UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CAMPUS DE BOTUCATU Filogenia e taxonomia de mixozoários parasitos de peixes provenientes de rios interiores do Estado de São Paulo Diego Henrique Mirandola Dias Vieira Orientador: Prof. Dr. Rodney Kozlowiski de Azevedo Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus de Botucatu/SP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Zoologia). Botucatu 2020 Vieira, Diego Henrique Mirandola Dias. Filogenia e taxonomia de mixozoários parasitos de peixes provenientes de rios interiores do Estado de São Paulo / Diego Henrique Mirandola Dias Vieira. - Botucatu, 2020 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Rodney Kozlowiski de Azevedo Capes: 20400004 1. Peixe - Filogenia. 2. Peixes - Parasitos. 3. Myxobolus. 4. Biologia molecular. 5. Histologia. Palavras-chave: Myxobolidae; análise ultraestrutural; biologia molecular; filogenia; histologia. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU – UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 À Antonio e Maria, Dedico “A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez” (George Bernard Shaw) Agradecimentos ii Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, pela força e sabedoria que tem me proporcionado em todos os momentos da minha vida. Aos meus pais, Antonio e Maria, pela educação, base, amor, esforço, carinho, confiança e apoio. Sem eles nada disso seria possível e eu não seria nada. À minha noiva Priscila, pelo companheirismo, amor, incentivo em minhas atividades, conselhos e por todas as conversas sobre presente, passado e futuro. Por ser minha companheira de congressos e viagens. Obrigada por estar sempre ao meu lado e pelo sorvete. À minha família, por todas as festas, churrascos e momentos de descontração que são tão importantes quando se escreve uma tese. Obrigado por acreditarem em mim. À Pérola, pelo amor incondicional. Ao meu orientador e amigo, Prof. Rodney, por todos os ensinamentos, conversas e debates. Obrigado pelo apoio e confiança em todos esses anos de convívio. À Profª. Vanessa, por todas as ideias, ajuda e colaborações. Obrigado por ser minha coorientadora informal. À Profa. Maria João Santos, da Universidade do Porto - Portugal, pela receptividade e por ter compartilhado comigo seus conhecimentos durante meu período de estágio. iii Aos colegas do LAPAS – Unesp e do Laboratório de Ictioparasitologia – USC, por compartilharem os momentos bons e ruins, de alegria e de desespero, de confiança e de incertezas. No final, todos conseguiremos vencer as batalhas. Aos meus amigos de São Manuel, por todas as conversas, momentos de descontração e relaxamento. Ao Prof. Tit. Reinaldo, por ter me aberto as portas do laboratório da iniciação científica até hoje, para que eu pudesse desenvolver pesquisa. Obrigado pelas correções na qualificação que ajudaram na escrita dessa tese. À Aline Zago, pela valorosa correção da minha qualificação que ajudou muito a tornar essa tese melhor. Obrigado pelas dicas e por toda a ajuda. Aos técnicos e funcionários do Departamento de Parasitologia do IBB, pela ajuda e colaboração em todos os momentos que precisei. Aos pescadores, que tanto contribuíram na coleta dos peixes utilizados nesse estudo. Muito obrigado. À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – Processo no 2015/24901-8) pelo apoio científico e financeiro para a realização desta pesquisa. A todos que estiveram ao meu lado. Sumário v Sumário Resumo.............................................................................................................................1 Abstract............................................................................................................................3 Introdução geral..............................................................................................................5 Rios Batalha e Tietê...........................................................................................................6 Parasitos de peixes: Mixozoários......................................................................................9 Biodiversidade de mixozoários........................................................................................17 Objetivos.........................................................................................................................29 Material e Métodos........................................................................................................31 Referências.....................................................................................................................34 Capítulo 1: Morphological and molecular analysis of Henneguya sp. 1 (Cnidaria: Myxosporea), parasitizing gills of Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1837) from Brazil...............................................................................................................................60 Capítulo 2: Uma nova espécie, Henneguya sp. 2 (Cnidaria: Myxosporea), infectando as brânquias de Astyanax lacustris do Brasil.......................................................................85 Capítulo 3: Análise filogenética das espécies de mixozoários da família Myxobolidae (Cnidaria) do Brasil.......................................................................................................107 Anexo 1: Morphological and molecular description of Myxobolus batalhensis n. sp. (Myxozoa, Myxosporea), a liver and ovaries parasite of Salminus hilarii in Brazil.....126 Anexo 2: Myxobolus imparfinis n. sp. (Myxozoa: Myxosporea), a new gill parasite of Imparfinis mirini Haseman (Siluriformes: Heptapteridae) in Brazil.............................156 Anexo 3: Supplementary studies on Henneguya guanduensis (Cnidaria: Myxosporea) infecting gills and intestine of Hoplosternum littorale in Brazil: ultrastructural and molecular data................................................................................................................176 Considerações finais....................................................................................................195 Resumo 2 RESUMO Parasitos de organismos aquáticos apresentam considerável relevância para estudo devido ao seu impacto nos sistemas de aquicultura e na pesca em todo o mundo. Mixozoários são microparasitos que tem um ciclo de vida complexo, alternando entre um hospedeiro vertebrado e um invertebrado, podendo ser responsáveis por causar doenças principalmente em peixes, com altas taxas de mortalidade. Muitos mixozoários permanecem desconhecidos pela comunidade científica e seu potencial em causar doenças em peixes segue indeterminado em alguns casos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo analisar de forma morfológica e molecular mixozoários parasitos de peixes de rios interiores do estado de São Paulo, assim como caracterizar as relações filogenéticas desses parasitos e seu potencial patológico. Durante os anos de 2016 a 2019 foram coletados espécimes de cinco espécies de peixes das ordens Characiformes e Siluriformes. Foram utilizadas técnicas de biologia molecular, histologia e análise ultraestrutural na descrição taxonômica das espécies. Myxobolus batalhensis n. sp. encontrado parasitando Salminus hilarii (Bryconidae), Myxobolus imparfinis n. sp. encontrando parasitando Imparfinis mirini (Heptapteridae), Henneguya sp. 1 encontrado parasitando Prochilodus lineatus (Prochilodontidae) e Henneguya sp. 2 encontrado parasitando Astyanax lacustris (Characidae), tiveram a caracterização morfológica e molecular realizadas. Foi feito um estudo suplementar sobre Henneguya guanduensis, encontrado parasitando Hoplosternum littorale (Callichthyidae), com análise molecular, ultraestrutural e filogenética. Foi realizada ainda a análise filogenética das espécies de mixozoários da família Myxobolidae que parasitam peixes do Brasil. A diversidade de mixozoários encontrados nas espécies de peixes alvos deste estudo evidencia a necessidade de se intensificar o estudo da diversidade e do potencial patogênico destes parasitos. 3 Palavras-chave: Análise ultraestrutural, biologia molecular, histologia, filogenia Myxobolidae, rio Batalha, rio Tietê, SSU rDNA. Abstract ABSTRACT Parasites of aquatic organisms present considerable relevance to study because of their impact on aquaculture and fisheries worldwide. Myxozoans are microparasites that have a complex life cycle, alternating between a vertebrate and an invertebrate host, being able to be responsible for causing diseases mainly in fish, with high mortality rates. Many myxozoans remain unknown to the scientific community and their potential to cause disease in fish remains undetermined in some cases. Thus, the present study aimed to analyze morphologically and molecularly myxozoans parasites of fish from inland rivers of the state of São Paulo, as well as to characterize the phylogenetic relationships of these parasites and their pathological potential. From 2016 to 2019 specimens from five species from Characiformes and Siluriformes orders were collected. Molecular biology, histology, and ultrastructural analysis techniques were used taxonomic description of species. Myxobolus batalhensis n. sp. found parasitizing Salminus hilarii (Bryconidae), Myxobolus imparfinis n. sp. found parasitizing Imparfinis mirini (Heptapteridae), Henneguya sp. 1 found parasitizing Prochilodus lineatus (Prochilodontidae) and Henneguya sp. 2 found parasitizing Astyanax lacustris (Characidae), had the morphological and molecular characterization performed. A supplementary study on Henneguya guanduensis found parasitizing Hoplosternum littorale (Callichthyidae) was done, with molecular, ultrastructural and phylogenetic analysis. A phylogenetic analysis of the myxozoans species of Myxobolidae family parasitizing fish from Brazil was performed. The diversity of myxozoans found in the target fish species of this study highlights the need to intensify the study of the diversity and pathogenic potential of these parasites. Keywords: Batalha river, histology, molecular biology, Myxobolidae, phylogeny, SSU rDNA, Tietê river, ultrastructural analysis. Introdução geral 6 INTRODUÇÃO GERAL Rios Batalha e Tietê O continente americano possui uma grande quantidade de rios e lagos, contendo uma grande diversidade de peixes nativos. Segundo Bizerril e Primo (2001), o Brasil está entre os países que possuem a chamada megadiversidade, sendo privilegiado em recursos hídricos, com cerca de 12% de toda a água doce do mundo. A fauna de peixes da região Neotropical é a mais diversa do mundo e tem aproximadamente 7.000 espécies, que representam cerca de 22% da diversidade total de peixes do mundo (Nelson et al., 2016). O rio Batalha (Figura 1) pertence à bacia hidrográfica do Tietê-Batalha e percorre cerca de 167 Km, abrangendo total ou parcialmente os municípios de Agudos, Bauru, Piratininga, Avaí, Duartina, Gália, Presidente Alves, Reginópolis e Uru, localizados no Estado de São Paulo, Brasil. A má utilização e ocupação do solo pelas atividades antrópicas desenvolvidas em sua área de drenagem (monocultura, reflorestamento e pecuária) tem reduzido a mata nativa e ripícola. Isso pode desencadear alterações da qualidade de suas águas e exposição das áreas das nascentes a crescentes processos de erosão de áreas terrestres adjacentes ao rio, que conduzem ao assoreamento de seu leito, além da poluição das suas águas (Silva et al., 2009). Além disso, existem grandes indústrias na maioria das cidades que margeiam o rio Batalha, contribuindo para a poluição deste rio. Segundo relatório da CETESB (2017) a qualidade da água do rio Batalha vem piorando recentemente, devido a ocorrência de eventos pontuais, como fortes chuvas e rompimento do talude, promovendo arraste de partículas sólidas. Também houve aumento no nível de agrotóxicos presentes na água e 3 registros de mortandade de peixes no ano de 2017. Apesar disso, a água ainda é 7 considerada de boa qualidade para captação e abastecimento de cerca de 50% da população bauruense. Figura 1. Trecho do rio Batalha na cidade de Reginópolis, Estado de São Paulo, Brasil. Na cidade de Uru, o rio Batalha desagua no rio Tietê, sofrendo grande influência ecológica deste. Embora seja um dos rios mais importantes economicamente para o estado de São Paulo e para o país, o rio Tietê (Figura 2) é conhecido pelos seus problemas ambientais, especialmente no trecho em que banha a cidade de São Paulo (Silva et al. 2002). O potencial hidrelétrico do rio é bem utilizado na atualidade, sendo que em seu percurso encontram-se instaladas diversas barragens, tais como: Edgard de Souza, Pirapora do Bom Jesus, Laras, Anhembi, Rasgão, Barra Bonita, Ibitinga, Três Irmãos e Promissão. De acordo com o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA - Resolução 20/1986), que estabelece normas de qualidade de água do 8 Brasil, com base no uso predominante, a água no rio Tietê foi classificada na categoria 2 (água apropriada para o consumo doméstico, recreação, irrigação e proteção das comunidades aquáticas). Figura 2. Trecho do rio Tietê na cidade de Uru, Estado de São Paulo, Brasil. Dentre as espécies de peixes presentes nos rios Batalha e Tietê com boa aceitação no mercado comercial, pode-se destacar Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1837) (curimba ou curimbatá), Salminus hilarii Valenciennes, 1850 (tabarana ou dourado), Astyanax lacustris (Lutken, 1875) (lambari ou tambiú), Leporinus fridericii (Bloch, 1794) (piau) e Cyphocharax modestus (Fernández-Yépez, 1948) (saguiru). Estas espécies são pertencentes à ordem Characiformes, a qual compreende 24 famílias, 520 gêneros e aproximadamente 2.300 espécies de peixes descritas, podendo ser considerado um dos grupos de peixes mais especiosos de água doce do mundo (Nelson 9 et al., 2016). Devido a grande diversidade de peixes e de parasitos existentes no Brasil e no mundo, a importância de estudar patógenos de organismos aquáticos tem aumentado significativamente nas últimas décadas, uma vez que é sabido que estes agentes podem causar altas taxas de mortalidade em peixes, redução das capturas ou diminuir em valores de mercado as amostras afetadas (Luque, 2004; Thomson et al., 2018) Parasitos de peixes: Mixozoários Os parasitos são reconhecidos como importantes componentes da biodiversidade global, devido aos importantes papéis desempenhados por esses organismos em ecossistemas naturais. Estima-se que de 30 a 50% das espécies de animais conhecidas podem ser classificadas como parasitos (Poulin e Morand, 2000). Segundo Eiras (1994), a distribuição geográfica desses parasitos é diferente de sua distribuição original, o que deriva diretamente da ação antrópica, pela disseminação artificial intra e intercontinental de algumas espécies de peixes. Vários são os mecanismos de transmissão de parasitos entre os peixes, já que o ambiente aquático, por ser bastante homogêneo, facilita a propagação e distribuição desses organismos (Sitjà-Bobadilla, 2008). Luque (2004) afirmou que estudos parasitológicos em peixes são importantes, pois os parasitos podem ser utilizados como bioindicadores, para avaliar a ecologia do parasitismo, o seu potencial zoonótico e indicar o parasitismo como um fator limitante para a criação comercial de determinada espécie. Biologia e ciclo de vida Dentre os parasitos de peixes podemos destacar os mixozoários como um dos grupos de maior importância (Feist e Longshaw, 2006), uma vez que algumas espécies 10 podem influenciar na imunidade dos peixes, aumentando assim a susceptibilidade a infecções secundárias, como fungos e bactérias (Kumaraguru et al., 1995; Woo et al., 1995; Gómez et al., 2014). Os mixozoários são cnidários parasitos principalmente de peixes (Okamura et al., 2015). Antes de serem classificados como cnidários, os mixozoários eram divididos em duas classes, sendo que aqueles encontrados parasitando peixes, répteis e anfíbios, compunham a classe Myxosporea, cujos esporos eram considerados os estágios disseminadores do parasito, e os demais, encontrados parasitando invertebrados (anelídeos oligoquetas) formavam a classe Actinosporea Noble, 1980. Markiw e Wolf (1983) ao estudarem a forma de transmissão de Myxobolus cerebralis Hofer, 1903, agente causador da “doença do rodopio” em peixes, relataram o envolvimento de oligoquetas no ciclo de vida deste parasito. Em um trabalho posterior, Wolf e Markiw (1984) esclareceram a participação de anelídeos tubificídeos no ciclo de vida de M. cerebralis. Nesse trabalho, os autores mostraram que tubificídeos colocados em contato com esporos de M. cerebralis eram parasitados por actinosporídeos do gênero Triactinomyxon, indicando que esporos de M. cerebralis e de Triactinomyxon eram formas distintas do ciclo de vida do M. cerebralis. Desde então, algumas espécies de mixozoários tiveram seu ciclo de vida elucidado, contendo oligoquetas como hospedeiros intermediários, levando a invalidação da classe Actinosporea. Os mixozoários são divididos em duas classes, Myxosporea Buetschli, 1881 que contêm a grande maioria das espécies descritas, e Malacosporea Canning, Curry, Feist, Longshaw e Okamura, 2000, que têm briozoários como hospedeiros invertebrados e peixes como hospedeiros vertebrados. Esses microparasitos podem afetar qualquer órgão e tecido de répteis, anfíbios, aves, mamíferos e peixes, tendo um ciclo de vida indireto envolvendo um hospedeiro invertebrado, sendo este um anelídeo oligoqueta, no 11 qual o parasito produz actinosporos (Figura 4) que infectam o hospedeiro vertebrado, geralmente um peixe teleósteo, sendo que nestes o parasito produz mixosporos que infectam os hospedeiros anelídeos (Figura 5) (Rangel et al., 2015). Andree et al. (1999) mo. Matos et al. (2001) mostraram que o mixosporo é derivado da diferenciação terminal de três linhagens celulares que formam as cápsulas polares contendo filamentos extrusivos enrolados, uma ou mais células de esporoplasma e as valvas protetoras circundantes. Porém, é sabido que o processo de desenvolvimento celular do myxosporo é complexo e ainda não completamente entendido (Eiras et al., 2017) O desenvolvimento dos mixozoários nos hospedeiros vertebrados é caracterizado em alguns casos pela formação de plasmódios. Os plasmódios podem se desenvolver em vários tecidos do peixe hospedeiro e seu tamanho pode variar desde poucos micrômetros até milímetros (Feist e Longshaw, 2006). O desenvolvimento pode ser histozóico (plasmódios localizados intracelularmente ou intercelularmente) ou celozóico (localizados nas cavidades dos órgãos, soltos ou aderidos ao epitélio interno) (Lom, 1987; Eiras, 1994). A maioria destes parasitos é estenoxena, ou seja, apresentam alta especificidade parasitária, entretanto uma espécie de peixe pode albergar várias espécies de mixozoários (Lom e Dyková, 2006). 12 Figura 4. Morfologia geral básica de um actinosporo, apontando as principais estruturas morfológicas que compõe essa fase do ciclo. Adaptado de Kallert et al. (2015). 13 Figura 5 A-C. A. Fase actinosporea do mixozoário Ortholinea auratae Rangel, Rocha, Borkhanuddin, Cech, Castro, Casal, Azevedo, Severino, Székely e Santos, 2014. Barra de escala: 100 μm. B. Fase mixosporea do mixozoário O. auratae. Barra de escala: 10 μm. C. Ciclo de vida genérico de mixozoários mostrando o hospedeiro vertebrado e o hospedeiro invertebrado de forma alternada, e os dois estágios morfologicamente diferentes de esporos transmitidos pela água. Adaptado de Rangel et al. (2015). Na classe Myxosporea, os gêneros com maior diversidade de espécies são Myxobolus Bütschli, 1882 e Henneguya Thélohan, 1892. Myxobolus spp. são caracterizadas pelos esporos elipsoidais ou arredondados com duas cápsulas polares no plano sutural (Lom e Dyková, 2006). Myxobolus cerebralis é a espécie mais conhecida por ser o agente etiológico da “doença do rodopio”, uma patologia que acomete salmonídeos de várias partes do mundo, sendo um grave problema para a aquicultura mundial (Feist e Longshaw, 2006; Hallett e Bartholomew, 2012). O morfotipo de esporo de Myxobolus (Figura 6) é simples e pode ser considerado um morfotipo primário dentro da família Myxobolidae, a partir do qual outros morfotipos de esporos, como Henneguya, evoluíram (Fiala e Bartošová, 2010). A característica típica de esporos de Henneguya é a presença de dois apêndices caudais nos esporos, que os 14 distinguem das espécies do gênero Myxobolus, sendo que essas estruturas representam extensões das valvas na parte posterior do esporo (Lom e Dyková, 2006). Figura 6. Morfologia básica geral de mixosporos de Henneguya (a esquerda) e Myxobolus (a direita). São apontadas as principais estruturas morfológicas formadoras dos esporos. Adaptado de imagem de domínio público, disponível online. Barra de escala: 10 μm. Patogenicidade Cerca de 2500 espécies de mixozoários foram registrados e apenas uma fração é conhecida por causar infecções graves ou fatais, uma vez que geralmente tanto mixozoários quanto seus hospedeiros estão adaptados um ao outro (Vita et al., 2003). Porém, é sabido que estes parasitos podem ocasionar danos significativos para seus hospedeiros em ambiente natural e em sistemas de criação ocasionando a morte (Kent et al., 2001; Allen e Bergensen, 2002). Algumas espécies de mixozoários podem causar sérios danos em peixes de ambientes naturais ou em pisciculturas, como os do gênero Kudoa, que se alojam nos 15 músculos de peixes marinhos e, após a morte do hospedeiro, ocasionam a liquefação da carne tornando-a assim inviável para o consumo (Woo, 2006). Alguns outros exemplos são: Ceratonova shasta (Noble, 1950) (sin. Ceratomyxa shasta), um parasito de intestino, que ocasiona uma alta taxa de mortalidade em salmões juvenis do rio Klamath, localizado no Oregon-Califórnia, EUA (Foott et al., 2004); Henneguya ictaluri Pote, Hanson & Shivaji, 2000 que provoca a doença proliferativa da brânquia (PGD) no peixe Ictalurus punctatus (Rafinesque, 1818), gerando grandes perdas para pisciculturas; Henneguya lateobracis Yokoyama, Kawakami, Yasuda, Tanaka, 2003 e Henneguya pagri Yokoyama, Itoh e Tanaka, 2005, que podem causar mortalidade em Lateobrax sp. e Pagrus major (Temminck & Schlegel, 1843), respectivamente, por infecções no coração, levando a cardiomiopatias degenerativas; Myxobolus sp. que foi associado a miosite necrosante no palato de Gobioides broussonnetii Lacepède, 1800; Henneguya sp. que infecta e causa nódulos (Figura 7) na pele de C. modestus (Yokoyama et al., 2003; Yokoyama et al., 2005; Pote et al., 2012; Velasco et al., 2012; Vieira et al., 2019a). Figura 7. Espécime de Cyphocharax modestus (Fernández-Yépez, 1948) com grande nódulo localizado na região dorsal (seta). O espécime apresenta hiperplasia de escamas ou falta de escamas em alguns pontos do nódulo. Barra de escala: 3 cm. 16 As brânquias são o principal órgão respiratório dos peixes, tendo papel importante na excreção de nitrogênio e no balanço iônico (Noga, 2000). Dessa forma, intensas infecções por mixozoários nas brânquias podem comprometer o funcionamento deste órgão, afetando negativamente o desenvolvimento dos peixes (Naldoni et al., 2009). O rompimento do plasmódio pode lesar o tecido epitelial, abrindo assim uma porta de entrada para infecções secundárias (Feist e Longshaw, 2006). Algumas das patologias que podem ser causadas por mixozoários nas brânquias de peixes são: fusão das lamelas, inflamação, hiperplasia, atrofia e necrose celular (Feist e Longshaw, 2006). Pode ser citado como exemplo de espécie que causa patologia em brânquias de peixes Myxobolus koi Kudo, 1919 que se desenvolve nas brânquias de Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) e induz a hipertrofia do epitélio branquial e lesão nos filamentos branquiais (Yokoyama et al., 1997). No Brasil também já foram descritas espécies que causam danos as brânquias de seus respectivos hospedeiros, como por exemplo: Martins et al. (1997), que relataram hemorragia e focos inflamatórios no epitélio das brânquias de Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) infectados por Henneguya sp. em sistemas de criação; Adriano et al. (2005) que relataram Henneguya piaractus Martins e Souza, 1997 produzindo alterações das estruturas branquiais, com hiperplasia do epitélio das lamelas e compressão dos capilares e tecidos adjacentes em exemplares de pacu de sistemas de criação; Henneguya pseudoplatistoma Naldoni, Arana, Maia, Ceccarelli, Tavares, Borges, Pozo e Adriano, 2009 que foi identificado causando deformação das estruturas dos filamentos branquiais de pintado híbridos, levando à deformação das estruturas dos filamentos com importante redução da área funcional do epitélio respiratório (Naldoni et al., 2009); Adriano et al. (2009) que relataram intensa infecção nas brânquias de dourado Salminus brasiliensis Cuvier, 1816 por Myxobolus salminus Adriano, Arana, Carriero, Naldoni, Ceccarelli e Maia, 2009, onde os 17 plasmódios se desenvolveram na parede dos vasos sanguíneos do filamento branquial, afetando o fluxo sanguíneo (Adriano et al., 2009). Análise molecular Alguns trabalhos realizados com mixozoários ainda utilizam somente análises morfológicas para identificação de mixozoários (Lom e Arthur, 1989; Araújo et al., 2019; Rodríguez-Ponce et al., 2019; Santos et al., 2019; Vieira et al., 2019a). Entretanto, de acordo com Molnár et al. (2002), a classificação zoológica utilizando apenas os métodos morfológicos podem dificultar a classificação devido à alta similaridade que os mixosporídeos compartilham e, com isso, o uso das técnicas moleculares podem ajudar nesta tarefa. De acordo com Zhao et al. (2008), em alguns gêneros de mixozoários, os critérios taxonômicos baseados na morfologia não correspondem aos da biologia molecular, sugerindo que somente a classificação com base na morfologia pode não ser exata, indicando assim que o uso conjunto dessas duas análises é importante para a identificação de novas espécies. No Brasil, trabalhos foram publicados adicionando métodos moleculares na descrição de novas espécies ou no sequenciamento de espécies já descritas (Milanin et al., 2010; Naldoni et al., 2011; Adriano et al., 2012; Müller et al., 2013; Carriero et al., 2013; Azevedo et al, 2014; Vieira et al., 2017; Matos et al., 2018; Vieira et al., 2019b). Estes avanços na utilização dos métodos de análise molecular para a descrição dos mixozoários, bem como sua filogenia, mostram a importância do uso dessa técnica. A classificação dos mixosporídeos vem sendo debatida por vários autores em relação a quais parâmetros são os mais confiáveis para determinar a correta taxonomia do grupo. Fiala e Bartošová (2010), através de um amplo estudo envolvendo a análise de vários marcadores moleculares, como 28S rDNA, 18S rDNA e o gene codificante de 18 proteína EF-2, bem como dados morfológicos, demonstraram que as inferências filogenéticas baseadas unicamente no sequenciamento do gene 18S rDNA representam dados consistentes para estimar a relação evolutiva dos mixosporídeos, não se tratando apenas da história evolutiva do gene em si. A correta determinação taxonômica é um fator essencial para que se possa chegar às generalizações e conclusões confiáveis a respeito da ecologia, patogenicidade e epidemiologia relacionados a qualquer patógeno. Análises ultraestruturais e histológicas As análises ultraestruturais e histológicas vem sendo usadas como complemento para a identificação dos mixozoários e os efeitos do seu parasitismo para o hospedeiro. A utilização de microscopia eletrônica de transmissão (MET) é de extrema importância no estudo dos mixozoários, pois fornece informações muito relevantes sobre a morfologia dos esporos, principalmente o número de voltas do filamento polar, como também análise da relação parasito-hospedeiro (Adriano et al., 2005). As análises histológicas são importantes no estudo dos mixozoários, pois estes parasitos têm inúmeras estratégias para evitar a detecção por parte do hospedeiro, impossibilitando a ação imunológica do organismo (Kent et al., 2001). Um equilíbrio evolutivo foi alcançado entre o hospedeiro e o parasito e, mesmo quando a histopatologia é evidente, é necessário um exame detalhado. Exemplos incluem inflamação crônica, formação de granulomas e fibrose central (Feist e Longshaw, 2008). Sendo assim, os estudos histológicos são de grande importância para a identificação de parasitos, bem como os efeitos por eles causados. Devido à crescente importância que peixes nativos vêm assumindo na piscicultura, além de ampliar o conhecimento sobre a diversidade de mixozoários que infectam nossa ictiofauna, torna-se imprescindível 19 ainda identificar o possível potencial patológico desses parasitos, visando evitar uma perda ecológica e econômica causada pela morte dos hospedeiros. Biodiversidade de mixozoários Embora o conhecimento sobre a diversidade de parasitos em geral tenha aumentado substancialmente nas últimas décadas, existem ainda muitas espécies a serem registradas e descritas (Brooks e Hoberg, 2000), uma vez que há estimativa de um grande número de espécies hospedeiras a serem estudadas (Poulin e Morand, 2004). A diversidade de mixozoários conhecidos cresceu muito desde os primeiros estudos. Esse grupo de parasitos representa cerca de 18% da diversidade de espécies cnidárias (Okamura et al., 2015), com cerca de 2500 espécies descritas segundo as listas de sinopses disponíveis, e com dezenas de novas descrições acontecendo anualmente (Morris, 2010; Eiras e Adriano, 2012; Eiras et al., 2013; Vidal et al., 2017). São reconhecidos 64 gêneros em 17 famílias e é cada vez mais certo que os mixozoários são componentes diversos e importantes dos ecossistemas (Okamura et al., 2015). De acordo com os dados de literatura disponível sobre mixozoários do continente americano, são registradas cerca de 500 espécies válidas distribuídas em 15 famílias e 36 gêneros (Vidal et al., 2017). As espécies infectam principalmente peixes, tanto de água doce quanto de espécies marinhas, mas também podem parasitar anfíbios, répteis e mais raramente aves e mamíferos (Vidal et al., 2017). O número de espécies descritas de mixozoários no Brasil ainda é muito baixo se comparado com a sua grande diversidade de peixes (Azevedo et al., 2014). Nos rios onde foram coletados os peixes que foram objeto de estudo desse estudo, as pesquisas relacionadas a parasitos são escassas, ressaltando-se ainda que no rio Tietê não existia nenhum trabalho feito com foco em mixozoários realizado até o presente momento. 20 Embora a busca pelo estudo taxonômico e filogenético dos mixozoários venha aumentando gradativamente (cerca de 50% das espécies descritas no Brasil foram registradas nos últimos 10 anos), ainda há muitas espécies de peixe com potencial para serem hospedeiras a serem analisadas. Atualmente no Brasil existem 141 espécies descritas parasitando peixes, divididas em 16 gêneros. Dentre as espécies, a grande maioria se concentra nos gêneros Henneguya (57 espécies) e Myxobolus (51 espécies) (Tabela 1). 21 Tabela 1. Lista da diversidade de mixozoários descritos em peixes do Brasil até fevereiro de 2020, organizados em ordem alfabética de acordo com o seu gênero. Espécie Hospedeiro-tipo Local de infecção Referência Ceratomyxa amazonensis Symphysodon discus Vesícula biliar Mathews et al. (2016) Ceratomyxa curvata Carcharias taurus Vesícula biliar Cunha e Fonseca (1918) Ceratomyxa hippocampi Hippocampus erectus Vesícula biliar Cunha e Fonseca (1918) Ceratomyxa microlepis Hemiodus microlepis Vesícula biliar Azevedo et al. (2013) Ceratomyxa vermiformis Colossoma macropomum Vesícula biliar Adriano e Okamura (2017) Chloromyxum menticirrhi Menticirrhus americanus Bexiga urinária Casal et al. (2009) Chloromyxum riorajum Rioraja agassizii Vesícula biliar Azevedo et al. (2009) Chloromyxum sphyrnae Sphyrna tiburo Bexiga natatória Cunha e Fonseca (1918) Coccomyxa claviforme Chilomycterus spinosus spinosus Vesícula biliar Cunha e Fonseca (1919) Ellipsomyxa amazonensis Brachyplatystoma rousseauxii Vesícula biliar Zatti et al. (2018) Ellipsomyxa arariensis Pygocentrus nattereri Vesícula biliar Silva et al. (2018) Ellipsomyxa gobioides Gobioides broussonnetii Vesícula biliar Azevedo et al. (2013b) Henneguya adherens Acestrorhynchus falcatus Brânquias Azevedo e Matos (1995) Henneguya aequidens Aequidens plagiozonatus Brânquias Videira et al. (2015) 22 Henneguya amazonica Crenicichla lepidota Brânquias Rocha et al. (1992) Henneguya arapaima Arapaima gigas Brânquias e bexiga natatória Feijó et al. (2008) Henneguya astyanax Jupiaba keithi Brânquias Vita el al. (2003) Henneguya azevedoi Leporinus obtusidens Brânquias Barassa et al. (2012) Henneguya carolina Trachinotus carolinus Intestino Rocha et al. (2014) Henneguya caudalongula Prochilodus lineatus Brânquias Adriano et al. (2005b) Henneguya caudicula Leporinus lacustris Brânquias Eiras et al. (2008) Henneguya chydadea Astyanax lacustris (sin. A. altiparanae) Brânquias Barassa et al. (2003) Henneguya corruscans Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Eiras et al. (2009) Henneguya cuniculator Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Naldoni et al. (2014) Henneguya curimata Curimata inornata Rins Azevedo e Matos (2002) Henneguya curvata Serrasalmus spilopleura Brânquias Barassa et al. (2003b) Henneguya cyphocharax Cyphocharax gilberti Brânquias Abadallah et al. (2007) Henneguya eirasi Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Naldoni et al. (2011) Henneguya friderici Leporinus friderici Brânquias e órgãos internos Casal et al. (2003) Henneguya garavelli Cyphocharax nagelli Brânquias Martins e Onaka (2006) Henneguya gilbert Cyphocharax gilbert Brânquias Casal et al. (2017) 23 Henneguya guanduensis Hoplosternum littorale Brânquias Abdallah et al. (2007) Henneguya hemiodopsis Hemiodopsis microlepis Brânquias Azevedo et al. (2009b) Henneguya jariensis Cichla monoculus Nadadeiras Zatti et al. (2018b) Henneguya jundiai Rhamdia quelen Brânquias Negrelli et al. (2019) Henneguya jocu Lutjanus jocu Brânquias Azevedo et al. (2014) Henneguya leporini Hypomasticus mormyrops Ductos urinários Nemeczek (1926) Henneguya leporinicola Leporinus macrocephalus Brânquias Martins et al. (1999) Henneguya lepturus Hypopygus lepturus Cérebro e medula espinhal Azevedo et al. (2018) Henneguya maculosus Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Carriero et al. (2013) Henneguya malabarica Hoplias malabaricus Brânquias Azevedo e Matos (1996) Henneguya melini Corydoras melini Brânquias Mathews et al. (2016b) Henneguya multiplasmodialis Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Adriano et al. (2012) Henneguya nagelii Cyphocharax nagelii Brânquias Azevedo et al. (2013c) Henneguya occulta Loricaria sp. Brânquias Nemeczek (1926b) Henneguya paraensis Cichla temensis Brânquias Velasco et al. (2016) Henneguya paranaensis Prochilodus lineatus Brânquias Eiras et al. (2004) Henneguya pelucida Piaractus mesopotamicus Membrana serosa e bexiga natatória Adriano et al (2005c) 24 Henneguya piaractus Piaractus mesopotamicus Brânquias Martins e Souza (1997) Henneguya pilosa Serrasalmus altuvei Brânquias Azevedo e Matos (2003) Henneguya pisciforme Hyphessobrycon anisitsi Brânquias Cordeiro et al. (1994) Henneguya pseudoplatystoma Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Naldoni et al. (2009) Henneguya quelen Rhamdia quelen Rins Abrunhosa et al. (2018b) Henneguya rhamdia Rhamdia quelen Brânquias Matos et al. (2005) Henneguya rondoni Gymnorhamphichthys rondoni Nervos da linha lateral Azevedo et al. (2008) Henneguya rotunda Salminus brasiliensis Brânquias e nadadeiras Moreira et al. (2014) Henneguya santae Hyphessobrycon santae Brânquias Guimaraes e Bergamin (1934) Henneguya santarenensis Phractocephalus hemioliopterus Brânquias Naldoni et al. (2018) Henneguya schizodon Schizodon fasciatus Rins Eiras et al. (2004b) Henneguya striolata Pristobrycon striolatus Brânquias Casal et al (1997) Henneguya tapajoensis Cichla pinima Brânquias Zatti et al. (2018) Henneguya testicularis Moenkhausia oligolepis Testículos Azevedo et al. (1997) Henneguya theca Eigenmannia virescens Cérebro Kent e Hoffmam (1984) Henneguya torpedo Brachyhypopomus pinnicaudatus Cérebro e medula espinhal Azevedo et al. (2011) Henneguya travassosi Leporinus sp. Músculos Guimaraes e Bergamin (1933) 25 Henneguya tucunarei Cichla monoculus Brânquias Zatti et al. (2018) Henneguya unitaeniata Hoplerythrinus unitaeniatus Brânquias Úngari et al. (2019) Henneguya visibilis Leporinus obtusidens Nadadeiras Moreira et al (2014b) Henneguya wenyoni Tetragonopterus sp. Brânquias Pinto (1928) Hoferellus azevedoi Chaetobranchus flavescens Bexiga urinária Matos et al. (2018) Kudoa aequidens Aequidens plagiozonatus Musculatura sub-opercular Casal et al. (2008) Kudoa amazonica Hypophthalmus marginatus Musculatura esofágica Velasco et al. (2019) Kudoa orbicularis Chaetobranchopsis orbicularis Músculos Azevedo et al. (2016) Kudoa viseuensis Batrachoides surinamensis Músculos Monteiro et al. (2019) Myxidium amazonense Corydoras melini Vesícula biliar Mathews et al. (2015) Myxidium ceccarellii Leporinus elongatus Vesícula biliar Adriano et al. (2014) Myxidium cholecysticum Astyanax scabripinnis Vesícula biliar Cordeiro e Gioia (1990) Myxidium cruzi Triportheus nematurus Vesícula biliar Penido (1927) Myxidium fonsecai Erichthonius fasciatus Vesícula biliar Penido (1927) Myxidium gurgeli Acestrorhamphus sp. Vesícula biliar Pinto (1928) Myxidium striatum Menticirrhus americanos Vesícula biliar Cunha e Fonseca (1917) Myxidium volitans Dactylopterus volitans Vesícula biliar Azevedo et al. (2011b) 26 Myxobolus absonus Pimelodus maculatus Cavidade opercular Cellere et al. (2002) Myxobolus arariensis Rhamdia quelen Músculos Abrunhosa et al. (2018) Myxobolus associatus Hypomasticus mormyrops Rins Nemeczek (1926) Myxobolus aureus Salminus brasiliensis Fígado Carriero et al. (2013) Myxobolus batalhensis Salminus hilarii Ovário e fígado Vieira et al. (2017) Myxobolus braziliensis Bunocephalus coracoideus Brânquias Casal et al. (1996) Myxobolus brycon Brycon hilarii Brânquias Azevedo et al. (2011c) Myxobolus colossomatis Colossoma macropomum Brânquias, fígado e músculos Molnár e Békési (1993) Myxobolus chondrophilus Sardinella aurita Brânquias Nemeczek (1926) Myxobolus cordeiroi Zungaro jahu Brânquias, pele, serosa, bexiga urinária, olho Adriano et al. (2009) Myxobolus cuneus Piaractus mesopotamicus Brânquias, pele, nadadeira e órgãos internos Adriano et al. (2006) Myxobolus cunhai Synodontis clarias Intestino Penido (1927) Myxobolus curimatae Prochilodus costatus Brânquias Zatti et al. (2015) Myxobolus desaequalis Apteronotus albifrons Brânquias Azevedo et al. (2002) Myxobolus figueirae Phractocephalus hemioliopterus Pele Naldoni et al. (2018) Myxobolus filamentum Brycon orthotaenia Brânquias Naldoni et al. (2015) Myxobolus flavus Pseudoplatystoma corruscans Brânquias Carriero et al. (2013) 27 Myxobolus franciscoi Prochilodus argenteus Nadadeiras Eiras et al. (2010) Myxobolus heckelii Centromochlus heckelii Brânquias Azevedo et al. (2009c) Myxobolus hilarii Brycon hilarii Túbulos renais Capodifoglio et al. (2016) Myxobolus iecoris Salminus franciscanus Fígado Naldoni et al. (2019) Myxobolus imparfinis Imparfinis mirini Brânquias Vieira et al. (2018) Myxobolus inaequus Eigenmannia virescens Cérebro Kent e Hoffman (1984) Myxobolus insignis Semaprochilodus insignis Brânquias Eiras et al. (2005) Myxobolus kudoi Nemathognata sp. Integumento Guimaraes e Bergamin (1938) Myxobolus lienis Brycon orthotaenia Baço Naldoni et al. (2019) Myxobolus longissimus Colossoma macropomum Estômago e arco branquial Capodifoglio et al. (2019) Myxobolus lutzi Poecilia vivipara Testiculos Aragão (1919) Myxobolus macroplasmodialis Salminus brasiliensis Cavidade abdominal Molnár et al. (1998) Myxobolus maculatus Metynnis maculatus Rins Casal et al. (2002) Myxobolus marajoensis Rhamdia quelen Músculo do intestino Abrunhosa et al. (2017) Myxobolus matosi Colossoma macropomum Opérculo Capodifoglio et al. (2019) Myxobolus metynnis Metynnis argenteus Tecido subcutâneo da região opercular Casal et al. (2006) Myxobolus myleus Myloplus rubripinnis Vesícula biliar Azevedo et al. (2012) 28 Myxobolus niger Corydoras melini Brânquias Mathews et al. (2016c) Myxobolus noguchii Serrasalmus spilopleura Brânquias Pinto (1928) Myxobolus oliveirai Brycon hilarii Brânquias Milanin et al. (2010) Myxobolus orthotaenae Brycon orthotaenia Fígado Naldoni et al. (2020) Myxobolus ovarium Brycon orthotaenia Ovário Naldoni et al. (2020) Myxobolus pantanalis Salminus brasiliensis Brânquias Carriero et al. (2013) Myxobolus peculiaris Cyphocharax nagelii Brânquias Martins e Oanaka (2006) Myxobolus piraputangae Brycon hilarii Rins Carriero et al. (2013) Myxobolus platanus Mugil platanus Baço Eiras et al. (2007) Myxobolus porofilus Prochilodus lineatus Cavidade visceral Adriano et al. (2002) Myxobolus prochilodus Prochilodus lineatus Brânquias Azevedo et al. (2014) Myxobolus pygocentrus Pygocentrus piraya Intestino Penido (1927) Myxobolus salminus Salminus brasiliensis Brânquias Adriano et al. (2009b) Myxobolus sciades Sciades herzbergii Brânquias Azevedo et al. (2010) Myxobolus serrasalmi Serrasalmus rhombeus Baço, fígado e rins Walliker (1969) Myxobolus stokesi Pimelodus sp. Tecido subcutâneo da narina Pinto (1928) Myxobolus tapajosi Brachyplatystoma rousseauxii Brânquias Zatti et al. (2018) 29 Myxobolus testicularis Hemiodus microlepis Testículos Tadjari et al. (2005) Myxobolus umidus Brycon hilarii Baço Carriero et al. (2013) Sinuolinea niloticus Oreochromis niloticus Diversos órgãos internos Rodrigues et al. (2016) Sphaerospora chagasi Leptopelis ocellatus Ductos urinários Gunter e Adlard (2010) Tetrauronema desaequalis Hoplias malabaricus Nadadeiras Azevedo e Matos (1996b) Thelohanellus lepturus Hypopygus lepturus Cérebro e medula espinhal Azevedo et al. (2018) Thelohanellus marginatus Hypophthalmus marginatus Brânquias Rocha et al. (2014b) Triangulamyxa amazonica Sphaeroides testudineus Intestino Azevedo et al. (2005) Unicauda whippsi Astyanax lacustris (sin. A. altiparanae) Rins Vidal et al. (2018) Objetivos 30 OBJETIVOS Geral Realizar um estudo taxonômico e filogenético sobre os mixozoários parasitos das espécies de peixes mais comumente encontradas no rio Batalha e no rio Tietê, através da caracterização morfológica e molecular. Específicos I. Realizar análise filogenética (filogenia molecular) de novas espécies de mixozoários, propondo hipóteses sobre as posições filogenéticas em relação aos parasitos de peixes de água doce da América do Sul e em relação às espécies de mixosporídeos de outros continentes. II. Identificar as principais alterações histológicas causadas pelos mixozoários e, através de análises ultraestruturais, identificar as relações parasito-hospedeiro. Através dessas análises, identificar uma possível patogenicidade causada pelos parasitos. III. Realizar uma ampla análise filogenética, incluindo todas as espécies de mixozoários da família Myxobolidae que parasitam peixes do Brasil, visando inferir relações e preferências referentes ao parasitismo dentro desse grupo de parasitos. Material e métodos 32 MATERIAL E MÉTODOS Espécies de hospedeiros estudadas As coletas dos peixes foram realizadas com autorização do SISBIO e do Ministério do Meio Ambiente (no 40998-2) e com autorização do comitê de ética (CEUA 9530230816). Foi feita uma análise parasitária de espécies de peixes dominantes nos rios Batalha e Tietê. As espécies P. lineatus, S. hilarii, A. lacustris, L. fridericii e C. modestus foram escolhidas pois são abundantes no rio Batalha e Tietê e por apresentarem alta prevalência de mixozoários parasitando seus órgãos, como constatado em estudos prévios. Coleta dos hospedeiros Foram realizadas quatro coletas de peixes no rio Batalha, município de Reginópolis, Estado de São Paulo, Brasil. No rio Tietê, município de Uru, Estado de São Paulo, Brasil, também foram realizadas quatro coletas de peixes. Para a captura dos peixes, foram utilizadas redes de espera simples de diferentes malhas (redes de 2 a 10 cm, entre nós alternados). Outros aparatos de captura dos hospedeiros, como as redes de arrasto e o peneirão, também foram utilizados. As coletas de peixes foram realizadas com apoio técnico e logístico de uma equipe de pescadores locais. Após a coleta de cada espécime de hospedeiro e sua identificação específica, foram registradas as seguintes informações: data e ponto da amostragem, comprimento padrão (cm), peso total (g) e sexo. As informações foram obtidas com paquímetro metálico e balança dinanométrica. Os peixes foram analisados ainda em campo, sendo que alguns espécimes foram embalados em sacos individuais e congelados para possíveis análises posteriores em laboratório. Referências 35 REFERÊNCIAS Abdallah, V. D., de Azevedo, R. K., Luque, J. L., & do Bomfim, T. C. 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Capítulo 1 61 Capítulo 1 – Artigo submetido na revista Parasitology Research Morphological and molecular analysis of Henneguya sp. 1 (Cnidaria: Myxosporea), parasitizing the gill filaments of Prochilodus lineatus (Valenciennes 1837) from Brazil Abstract The present study describes Henneguya sp. 1 parasitizing Prochilodus lineatus from Brazil, through morphological and molecular analysis. Myxospores were found in the gill tissue of P. lineatus with a 10% prevalence of infection. The myxospores were elongated and ellipsoidal, consisted of two elongate, elliptical shell valves with long, tapering caudal appendage. The morphology was consistent with Henneguya genus and measured as follows (mean ± SD): total length 55.3 ± 2.2 μm, body length 16.1 ± 1.0 μm, body width 5.5 ± 0.2 μm, caudal appendage length 38.7 ± 2.4 μm and thickness 3.7 ± 0.6 μm. The polar capsules were 7.2 ± 0.4 long, 1.6 ± 0.3 μm wide and contained a polar filament coiled 11 to 13 turns. Histological analysis showed the plasmodia developing in the middle region of each gill filament and caused a focally extensive distension by forming a space-occupying mass within the gill filament. The ultrastructural analysis allowed the observation of the presence of mature myxospores throughout the plasmodium. Phylogenetic analysis showed Henneguya sp. 1 as a sister species of the subclade formed by Henneguya piaractus and Henneguya sp. that infect fish of the genus Piaractus. The genetically closest species was H. piaractus, which showed a similarity of 82.4%. Using molecular and morphological characterization, the myxozoan parasite described herein represents a new species of the genus Henneguya. Keywords: Characiformes, Myxobolidae, phylogeny, Tietê river. 62 Introduction Myxozoans are cnidarians with a complex life cycle, alternating between vertebrate hosts in the myxospore phase and invertebrate hosts in the actinospore phase (Okamura et al. 2015). Several species of myxozoans have been reported as important fish pathogens (Molnár et al. 1998; El-Mansy and Bashtar 2002; Yokoyama et al. 2003; Griffin et al. 2008). Within the genus Henneguya Thélohan 1892 several species have been characterized as pathologies in their hosts (Eiras and Adriano 2012). Henneguya pellis Minchew 1977, which causes complete or partial loss of the epidermis in Ictalurus furcatus (Valenciennes 1840), Henneguya ghaffari Abdel-Baki, Sakran, Zayed and Al-Quraishy 2014, which causes epithelial hyperplasia and atrophy of the respiratory lamellae in Lates niloticus (Linnaeus 1758), and Henneguya sp., which causes skin nodules in Cyphocharax modestus (Fernández-Yépez 1948), are some examples (Griffin et al. 2009; Abdel-Baki et al. 2014; Vieira et al. 2019). In South America, there are reports of species of Henneguya spp. infecting the gills of their hosts and generating pathologies. Examples include Henneguya sp. which causes henneguyosis in the gills of Metynnis hypsauchen (Müller and Troschel 1844), Henneguya hemiodopsis Azevedo, Casal, Mendonça and Matos 2009 which causes local atrophy and deformation of the gill lamellae in Hemiodopsis microlepis Kner 1858, and Henneguya cuniculator Naldoni, Maia, Silva and Adriano 2014, which causes lamellar fusion in areas affected by the growth of the plasmodium in Pseudoplatystoma corruscans (Spix and Agassiz 1829) (Azevedo et al. 2009; Naldoni et al. 2014; Figueredo et al. 2019). In addition, studies have reported the dilatation of the infected lamellae, reduction of the epithelial surface area, and the presence of club cells (Martins et al. 1997; Naldoni et al. 2009; Adriano et al. 2012). 63 Prochilodus lineatus (Valenciennes 1837) is a fish species from Central and South America that inhabits the Paraná River and Paraguay River basin, the Paraíba do Sul River in Brazil and the San Juan River in Nicaragua. It is a migratory species of great economic importance to both fisheries and aquaculture (Froese and Pauly 2019). Two species of Henneguya have been recorded parasitizing the gills of P. lineatus: Henneguya caudalongula Adriano, Arana and Cordeiro 2005 and Henneguya paranaensis Eiras, Pavaneli and Takemoto 2004 (Eiras et al. 2004b; Adriano et al. 2005). Three species of Myxobolus Bütschli 1882 have been recorded parasitizing Prochilodus spp.: Myxobolus porofilus Adriano, Arana, Ceccarelli and Cordeiro 2002 parasitizing the visceral cavity of P. lineatus; Myxobolus prochilodus Azevedo, Vieira, Vieira, Silva, Matos and Abdallah 2014 parasitizing the gills of P. lineatus; and Myxobolus curimatae Zatti, Naldoni, Silva, Maia and Adriano 2015 parasitizing the gills of Prochilodus costatus Valenciennes 1850 (Adriano et al. 2002; Azevedo et al. 2014; Zatti et al. 2015). During parasitological research studying the biodiversity of myxozoans from P. lineatus from the Tietê River, plasmodia containing myxospores were found parasitizing the gills. The present study aimed to characterize the morphology, as well as the molecular characteristics (SSU rDNA sequences) and phylogeny of Henneguya sp. 1 from Brazil. Material and methods Study site and host collection Mature specimens of P. lineatus (n = 30, 22 females / 8 males) were collected (10 in March 2017, 10 in July 2018 and 10 in December 2019) from Uru, on the Tietê River, São Paulo, Brazil (21°44'09.1"S, 49°07'10.2"W). The Tietê River is one of the 64 most economically important rivers in Brazil and is best known for its environmental problems, especially where it flows into the city of São Paulo (Silva et al. 2002). To the authors' knowledge, no studies of myxozoan biodiversity have been performed in this river. Fish were collected using nets and were euthanized by an overdose of benzocaine solution (70 mg L−1). The specimens were examined and fresh smears of the gills were evaluated in search of plasmodia containing myxospores under a differential interference contrast microscope (Leica DMLB 5000, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) with a magnification of 1000×. Morphometric analysis confirmed that all myxospores present in the plasmodia were the same species. Samples of the gills infected with myxospores with morphological characteristics of the genus Henneguya were collected for further morphological and molecular analysis. Morphological analysis The morphological measurements of the fresh myxospores followed the recommendations of Lom and Arthur (1989). The measurements of 30 myxospores, from one specimen of P. lineatus, were obtained from 1000× magnification digital images under light microscopy using the Leica LAS V3.8 software application (Leica Microsystems, Germany). For transmission electron microscopy (TEM), gill fragments from the same fish specimen containing plasmodia were fixed in Karnovsky solution at 4 °C for 10 h. After rinsing, the tissue was postfixed in 2% osmium tetroxide for 3 h at 4 °C. Subsequently, the tissue was immersed in 0.5% uranyl acetate in distilled water for 2 h. Tissue fragments were dehydrated through an upward ethanol series followed by propylene oxide and incorporated into the Epon resin. Semi-thin sections were stained with methylene azure II blue and observed under differential interference contrast 65 microscopy. Ultra-thin sections were double stained with aqueous uranyl acetate and lead citrate and observed under a 60 kV operated JEOL 100CXII. For histological analysis, infected gill arches from the same fish specimen were fixed in 5% formaldehyde for one week and dehydration was subsequently initiated at increasing ethanol concentrations (3 × 70% for 2h and 95% for 4h). The material was subjected to an alcohol-resin mixture for 12 h and the tissue was then embedded in resin (HistoResin, Leica, Germany). Sections with 3 μm were stained with hematoxylin-eosin and then examined under a light microscope. Molecular analysis Gill samples from two different host specimens containing myxozoan plasmodia, one of which was collected from the same host specimen used in the morphometry, were submitted to the DNA extraction process. Extraction was performed according to the GenElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit protocol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for DNA extraction from the small organi