RESSALVA 

Atendendo solicitação do(a) 
autor(a), o texto completo deste 

trabalho será disponibilizado 
somente a partir de 21/02/2019. 



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

 

  

 

 

Avaliação meta-classificatória de ferramentas de predição de alvos de 

microRNAs e análise de enriquecimento funcional de alvos utilizando 

Homo sapiens como modelo biológico 

 

 

 

 

 

Arthur Casulli de Oliveira 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Botucatu, SP 

2017  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA  

“Julio de Mesquita Filho”  

 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU 

 

 

Avaliação meta-classificatória de ferramentas de predição de alvos de 

microRNAs e análise de enriquecimento funcional de alvos utilizando 

Homo sapiens como modelo biológico 

 

Candidato: Arthur Casulli de Oliveira 

Orientador: Danillo Pinhal 

 

 

Dissertação apresentada ao Instituto de 

Biociências, Câmpus de Botucatu, 

UNESP, para obtenção do título de 

Mestre pelo Programa de Pós-Graduação 

em Ciências Biológicas (Genética). 

 

 

 

Botucatu, SP 

2017 

  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico este trabalho aos meus pais e 

avós, que me forneceram todo carinho e 

apoio necessário no decorrer do meu 

mestrado e à minha namorada, que 

sempre esteve ao meu lado me apoiando 

durante todos estes anos.  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

Agradeceço:  

 Ao meu orientador, Prof. Dr. Danillo Pinhal, pelo suporte, orientação científica e 

amizade durante todos estes anos em que fui seu aluno e por sempre me incentivar a encarar 

novos desafios nesta jornada acadêmica. 

 À minha mãe, Fernanda Bressanelli Casulli, por todo amor e carinho e por sempre 

estar ao meu lado me apoiando e educando, nos momentos felizes e tristes da minha vida. 

Sem ela, não estaria perto de onde estou agora. 

 Aos meus avós, Ida Maria e Pilade, por todo amor, carinho e suporte que sempre me 

deram durante todos os anos da minha vida e, principalmente, durante anos de graduação e 

pós-graduação. 

 Ao meu irmão, Victor Casulli de Oliveira, por todos estes anos de amizade, 

brincadeiras e brigas e por sempre estar ao meu lado, nas risadas e nas tristezas.  

 Ao amor da minha vida, minha namorada Karina Gabriele Alves Dias (Nuros), por 

compartilhar comigo todos os momentos, bons e ruins, dos últimos quatro anos, pelos 

momentos divertidos que passamos juntos: jantares, parques, sessões de Netflix, cinema, etc e 

por tudo que o futuro ainda nos reserva. Te amo. 

 A todos os colegas do Laboratório Genômica e Evolução Molecular pelas conversas e 

discussões sobre os mais derivados temas relacionados a pesquisa e ciência. 

 Aos amigos de trabalho Pedro (Batata), Marcos, e Luiz (Chokito) por todas as 

brincadeiras, risadas e colaborações realizadas durante todo o período do meu mestrado e por 

sempre me auxiliarem durante o desenvolvimento deste projeto. 

 Ao Prof. Dr. Ney Lemke, por todo suporte fornecido na área da computação e 

bioinformática, essenciais durante a realização deste projeto. 

 Ao Dr. Simon Moxon, pelo estágio realizado em Norwich, Inglaterra e por todo 

suporte e conhecimento transferido durante minha estádia no TGAC. 

 Aos meus grandes amigos e parceiros de vida, Julinho, Dox e Marsal, por todos os 

anos de grande amizade, jogatina e conversas e por estarem sempre comigo nos principais 

momentos da minha vida 

 Aos funcionários da seção de Pós-graduação por todas as dúvidas esclarecidas.  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

Ao Laboratório de Genômica e Evolução Animal, ao Departamento de Genética, à 

Pós-graduação em Genética, ao Instituto de Biociências de Botucatu e à Universidade 

Estadual Paulista pela estrutura cedida para a realização deste trabalho.  

À CAPES pela bolsa de mestrado concedida no período de estudo.  

A todas as pessoas que de alguma forma, direta ou indiretamente, auxiliaram na 

realização e finalização deste trabalho. 

   



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Se, a princípio, a ideia não é absurda, 

então não há esperança para ela. 

- Albert Einstein  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

Resumo 

 MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores que regulam uma ampla 

gama de vias biológicas. Esta regulação ocorre através do pareamento complementar entre o 

miRNA e seu RNA mensageiro (mRNA) alvo, gelramente na região 3’UTR, inibindo a síntese 

proteica. Diversos trabalhos têm buscado determinar as funções biológicas desempenhadas pelos 

miRNAs por meio da identificação de seus alvos e posterior análise de enriquecimento funcional. 

Entretanto, as ferramentas de predição de alvos in silico disponíveis atualmente apresentam 

resultados pouco robustos e não há um consenso sobre a melhor ferramenta e estratégia para 

análise dos dados. Adicionalmente, a metodologia de enriquecimento funcional atual não leva em 

conta diversos fatores fundamentais atuantes na regulação dos alvos dos miRNAs, retornando 

resultados inconsistentes que culminam em experimentos de validação desnecessários e pouco 

específicos, com consequente desperdício de tempo e recursos. Desta maneira, o presente trabalho 

tem como objetivos (i) elaborar metodologia de predição de alvos com alta eficiência utilizando 

as ferramentas de bioiformática disponíveis e (ii) avaliar a regulação dos processos biológicos 

controlados pelos miRNAs através da análise de enriquecimento funcional, considerando o fold-

change de seus mRNA alvo. Para tal, comparou-se as performances das três ferramentas de 

predição de alvos atualmente mais utilizadas (TargetScan, miRanda-mirSVR, e Pita), assim como 

testou-se todas as possibilidades de combinação dos dados gerados por cada ferramenta (uniões 

e/ou intersecções). A metodologia de união das ferramentas TargetScan + miRanda-mirSVR 

resultou na melhor performance, com o melhor balanço entre sensibilidade e especificidade. 

Posteriormente, dados de expressão de genes alvos obtidos por microarray após a superexpressão 

de onze miRNAs foram utilizados para as análises de enriquecimento funcional. Os alvos dos 

miRNAs foram agrupados manualmente em cinco clusters de acordo com seu fold-change. Os 

clusters foram então submetidos à análise de enriquecimento funcional. Os processos biológicos 

enriquecidos por esta análise foram distintos em cada cluster, sugerindo que os miRNAs regulam 

com intensidade semelhante genes associados a uma mesma função biológica, mas funções 

biológicas distintas são reguladas com intensidades diferentes. Os resultados obtidos neste projeto 

aprimoram significativamente a qualidade das análises in silico de predição de alvos, o que 

permitirá aos pesquisadores obterem resultados mais robustos durante a identificação de alvos dos 

miRNAs. Adicionalmente, a análise de enriquecimento funcional realizada sugere uma nova 

complexidade dos miRNAs, podendo justificar o fato de um único miRNA ser capaz de regular 

processos biológicos distintos com a especificidade demandanda para cada processo dentro de um 

contexto celular.  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

Abstract 

MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that regulates a wide range 

biological pathways. This regulation occurs by the complementary biding between miRNA 

and its target Messenger RNA (mRNA), mainly at 3’UTR region, blocking the protein 

sinthesis. Several works tries to identify the biological functions that miRNAs are assign by 

detecting its mRNA targets and performing functional enrichment analysis using 

bioinformatic tools. However, in silico target prediction tools available nowadays often return 

little robust results and there is no consensus about a tool that highlights from the others or if 

combining the results from more than one tool improves the quality of the analysis. Moreover, 

the functional enrichment metodology used nowadays do not take in account several 

important aspects of the regualtion of the miRNA targets, thus generates inconsistent results. 

This way, the objectives of this project are (i) to elaborate a target prediction method with 

high efficience using the available tools and (ii) to evaluate the regulation of the biological 

process controled by the miRNAs by functional analysis considering the fold-change levels of 

the target mRNAs. To do this, we compared the performances of the three most used target 

prediction tools (TargetScan, miRanda-mirSVR and Pita), as well as all combinatorial 

possibilities of these tools (unions and intersections). The union of TargetScan + miRanda-

mirSVR returned the greatest performance, with the bese balance between sensitivity e 

specificity. After, microarray data from gene expression after super-expression of eleven 

miRNAs were used for the functional enrichment analysis. The miRNA targets were grouped 

in five clusters according to their fold-change levels after the superexpression of the miRNAs. 

The clusters were individually submited to functional enrichment analysis. The enriched 

biological process were distinct in each cluster, suggesting that miRNAs control genes assign 

with one function with similar intensity, but distinct biological process are controled with 

distinct intensities. The results obtained in this project improved the quality of in silico target 

prediction analysis, which can help researchers obtaining results with more quality when 

performing miRNA target prediction. Moreover, the funcional enrichment analysis suggests a 

new complexity of miRNAs, and could jusity the fact of an unique miRNA be capable of 

control several bilogical process with the specificity required for each one within the celular 

context. 

  



 

Campus de Botucatu 
 

 

 

Sumário 

1. Introdução geral .................................................................................................................... 11 

1.1. A predição de alvos e seus principais atributos ................................................................. 14 

1.1.1. Ferramentas de predição de alvos ................................................................................... 16 

1.2. O enriquecimento funcional dos alvos de miRNAs .......................................................... 18 

1.2.1. Os problemas do enriquecimento funcional ................................................................... 19 

2. Objetivos ............................................................................................................................... 21 

3. Capítulo I: Análise de Predição de Alvos  ............................................................................ 22 

3.1. Material e métodos ............................................................................................................ 22 

3.1.1. Resumo do workflow...................................................................................................... 22 

3.1.2. Obtenção dos dados de predição de alvos ...................................................................... 22 

3.1.3. União e intersecção dos resultados das ferramentas ....................................................... 24 

3.1.4. Cálculo da sensibilidade, especificidade, precisão e performance ................................. 24 

3.1.5. Análise estatística  .......................................................................................................... 27 

3.2. Resultados e discussão – Artigo Científico ....................................................................... 28 

4. Capítulo II: Análise de enriquecimento funcional ................................................................ 49 

4.1. Material e Métodos ............................................................................................................ 50 

4.1.1. Resumo do Workflow ..................................................................................................... 50 

4.1.2. Obtenção dos dados de microarray ................................................................................. 50 

4.1.3. Agrupamento dos alvos em clusters de mRNA fold-change  ......................................... 50 

4.1.4. Análise de enriquecimento funcional ............................................................................. 51 

4.1.5. Análise de conservação evolutiva................................................................................... 51 

4.2. Resultados e discussão – Artigo Científico ....................................................................... 53 

5. Considerações finais ............................................................................................................. 69 

6. Referências bibliográficas .................................................................................................... 71  



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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1. Introdução geral 

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não-codificadores (~22 nucletídeos) 

presentes no genoma de animais, plantas e, inclusive, vírus (Lee et al., 1993; Sunkar et al., 

2005; Jia et al., 2008). Descobertos pioneiramente há mais de duas décadas em 

Caenorhabditis elegans (Lee et al., 1993), possuem atualmente a reconhecida importância de 

participar da regulação de uma vasta gama de processos biológicos, tais como diferenciação e 

proliferação celular, carcinogênese, resposta imune, morte celular, dentre outros (Ambros, 

2004; Flynt et al., 2007, 2009; Liu e Olson, 2010; Shkumatava et al., 2009; Christodoulou et 

al., 2010; Takacs e Giraldez, 2011). 

A via canônica da biogênese de um miRNA (Figura 1) tem início com a transcrição de 

uma longa molécula (~110 nucleotídeos) conhecida como miRNA primário (pri-miRNA) 

(Borchert et al., 2006). Essa molécula dobra-se em uma estrutura secundária em forma de 

grampo de cabelo (estrutura em hairpin), passando então a ser reconhecida pela enzima 

Drosha. A Drosha cliva o pri-miRNA na região caudal do hairpin, formando o miRNA 

precursor (pré-miRNA; ~70 nucleotídeos; Lee et al., 2006). O pré-miRNA é, então, exportado 

para o citoplasma através da proteína exportina-5 (Lund et al., 2004) e processado pela 

enzima Dicer. Essa enzima cliva o pré-miRNA na região loop, formando uma molécula de 

RNA fita dupla (dsRNA) de aproximadamente 22 pares de bases. Proteínas da família 

argonauta associam-se com uma das fitas do dsRNA para formar o complexo de 

silenciamento induzido por RNA (RISC), dando origem ao miRNA maduro, ou canônico 

(Krutzfeldt et al., 2006), enquanto que a outra fita (miRNA*) pode ser degradada ou também 

se associar a um complexo RISC (Rand et al., 2005; Bang et al., 2014).  



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

|12| 

 

 

 

Figura 1: Via canônica da biogênese de miRNAs. Figura editada de Ameres e Zamore (2013). 

 

Funcionalmente, os miRNAs atuam pelo pareamento simples de "Watson e Crick" 

com a sequência complementar presente na molécula do RNA mensageiro (mRNA) alvo. O 

miRNA maduro interage preferencialmente com a região 3’UTR do RNA mensageiro 

(mRNA) alvo por complementaridade total (nas plantas) ou parcial (nos animais) levando à 

inibição de sua síntese proteica (Lee e Dutta, 2009). Entretanto, adicionalmente à região 

3’UTR, diversos trabalhos também detectaram sítios de interação em éxons (Tay et al., 2008; 

Reckzo et al., 2012; Schnall-Levin et al., 2010; Hausser et al., 2013) e na região 5’UTR (Lytle 

et al., 2007; Orom et al., 2008; Devlin et al., 2010; Zhou e Rigoutsos, 2014) da molécula de 

mRNA. Nas plantas, a alta complementaridade dos miRNAs tende a desencadear a clivagem 

do mRNA pelas proteínas da família argonauta (Tang et al., 2003; Lanet et al., 2009), 

enquanto que, a baixa complementaridade dos miRNAs com seu mRNA alvo, nos animais, 

geralmente não permite a clivagem do mRNA, sugerindo que neste grupo, a regulação da 

expressão gênica seja feita de maneira alternativa à clivagem (Karginov et al., 2010; Shin et 

al., 2010), embora haja excessões em ambos os grupos. Estudos realizados no Danio rerio 

(zebrafish) e em Droshophila melanogaster (drosófila) apontam que nos animais, os miRNAs 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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tendem a primeiramente inibir a tradução impedindo o acoplamento do ribossomo ao mRNA 

e posteriormente levar à degradação prematura deste mRNA (Bazzini et al., 2012; Mathonnet 

et al., 2007; Zdanowicz at al., 2009). 

 A interação de um miRNA com seu alvo é guiada principalmente por uma sequência 

de 7 nucleotídeos na região 5’ do miRNA (nucleotídeos 2 a 8), chamada de sequencia seed, 

embora importância cada vez maior esteja sendo atribuida ao pareamento 3' complementar 

nesse processo (Broughton et al., 2016). Cinco tipos de pareamentos da sequencia seed são 

descritos atualmente: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, 6mer e offset-6mer, apresentados na ordem 

do mais para o menos efetivo (Agarwal et al., 2015). O pareamento 8mer, se caracteriza pelo 

pareamento de sete nucleotídeos (2-8) com um “A” na posição “1” do 3’UTR. Estudos 

mostram que há uma preferência no reconhecimento de MREs que apresentam este 

nucleotídeo na posição “1” do 3’UTR, devido ao fato de este “A” ser uma região de 

assentamento das proteínas argonautas (Baek et al., 2008; Schirle et al., 2014). O pareamento 

7mer-m8 representa um pareamento de sete nucleotídeos (2-8), porém sem a presença da “A” 

na posição “1”. O pareameno 7mer-A1, é um pareamento de seis nucleotídeos (2-7), que 

contém um “A” na posição “1” do 3’UTR. O pareamento 6mer representa um pareamento de 

6 nucleotídeos (2-7), enquanto que a seed offset-6mer caracteriza-se por um pareamento 

deslocado de 6 nucleotídes (3-8), ambos sem a presença do “A” na posição “1”. Entretanto, 

estes dois últimos tipos de pareamento apresentam baixa eficiência de regulação e são pouco 

conservados (Agarwal et al., 2015). Adicionalmente a estas interações baseadas na sequencia 

seed, diversas outras interações não baseadas na seed foram detectadas (Clark et al., 2012; 

Clark et al., 2014; Chi et al., 2012), assim como foi demonstrada que a porção 3’ dos miRNAs 

pode ser tão relevante quanto a região seed na detecção de seus alvos (Broughton et al., 2016). 

Análises computacionais de predição de alvos de miRNAs indicam que um único 

miRNA pode ligar-se a centenas de mRNAs. Assim, cada miRNA regula uma gama extensa 

de processos biológicos distintos. Portanto, os miRNAs devem ser capazes de regular de 

forma específica cada processo biológico.  

 Desta maneira, a predição de genes alvo e a caracterização dos processos biológicos 

regulados são etapas fundamentais em diversas pesquisas envolvendo miRNAs e sus papéis 

biológicos. A predição de alvos de miRNAs atualmente é realizada através de ferramentas 

computacionais que avaliam diversos parâmetros envolvendo a interação miRNA-alvo. Já a 

caracterização dos processos biológicos regulados pelos miRNAs geralmente é feita através 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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de análises de enriquecimento funcional dos alvos preditos computacionalmente ou dos genes 

cuja expressão foi alterada através de técnicas de manipulação do miRNA estudado. 

 Entretanto, a predição computacional de alvos ainda está distante do ideal, pois as 

ferramentas exibem uma alta quantidade de interações falso-positivas ou são falhas em 

detectar interações genuínas. Adicionalmente, as análises de enriquecimento funcional dos 

alvos de miRNAs são realizadas sem que sejam considerados diversos fatores relevantes para 

que haja a interação miRNA-alvo (ex., pareamento da seed, acessibilidade do sítio de ligação, 

tamanho do 3’UTR). Desta maneira, diversas funções biológicas desempenhadas pelos 

miRNAs podem estar sendo equivocadamente propostas ou descartadas a priori. 

 

1.1. A predição de alvos e seus principais atributos  

Nos últimos anos, diversas propriedades importantes para o reconhecimendo de um 

mRNA como alvo de um miRNA foram identificadas em animais, melhorando a compreensão 

destas interações e, consequentemente, aprimorando a predição computacional de alvos. 

Dentre todos os parâmetros descritos atualmente, alguns recebem maior destaque devido sua 

grande influência tanto na regulação quanto no reconhecimento de um mRNA como pleno 

alvo de um miRNA (Figura 2).   

 

Figura 2: Principais parâmetros utilizados durante a predição de alvos.  Figura editada de Betel et 

al. (2010). 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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 Estes parâmetros podem ser dividadas em três grandes grupos: os parâmetros do 

dulpex, os parâmetros locais e os parâmetros globais (Betel et al., 2010). Os parâmetros do 

duplex contêm os parâmetros pareamento da seed, contribuição 3’, estabilidade do 

pareamento da seed (seed pairing stability – SPS; Betel et al., 2010,), energia livre do 

heteroduplex e P-value (Miranda et al., 2010). Estes parâmetros aferem a interação direta 

entre o miRNA e seus alvos. O pareamento da seed avalia quantos nucleotídeos da região 

seed do miRNA estão parenado com o mRNA alvo. A contribuição 3’ avalia se além do 

pareamento da seed ocorre também um pareamento da porção 3’ do miRNA e o quão ele 

auxilia na regulação (Witkos et al., 2011). O SPS avalia quais os nucleotídeos que compõe a 

sequencia seed (Garcia et al., 2008). A energia livre do heteroduplex avalia se a mínima 

energia livre formada entre o miRNA e o mRNA alvo é suficiente para estabelecer uma 

hibridização. Finalmente, o P-value avalia a probabilidade da interação miRNA-alvo ter sido 

predita de maneira aleatória. 

 Os parâmetros locais aferem propriedades da 3’UTR do mRNA com influência direta 

no reconhecimendo deste como um alvo de um miRNA qualquer. Estes parâmentros perfazem 

a acessibilidade do sítio de ligação (site acessibility – SA) e o conteúdo AU flanqueador. A 

SA avalia a capacidade do miRNA em desdobrar a potencial estrutura secondária formada na 

região de interação do miRNA (Kertsz et al., 2007), conhecida como elemento de 

reconhecimento de miRNAs (miRNA recognition element – MRE). O conteúdo AU 

flanqueador avalia o número de nucleotídeos “A” e “U” que flanqueiam os MREs, uma vez 

que altas concentrações destes nucleotídeos nestas regiões aumentam a eficiência da 

regulação (Grimsom et al., 2007).  

 Os parâmetros globais aferem propriedades da 3’UTR do mRNA alvo com influência 

indireta no reconhecimento deste como um alvo. Estes parâmetros são o tamanho total da 

sequencia e do 3’UTR, o número de sítios de ligação no transcriptima (transcriptome 

abundance – TA), a posição do pareamento e o grau de conservação do 3’UTR. O tamanho do 

3’UTR é importante de ser avaliado, uma vez que 3’UTRs mais longos sofrem maior grau de 

regulação (Sandberg et al., 2008), já o tamanho total da sequencia é relevante pois há maior 

probabilidade de predições falsas em sequencias maiores (Miranda et al., 2006). O TA avalia 

a quantidade de sítios de ligação de um mesmo miRNA em todo o transcriptoma, uma vez 

que quanto mais alvos esse miRNA regular, maior vai ser a diluição de seu efeito. A posição 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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do pareamento avalia a posição do MRE no 3’UTR, uma vez que MREs localizados nas 

porções terminais do 3’UTR apresentam um maior potencial regulatório (Grimsom et al., 

2007). A conservação avalia a conservação dos MREs entre as espécies, uma vez que 

miRNAs mais conservados tendem a apresentar maior potencial regulatório (Grimsom et al., 

2007).  

 

1.1.1. Ferramentas de predição de alvos 

 A partir dos avanços da bioinformática nos últimos anos, diversas ferramentas de 

predição foram elaboradas na tentativa de se otimizar a busca por interações de genes alvos 

relacionados às vias regulatórias diversas nas quais os miRNAs estejam atuando. Atualmente, 

dezenas de ferramentas encontram-se disponíveis. Dentre elas, quatro têm sido amplamente 

utilizadas pela comunidade científica: TargetScan, miRanda-mirSVR, Pita e RNA22. As 

ferramentas Targetscan, miRanda-mirSVR e Pita consideram predições baseadas na sequencia 

seed e nas regiões 3’UTR, enquanto a ferramenta RNA22 também considera interações não 

baseadas na seed e em todo o transcrito.  

Apesar de todas estas ferramentas terem como objetivo a identificação de uma ampla 

gama de interações miRNA-alvo genuínas, elas são constituídas de parâmetros distintos 

(Tabela 1), proporcionando resultados divergentes entre elas. 

Contudo, mesmo essas ferramentas mais avançadas, ainda geram predições de alvo 

pouco robustas, pois retornam (i) uma alta quantidade de interações falso-positivas ou (ii) são 

falhas em detectar interações genuínas. Adicionalmente, como demonstrado, essas 

ferramentas utilizam uma série de parâmetros divergentes, o que produz resultados 

inconsistentes quando comparadas entre si. Este fato acentua-se principalmente nas predições 

de alvos de miRNAs de animais, devido à possibilidade de pareamento incompleto entre e o 

miRNA e seu alvo.  

 Desta maneira, apesar da disponibilidade de uma série de ferramentas de predição de 

alvos não há um consenso sobre a melhor maneira de utiliza-las. De fato, diversos 

experimentos de validação revelaram muitos resultados falso positivos e falso negativos, 

demnstrando que ainda há necessidade de futuras melhoras nas ferramentas. Na tentativa de 

minimizar estes resultados pesquisadores tem usado diversas estratégias para selecionar os 

alvos preditos, incluindo a utilização da intersecção ou união dos resultados de diversas 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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ferramentas. Entretanto, estas metodologias vêm sendo usadas de maneira indiscrimidada, 

sem um critério bem definido e um teste comparativo para determinar a qualidade de tais 

estratégias. Desta maneira, ainda não se sabe a intersecção ou união dos resultados de mais de 

uma ferramenta de fato melhora a qualidade das análises de predição de alvo. 

 

Tabela 1: Principais parâmetros utilizados pelas ferramentas TargetScan, miRanda-mirSVR, 

PiTa e RNA22. 

Grupos Atributos TargetScan 
miRanda-

miRSVR 
PiTa RNA22 

Parâmetros 

do duplex 

Pareamento 

seed 
X X X X 

Contribuição 3’ X X X X 

SPS X    

Energia livro do 

heteroduplex  
   X 

P-value    X 

Parâmetros 

Locais 

SA X X X  

Conteúdo AU 

flanqueador 
X X X  

Parâmetros 

Globais 

TA X    

Posição do 

pareamento 
X X   

Tamanho do 3’ 

UTR 
X X   

Tamanho total 

da sequencia 
   X 

Conservação X X X  

- Outros X   X 

 

1.2. O enriquecimento funcional dos alvos de miRNAs 

 Após a obtenção dos resultados provenientes da predição de alvos dos miRNAs, uma 

das principais análises realizadas com estes dados visa à busca e identificação dos papéis e 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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vias biológicas que cada miRNA participa (Bleazard et a., 2015). O método mais utilizado 

nesta análise é o enriquecimento funcional in silico dos alvos regulados pelos miRNAs. Este 

método consiste em três etapas: (i) identificar os genes regulados pelos miRNAs analisados, 

(ii) associar estes alvos com suas funções biológicas e (iii) calcular a super-representação 

estatística dos processos biológicos dos alvos dos miRNAs (Gusev et al., 2007).  

 A primeira etapa é geralmente realizada com a utilização de ferramentas de predição 

de alvo ou de datasets experimentais que avaliaram interação mRNA-alvo. Uma vez que tais 

experimentos em larga escala da interação mRNA-alvo, como por exemplo chips de 

microarray e CLIP-seqs, ainda são escassos a abordagem de predição de alvos permanece 

como a mais utilizada. Durante esta etapa os pesquisadores podem optar por analisar os alvos 

provenientes de um único miRNA ou de uma lista de miRNAs que possuem uma 

característica em comum, como por exemplo serem enriquecidos em determinado tecido ou 

estarem sub/super-expressos em pacientes com determinada doença. 

A segunda etapa é geralmente realizada utilizando-se as anotações do Gene Ontology 

(GO; Ashburner et al., 2000), ou as vias biológicas do Kyoto Encyclopedia of Genes and 

Genome (KEGG; Kanehisa and Goto, 2000). O GO é um consórcio que agrega termos 

funcionais dos genes de diversas espécies de animais, plantas e microorganismos, dividindo-

os em três categorias: processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares. Os 

termos associados aos processos biológicos se referem às vias nas quais o gene contribui, 

como por exemplo generation of neurons (GO:0048699) e response to stress (GO:0006950). 

Os termos associados aos componentes celulares referem-se às partes da célula ou ambiente 

extracelular em que os genes atuam, como por exemplo cytoplasmatic vesicle (GO:0031410) 

e synapse part (GO:0044456). Os termos associados às funções moleculares referem-se às 

atividades bioquímicas do gene, como por exemplo hydrolase activity (GO:0016787) e 

protein complex binding (GO:0032403) (Ashburner et al., 2000).  

O KEGG, assim como o GO, é um banco de dados que agrega termos funcionais de 

diversas espécies de animais, plantas e microorganismos. Entretanto, diferentemente do GO, o 

KEGG fornece um mapa de vias biológicas, agrupando os genes segundo as grandes vias 

biológicas das quais participam, por exemplo, fatty acid metabolism e lipid metabolism 

(Kanehisa and Goto, 2000), ao invés de agrupá-los por processos biológicos relacionados a 

eventos específicos.  



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

|19| 

 

A terceira etapa consiste no teste de distribuição hipergeométrica, ou o teste de Fisher, 

utilizado para o enriquecimento dos dados. Neste contexto, a distribuição hipergeométrica 

calcula a probabilidade de um miRNA regular n genes num determinado processo biológico 

dado um total de x genes presentes na amostra. Por essa estratégia é possível testar se os genes 

alvos de miRNAs são controlados aleatoriamente ou se estão preferencialmente associados a 

determinados processos biológicos (Bleazard et a., 2015).  

 

1.2.1. Os problemas do enriquecimento funcional 

 Apesar de este ser o método mais utilizado para determinação dos processos e vias 

biológicas controladas pelos miRNAs, ele não leva em consideração diversos fatores 

relevantes durante a interação miRNA-alvo, como os demonstrados na Tabela 1.  

Bleazard et al. (2015) questiona a eficiência do modo pelo qual o enriquecimento 

funcional dos alvos de miRNAs é atualmente realizado, alertando que esta abordagem possui 

diversos problemas e enviesamento metodológico. Estes autores discutem que esta abordagem 

gera diversos resultados inespecíficos, como por exemplo retorna processos biológicos 

enriquecidos semelhantes indepententemente da lista de alvos utilizada. Isso ocorre, pois, uma 

vez que os genes podem estar associados a mais de uma função biológica, isto pode 

tendenciar o aparecimento de determinados processos biológicos gerais, como por exemplo 

regulation of biological process (GO:0050789), single-organism process (GO:0044699), 

multicellular organismal process (GO:0032501), dentre outros, em diversas listas 

independentes. 

Na tentativa de atenuar estes problemas, estes e outros pesquisadores têm buscado 

identificar abordagens alternativas à metodologia padrão de enriquecimento funcional. 

Bleazard et al. (2015), por exemplo, elaborou um cálculo empírico que também leva em 

consideração o número de MREs presentes em cada 3’UTR. Entretanto, além desta, diversas 

outras características influenciam a regulação final dos alvos dos miRNAs. Ignorar tais 

características ou o potencial regulatório de um miRNA sobre seus alvos como um todo 

durante a etapa de enriquecimento pode ocultar diversos padrões regulatórios e propriedades 

biológicas recorrentes dos miRNAs.  Em outras palavras, uma vez que um único miRNA é 

capaz de regular diversos processos biológicos dentro de um mesmo contexto celular, é 

provável que cada processo seja regulado de modo diferencial e particular e que os genes alvo 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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atuantes num mesmo processo biológico sejam regulados com intensidades semelhantes, 

diferentemente de genes atuantes em outros processos biológicos cuja intensidade de 

regulação não estaria correlacionada (aqui, nos definimos “intensidade de regulação” como o 

grau de fold-change apresentado pelos mRNA após a super-expressão dos miRNAs através de 

mimetizadores). Tal categorização regulatória hipotética não pode ser avaliada com o uso das 

metodologias atuais de enriquecimento funcional, porém caso verdadeira, ajudaria a justificar 

a capacidade dos miRNAs em regular vias biológicas distintas com alta especificidade, 

atendendo às demandas próprias de cada via, e assim promovendo a homeostasia celular.  

  



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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5. Considerações finais  

A quantidade de trabalhos envolvendo o estudo do papel biológico dos miRNAs vem 

crescendo nor últimos anos. Nestes trabalhos, a predição in silico de alvos e o respectivo 

enriquecimento funcional dos mesmos estão quase sempre presentes. Entretanto, muito ainda 

se discute sobre a real eficiência de tais métodos, uma vez que em diversos casos trazem 

resultados pouco eluzivos ou de baixa qualidade. Neste contexto, os resultados apresentados 

neste trabalho poderão auxiliar os pesquisadores na realização destas duas etapas 

fundamentais durante a caracterização dos papeis biológicos desempenhados pelos miRNAs. 

 No capítulo I demonstramos que as últimas atualizações das ferramentas de predição 

de alvos forneceram valores de alta qualidade de especificidade e precisão, gerando predições 

quase totalmente livres de resultados falso-positivos. Estes dados, mostram que a técnica de 

intersecção, apesar de ainda ser muito adotada, atualmente não se faz necessária, trazendo 

prejuízos devido à perda da sensitividade. Entretanto, os cutoffs utilizados pelas ferramentas 

excluem diversos alvos verdadeiros. Desta maneira, os desenvolvedores das ferramentas de 

predição de alvos devem agora investir na melhora da sensibilidade. 

  A união dos resultados das ferramentas TargetScan e miRanda-mirSVR obteve a 

elevada performance de 0.7 (em uma escala de 1 a -1), por agregar uma alta sensibilidade sem 

prejuízo de especificidade e precisão. Desta maneira, os resultados provenientes desta análise 

foram capazes de aprimorar a qualidade das análises in silico de predição de alvos, o que 

permitirá aos pesquisadores obterem resultados mais robustos durante a identificação de alvos 

dos miRNAs, economizando tempo e dinheiro em experimentos funcionais subsequentes. 

 No capítulo II, as análises de enriquecimento funcional, levando em consideração a 

intensidade da regulação fornecida pelos miRNAs, sugerem um novo nível de complexidade 

da atuação destas moléculas. Regular diversos genes associados a um mesmo processo 

biológico com intensidades semelhantes, enquanto processos biológicos distintos são 

regulados com intensidades diferentes é uma habilidade dos miRNAs que os torna capaz de 

regular de maneira precisa uma grande gama de funções biológicas distintas dentro de um 

mesmo contexto celular. Adicionalmente, nossas análises apontam que este é um fenômeno 

conservado entre as espécies de vertebrados analisadas, sugerindo que tal segregação 

regulatória vem sendo positivamente selecionada durante a evolução dos vertebrados. 



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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 O estudo aprofundado das funções biológicas reguladas pelos miRNAs miR-1, miR-7 

e miR-9 trouxe também contribuições para a compreensão do comportamento dos miRNAs 

dentro da célula ou mesmo do organismo. Assim, a partir dos direcionamentos trazidos, novos 

estudos podem tentar identificar os padrões que causam a segregação da intensidade da 

regulação, o que possibilitaria a manipulação de uma via de ação dos miRNAs sem afetar as 

demais, minimizando os efeitos off-target comuns nos experimentos atuais.   



Dissertação de mestrado                                                                 Arthur Casulli de Oliveira

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