UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP KAMILLE DALECK SPERA CARACTERIZAÇÃO, AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E MICROENCAPSULAÇÃO DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. ARARAQUARA 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP KAMILLE DALECK SPERA CARACTERIZAÇÃO, AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E MICROENCAPSULAÇÃO DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. Tese apresentada como requisito à obtenção do grau de Doutora em Biotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista – UNESP – campus Araraquara. Orientador: Profº. Drº. Regildo M.G. da Silva ARARAQUARA 2019 Dedico a todos e a tudo que eu penso quando tento significar a palavra gratidão. AGRADECIMENTOS Agradeço, À minha família, Julio, Katia e Allain, por serem sempre o meu motivo, e a minha força quando ela parece acabar. Ao profº Drº Regildo Marcio Gonçalves da Silva, pela orientação e a confiança. A UNESP/Assis em nome do Fitolab, por sediar as nossas pesquisas. Aos companheiros do Fitolab, pela troca de experiências diárias de vida e conhecimento, em especial ao Anderson e ao Filipe pelo auxílio na realização do projeto. Aos amigos de doutorado Pamela e Pedro que tiveram papel fundamental no desenvolvimento do meu trabalho de doutorado e também da vida. Ao Conselho e a Secretaria de Pós-graduação em Biotecnologia pela liberação para o período de doutorado sanduíche, e o auxílio sempre que necessário. Ao João Luiz Bronzel Jr. e ao Nubbe do Instituto de Química da UNESP/Araraquara pelas análises com os espectrômetros e por estar sempre disponível para nos ajudar no que fosse preciso. Ao Leonardo Saldanha da UNESP/Bauru pelas análises com HPLC. À Drª Ana Lucia Tasca Gois Ruiz da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Unicamp pelas análises de citotoxicidade, e ao Rafael Rosolen pelo auxílio com os resultados. Ao pessoal do Horto Florestal de Assis em nome da Drª Elaine Akiko Honda, pelas portas sempre abertas e para o auxílio na coleta das plantas, em especial ao Adriano e ao Joãozinho. Ao pessoal da fazenda de Platina/SP, pelo fornecimento dos frutos de marolo. À Profª Drª Patrizia Perego por ter aberto as portas da Università degli studi de Genova, e me proporcionado viver essa experiência única, e ao técnico Drº Alberto Casazza, pela paciência e por ter me ajudado sempre. A todo o pessoal do laboratório da UNIGE que esteve comigo em Genova, em especial a Caroline, a Elena e ao Piffa, por estarem presentes em momentos que serão inesquecíveis. E ao Profº Drº Attilio Converti por ter me acolhido e tornado tudo mais fácil. Aos meus amigos da vida, que se eu for nomear vão faltar páginas, estou com todos no pensamento. A CAPES pelo financiamento da pesquisa. “... – Eu só queria saber que caminho tomar. – Isso depende do lugar onde quer ir. – Oh realmente não importa desde que eu... – Então não importa que caminho tomar,” (Lewis Carroll, Alice no país das maravilhas, 1865) SPERA, K.D. Caracterização, avaliação do potencial antioxidante e microencapsulação de Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. 2019. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, Universidade Estadual Paulista – UNESP – Instituto de Química, Araraquara/SP. RESUMO GERAL Os compostos de origem vegetal e fitoterápicos tem seu uso cada vez mais difundido na indústria na busca de fontes que tenham atividade biólogica para auxílio do tratamento e/ou prevenção de doenças. Esse aumento traz consigo a busca por alternativas que visem preservar as características de extratos vegetais, como a encapsulação em micropartículas. As acetogeninas são compostos orgânicos derivados de ácidos graxos de cadeia longa que apresentam ampla variedade de propriedades biológicas, tais como atividades citotóxica, imunossupressora, pesticida, antiparasitária e antimicrobiana, além disso existe um interesse crescente neste composto devido ao seu potencial para inibir células resistentes a alguns fármacos. Annona crassiflora e Annona cacans são espécies da família Annonaceae que foram pouco estudadas, sendo, portanto, alvo de interesse na busca de compostos com potencial terapêutico. O presente trabalho obteve a caracterização dos compostos, o perfil antioxidante através de diferentes métodos e a avaliação do potencial antiproliferativo de extratos da folha e polpa das duas espécies. Foi realizado também um design experimental para a microencapsulação com maltodextrina em Spray Dryer com os extratos das folhas de A. crassiflora e A. cacans. Foram identificados diversos compostos nas espécies, com maior incidência de açúcares e compostos fenólicos. Todos os extratos apresentaram antioxidante significativa para os diferentes métodos, dando destaque para A. crassiflora, que precisou de uma menor concentração do extrato para obter atividade. Foram identificados possíveis picos do composto acetogeninas nas folhas de A. cacans. Os extratos de polpa e folha de ambas as espécies apresentaram potencial quanto a avaliação da atividade antiproliferativa. O desenvolvimento do método de microencapsulação foi efetivo, mantendo a composição dos extratos brutos quando encapsulado. Palavras-chave: Annonaceae, radicais livres, acetogeninas, DPPH, maltodextrina LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Produção de radicais livres no organismo..............................................................15 FIGURA 2 Antioxidantes endógenos e exógenos produzidos pelo organismo e obtidos na alimentação...............................................................................................................................17 FIGURA 3 Annona crassiflora (A) Annona cacans (B) e suas ocorrências no Brasil.........................................................................................................................................20 FIGURA 4 Mapa de espécies com ocorrência no Brasil ameaçadas de extinção (CNCFLora, 2012).........................................................................................................................................21 CAPÍTULO 1 FIGURA 1.1 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da folha de A. crassiflora obtida por HPLC (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo 1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40 ºC...........................................................................................32 FIGURA 1.2 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na folha de A. crassiflora................................................................................................................33 FIGURA 1.3 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da polpa de A. crassiflora obtida por HPLC (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250x4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo 1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40 ºC...........................................................................................34 FIGURA 1.4 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na polpa de A. crassiflora...............................................................................................................34 FIGURA 1.5 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da folha de A. cacans obtida por HPLC (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1% Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250x4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo 1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40 ºC...................................................................................................................35 FIGURA 1.6 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na folha de A. cacans......................................................................................................................36 FIGURA 1.7 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da polpa de A. cacans obtida por HPLC (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250x4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo 1,0mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40 ºC...................................................................................................................37 FIGURA 1.8 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na polpa de A. cacans.....................................................................................................................37 FIGURA 1.9 Componentes principais (PCA) da folha e polpa de Annona crassiflora (A) e Annona cacans (B) de acordo com a classe dos compostos........................................................39 FIGURA 1.10 Atividade antioxidante pelo método de hemólise do extrato da folha (A) e polpa (B) de A. crassiflora durante 6 h de incubação e mensurada a 540 nm em espectrofotômetro......................................................................................................................42 FIGURA 1.11 Atividade antioxidante pelo método de hemólise do extrato da folha (A) e polpa (B) de A. cacans durante 6 h de incubação e mensurada a 540 nm em espectrofotômetro......................................................................................................................43 CAPÍTULO 2 FIGURA 2.1 – Cromatograma do extrato bruto das folhas (negativo) e polpa (positivo) de A. crassiflora por MS.....................................................................................................................63 FIGURA 2.2 – Cromatograma do extrato bruto em 10 ppm das folhas e polpa de A. cacans por Ms (Modo positivo)...................................................................................................................64 FIGURA 2.3 – Fragmentação do ión aduto 597 [M+H]+ identificado nas folhas de A. cacans 10 ppm HPLC/Ms (Modo positivo)...........................................................................................65 FIGURA 2.4 – Fragmentação do ión aduto 613 [M+H]+ identificado nas folhas de A. cacans 10 ppm HPLC/Ms (Modo positivo)...........................................................................................65 FIGURA 2.5 – Fragmentação do ión aduto 623 [M+H]+ identificado nas folhas de A. cacans 10 ppm HPLC/Ms (Modo positivo)...........................................................................................66 FIGURA 2.6 – Fragmentação do ión aduto 629 [M+H]+ identificado nas folhas de A. cacans 10 ppm HPLC/Ms (Modo positivo)...........................................................................................66 FIGURA 2.7 – Fragmentação do ión aduto 639 [M+H]+ identificado nas folhas de A. cacans 10 ppm HPLC/Ms (Modo positivo)...........................................................................................66 FIGURA 2.8 Fullscan do extrato bruto em 10 ppm das folhas de A. cacans em modo positivo por MS de alta resolução............................................................................................................67 FIGURA 2.9 – Taxa de crescimento celular com doxorrubicina em linhagens celulares tumorais e em queratinócitos. Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-O (rim); NCI- H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVCAR-03 (ovário); HT-29 (cólon). Linhagem não tumoral humana: HaCaT (queratinócito)..............................................68 FIGURA 2.10 Taxa de crescimento celular com extrato da polpa e folha de A. crassiflora em linhagens celulares tumorais e em queratinócitos. Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-O (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVCAR-03 (ovário); HT-29 (cólon). Linhagem não tumoral humana: HaCaT (queratinócito)...........................................................................................................................69 FIGURA 2.11 Taxa de crescimento celular com extrato da polpa folha de A. cacans em linhagens celulares tumorais e em queratinócitos. Linhagens tumorais humanas: U251 (glioma); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-O (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVCAR-03 (ovário); HT-29 (cólon). Linhagem não tumoral humana: HaCaT (queratinócito)...........................................................................................................................70 CAPÍTULO 3 FIGURA 3.1 Quantificação de fenóis totais pelo método de Follin ciocateau dos extratos em diferentes condições de extração...............................................................................................78 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 TABELA 1.1 Teor de Fenois e Flavonoides totais dos extratos da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans................................................................................................................................ 31 TABELA 1.2 Resultados de açúcares solúveis totais das folhas de A. crassiflora e A. cacans........................................................................................................................................38 TABELA 1.3 Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH (%) e EC50, FRAP, TBARS e NO dos extratos da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans......................41 CAPÍTULO 2 TABELA 2.1 Identificação dos picos de acetogeninas nos extratos da folha de A. crassiflora e A. cacans ...................................................................................................................................64 TABELA 2.2 Atividade antiproliferativa dos extratos de A. crassiflora e A. cacans e do fármaco antineoplásico Doxorrubicina frente a linhagens tumorais .........................................71 CAPÍTULO 3 TABELA 3.1 Atividade antioxidante dos extratos das folhas de A. crassiflora e A. cacans pelo método DPPH em diferentes concentrações..............................................................................79 TABELA 3.2 Atividade antioxidante dos extratos de folha de A. crassiflora e A. cacans pelo método ABTS em diferentes concentrações..............................................................................79 TABELA 3.3 Condições de processo obtidas por Box-Behnken e rendimento de processo do pó obtidos para os extratos de folha de A. crassiflora e A. cacans .............................................80 TABELA 3.4 Índice de solubilidade em água (IA) e índice de absorção de água (IA) e atividade de água (AA) nas microcápsulas de extratos de A. crassiflora e A. cacans................................81 TABELA 3.5 Quantificação de Polifenois totais, superficiais e microencapsulados nas microcápsulas de extratos de A. crassiflora e A. cacans………………………………..................81 TABELA 3.6 Atividade antioxidante pelo método ABTS das microcápsulas de extratos de A. crassiflora e A. cacans nas condições definidas pelo modelo experimental…………………...82 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................................12 2 LEVANTAMENTO TEORICO.............................................................................................15 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................................24 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................24 CAPÍTULO 1 CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. 1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................26 2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................27 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................31 4 CONCLUSÃO.......................................................................................................................44 CAPÍTULO 2 IDENTIFICAÇÃO DE ACETOGENINAS E ATIVIDADE CITOTÓXICA DE EXTRATOS DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm.. 1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................58 2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................60 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................63 4 CONCLUSÃO.......................................................................................................................71 CAPÍTULO 3 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO DE MICROENCAPSULAÇÃO DE EXTRATOS DE FOLHAS Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. 1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................75 2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................76 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................78 4 CONCLUSÃO.......................................................................................................................82 CONCLUSÃO GERAL............................................................................................................85 REFERÊNCIAS........................................................................................................................86 Introdução Geral 12 1 INTRODUÇÃO GERAL A microencapsulação é um processo utilizado para recobrir pequenas partículas de sólidos, gotículas de líquido ou materiais gasosos (Menezes et al., 2013). As microcápsulas são constituídas por um núcleo interno contendo o agente ativo recoberto por uma camada de polímero de espessura variável (FIB, 2013). A técnica de microencapsulação permitiu o desenvolvimento de fórmulas com liberação controlada de compostos ativos em locais e meios onde devem agir ou onde serão absorvidos (Santos et al., 2000; Ré, 2000). O princípio ativo protegido é liberado gradativamente por meio de estímulos adequados, como mudança de pH, rompimento físico, intumescimento, dissolução, entre outros (Gibbs et al., 1999). Substâncias com atividade medicamentosa, por exemplo, tem seu efeito prolongado no organismo, assim como produtos alimentícios funcionais podem ser otimizados pelo mecanismo de liberação mais eficiente, sendo assim os produtos de microencapsulação têm aplicação direta tanto na indústria farmacêutica quanto na alimentícia e cosmética (Ré, 2000). Compostos funcionais passaram a ter maior atenção devido a suas propriedades preventivas a doenças. Entre eles, destaca-se os antioxidantes, que protegem o organismo contra o estresse oxidativo (Oroian e Escriche, 2015). A oxidação é um processo metabólico que resulta na produção de energia para as atividades celulares (Roesler et al., 2007). O metabolismo do oxigênio nas células vivas desencadeia a produção de radicais livres (Oroian e Escriche, 2015), a qual, se não for controlada, pode causar danos ao organismo (Roesler et al., 2007). Em sistemas biológicos existe um equilíbrio entre os fatores que promovem a oxidação e os mecanismos de defesa antioxidantes (Carocho et al., 2018), porém, é o acúmulo desses radicais que leva ao estresse e ao desenvolvimento de doenças crônicas e degenerativas, incluindo o câncer, doenças cardíacas e Alzheimer (Ferreira e Abreu, 2007). Os antioxidantes são compostos capazes de agir contra os danos da oxidação (Niki, 2010). Entre seus mecanismos de ação estão: suprimir a formação de radicais por inibição enzimática ou por quelar elementos envolvidos na sua produção; eliminar espécies reativas de oxigênio, manter o mecanismo de defesa antioxidante regulado e protegido (Andallu et al., 2014). Extratos vegetais têm sido considerados em diferentes estudos por apresentar flavonoides com capacidade de sequestrar radicais livres, doadores de hidrogênio, e quelante de metais (Pietta, 2000; Gonzalo e Alonso, 2002; Zaid et al., 2009). Outros compostos naturais que possuem atividade antioxidante incluem a classe de fenóis, ácidos fenólicos e seus derivados, tocoferóis, fosfolipídios e esteróis (Roesler, 2007). Introdução Geral 13 Entre as famílias botânicas, de interesse como produtoras de compostos ativos, destaca- se a Annonaceae e o gênero Annona. Annonaceae é uma família pantropical de árvores, arbustos e lianas, ocorrentes principalmente em ecossistemas de floresta tropical (Couvreur et al., 2012). Até o momento são descritos e reconhecidos cerca de 130 gêneros e mais de 2000 espécies (Joly, 1979; Lorenzi e Matos, 2002), sendo o gênero Annona um dos mais representativos (Nunes et al., 2012). No Brasil ocorrem 29 gêneros (sendo um endêmico) e cerca de 386 espécies (Maas et al., 2015). Economicamente, a família tem importância considerável como fonte de frutos comestíveis (Lebouef et al., 1982) sendo as espécies mais exploradas Annona muricata L. (graviola), Annona squamosa Delile (fruta-do-conde) e Annona crassiflora Mart. (marolo) (Telles et al., 2003), devido às propriedades nutricionais dos frutos consumidos in natura, e ao fato de apresentarem como particularidade, sabor adocicado e perfume característico (Lorenzi e Matos, 2002; Takahashi, 2008). Existem espécies dessa família, como por exemplo, a espécie nativa do cerrado Annona cacans Warm., (Lorenzi e Matos, 2002) que apesar de não consideradas com importância econômica relevante, são conhecidas em comunidades locais. O Marolo (Annona crassiflora) apresenta grande apelo sensorial, tais como cor, aroma e sabor, além de ser muito eficiente nutricionalmente, apresentando altos níveis de vitaminas, ácido ascórbico e carotenoides (Corrêa et al., 2011). Apesar destas características, o marolo fresco na fase maduro é pouco consumido, mas apresenta características físico-químicas adequadas para a utilização como ingrediente alimentar (Lage et al., 2014). Além de ser conhecido pela riqueza em compostos antioxidantes, marolo fornece fibras alimentares, o que torna este fruto benéfico para a saúde (Corrêa et al., 2011). Na alimentação humana, o fruto do araticum-cagão (A. cacans) não é muito apreciado in natura, pois apesar de ter polpa abundante e doce, apresenta efeito diarreico (Mattos, 1978; Saito e Alvarenga, 1994). Os frutos são saborosos, porém sua ação é tão grande que essa propriedade específica lhe ficou consagrada até na denominação popular como na botânica (Kulhmann e Kuhn, 1947). Na formação da biodiversidade de substâncias químicas das Annonaceae foram catalogados cerca de 320 produtos naturais secundários provenientes de 150 espécies pertencentes a 41 gêneros, como substâncias aromáticas, ácidos fenólicos, taninos, flavonoides, catequinas, proantocianidinas, óleos essenciais, terpenos, esteroides, carboidratos, lipídios, proteínas, lactonas, carotenos, saponinas, entre outros (Lebouef et al., 1982; Carocho et al., 2018). Flavonoides encontrados no gênero Annona foram flavonas (luteonina) e flavonóis (canferol, quercetina, ramnetina e rutina) (Arruda, 2018). Introdução Geral 14 Algumas Annonaceaes são amplamente cultivadas e utilizadas como inseticidas e parasiticidas (Chen et al., 2004), e comprovadas atividades anti-helmíntica, antimalárica, antimicrobiana, antiprotozoária, pesticida e antioxidantes (Alali et al., 1999; Julián-Loaeza et al., 2010). Estudos farmacológicos em espécies de Annonaceae se intensificaram, em grande parte, devido à descoberta das acetogeninas, compostos orgânicos derivados de ácidos graxos de cadeia longa, e que tem grande variedade de atividades biológicas (Rupprecht et al., 1990). Diversos estudos apontam o alvo de ação das acetogeninas como sendo a cadeia mitocondrial de transporte de elétrons no complexo I da cadeia respiratória e ação específica na enzima NADH-ubiquinona-oxidoredutase (Rupprecht et al., 1990). As acetogeninas inibem a NADH-oxidase ligada a ubiquinona, presente nas membranas de células tumorais (Alali et al.,1999). Tem demonstrado citoxicidade seletiva em células cancerosas (Wu, 2006), atividade parasiticida (Wang et al., 2002), insecitida, antitumoral e imunossupressora, antimalárica e antiprotozoária (Alali et al.,1999; Nova, 2008), e antimicrobiana (Yang et al., 2010). Os processos micro/nanotecnológicos vêm sendo aplicados, principalmente, na indústria farmacêutica e cosmética pois torna eficiente a veiculação de moléculas bioativas no organismo, bem como facilita a penetração desses compostos nas camadas mais profundas da pele, potencializando o efeito dos produtos (Schmaltz et al., 2005). Existem muitas razões para encapsular compostos bioativos, sendo que, de modo geral, este processo resulta em sua maior proteção, melhora a especificidade do produto final, e otimiza a ação dos mesmos em sítios alvo (Suave et al., 2006). A microencapsulação de acetogeninas, por exemplo, pode prolongar a estabilidade do composto e, consequentemente, permitindo que seu valor medicinal e/ou nutricional não seja significativamente diminuído. Diante da variedade de atuação das acetogeninas, e a possibilidade de encontrar compostos de interesse nas Annonaceae, se justificam a implantação, o objetivo e o desenvolvimento deste projeto e a importância da investigação das espécies Annona crassiflora e Annona cacans para conhecer a biodiversidade de sua composição, e assim serem possíveis fontes de bioativos, assim como o processo de microencapsulação do mesmo, permitindo forma otimizar as atividades biológicas das espécies para aplicação na indústria alimentícia, de medicamentos e cosméticos. Levantamento Teórico 15 2 LEVANTAMENTO TEÓRICO 2.1 Radicais livres Radicais livres são moléculas instáveis de qualquer espécie química contendo elétrons não pareados, e que tendem a capturar elétrons de moléculas biológicas estáveis, como lipídios, DNA, proteínas, para se neutralizar (Betteridge, 2000). Os radicais livres mais conhecidos são, as espécies reativas de oxigênio (ROS) e as espécies reativas de nitrogênio (RNS) (Carocho et al., 2018), as quais podem ser, ânion superóxido (O2 -), óxido nítrico (NO), o radical hidroxila (OH-), metais como ferro e cobre, entre outros (Betteridge, 2000). Existem processos naturais no organismo que levam a produção de radicais livres (Figura 1). Os derivados do oxigênio representam a classe mais importante de espécies radicais geradas em sistemas vivos (Miller et al., 1990), e a principal fonte de acúmulo das ROS são as mitocôndrias, onde durante a transdução de energia, ocorre a oxidação, e com ela se dá a formação do produto final superóxido (Valko et al., 2007). (Fonte: King, 2007) FIGURA 1. Produção de radicais livres no organismo O radical fisiológico óxido nítrico (NO) é produzido pelo endotélio vascular como um fator de relaxamento (Moncada e Higgs. 1993). O óxido nítrico (NO) atua como molécula sinalizadora oxidativa em vários processos fisiológicos, como neurotransmissão, regulação da pressão arterial, mecanismos de defesa, relaxamento da musculatura lisa e regulação imunológica, porém seu excesso pode ser tóxico (Bergendi et al., 1999). https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1357272506002196?via%3Dihub#bib19 Levantamento Teórico 16 Uma via de formação de radicais livres é quando o radical superóxido reage com íons de ferro e cobre e geram radicais hidroxila, ou então, se combina com o óxido nítrico e obtém peroxinitrito (Anderson, 1996). Esse produto final, quando em decomposição, gera produtos tóxicos, incluindo gás dióxido de nitrogênio, radical hidroxila e íon nitronium, e tem propriedades que podem causar a fragmentação do DNA (Carr et al., 2000). O ataque de radicais nas membranas ou lipoproteínas inicia a peroxidação lipídica (Witzum, 1994). Durante a peroxidação lipídica, ocorrem reações em cadeia frequentes e que removem H de moléculas, nesse processo, ocorre a liberação do radical hidrogênio (H+), considerado o radical livre mais simples, pois é formado apenas por um próton e um elétron (Anderson, 1996) e a formação de AGES, os produtos finais da reação entre carboidratos e grupo amino livre de proteínas (Valko et al., 2007). Além de serem geradas no metabolismo celular, as ROSs podem ser produzidas em resposta a diferentes estímulos externos como radiação ionizante, poluição, agentes oxidantes e quimioterápicos (Halliwell, 1991; Halliwell e Gutteridge, 2007). A formação do radical hidroxila (OH-) pode ocorrer com a quebra da água por raios gama quando em exposição à radiação solar ou até mesmo uma radiação eletromagnética de baixo comprimento de onda (Anderson, 1996). Este mecanismo demonstra que os radicais livres além de serem produzidos pelo organismo, podem ter sua produção agravada por fatores externos. 2.2 Estresse oxidativo Em sistemas biológicos existe um equilíbrio entre os fatores que promovem a oxidação e os mecanismos de defesa contra os radicais livres, os antioxidantes (Ferreira e Abreu, 2007). Se a produção de radicais livres supera a capacidade de ação dos antioxidantes, a oxidação de biomoléculas é facilitada e então, gerados seus produtos finais, que servem como marcadores do chamado estresse oxidativo (Barbosa et al., 2010). Esses produtos podem ser, entre outros, derivados de lipídeos, proteínas e DNA (Vincent et al., 2007). O estresse oxidativo, portanto, é configurado como o desequilíbrio da relação radical livre/antioxidante, que pode contribuir para o surgimento ou a piora no desenvolvimento de doenças crônicas e degenerativas como Alzheimer, Parkinson, Diabetes, Escleroses, Hipertensão, entre outras (Carocho et al., 2018). Os danos no DNA causados pelos radicais livres tem como seu alvo de ação principal os processos de mutagênese e carcinogênese (Poulsen et al., 1998). Levantamento Teórico 17 O organismo humano está sujeito ao estresse oxidativo causado por ROS e RNS vindas do meio ambiente ou geradas pelo próprio organismo e a ação de espécies oxidantes sobre o DNA é responsável por mutação ou oncogênese e cabe às micromoléculas, tais como tocoferóis, carotenoides e flavonoides o papel de impedir ou regenerar os danos causados (Barreiros e David, 2006). Muitas fontes vegetais frequentemente utilizadas com atividade antioxidante ainda não foram estudadas ou seus princípios ativos ainda não foram totalmente identificados (Pan et al., 2009). O mecanismo complexo de atividade anti e pró-oxidante destas substâncias ainda precisa ser avaliado para verificar como e onde serão utilizadas suas propriedades, bem como se existem mecanismos de sinergia entre os compostos presentes. 2.3 Antioxidantes e mecanismos de ação Os antioxidantes equilibram os radicais livres no organismo. São moléculas que agem contra os danos dos radicais por diversos mecanismos de ação, seja por impedir sua formação pela inibição das reações; impedir o ataque a moléculas estáveis; reparar lesões causadas; remover os danos do DNA; reconstituir membranas celulares e/ou aumentar a síntese de enzimas antioxidantes (Bianchi e Antunes, 1999; Carocho et al., 2018). Um antioxidante considerado de boa atividade, possui doadores de elétrons ou de hidrogênio aos radicais em função de seu potencial de redução; capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura; capacidade de quelar metais de transição e local de ação (Manach et al., 2004). O organismo possui antioxidantes endógenos que atuam como primeira linha de defesa, como as enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa eroxidase (Barreiros e David, 2006). Muitas vezes as defesas antioxidantes do organismo não são suficientes, sendo necessários antioxidantes provenientes de fontes externas, os exógenos. São obtidos por meio da alimentação, por exemplo, α-tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), curcumina, β-caroteno, flavonoides, glutationa, e metais como zinco, cobre, selênio e magnésio, que otimizam a proteção contra os radicais livres (Shahidi e Ho, 2007) (Figura 2). A busca por antioxidantes tem sido beneficiada pelo estudo de compostos de origem natural, principalmente os oriundos de vegetais, como os polifenóis, em particular, flavonoides, que tem sido considerado os de maior potencial antioxidante em diversos estudos (Niciforovic et al., 2010), sendo até mesmo mais efetivos que as vitaminas C e E. A atividade dos compostos fenólicos é principalmente devida às suas propriedades de óxido-redução, com papel na absorção e neutralização de radicais livres (Degáspari e Waszczynskyj, 2004). Levantamento Teórico 18 (Fonte: Quiles, J., 2018) FIGURA 2. Antioxidantes endógenos e exógenos produzidos pelo organismo e obtidos na alimentação Vegetais in natura, como frutos, legumes, folhosos em geral e condimentos, contêm numerosos fitoquímicos, destacando-se os compostos fenólicos, os compostos nitrogenados, os carotenoides, o ácido ascórbico e os tocoferóis (Pereira e Cardoso, 2012). Esses compostos apresentam significativa atividade antioxidante e estão associados à menor incidência e menor mortalidade por doenças crônicas não transmissíveis, sobretudo o câncer, em seres humanos. Ressalta-se assim a importância da dieta balanceada na prevenção de diferentes doenças e do envelhecimento precoce (WCRF, 2007). 2.4 Família Annonaceae Entre as famílias botânicas de interesse como fontes de compostos ativos destaca-se a Annonaceae, principalmente as espécies do gênero Annona. Esta família caracteriza-se por árvores, arbustos e lianas, ocorrentes principalmente em ecossistemas de floresta tropical (Couvreur et al., 2012). São geralmente de hábito disperso e ocorrem em florestas perene de baixa altitude, na América tropical são arbóreos e crescem principalmente em planícies abertas (Hutchinson, J. 1964). Até o momento foram descritos e reconhecidos cerca de 130 gêneros e mais de 2000 espécies, sendo o gênero Annona um dos mais representativos (Leboeuf et al., 1982). No Brasil ocorrem 29 gêneros e cerca de 386 espécies (Maas et al., 2015). Economicamente a família é de importância considerável, como fonte de frutos comestíveis (Nunes et al., 2012). As espécies mais exploradas são Annona muricata L. (graviola), Annona squamosa Delile (fruta-do-conde), Annona reticulata Sieber ex A.DC. (condessa) e Annona crassiflora Mart. (marolo), devido às propriedades nutricionais dos frutos e pelo sabor adocicado e perfume (Takahashi, 2008). Levantamento Teórico 19 Existem espécies silvestres dessa família, como por exemplo, a espécie nativa do cerrado Annona cacans Warm., que apesar de não serem consideradas de importância econômica relevante são conhecidas em comunidades locais. Os estudos científicos de caracterização fitoquímica das diferentes espécies de Annonaceaes concentram-se na composição alcaloídica das plantas, mas estas, também produzem uma ampla gama de diferentes compostos pertencentes a vários grupos fitoquímicos, aproximadamente 500 alcaloides são investigados em 138 espécies de Annonaceae de 43 gêneros (Leboeuf et al., 1982; González-Esquinca et al., 2014). Essa família necessita de investigações fitoquímicas completas e mais amplas que proporcionem a elucidação e a descoberta de novos compostos ativos passíveis de serem empregados na indústria de medicamentos, cosméticos, agrícolas e de alimentos (Alfaia e Almeida, 2016). Em estudos fitoquímicos realizados com diferentes Annonaceaes já foram identificados cerca de 320 produtos naturais secundários como substâncias aromáticas, fenólicos, taninos, flavonoides, catequinas, proantocianidinas, óleos essenciais, terpenos, esteroides, carboidratos, lipídios, proteínas, carotenos, saponinas, entre outros (Lebouef et al., 1982, Lúcio et al., 2015). Entre os compostos da presentes na graviola, destacam-se ácidos graxos, terpenóides e acetogeninas. No óleo essencial das folhas estão presentes 80 compostos, 39 os constituintes mais abundantes β-cariofileno, Δ-cadineno, epi-α-cadinol e α-cadinol (Kossouoh, 2007). Em estudo realizado por Coria-Téllez (2018) foi revisado cerca de 200 compostos com atividades metabólicas desta espécie. As cascas, raízes, sementes ou folhas de graviola utilizadas em decocções ou cápsulas são empregadas no tratamento popular do câncer (Tisott et al., 2013). As atividades biológicas desta espécie são atribuídas principalmente à sua composição em acetogeninas, devido a suas propriedades citotóxica, antitumoral, sedativa, imunossupressora, antiparasitária, antimicrobiana e pesticida (Nova, 2008; Yang et al., 2010). Os óleos essenciais de Annona possuem várias atividades biológicas, como perfil anticancerígeno, analgésico, antinflamatório e de citotoxicidade (Râbelo et al., 2015). Estudos tem demonstrado de modo geral, que o gênero Annona apresentam em sua composição flavonoides principalmente flavonas (luteonina) e flavonóis (canferol, quercetina, ramnetina e rutina) (Nunes et al., 2012). Quanto aos efeitos farmacológicos das Anonnaceaes, podemos citar a atividade antitumoral, bioinseticida, vermicida, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do apetite, repelente de insetos tópicos, entre outras (Cavé et al., 1997; Alali et al., 1998, Leatemia e Isman, 2004, Isman e Akhtar, 2007). Levantamento Teórico 20 2.5 Annona crassiflora e Annona cacans Entre as espécies do gênero Annona, com capacidade de se tornar fonte de compostos ativos de interesse industrial, destacam-se A. crassiflora e A. cacans (Figura 3). Estas espécies possuem poucos estudos científicos baseados em seus compostos e suas potencialidades de aplicação em comparação a outras espécies do mesmo gênero. Entretanto já foram identificados pontos relevantes de análise como pós-colheita e conservação, pois os frutos são altamente perecíveis, a produção é irregular, com anos de alta e de baixa produtividade; ocorrência de pragas e doenças como broca-do-fruto (Cerconota anonella) e sistema propagação vegetativa pois as sementes possuem alto grau de dormência (Broglio-Micheletti e Berti-Filho, 2000). (Fonte: autor e Maas et al., 2015) FIGURA 3 - Annona crassiflora (A) Annona cacans (B) e suas ocorrências no Brasil Sobre as características morfológicas de Annona crassiflora, apresenta porte arbóreo, medindo entre 4 a 8 metros de altura, com tronco geralmente tortuoso de 20 a 30 cm de diâmetro, casca áspera e corticosa; folhas alternas simples; flores axilares, com pétalas engrossadas e carnosas (Lorenzi, 2002). Os frutos têm cerca de 15 cm de diâmetro com média de 2 kg de peso, oval arredondado, com casca na cor marrom claro e polpa creme amarelada firme e grande quantidade de sementes elípticas e marrom escuras. B A B Levantamento Teórico 21 No domínio fitogeográfico do Cerrado, o araticum é encontrado nas fisionomias: cerradão, cerrado denso, cerrado típico, cerrado ralo e campo rupestre (Almeida et al., 1998). A distribuição geográfica de A. crassiflora no Brasil ocorre nos estados de MG, SP, MS, DF, GO, MT, PA, BA, TO, MA e em áreas remanescentes de cerrado no PR (Maas et al., 2015). Conhecida popularmente como marolo, araticum, araticum-do-cerrado, Annona crassiflora, é amplamente consumida como fruto de mesa e em pratos típicos (doces, geleias, licores, refrigerantes, sorvetes e sucos) nas regiões de ocorrência, principalmente devido ao seu sabor, aroma e cor (Luzia e Jorge, 2013). Tem grande potencial nutricional, apresentando altos níveis de vitaminas, ácido ascórbico e carotenoides (Botrel et al., 2016). No entanto, seu consumo é menor que os das outras espécies de anonas, como a graviola e fruta do conde. Esta espécie possui também compostos antioxidantes e seus frutos fornecem fibras alimentares que beneficiam a saúde (Corrêa et al., 2011). A capacidade antioxidante e a estabilidade oxidativa foram evidenciadas em A. crassiflora como significativamente influenciadas pelo teor de fitoesterol e pela composição de ácidos graxos presentes, o que contribui para a possibilidade de emprego dessa espécie como ingrediente na indústria de alimentos, farmacêutica e de cosméticos (Luzia e Jorge, 2013). São vários os aspectos que tornam a espécie interessante do ponto de vista comercial, inclusive seu fruto já é explorado por indústrias de doces, sorvetes e outros produtos alimentícios. Annona cacans é conhecida popularmente como Araticum cagão. Sua distribuição geográfica tem ocorrência estados da BA, PE, MS, ES, MG, RJ, SP, PR, RS e SC, e presença nos domínios fitogeográficos do Cerrado e Mata Atlântica (CNCFlora, 2012). A árvore tem de 7 a 20 m de altura, ramos jovens, ramos adultos glabros, folhas cartáceas, elípticas, glabras, até 2 flores, fruto ovóide verde com polpa amarelada e vermelha na base (Maas et al.,2001). (Fonte:CNCFLora, 2012) FIGURA 4. Mapa de possibilidade de extinção de A. cacans no Brasil Levantamento Teórico 22 Os frutos de Annona cacans não são consumidos pois possuem atividade diarreica, porém apresenta uma polpa adocicada e aromática (Carvalho, 2003). A espécie foi pouco avaliada, porem já foram identificados alcaloides, em extratos obtidos de seu caule e em particular, a liriodenina, tanto no tegumento quanto no endosperma das suas sementes (Saito e Alvarenga, 1994; Sousa et al., 2019). A espécie está na lista vermelha de risco de extinção (Figura 4) (CNCFlora, 2012). Nascimento (2008) descreveu diterpenos caurânicos, acetogeninas, esteróides, e alcaloides em Annona cacans, além de ter isolado seis substâncias inéditas: um caurano, três acetogeninas naturais, verificou alta toxicidade em Artemia salina e possível atividade inseticida contra Musca domestica. Recentemente foram avaliadas sua potencialidade antioxidante e fotoprotetora de extratos obtidos da polpa do fruto e das folhas desta espécie (Spera, K.D. 2014). 2.6 Acetogeninas Estudos farmacológicos utilizando espécies de Annonaceae se intensificaram, em grande parte, devido à descoberta das acetogeninas, compostos orgânicos derivados de ácidos graxos de cadeia longa e que tem grande variedade de atividades biológicas (Rupprecht et al., 1990). Setenta espécies a partir de cinco gêneros (Annona, Goniothanlamus, Rollinia, Uvaria e Xylopia) da família Annonaceae são fontes de acetogeninas (Gu, 1995). Diversos estudos apontam como alvo de ação das acetogeninas a cadeia mitocondrial de transporte de elétrons, conhecido como complexo I da cadeia respiratória, e tem ação específica na enzima NADH-ubiquinona-oxidoredutase (Rupprecht et al., 1990). Além disso inibe a NADH-oxidase ligada a ubiquinona está presente nas membranas de células tumorais (Alali et al.,1998). As acetogeninas de Annonaceae exibem uma ampla gama de propriedades bioativas tais como citoxicidade seletiva especificamente em células cancerosas, atividade parasiticida, inseticida antitumoral, antineoplásicas, antiparasitárias, citotóxicas, imunossupressoras, neurotóxicas e pesticidas (Wu, 2006; Nova, 2008). Quanto à citotoxicidade, foi relatada a atividade de annonacina e acetogeninas presentes em extratos de Annona muricata em células Raji linfoblastos-B infectados com vírus Epstein Barr (Roduan et al., 2018) existem também estudos anteriores, que descobriram que a anonacina é citotóxica na maioria das linhas celulares de câncer, como pâncreas e mama (Woo et al. 1999; Yuan et al. 2003; Ko et al. 2011). Levantamento Teórico 23 Foram verificadas interações entre fármacos antitumorais e antioxidantes, onde ocorreu potencialização do mecanismo de ação desses fármacos na diminuição do tamanho dos tumores e devido a atividade biológicas dos antioxidantes, obtiveram uma ação com menos efeitos colaterais, o que levou a melhoria da qualidade de vida do paciente (Rohenkohl et al., 2011). Portanto, quando se fala em quimioterapia, já está sendo considerado o uso da graviola, para evitar possíveis infecções protegendo o sistema imunológico levando em consideração o fato de que diferente dos quimioterápicos convencionais, os compostos não atingem as células saudáveis (González-Esquinca et al., 2014). Já foram identificadas mais de 500 tipos de acetogeninas em Annonaceae de 51 espécies em 13 gêneros (González-Esquinca et al., 2014). Os efeitos citotóxicos e antitumorais dessas substâncias são responsáveis pela popularidade destas moléculas (Liaw et al., 2016). 2.7 Tecnologia de microencapsulação de compostos bioativos Uma desvantagem na utilização de antioxidantes naturais, é a possibilidade de degradação durante o processamento, o que resulta em perda total ou parcial de atividade. O microencapsulamento, que consiste no processo de recobrir o composto ativo por uma camada de polímero de espessura variável e conhecida, está provando ser uma solução para manutenção da atividade antioxidante de diferentes compostos naturais (FIB, 2013; Carocho et al., 2018). Essa tecnologia permite também o desenvolvimento de fórmulas com liberação controlada por estímulos adequados (mudança de pH, rompimento físico, intumescimento, dissolução, entre outros) em locais e meios onde devem agir ou onde serão absorvidos (Suave et al., 2006). No que diz respeito ao processo de microencapsulamento de ativos naturais, a escolha do material encapsulante se dá pela sua capacidade de formação de filme, baixa viscosidade em altas concentrações, capacidade emulsificante e não reatividade com o material encapsulado (Gharsallaou et al, 2007). Entre os diferentes encapsulantes a maltodextrina sozinha ou combinada com gomas são os agentes mais utilizados no processo de secagem e obtenção do produto encapsulado (Ding e Shah, 2009). A técnica de microencapsulação por Spray Dryer consiste numas etapas onde a substância a ser encapsulada é homogeneamente dispersa ou dissolvida em uma solução aquosa ou com o solvente de interesse, contendo o agente encapsulante, então, essa solução é atomizada em corrente de ar quente que vai promover a evaporação do solvente, obtendo-se a rápida solidificação das gotículas que depois serão recolhidas no ciclone em forma de pó (Nunes, 2014, Maciel, 2018). Levantamento Teórico 24 Os produtos de microencapsulação têm, portanto, aplicação direta tanto na indústria farmacêutica quanto na de alimentos, cosméticos e agrícola. A encapsulação de extratos direcionados para acetogenina pode oferecer um sistema eficiente para o composto ativo. Os processos micro/nanotecnológicos vêm sendo aplicados, principalmente, na indústria farmacêutica e cosmética e torna mais eficiente a veiculação de moléculas bioativas no organismo, bem como facilita a penetração desses compostos nas camadas mais profundas da pele (Schmaltz et al., 2005). Objetivos 25 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Analisar o perfil fitoquímico de Anonna crassiflora e Annona cacans, avaliar a atividade antioxidante dos extratos, identificar acetogeninas e microencapsular os extratos. 3.2 Objetivos específicos Realizar o screening fitoquímico de folha e polpa de A. crassiflora e A. cacans, verificando compostos de interesse, através de HPLC e Cromatografia Gasosa. Determinar o conteúdo de fenóis e flavonoides totais dos extratos da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans. Determinar a atividade antioxidante por diferentes metodologias dos extratos de polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans. Identificar a presença de acetogeninas nos extratos com espectrômetro de massas MS. Determinar a atividade antiproliferativa em linhagens celulares tumorais dos extratos de polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans Microencapsular os extratos das folhas com Spray Dryer, otimizar o método e avaliar as microcápsulas obtidas quanto ao teor de fenóis totais. Capítulo 1 CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE CARACTERIZAÇÃO, DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. Capítulo 1 27 CARACTERIZAÇÃO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Annona crassiflora Mart. E Annona cacans Warm. RESUMO Em consideração a biodiversidade brasileira e a possibilidade de descobrir novos compostos bioativos que podem ser encontrados nas espécies vegetais nativas se dá a importância do presente estudo. Annona é um gênero bastante representativo do Cerrado brasileiro. A fruta de Annona crassiflora já tem seu consumo difundido, porém ainda se sabe pouco sobre a relação de suas atividades já comprovadas biológicas e seus compostos, já Annona cacans, tem menor ocorrência e não existem estudos aprofundados na literatura sobre seu perfil fitoquímico. Foi realizado um screening para verificação dos compostos majoritários nos extratos de acetato de etila da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans, com Cromatografia Gasosa, foi quantificado a quantidade de Fenois e Flavonoides totais, e analisado em HPLC para verificação dos principais Flavonoides, e verificado o potencial antioxidante de acordo com os testes DPPH, TBARS, FRAP, Óxido nítrico e Hemólise, para comparação dos diferentes métodos de ação antioxidante dos extratos. Os resultados demostraram que os extratos de folha e polpa de ambas as espécies apresentam atividade antioxidante significativa, principalmente pelo método DPPH, e em baixas concentrações. Foram identificados cerca de 90 compostos em A. crassiflora e 270 em A. cacans, em sua maioria açúcares e compostos fenólicos. Palavras-chave: Annonaceae, radicais livres, compostos, Follin, CG. 1 INTRODUÇÃO Annonaceae é uma família botânica constituída de aproximadamente 120 gêneros, com mais de 2000 espécies, sendo 29 gêneros e cerca de 386 espécies brasileiras (Leboeuf et al., 1982, Maas et al., 2015). Estudos fitoquímicos e nutricionais já realizados com espécies desta família demonstraram a presença de carboidratos, lipídios, aminoácidos, proteínas, polifenóis, óleos essenciais, terpenos e alcaloides em diferentes partes das plantas (Leboeuf et al., 1982, González-Esquinca et al., 2014, Lúcio et al., 2015). Estes compostos podem estar envolvidos na atividade biológica atribuída as espécies desta família, tais como a atividade antitumoral, bioinseticida, vermicida, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do apetite, repelente de insetos tópicos, entre outras (Tissot et al., 2013, Coria-Téllez et al., 2018). O gênero Annona é representado no Brasil por mais de 80 espécies, sendo 24 endêmicas (Maas et al., 2015). Entre as espécies deste gênero, algumas são conhecidas e amplamente utilizadas como alimento e na medicina popular para o tratamento de diferentes doenças, destacando-se a Annona muricata (graviola) e Annona squamosa (fruta-do-conde) que possuem inúmeros estudos científicos sobre seus constituintes e atividades biológicas exercidas em diferentes áreas (Cória-Tellez et al., 2018, Roduan et al., 2018, Sandeepa et al., 2019). Capítulo 1 28 Outras espécies do gênero ainda necessitam de investigações científica mais aprofundadas, tanto sobre seus constituintes como suas potencialidades de aplicação, entre estas espécies destacam-se Annona crassiflora (marolo) e Annona cacans (araticum-cagão) ocorrentes em áreas de Cerrado e Mata Atlântica do território brasileiro. Diferentes compostos ativos vegetais atuam como antioxidantes, influenciando e inibindo o aparecimento de doenças crônicas e degenerativas relacionadas ao estresse oxidativo ou diminuindo os sintomas no desequilíbrio biológico causado por agentes endógenos e/ou exógenos que proporcionam também no estresse oxidativo (Ferreira e Abreu, 2007). Entre os compostos ativos de origem vegetal com atividade antioxidante destacam-se os flavonoides, carotenoides, esteróis, ácido ascórbico, lipídios, aminoácidos (Roesler et al., 2006; Sila e Bougatef, 2016). Estes, são descritos e caracterizados em diferentes espécies da família Annonaceae, tornando as importante alvos na busca de compostos com atividade antioxidante. Para avaliar a atividade antioxidante de compostos naturais existem diferentes técnicas, que são importantes ferramentas para constatar o potencial de diferentes compostos e seus possíveis mecanismos de ação antioxidante, quais sejam sequestadores de radicais de oxigênio e nitrogênio, quelantes de metais, entre outros (Gomèz et al., 2019). A busca por antioxidantes naturais, especialmente de origem vegetal, vem aumentando nos últimos anos, principalmente por parte da indústria farmacêutica, cosmética e nutricional. Diante do exposto o presente estudo teve por objetivo realizar pela primeira vez a caracterização dos compostos naturais de extratos das folhas e da polpa dos frutos de Annona crassiflora e Annona cacans afim de verificar a possiblidade de ocorrências de potenciais bioativos de interesse, além de determinar, por diferentes métodos, a atividade antioxidante 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Coleta do material vegetal e preparação dos extratos Os frutos e folhas de Annona crassiflora e Annona cacans foram coletados no município de Assis, São Paulo, Brasil (latitude: 22º39 '42''S, longitude: 50º24'44''W, altitude: 546m), nos meses de março e abril de 2017, nas imediações do Instituto Florestal do Estado de São Paulo e em propriedade particular no município de Platina/SP. As polpas foram congeladas (-18ºC) e liofilizadas. As folhas foram secas a 40º em estufa de ar forçado até obter propriedade para pulverização. Capítulo 1 29 Foram depositadas as exsicatas no Herbário Assisense HASSI da Universidade Estadual Paulista – Faculdade de ciências e Letras- campus Assis. Annona crassiflora VOUCHER nº: 1170 e Annona cacans VOUCHER nº 1171. O extrato foi preparado com o pó obtido da secagem das folhas e da polpa, colocados em solução hidrometanólica (70:30) por 3 dias em temperatura ambiente e filtrado. O metanol foi removido e realizada a separação líquido/líquido com acetato de etila por 4x. A fração de acetato de etila foi a utilizada no trabalho. 2.2 Caracterização dos extratos de folha e polpa de A. crassiflora e A. cacans 2.2.1 Determinação de fenóis e flavonoides totais Para a quantificação de compostos fenólicos totais foi utilizado o método Folin- Ciocalteu, adaptado de Wu (2006). Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mg de ácido gálico por g de extrato. A dosagem dos flavonoides totais foi realizada em espectrofotômetro UV-Vis de acordo com a metodologia de Zhinshen et al., (1999), baseada na complexação dos flavonoides com AlCl3. A absorbância mensurada a 510 nm, todas em triplicata, e os resultados obtidos expressos em mg de rutina por g de extrato. 2.2.2 Determinação flavonoides totais (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) As análises foram realizadas no laboratório de Ciências Biológicas da UNESP/Bauru. As análises cromatográficas dos extratos foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência HPLC (Jasco, Tokyo, Japan), acoplado a detector de arranjo de foto diodos (PAD), injetor automático com volume 20 µL e forno de coluna 40º. As amostras foram monitoradas por detector PDA na região do espectro ultravioleta visível (UV-vis) na faixa de 200 a 400 nm, com coluna fase reserva Phenomenex® C18 de 250 x 4.6 mm i.d., tamanho médio de partícula: 5 μm, 10 mg do extrato de acetato de etila foi dissolvido de 1 mL de acetonitrila (ACN) e filtrada com seringa com poro de 0,45 um. Os cromatogramas foram obtidos a 254 e 360 nm. 2.2.3 Determinação do conteúdo de açúcares totais Para a determinação do conteúdo de açúcares solúveis totais etodologia descrita por Dubois et al. (1956), A leitura de absorbância da solução foi realizada em 490 nm. O cálculo foi feito de acordo com a equação: Açúcares solúveis (mg/g) = (Absorbância x K x, Fator de diluição) / Peso seco. Onde, absorbância: 490 nm, K: valor da curva padrão, Fator de diluição: 10 mL, Peso seco: 100 mg. Capítulo 1 30 2.2.4 Cromatografia à gas acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) As análises cromatográficas por GC/ MS foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu Modelo GCMS-QP2020, equipado com detector de massa com analisador do tipo quadrupolo, empregado com coluna Shimadzu-Rtx-5MS com comprimento de 30 m, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura da fase estacionária. Foi realizado o processo de sililação, onde foram dissolvidos 10 mg do extrato em 200 µL de piridina em vial de 4 mL, foi adicionado 200 µL de MSTFA (N-methyl-N(trimetylsilyl)trifluoroacetamide), homogeneizado e aquecido a 37º por 30 min, e deixado em repouso por 24 h a 5º C, e então filtrado com microfiltro de 0,22 µm e transferido para vial de 2 mL com insert de 350 µL. A análise foi realizada com temperatura do injetor de 290 °C; volume de amostra injetada de 1,0 µL com razão de split 1:50; energia de ionização por elétrons de 70 eV e faixa de aquisição dos espectros de massa, de m/z 45 a 500. O gradiente de temperatura iniciou a 100° C levando-se até 320° C, com uma taxa de aquecimento de 3° C min-1. Os compostos encontrados foram identificados por comparação dos espectros de massa já existentes em biblioteca de referência do equipamento (NIST Library MS). 2.2.4.1 Análises dos Componentes Principais (PCA) Foram realizadas análises exploratórias multivariadas e análise de componentes principais dos dados obtidos e organizadas em um gráfico onde variáveis semelhantes são agrupadas (Moita et al., 1998). A análise de componentes principais permite agrupar a maior quantidade dos dados originais em p variáveis. Cada composto identificado dos extratos, foi plotado com sua quantidade área em % e removidos os compostos que não foram identificados. As análises foram realizadas utilizando o programa Minitab 18. 2.3 Avaliação da atividade antioxidante dos extratos 2.3.1 DPPH Para a análise da atividade antioxidante do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) foi utilizada a metodologia descrita por Blois, 1958. Os extratos reagiram com o DPPH por 30 min e lidos em espectrofotômetro UV-Vis em comprimento de onda 517 nm. O cálculo da atividade antioxidante foi realizado com a fórmula: Atividade antioxidante (%) = [(ACONT– AAMOSTRA) /ACONT]x100, onde AAMOSTRA é a absorbância das amostras após 30 minutos e ACONT é a absorbância do DPPH, ambos a 517 nm. Capítulo 1 31 2.3.2 Poder de redução do Ferro (FRAP) Para a determinação da atividade antioxidante por meio da redução do ferro (FRAP- Ferric Reducing Antioxidant Power) (Rufino et al., 2006), o reagente FRAP foi preparado no momento da análise. As absorbâncias foram medidas a 595 nm. Os resultados foram expressos em μM equivalente de Trolox (ET) por g de extrato seco. As análises foram realizadas em diferentes concentrações, sendo considerada para discussão a menor concentração que apresentou resultado no teste. 2.3.3 TBARS A determinação do conteúdo de substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi realizada quantificando o nível de inibição da peroxidação lipídica de acordo com metodologia descrita por Costa et al. (2012). A gema de ovo foi usada como substrato lipídico. As absorbâncias dos sobrenadantes foram medidas a 532 nm e os resultados expressos em % de TBARS: (ACONT-AAMOSTx100/ACONT). Onde ACONT é a absorbância do AAPH sozinho e AAMOST, a absorbância das amostras. 2.3.4 Sequestro do NO A atividade de sequestro do radical NO foi determinada utilizando nitroprussiato de sódio (SNP) gerado no sistema de NO. O NO gerado pelo SNP em solução aquosa e em pH fisiológico reage com o oxigênio para produzir íons nitrito que foram mensurados pelo reagente Greiss (Marcocci et al., 1994). A absorbância dessas soluções foi medida à 540 nm e comparadas com a solução branco correspondente. 2.3.5 Método Hemolítico 2.3.5.1 Obtenção de Eritrócitos A obtenção dos eritrócitos foi realizada conforme protocolo submetido à Comissão de Ética em Pesquisa da FCL/Assis e teve início após sua aprovação (Comitê de Ética em Pesquisa FCL/Assis, nº833.386). O sangue foi coletado em heparina, de voluntários sadios por punção venosa e centrifugado (2500rpm/5min, temperatura ambiente) para obter a fração de eritrócitos, lavados 3x em Tampão PBS 10mM, pH=7,4 contendo NaCl 150mM por centrifugação (2500rpm/5min). Foi realizada diluição a 5%. Capítulo 1 32 2.3.5.2 Ensaio de Hemólise induzida por AAPH A ação dos diferentes extratos sobre os eritrócitos foi avaliada tanto na ausência de radicais livres como na presença do radical 2,22-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) de acordo com a metodologia descrita por Magalhães et al., 2009. Para avaliação dos extratos sobre a lise de eritrócitos, 200 μl da suspensão contendo 5% de eritrócito foi incubado com 40μl dos extratos em diferentes concentrações e 160 μl tampão fosfato de sódio (10 mM/NaCl 150 mM, pH=7,4), por 150 minutos a 37º C, com agitação lenta e constante. O mesmo procedimento foi realizado com a inclusão do radical AAPH a 25 μM. Após incubação, foi realizada a centrifugação (2500 rpm/10 min) obtendo-se o sobrenadante. Os graus de hemólise foram avaliados de acordo com a concentração de hemoglobina no sobrenadante, por absorbância em 540 nm. O grau de hemólise foi determinado pela equação: % hemólise = 100xAbs(teste)–Abs(cont neg)/Abs(cont pos)-Abs(cont neg). Onde, cont pos: 100% de hemólise (200 μl da solução de eritrócitos + 200 μl de água MiliQ); o cont neg (200 μl da solução de eritrócitos + 160 μl do tampão PBS + 40 μl de água Mili Q com 1% de DMSO). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Caracterização dos extratos 3.1.1 Determinação de fenóis e flavonoides totais Foram avaliadas as quantidades de fenóis e flavonoides totais nos extratos da folha e polpa de A. crassiflora e A. cacans (Tabela 1.1). Entre os metabólitos secundários já encontrados no gênero Annona que possuem atividade antioxidante, destacam-se os flavonoides como quercetina, acetogeninas, isoramnetina, kaempferol e seus derivados- ou O- glicosídeos (Lage et al., 2014). TABELA 1.1 Teor de Fenois e Flavonoides totais dos extratos da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans. FeT (mg EAG/g) FlT (mg RE/g) A.crassiflora Folha 833.20±32.3 602.87±35.6 Polpa 90.34±12.4 72.91±9.6 A. cacans Folha 345.15±21.2 201.23±22.9 Polpa 180.23±13.1 94.32±7.3 FeT (mg EAG/g): Resultados de Fenois Totais expressos em mg equivalente ao ácido gálico por g de extrato seco; FlT (mg RE/g): Resultados de Flavonoides Totais expressos em mg equivalente a rutina por g de extrato seco Capítulo 1 33 Todos os extratos avaliados apresentaram conteúdo de Fenóis e Flavonoides para os testes utilizados (Tabela 1.1) sendo os maiores valores, para ambos, encontrado na folha de A. crassiflora, com Fenóis em 833,2 mgEAG/g de extrato seco de, e Flavonoides com 602,8 mgRE/g de extrato seco. Os resultados da polpa de A. crassiflora corroboram com o avaliado por Roesler et al. (2006) que identificaram compostos fenólicos nos extratos etanólico e aquoso na polpa, semente, e casca de A. crassiflora. Flavonoides foram verificados na polpa e casca do araticum (Arruda et al., 2018). 3.1.2 Determinação de flavonoides totais (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) Os perfis cromatográficos por HPLC dos extratos de acetato de etila das folhas e polpa de A. crassiflora e A. cacans (Figuras 1.1 1.3 1.5 e 1.7) foram realizados com auxílio do detector PAD com varredura na faixa espectral de 200-600 nm, obteve-se espectros na região UV. Foram observados picos com bandas de absorção típicos de flavonoides, que apresentam duas bandas, uma com máximo de comprimento de onda de 240-290 nm, e a outra com máximo de comprimento de 300-390nm, atribuída ao anel-B, apresentando maior incidência do grupo das flavonas e flavonóis. 3.1.2.1 Perfis cromatográficos de folha e polpa de Annona crassiflora FIGURA 1.1 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da folha de A. crassiflora obtida por HPLC-PAD. (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250 x 4,6mm i.d. 5 μm), fluxo1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40º C. A B C https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/flavonoid Capítulo 1 34 Nas folhas de A. crassiflora (Figura 1.2) foram identificados picos de possíveis catequinas, com absorção em 278 nm (1,2,3 e 4), e picos com absorção na região de flavonas e flavonois, que tem por característica apresentar a banda II com absorção em 240-280 nm e banda I de 300-380 nm (Mabry et al.,1970). Nos picos monitorados, os espectros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 e 9 apresentaram perfis de espectros semelhantes ao de flavanonas, que apresentam a banda II com pico de absorção entre 270-295 nm. FIGURA 1.2 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na folha de A. crassiflora. Os espectros com picos de absorção para possíveis flavonoides corroboram com as avaliações feitas in vitro para análise quantitativa de fenóis e flavonoides dos extratos de folha e polpa de A. crassiflora, que apresentaram resultados promissores na análise quantitativa. Foi relatado por Lage et al. (2014) o isolamento de flavonóides como quercetina, kaempferol e epicatequina nas folhas de A. crassiflora. Os flavonoides podem ter diferentes aplicações farmacologicamente ativas, já foi verificada, atividade antimalárica de frações enriquecidas de flavonoides nas folhas desta espécie (Pimenta et al., 2014). A análise LC-ESI- MS / MS da casca de A. crassiflora mostrou a presença de vários componentes bioativos, como ácido cítrico clorogênico, catequina, procianidinas, e kaempferol, que podem ser associados a todas essas atividades biológicas verificadas in vitro (Justino et al., 2016). Capítulo 1 35 FIGURA 1.3 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da polpa de A. crassiflora obtida por HPLC-PAD. (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40º C. FIGURA 1.4 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na polpa de A. crassiflora. A B C Capítulo 1 36 Foi identificado uma área de incidência de taninos na polpa de A. crassiflora (Figura 1.3), possivelmente devido ao grau de maturação do fruto analisado. Na polpa de A. crassiflora foram identificados 9 picos relacionados a flavonoides na Figura 1.4, o pico 2, com pico de absorção em 260 nm pode ser considerado um pico característico das isoflavonas. Arruda et al. (2018) caracterizou e quantificou cerca de dez compostos fenólicos em diferentes partes do fruto do araticum, catequina e epicatequina foram os principais da polpa e casca do araticum. Na polpa e casca apresentam-se mais flavonoides, já na semente, são ácidos fenólicos, mas em geral os fenólicos se apresentam nas formas ligada e insolúvel em todas as partes (Arruda et al., 2018). 3.1.2.2 Perfis cromatográficos de folha e polpa de Annona cacans Existem poucos relatos de estudos na literatura sobre os compostos presentes em A. cacans, sendo portanto, as primeiras avaliações da espécie quanto a sua composição, levando em consideração os importantes compostos de interesse biológico encontrados em outras espécies do gênero Annona. FIGURA 1.5 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da folha de A. cacans obtida por HPLC-PAD. (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40º C. A B C https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/catechin https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/epicatechin Capítulo 1 37 FIGURA 1.6 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na folha de A. cacans. A folha de A. cacans também apresentou picos com duas bandas de absorção, sendo uma com incidencia na região de 240-280, e outra em 300-380, como os picos 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 14, sempre com a segunda banda mais pronunciada, o que é característicos de flavonas e flavonois. A quercetina tem por característica apresentar absorção banda I na região de 352- 385 nm, padrão esse que pode ser observado nos picos encontrados na figura 1.6. Os resultados apresentados no presente trabalho consitutem uma das primeiras avaliações para a espécie Annona cacans quanto a sua composição fitoquímica para avaliação de substâncias com interesse biológico. Capítulo 1 38 FIGURA 1.7 Perfil cromatográfico do extrato de acetato de etila da polpa de A. cacans obtida por HPLC-PAD. (A) Perfil cromatográfico obtido com λ=360 nm (B) Perfil cromatógrafico com λ=245 nm (C) Perfil cromatográfico com λ= 210 nm. Sistema de eluição: ACN (A) e H2O (B) acidificados (0,1 % Ác. Fórmico). Gradiente exploratório: 5-100 % de A em B em 60 min. Coluna Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm i.d. 5 μm), fluxo1,0 mL Volume de injeção: 20 µL. Forno coluna: 40º C. FIGURA 1.8 Espectros de banda de absorção máxima UV identificados para flavonoides na polpa de A. cacans. A B C Capítulo 1 39 Na polpa de A. cacans foram identificados 9 possíveis flavonoides (Figura 1.8). Nas folhas, foram observados picos com absorbância em 260 nm, que indicam possíveis isoflavonas (Figura 1.6). 3.1.3 Determinação do conteúdo de açúcares totais Na tabela 1.2 estão apresentados os resultados quanto a açucares solúveis totais encontrados nas folhas de A. crassiflora e A. cacans, evidenciando grande quantidade e corroborando com a grande quantidade de açúcares encontrados nas análises cromatográficas. TABELA 1.2 Resultados de açúcares solúveis totais das folhas de A. crassiflora e A. cacans mg/g A. cacans 128.42 A. crassiflora 50.12 3.1.4 Cromatografia à gas acoplada à espectrometria de massas CG-MS Os compostos das folhas e polpa de A. crassiflora e A. cacans foram identificados em comparação de dados com a biblioteca NIST e estão listados nas tabelas em anexo. Em A. crassiflora foram identificados na biblioteca 97 compostos encontrados pela análise de Cromatografia Gasosa (Anexo 1 e 2). Já em A. cacans, foram mais de 250 compostos. Os compostos se apresentam numerados de acordo com a tabela no Anexo 1 e 2. A figura 1.9 representa a análise do componente principal (PCA) identificados nas folhas e polpa de A. crassiflora e A. cacans de acordo com a classe dos compostos identificados. Um grande número de pontos se encontra na região negativa, indicando baixa incidência da classe de compostos. Foi verificado um grande agrupamento de pontos nas figuras 1.9 (A) e (B), indicando similaridade entre a composição da polpa e folha das duas espécies. Os compostos que aparecem na região negativa possuem baixa concentração comparados uns aos outros. Quanto mais longe da linha de zero o composto aparece, maior a sua incidência da amostra avaliada. De acordo com análise da biblioteca utilizada para comparação dos dados obtidos, os compostos identificados em A. crassiflora como similares foram sendo o composto -[(2-{3,4- Bis[(trimethylsilyl)oxy]phenyl}-3,5-bis[(trimethylsilyl)oxy]-3,4-dihydro-2H-chromen-7- yl)oxy](trimethyl)silane, (9) um isômero de Catequina, teve 31,46 % de porcentagem de área na folha, e 0,47 % na polpa, foi relacionado outra Catequina (42) como sendo 13,46 % da área total de compostos na folha; um composto possível de ser Quercetina (92) obteve 12,4 % do total nas folhas (Anexo I) Capítulo 1 40 A análise indicou a possível identificação de vários compostos flavonoidicos, que vem de encontro com os outros métodos de avaliação realizados em A. crassiflora. Além destes foram identificados também grande quantidade de açucares, como Glucopiranose, Frutose e Ribose, o que corrobora com a análise de açucares totais realizada. FIGURA 1.9 Componentes principais (PCA) da folha e polpa de Annona crassiflora (A) e Annona cacans (B) de acordo com a classe dos compostos. Em A. Cacans os compostos que tiveram maior incidência foram os açucares (Anexo II) Talose com 10,69 % na folha e 0,52 na polpa, Sucrose 12,2 % folha e 0,78 polpa, e Talose, 10,69 na folha e 0,52 %. Outra grande incidência nos extratos foram os ácidos, como por exemplo o ácido octadenoico, que representou 7,12 % da área total de compostos identificados na polpa, e o ácido caféico com 2,55 na polpa e 1,11 na folha. 3.2 Avaliação da Atividade Antioxidante Os resultados das análises antioxidantes dos extratos de polpa e folha de Annona crassiflora e Annona cacans estão apresentados na Tabela 1.3. TABELA 1.3 Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH (%) e EC50, FRAP, TBARS e NO dos extratos da polpa e folha de A. crassiflora e A. cacans. DPPH (%) EC50 FRAP TBARS NO Annona crassiflora POLPA 43.63±3.95a 590.47 188.08±9.34 42.92±2.09a 5.42 FOLHA 81.93±0.89b 111.76 68.88±3.22 64.57±2.09b 6.58 Annona cacans POLPA 33.42±5.21c 761.20 158.40±7.71 73.29±2.69c 6.78 FOLHA 28.08±2.98c 830.54 672.13±1.17 50.53±1.79d 6.34 Ácido Gálico 72.76±1.11d 43.81 - Trolox - 73.85±3.64c DPPH: extratos: 500 µg/mL, ácido gálico 60 µg/mL; TBARS: extratos e trolox 100 µg/mL NO: 500 µg/mL expresso µmol/mL de Nitrito A B Capítulo 1 41 3.2.1 DPPH As substâncias antioxidantes presentes nos extratos reagem com o DPPH e converte-o em 2,2-difenil-1-picril hidrazina, o grau de descoloração indica o potencial antioxidante do extrato (Roesler et al., 2007). Um extrato que apresenta alto potencial em seqüestrar radicais livres possui baixo valor de EC50, ou seja, de inibir a oxidação do radical em 50%. Para a avaliação da porcentagem de atividade sequestradora do radical DPPH foram analisados os resultados dos extratos em diferentes concentrações. Em A. crassiflora (Tabela 1) os extratos da polpa demonstraram atividade antioxidante significativa a partir da concentração de 500 µg/g de extrato seco, e EC50, que é a quantidade mínima para inibição de 50% da atividade no valor de 590.47, a folha, com EC50 de 111.76, foi o extrato que apresentou melhor resultado entre as espécies testadas. O extrato da folha de A. crassiflora já foi avaliado pelo método de DPPH por Silva et al. (2016) apresentando ótimos resultados. A. cacans apresentou como resultados para a polpa, EC50 de 761.20 e para a folha 830.54. 3.2.2 Poder de redução do Ferro (FRAP) Para A. crassiflora, a polpa apresentou 186,08 μMET/g de extrato, na concentração de 1000 μg/mL, já a folha, já na concentração de 50μg/mL apresentou 68,88. No estudo feito por Justino et al. (2016), que realizaram análises na casca de A. crassiflora, a fração de acetato de etila apresentou maior potencial diante do teste FRAP, perdendo apenas para a fração de butanol. A. cacans apresentou atividade tanto para polpa quanto para folha, na concentração de 500 μg/mL, sendo 158,40 e 672,13 μMET/g de extrato, respectivamente. 3.2.3 Inibição da peroxidação lipídica (TBARS) O teste de TBARS avalia a inibição de peroxidação lipídica em sistemas biológicos. Os extratos da folha e polpa, bem como do padrão antioxidante Trolox, foram avaliados na concentração de 250 µg/mL Foi possível observar que a maior atividade inibidora da peroxidação lipídica foi promovida pelo extrato da polpa de A. cacans (79.9 %) Já para A. crassiflora os resultados para polpa e folha foram 57.2 % e 69.6.57 %, respectivamente. Sendo estes resultados próximos do controle positivo Trolox (79.1 %). No processo oxidativo, ocorre a doação de um átomo de hidrogênio a partir de uma cadeia de ácidos graxos insaturados de fosfolipídios da membrana, dando origem ao processo de peroxidação lipídica onde são gerados peróxidos lipídicos e peróxidos cíclicos, que em última análise são fragmentos de aldeídos combinados como malonaldeído (Sreelatha e Padma, 2009). Capítulo 1 42 Os extratos das Annonaceaes testadas inibiram a quantidade de TBARS gerado pelo meio reacional AAPH, indicando um efeito protetor contra a peroxidação lipídica. Estudos realizados por Roesler (2011) demonstraram atividade antioxidante pela inibição da peroxidação lipídica in vivo (TBARS) para extratos obtidos de sementes e cascas de A. crassiflora. 3.2.4 Sequestro do NO O radical nitrito em excesso pode estar envolvido no desenvolvimento de inúmeras patologias, portanto, se dá necessária a busca por substâncias capazes de sequestrar, ou seja, reduzir esse radical (Santana et al., 2013). Na Tabela 1.3 estão apresentados os resultados da atividade antioxidante pelo método sequestro do NO para os extratos na concentração de 500 µg/mL. O maior resultado foi encontrado para o extrato da polpa de A.cacans, com 6.78 µmol/mL de Nitrito. E o menor valor encontrado na polpa de A. crassiflora (5.42 µmol/mL de Nitrito). 2.1.5 Método Hemolitico Para análise da atividade antioxidante pelo método hemolítico foi realizada a avaliação dos extratos em diferentes concentrações (Figuras 1.10 e 1.11). De acordo com os resultados, é possível observar que os extratos apresentaram potencial para sequestrar o radical livre e impossibilitar a ação hemolítica do AAPH para todas as concentrações avaliadas e seguiram uma tendência de concentração/dependente, menos em A. cacans. O controle positivo mostra a ocorrência de hemólise total nas amostras. O melhor resultado para as folhas de A. crassiflora (Figura 1.10) foi observado na 5ª hora do tratamento com a concentração de 50 µg/mL. Foi observado que na 6ª hora o extrato da polpa de A. crassiflora inibiu a hemólise em todas as concentrações, a concentração de 50 µg/mL apresentou uma atividade dose-resposta, onde a atividade antioxidante aumenta gradativamente conforme as horas, e com o melhor resultado, sendo que na 6ª hora, as amostras que foram tratadas com essa concentração de extrato, sofreram somente 4,4% de hemólise. Capítulo 1 43 FIGURA 1.10 Atividade antioxidante pelo método de hemólise do extrato da folha (A) e polpa (B) de A. crassiflora durante 6 horas de incubação e mensurada a 540nm em espectrofotômetro Em A. cacans os melhores resultados na polpa foram na concentração de 50µg/mL, também foi observada uma tendência dose-resposta na atividade desse extrato, atingindo um pico na 6ª hora, deixando ocorrer apenas 8,1 % de hemólise (Figura 1.11). Sabe-se que o reagente AAPH se decompõe a 37º C em solução aquosa e gera radicais alquila que na presença do oxigênio são convertidos no radical peroxila correspondente, e esses radicais peroxila induzem a peroxidação lipídica dos ácidos graxos poliinsaturados das membranas dos eritrócitos levando a peroxidação lipídica (Banerjee et al., 2008). A B Capítulo 1 44 FIGURA 1.11 Atividade antioxidante pelo método de hemólise do extrato da folha (A) e polpa (B) de A. cacans durante 6 horas de incubação e mensurada a 540nm em espectrofotômetro As folhas de A. cacans também apresentaram atividade contra a hemólise, sendo a mais significativa, a de 50 µg/mL, que na 6ª hora inibiu completamente a formação de hemólise na amostra Figura 1.11 (A). Foi observado que em ambos os extratos, polpa e folha, de A. crassiflora e A. cacans, ocorreu impedimento da hemólise nas amostras avaliadas, sendo sempre a melhor atividade verificada na concentração mais baixa analisada (50 µg/mL), sendo um resultado promissor para emprego do extrato na busca por compostos antioxidantes. O extrato etanólico das folhas já foi avaliado como antimicrobianos, antioxidantes e larvicida e também expressou atividades antioxidante (Couto e Canniatti-Brazaca, 2010). Frações fenólicas de A. crassiflora apresentaram atividade sequestradora contra DPPH, ABTS e radicais peroxil (Arruda et al., 2018). A B https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/abts Capítulo 1 45 4 CONCLUSÃO Foram caracterizadas as polpas e folha de A. crassiflora e A. cacans, e identificados diversos compostos que possuem potencial para aplicação em diferentes áreas de estudo, entre eles Catequina, Quercetina, ácidos fenólicos. Foi observada uma grande quantidade de açucares na composição de ambas as espécies, bem como verificada grande quantidade quando analisado o teor de açucares totais, o que leva a serem interessantes do ponto de vista alimentar. A. crassiflora e A. cacans apresentaram alto teor de fenóis e flavonoides totais, e quantidade representativa de atividade antioxidante por diferentes mecanismos de ação, verificada pelos diferentes métodos aplicados no trabalho. REFERÊNCIAS Arruda, H.S.,Pereira, G.A., Morais, D.R., Eberlin, M.N., Pastore, G.M. Determinação da composição fenólica livre, esterificada, glicosilada e insolúvel na parte comestível de frutos de araticum ( Annona crassiflora Mart.) e seus subprodutos por HPLC-ESI-MS / MS. Química alimentar, 245, 738-749, 2018. Blois, M.S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181, 1199- 1200, 1958. Cória-Téllez, V., Montalvo, Gonzalez, E., Yahia, E.M., Obledo-Vázquez, E.N. 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[(2-{3,4-Bis[(trimethylsilyl)oxy]phenyl}-3,5-bis[(trimethylsilyl)oxy]-3,4-dihydro-2H- chromen-7-yl)oxy](trimethyl)silane 31.46 0.47 10 1,2,3-Butanetriol, 3TMS derivative 0 1.34 11 1,2,4-Butanetriol, 3TMS derivative 0 0.6 12 1,3-Dioxane, 2,2-dimethyl-5-trimethylsilyloxy- 0 1.95 13 1,3-Propanediol, 2TMS derivative 0.33 0 14 1,4-Dioxane-2,5-diol, 2TMS derivative 0 4.94 15 1-[(Trimethylsilyl)oxy]propan-2-ol 0 0.14 16 1-Deoxy-d-arabitol 0 0.32 17 2-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)ethanol bis(trimethylsilyl) ether 0.29 0 18 2,3-Butanediol, 2TMS derivative 0 0.21 19 2-Hexenoic acid, (E)-, TMS derivative 0.07 0 20 2-Hydroxyisocaproic acid, 2TMS derivative 0.13 0 21 2-Oxovaleric acid, TBDMS derivative 0 0.85 22 3,5-Dimethoxymandelic amide, di-TMS 0.35 0 23 3,7,11,14,18-Pentaoxa-2,19-disilaeicosane, 2,2,19,19-tetramethyl- 0 0.73 24 3-.alpha.-Mannobiose, octakis(trimethylsilyl) ether (isomer 1) 0.31 0 25 3-Methyl-2-furoic acid, TMS derivative 0 0.62 26 4-(Methoxycarbonyl)phenol, TMS derivative 0 0.16 27 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- 0 0.11 28 5-Hydroxymethylfurfural 0 1.02 29 6-Dimethyl(trimethylsilyl)silyloxytetradecane 0 0.06 30 6-Octadecenoic acid, methyl ester, (Z)- 0 0.24 31 8,11-Octadecadienoic acid, methyl ester 0 0.08 32 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, TMS derivative 0.57 0 33 9-Octadecenamide, (Z)- 0 1.89 34 9-Octadecenoic acid, (E)-, TMS derivative 0 0.45 35 9-Octadecenoic acid, 1,2,3-propanetriyl ester, (E,E,E)- 0 0.3 36 acetic acid, 2-[[2-[(trimethylsilyl)oxy]ethyl]thio]-, trimethylsilyl ester 0 0.55 37 Acetin, bis-1,3-trimethylsilyl ether 0 1.03 38 Acetoin, TMS derivative 0 0.16 39 Allylamine, 2TMS derivative 0.18 0 40 Benzyl alcohol, TMS derivative 0.06 0 Capítulo 1 49 41 Butoxytriglycol, TMS derivative 0 1.98 42 Catechine, (2R-cis)-, 5TMS derivative 13.56 0 43 Chlorogenic acid (6TMS) 1.94 0 44 D-(-)-Fructofuranose, pentakis(trimethylsilyl) ether (isomer 1) 0 0.31 45 D-(-)-Fructofuranose, pentakis(trimethylsilyl) ether (isomer 2) 0 0.18 46 D-(-)-Fructose, pentakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (anti) 2.81 4.94 47 D-(-)-Tagatose, pentakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (anti) 0 1.18 48 D-(-)-Tagatose, pentakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (syn) 0 0.14 49 D-(+)-Galactopyranose, 5TMS derivative (isomer 1) 0.33 0 50 D-(+)-Glucuronic acid .gamma.-lactone, tris(trimethylsilyl) ether, methyloxime (anti) 0 3.11 51 D-(+)-Glucuronic acid .gamma.-lactone, tris(trimethylsilyl) ether, methyloxime (syn) 0 1.21 52 D-(+)-Talose, pentakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (syn) 2.05 0 53 D-(+)-Turanose, octakis(trimethylsilyl) ether 0.16 0 54 D-Fructose, 1,3,4,5,6-pentakis-O-(trimethylsilyl)-, O-methyloxime 1.2 0 55 d-Galactose, 2,3,4,5,6-pentakis-O-(trimethylsilyl)-, o-methyloxyme, (1E)- 0 1.57 56 d-Glucose, 2,3,4,5,6-pentakis-O-(trimethylsilyl)-, o-methyloxyme, (1Z)- 0.36 0 57 Disiloxane, hexamethyl- 0.29 0 58 Divinyl sulfide 0 0.88 59 D-Mannose, 5TMS derivative 0.19 0 60 D-Psicofuranose, pentakis(trimethylsilyl) ether (isomer 1) 0 0.2 61 d-Ribose, 2,3,4,5-tetrakis-O-(trimethylsilyl)-, O-methyloxime 0 4.19 62 Ethanolamine, 3TMS derivative 0.16 0 63 Gluconic acid, 2-methoxime, tetra(trimethylsilyl)-, trimethylsilyl ester 0 1.04 64 Glucose, 5TMS derivative 1.04 0 65 Glycerol, 1-tert-butyl 3-trimethylsilyl ether 0 0.9 66 Glycerol, 3TMS derivative 1.3 0 67 Glycolic acid, 2TMS derivative 0 0.12 68 Gulonic acid, .gamma.-lactone, 4TMS derivavative 0.22 0 69 Hexadecanoic acid, methyl ester 0.2 0 70 Hydracrylic acid, 2TMS derivative 0 0.07 71 L-(-)-Sorbofuranose, pentakis(trimethylsilyl) ether 0 0.82 72 L-(-)-Sorbose, pentakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (anti) 0 1.41 73 L-(+)-Threose, tris(trimethylsilyl) ether, ethyloxime (isomer 1) 0 0.55 74 L-5-Oxoproline, , 2TMS derivative 0.24 0 75 Lactic Acid, 2TMS derivative 0.24 0.22 76 Lanreline 1.06 0 77 L-Aspartic acid, 2TMS derivative 0 1.14 78 L-Serine, 2TMS derivative 0 0.33 79 L-Threonic acid, tris(trimethylsilyl) ether, trimethylsilyl ester 0.22 0 80 Melibiose, octakis(trimethylsilyl)- 0.45 0 81 Methyl .alpha.-D-glucofuranoside, 4TMS derivative 0 1.06 82 Methyl .alpha.-Lyxofuranoside, 3TMS derivative 0 1.38 83 Methyl 3,4-dihydroxybenzoate, 2TMS derivative 0.11 0 84 Methylparaben 0 0.28 85 Myo-Inositol, 6TMS derivative 3.92 0.17 86 Oleamide, TMS derivative 1.51 0 Capítulo 1 50 87 Oxalic acid, 2TMS derivative 0.36 0 88 Palmitic Acid, TMS derivative 0.43 0 89 Pentasiloxane, dodecamethyl- 0.29 0.1 90 Phytol, TMS derivative 0.45 0 91 Protocatechoic acid, 3TMS derivative 0.63 0 92 Quercetin (5TMS) 12.4 0 93 Shikimic acid (4TMS) 0.18 0 94 Silane, trimethyl-3-penten-2-yl-, trans 0.5 0 95 Silanol, trimethyl-, phosphate (3:1) 0 2.08 96 Thymidine, 2TMS derivative 0 0.32 97 Uridine, 3TMS derivative 0 0.19 Capítulo 1 51 Anexo 2 Compostos identificados por Cromatografia Gasosa (GC/MS) dos extratos de folha e polpa de Annona cacans em % de área COMPOSTO F P 1 1-Dimethyl(dichloromethyl)silyloxypropane 0.02 0 2 (3-Hydroxyphenyl)butyric acid, 2TMS derivative 0.72 0 3 (E)-9-Octadecenoic acid ethyl ester 0 0.21 4 (R)-3-Hydroxybutyric acid, 2TMS derivative 0 0.07 5 .alpha.-D-Lactose, 8TMS derivative 0 0.11 6 .alpha.-L-Galactofuranose, 6-deoxy-1,2,3,5-tetrakis-O-(trimethylsilyl)- 1.3 0 7 .alpha.-L-Galactopyranoside, methyl 6-deoxy-, (R,R,R,S,S)-, 3TMS derivative 0.51 0 8 .alpha.-Linolenic acid, TMS derivative 2.27 0 9 .beta.-D-Galactofuranose, 1,2,3,5,6-pentakis-O-(trimethylsilyl)- 0 0.05 10 .beta.-D-Glucopyranose, 6-O-methyl-1,2,3,4-tetrakis-O-(trimethylsilyl)- 0 0.09 11 .beta.-Gentiobiose, octakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime (isomer 2) 0.12 0 12 .beta.-Lactose, 8TMS derivative 0.19 0 13 .beta.-Lyxopyranose, 4TMS derivative 0 0.02 14 .beta.-Ocimene 0 0.02 15 [(2-{3,4-Bis[(trimethylsilyl)oxy]phenyl}-3,5-bis[(trimethylsilyl)oxy]-3,4-dihydro-2H- chromen-7-yl)oxy](trimethyl)silane 0.49 0 16 1-(2-Methoxy-1-methylethoxy)-2-propanol, TMS derivative 1.67 0.63 17 1,1,3,3,5,5-Hexamethyl-2-thia-1,3,5-trisilacyclohexane 0.19 0 18 1,12-Dodecanediol, 2TMS derivative 0.18 0 19 1,2,3-Butanetriol, 3TMS derivative 4.9 0.02 20 1,2,4-Butanetriol, 3TMS derivative 0.09 0 21 1,2