UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CAMPUS DE JABOTICABAL TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE CO2 DURANTE A INCUBAÇÃO INTERFEREM NA MORFOFISIOLOGIA DO SISTEMA DIGESTÓRIO DE FRANGOS DE CORTE Lilian Francisco Arantes de Souza Médica Veterinária 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CAMPUS DE JABOTICABAL TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE CO2 DURANTE A INCUBAÇÃO INTERFEREM NA MORFOFISIOLOGIA DO SISTEMA DIGESTÓRIO DE FRANGOS DE CORTE Lilian Francisco Arantes de Souza Orientador: Prof. Dr. Renato Luis Furlan Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Macari Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Zootecnia. Souza, Lilian Francisco Arantes de S729t Temperatura e concentração de CO2 durante a incubação interferem na morfofisiologia do sistema digestório de frangos de corte. / Lilian Francisco Arantes de Souza. – – Jaboticabal, 2013 xiv, 141 f. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2013 Orientador: Renato Luis Furlan Banca examinadora: Isabel Cristina Boleli, Lizandra Amoroso, José Fernando Machado Menten, José Roberto Sartori Bibliografia 1. Digestão. 2. Eclodibilidade. 3. Hipercapnia. 4. Temperatura I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 636.5:636.082.47 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DA AUTORA LILIAN FRANCISCO ARANTES DE SOUZA – nascida na cidade de Barretos/SP aos 28 de setembro de 1981. Ingressou na Universidade Estadual de Londrina – UEL em fevereiro de 2001, colando grau de Médica Veterinária em janeiro de 2006. Em agosto do mesmo ano iniciou o curso de Mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, campus de Jaboticabal, sendo aprovada pela banca examinadora em janeiro de 2009. Em março de 2009 iniciou o curso de Doutorado pelo Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, campus de Jaboticabal sendo aprovada pela banca examinadora em fevereiro de 2013. “Ando devagar porque já tive pressa E levo esse sorriso porque já chorei demais Hoje me sinto mais forte Mais feliz, quem sabe Eu só levo a certeza de que muito pouco eu sei E nada sei Conhecer as manhas e as manhãs O sabor das massas e das maçãs É preciso amor pra poder pulsar É preciso paz pra poder seguir É preciso chuva para florir Penso que cumprir a vida seja simplesmente Compreender a marcha E ir tocando em frente Como um velho boiadeiro levando a boiada Eu vou tocando os dias pela longa estrada Eu sou, estrada eu vou Conhecer as manhas e as manhãs O sabor das massas e das maçãs É preciso amor pra poder pulsar É preciso paz pra poder sorrir É preciso chuva para florir Todo mundo ama um dia Todo mundo chora Um dia a gente chega Um outro vai embora Cada um de nós compõe a sua história E cada ser em si carrega o dom de ser capaz De ser feliz...” Almir Sater e Renato Teixeira AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus por todas as graças recebidas diariamente, pelo aprendizado constante e por minha linda família. Ao Professor Doutor Renato Luis Furlan pela compreensão e orientação. Ao Professor Doutor Marcos Macari pela inestimável ajuda, desde a elaboração do projeto até a discussão dos resultados. Minha eterna gratidão e admiração. Ao Professor Doutor João Martins Pizauro Júnior, por sua atenção e paciência, contribuindo para minha formação desde o mestrado. Às Professoras Doutoras Kênia Cardoso Bícego e Luciane Helena Gargaglione Batalhão pela valiosa contribuição, amizade e solidariedade. Não tenho palavras para agradecer a ajuda de vocês. Aos Professores Doutores Isabel Cristina Boleli, Lizandra Amoroso, José Fernando Machado Menten e José Roberto Sartori pelas valiosas contribuições como membros da banca. À Professora Doutora Silvana Martinez Baraldi Artoni pelas contribuições no Exame Geral de Qualificação. Ao meu alicerce familiar. Primeiramente à minha mãe, Haideé Francisco Arantes de Souza, meu grande exemplo de força, por seu apoio constante, amor incondicional, dedicação e valiosa ajuda com o experimento e análises laboratoriais. Ao meu pai, Izaú Arantes de Souza Filho, por seu carinho, interesse e apoio diário. Aos meus queridos irmãos, Lucas, Lígia e Lívia Francisco Arantes de Souza, que me ensinaram o valor da amizade eterna e são grandes exemplos para mim. Eu amo muito cada um de vocês. Ao meu amor, Daniel Alexandre Ramiro, pela força e dedicação nos momentos mais difíceis, quando eu achei que não iria conseguir você esteve ao meu lado, trazendo paz, tranquilidade e confiança. Monstro, minha vida é muito feliz com você fazendo parte dela. Eu amo muito você. Às minhas grandes amigas Lara Silva do Amaral, Bárbara Rodrigues Nogueira e Lívia Pegoraro Espinha, pela inestimável ajuda. Vocês foram grandes companheiras durante todos os momentos e serei eternamente grata a vocês. Contem sempre comigo. Aos queridos amigos e companheiros de jornada, Aretuza Carregari Capalbo, Fabrício Hirota Hada, Eduardo Alves de Almeida, Paula Toro Velasquez, Daniel Mendes Borges Campos, Wedson Carlos Lima Nogueira, Miguel Frederico Fernandez Alarcon, Fernando Augusto de Souza, Miryelle Freire Sarcinelli, Katiane silva Venturini, César Martoreli da Silveira, Marcos Gonçalves de Souza, Viviane de Souza Morita, Vitor Rosa de Almeida, Tamiris Iara Vicentini e Raquel Lunedo, pela valiosa e indispensável ajuda na condução dos experimentos e análises laboratoriais, além dos agradáveis momentos de convivência. Muito obrigada, sem vocês seria impossível. À Ligia Francisco Arantes de Souza pela ajuda com a revisão e fotos de microscopia. Ao Professor Doutor João Waine Pinheiro, pelos conhecimentos transmitidos na graduação, pelo contato com a avicultura e por ser um exemplo pra mim. Aos alunos do Colégio Técnico Agrícola “José Bonifácio” Kaiki Henrique de Almeida da Silva, Laura Silva Penariol, Marina Carla Bezerra e Jéssica Cristina dos Santos Marques, pela ajuda na condução dos experimentos. À família Ramiro, Iraci Guadanhin Ramiro (Dê), Senhor Sebastião Ramiro e Elisa Santana Ramiro por me acolherem como parte da família. Á equipe do Laboratório de Bioquímica do Departamento de Tecnologia. À querida Fátima Aparecida Ribeiro Harnich pela valiosa ajuda e amizade desde o mestrado. Fá, você é especial. Cecília Maria Costa do Amaral, Luiz Flávio José dos Santos, Adriano Marques Gonçalves, Caroline Carla Santana, Maria Cecília Pereira e Rafael Rodrigues Colosio, minha gratidão pelas análises enzimáticas. À querida Claudinha, pela amizade, atenção e grande ajuda nas análises de varredura. Muito obrigada, Claudinha. Ao senhor Orandi, pelos ensinamentos transmitidos e pela alegria e paciência. Ao Euclides pelo grande apoio durante todos os momentos e pela agradável convivência. Ao Robson e Izildo, do Setor de Avicultura pela ajuda durante o período experimental. À Ana Claudia Ambiel Corral Camargo, pelo grande apoio nos últimos quatro anos. Serei eternamente grata por sua amizade e confiança, sem os quais esse período seria muito mais difícil. Meu carinho e gratidão. A minha querida amiga Denise Nunes Araújo, pela ajuda indireta e pela agradável amizade. Gorducha, sinto muito sua falta. Às minhas queridas amigas Vivian Biancardi, Brisa Fregonesi, Vanessa de Souza Moreno e Marilice Zundt. A amizade torna os momentos difíceis mais leves. Ao Conselho Nacional de Pesquisa, pela bolsa concedida. A todas as pessoas que participaram de minha vida contribuindo para minha formação profissional e pessoal. i SUMÁRIO Página RESUMO.....................................................................................................................iii LISTA DE TABELAS....................................................................................................xi LISTA DE FIGURAS...................................................................................................vii CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................1 REFERÊNCIAS............................................................................................................9 CAPÍTULO 2 – TEMPERATURAS DE INCUBAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO MORFOFISIOLÓGICO DO SISTEMA DIGESTÓRIO DE FETOS E PINTOS DE MATRIZES PESADAS DE DIFERENTES IDADES...................................................19 INTRODUÇÃO...........................................................................................................21 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................23 RESULTADOS...........................................................................................................30 DISCUSSÃO..............................................................................................................66 CONCLUSÃO.............................................................................................................74 REFERÊNCIAS..........................................................................................................75 CAPÍTULO 3 – CONCENTRAÇÕES DE CO2 DURANTE A INCUBAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO MORFOFISIOLÓGICO DO SISTEMA DIGESTÓRIO DE FETOS E PINTOS ORIUNDOS DE OVOS DE MATRIZES DE DIFERENTES IDADES......................................................................................................................83 INTRODUÇÃO...........................................................................................................85 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................86 RESULTADOS...........................................................................................................93 DISCUSSÃO............................................................................................................128 CONCLUSÃO...........................................................................................................134 REFERÊNCIAS........................................................................................................135 CAPÍTULO 4 – IMPLICAÇÕES................................................................................141 ii iii TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE CO2 DURANTE A INCUBAÇÃO INTERFEREM NA MORFOFISIOLOGIA DO SISTEMA DIGESTÓRIO DE FRANGOS DE CORTE RESUMO - O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da temperatura e da concentração de CO2 durante a incubação sobre o desenvolvimento morfofisiológico do sistema digestório de frangos de corte durante a fase fetal e pré-inicial. Foram realizados dois experimentos, cada um com 1296 ovos férteis de matrizes Cobb, metade com 35 semanas (jovens) e metade com 55 semanas (velhas). No experimento 1 os ovos foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado (DIC) em três incubadoras mantidas a 37,5˚C até o nono dia de incubação. A partir do décimo dia as temperaturas foram alteradas correspondendo a 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C em cada incubadora até o final da incubação. No experimento 2 os ovos foram distribuídos em DIC em três incubadoras, uma mantida sem injeção de CO2 durante todo o período de incubação e as outras receberam injeções contínuas e crescentes de CO2 até atingir 1% e 1,5% de CO2 cada uma, até o décimo dia de incubação. Todas as incubadoras foram mantidas em condições normais de ventilação durante todo o período de incubação. Foram avaliados: eclodibilidade, eclosão, qualidade do pinto, o período médio e a duração de bicagem interna, externa e nascimento, o crescimento alométrico dos órgãos do sistema digestório dos fetos (16, 18 e 20 dias de incubação) e dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida), o desenvolvimento da mucosa intestinal dos fetos (16, 18 e 20 dias de incubação) e dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida) e a atividade de enzimas pancreáticas dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida). No experimento 1, não houve efeito das temperaturas de incubação sobre a eclosão, eclodibilidade e qualidade dos pintos nas duas idades de matrizes avaliadas. As temperaturas de incubação de 38,5˚C e 36,5˚C causaram, respectivamente, diminuição e aumento do período médio de bicagem interna, externa e nascimento. O peso dos fetos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C apresentou-se menor em relação à temperatura de 37,5˚C aos 18 dias, bem como aos 20 dias para fetos de matrizes de 35 e 55 semanas. Fetos aos 20 dias e pintos de 1 dia de matrizes de 35 semanas incubados em 36,5˚C e 38,5˚C apresentaram maior porcentagem de vitelo. Aos 16 dias, a incubação em temperatura de 36,5˚C resultou em menor porcentagem de pâncreas e moela nos fetos de matrizes de 35 e 55 semanas, respectivamente. Aos 16 e 20 dias a incubação em temperatura de 36,5˚C causou menor porcentagem de intestinos nos fetos de matrizes de 35 semanas. A incubação em temperatura de 38,5˚C e 36,5˚C influenciaram negativamente a altura e densidade dos vilos nos segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) com maior intensidade para 36,5˚C, nas duas idades de matrizes avaliadas, principalmente na fase fetal e nos pintos recém-eclodidos. A incubação em temperatura de 36,5˚C prejudicou a atividade enzimática total e específica da amilase e tripsina. No experimento 2, as condições de incubação utilizadas não influenciaram a eclodibilidade, eclosão ou qualidade dos pintos. Entretanto, a concentração de 1,5% de CO2 prolongou no período médio de bicagem interna, externa e nascimento em relação aos grupos controle e em concentração de 1% de CO2. Aos 16 dias de incubação, observou-se maior peso dos fetos de matrizes de 35 semanas incubados em 1% de CO2 em comparação ao controle, ambos não diferindo de 1,5%. Pintos de 1 dia oriundo de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em 1,5% de CO2 apresentaram maior proporção de vitelo iv e menor porcentagem de moela, pâncreas e intestino. Aos 7 dias, a incubação em 1,5% de CO2 causou redução na porcentagem de intestinos em pintos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas em comparação ao grupo controle e à concentração de 1% de CO2. Nas duas idades de matrizes, a incubação em 1% de CO2 estimulou o desenvolvimento dos vilos intestinais em fetos e pintos após a eclosão por meio de aumento na altura dos vilos e menor densidade de vilos no intestino delgado, enquanto a concentração de 1,5% prejudicou esses parâmetros. Pintos de 1 dia provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 de 1% apresentaram maior atividade de amilase total e tripsina total em relação aos pintos incubados em 1,5%, ambos não diferindo do controle. Independentemente da idade da matriz, aos 7 dias, a incubação em 1,5% resultou em menor atividade de amilase específica e total em relação ao controle e à concentração de 1%. Assim, a incubação em temperatura de 36,5˚C ou 38,5˚C afetou negativamente o desenvolvimento digestório em fetos e pintos, bem como a incubação em concentração de 1,5% de CO2. Por outro lado, a incubação em concentração de 1% de CO2 nos primeiros 10 dias influenciou positivamente o desenvolvimento do sistema digestório em fetos em pintos. Palavras-chave: digestão, eclodibilidade, hipercapnia, temperatura v TEMPERATURE AND CO2 CONCENTRATION DURING INCUBATION AFFECT THE MORPHOPHYSIOLOGY OF DIGESTIVE SYSTEM OF BROILER CHICKEN ABSTRACT - The aim of this study was to evaluate the effect of temperature and CO2 concentration during incubation on morphophysiological development of digestive system of broiler breeders during fetal and pre-starter stages. Two experiments were conducted, each with 1296 fertile eggs of Cobb broiler breeders, half at 35 weeks (young) and half at 55 weeks (old). In experiment 1, the eggs were distributed in a completely randomized design in three incubators maintained at 37.5˚C until the ninth day of incubation. From the tenth day the temperatures were changed to 36.5˚C, 37.5˚C and 38.5˚C in each incubator until the end of incubation. In experiment 2, the eggs were divided in completely randomized design in three incubators, one group was maintained without CO2 injection during the whole incubation period and other groups received CO2 increasing and continuous injections until CO2 concentration reached 1% for the first and 1,5% for the second, until the tenth days of incubation. All incubators were kept under normal conditions of ventilation during the entire incubation period. Was evaluated: hatchability, hatching, chick quality, the average time and duration of internal and external pecking and birth, allometric growth of fetuses digestive organs (16, 18 and 20 days of incubation) and chicks digestive organs (1 , 4 and 7 days of life), the intestinal mucosa development of fetuses (16, 18 and 20 days of incubation) and chicks (1, 4 and 7 days old) and the activity of chicks pancreatic enzymes (1, 4 and 7 days of life). In experiment 1, there was no effect of incubation temperatures on hatching, hatchability and chick quality regardless of the age of the breeder. The incubation in 38.5˚C and 36.5˚C temperatures caused respectively a decrease and increase in the average period of internal and external pecking and birth. The weight of 35 weeks breeders fetuses, incubated in cold temperature, was lower than for the control temperature at 18 days, just as the weight at 20 days of 35 and 55 weeks breeders fetuses. 20 days fetuses and 1 day old chicks of 35 weeks breeders, incubated at 36.5˚C and 38.5˚C, had higher yolk sac. At 16 days, incubation in 36.5˚C resulted in a lower rate of pancreas and gizzard of 35 and 55 weeks breeders, respectively. At 16 and 20 days the incubation in 36.5˚C caused a lower rate of intestines in fetuses of 35 weeks broiler breeders. The incubation in 36.5˚C or 38.5˚C influenced negatively the height and density of villi in intestinal segments (duodenum, jejunum and ileum) with higher intensity in 36.5˚C, regardless of the broiler breeders age, mainly in fetal stage and in newly hatched chicks. Incubation in 36.5˚C damaged the total and specific enzyme activity of amylase and trypsin. In experiment 2, the incubation conditions used did not affect hatchability, hatching and chick quality. However, 1.5% CO2 concentration caused an elongation at the average period of internal and external pipping and birth compared to the control groups and to 1% CO2 concentration. At 16 days of incubation, there was an increase in the fetuses weight of 35 weeks breeders, incubated in 1% CO2 concentration, in comparison to the control, neither of differing 1.5%. 1 day old chicks from eggs of 35 weeks breeders, incubated in 1.5% CO2 concentration, had higher proportion of yolk and lowest percentage of gizzard, pancreas and intestine. At 7 days, the incubation in 1.5% CO2 concentration caused a reduction in the rate of intestine in chicks from eggs of 35 weeks breeders compared to the control group and to the group in 1% CO2 vi concentration. Regardless of breeders’ age, incubation in 1% CO2 concentration stimulated the development of intestinal villi in fetuses and post-hatch chicks by increasing villous height and lower density of small intestine villi, while the 1.5% concentration of CO2 decreased these parameters. 1 day old chicks from 35 weeks breeder incubated in 1% CO2 concentration, had higher activity of total amylase and total trypsin than in chicks incubated in 1.5% CO2 concentration, both not different from the control group. Regardless of breeder age, at 7 days the incubation in 1.5% resulted in lower activity of specific and total amylase in comparison to control group and the 1% CO2 concentration group. Thus, the incubation at 36.5, 37.5˚C and 1.5% CO2 affects negatively the digestive development in fetuses and chicks, but the incubation in 1% CO2 concentration in the first 10 days can influence positively the digestive system development in fetuses and chicks. Keywords: digestion, hatchability, hypercapnia, temperature vii LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 2 Página Tabela 1 - Atribuição dos escores a diferentes parâmetros observados...................24 Tabela 2 – Porcentagem de eclosão (%) e eclodibilidade (%) e escore médio de qualidade dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas.........................30 Tabela 3 – Porcentagem de eclosão (%) e eclodibilidade (%) e escore médio de qualidade dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas.........................30 Tabela 4 – Tempo médio de bicagem interna (horas), bicagem externa (horas), nascimento (horas), duração da bicagem interna (horas), bicagem externa (horas) e nascimento (horas) de pintos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas.....30 Tabela 5 – Tempo médio de bicagem interna (horas), bicagem externa (horas), nascimento (horas), duração da bicagem interna (horas), bicagem externa (horas) e nascimento (horas) de pintos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas.....31 Tabela 6 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 16 dias de incubação............................33 Tabela 7 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 16 dias de incubação............................33 Tabela 8 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 18 dias de incubação............................34 Tabela 9 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 18 dias de incubação............................34 Tabela 10 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 20 dias de incubação............................34 Tabela 11 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas aos 20 dias de incubação............................35 Tabela 12 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas com 1 dia de vida........................................35 viii Tabela 13 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas com 1 dia de vida.........................................36 Tabela 14 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas com 4 dias de vida.......................................36 Tabela 15 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas com 4 dias de vida.......................................37 Tabela 16 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas com 7 dias de vida.......................................37 Tabela 17 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas com 7 dias de vida.......................................37 Tabela 18 – Profundidade de criptas (μm) do duodeno, jejuno e íleo de pintainhos de 1, 4 e 7 dias de idade oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes temperaturas..............................................................................................................53 Tabela 19 – Profundidade de criptas (μm) do duodeno, jejuno e íleo de pintainhos de 1, 4 e 7 dias de idade oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes temperaturas..............................................................................................................53 Tabela 20 – Densidade de vilos intestinais (número de vilos/mm2) no duodeno, jejuno e íleo de fetos aos 20 dias de incubação e pintos aos 1, 4 e 7 dias oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas...............................................................................55 Tabela 21 – Densidade de vilos intestinais (número de vilos/mm2) no duodeno, jejuno e íleo de fetos aos 20 dias de incubação e pintos aos 1, 4 e 7 dias oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas...............................................................................56 Tabela 22 – Atividade enzimática específica (U.mg-1) e total (U.g-1) da tripsina e amilase pancreáticas dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas aos 1, 4 e 7 dias de vida.......................................................................................................65 Tabela 23 – Atividade enzimática específica (U.mg-1) e total (U.g-1) da tripsina e amilase pancreáticas dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas aos 1, 4 e 7 dias de vida.......................................................................................................65 ix CAPÍTULO 3 Página Tabela 1 - Atribuição dos escores a diferentes parâmetros observados...................88 Tabela 2 – Porcentagem de eclosão (%) e eclodibilidade (%) e escore médio de qualidade dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas.........................94 Tabela 3 – Porcentagem de eclosão (%) e eclodibilidade (%) e escore médio de qualidade dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas.........................94 Tabela 4 – Tempo médio de bicagem interna (horas), bicagem externa (horas), nascimento (horas), duração da bicagem interna (horas), bicagem externa (horas) e nascimento (horas) de pintos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas.....95 Tabela 5 – Tempo médio de bicagem interna (horas), bicagem externa (horas), nascimento (horas), duração da bicagem interna (horas), bicagem externa (horas) e nascimento (horas) de pintos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas.....95 Tabela 6 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 16 dias de incubação.............97 Tabela 7 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 16 dias de incubação.............97 Tabela 8 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 18 dias de incubação.............97 Tabela 9 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 18 dias de incubação.............98 Tabela 10 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 20 dias de incubação.............98 Tabela 11 – Peso do feto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado e intestinos de fetos provenientes de ovos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 aos 20 dias de incubação.............98 Tabela 12 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 1 dia de vida..........................99 x Tabela 13 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 1 dia de vida..........................99 Tabela 14 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 4 dias de vida........................99 Tabela 15 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 4 dias de vida......................100 Tabela 16 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 7 dias de vida......................100 Tabela 17 – Peso do pinto e porcentagem do saco de vitelo, proventrículo, moela, fígado, pâncreas e intestinos de pintos provenientes de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2 com 7 dias de vida......................101 Tabela 18 – Profundidade de criptas (μm) do duodeno, jejuno e íleo de pintainhos de 1, 4 e 7 dias de idade oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2.............................................................................................117 Tabela 19 – Profundidade de criptas (μm) do duodeno, jejuno e íleo de pintainhos de 1, 4 e 7 dias de idade oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em diferentes concentrações de CO2.............................................................................................117 Tabela 20 – Densidade de vilos intestinais (número de vilos/mm2) no duodeno, jejuno e íleo de fetos aos 20 dias de incubação e pintos aos 1, 4 e 7 dias oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas.............................................................................118 Tabela 21 – Densidade de vilos intestinais (número de vilos/mm2) no duodeno, jejuno e íleo de fetos aos 20 dias de incubação e pintos aos 1, 4 e 7 dias oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas.............................................................................118 Tabela 22 – Atividade enzimática específica (U.mg-1) e total (U.g-1) da tripsina e amilase pancreáticas dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 35 semanas aos 1, 4 e 7 dias de vida.....................................................................................................127 Tabela 23 – Atividade enzimática específica (U.mg-1) e total (U.g-1) da tripsina e amilase pancreáticas dos pintos oriundos de ovos de matrizes de 55 semanas aos 1, 4 e 7 dias de vida.....................................................................................................127 xi LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 2 Página Figura 1 – Distribuição da eclosão (%) em relação à duração da incubação (h) de pintos provenientes de ovos de matrizes novas (A) e velhas (B) incubados em temperatura de 36,5˚C , 37,5˚C e 38,5˚C .......................................32 Figura 2 – Desenvolvimento dos vilos intestinais do duodeno, jejuno e íleo de fetos de matrizes jovens e velhas incubados em temperatura de 36,5˚C , 37,5˚C e 38,5˚C , aos 16, 18 e 20 dias de incubação...........................................39 Figura 3 – Desenvolvimento dos vilos intestinais do duodeno, jejuno e íleo de pintos de matrizes jovens e velhas incubados em temperatura de 36,5˚C , 37,5˚C e 38,5˚C , aos 1, 4 e 7 dias de idade.........................................................40 Figura 4 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 16 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................41 Figura 5 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 16 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................42 Figura 6 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 18 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................43 Figura 7 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 18 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................44 Figura 8 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................45 Figura 9 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................46 Figura 10 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................47 Figura 11 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................48 xii Figura 12 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................49 Figura 13 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................50 Figura 14 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................51 Figura 15 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C............................................52 Figura 16 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................57 Figura 17 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................58 Figura 18 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................59 Figura 19 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................60 Figura 20 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................61 Figura 21 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................62 Figura 22 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................63 Figura 23 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em temperatura de 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C....................................................................64 xiii CAPÍTULO 3 Página Figura 1 - Concentrações de CO2 durante o processo de incubação.......................86 Figura 2 – Distribuição da eclosão (%) em relação à duração da incubação (h) de pintos provenientes de ovos de matrizes novas (A) e velhas (B) incubados em concentração de CO2 controle , 1% e 1,5% ....................................96 Figura 3 – Desenvolvimento dos vilos intestinais do duodeno, jejuno e íleo de fetos de matrizes jovens e velhas incubados em concentração de CO2 controle , 1% e 1,5% aos 16, 18 e 20 dias de incubação.............................................103 Figura 4 – Desenvolvimento dos vilos intestinais do duodeno, jejuno e íleo de pintos de matrizes jovens e velhas incubados em concentração de CO2 controle , 1% e 1,5% , aos 1, 4 e 7 dias de idade.........................................................104 Figura 5 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 16 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................105 Figura 6 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 16 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................106 Figura 7 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 18 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................107 Figura 8 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 18 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................108 Figura 9 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................109 Figura 10 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................110 Figura 11 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................111 Figura 12 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................112 xiv Figura 13 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................113 Figura 14 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................114 Figura 15 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................115 Figura 16 – Fotomicrografias dos cortes histológicos transversais do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%.......................................116 Figura 17 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................119 Figura 18 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de fetos com 20 dias de incubação, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................120 Figura 19 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................121 Figura 20 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 1 dia de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................122 Figura 21 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................123 Figura 22 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 4 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................124 Figura 23 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 35 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................125 Figura 24 - Fotomicrografias da superfície intestinal do duodeno, jejuno e íleo de pintos com 7 dias de idade, oriundos de matrizes de 55 semanas incubados em concentração de CO2 controle, 1% e 1,5%..............................................................126 1 CAPÍTULO 1 – Considerações Gerais A indústria avícola mundial deverá atender ao aumento na demanda por alimentos. A população mundial está em crescimento e as maiores taxas são observadas nos países em desenvolvimento. Neste sentido, a carne de frango se destaca como fonte de proteína de boa qualidade. Segundo Windhorst (2006), nos últimos 30 anos, o crescimento da produção de carne de frango superou a da carne suína e bovina, em 2 e 7,5 vezes, respectivamente. A carne de frango apresenta vários aspectos positivos que justificam tal crescimento. Um primeiro ponto está relacionado às restrições religiosas ou culturais ao consumo de carnes. Sabe-se que a carne suína apresenta restrições em seu consumo para os judeus e muçulmanos e que os indianos não consomem carne bovina. Outro aspecto positivo está relacionado ao baixo preço da carne de frango em relação às outras carnes. De acordo com o USDA (2011), nos últimos anos as carnes bovina e suína apresentaram preços 200 e 150% superiores ao da carne de frango no varejo, respectivamente. Ainda, a carne de frango é considerada de boa qualidade (FLETCHER, 2002) e não está associada ao desenvolvimento de câncer colorretal em comparação às carnes vermelhas (ENGLISH et al., 2004). Além disso, em relação aos outros tipos de carne, a carne de frango é considerada causadora de menor impacto ambiental (VRIES & BOER, 2010). Para atender à crescente demanda na produção, a avicultura vem mostrando maior produtividade e, grande parte deste cenário deve-se ao melhoramento genético que busca constantes avanços no desempenho do frango de corte. Havenstein et al. (2003) observaram a evolução do desempenho de frangos de corte nas últimas décadas evidenciando aumento no peso vivo, melhora na conversão alimentar, redução da mortalidade e drástica redução na idade ao abate. A duração do período de incubação do ovo de galinha é de aproximadamente 21 dias. Sabendo-se que a idade ao abate do frango de corte atualmente é de aproximadamente 42 dias, o período de incubação representa um terço do tempo de vida dessa ave. Em virtude de tais fatos, atualmente, a incubação vem recebendo atenção especial dos pesquisadores. As perspectivas futuras são de redução na idade ao abate e, consequentemente, o período de incubação será cada vez mais significativo para a avicultura de corte. A incubação artificial é ponto fundamental da 2 avicultura industrial permitindo a produção de pintos em escala. Algumas condições são imprescindíveis para o adequado desenvolvimento embrionário e devem ser mantidas dentro de padrões considerados ideais. As principais condições observadas durante a incubação são temperatura, umidade, viragem e ventilação. A temperatura e o ambiente gasoso na incubação alteram a taxa de desenvolvimento embrionário (MORTOLA, 2009). O desenvolvimento embrionário tem início no oviduto da galinha e a partir daí passa a sofrer ação do ambiente. O fator ambiental mais importante durante o processo de incubação é a temperatura (DECUYPERE & MICHELS, 1992). De acordo com Decuypere e Bruggeman (2007) a temperatura ótima para incubação está situada entre 37 e 38°C, sendo importante para o desenvolvimento embrionário, sucesso da incubação e desempenho pós-eclosão. Segundo Romijn e Lokhorst (1955) a temperatura corporal do embrião é regulada pela temperatura da incubadora, já que o embrião não é capaz de controlar sua temperatura antes de completar o processo de incubação. De acordo com French (1997) os ovos absorvem calor do ar circundante durante a primeira metade de incubação e precisam perder calor na segunda metade, quando a produção de calor pelo embrião aumenta. Muitos trabalhos demonstram os efeitos da redução e aumento da temperatura durante diferentes fases da incubação (HULET et al., 2007; LOURENS et al., 2005; MORITA et al., 2010). Nesse sentido, a busca por uma temperatura ideal para incubação é importante para a obtenção da máxima eclodibilidade (FRENCH, 1997) e para a melhor qualidade do pinto (DECUYPERE & MICHELS, 1992). O efeito de mudanças na temperatura de incubação depende da intensidade, da duração da exposição e do período onde é aplicada (FRENCH, 1997). Assim, mudanças crônicas podem resultar em melhoras, prejuízos ou não influenciar o desempenho da incubação. Christensen et al. (2002) mostraram que a redução da temperatura de incubação piorou ou não influenciou a eclodibilidade dos ovos, dependendo da linhagem de perus utilizada e Tzschentke e Halle (2008) também verificaram que o aumento em 1˚C nos últimos 4 dias de incubação não afetou a eclodibillidade. Já, Molenaar et al. (2011) encontraram piora da eclodibilidade com o 3 aumento da temperatura em 1 ˚C entre 7 e 19 dias de incubação e Piestun et al. (2008) observaram piora da eclodibilidade e outros parâmetros de desempenho com a incubação em 39,5˚C. Morita et al. (2010) relataram menor mortalidade embrionária total com a redução na temperatura de incubação em 1,5˚C. Por outro lado, Lourens et al. (2005) concluíram que redução da temperatura durante a primeira semana de incubação ou aumento na última semana causam atraso no desenvolvimento embrionário, aumento da mortalidade embrionária, piora na qualidade dos pintos, diminuição na eclodibilidade e redução no crescimento pós- eclosão. A taxa de desenvolvimento embrionário também é bastante influenciada por mudanças na temperatura de incubação (MOLENAAR et al., 2011; YALCIN et al., 2012). O tempo de desenvolvimento embrionário depende do tamanho do ovo e da temperatura de incubação (GILLOOLY et al., 2002). Assim, altas temperaturas de incubação resultam em desenvolvimento acelerado dos embriões (CHRISTENSEN et al., 1999), bem como a incubação em temperaturas inferiores remete a períodos mais longos (YALCIN et al., 2012). Variações na temperatura também resultam em redução do peso corporal das aves quando incubados em temperatura baixa (KUHN et al., 1982) ou alta (LOURENS et al., 2005; PIESTUN et al., 2008), além de prejudicar o desenvolvimento de órgãos vitais como coração e pulmão (MOLENAAR et al., 2011) e do sistema digestório (LEKSRISOMPONG et al., 2007; MOLENAAR et al., 2011; WINELAND et al., 2006). Os hormônios tireoidianos participam do desenvolvimento de vários órgãos, como o cérebro (KOIBUCHI & CHIN, 2000), pulmões (HITCHCOCK, 1979), intestinos (PLATEROTI et al., 2001), inclusive do intestino de espécies avícolas (BLACK, 1978). Os hormônios tireoidianos estão diretamente relacionados com a eclosão (LU et al., 2007) e a temperatura de incubação pode influenciar a concentração plasmáticas desses hormônios. A redução na temperatura de incubação resulta em aumento nas concentrações plasmáticas de triodotironina (T3) durante o período de incubação (KUHN et al., 1982; YALCIN et al., 2012), entretanto, essa resposta varia em função da genética das aves (CHRISTENSEN et al., 2002) e da idade da matriz (YALCIN et al., 2012). Por outro lado, a incubação em alta temperatura, ocasiona reduções nas concentrações de T3, T4 (tiroxina) e 4 corticosterona (PIESTUN et al., 2009). Ainda, Christensen et al. (2001) relataram maiores concentrações plasmáticas de IGF-I e IGF-II (Insuline-Like Growth Factor I e II) e de glicose sanguínea em embriões de perus incubados em altas temperaturas. De acordo com Stewart e Rotwein (1996) IGF-I e IGF-II possuem papel importante no desenvolvimento de embriões e fetos e atuam sobre a maturação de tecidos. Nesse sentido, as consequências de alterações na temperatura de incubação sobre o desenvolvimento de órgãos do sistema digestório vêm sendo investigadas, embora existam poucos trabalhos relacionados com esse sistema (LEKSRISOMPONG et al., 2007; MOLENAAR et al., 2011; WINELAND et al., 2006) e alguns autores encontraram dificuldade para explicar o efeito da temperatura de incubação sobre o desenvolvimento desse órgãos sugerindo a necessidade de novas investigações sobre o assunto (LEKSRISOMPONG et al., 2007). Entretanto, pouco se sabe a respeito dos efeitos de diferentes temperaturas de incubação sobre a mucosa intestinal ou sobre a atividade exócrina pancreática. Além da temperatura, os fatores relacionados à ventilação durante a incubação vêm sendo muito pesquisados atualmente, seja em relação ao oxigênio ou ao dióxido de carbono. A hipóxia durante a incubação vem sendo estudada principalmente com o objetivo de manipular a capacidade termorregulatória (AZZAN et al., 2007) e ventilatória das aves (FERNER & MORTOLA, 2009). Em relação à hipercapnia, estudos mostram que dependendo do tempo de incubação, níveis mais elevados de CO2 estão associados à pior eclodibilidade (TAYLOR et al., 1956; TAYLOR & KREUTZIGER 1965, 1966). Entretanto, atualmente as pesquisas mostram resultados positivos associados a maiores níveis de CO2 durante a incubação. Tanto os efeitos da hipóxia como da hipercapnia, dependem da concentração e da fase de desenvolvimento que o embrião é exposto (DECUYPERE et al., 2006). A hipercapnia durante a incubação estimula a angiogênese (VERHOELST et al., 2011b), além de melhorar os índices produtivos da incubação e a qualidade dos pintos. Buys et al. (1998) trabalharam com aumento do concentração de CO2 (0,4%) no final da incubação (14 a 19 dias) e verificaram menor mortalidade por ascite, redução no tempo de incubação e aumento do peso dos pintos em aves com maior sensibilidade à ascite. Outros autores obtiveram 5 melhora na eclodibilidade e menor duração da incubação utilizando aumento gradual na concentração de CO2 (1 e 1,5%) durante os primeiros 10 dias de incubação (DE SMIT et al. 2006). Da mesma forma, Bruggeman et al. (2007) concluíram que a utilização de concentração crescente de CO2 (1,5%) nos primeiros 10 dias de incubação causou aumento do peso do embrião redução no tempo de incubação. Já Everaert et al. (2007) utilizaram concentração crescente de CO2 (2 a 4%) no período final de incubação (10 a 18 dias) e sugeriram que os embriões toleram tal concentração de hipercapnia, já que não houve prejuízo na taxa de crescimento dos embriões e na eclodibilidade, embora os pintos tenham apresentado maiores concentrações de corticosterona e tiroxina. Decuypere e Bruggeman (2007) relatam o aumento no interesse pelas investigações a respeito do ambiente gasoso nas fases iniciais e finais da incubação envolvendo CO2 e O2, sugerindo que práticas podem melhorar o desempenho da incubação. Assim como a temperatura, a ventilação também interfere nas concentrações de hormônios tireoidianos. Buys et al. (1998) e De Smit et al. (2006) evidenciaram a relação entre a incubação em condições de hipercapnia e as concentrações plasmáticas de T3 e corticosterona. Esses hormônios estão associados à taxa de desenvolvimento embrionário (DECUYPERE et al., 1991), além de envolvidos com o crescimento e maturação funcional do intestino de embriões de aves (BLACK, 1978). Ainda, condições de hipercapnia durante a incubação estimulam a vascularização na membrana corioalantóide durante o desenvolvimento embrionário (VERHOELST et al., 2011). A vasculogênese é o processo de surgimento dos primeiros vasos sanguíneos no embrião (RISAU, 1997) e é importante no desenvolvimento vascular intestinal (PARDANAUD et al., 1989). Assim, em humanos, muitos vasos são formados e se conectam a artéria mesentérica superior dando origem à vascularização intestinal presente na vida adulta (ARA et al., 2005). Inclusive, essa irrigação e drenagem é encontrada nas vilosidades intestinais (CHEN et. al., 2003). Assim como para a temperatura de incubação, pouco se sabe a respeito dos efeitos da incubação em condições de hipercapnia sobre a mucosa intestinal ou atividade pancreática exócrina das aves. 6 A sobrevivência, o desenvolvimento e o desempenho das aves dependem da obtenção de energia e nutrientes. Durante a incubação, os nutrientes necessários para garantir a formação dos órgãos e tecidos corporais são provenientes do vitelo (LITKE & LOW, 1975) e do albúmen (DEEMING, 1989). Após a eclosão, a nutrição passa a ser dependente dos alimentos fornecidos aos animais. Portanto, quando as reservas provenientes do ovo se esgotam, o sistema digestório passa a ser responsável pela nutrição da ave (VIEIRA & MORAN JR, 1999). Ainda, atualmente os frangos de corte apresentam alta taxa de crescimento, que é bastante influenciada pelo desenvolvimento do sistema digestório (SMITH et al., 1990). Nesse sentido, estratégias que melhorem o desenvolvimento do trato gastrintestinal são válidas para melhorar o processo de digestão e absorção dos nutrientes e, consequentemente, o desenvolvimento e desempenho das aves durante todo seu ciclo de vida. A mucosa intestinal é responsável pela secreção de enzimas e pela absorção dos nutrientes. De acordo com Gomide Junior et al. (2004), avaliações da qualitativas e quantitativas da mucosa intestinal são válidas para analisar a capacidade de digestão e absorção intestinal. Ainda, Cera et al. (1988) relatam que a máxima capacidade digestiva e absortiva de suínos ocorre em função da área luminal, altura das vilosidades intestinais e maturidade dos enterócitos. Fatores externos afetam a mucosa intestinal que responde por meio de modificações morfológicas em suas estruturas como altura dos vilos, profundidade das criptas e proliferação celular (GOMIDE JUNIOR et al., 2004). Assim como a mucosa intestinal, segundo Noy e Sklan (1995) a digestão das macromoléculas depende da hidrólise enzimática para que os nutrientes sejam absorvidos. De um modo geral, a organogênese ocorre durante o início da incubação (LILJA & OLSSON, 1987) e maturação entre o final da incubação e as primeiras semanas pós-eclosão (CHRISTENSEN et al., 2001). Em relação à mucosa intestinal, os precursores dos vilos intestinais surgem apenas após oito dias de incubação, que apresentam aparência de vilos apenas após 16 dias de desenvolvimento (COULOMBRE & COULOMBRE, 1958). Ainda, de acordo com Burguess (1975) esses precursores dos vilos intestinais se formam por volta de 10 a 13 dias a partir de microfilamentos intracelulares. 7 Na eclosão, o sistema digestório está anatomicamente completo (OVERTON & SHOUP, 1964; CHAMBERS & GREY, 1979), porém a capacidade digestiva e absortiva ainda está imatura. As principais modificações intestinais são aumento da altura dos vilos e, consequentemente dos enterócitos, células caliceformes e enteroendócrinas (BARANYIOVA, 1972; BARANYIOVA & HOLMAN, 1976), além de aumento na atividade de enzimas pancreáticas (NITSAN et al., 1991 a, b; SELL et al., 1991). Ainda, de acordo com Uni et al. (2003) avaliaram o desenvolvimento do intestino delgado durante a fase final de incubação e concluíram que o peso do intestino em relação ao peso do embrião aumenta de 1 para 3,5% nos últimos três dias de incubação e neste período os vilos são classificados em dois tipos principais (vilos maiores e menores) de acordo com seu estágio de desenvolvimento. Nesse sentido, fatores que afetem o desenvolvimento do sistema digestório durante a incubação podem determinar mudanças no desenvolvimento e desempenho das aves. Ainda, Maiorka et al. (2004) concluíram que a idade da matriz influencia o desenvolvimento de órgãos do sistema digestório e a atividade de enzimas pancreáticas durante a fase embrionária, sendo que os fetos de matrizes jovens apresentaram menor desenvolvimento em relação às matrizes mais velhas. Portanto, sempre que o processo de incubação é avaliado, é importante considerar a idade da matriz, já que é um fator importante para o desenvolvimento embrionário e eclodibilidade (GLADYS et al., 2000). Sabe-se que o tamanho dos ovos é determinado pela idade da matriz (BENOFF & RENDEN, 1983; TONA et al., 2001; TSERVENI-GOUSI, 1987). Também, ovos provenientes de matrizes jovens possuem melhor qualidade de casca e de albúmen em relação a matrizes mais velhas (BAINS, 1994). Ainda, durante a incubação, ovos maiores produzem mais calor que ovos menores (MEIJERHOF & VAN BEEK, 1993) e possuem maior dificuldade de dissipar calor (FRENCH, 1997). Lourens et al. (2005) mostraram que a produção de calor nos ovos durante a incubação aumenta fortemente após 9 dias de incubação, existindo diferenças entre ovos maiores e menores a partir de 15 dias, sendo maior nos ovos maiores que nos menores. Assim, Gillooly et al. (2002) destacaram a importância da relação entre tamanho do ovo e temperatura de incubação sobre o tempo de desenvolvimento embrionário. 8 Bray e Iton (1962) relataram alta correlação positiva entre tamanho do ovo e tamanho do pinto à eclosão. Entretanto, Decuypere e Bruggeman (2007) relatam as diferenças entre ovos de matrizes de diferentes idades e mostram que pintos de matrizes mais velhas apresentam qualidade inferior e menor taxa de crescimento que pintos de matrizes jovens. Ainda, os autores demonstram diferenças nos níveis hormonais e nos metabólitos de pintos originados de ovos de matrizes de diferentes idades. Assim, Morita et al. (2010) concluíram que a temperatura de 36°C resultou em menor mortalidade embrionária para ovos de matrizes de 29 semanas em relação a 37,5 e 39°C. De acordo com Gimenez et al. (2008) e Applegate et al. (1999) o desenvolvimento da mucosa intestinal é influenciado pela idade da matriz ou tamanho do ovo. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas de incubação e concentrações de CO2 sobre o desenvolvimento dos órgãos do sistema digestório durante a fase fetal e pré-inicial de pintos oriundos de ovos de matrizes de diferentes idades. 9 REFERÊNCIAS APPLEGATE, T.J.; DIBNER, J.J.; KITCHELL, M.L.; UNI, Z.; LILBURN, M.S. Effect of turkey (Meleagridis gallopavo) breeder hen age and eggsize on poult development. 2. Intestinal villus growth, enterocyte migration and proliferation of the turkey poult. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B: Biochemistry and Molecular Biology, v. 124, n. 4, p. 381-389, 1999. ARA, T.; TOKOYODA, K.; OKAMOTO, R.; PANDELAKIS, A.K.; NAGASAWA, T. The role of CXCL12 in the organ-specific processo f artery formation. Blood, v. 105, n. 8, p. 3155-3161, 2005. AZZAN, M.A.; SZDZUY, K.; MORTOLA, J.P. Hypoxic incubation blunts the development of thermogenesis in chicken embryos and hatchlings. The American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, v. 292, p. R2373-R2379, 2007. BAINS, B.S. Internal egg quality influence on fertility and hatchability. Worlds Poultry Science Journal, v. 10, n. 11, p.35–37, 1994. BARANYIOVA, E. Influence of deutectomy, food intake and fasting on digestive tract dimensions in chicken after hatching. Acta Veterinária, v. 41, n. 3, p. 373-384, 1972. BARANYIOVA, E.; HOLMAN, J. Morphological changes in the intestinal wall in fed and fasted chickens in the first week after hatching. Acta Veterinária, v. 45, p. 151- 158, 1976. BENOFF, F.H.; RENDEN, J.A. Divergent selection for mature body weight in dwarf White Leghorn. 2. Maternal determinants of egg size. Poultry Science, v. 62, n. 10, p. 1938–1943, 1983. 10 BLACK, B.L. Morphological development of the epithelium of the embryonic chick intestine in culture: Influence of thyroxine and hydrocortisone. American Journal of Anatomy, v. 153, n. 4, p. 573-600, 1978. BRAY, D.F.; ITON, E.L. The effect of egg weight on strain differences in embryonic and postembryonic growth in the domestic fowl. British Poultry Science, v.3, n.3, p.175–187, 1962. BRUGGEMAN, V.; WITTERS, A.; DE SMIT, L.; DEBONNE, M.; EVERAERT, N.; KAMERS, B.; ONAGBESAN, O.M.; DEGRAEVE, P.; DECUYPERE, E. Acid-base balance in chicken embryos (Gallus domesticus) incubated at high CO2 concentrations during first 10 days of incubation. Respiratory Physiology & Neurobiology, v. 159, n. 2, p. 147-154, 2007. BUYS, N.; DEWIL, E.; GONZALES, E.; DECUYPERE, E. Differente CO2 level during incubation interact with hatching time and ascites susceptibility in two broiler lines selected for different growth rate. Avian Pathology, v. 27, n.6, p. 605-612, 1998. BURGUESS, D. Morphogenesis of intestinal villi II. Mechanism of formation of previllous ridges, Journal of Embryology Experimental Morphology, v. 34 , n. 3, p. 723-740, 1975. CERA, K. R.; MAHAN, D. C.; CROSS, R. F.; REINHART, G. A.; WHITMOYER, R. E. Effect of age, weaning and posweaning diet on small intestinal growth and jejunal morphology in young swine. Journal of animal Science, v. 66, n. 2, p. 574-584, 1988. CHAMBERS, C.; GREY, R. D. Development of the structural components of the brush border in absorptive cells of chick intestine. Cell and Tissue Research, v. 204, n. 3, p. 387-405, 1979. 11 CHEN, Y.M.; ZHANG, J.S.; DUAN, X.L. Changes of microvascular architecture, ultrastructure and permeability of rat jejunal villi at different ages. World Journal of Gastroenterology, v. 9, n. 4, p. 795-799, 2003. CHRISTENSEN, V.L.; DONALDSON, W.E.; NESTOR, K.E. Length of plateau and pipping stages of incubation affects the physiology and survival of turkeys. British Poultry Science, v. 40, p. 297–303, 1999. CHRISTENSEN, V.L.; DAVIS, G.S.; NESTOR, K.E. Environmental incubation factors influence embryonic thyroid hormones. Poultry Science, v. 81, n. 4, p. 442-450, 2002. CHRISTENSEN, V.L.; WINELAND, M.J.; FASENKO, G.M.; DONALDSON, W.E. Egg storage effects on plasma glucose and supply and demand tissue glycogen concentrations of broiler embryos. Poultry Science, v. 80, n. 12, p. 1729–1735, 2001. COULOMBRE, A.J.; COULOMBRE, J.L. Intestinal development: I. Morphogenesis of the villi and musculature. Journal of Embryology and Experimental Morphology, v. 6, n. 3, p. 403-411, 1958. DECUYPERE, E.; BRUGGEMAN, V. The endocrine interface of environmental and egg factors affecting chick quality. Poultry Science, v. 86, n. 5, p. 1037-1042, 2007. DECUYPERE, E.; DEWIL, E.; KUHN, E.R. The hatching process and the role of hormones. In: Tallet, SG (Ed.), Avian Incubation. 2nd Ed., London, Butterworth- Heinemann. PP: 239-256, 1991. DECUYPERE, E.; MICHELS, H. Incubation temperature as a management tool: a review. World’s Poultry Science Journal, v. 48, n. 1, p. 28-38, 1992. 12 DECUYPERE, E.; ONAGBESAN, O.; DE SMIT, D.; TONA, K.; EVERAERT, N.; WITTERS, A.; DEBONNE, M.; VERHOELST, V.; BUYSE, J.; HASSANZADEH, M.; DEBAERDEMAEKER, J.; ARCKENS, L.; BRUGGEMAN, V. Hypoxia and hypercapnia during incubation of chicken eggs on development and subsequent performance. XII European Poultry Congress, 10–14 September, Verona, Italy, World’s Poultry Science Journal, v. 62, p. 486–487, 2006. DEEMING, D.C. Importance of sub-embryonic fluid and albumen in the embryo´s response to turning of the eggs during incubation. British Poultry Science, v. 30, n. 3, p. 591-606, 1989. DE SMIT, L.; BRUGGEMAN, V.; TONA, J. K.; DEBONNE, M.; ONAGBESAN, O.; ARCKENS, L.; BAERDEMAEKER, J.; DECUYPERE, E. Embryonic developmental plasticity of the chick: increased CO2 during early stages of incubation changes the developmental trajectories during prenatal and postnatal growth. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v. 145, n. 2, p. 166-175, 2006. ENGLISH D.R.; MACLNISS, R.J.; HODGE, A.M.; HOPPER, J.L.; HAYDON, A.M.; GILES, G.G. Red meat, chicken and fish consumption and risk of colorectal cancer. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, v. 13, n. 9, p. 1509-1514, 2004. EVERAERT, N.; KAMERS, B.; WITTERS, A.; DE SMIT, L.; DEBONNE, M.; DECUYPERE, E.; BRUGGEMAN, V. Effect of four percent carbon dioxide during the second half of incubation on embryonic development, hatching parameters, and posthatch growth. Poultry Science, v. 86, n. 7, p. 1372-1379, 2007. FERNER, K.; MORTOLA, J.P. Ventilatory response to hypoxia in chicken hatchlings: A developmental window of sensitivity to embryonic hypoxia. Respiratory Physiology & Neurobiology, v. 165, p. 49-53, 2009. FLETCHER, D.L. Poultry Meat Quality. World’s Poultry Science Journal, v. 58, n. 2, p. 131-145, 2002. 13 FRENCH, N.A. Modeling incubation temperature: the effects of incubator design, embryonic development, and egg size. Poultry Science, v. 76, n. 1, p. 124-133, 1997. GILLOOLY, J.F.; CHARNOV, E.L.; WEST, G.B.; SAVAGE, V.M.; BROWN, J.H. Effects of size and temperature on developmental time. Nature, v. 417, p. 70-73, 2002. GIMENEZ, A.C.; RICCARDI, R.R.; MALHEIROS, E.B.; BOLELI, I.C. Influência do sexo e peso dos ovos sobre a altura dos vilos e profundidade das criptas do intestino delgado de embriões e pintos de corte, Ciência Animal Brasileira, v. 9, n. 3, p. 608- 616, 2008. GOMIDE JUNIOR, M.L.; STERZO, E. V.; MACARI, M.; BOLELI, I. C. Use of scanning electron microscopy for the evaluation of intestinal epithelium integrity. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 33, n. 6, p. 1500-1505, 2004. HAVENSTEIN, G.B.; FERKET, P.R.; QURESHI, M.A. Growth, livability and feed conversion of 1957 versus 2001 broilers when fed representative 1957 and 2001 broiler diets. Poultry Science, v. 82, n. 10, p. 1500-1508, 2003. HITCHCOCK, K.R. Hormones and the lung. I. Thyroid hormones and glucocorticoids in lung development. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology, v. 194, n. 1, p. 15–39, 1979. HULET, R.; GLADYS, G.; HILL, D.; MEIJERHOF, R.; EL-SHIEKH, T. Influence of egg shell embryonic incubation temperature and broiler breeder flock age on posthatch growth performance and carcass characteristics. Poultry Science, v. 86, n.2, p. 408-412, 2007. KOIBUCHI, N.; CHIN, W.W. Thyroid Hormone Action and Brain Development. Trends in Endocrinology & Metabolism, v. 11, n. 4, p. 123-128, 2000. 14 KUHN, E.R.; DECUYPERE, E.; COLEN, L.M.; MICHELS, H. Posthatch Growth and Development of a Circadian Rhythm for Thyroid Hormones in Chicks Incubated at Different Temperatures. Poultry Science, v. 61, n. 3, p. 540-549, 1982. LEKSRINSOMPONG, N.; ROMERO-SANCHEZ, H.; PLUMSTEAD, P.W.; BRANNAN, K. E.; BRAKE, J. Broiler incubation. 1. Effect of elevated temperature during late incubation on body weight and organs of chicks. Poultry Science, v. 86, n. 12, p. 2685-2691, 2007. LILJA, C.; OLSSON, U. Changes in embryonic development associated with long- term selection for high growth rate in Japanese quail. Growth, v. 51, n. 3, p. 301– 308, 1987. LITKE, L. L.; LOW, F. N. Scanning electron microscopy of yolk absorption in early chick embryos. American Journal of Anatomy, v. 142, n. 4, p. 527-531, 1975. LU, J. W.; MCMURTRY, J. P.; COON, C. N. Developmental Changes of Plasma Insulin, Glucagon, Insulin-like Growth Factors, Thyroid Hormones, and Glucose Concentrations in Chick Embryos and Hatched Chicks. Poultry Science, v. 86, n. 4, p. 673-683, 2007. LOURENS, A.; VAN DEN BRAND, H.; MEIJERHOF, R.; KEMP, B. Effect of eggshell temperature during incubation on embryo development, hatchability, and posthatch development. Poultry Science, v. 84, n. 6, p. 914-920, 2005. MAIORKA, A.; SANTIN, E.; SILVA, A. V. F.; ROUTMAN, K. S.; PIZAURO JUNIIOR, J.M.; MACARI, M. Effect of broiler breeder age on pancreas enzymes activity and digestive tract weight of embryos and chicks. Brazilian Journal of Poultry Science, v. 6, n. 1, p. 19-22, 2004. 15 MEIJERHOF, R.; VAN BEEK, G. Mathematical modeling of temperature and moisture loss of hatching eggs. Journal of Thermal Biology, v. 165, n. 1, p. 27-41, 1993. MOLENAAR, R.; VAN DEN ANKER, I.; MEIJERHOF, R.; KEMP, B.; VAN DEN BRAND, H. Effect of eggshell temperature and oxygen concentration during incubation on the developmental and physiological status of broiler hatchlings in the perinatal period. Poultry Science, v. 90, n. 6, p. 1257-1266, 2011. MORITA, V.S.; BOLELI, I.C.; OLIVEIRA, J.A. Hematological and incubation parameters of chicks from young breeders eggs: variation with sex and incubation temperature. International Journal of Poultry Science, v. 9, n. 6, p. 606-612, 2010. MORTOLA, J.P. Gas exchange in avian embryos and hatchlings. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v. 153, n. 4, p. 359-377, 2009. NITSAN, Z.; BEN-AURAHAM, G.; ZOREF, Z.; NIR, I. Growth and development of the digestive organs and some enzymes in broiler chicks after hatching. British Poultry Science, v. 32, n. 3, p. 515-523, 1991a. NITSAN, Z.; DUNNINGTON, E. A.; SIEGEL, P. B. Organ growth and digestive enzymes levels to fifteen days of age in lines of chickens differing in body weight. Poultry Science, v. 70, n. 10, p. 2040-2048, 1991b. OVERTON, J.; SHOUP, J. Fine structure of cell surface specializations in the maturing duodenal mucosa of the chick. Journal of Cell Biology, v. 31, p. 75-82, 1964. PARDANAUD, L.; YASSINE, F.; DIETERLEN-LIEVRE, F. Relationship between vasculogenesis, angiogenesis and haemopoiesis during avian ontogeny. Development, v. 105, n. 3, p. 473-485, 1989. 16 PIESTUN, Y.; HALEVY, O.; YAHAV, S. Thermal manipulations of broiler embryos – the effect on thermoregulation and development during embryogenesis. Poultry Science, v. 88, n. 12, p. 2677-2688, 2009. PIESTUN, Y.; SHINDER, D.; RUZAL, M.; HALEVY, O.; BRAKE, J.; YAHAV, S. Thermal manipulation during broiler embryogenesis: effects on the acquisition of thermotolerance. Poultry Science, v. 87, n. 8, p. 1516-1527, 2008. PLATEROTI, M.; GAUTHIER, K.; DOMON-DELL, C.; FREUND, J. L.; SAMARUT, J.; CHASSANDE, O. Functional Interference between Thyroid Hormone Receptor α (TRα) and Natural Truncated TRΔα Isoforms in the Control of Intestine Development, Molecular and Cellular Biology, v. 21, n. 14, p. 4761–4772, 2001. RISAU, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature, v. 386, n. 6626, p. 671-674, 1997. ROMIJN, C.; LOKHORST, W. Chemical heat regulation in the chick embryo. Poultry Science, v. 34, n. 3, p. 649–654, 1955. SMITH, M. W.; MITCHELL, M.A.; PEACOCK, M. A. Effects of genetic selection on growth rate and intestinal structure in the domestic fowl (Gallus Domesticus). Comparative Biochemistry and Physiology A, Comparative Physiology, v. 97A, n. 1, p. 57–63, 1990. SELL, J. L.; ANGEL, C. R.; PIQUER, F. J. Development patterns of selected characteristics of the gastrointestinal tract of young turkeys. Poultry Science, v. 70, n. 5, p. 1200-1205, 1991. STEWART, C.E.; ROTWEIN, P. Growth, differentiation, and survival: multiple physiological functions for insulin-like growth factors. Physiological Reviews, v. 76, n. 4, p. 1005-1026, 1996. 17 TAYLOR, L.W., KREUTZIGER, G.O. The gaseous environment of the chick embryo in relation to its development and hatchability. 2. Effect of carbon dioxide and oxygen levels during the period of the fifth through the eighth days of incubation. Poultry Science, v. 44, p. 98–106, 1965. TAYLOR, L.W., KREUTZIGER, G.O. The gaseous environment of the chick embryo in relation to its development and hatchability. 3. Effect of carbon dioxide and oxygen levels during the period of the ninth through the twelfth days of incubation. Poultry Science, v. 45, p. 867–884, 1966. TAYLOR, L.W., SJODING, R.A. and GUNNS, C.A. The gaseous environment of the chick embryo in relation to its development and hatchability. 1. Effect of carbon dioxide and oxygen levels during the first four days of incubation upon hatchability. Poultry Science, v. 35, p. 1206 – 1215, 1956. TZSCHENTKE, B.; HALLE, I.; Influence of temperature stimulation during the last 4 days of incubation on secondary sex rate and later performance in male and female broiler chicks. British Poultry Science, v. 50, n. 5, p. 634-640, 2009. TONA, K.; BAMELIS, F. COUCKE, W.; BRUGGEMAN, V.; DECUYPERE, E. Relationship between broiler breeder’s age and egg weight loss and embryonic mortality during incubation in large-scale conditions, Journal of Applied Poultry Research, n. 10, v. 221–227, 2001 TSERVENI-GOUSI, H.S. Relationship between parental age, egg weight, and hatching weight of Japanese quail. British Poultry Science, v. 28, n. 4, p. 749–752, 1987. UNI, Z.; TAKO, E.; GAL-GARBER, O.; SKLAN, D. Morphological, molecular, and functional changes in the chicken small intestine of late term-embryo. Poultry Science, v. 82, n. 11, p. 1747-1754, 2003. 18 United States Department of Agriculture (2011). Disponível em . Acesso em: 24 de outubro de 2011. VERHOELST, E.; KETELAERE, B.; DECUYPERE, E.; BAERDEMAEKER, J. The effect of early prenatal hypercapnia on the vascular network in the chorioallantoic membrane of the chicken embryo. Biotechnology Progress, v. 27, n. 2, p. 562-570, 2011b. VIEIRA, S. L.; MORAN JR, E. T. Effects of egg of origin and chick post-hatch nutrition on broiler live performance and meat yields. World´s Poultry Science Journal, v. 55, n. 2, p. 126-192, 1999. VRIES, M.; BOER, I.J.M. Comparing environmental impacts for livestock products: A review of life cycle assessments. Livestock Science, v. 128, n. 1-3, p. 1-11, 2010. WINDHORST, H. W. Changes in poultry and trade worldwide. World’s Poultry Science Journal, v. 62, n. 4, p. 584–602, 2006. WINELAND, M.W.; CHRISTENSEN, V.L.; YILDRUM, I.; FAIRCHILD, B.D.; MANN, K.M.; ORT, D.T. Incubator temperature and oxygen concentration at the plateau stage in oxygen consumption affects intestinal maturation of broiler chicks. International Journal of Poultry Science, v. 5, n. 3, p. 229-240, 2006. YALCIN, S.; OZKAN, S.; SIEGEL, P.; YENISEV, C.; AKSIT, M. Manipulation of Incubation Temperatures to Increase Cold Resistance of Broilers:Influence on Embryo Development, Organ Weights, Hormones and Body Composition. The Journal of Poultry Science, v. 49, n. 2, p. 133-139, 2012. 19 CAPÍTULO 2 – Temperaturas de incubação no desenvolvimento morfofisiológico do sistema digestório de fetos e pintos de matrizes pesadas de diferentes idades RESUMO - O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas de incubação sobre o desenvolvimento morfofisiológico do sistema digestório de fetos e pintos de frangos de corte na fase pré-inicial oriundos de ovos de matrizes de diferentes idades. Foram utilizados 1296 ovos férteis de matrizes pesadas Cobb, sendo 648 de 35 semanas (jovens) e 648 de 55 semanas (velhas). Os ovos foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado em três incubadoras mantidas a 37,5˚C até o nono dia de incubação. A partir do décimo dia as temperaturas foram alteradas correspondendo a 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C em cada incubadora até o final da incubação. Foram avaliados: eclodibilidade, eclosão, qualidade do pinto, o período médio e a duração de bicagem interna, bicagem externa e nascimento, o crescimento alométrico dos órgãos do sistema digestório dos fetos (16, 18 e 20 dias de incubação) e dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida), o desenvolvimento da mucosa intestinal dos fetos (16, 18 e 20 dias de incubação) e dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida) e a atividade de enzimas pancreáticas dos pintos (1, 4 e 7 dias de vida). Não houve efeito das temperaturas de incubação sobre a eclosão, eclodibilidade e qualidade dos pintos independentemente da idade da matriz. As temperaturas de 38,5˚C e 36,5˚C causaram, respectivamente, diminuição e aumento do período médio de bicagem interna, externa e nascimento. O peso dos fetos de matrizes de 35 semanas incubados em 36,5˚C apresentou-se menor em relação à temperatura controle aos 18 dias, bem como aos 20 dias para fetos de matrizes de 35 e 55 semanas. Fetos aos 20 dias e pintos de 1 dia de matrizes de 35 semanas incubados em 36,5˚C e 38,5˚C apresentaram maior porcentagem de vitelo. Aos 16 dias, a incubação em 36,5˚C resultou em menor porcentagem de pâncreas e moela nos fetos de matrizes de 35 e 55 semanas, respectivamente. Aos 16 e 20 dias a incubação em 36,5˚C causou menor porcentagem de intestinos nos fetos de matrizes de 35 semanas. A incubação em temperatura de 38,5˚C ou 36,5˚C influenciou negativamente a altura e densidade dos vilos nos segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) com maior intensidade para a temperatura de 36,5˚C, independentemente da idade da matriz, principalmente na fase fetal e nos pintos recém-eclodidos. A incubação em 36,5˚C prejudicou a atividade enzimática total e específica da amilase e tripsina. O aumento ou redução na temperatura de incubação afetam negativamente o desenvolvimento morfofisiológico do sistema digestório principalmente durante a fase fetal. Palavras-chave: digestão, eclodibilidade, frangos de corte, temperatura 20 CHAPTER 2 - Incubation temperatures on the morphophysiological development of the digestive system of fetuses and chicks from heavy broiler breeders of different ages ABSTRACT - The aim of this study was to evaluate the effect of different temperatures of incubation on morphophysiological development of digestive system of fetuses and broiler chicks during the pre-initial phase from eggs of broiler breeders of different ages. We used 1296 fertile eggs from Cobb broiler breeders; 648 for 35 weeks (young) and 648 of 55 weeks (old). The eggs were divided into three incubators in completely randomized design maintained at 37.5˚C until the ninth day of incubation. From the tenth day on the temperatures were changed to 36.5˚C, 37.5˚C and 38.5˚C in each incubator, until the end of incubation. We evaluated: hatchability, hatching, chick quality, the average time and duration of internal and external pipping and birth, the allometric growth of the organs of fetus digestive system (16, 18 and 20 days of incubation) and chicks (1 , 4 and 7 days of life), intestinal mucosa development of the fetuses (16, 18 and 20 days of incubation) and chicks (1, 4 and 7 days old) and the activity of pancreatic enzymes in chicks (1, 4 and 7 days of life). There was no effect of incubation temperatures on hatching, hatchability and chick quality, regardless of broiler breeders’ age. Incubation in 38.5˚C and 36.5˚C caused respectively a decrease and increase in the average period of internal pipping, external pipping and birth. The fetuses weight of fetuses from 35 weeks broiler breeders, incubated in 36.5˚C, was lower when compared to the 37.5˚C at 18 days and at 20 days, just as for fetuses from 35 and 55 weeks breeders. Fetuses at 20 days and 1 day old chicks from 35 weeks breeders, incubated at 36.5 ˚C and 38.5 ˚C had higher yolk percentage. At 16 days, incubation at 36.5˚C resulted in a lower percentage of pancreas and gizzard in fetuses from 35 and 55 weeks breeders, respectively. At 16 and 20 days incubation in 36.5˚C caused a lower percentage of intestines in fetuses from 35 weeks breeders. The incubation in 38.5˚C or 36.5˚C adversely influenced the height and density of the villi in intestinal segments (duodenum, jejunum and ileum) with higher intensity in 36.5˚C, regardless of the breeder age, mainly in the fetal and newly hatched chicks. The incubation in 36.5˚C damaged the total and specific enzyme activity of amylase and trypsin. The increase or decrease in incubation temperature affect negatively digestive system morphophysiological development of the digestive system particularly during fetal stage. Keywords: broilers, digestion, hatchability, temperature 21 1. INTRODUÇÃO Nas últimas décadas a produção de carne de frango apresentou grande crescimento, superando as carnes suína e bovina (WINDHORST, 2006). Para atender tal demanda, o frango de corte atual apresenta melhor eficiência alimentar, rápido ganho de peso e grande redução na idade de abate (HAVENSTEIN et al., 2003). Considerando que a idade de abate do frango de corte é de 42 dias, o período de incubação, que é de aproximadamente 21 dias, representa um terço da vida das aves e será cada vez mais representativo devido às perspectivas de contínua redução da idade de abate. Os principais fatores físicos considerados durante a incubação são temperatura, umidade, viragem e ventilação. De acordo com Decuypere & Michels (1992), a temperatura é o fator ambiental mais importante durante o processo de incubação. Geralmente a temperatura das incubadoras está situada entre 37 e 38°C (MEIJERHOF & VAN BEEK, 1993). Entretanto, muitas pesquisas vêm sendo realizadas para demonstrar os efeitos da redução e aumento da temperatura durante diferentes fases da incubação (HULET et al., 2007; LOURENS et al., 2005; MORITA et al., 2010). Nesse sentido, a busca por uma temperatura ideal na incubação é importante para obter a máxima eclodibilidade (FRENCH, 1997) e, a melhor qualidade do pinto (DECUYPERE & MICHELS, 1992). Sabe-se que a taxa de desenvolvimento embrionário pode ser modificada em função da temperatura de incubação (MOLENAAR et al., 2011; YALCIN et al., 2012). Desse modo, mudanças na temperatura de incubação interferem no desenvolvimento embrionário e, consequentemente, de órgãos vitais para o embrião, inclusive órgãos do sistema digestório (LEKSRISOMPONG et al., 2007; MOLENAAR et al., 2011). No final do período de incubação ocorrem grandes mudanças morfológicas e funcionais no intestino delgado de fetos de frangos de corte (UNI et al., 2003). Neste período observa-se o surgimento e desenvolvimento dos vilos na mucosa intestinal (BURGESS, 1975; COULOMBRE & COULOMBRE, 1958), bem como o pâncreas apresenta atividade de suas enzimas (MAIORKA et al., 2004; MARCHAIM & KULKA, 1967). Entretanto, pouco se sabe sobre o efeito de 22 mudanças na temperatura de incubação sobre a morfofisiologia da mucosa intestinal ou atividade das enzimas pancreáticas. Segundo Vieira & Moran Jr (1999) quando as reservas provenientes do ovo se esgotam, o sistema digestório torna-se responsável pela nutrição da ave. Nesse sentido, estratégias que interfiram no desenvolvimento do trato gastrintestinal são importantes, já que podem melhorar ou piorar o processo de digestão e absorção dos nutrientes e, consequentemente, alterar o desenvolvimento e desempenho das aves durante todo seu ciclo de vida, já que atualmente os frangos de corte apresentam alta taxa de crescimento, que é bastante influenciada pelo desenvolvimento do sistema digestório (SMITH et al., 1990). Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de diferentes temperaturas durante a segunda metade da incubação sobre o desenvolvimento morfofisiológico dos órgãos do sistema digestório de fetos e pintos de frangos de corte oriundos de ovos de matrizes de diferentes idades. 23 2. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp/Jaboticabal, utilizando três incubadoras verticais com capacidade para 600 ovos cada, equipadas com controladores de umidade e de temperatura (Premium Ecológica). Foram utilizados 1296 ovos férteis, sendo 648 de matrizes com idade de 35 semanas (jovens) com peso médio de 57,86 gramas e 648 de matrizes com idade de 55 semanas (velhas) com peso médio de 70,74 g. Os ovos foram pesados, numerados e distribuídos em delineamento inteiramente casualizado nas três incubadoras, resultando em três tratamentos. Até o nono dia de incubação, todas as incubadoras foram mantidas em temperatura de 37,5˚C. A partir do décimo dia as temperaturas foram alteradas correspondendo a 36,5˚C, 37,5˚C e 38,5˚C em cada incubadora até a eclosão dos pintos. Assim, foram utilizados três tratamentos (temperaturas) em duas idades de matrizes. No nono dia de incubação foi realizada ovoscopia e os ovos inférteis foram retirados. A umidade do ar das incubadoras foi mantida em 60% até a eclosão dos pintos e a viragem dos ovos em 45˚ a cada 1 hora até o 18° dia de incubação. Cada incubadora foi abastecida com 216 ovos de matrizes jovens e 216 ovos de matrizes velhas. Após a eclosão, os pintos foram criados até 7 dias. As aves foram alojadas em gaiolas em câmara climatizada com temperatura de 32˚C com programa de luz contínua, recebendo água e ração com 22,48% de proteína bruta e 2960 kcal de energia metabolizável/kg, segundo Rostagno et al. (2011) à vontade. 2.1 Características avaliadas: 2.1.1 Parâmetros da Incubação Para avaliação da eclosão, eclodibilidade e qualidade dos pintos foram utilizadas 5 repetições de 30 ovos para cada idade de matriz utilizada, totalizando 150 ovos de matrizes jovens e 150 ovos de matrizes velhas. A eclosão foi avaliada através da relação entre o número de pintos eclodidos e o número de ovos 24 incubados. A eclodibilidade foi calculada por meio da relação entre o número de ovos eclodidos e o número de ovos férteis incubados. Após a eclosão foi realizada a classificação dos pintos de acordo com Tona et al. (2003). A Tabela 1 mostra a classificação dos escores de acordo com os parâmetros observados. Tabela 1 – Atribuição dos escores a diferentes parâmetros observados. Parâmetros Características Escores Atividade Boa Fraca 6 0 Penas e aparência Limpas e secas Úmidas Sujas e úmidas 10 8 0 Retração da gema Interiorização normal da gema Interiorização de gema grande e difícil ao toque 12 0 Olhos Abertos e brillhantes Abertos e sem brilho Fechados 16 8 0 Pernas Pernas e dedos normais Uma perna afetada Duas pernas afetadas 16 8 0 Umbigo Completamente fechado e limpo Parcialmente aberto e cor semelhante à pele Aberto e cor diferente da pele 12 6 0 Membrana remanescente Sem membrana Membrana pequena Membrana grande Membrana muito grande 12 8 6 0 Gema remanescente Sem gema Gema pequena Gema grande Gema muito grande 16 12 8 0 (TONA et al., 2003) Para avaliação da bicagem interna, externa e o nascimento os ovos foram colocados em sacos de tule aos 18 dias de incubação. Foram utilizados 5 repetições de 24 ovos para cada idade de matriz utilizada, totalizando 120 ovos de matrizes jovens e 120 ovos de matrizes velhas. O monitoramento da bicagem interna, externa e do nascimento iniciou-se às 444 horas de incubação e terminou às 532 horas e foi realizado a cada 2 horas. A bicagem interna foi avaliada através de ovoscopia. A bicagem externa e o nascimento foram avaliados a olho nu, observando-se o 25 rompimento da casca do ovo pelo bico do pinto e a saída completa do pinto da casca do ovo, respectivamente. O tempo médio de bicagem interna é representado pelo período entre o início da incubação e a visualização da bicagem interna. O tempo médio de bicagem externa é representado como o período entre o início da incubação e a visualização da bicagem externa. O tempo médio de nascimento é ocorre entre o início da incubação e a visualização do nascimento. A duração da bicagem interna foi calculada subtraindo-se o horário de início da bicagem externa do início da bicagem interna de cada ovo monitorado. A duração da bicagem externa foi calculada subtraindo-se o horário de início do nascimento do horário de início da bicagem externa. A duração do nascimento foi calculada somando-se a duração da bicagem interna e a duração da bicagem externa, considerando-se que o processo de nascimento iniciou-se no momento em que o pinto perfurou a câmara de ar até ao momento da saída da casca. 2.1.2 Crescimento Alométrico dos Órgãos do Sistema Digestório O crescimento alométrico dos órgãos do sistema digestório foi avaliado nos fetos e nos pintos. Para tanto, foram utilizadas cinco ovos de cada tratamento em cada idade. Nos fetos foi mensurado aos 16, 18 e 20 dias de incubação e nos pintos com 1, 4 e 7 dias de idade após jejum alimentar de 12 horas. Os ovos e os pintos através do peso médio do grupo (± 10%). Os fetos e os pintos foram abatidos por decapitação. Os protocolos experimentais estão de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da FCAV-UNESP. O sistema digestório dos fetos foi separado em: saco de vitelo, proventrículo, moela (ventrículo muscular), intestino e fígado e dos pintos em saco de vitelo, proventrículo, moela, intestino, fígado e pâncreas, sendo cada órgão lavado e pesado individualmente. O peso dos fetos e pintos foi registrado descontando-se o peso do saco de vitelo para o cálculo da porcentagem de cada órgão do sistema digestório que foi calculado através da relação entre o peso do órgão e o peso do feto ou pinto em porcentagem. 26 2.1.3 Desenvolvimento da Mucosa Intestinal 2.1.3.1 Microscopia de Luz As análises dos parâmetros morfométricos intestinais foram realizadas nas mesmas aves utilizadas para coleta dos órgãos do sistema digestório, ou seja, fetos aos 16, 18 e 20 dias de incubação e pintos aos 1, 4 e 7 dias de vida, após jejum de 12 horas. Foram extraídas amostras de cada uma das regiões do intestino delgado: duodeno, jejuno e íleo. Foram coletadas amostras do duodeno na porção proximal descendente da alça duodenal, do jejuno na região posterior à porção distal da alça duodenal e do íleo na região cranial aos cecos. Foram coletadas amostras de 1 cm aos 16 e 18 dias de incubação, de 1,5 cm aos 20 dias de incubação e 1 dia de vida e de 2 cm aos 4 e 7 dias de vida. As amostras foram fixadas imediatamente em solução de Bouin por 24 horas. Em seguida foram lavadas em álcool 70% para retirada do fixador e, posteriormente, desidratadas em série crescente de etanol (70%, 80%, 90% e 100%), diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Foram feitos 5 cortes histológicos por amostra, com cinco micrômetros cada, corados com hematoxilina e eosina. As imagens dos cortes histológicos foram obtidas utilizando- se um sistema de captura de imagem (Leica). As imagens foram fotografadas em aumento de 10 vezes (16 dias de incubação e 1 dia de idade), 20 vezes (18 e 20 dias de incubação) e 5 vezes (4 e 7 dias de idade). As análises foram feitas pelo programa Image J® (RASBAND, 2004). Foi mensurada a altura de vilos aos 16, 18 e 20 dias nos fetos e aos 1, 4 e 7 dias nos pintos e a profundidade das criptas nos pintos aos 1, 4 e 7 dias, sendo realizadas 30 leituras/segmento intestinal. 2.1.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura Para o estudo da microscopia eletrônica de varredura foram utilizadas amostras intestinais coletadas das mesmas aves utilizadas na microscopia de luz (20 dias de incubação e 1, 4 e 7 dias de idade), seguindo a mesma metodologia de coleta. As amostras foram fixadas em glutaraldeído 2,5% e tampão fosfato, por 24 27 horas a 4ºC. Após fixação, os fragmentos foram lavados com o mesmo tampão e pós-fixados com tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato por 2 horas. As amostras foram lavadas novamente na mesma solução tampão e desidratadas em série crescente de etanol. Após obtenção do ponto crítico de secagem, utilizando CO2, os fragmentos foram metalizados em ouro e fotografados em microscópio eletrônico de varredura (modelo JEOL JSM 25SII). As amostras intestinais dos fetos aos 20 dias de incubação e pintos de 1 dia de idade foram fotografadas em aumento de 500 vezes e as amostras de pintos aos 4 e 7 dias em aumento de 150 vezes, assim, a área de cada fotomicrografia correspondeu a 0,039287 e 0,468843 mm2 da mucosa de cada amostra, respectivamente. A densidade de vilos por área foi expressa como o número de vilos/mm2. 2.1.4 Atividade de enzimas pancreáticas Para análise da atividade de enzimas pancreáticas foram coletados amostras aos 1, 4 e 7 dias. Nos pintos de 1 dia foram coletadas 5 repetições de 5 pâncreas cada. Nos pintos de 4 dias foram coletadas 5 repetições de 3 pâncreas cada. Nos pintos de 7 dias foram coletadas 5 repetições de 1 pâncreas cada. O material coletado foi congelado imediatamente em nitrogênio líquido para posteriores análises. Para obtenção do extrato bruto, o pâncreas foi homogeneizado em tampão tipo Tris-HCl 5 mM com CaCl2 50 mM (1:20). Os extratos brutos assim obtidos foram centrifugados, filtrados, aliquotados, congelados em nitrogênio líquido, armazenado a -80ºC e utilizados, posteriormente, para a determinação da atividade enzimática de amilase e tripsina e dosagem da concentração de proteína. As determinações foram realizadas em triplicatas. 2.1.4.1 Determinação da atividade de tripsina pancreática A atividade da tripsina foi determinada pelo método descrito por Pizauro et al. (2004). 28 Primeiramente, foi efetuada a ativação do zimogênio em tampão Tris-HCl 0,5M pH 8,0 contendo CaCl2 (50mM). Cada dosagem de 0,4 mL do extrato pancreático foi incubada com 0,08 unidades de enteroquinase (SIGMA®) a 37ºC por 5 minutos. A reação foi iniciada pela adição de 1mL do substrato N-benzoil-DL- arginina-p-nitroanilida (BAPNA, SIGMA®) ao meio de reação contendo o extrato ativado. Depois de 20 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 0,2 mL de ácido acético 30% (v/v). Após centrifugação em microcentrífuga SPIN I durante 2 minutos a 4ºC, a absorbância foi determinada a 410 m. Em cada determinação foram incluídos controles sem adição de enzimas. Uma unidade de atividade enzimática específica (U.mg-1) foi definida e expressa como a quantidade de enzima que libera 1 mol de p-nitroanilida por minuto por miligrama de proteína nas condições padrões do teste e uma unidade de atividade enzimática total (U.g-1) foi definida e expressa como a quantidade de enzima que libera 1 mol de p-nitroanilida por minuto por grama de tecido pancreático nas con