificação de elementos reguladores (KRZYWINSKI et al., 2004). Com a disponibilidade da biblioteca BAC, as primeiras regiões do genoma do búfalo a serem caracterizadas serão aquelas que contêm os genes relacionados com produção e qualidade do leite, as quais englobam os genes codificantes das caseínas (alfa-s1, alfa-s2, beta e kapa), da beta-lactoglobulina e da alfa-lactoalbumina, presentes nos cromossomos bubalinos 7, 12 e 4 respectivamente. Outra região-alvo se encontra no braço curto do cromossomo 2 bubalino (BBU2p), onde estão localizados os genes do MHC, muitos dos quais desempenham um papel importante na resposta imune inata e adaptativa. Por fim, os genes da família das lipocalinas também se localizam em regiões importantes a serem caracterizadas devido às diversas funções desempenhadas por essas proteínas, das quais algumas já foram relacionadas com características de produção, reprodução e resposta imune e inflamatória. Alguns genes das lipocalinas encontram-se alocados nos cromossomos bubalinos 2, 3, 4, 9, 12, 15 e 23. Para que essas regiões possam ser caracterizadas com a biblioteca BAC de búfalo, há a necessidade de gerar marcadores de DNA para identificar e isolar clones específicos da biblioteca para esses genes. Marcadores derivados do genoma bovino têm sido utilizados com sucesso em estudos de mapeamento do genoma bubalino demonstrando ser uma opção viável (AMARAL et al., 2008). Porém, para genes com seqüências de DNA muito similares, principalmente aqueles genes oriundos de famílias gênicas, surge a necessidade da geração de marcadores específicos de búfalo. A associação entre as informações geradas pelos mapas RH e a biblioteca BAC, possibilitará gerar conhecimentos que poderão ser aplicados no aperfeiçoamento da utilização e conservação da variabilidade genética em búfalos, na implementação dos programas de melhoramento genético desses animais e na avaliação de populações comerciais, contribuindo sobremaneira para um maior retorno econômico para o setor. Objetivos Esse trabalho teve como objetivo geral ampliar as ferramentas genômicas disponíveis no Brasil para o estudo do genoma do búfalo. Os objetivos específicos se encontram descritos em cada capítulo da presente tese, os quais podem ser sumarizados em: � Construir uma biblioteca BAC com o genoma do búfalo de rio (Bubalus bubalis); � Avaliar marcadores de DNA derivados de genes bovino para posterior aplicação na seleção dos clones da biblioteca BAC de búfalo; � Gerar marcadores de DNA derivados do genoma do búfalo visando identificar clones na biblioteca BAC gerada. Referências Bibliográficas* ABCB. Associação Brasileira dos Criadores de Búfalos. Disponível em: http://www.bufalo.com.br/. Acesso em: Junho de 2010. AMANO, T. Genetic differences between swamp and river buffaloes in biochemical and immunological characteristics. In: World Conference on Animal Production, 5., Tsukuba, Japão, Japanese Society of Zootechnical Sciences. Anais… 1983. p. 131-135. AMARAL, M.E.J. et al. Construction of a river buffalo (Bubalus bubalis) whole-genome radiation hybrid panel and preliminary RH mapping of chromosomes 3 and 10. 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A biblioteca BAC de búfalo foi gerada utilizando a enzima de restrição HindIII para digestão parcial do DNA bubalino, o vetor pBeloBAC11 para a ligação dos fragmentos de DNA digeridos e a bactéria DH10B para o processo de transformação com a molécula de DNA recombinante. A biblioteca BAC gerada, denominada BBU_LG, possui 50.000 clones, dos quais 240 foram analisados quanto ao tamanho do inserto, revelando um tamanho médio de inserto de 92 kb, o que fornece uma representatividade de 1,5X o genoma bubalino. A disponibilidade dessa nova ferramenta genômica para a espécie B. bubalis permitirá um novo direcionamento nos estudos moleculares do genoma bubalino, uma vez que a biblioteca BAC poderá ser utilizada para o isolamento e caracterização de genes a partir de uma região de interesse, no mapeamento físico, na elucidação da organização gênica, na clonagem posicional, no seqüenciamento e re-sequenciamento de regiões-alvo ou de cromossomos inteiros, além da identificação de elementos reguladores inter e intra- gênicos. A associação das informações geradas pelos mapas com a biblioteca BAC tornará possível o estabelecimento da estrutura molecular de regiões alvo do genoma do búfalo. Os resultados poderão ser aplicados em um melhor entendimento da conservação e da variação genética dos búfalos nos rebanhos brasileiros contribuindo para o desenvolvimento de novas estratégias para os programas de melhoramento genético desta importante espécie. Palavras-chave: Biblioteca genômica, Bubalus bubalis, clonagem, cultura celular Introdução 1. A importância da construção de uma biblioteca BAC Uma biblioteca de DNA é uma coleção de clones obtidos “in vitro” contendo fragmentos de DNA (insertos) inseridos em um vetor de clonagem, o qual apresenta os elementos necessários para sua replicação em uma célula hospedeira, geralmente uma bactéria. Esse DNA pode ser originado de duas fontes: do genoma da espécie (bibliotecas genômicas) ou de cDNA (DNA complementar) gerado a partir da cópia de moléculas de mRNA extraídas de um tecido específico. Muitas estratégias vêm sendo desenvolvidas e utilizadas na construção de bibliotecas de DNA de animais, plantas, insetos e microorganismos, uma vez que se trata de uma poderosa ferramenta de pesquisa que possibilita o estudo tanto de genes quanto de genomas inteiros (ZHANG, 2000). O número de clones (N) requeridos para uma biblioteca genômica depende da cobertura desejada do genoma (C), do tamanho do genoma da espécie em questão (G) e da média do tamanho dos insertos da biblioteca (I), cuja relação é representada pela seguinte fórmula: C = (N x I)/G (PATERSON, 1996). O valor da cobertura do genoma indica, em média, quantas vezes uma determinada seqüência está presente na biblioteca (MCCUBBIN & ROALSON, 2005). A probabilidade (P) de um fragmento particular do genoma estar representado na biblioteca é determinada teoricamente pela seguinte fórmula: N=ln(1-P)/ln(1-[I/G]) (CLARKE & CARBON, 1976). As bibliotecas genômicas do tipo BAC são aquelas que utilizam como vetor de clonagem o BAC (do inglês Bacterial Artificial Chromosome). Esses vetores possuem origem de replicação (fator-F) e gene para resistência ao antibiótico cloranfenicol. Esse vetor permite a propagação estável de insertos maiores que 100 Kb, permitindo a construção de bibliotecas de alta integridade (AMENIYA & ZON, 1999). Os clones BAC são estáveis e fáceis de manipular, além de não apresentarem quimerismo (WOO et al., 1994). Clones quiméricos apresentam o inserto de DNA oriundos de diferentes partes do genoma, os quais foram combinados em um único clone acidentalmente (LIBERT et al. 1993). Esse é um grave obstáculo para o mapeamento físico, porque a verdadeira localização do gene pode não ser facilmente determinada (GILL et al., 1999). Diferentes bibliotecas BAC foram construídas a partir do genoma dos principais animais de interesse econômico como bovino (CAI et al., 1995; ZHU et al., 1999; BUITKAMP et al., 2000; WARREN et al., 2000; EGGEN et al., 2001; FUJISAKI et al., 2002), caprino (SCHIBLER et al., 1998), eqüino (GODARD et al., 1998), suíno (SUZUKI et al., 2000; FAHRENKRUG et al., 2001; JEON et al., 2003; LIU et al., 2010) e ovino (VAIMAN et al., 1999). Essas bibliotecas mostraram-se como uma ferramenta genômica indispensável para diferentes estudos, tais como o isolamento de genes isolados ou agrupados (clusters) (CHIU et al., 2004; ZENG et al., 2007; LIU et al., 2010); mapeamento físico de cromossomos únicos ou de genomas inteiros (ROGEL-GAILLARD et al., 2001; CHEN et al., 2004); elucidação da organização gênica (STRONG et al., 1999; SAZANOV et al., 2006); estudos de clonagem posicional (DONOVAN et al., 2000), seqüenciamento de genomas (KRZWINSKI et al., 2004) e identificação de elementos reguladores intra e inter-gênicos (SUMIYAMA & RUDDLE, 2003). 2. Principais etapas envolvidas na construção de uma biblioteca BAC O esquema a seguir (Figura 1) aponta as principais etapas da construção de uma biblioteca BAC, que envolve: a obtenção de um DNA íntegro representando o genoma de interesse, a digestão parcial deste DNA com enzima de restrição para gerar fragmentos que serão clonados (preferencialmente com um tamanho médio de 100kb), a escolha do vetor de clonagem (BAC) para a inserção dos fragmentos de DNA e transformação por eletroporação de células eletrocompetentes para inserção da molécula recombinante (DNA + vetor) na célula hospedeira (bactéria). A seguir serão discutidos os principais aspectos técnicos relacionados com a construção de uma biblioteca BAC, um projeto sempre de grandes dimensões, realizado pela primeira vez no Brasil com o genoma de um mamífero de interesse econômico. Figura 1. Representação esquemática das principais etapas e tecnologias utilizadas na construção de uma biblioteca BAC. Bactérias Eletrocompetentes DNA parcialmente digerido -Cultura celular *escolha do animal representante da espécie *obtenção da concentração celular ideal *inclusão de células em agarose -Pré-tratamento das células incluídas nos blocos de agarose com proteinase-K -Digestão do DNA com enzima de restrição *seleção da enzima ideal e sua concentração -Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE) *gradiente de voltagem *tipo e concentração da agarose *temperatura *tipo e concentração do tampão *tempo de corrida Recuperação dos fragmentos de DNA do gel Vetor Ligação Transformação 2.1. Obtenção do DNA-HMW (do inglês High Molecular Weight) Para a construção de uma biblioteca genômica é necessário determinar a concentração ideal de células/mL antes da inclusão das mesmas em blocos de agarose, para a manutenção do DNA de alta integridade. Uma revisão da literatura mostra que a concentração de células/mL é bastante variável conforme a espécie em estudo. Por exemplo, para a construção da biblioteca de bovino foi utilizada uma concentração de 2x107cel/ml (CAI et al., 1995); para rã 2,4x107cel/ml (ISHII et al., 2004); humano (ASAKAWA et al. 1997) e bovino (FUJISAKI et al., 2002) 3x107cel/ml; para salmão (THORSEN et al., 2005) e gato (BECK et al., 2001) 5x107cel/ml; para caprino 6x107cel/ml (SCHIBLER et al., 1998). Já para galinha (ZIMMER & VERRINDER GIBBINS, 1997) e urso panda (ZENG et al., 2007) foi utilizada uma concentração de 1x108cel/ml. Outro fator importante é o tipo celular utilizado como fonte de DNA. A maioria das bibliotecas BAC de mamíferos foram construídas utilizando DNA proveniente de células brancas do sangue, como descrito para as bibliotecas de bovino (CAI et al., 1995; ZHU et al., 1999; BUITKAMP et al., 2000; WARREN et al., 2000), cachorro (LI et al., 1999), coelho (ROGEL-GAILLARD et al., 2001) e suíno (JEON et al., 2003). Bibliotecas BAC construídas com células brancas do sangue podem conter os genes das imunoglobulinas rearranjados, não sendo indicadas para estudos desses genes (FUJISAKI et al., 2002). Informações da literatura sobre bibliotecas BAC de mamíferos construídas utilizando DNA de fibroblasto incluem aquelas do genoma bovino (FUJISAKI et al., 2002), caprino (SCHIBLER et al., 1998), eqüino (GODARD et al., 1998), gato (BECK et al., 2001) e humano (KIM et al., 1996). A principal vantagem da utilização de fibroblastos se deve à imortalização da linhagem celular, a qual pode ser congelada em nitrogênio líquido e utilizada também para outros estudos. 2.2. Digestão parcial do DNA com enzima de restrição Segundo MCCUBIN e ROALSON (2005), a enzima de restrição ideal a ser utilizada na digestão parcial do DNA deve fragmentar a molécula em intervalos uniformes de 40 a 60 Kb, o que varia conforme o DNA da espécie. As enzimas mais utilizadas em bibliotecas BAC são EcoRI e HindIII. Algumas bibliotecas BAC que utilizaram a enzima EcoRI foram: bovino (ZHU et al., 1999; WARREN et al., 2000), cachorro (LI et al., 1999), camundongo (OSOEGAWA et al., 2000) e suíno (FAHRENKRUG et al., 2001). A enzima de restrição HindIII, por sua vez, foi utilizada na construção de bibliotecas BAC de bovino (CAI et al., 1995; EGGEN et al., 2001), caprino (SCHIBLER et al., 1998), eqüino (GODARD et al., 1998), coelho (ROGEL-GAILLARD et al., 2001), galinha (ZIMMER & VERRINDER GIBBINS, 1997), humano (KIM et al., 1996; ASAKAWA et al., 1997) ovino (VAIMAN et al., 1999) e urso panda (ZENG et al., 2007). A enzima HindIII apresenta uma particularidade que faz com que seu uso seja vantajoso na construção de uma biblioteca BAC, que é o fato do DNA centromérico ser resistente à ação desta enzima. Sendo assim, sua utilização evita que essas seqüências altamente repetitivas sejam incorporadas nos clones gerados. A enzima HindIII é produzida a partir do microorganismo Haemophilus influenzae e reconhece uma seqüência palindrômica composta por seis nucleotídeos (5’-A�AGCTT-3’). 2.3. Vetor de clonagem do tipo BAC Os vetores BAC disponíveis para a construção de bibliotecas genômicas apresentam os padrões para seleção característicos dos plasmídeos como resistência a antibiótico e um sítio de policlonagem com um gene repórter. Segundo a literatura, o vetor BAC mais utilizado é o pBeloBAC11, como descrito para diversos animais de interesse econômico como, por exemplo, galinha (ZIMMER & VERRINDER GIBBINS, 1997), eqüino (GODARD et al., 1998), caprino (SCHIBLER et al., 1998), ovino (VAIMAN et al., 1999), bovino (EGGEN et al., 2001) e coelho (ROGEL-GAILLARD et al., 2001). O vetor pBeloBAC11 foi desenvolvido por KIM e colaboradores em 1996 e representa a segunda geração de vetores BAC. Esse vetor, desenvolvido a partir do vetor pBAC108L, contém o gene LacZ o qual permite a identificação dos clones por meio do fenótipo de colônias brancas (clones positivos) e colônias azuis (clones negativos). Sítios de clonagem para três enzimas (BamHI, SphI e HindIII) estão presentes no vetor, os quais são flanqueados pelos promotores T7 e SP6. Sítios de restrição adicionais para seis enzimas (NotI, EagI, XmaI, SmaI, BglI e SfiI), ricos em citosina e guanina, podem ser utilizados para a excisão do inserto de DNA do vetor. O vetor pBeloBAC11 apresenta ainda o gene de resistência ao antibiótico cloranfenicol (CMR), o qual é utilizado na seleção dos clones transformados. Esse vetor também apresenta um sistema de regulação da sua replicação, denominado fator-F, que controla seu número de cópias por célula. Os genes regulatórios presentes no vetor incluem os genes oriS (origem de replicação), repE, parA e parB, sendo que os dois primeiros são mediadores da replicação unidirecional do fator-F e os dois últimos mantém o número de cópias entre uma ou duas moléculas por célula. A Figura 2 ilustra o vetor pBeloBAC11 com seus genes e principais seqüências reguladoras, e no Apêndice 1 está apresentada a seqüência linear completa (em nucleotídeos) do referido vetor. 2.4. Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE) Em 1984, SCHWARTZ e CANTOR desenvolveram a técnica de eletroforese de campo pulsado (PFGE), tornando possível a separação de grandes fragmentos de DNA com tamanhos de até 2 Mb. No entanto, esta tecnologia também pode ser aplicada com sucesso na separação de fragmentos de DNA com tamanhos variando de 1 Kb a 6 Mb (GARDINER 1991). Há muitas variáveis que influenciam a eletroforese de campo pulsado, como por exemplo, o gradiente de voltagem, o tipo e a concentração da agarose utilizada no gel, o tipo de tampão utilizado para a corrida, a temperatura e o tempo de duração da corrida (LAI & BIRREN 1995). Figura 2. Vetor de clonagem pBeloBAC11, ilustrando os principais genes (regiões em vermelho) e as principais regiões reguladoras (regiões em azul). As setas verdes indicam os promotores T7 e SP6 e as setas pretas alguns sítios para enzimas de restrição. Adaptado de KIM et al., 1996. O gradiente de voltagem é a diferença entre o potencial elétrico dos eletrodos, representando a força que dirige as moléculas de DNA através do gel, a qual é expressa em unidades de voltagem por distância. Mudanças no gradiente de voltagem afetam diretamente a velocidade de migração e o tamanho das moléculas a serem separadas no gel (BIRREN & LAI, 1993). Uma variedade de tipos de agarose encontra-se disponível para uso em eletroforese, cujas principais propriedades incluem a sua capacidade de resistência à rupturas, a carga molecular e o nível de pureza. A agarose com baixo ponto de fusão resulta em um gel com poros menores quando comparado com géis de agarose comum. Seu uso é recomendado quando se almeja resgatar fragmentos de DNA do gel após a eletroforese. Mudanças na concentração da agarose em um gel submetido à eletroforese de campo pulsado afetam diretamente a velocidade de separação dos fragmentos e sua resolução. Para separar fragmentos de DNA de 1 Kb a 2,5 Mb é aconselhável utilizar géis de agarose com baixo ponto de fusão a 1% (BIRREN & LAI, 1993). Outro ponto crucial para a separação com sucesso de grandes fragmentos de DNA é a escolha da temperatura utilizada durante a eletroforese, sendo as temperaturas entre 12-15ºC as mais utilizadas. Com o aumento da temperatura, as moléculas de DNA tendem a migrar mais rapidamente, porém há uma diminuição na resolução da separação desses fragmentos no gel. A temperatura de 14ºC é tida como ideal por manter um equilíbrio entre velocidade de separação dos fragmentos de DNA e resolução (BIRREN & LAI, 1993). A mobilidade das moléculas através do gel, assim como sua resolução também dependem da composição do tampão utilizado durante a eletroforese de campo pulsado, já que o DNA tende a migrar mais rapidamente em tampões com baixa força iônica. Tris- acetato (TAE) e Tris-borato (TBE) são os tampões mais utilizados. Fragmentos de DNA migram 25% mais rápido em 0.5X TBE do que em 1X TBE e cerca de 10% mais rápido em 0.5X TAE do que em 1X TAE. Embora fragmentos de DNA migrem de maneira mais rápida em TAE do que em TBE, o tampão TAE perde suas propriedades iônicas após um período de corrida de 24 a 36 horas (BIRREN et al., 1997). Objetivos Visando ampliar as ferramentas genômicas existentes no Brasil para os estudos do genoma do búfalo, o presente trabalho teve como objetivos: � Construir uma biblioteca genômica do tipo BAC para o búfalo de rio (Bubalus bubalis) para posterior utilização em estudos relacionados com a caracterização da estrutura molecular de regiões-alvo do genoma bubalino; � Avaliar parte dos clones obtidos na biblioteca BAC quanto ao tamanho médio do inserto de DNA e a cobertura do genoma. Material e Métodos Todas as soluções citadas no item Material e Métodos estão descritas em detalhe no Apêndice 2, em ordem alfabética. Toda metodologia descrita a seguir foi realizada no Laboratório de Genômica Comparativa do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto-SP (IBILCE-UNESP). 1. Estabelecimento e manutenção da cultura celular Células de fibroblasto foram utilizadas como fonte de DNA do genoma bubalino para a construção da biblioteca BAC. Para o estabelecimento da cultura de fibroblasto, foram utilizados fragmentos de cartilagem de orelha de um animal macho da raça Murrah. Os fragmentos do tecido foram desprovidos dos pêlos e da camada externa da pele com o auxilio de um bisturi. Durante o processo de limpeza, os fragmentos de tecido foram mantidos em solução tampão, livre de cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e carbonato de sódio, conhecida como HANKS 1X (do inglês Hanks’ balanced salt solution – Sigma- Aldrich - EUA), na qual foram adicionados 10% de um composto antibiótico e antimicótico da GIBCO (EUA) a 100X (10.000 U/mL de penicilina sódica, 10 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 µg/ml de anfotericina B). Para o estabelecimento da cultura, os fragmentos foram cortados em pedaços de aproximadamente 1 mm, e transferidos para frascos de cultura com superfície de 25 mm2 contendo 5 mL de meio de cultura DMEM (do inglês Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - GIBCO - EUA) enriquecido com 10% de soro fetal bovino estéril (Cripion - BR), 1% de antibiótico e antimicótico (GIBCO - EUA) e 1% de piruvato de sódio a 100mM (GIBCO - EUA). As culturas celulares foram mantidas em estufa à 37°C, 5% de CO 2 e 90% de umidade. Durante os 10 primeiros dias de cultura, o meio foi trocado diariamente. Após esse período inicial, o meio de cultura foi trocado conforme a confluência apresentada pelas células. Diariamente, a proliferação do número de células foi acompanhada visando a obtenção de uma camada uniforme de células por toda a superfície de cultura do frasco. O manuseio das células, troca do meio de cultura e posteriores subculturas foram realizadas em condições de assepsia em fluxo laminar. As subculturas foram realizadas na fase de confluência das células, ou seja, no momento em que a superfície de cultura do frasco encontrava-se inteiramente coberta por células, o que ocorreu após 16 dias da manutenção da cultura celular. Tal procedimento foi realizado removendo-se o meio antigo, lavando-se as células em cultura com 1 mL de solução HANKS 1X e em seguida, promovendo a liberação das células do frasco por ação da tripsina. Este passo foi realizado adicionando 1 mL de solução de tripsina 1X (Sigma- Aldrich - EUA) diluída em solução HANKS. Após 5 minutos de incubação com tripsina, as células foram ressuspendidas em 1 mL de solução HANKS 1X, e posteriormente transferidas para novos frascos de cultura providos com meio DMEM (5 mL quando em frascos com 25 mm2 de superfície e 25 mL quando em frascos com 150 mm2). Os fibroblastos em cultura foram utilizados em três diferentes procedimentos: armazenamento em nitrogênio líquido para estoque; preparações citogenéticas para avaliação da integridade do genoma bubalino e contagem celular para inclusão em blocos de agarose. 2. Preparações citogenéticas para avaliação da integridade do genoma bubalino 2.1. Obtenção das células metafásicas a partir da cultura celular Cada frasco de cultura contendo uma monocamada confluente de células foi submetido a subcultura utilizando 0,5 mL de suspensão celular, 9 mL de meio DMEM enriquecido com 1% de antibiótico, 1% de piruvato e 10% de soro fetal bovino, acrescido de 0,5 mL de BrdU (Bromodexodiuridina a 1 mg/mL – Sigma-Aldrich - EUA). Esses frascos foram incubados em estufa a 37ºC, 5% de CO2 e 90% de umidade, até o aparecimento de células mitóticas, que se deu entre 18 e 20 horas após a subcultura. A partir do momento em que foram encontradas 10 a 20 células mitóticas nos frascos, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas duas vezes com solução HANKS 1X. Em seguida adicionou-se 10 mL de meio DMEM e 0,1 mL de solução de timidina a 300 µg/mL (Sigma-Aldrich - EUA), seguido de incubação em estufa por 6 horas. Posteriormente ao período de incubação, adicionou-se 0,1 mL de colcemid (GIBCO - EUA) por 10, 15 e 30 minutos para promover o acúmulo de células em mitose e impedir que as células em metáfase completem o processo de divisão celular. Em seguida, o meio foi removido e adicionou-se 5 mL de solução hipotônica de KCl (75 mM). Essa solução de células foi transferida para um tubo cônico, o qual foi submetido à centrifugação durante 5 minutos a 1000 rpm. O concentrado de células foi ressuspendido em 0,5 mL de solução de KCl e em seguida foi adicionada a solução fixadora contendo metanol anidro-ácido acético glacial (3:1), no qual as células foram mantidas a 4°C por 10 minutos. Em seguida as células foram novamente centrifugadas (condições descritas previamente) e o concentrado de células foi ressuspendido com o fixador e mantidos a 4°C durante 12 horas. Por fim, promoveu-se a lavagem das células com o fixador por mais duas vezes e seguiu-se com a montagem das lâminas. 2.2. Preparo e montagem das lâminas para microscopia óptica As lâminas para microscopia foram limpas, secas e mantidas no freezer (-20ºC) até o momento de sua utilização. A solução de células em fixador foi gotejada nas lâminas ainda geladas de uma distância aproximada de 30 cm para obtenção de um bom espalhamento dos cromossomos. Em seguida, as lâminas foram lavadas em ácido acético 70%; rapidamente flambadas em lamparina, secas em temperatura ambiente e armazenadas em freezer -80ºC. Visando determinar a integridade do cariótipo do animal, ou seja, a ausência de qualquer tipo de alteração cromossômica numérica e/ou estrutural como deleção, duplicação, inversão e/ou translocação, as lâminas com os cromossomos em metáfase foram submetidas à diferentes técnicas citogenéticas, tais como coloração com Giemsa e Ag-NOR, além de bandamentos C e G. As análises foram realizadas sob microscópio óptico (objetiva de imersão - 100X) e foto documentadas com câmera digital Cyber-shot DSC5700 (Sony). 2.3. Coloração com Giemsa As lâminas envelhecidas em estufa a 60ºC por um dia, foram hidrolisadas em HCl 1N a 60ºC por 7 minutos. A hidrólise foi interrompida mergulhando-se as lâminas em água deionizada gelada. Posteriormente foram lavadas em água destilada por 10 minutos e em solução tampão Sorensen por um período de 1 a 2 minutos. Na seqüência, as lâminas foram mergulhadas em uma solução de Giemsa 6% (GIBCO - EUA) por 5 minutos e finalmente lavadas em água deionizada e secas em temperatura ambiente. Esta técnica de coloração permite a visualização e classificação dos cromossomos por grupos de acordo com o tamanho e a posição do centrômero. 2.4. Bandamento G As bandas G foram produzidas pelo tratamento da lâmina com tripsina e subseqüente coloração com Giemsa. Para isso, foram montados 5 boréis, sendo um com solução de tripsina, dois com tampão Sorensen, um com Giemsa a 6% e um com água deionizada. As lâminas foram envelhecidas em estufa, seguindo o mesmo procedimento descrito na técnica de coloração com Giemsa. Em seguida, foram colocadas por 20 segundos na solução de tripsina, banhadas no primeiro borel com tampão Sorensen e incubadas por 2 minutos no segundo borel com tampão Sorensen. Finalmente foram coradas em solução Giemsa 6% durante 5 minutos sob agitação, lavadas com água deionizada e secas em temperatura ambiente. 2.5. Bandamento C As lâminas foram mergulhadas em HCl 0,2 N por 5 minutos, lavadas em água gelada e secas a temperatura ambiente. Em seguida, foram incubadas de 5 a 10 minutos em solução de bário 5%. Posteriormente as lâminas foram lavadas em solução gelada de HCl 3%, em água gelada e secas a temperatura ambiente. Depois de secas foram incubadas a temperatura ambiente em solução 2X SSC por 10 minutos e em seguida, em solução 2X SSC a 60ºC por uma hora. Posteriormente foram lavadas em água gelada e secas a temperatura ambiente. Quando secas, as lâminas foram submetidas a várias incubações em álcool para promover a desidratação, sendo duas incubações em álcool 70% por 5 minutos cada e duas incubações em álcool 95% por 5 minutos cada. Posteriormente foram secas e coradas com uma solução tamponada de Giemsa 6% por 30 minutos, lavadas em água destilada e secas a temperatura ambiente. 2.6. Coloração Ag-NOR Três gotas de solução coloidal reveladora foram adicionadas sobre as lâminas, seguindo-se com a adição de 3 gotas da solução de nitrato de prata 50%, as quais foram misturadas com o auxílio de uma pipeta. Cada lâmina foi coberta com uma lamínula e incubada em câmara úmida por 7 minutos a 70ºC. Em seguida, as lâminas foram lavadas duas vezes com água destilada, coradas em Giemsa 6% por 3 minutos, lavadas em água destilada e secas a temperatura ambiente. 3. Contagem e inclusão das células em blocos de agarose Na construção de uma biblioteca BAC, o processo de inclusão das células em blocos de agarose é primordial para preservar a integridade do DNA até o momento da digestão parcial e clonagem. Para a contagem celular e posterior inclusão das células em blocos de agarose, frascos de cultura de 150 mm2 de superfície tiveram suas células recolhidas, como descrito previamente. A determinação da concentração celular foi estimada por meio de contagem direta em câmara de Neubauer utilizando microscópio óptico invertido, seguindo a metodologia desenvolvida por Freshney (2000), ilustrada na Figura 3. Por capilaridade foram introduzidos 20 µL da solução de células entre o contador Neubauer e uma lamínula de vidro. Com a objetiva de 10X do microscópio óptico foi localizado o campo de contagem (Figura 3d). Após a contagem das células em ambos os campos, foi calculada a concentração do número de células, por meio da fórmula: C = N/V (C= concentração; N= número de células; V= volume em mL= 0,1mm3). Figura 3. Câmara de Neubauer. a) Adição da suspensão celular na câmara de Neubauer. b) Seção longitudinal da câmara de Neubauer mostrando a posição da amostra celular em 0,1 mm de profundidade. c) Câmera de Neubauer vista de cima. d) Visão da área total da lâmina, cuja área central iluminada pela luz de um microscópio comum com a objetiva de 10X representa 1mm2 de área. e) Visão ampliada de um dos 25 quadrados menores cercados por três linhas paralelas que juntos formam a área de 1 mm2. Ilustração modificada de FRESHNEY, 2000. Campo de contagem celular com a objetiva de 10X Lamínula Câmara de Neubauer Suspensão de células Uma vez determinada a concentração, as células em suspensão foram mantidas em banho-maria a 42ºC e misturadas com solução de agarose com baixo ponto de fusão 1% na proporção 1:1. Em seguida, 100 µl dessa solução foi aplicada nos moldes (Figura 4) para a confecção dos blocos, e mantidos a 4ºC por 2 horas para a solidificação. Em seguida os blocos de agarose foram retirados dos moldes e armazenados em tubos cônicos contendo TE (Tris-EDTA pH 8.0), e mantidos a 4ºC. Segundo a literatura, as bibliotecas BAC bovino (FUJISAKI et al., 2002) e de cabra (SCHIBLER et al., 1998) foram construídas a partir de células de fibroblastos, nas quais foram utilizadas as concentrações celulares de 3x107 e 6x107cel/ml, respectivamente, na confecção de blocos de agarose. Assim, também optou-se pela geração de blocos de Figura 4. Preparação de blocos de agarose com DNA. a) Ilustração dos componentes de um molde para blocos; b) A mistura de células com agarose de baixo ponto de fusão é depositada dentro de cada um dos poços do molde; c) Depois de solidificado o conteúdo, a fita é removida e os blocos de agarose com as células são retirados dos moldes com auxílio de uma tira plástica. Esquema modificado de PETERSON e colaboradores, 2000. moldes fita adesiva tira de plástico ponteira com células tira de plástico agarose para búfalo com as mesmas concentrações celulares utilizadas para esses bovídeos. 4. Tratamento das células contidas nos blocos de agarose com proteinase K Comparando-se os procedimentos estabelecidos para as diversas espécies, verifica- se a necessidade de um protocolo específico para cada espécie e tipo celular utilizado. Desse modo, o protocolo desenvolvido para a manipulação de blocos de agarose contendo células de fibroblasto de búfalo encontra-se descrito a seguir. Os blocos de agarose com as células foram colocados em tubo cônico contendo 0,5 mg/mL de proteinase K (Promega Corporation – EUA) e 3 mL de uma solução de laurilsarcosina sódica-EDTA (pH 9.0) , os quais foram incubados a 50ºC, sob agitação de 25 rpm, durante 12 horas para a lise da membrana nuclear e degradação das proteínas. Em seguida os tubos foram colocados no gelo para equilíbrio da temperatura. Esse processo de incubação de 12 horas foi repetido por mais duas vezes, com novas soluções de laurilsarcosina sódica-EDTA e proteinase K. Os blocos foram transferidos para um novo tubo cônico contendo 30 mL de TE (Tris-EDTA pH 8.0) acrescido de 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) e incubados por uma hora a temperatura ambiente, sendo invertidos ocasionalmente. Essa etapa de equilíbrio dos blocos com TE + PMSF foi repetida por mais duas vezes para remover todos os vestígios de proteinase K. Em seguida, os blocos foram transferidos para outro tubo cônico contendo 30 mL de TE e incubados por uma hora a temperatura ambiente. Essa etapa foi repetida por mais duas vezes para remover os traços de PMSF. Após as sucessivas lavagens dos blocos com TE, os mesmos foram transferidos para uma nova solução de TE e armazenados a 4ºC. A qualidade do DNA obtido foi verificada por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose 1%, antes do processo de digestão parcial com enzima de restrição. Os parâmetros utilizados na eletroforese foram: 14ºC, 120º, 6V/cm, 1,4s-13,5s por 16 horas em tampão TAE 1X. 5. Digestão parcial do DNA nos blocos de agarose com enzima de restrição HindIII e recuperação dos fragmentos de DNA de interesse A digestão parcial do DNA nos blocos de agarose é outro aspecto crucial no processo de construção de uma biblioteca BAC, uma vez que cada genoma apresenta uma exigência particular. A concentração de células assim como a concentração de enzima de restrição necessária para uma digestão parcial do DNA é específica para cada genoma. Para se obter o DNA parcialmente digerido, há quatro metodologias descritas que se baseiam no controle de componentes e variáveis da reação de digestão do DNA. São elas: variação na concentração da enzima de restrição (BURKE & OLSON, 1991), variação no tempo de incubação com a enzima de restrição (ANAND et al., 1989), variação na concentração de co-fatores da enzima como, por exemplo, Mg+2 (ALBERTSEN et al., 1989), e variação da proporção de enzimas e metilases a serem adicionadas na reação de digestão do DNA (LARIN et al., 1991). Para búfalo, optou-se pela utilização de duas variáveis - a concentração de enzima de restrição e tempo de incubação - por serem de mais fácil controle, resultando em uma menor porcentagem de erros durante a manipulação. Para o teste de digestão, cada bloco de agarose com as células foi cortado em 4 partes iguais. Cada ¼ do bloco foi fatiado 4 vezes na direção horizontal e 4 vezes na direção vertical, cujos fragmentos foram colocados em microtubos contendo 5 µl do tampão da enzima HindIII (New England Biolabs - EUA), 5 µl de espermidina a 40 mM (Sigma-Aldrich - EUA), 0,5 µl de BSA a 10 mg/ml (Sigma-Aldrich - EUA) e 34,5 µl de água. Seguiu-se a incubação em gelo por 60 minutos. A digestão ocorreu em banho-maria a 37ºC por um período de 2 a 12 minutos, com a adição de 5 µl da enzima HindIII (New England Biolabs - EUA) em diferentes concentrações, variando de 0,25U a 12U. A interrupção da ação da enzima de restrição foi realizada adicionando-se 5 µl de EDTA 0,5 M (pH 8.0). Com o auxílio de um micropipetador, as amostras foram colocadas em um gel de agarose 1%. A eletroforese em campo pulsado foi realizada de acordo com os seguintes parâmetros: 6V/cm, 120º, 50s-50s por 18 horas em tampão TAE 1X a 14ºC. Após 18 horas da corrida de eletroforese em campo pulsado, a seleção dos fragmentos de DNA de interesse (100 a 300 Kb) foi realizada a partir da coloração com brometo de etídio das laterais do gel contendo o marcador molecular Lambda (New England Biolabs - EUA). As regiões coradas indicaram a região do gel com os fragmentos de DNA de interesse, a qual foi excisada e submetida ao processo de digestão da agarose para a liberação dos fragmentos de DNA para a clonagem. A Figura 5 ilustra de maneira esquemática o processo. 6. Purificação dos fragmentos de DNA utilizando a enzima beta-agarase A purificação dos fragmentos de DNA de interesse a partir do gel de agarose foi realizada utilizando-se a enzima beta-agarase (GELaseTM - Epicentre) que digere a agarose produzindo moléculas de carboidratos, os quais não interferem na reação de ligação dos fragmentos de DNA com o vetor. Os procedimentos de digestão da agarose pela enzima beta-agarase, foram realizados de acordo com as indicações do fabricante, os quais estão descritos resumidamente a seguir. A fatia do gel contendo os fragmentos de DNA de interesse foi transferida para um microtubo, o qual foi pesado para o cálculo do volume da enzima e do tampão a serem adicionados. Em seguida, o microtubo foi levado ao banho-maria a 68ºC por 5 minutos para o derretimento da agarose. Posteriormente adicionou-se o tampão da enzima beta-agarase 1X em um volume correspondente a 3X o peso da fatia do gel. O tubo foi transferido imediatamente para o banho-maria a 45ºC por 5 minutos para equilíbrio da temperatura antes da adição da enzima beta-agarase. Por fim, adicionou-se 1 Marcador Molecular DNA parcialmente digerido Marcador Molecular C O R A R C O R A R NÃO CORAR Figura 5. Partes do gel submetido à PFGE que devem ser recortadas e coradas para guiar a retirada da fatia do gel contendo os fragmentos de DNA com tamanho desejado. µL da enzima beta-agarase (1U/µL) para cada 300 mg de agarose, incubando-se em banho-maria a 45ºC por 30 minutos. Após o processo de digestão da agarose, a concentração do DNA foi estimada submetendo-se 10 µL da solução obtida em gel de agarose 1%, contendo uma diluição seriada de DNA lambda (Promega Corporation - EUA) de 10 a 50 ng. Esse gel foi submetido à eletroforese horizontal em tampão TBE 0,5X a 80V por 30 minutos. 7. Preparação do vetor de clonagem pBeloBAC11 O vetor de clonagem pBeloBAC11 é uma molécula de DNA circular. Portanto, deve ser clivada e desfosforizada para poder se ligar ao fragmento de DNA de interesse, formando assim uma molécula de DNA recombinante (vetor + inserto de DNA). O vetor utilizado no presente trabalho foi doado pela Dra. Clare Gill (Department of Animal Science - Texas A&M University - EUA) como parte da colaboração estabelecida. Foram utilizadas 50 unidades da enzima HindIII (New England Biolabs - EUA) para cortar 1 µg do vetor pBeloBAC11. A reação de digestão do vetor foi realizada em um volume total de 100 µL, sendo 2,5 µL de DNA (400 ng/µL), 2,5 µL de HindIII (20 U/µL), 10 µL de 10X tampão fosfatase ácida e 85 µL de água ultra pura. A reação de digestão foi incubada a 37ºC por 6 horas, seguida de uma incubação a 65ºC por 20 minutos para desativar a enzima HindIII. Posteriormente foi adicionado CaCl2 fornecido com a fosfatase alcalina em uma concentração final de 5 mM, sendo incubado a 30ºC por 5 minutos. A reação de desfosforização do vetor pBeloBAC11 foi realizada em um volume total de 108 µL, sendo 100 µL do vetor de clonagem, 5 µL de CaCl2 e 3 µL de fosfatase alcalina. Essa reação foi incubada a 30ºC por 2 horas, seguida de incubação a 65ºC por 20 minutos para desativar a fosfatase alcalina. Em seguida a concentração do vetor foi determinada por eletroforese horizontal em gel de agarose 1% com tampão TBE 0,5X a 80V por 30 minutos. Por fim, o vetor foi diluído em água ultrapura para a concentração de uso (10 ng/µL) e armazenado em freezer (-20ºC). 8. Clonagem O processo de clonagem envolveu duas etapas. A primeira inclui a ligação do fragmento de DNA bubalino com o vetor de clonagem pBeloBAC11. A segunda é o processo de transformação bacteriana, ou seja, a entrada do vetor contendo o DNA bubalino nas células eletrocompetentes por meio de eletroporação. 8.1. Reação de ligação do vetor de clonagem pBeloBAC11 com o fragmento de DNA bubalino A reação de ligação foi realizada em um volume total de 60 µL, sendo 1 µL do vetor pBeloBAC11 (10 ng/µL), 50 µL dos fragmentos de DNA bubalino (2 ng/µL), 0,6 µL da enzima T4 DNA ligase (Promega Corporation - EUA), 6 µL do tampão da enzima T4 DNA ligase e 2,4 µL de água ultrapura. A reação de ligação ocorreu a temperatura ambiente por 12 horas, sendo posteriormente armazenada em freezer (-20ºC). 8.2. Transformação bacteriana por eletroporação Para o processo de transformação foi utilizado 1,5 µL do produto de ligação e 20 µL da bactéria eletrocompetente ElectroMaxTM DH10BTM (Invitrogen Corporation - EUA), os quais foram adicionados a uma cubeta de eletroporação com 1 mm de espaçamento e submetidos à eletroporação com 2000 V no aparelho Electroporator 2510 (Eppendorf- EUA). Após a eletroporação, as células foram imediatamente transferidas para um tubo de fundo U, contendo 1 mL de meio SOC e levadas ao agitador a 37ºC por 50 minutos a 200 rpm. Em seguida, 200 µL da cultura foi distribuída em placas com meio LB-ágar acrescido de antibiótico cloranfenicol (12,5 mg/mL – SERVA - Alemanha), 20 µL de IPTG a 20% (Isopropil-�-D-tiogalactosídeo - Eppendorf - EUA) e 100 µL de XGal a 2% (5-bromo-4- cloro-3-indolil-�-D-galactopiranoside - Invitrogen Corporation - EUA), sendo levados a estufa a 37ºC por 12 horas. 9. Preparação dos BACs para verificação dos tamanhos dos fragmentos de DNA bubalino Cada clone foi colocado em um tubo de fundo cônico contendo 5 mL de meio LB acrescido de cloranfenicol (12,5 mg/mL), sendo levados ao agitador a 37ºC, 200 rpm por 18 horas para propagação celular. Após este período, foram então centrifugados a 3000 rpm por 15 minutos a 4ºC, sendo descartado o sobrenadante. O concentrado de células foi ressuspendido em 200 µL de solução de lisoenzima com auxílio de uma pipeta descartável e transferido para um microtubo de 1,5 mL, o qual foi mantido no gelo por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 400 µL de solução de NaOH-SDS e novamente incubados em gelo por 5 minutos. Foram adicionados 300 µL de solução de acetato de potássio e incubadas a -80ºC por 15 minutos, e em seguida à temperatura ambiente por 15 minutos. Seguiu-se com centrifugação a 12000 rpm por 15 minutos à temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi transferido para novos microtubos, onde foram adicionados 600 µL de isopropanol gelado (-20ºC), mantendo-se os mesmos a -80ºC por 20 minutos. Uma nova centrifugação foi realizada a 12000 rpm por 20 minutos a 4ºC. Por fim, o sobrenadante foi removido e o concentrado de BAC foi ressuspendido em 1 mL de etanol 70% gelado (-20ºC), seguido de centrifugação por 5 minutos a 12000 rpm a 4ºC. Os microtubos foram colocados para secar em temperatura ambiente. Depois de secos, os BACs foram ressuspendidos em 30 µL de TE (Tris-EDTA pH 8.0) e seguiu-se a digestão do vetor BAC para a liberação do inserto. A reação de digestão do BAC para a liberação do inserto de DNA foi realizada em um volume total de 21 µL, sendo 10 µL do BAC_DNA; 3 µL do tampão da enzima NotI 10X (New England Biolabs - EUA); 0,3 µL de 100X BSA; 0,5 µL da enzima Not I (10U/ µL - New England Biolabs - EUA) e 17,2 µL de água. A reação ocorreu em banho-maria a 37ºC por 2 horas. O produto de digestão foi submetido a eletroforese de campo pulsado em gel de agarose 1% seguindo-se os parâmetros de: 6V/cm, 120º, 1,4s-13,5s por 16 horas em tampão TBE 0,5X a 14ºC. O gel foi corado com brometo de etídio e fotodocumentado com câmera digital (DC290 KodakTM). A partir da avaliação do tamanho dos insertos de parte dos clones, foi calculada a média de tamanho de inserto na biblioteca BAC. Também foi calculada a cobertura do genoma, utilizando a fórmula C = (N x I)/G, onde a cobertura do genoma (C) depende do número de clones (N), da média do tamanho dos insertos da biblioteca (I), além do tamanho do genoma da espécie (G). 10. Congelamento e armazenamento dos clones Após a obtenção do tamanho dos insertos de DNA desejado, os clones foram retirados da placa com meio sólido, um a um, com auxílio de um palito de dente, e depositados em placas de 384 poços contendo 70 µL de uma solução composta por meio LB acrescido de uma solução de congelamento (36 mM de K2HPO4, 13,2 mM de KH2PO4, 1,7 mM de Na3C6H5O7, 0,4 mM de MgSO4, 68 mM de (NH4)2SO4 e 4,4% de glicerol) na proporção 9:1. As placas de 384 poços contendo os clones foram então levadas à estufa a 37ºC por 6 horas para propagação dos clones. Em seguida, foram transferidas para o freezer -80ºC para armazenamento. Resultados e Discussão 1. Avaliação da integridade do genoma Os resultados obtidos a partir das análises citogenéticas permitiram avaliar o cariótipo quanto à ausência de alterações cromossômicas numéricas e/ou estruturais. A partir da coloração com Giemsa observou-se a presença de um cariótipo típico da espécie Bubalus bubalis (2n=50), composto por cinco pares de cromossomos autossomos submetacêntricos, 19 pares de cromossomos autossomos acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (IANNUZZI, 1994). A Figura 6 ilustra uma metáfase corada com uma solução de Giemsa 6%. As metáfases submetidas à técnica de bandamento G apresentaram cromossomos com bandas distintas e contrastantes entre regiões claras e escuras, e com um mínimo de distorção da morfologia cromossômica, como pode ser observado na Figura 7. Optou-se por fotografar as metáfases em preto e branco para facilitar a identificação do padrão de bandas obtido. A partir do bandamento G, quando comparado com o bandamento G 5 µm Figura 6. Fotomicrografia óptica de uma metáfase obtida a partir de um animal macho (Bubalus bubalis, 2n=50) com um aumento de 1000X, corada com Giemsa, mostrando o cariótipo padrão da espécie, padrão da espécie descrito por IANNUZI em 1994, não foi detectada deleção e/ou duplicação de material genético. Como descrito por MIYAKI e colaboradores (1980), resultados de bandamento C em Bubalus bubalis somente podem ser observados nos cromossomos acrocêntricos, uma vez que esta técnica revela somente heterocromatina constitutiva. O fato dos cromossomos submetacêntricos não apresentarem as bandas C pode ser explicado pela provável perda de heterocromatina constitutiva durante o processo de fusão cêntrica na formação dos cromossomos submetacêntricos (IANNUZZI, 1994). Como pode ser observado na Figura 8, os cromossomos mantiveram sua morfologia integra, apresentando as regiões centroméricas e de constrição secundária muito coradas, contrastando com o restante do cromossomo. 5 µm Figura 7. Fotomicrografia óptica de uma metáfase obtida a partir de um animal macho (Bubalus bubalis, 2n=50) submetida à técnica de bandamento G com um aumento de 1000X. No detalhe observa-se um cromossomo acrocêntrico em maior aumento, evidenciando o padrão do bandamento G correspondente ao descrito por IANNUZZI em 1994. A coloração Ag-NOR evidenciou pontos escuros em determinados cromossomos indicando a localização de um tipo particular de DNA, o DNA ribossômico (rDNA), que codifica o RNA ribossômico (rRNA), principal componente dos ribossomos. O rDNA caracteriza-se por sua natureza repetitiva, sendo constituído por seqüências ou unidades de repetições em regiões específicas de determinados cromossomos. As regiões que apresentam esse DNA são denominadas de regiões organizadoras de nucléolos (NORs). Apenas as NORs que estiverem ativas na interfase podem ser visualizadas por essa coloração, que por intermédio do nitrato de prata, impregna às proteínas não histônicas remanescentes da atividade transcricional dessas regiões, contrastando com a cromatina fracamente corada no restante do cromossomo. A Figura 9 ilustra uma metáfase submetida ao tratamento Ag-NOR, onde podem ser observadas as marcações nos cromossomos 3, 19, 22, 25, 26 e 28, que estão de acordo com o padrão estabelecido para a espécie Bubalus bubalis (IANNUZZI et al., 1996). 5 µm Figura 8. Fotomicrografia óptica de uma metáfase obtida a partir de um animal macho (Bubalus bubalis, 2n=50), com um aumento de 1000X, submetida à técnica de bandamento C, cujos cromossomos acrocêntricos apresentam a região centromérica fortemente corada. 2. Construção da biblioteca BAC A partir da contagem de células utilizando-se a câmara de Neubauer e posterior inclusão das mesmas em agarose com baixo ponto de fusão, foram produzidos 96 blocos de agarose com concentração celular de 3x107 células/mL e 58 blocos com 6x107 células/mL, os quais foram armazenados em Tris-EDTA (pH 8.0) a 4ºC. As células contidas nos blocos foram submetidas ao tratamento com proteinase K para lise da membrana nuclear e degradação das proteínas. A Figura 10 ilustra um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, submetido à PFGE, mostrando a qualidade do DNA nos blocos de agarose com concentrações de 3x107 e 6x107 células/mL, após o tratamento com proteinase K. Pode ser observada a presença de um DNA íntegro indicando que ambas as concentrações celulares apresentaram a qualidade exigida para a construção de uma biblioteca BAC. Figura 9. Fotomicrografia óptica de uma metáfase obtida a partir de um animal macho (Bubalus bubalis, 2n=50), com um aumento de 1000X, submetida ao tratamento Ag- NOR, cujos cromossomos 3, 19, 22, 25, 26 e 28 apresentam as regiões organizadoras nucleolares. A seta aponta para uma dessas regiões organizadoras nucleolares. Após verificada a qualidade do DNA dos blocos de agarose, realizou-se o teste de digestão parcial do DNA com diferentes concentrações da enzima de restrição HindIII (de 0,25U a 12U) para definir a concentração ideal da mesma. Para os blocos de agarose com concentração de 3x107 células/mL a concentração ideal de HindIII foi de 0,75U por 5 minutos a 37ºC. Já para os blocos de agarose com concentração de 6x107 células/mL, a concentração ideal de HindIII foi de 1,5U também por 5 minutos. A Figura 11 ilustra um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, submetido à PFGE, mostrando os resultados obtidos com diferentes concentrações da enzima de restrição HindIII e diferentes tempos de digestão. Figura 10. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio e submetido à PFGE, ilustrando a qualidade das células nos blocos de agarose com as diferentes concentrações celulares (3x107 células/mL e 6x107 células/mL) após os tratamentos com proteinase K. Marcador molecular lambda (New England Biolabs - EUA). As setas vermelhas indicam o DNA íntegro. 873.0Kb 1018.5Kb 727.5Kb 824.5Kb 776.0Kb 3x107 6x107 Marcador molecular Lambda Marcador molecular Lambda 679.0Kb Com a determinação da concentração ideal da enzima HindIII para as duas concentrações celulares (3 e 6x107células/mL), seguiu-se a digestão do DNA em larga escala para posterior isolamento e recuperação dos fragmentos para o processo de clonagem. A Figura 12 ilustra um gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio, contendo o DNA proveniente de dois blocos de agarose com 3x107células/mL, parcialmente digeridos com 0,75U da enzima HindIII por 5 minutos a 37ºC, submetido à PFGE. Figura 11. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, submetido à PFGE, ilustrando um dos testes de digestão parcial realizada com diferentes concentrações da enzima HindIII nos blocos de agarose com concentração de 3 e 6x107 células/ml. 3 e 6X107 células/ml: 1. 0,25U de HindIII por 10 minutos a 37ºC; 2. 0,25U de HindIII por 12 minutos a 37ºC; 3. 0,5U de HindIII por 3 minutos a 37ºC; 4. 0,5U de HindIII por 5 minutos a 37ºC. Marcador molecular lambda (New England Biolabs - EUA). DNA parcialmente digerido Marcador molecular Lambda Marcador molecular Lambda 1018.5Kb 48.5Kb 533.5Kb 145.4Kb 630.5Kb 824.5Kb 291.0Kb 388.0Kb 3x107 6x107 1 12 3 4 2 3 4 A fatia excisada do gel contendo os fragmentos de DNA de interesse foi submetida à ação da enzima beta-agarase para a digestão da agarose com baixo ponto de fusão. A concentração do DNA recuperado foi estimada em 2 ng/µL por meio de gel de agarose contendo diluição seriada de DNA lambda e submetido à eletroforese horizontal. A Figura 13 ilustra um gel de agarose 2%, submetido à eletroforese horizontal e corado com brometo de etídio, onde pode ser observada a qualidade do DNA recuperado pela ação da enzima beta-agarase. Figura 12. Gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1% corado com brometo de etídio, submetido à PFGE, ilustrando o resultado da digestão parcial em larga escala com 0,75U de HindIII por 5 minutos de dois blocos de agarose com 3x107 células/ml. Marcador molecular lambda (New England Biolabs - EUA). 1018.5Kb 48.5Kb 533.5Kb 145.4Kb 630.5Kb 824.5Kb 291.0Kb 388.0Kb Marcador Molecular Lambda Marcador Molecular Lambda DNA parcialmente digerido Região do gel com os fragmentos de DNA de interesse As reações de ligação do DNA bubalino com o vetor pBeloBAC11 foram realizadas utilizando uma proporção de 8:1 entre vetor e DNA. Após a reação de ligação, seguiu-se com a transformação por eletroporação das bactérias comerciais ElectroMAXTM DH10BTM (Invitrogen Corporation - EUA), as quais foram espalhadas em placas com meio LB-ágar acrescido do antibiótico cloranfenicol (Serva - Alemanha), XGal (Invitrogen Corporation - EUA) e IPTG (Eppendorf - EUA). Cerca de 50 mil clones foram gerados, dos quais 240 foram analisados quanto ao tamanho do inserto de DNA, revelando uma média de tamanho de inserto de 92 Kb, variando de 50 a 300 Kb. A Figura 14 ilustra um gel de agarose 1% submetido à PFGE, ilustrando o tamanho dos insertos de DNA contidos em um conjunto de 23 clones da biblioteca. Figura 13. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, submetido à eletroforese horizontal, ilustrando a recuperação do DNA parcialmente digerido após ação da enzima beta-agarase dos fragmentos de gel dos blocos de 3x107 células/ml. O DNA lambda padrão (Promega Corporation - EUA) foi diluído nas concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50ng, respectivamente. DNA recuperado com a enzima GELase DNA lambda Marcador molecular 100bp 10 ng 20 ng 30 ng 40 ng 50 ng Os dados obtidos quanto ao tamanho dos insertos da biblioteca BAC de búfalo estão de acordo com o descrito para as bibliotecas construídas para bovino: 103 Kb (FUJISAKI et al., 2002), 104 Kb (BUITKAMP et al., 2000) e 105 Kb (ZHU et al., 1999). Quando comparado com bibliotecas construídas para outros mamíferos, nossos dados continuam dentro do tamanho de inserto esperado, como por exemplo, a biblioteca de cavalo apresentou uma média de tamanho de inserto de 110 Kb (GODARD et al., 1998), de suíno de 116 Kb (LIU et al., 2010), de ovelha de 123 Kb (VAIMAN et al., 1999) e de urso panda apresentou uma média de inserto de 97 Kb (ZENG et al., 2007). Com o tamanho do genoma haplóide do búfalo estimado em três bilhões de nucleotídeos, a cobertura da biblioteca BAC, gerada com 50 mil clones e tamanho médio de inserto de 92 Kb, foi estimada em 1,5X. Figura 14. Gel de agarose 1%, submetido à PFGE e corado com brometo de etídio, ilustrando os tamanhos de insertos de DNA presente em 23 clones da biblioteca BAC. Marcador molecular MidRangeII (New England Biolabs - EUA). Vetor pBeloBAC11 (7,5 Kb) Marcador Molecular MidRangeII 48.5 Kb 73.0 Kb 97.0 Kb 121.0 Kb 145.5 Kb Marcador Molecular MidRangeII 24.5 Kb 218.0 Kb Conclusões Com a construção da biblioteca BAC, agora está disponível para a comunidade científica do Brasil e do exterior, mais uma ferramenta para estudos do genoma do búfalo, denominada BBU_LGC. Essa biblioteca se encontra disponível no Laboratório de Genômica Comparativa, IBILCE-UNESP, Campus de São José do Rio Preto-SP. O presente trabalho estabeleceu todos os parâmetros de obtenção, manutenção e manipulação do DNA-HWM, muitos dos quais se mostraram exclusivos para a espécie Bubalus bubalis, além daqueles parâmetros envolvidos na clonagem em larga escala, tornando possível a geração de clones com tamanho de inserto apropriado para uma cobertura do genoma satisfatória com a biblioteca. A biblioteca BAC de búfalo possui 50 mil clones com um tamanho médio de inserto de 92 Kb, o que fornece uma cobertura do genoma de aproximadamente 1,5X. A disponibilidade dessa nova ferramenta genômica para a espécie B. bubalis permitirá um novo direcionamento nos estudos moleculares do genoma bubalino, uma vez que a biblioteca BBU_LGC poderá ser utilizada para o isolamento e caracterização de genes ou grupos de genes a partir de uma região de interesse, no mapeamento físico, na elucidação da organização gênica, na clonagem posicional, no seqüenciamento e re- seqüenciamento de regiões-alvo ou de cromossomos inteiros, além da identificação de elementos reguladores inter e intra-gênicos. Os resultados poderão ser aplicados em um melhor entendimento da conservação e da variação genética dos búfalos nos rebanhos brasileiros, contribuindo para o desenvolvimento de novas estratégias para os programas de melhoramento genético desta importante espécie. Referências Bibliográficas* ALBERTSEN, H.M. et al. Improved control of partial DNA restriction enzyme digest in agarose using limiting concentrations of Mg++. 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