Tábata Peres Cardoso Análise Estrutural de Halogenases Encontradas em Clusters Gênicos da Biossíntese de Antibióticos Glicopeptídicos São José do Rio Preto 2015 Câmpus de São José do Rio Preto Tábata Peres Cardoso Análise Estrutural de Halogenases Encontradas em Clusters Gênicos da Biossíntese de Antibióticos Glicopeptídicos Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Profª. Drª. Marcio Vinicius Bertacine Dias São José do Rio Preto 2015 Cardoso, Tábata Peres Análise estrutural de halogenases encontradas em clusters gênicos da biossíntese de antibióticos glicopeptídicos/ Tábata Peres Cardoso -- São José do Rio Preto, 2015. 105 f. : il. ; tabs Orientador: Marcio Vinícius Bertacine Dias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Microbiologia médica. 2. Angentes Anti-infecciosos. 3. Streptomyces. 4.Composto organo-halogenados. 5. Produtos Naturais. 6. Expressão Gênica. I. Dias, Marcio Vinicius Bertacine. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título. CDU – 576.8 Ficha catalofráfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP – Campus de São José do Rio Preto Tábata Peres Cardoso Análise Estrutural de Halogenases Encontradas em Clusters Gênicos da Biossíntese de Antibióticos Glicopeptídicos Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. Marcio Vinicius Bertacine Dias UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Gabriel Padilla USP – São Paulo Dr. Daniel Maragno Trindade LNBio– Campinas São José do Rio Preto 10 de agosto de 2015 “Que a importância de uma coisa não se mede com fita métrica nem com balanças nem barômetros etc. Que a importância de uma coisa há que ser medida pelo encantamento que a coisa produza em nós” Manoel de Barros Dedico este trabalho aos meus pais, Angela e Valter, os quais dedicaram a suas vidas em favor da minha. Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, porque Ele é bom e justo e graças a demonstração magna de amor, hoje desfruto da vida com esperança e confiança. Agradeco pelas oportunidades concedidas, carinho e proteção contínua. Sem Ele, nada disso teria sentido. Agradeço ao meu orientador, prof Drº Marcio Dias, o qual abriu as portas da pesquisa para mim e com grande maestria se tornou o melhor exemplo. Por todo seu esforço, por toda sua dedicação, por toda confiança depositada, por toda paciência exercitada e principalmente por todos os ensinamentos transmitidos, a minha eterna gratidão! Aos meus amigos de grupo, que prontamente me acolheram no laboratório e compartilharam comigo o que aprenderam. Priscila Burry, Larissa de Sá, João Ribeiro e Carol Wilson, obrigada pela convivência no “puxadinho” e fora dele também. Vocês são especiais! A Larissa de Sá pelas clonagens realizadas. A Larissa Menezes que foi um instrumento utilizado por Deus. Aos amigos, os quais me proporcionaram o privilégio de compartilhar momentos que certamente enriqueceram minha vida. Arina Perez, Fernanda Costa, Angela Saito, Aline Cardoso, Maria Eugênia, Mayara Miyachiro, Paulo Madeira, Samira Zouhir, David Neves, Daniel Trindade e Fernanda Buchli, obrigada por todas as conversas, conselhos, risadas e por se tornarem minha família em Campinas. Vocês são especiais! A Jackeline Zanella e a Drª Juliana Fattorri por me ensinarem utilizarar os equipamentos de análises além da excelente amizade e carinho desenvolvido. Ao Dr. Arthur Cordeiro e grupo, por me acolherem. Ao Drº Andrew Truman pelo acolhimentono JIC e orientação durante projeto desenvolvido. A Drª Natália Miguel-Vior por todos os ensinamentos e também por toda paciência bem como os momentos. Aos amigos do departamento de biologia molecular do JIC. Aos amigos do LNBio, por todos os dias de convívio. Aos amigos do GEA, Eslo, Moises, Nelson, Michelle, Sissi, Flores, Janete, Marcos e Laura, por cada sábado de deleite. Aos amigos da minha cidade natal, Priscila Carvalho, Emily Sartori, Renata Apollinário e Daniel Pires, por sempre serem meus amigos. Aos meus pais e familiares, que me amam incondicionalmente. Ao CNPEM, pela infra-estrutura oferecida durante o desenvolvimento do projeto. A FAPESP, pelo apoio financeiro. Sumário 1 Introdução 18 1.1 Produtos naturais halogenados 19 1.2 Halogenases 23 1.2.1 Atividade relacionada à halogenação 24 1.2.2 Classes de Halogenases 25 1.3 Antibióticos Glicopeptídicos 34 1.3.1 Classificaçãos dos Antibióticos Glicopeptídicos 35 1.3.2 Biossíntese dos glicopeptídeos 38 1.4 Biossíntese combinatorial aplicada a glicopeptídeos 41 2 Objetivos 44 3 Materiais e Métodos 45 3.1 Obtenções de cepas, purificação de DNA genômico e clonagem de halogenases dos clusters gênicos de antibióticos glicopeptídicos (StaI, StaK, Orf8 e ComH) 45 3.2 Expressão e Purificação das halogenases StaI, StaK, Orf8 e ComH 47 3.3 Teste de Expressão das halogenases StaK e Orf8 49 3.4 Western Blotting com anticorpo anti-His 49 3.5 Ensaios de Cristalização 49 3.6 Análises Biofísicas das halogenases ComH e StaI 50 3.6.1 Dicroísmo Circular– CD 50 3.6.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) 51 3.7 Proteólise Limitada com Tripsina 51 3.8 Modelagem Molecular por Homologia 51 3.9 Ensaios de complementação realizados no laboratório do Dr. Andrew Truman no centro de pesquisa John Innes Centre- Norwich, UK. 52 3.9.1 Cepas produtoras des antibióticos 52 3.9.2 Complementação com genes staI e staK de S. toyocaensis 53 3.9.3 Aquisição de dados LC-ESI-MS 53 4 Resultados e Discussão 53 4.1 Expressão inicial das halogenases StaI, StaK e Orf8 em pET28a 55 4.2 Expressão e Purificação das proteínas ComH, StaI e StaK e visualização emWestern Blotting. 56 4.3 Teste de expressão das halogenases Orf8 e StaK em diferentes cepas de E. coli. 63 4.4 Expressão e purificação da proteína StaK 65 4.5 Testes de cristalização da ComH e da StaI 67 4.6 Ensaios Espectrométricos 69 4.6.1 Dicroísmo Circular – CD 69 4.6.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) 71 4.7 Purificação e Ensaios Espectrométricos da proteína StaI em novas condições padronizadas pelos resultados de DLS. 75 4.7.1 Expressão e Purificação 75 4.7.2 Ensaios Espectrométricos da proteína StaI 78 4.8 Proteólise Limitada com Tripsina para proteína StaI 80 4.9 Modelagem Molecular por Homologia 81 4.10 Resultados obtidos dos ensaios de complementação genes staI e staK de Streptomyces toyocaensis. 87 4.10.1 PCR Targeting 88 4.10.2 Conjugação e produção 90 4.10.3 Análises de Massa 91 5 Conclusão 96 6 Referências Bibliográficas 97 Lista de Tabelas TABELA 1. DADOS DO DICROÍSMO CIRCULAR PARA PROTEÍNAS COMH E STAI. ........................................ 71 TABELA 2. DADOS OBTIDOS ATRAVÉS DE DLS DAS HALOGENASES COMH E STAI A 1MG/ML EM TAMPÃO SEUS TAMPÕES ORIGINAIS. .............................................................................................................. 71 TABELA 3. DADOS OBTIDOS ATRAVÉS DE DLS DA HALOGENASE COMH A 1MG/ML EM DIFERENTES SOLUÇÕES TAMPÕES. ....................................................................................................................... 72 TABELA 4. DADOS OBTIDOS ATRAVÉS DE DLS DA HALOGENASE STAI A 1MG/ML EM DIFERENTES SOLUÇÕES TAMPÕES. ....................................................................................................................... 73 TABELA 5. DADOSDO DICROÍSMO CIRCULAR PARA PROTEÍNAS STAI. ....................................................... 79 TABELA 6. DADOS OBTIDOS ATRAVÉS DE DLS DAS HALOGENASE STAI A 1MG/ML EM TAMPÃO SEU ORIGINAL. ......................................................................................................................................... 79 TABELA 7. RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS PRESENTES NAS SEQUENCIAS DAS HALOGENASES STAI E STAK. .......................................................................................................................................................... 83 TABELA 8. VALORES OBTIDOS SEGUNDO GRÁFICO DE RAMACHANDRAN PARA ESCOLHA DOS MODELOS GERADOS PARA STAI E STAK. ............................................................................................................ 83 Lista de Figuras FIGURA 1. COMPOSTOS NATURAIS CLORADOS. A) REBECAMICINA; B) SALINOSPORAMIDA; C) CLOROTETRACICLINA; D) CLORANFENICOL; E) VANCOMICINA ........................................................ 20 FIGURA 2. COMPOSTOS ORGANOHALOGENADOS COM SEUS RESPECTIVOS PRODUTORES. PRODUTOS NATURAIS BROMADOS REPRESENTADOS POR PLAKORTAMINE C E CJ-19.784. COMPOSTOS IODADOS TIROXINA E TASIHALIDE A E REPRESENTANDO OS FLUORADOS, NUCLEOCIDINA E FLUORACETONA. ............................................................................................................................... 22 FIGURA 3. MECANISMO CATALÍTICO DE HALOPEROXIDASES HEME-DEPENDENTE (ADAPTADO DE (NEUMANN ET AL., 2008). ................................................................................................................ 27 FIGURA 4. MECANISMO CATALÍTICO DE HALOPEROXIDASES VANÁDIO-DEPENDENTE (ADAPTADO DE (NEUMANN ET AL., 2008). ................................................................................................................ 28 FIGURA 5. BIOSSÍNTESE DE PIRROLNITRINA. DEMONSTRAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE PRNA, B, C E D. (ADAPTADO DE (KIRNER ET AL., 1996). ..................................................................................... 29 FIGURA 6. ENZIMA REBH SENDO UTILIZADA NA FORAMAÇÃO DO INTERMEDIÁRIO 7-CLORATRIPTOFANO NA BIOSSÍNTESSE DE REBECAMICINA (YEH ET AL., 2005). ................................................................ 31 FIGURA 7. ESTRUTURA DE UMA FLAVINA DEPENDENTE CLOROHALOGENASE (PRNA). A MOLÉCULA DE FAD E O 7-CLOROTRIPTOFANO (PRODUTO DESTA ENZIMA) É MOSTRADO EM STICK, À MOLÉCULA DE CLORO É MOSTRADO COMO UMA ESFERA ROSA. O DOMÍNIO DE RECONHECIMENTO DA FLAVINA ESTÁ EM SALMÃO E O DOMÍNIO DE RECONHECIMENTO DO SUBSTRATO EM AZUL (DONG ET AL., 2005). .................................................................................................................................... 31 FIGURA 8. MECANISMO DE AÇÃO DE HALOGENASE NÃO-HEME FERRO-DEPENDENTE (ADPATADO DE (VAILLANCOURT ET AL., 2006). ......................................................................................................... 33 FIGURA 9. REAÇÃO DE CATÁLISE DE UMA METILTRANSFERASES (MURPHY ET AL., 2003). ....................... 34 FIGURA 10. REAÇÃO DE CATÁLISE POR UM FLUORINASE (DENG ET AL., 2006). ........................................ 34 FIGURA 11. OS CINCO DIFERENTES GRUPOS DE ANTIBIÓTICOS GLICOPEPTÍDICOS. OS RETÂNGULOS EM AZUL NA VANCOMICINA E AVOPARCINA MOSTRAM AS POSIÇÕES DOS RESÍDUOS 1 E 3 QUE SÃO DIFERENTES ENTRE O GRUPO I E II. OS CÍRCULOS EM VERMELHO MOSTRAM A LIGAÇÃO ÉTER ENTRE OS RESÍDUOS 1 E 3, QUE SÃO AROMÁTICOS NA RISTOCETINA (GRUPO III) E TEICOPLANINA (GRUPO IV) E O CÍRCULO EM VERDE MOSTRA A PRESENÇA DA CADEIA ALIFÁTICA NA TEICOPLANINA (GRUPO IV). O RETÂNGULO EM VERDE NA COMPLESTATINA MOSTRA A PRESENÇA DE UM TRIPTOFANO LIGADO AO AMINOÁCIDO CENTRAL. .............................................................. 37 FIGURA 12. ESTRUTURA DO ANTIBIÓTICO A 47934. SETAS INDICAM CATÁLISE PELAS HALOGENASES STAI E STAK. (ADAPTADO DE(POOTOOLAL ET AL., 2002). ........................................................................ 43 FIGURA 13. GÉIS DE AGAROSE MOSTRANDO A AMPLIFICAÇÃO DOS GENES CORRESPONDENTES A A) ORF8* (1, 2), B) STAK (1 E 2) E STAI (3, 4) (OS GÉIS FORAM EDITADOS PARA FACILITAR A VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS) ........................................................................................................... 54 FIGURA 14. PCR PARA CONFIRMAÇÃO DA CLONAGEM DOS GENES ORF8*, STAI, E STAK. 1, MARCADOR 1KB, 2, ORF8* CLONADA EM PET28A(+), 3, CONTROLE PARA ORF8*, 4, STAI CLONADA EM PET28A(+), 5, STAI CLONADA EM PET20A, 6, STAI CONTROLE, 7, STAK CLONADA EM PET20A(+), 8, STAK CLONADA EM PET20A, 9, STAK CLONADA EM PET28A(+), 10, STAK CLONADA EM PET28A(+), 11, STAK CONTROLE. ......................................................................................................................... 55 FIGURA 15.1, MARCADOR DE PESO MOLECULAR, 2, ORF8* LISADO, 3, ORF8* PELLET, 4, STAK LISADO, 5, STAK, PELLET, 6, STAI LISADO, 7, STAI, PELLET ................................................................................. 55 FIGURA 16. CROMATOGRAMA OBTIDO PARA A ENZIMA COMH. EM VERMELHO AS FRAÇÕES COLETADAS. FORAM UTILIZADAS COMO AMOSTRAS PARA A ANÁLISE EM SDS-PAGE 15% AS FRAÇÕES 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15; EM VERDE A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO B; EM AZUL A ABSORBÂNCIA A 280 NM. .............................................................................................................. 56 FIGURA 17. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DA COMH(1-7) M- MARCADOR DE 250 KD (BIO- RAD), 1- SOBRENADANTE, 2- PELLET, 3- FLOW THROUGH, 4 A 14- AMOSTRAS DA COMH REFERENTE ÀS FRAÇÕES 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 RESPECTIVAMENTE; SETA INDICA EXPRESSÃO DA HALOGENASE COM TAMANHO APROXIMADO DE 50KD. ........................................ 57 FIGURA 18. CROMATOGRAMA OBTIDO DA PURIFICAÇÃO POR EXCLUSÃO MOLECULAR DA ENZIMA COMH. ............................................................................................................................................... 58 FIGURA 19. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DAS FRAÇÕES DA PUIRIFICAÇÃO POR EXCLUSÃO MOLECULAR DA ENZIMA COMH REFERENTE ÀS FRAÇÕES DOS PICOS NA FIGURA 7. M- MARCADOR DE PESO MOLECULAR 250KD (BIO-RAD), 1 A 11 FRAÇÕES 2, 4, 6, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 32. .......................................................................................................................................................... 58 FIGURA 20. CROMATOGRAMA DA PROTEÍNA STAI. EM AZUL A ABSORBÂNCIA A 280NM; EM VERMELHO AS FRAÇÕES COLETADAS PELO SISTEMA DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS; EM VERDE CONCENTRAÇÃO DE TAMPÃO B (COM IMIDAZOL). ......................................................................... 59 FIGURA 21. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DA STAI (4-10) M- MARCADOR DE 1 KD (BIO- RAD), 1- LISADO E 8- PELLET, 2 –PELLET , 3- FLOW THROUGH, 4 E 10- AMOSTRAS DA STAI REFERENTE ÀS FRAÇÕES 3, 5, 7, 9, 11, 13. ........................................................................................ 59 FIGURA 22. CROMATOGRAMA OBTIDO DA PURIFICAÇÃO POR EXCLUSÃO MOLECULAR DA STAI. AS SETAS INDICAM QUAIS FRAÇÕES FORAM UTILIZADAS COMO AMOSTRAS NO GEL SDS-PAGE 15% (FIGURA 23) ..................................................................................................................................................... 60 FIGURA 23. VISUALIZAÇÃO DO GEL SDS-PAGE 15% REPRESENTANDO RESULTADOS DA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO MOLECULAR DA STAI, 1 MARCADOR 1KD (BIO-RAD), 2, 3, E 4 O LISADO, PELLET E FLOW THROUGH RESPECTIVAMENTE, 5-11 AS FRAÇÕES 2, 4, 12, 14, 17, 19, 25 OBTIDAS PELO CROMATOGRAMA DA EXCLUSÃO MOLECULAR................................................................................ 60 FIGURA 24. CROMATOGRAMA OBTIDO DA ENZIMA STAK. EM VERMELHO AS FRAÇÕES COLETADAS; EM VERDE A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO B; EM AZUL A ABSORBÂNCIA, A 280 NM. ........................ 61 FIGURA 25. GEL SDS-PAGE 15% DA PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE DA PROTEÍNA STAK, 1, MARCADOR MOLECULAR 1KD (BIO-RAD), 2, 3, E 4 O LISADO, PELLET E FLOW THROUGH RESPECTIVAMENTE, 5-9 AS FRAÇÕES 8, 10, 18, 24, 30 OBTIDAS NA PURIFICAÇÃO. .............................................................. 62 FIGURA 26. VISUALIZAÇÃO DA MEMBRANA DE WESTERN BLOT UTILIZANDO ANTICORPOS ANTI-HIS REALIZADO PARA A CONFIRMAÇÃO DA ENZIMA STAK, 1,O LISADO E 2, O PELLET. ......................... 62 FIGURA 27. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DO LISADO DAS PROTEÍNAS ORF8* E STAK. M- MARCADOR DE 250 KD (BIO-RAD), 1- ORF8 ROSETTA NÃO INDUZIDO, 2- ORF8* ORIGAMI NÃO INDUZIDO, 3- ORF8* ARTIC EXPRESS NÃO INDUZIDO, 4-STAK ROSETTA NÃO INDUZIDO, 5- STAK ORIGAMI NÃO INDUZIDO, 6- STAK ARTIC EXPRESS NÃO INDUZIDO, 7- ORF8 ROSETTA 37º-4H, 8- ORF8* ORIGAMI 37º - 4H, 9- STAK ROSETTA 37º-4H, 10- STAK ORIGAMI 37º-4H, 11- ORF8* ROSETTA 18º OVER NIGHT, 12- ORF8* ORIGAMI 18º OVER NIGTH, 13- STAK ROSETTA 18º OVER NIGHT, 14- STAK ORIGAMI 18º OVER NIGHT. ................................................................................... 63 FIGURA 28.GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DO PELLET DAS PROTEÍNAS ORF8* E STAK. M- MARCADOR DE 250 KD (BIO-RAD), 1- ORF8* ROSETTA NÃO INDUZIDO, 2- ORF8* ORIGAMI NÃO INDUZIDO, 3- ORF8* ARTIC EXPRESS NÃO INDUZIDO, 4-STAK ROSETTA NÃO INDUZIDO, 5- STAK ORIGAMI NÃO INDUZIDO, 6- STAK ARTIC EXPRESS NÃO INDUZIDO, 7- ORF8* ROSETTA 37º-4H, 8- ORF8* ORIGAMI 37º - 4H, 9- STAK ROSETTA 37º-4H, 10- STAK ORIGAMI 37º-4H, 11- ORF8* ROSETTA 18º OVER NIGHT, 12- ORF8* ORIGAMI 18º OVER NIGTH, 13- STAK ROSETTA 18º OVER NIGHT, 14- STAK ORIGAMI 18º OVER NIGHT. ................................................................................... 64 FIGURA 29. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DO LISADO E PELLET DAS PROTEÍNAS ORF8* E STAK. M- MARCADOR DE 250 KD (BIO-RAD), 1- ORF8* ARTIC EXPRESS18º OVER NIGHT LISADO, 2- STAK ARTIC EXPRESS 18º OVER NIGHT LISADO, 3- ORF8* ARTIC EXPRESS18º OVER NIGHT PELLET, 4- STAK ARTIC EXPRESS 18º OVER NIGHT PELLET. ............................................................................ 64 FIGURA 30. CROMATOGRAMA OBTIDO PARA PROTEÍNA STAK. EM AZUL A ABSORBÂNCIA A 280NM. EM VERMELHO AS FRAÇÕES COLETADAS, AS QUE SE REFEREM AO PICO FORAM ANALISADAS EM SDS- PAGE 15%. EM VERDE A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO 50 MM TRIS-HCL, 100 MM NACL E 500 MM DE IMIDAZOL. .................................................................................................................................... 66 FIGURA 31. PERFIL CROMATOGRÁFICO DA PROTEÍNA STAK NA ETAPA DE PURIFICAÇÃO POR EXCLUSÃO MOLECULAR (COLUNA HILOAD SUPERDEX 16/200 EQUILIBRADA EM SOLUÇÃO TAMPÃO 50MM TRIS-HCL PH 7,8; 100MM DE NACL). ................................................................................................. 66 FIGURA 32.GEL SDS-PAGE 15% DA PURIFICAÇÃO POR AFINIDADE E EXCLUSÃO MOLECULAR DA PROTEÍNA STAK. A. AMOSTRAS REFERENTES A PURFICAÇÃO POR AFINIDADE AO NÍQUEL. M, MARCADOR MOLECULAR 1KD (BIO-RAD), 2, 3, E 4 O PELLET, LISADO E FLOW THROUGH RESPECTIVAMENTE, 5-9 AS FRAÇÕES 8,10,18, 24, 30 OBTIDAS NA PURIFICAÇÃO.B. AMOSTRA REFERENTE AO PICO OBTIDO NA PURIFICAÇÃO EXCLUSÃO DE PESO MOLECULAR. M MARCADOR DE PESO MOLECULAR 1KD (BIO-RAD) (GEL EDITADO PARA MELHOR VISUALIZAÇÃO). ................... 67 FIGURA 33. FOTOGRAFIA DO CRISTAL OBTIDO EM CONDIÇÃO COMPOSTA DE 0,1 M DE CHES PH 9.0 E 30% PEG400. (A) EXPOSTO À VISUALIZAÇÃO NATURAL E (B) EXPOSTO A VISUALIZAÇÃO POR LUZ ULTRA VIOLETA. ................................................................................................................................ 69 FIGURA 34. FOTOGRAFIA DO CRISTAL OBTIDO NA CONDIÇÃO COMPOSTA POR 0,1M DE ACETATO DE SÓDIO PH 4,5, 0,2 M DE SULFATO DE LÍTIO, 50% PEG 400, (A) EXPOSTO A VISUALIZAÇÃO NATURAL E (B) EXPOSTO A VISUALIZAÇÃO POR LUZ ULTRA VIOLETA. ............................................................. 69 FIGURA 35. DICROÍSMO CIRCULAR DA PROTEÍNA STAI. CURVA DE CD EXPERIMENTAL COM A PROTEÍNA 5ΜMOL/L EM TAMPÃO 50MM CHES E 100 MM NACL, PH 9,0. ....................................................... 70 FIGURA 36. DICROÍSMO CIRCULAR DA COMH. CURVA DE CD EXPERIMENTAL COM A PROTEÍNA 5ΜMOL/L EM TAMPÃO 50MM TRIS-HCL E 100 MM NACL, PH 7,8 .................................................. 70 FIGURA 37. CROMATOGRAMA OBTIDO PARA A ENZIMA STAI. EM VERMELHO AS FRAÇÕES COLETADAS. FORAM UTILIZADAS COMO AMOSTRAS PARA A ANÁLISE EM SDS-PAGE 15% AS FRAÇÕES REFERENTE AOS PICOS; EM VERDE A CONCENTRAÇÃO DO TAMPÃO B; EM AZUL A ABSORBÂNCIA A 280NM .............................................................................................................................................. 76 FIGURA 38. CROMATOGRAMA OBTIDO DA PURIFICAÇÃO POR EXCLUSÃO MOLECULAR DA STAI. FRAÇÕES REFERENTES AOS PICOS FORAM UTILIZADAS COMO AMOSTRAS NO GEL SDS-PAGE 15% (FIGURA 39). .................................................................................................................................................... 77 FIGURA 39. GEL SDS-PAGE 15% CONTENDO AMOSTRAS DA STAI. M- MARCADOR DE 250 KD (BIO-RAD), 1- PELLET, 2- SOBRENADANTE, 3- FLOW THROUGH, 4 A 10- AMOSTRAS DA STAI REFERENTE ÀS FRAÇÕES 7, 12, 16 28, 41, 46, 65, RESPECTIVAMENTE, DO CROMATOGRAMA DE AFINIDADE. 11 A 14 – AMOSTRAS DA STAI REFERENTE AS FRAÇÕES 2, 9, 21, 32, OBTIDAS APÓS CROMATOGRÁFICA EXCLUSÃO DE PESO MOLECULAR. SETA INDICA EXPRESSÃO DA HALOGENASE COM TAMANHO APROXIMADO DE 50 KD. ................................................................................................................... 77 FIGURA 40. DICROÍSMO CIRCULAR DA PROTEÍNA STAI. CURVA DE CD EXPERIMENTAL COM A PROTEÍNA 5ΜMOL/L EM TAMPÃO 50MM CHES E 100 MM NACL, PH 9,0. ....................................................... 78 FIGURA 41. SDS-PAGE 15% CONTENDO O RESULTADO DA AÇÃO DA TRIPSINA SOBRE A HALOGENASE STAI. NOTA-SE O APARECIMENTO DE UMA BANDA DE APROXIMADAMENTE 50 KDA APÓS A PROTEÓLISE E DE OUTRA BANDA MENOR. M - MARCADORES DE PESO MOLECULAR; TEMPOS DE PROTEÓLISE: 0, 2, 5, 10,20 E 40 MINUTOS E 1:20, 3, E 24 HORAS APÓS A AÇÃO DA ENZIMA. SETA NA COR AMARELA EVIDÊNCIA BANDA QUE SE MANTEVE CONSTANTE. SETA NA COR ROSA INDICANDO BANDA MENOR PROVENIENTE DA DIGESTÃO .............................................................. 81 FIGURA 42. ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DA HALOGENASE. A) ALINHAMENTO DA HALOGENASE DE CHONDROMYCES CROCATUS (CNDH) QUE FOI UTILIZADO COM MOLDE PARA A CONSTRUÇÃO DOS MODELOS DA STAI E DA STAK. NO ALINHAMENTO É POSSÍVEL OBSERVAR UMA ALTA IDENTIDADE SEQUENCIAL ENTRE AS TRÊS PROTEÍNAS, COM EXCEÇÃO DA REGIÃO C TERMINAL QUE É PRATICAMENTE NÃO CONSERVADO EM NENHUMA DAS ESTRUTURAS. ENTRETANTO NA ESTRUTURA DA CNDH, O SEU C TERMINAL É DESORDENADO E NÃO FOI POSSÍVEL SER OBSERVADO NA ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA. B) ALINHAMENTO DAS HALOGENASES CONHECIDAS PARA A BIOSSÍNTESE DE ANTIBIÓTICOS GLICOPEPTÍDICOS. É POSSÍVEL OBSERVAR QUE UMA SÉRIE DE RESÍDUOS SOMENTE NÃO SÃO CONVERSADOS NA STAK E QUE ESSES RESÍDUOS PODEM ESTAR RELACIONADOS COM O RECONHECIMENTO DO SUBSTRATO E SUA ORDENAÇÃO QUE PODE LEVAR A UM PADRÃO DE HALOGENAÇÃO DIFERENTE. ............................................................................... 82 FIGURA 43. MODELOS DE ESTRUTURA TERCIÁRIA DAS HALOGENASES STAI (1) E STAK (2) GERADAS COM BASE NA PROTEINA MOLDE CNDH. ESQUEMA REPRESENTANDO O ENOVELAMENTO DAS HALOGENAS FAD-DEPENDENTES, COM MODULO DENOMINADO ‘CAIXA’ (MODULO DE LIGAÇÃO AO FAD) E O MODULO ‘ PIRÂMIDE’ (MODULO DE RECONHECIMENTO DO SUBSTRATO). ............... 84 FIGURA 44. SUPERFICIE ELETROSTÁTICA. A REFERE-SE A PROTEÍNA STAI E C REFERE-SE A STAK, SETAS INDICAM A REGIÃO DE SULCO. SUPERFÍCIE ELETROSTÁTICA CORTADA PARA VISUZALIZAÇÃO DO TÚNEL DE TRASFERÊNCIA DO CLORO. B REFERENTE A STAI E D PARA STAK, SETAS (EM VERMELHO) INDICAM O TÚNEL DE CADA ENZIMA. .............................................................................................. 85 FIGURA 45. SUPERPOSICAO DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS QUE SE APRESENTAM DIFERENTES ENTRE AS SEQUÊNCIAS DA STAK E STAI. EM VERDE, ENCONTRAM-SE OS RESÍDUOS DA STAI. EM AZUL, OS RESÍDUOS DA STAK SÃO MOSTRADOS. O ÍON CLORO ESTÁ REPRESENTADO EM COR ROSA E O FAD NA COR AZUL E SÃO REFERENTES AO MODELO DA STAK. ................................................................ 86 FIGURA 46. PLASMÍDEO PIJ 10257. STAK PREVIAMENTE CLONADO COM NDEI/PACI E STAI COM NDEI/HINDIII. ESTE PLASMÍDEO POSSUI O GENE DE RESISTÊNCIA A HIGROMICINA COMO MARCADOR DE SELEÇÃO. ................................................................................................................. 88 FIGURA 47. 0.8% TAE GEL DE AGAROSE. DIGESTÃO DO PLASMÍDEO PIJ773 COM ECORI E HINDIII (ROCHE). M- 1KB MARCADOR MOLECULAR (NEB). SETA INDICA O FRAGMENTO CORRESPONDENTE AO MARCADOR DE SELEÇÃO APRAMICINA. ..................................................................................... 88 FIGURA 48. 0.8% TAE GEL DE AGAROSE REPRESENTANDO QUARTO BANDAS RELACIONADAS COM A AMPLIFICAÇÃO POR PCR DO CASSETTE APRAMICINA. FOI USADA ENZIMA DNA POLIMERASE HERCULASE II FUSION (AGILENT TECHNOLOGIES) COM 4 DIFERENTES TEMPERATURAS DE MELTING: 1) 62ºC, 2) 60.6ºC, 3) 57.7ºC E 4) 55ºC. M- 1 KB MARCADOR DE PESO MOLECULAR (NEB). ................................................................................................................................................ 89 FIGURA 49.GEL DE AGAROSE MOSTRANDO A DISGESTÃO DO PLASMÍDEO PIJ10257 COM ENZIMA SACI (ROCHE). SETAS INDICAM O FRAGMENTO (~1.4 KB) QUE CORRESPONDE MARCADOR DE SELEÇÃO APRAMICINA, CONFIRMANDO ASSIM QUE O PLASMÍDEO CONTENDO OS STAK E STAI SÃO APRAMICINA RESISTENTE. COLUNA M- MARCADOR MOLECULAR 1 KB (NEB), COLUNAS 1 A 3 REFEREM-SE AO PLASMÍDEO PIJ10257+ STAI GENE E COLUNAS 4 A 6 AO PLASMÍDEO PIJ10257+ STAK GENE. ....................................................................................................................................... 89 FIGURA 50. STREAKING DE COLÔNIAS EM PLACAS CONTENDO ANTIBIÓTICO DE RESITÊNCIA A.AMYCOLATOPSIS ORIENTALIS, PRODUTORA DE VANCOMICINA; B. CEPA AMYCOLATOPSIS SP. MJM2582, PRODUTORA DE RISTOCETINA; C. CEPA ACTINOPLANES TEICHOMYCETICUS, PRODUTORA DE TEICOPLAMINA; D. CEPA ACTINOPLANES TEICHOMYCETICUS, PRODUTORA DE TEICOPLAMINA USANDO HIGROMICINA COMO MARCADOR DE SELEÇÃO...................................... 90 FIGURA 51.ANÁLISES LC-MS ANÁLISES LC-MS DA PRODUÇÃO PELA CEPA SELVAGEM DE GLICOPEPTÍDEOS: A. AMYCOLATOPSIS ORIENTALIS, PRODUTOR DA VANCOMICINA, TEMPO DE ELUIÇÃO DE 4.37 MIN ; B. AMYCOLATOPSIS SP. MJM2582, PRODUTOR DE RISTOCETINA, TEMPO DE ELUIÇÃO DE 0.52 MIN; C.ACTINOPLANES TEICHOMYCETICUS, PRODUTOR DE TEICOPLAMINA, TEMPO DE ELUIÇÃO DE 5.65 MIN.SETAS INDICAM OS PICOS REFERENTS AO TEMPO DE ELUIÃO. CADA ESPECTRO MOSTRA A MONITORIZAÇÃO IÓNICA SELETIVA PARA CADA GLICOPEPTÍDO. ...... 92 FIGURA 52.CROMATOGRAMA LC-MS DA PRODUÇÃO DE GLICOPEPTÍDEO POR AMYCOLATOPSIS ORIENTALIS (CEPA PRODUTORA DE VANCOMICINA) DO MUTANTE CONTENDO GENE STAK. M/Z 1481.30 – 1483.50 REFERE-SE A VANCOMICINA ADICIONADA DE UM HALOGÊNIO. NÓS SELECIONAMOS TRÊS COLÔNIAS PARA CADA MUTANTE CONSTRUÍDOS COM STAK E OUTRAS TRÊS COLÔNIOAS PARA MUTANTES CONTEND STAI. ENTRETANTO, ANÁLISES DE MASSA MONSTRAM QUE TODOS OS MUTANTES MANTÉM O MESMO PADRÃO DA CEPA SELVAGEM. ........................... 93 FIGURA 53. CROMATOGRAMA DE MASSA BUSCANDO RISTOCETINA PRODUZIDA PORAMYCOLATOPSIS SP. MJM2582 CONTENDO GENE STAI. O PICO CORRESPONDENTE A PRODUÇÃO DE RISTOCETINA E TAMBÉM A PRODUÇÃO DE RISTOCETINA ACRESCIA DE CLORO (M/Z1069.83 – 1071.34 ) NÃO SE FAZ PRESENTE. O MESMO PADRÃO SE MANTEVE PARA TODOS OS MUTANTES SELECIONADOS. .. 94 FIGURA 54. CROMATOGRAMA (ANÁLISES LC-MS) DA PRODUÇÃO DE TEICOPLAMINA ([M+H]+ = 1878.60 – 1882.00 [M+NA]+= 1892.00 – 1896.00). TRÊS MUTANTES PARA CADA CONSTRUÇÃO COM STAK E OUTROS TRÊS REFERENTES AS CONSTRUÇÕES COM STAI FORAM SELECIONADOS. UM MUTANTE CONTENDO GENE STAI, É REPRESENTADO NESTA FIGURA INDICANDO NÃO HAVER PICOS CORRESPONDENTES PARA PRODUÇÃO DE TEICOPLAMINA ADICIONADA DE CLORO (M/Z 1913.60 – 11917.00 E M/Z1927.60 – 1931.00) ................................................................................................. 94 FIGURA 55. BASE DE PICOS DA ANÁLISE CROMATOGRÁFICA PARA A PRODUÇÃO DE TEICOPLAMINA UTILIZANDO MEIO E25 PARA CULTIVO E MEIO TM1 PARA PRODUÇÃO. NÃO HÁ PICO QUE SE REFERE A M/Z 1913.60 – 1917.00 OU M/Z 1927.60 – 1931.00, O QUAL CORRESPONDEM PARA TEICOPLAMINA ACRESCIDA DE CLORO. ............................................................................................ 95 RESUMO Vários experimentos têm comprovado que compostos naturais podem ter sua atividade biológica alterada devido à presença ou ausência de halogênios ligados. Os antibióticos glicopeptídicos, como a vancomicina e teicoplanina são produtos naturais halogenados que apresentam destacada importância. Halogenases são enzimas que catalizam a transferência de halogênios para um determinado substrato, porém são muito pouco estudadas, principalmente aquelas envolvidas na biossíntese de produtos naturais, como antibióticos glicopeptídicos, mesmo com o seu potencial de aplicação em biologia sintética. Cepas produtoras de glicopeptideos foram obtidas da coleção NRRL e crescidas em meio TSB. O DNA foi extraído e os genes de 3 diferentes halogenases (staI e staK de Streptomyces toyocaensis, composto 47934 and Orf8* de Actinoplanes teichomyceticus, Teicoplanina) foram clonados em pET28a e pET20a. Um gene sintético foi obtido para enzima ComH (biossíntese de complestatina) e clonado em pET28a. A expressão desses genes foi induzida por IPTG e a purificação se deu em colunas de afinidade e gel filtração. Foram realizados estudos biofísicos (CD e DLS da StaI), bem como modelagem molecular e ensaios de complementação para proteínas StaK e StaI. Três halogenases foram purificadas, StaI, StaK e ComH e apresentaram coloração amarela indicando a co-purificação com FAD. Orf8* apresentou-se somente na fração insolúvel. Análises de CD indicam a presença de -hélices e folhas-β e foi possível observar o estado de oligomerização e polidispersividade em diferentes condições para halogenase StaI. Os modelos moleculares deram insights sobre uma possível diferença de padrão de halogenação catalizada pela StaI e StaK, devido à diferença de resíduos hidrofóbicos que formam os sulcos do sítio ativo. Tentativas de ensaios de cristalização para as enzimas StaI, StaK e ComH foram realizadas. No entanto, apenas a proteína StaI apresentou um único cristal não reproduzível mesmo com a troca de tampão em passos de purificação Palavras-chave: Halogenases. Produtos Naturais. Antibióticos Glicopeptídicos. Streptomyces. Biotecnologia. ABSTRACT Various experiments have shown that natural compounds may have their biologic activity altered by presence or absence of halogens. Glycopeptide antibiotics, such as vancomycin and teicoplanin are halogenated natural products and they have substantial importance in the medicine. Halogenases, are enzymes that catalyses the attachment of halogens to a substrate, howerver they are not well understood mainly those ones in glycopeptide biosynthesis. Producing glycopeptides strains were obtained from NRRL collection, they were grown in liquid TSB medium and the DNA was extracted. Three different genes for halogenases [(staI and staK from Streptomyces toyocaensis (compound 47934) and Orf8* from Actinoplanes teichomyceticus (Teicoplanin)] were amplified and cloned into pET28a and pET20a. A synthetic gene for comH from the biosynthesis of complestatin was obtained and also cloned in the pET28a. The expression of these four genes was carried out with the induction by IPTG and the purification was performed by affinity and molecular exclusion. Samples of soluble and insoluble fractions and chromatographic peaks were analyzed on SDS-PAGE gel. Circular Dichroism (CD) and Dynamic Light Scattering (DLS) studies were performed for StaI and ComH. We have also performed molecular modelling for StaI and StaK enzymes because attempts to crystallise all the soluble halogenases did not return any result (only StaI had a single crystal which showed not reproduzible). ComH, StaI and StaK were purified and they had an yellow colour indicating the co-purification with FAD.Orf8* was predominantly insoluble. SDS-PAGE gel showed that StaI had high purity already after the affinity purification and the molecular exclusion indicates that it had a tendency to aggregate. By the analysis of CD was possible to observe the structural integrity of StaI and ComH, which shows, as expected, the presence of -helixes and β-sheets. The DLS analysis shows the oligomerization state of the sample and some polidispersivity in several conditions. The molecular models give some insights on the possible difference of halogenation pattern catalysed by StaI and StaK due to the difference of hydrophobic residues that form the groove of the active site. They indicated that StaI and StaK might accommodate the substrate in a different orientation. Keywords: Halogenases. Natural products. Glycopeptide antibiotic. Streptomyces. Biotechnology. 18 1 Introdução A resistência aos antibióticos continua a ser um problema de saúde pública global (COOPER, 2011). De acordo com o Centro para Controle e Prevenção de Doenças (CDC, 2013), bactérias resistentes causam anualmente mais de dois milhões de infecções nos Estados Unidos, com uma taxa de mortalidade de mais de 20.000 pessoas por ano. A Organização Mundial de Saúde (OMS), no seu relatório global sobre vigilância e resistência antimicrobiana em 2014, afirmou que, mesmo em uma era pós- antibiótico, as infecções comuns e lesões menores podem matar. Fato o qual não está longe de ser uma fantasia apocalíptica, em vez disso, é uma possibilidade muito real para o século 21. Foi pensando nisso que em setembro de 2014, o governo dos EUA emitiu uma política nacional a fim de definir uma força-tarefa para combater bactérias resistentes aos antibióticos (CHENG et al., 2015). A resistência antimicrobiana é uma das principais ameaças à saúde humana. Infelizmente, o que se observou nos últimos anos foi um aumento do número de infecções causadas por tais bactérias resistentes (WALKER et al., 2009). Este fato chama a atenção para a necessidade de descoberta de novos medicamentos ou então a melhoria de antibióticos existentes. Para cada fármaco de sucesso que chega ao mercado, dezenas de milhares de compostos precisam ser selecionados e introduzidos no processo de descoberta de um novo medicamento. No entanto, esforços a fim de melhorar a diversidade dos compostos a serem selecionados são cruciais para aumentar a probabilidade de que um composto se torne um medicamento aprovado. Uma análise das fontes de novas drogas no período de 1981 a 2010 revelou que 64% dos 1.073 medicamentos são ou produtos naturais ou derivados de produtos naturais. Dotado de extraordinária diversidade estrutural e atividades biológicas inigualáveis, produtos naturais são classificados como metabólitos secundários montados e modificados por vias biossintéticas exclusivas em microrganismos e plantas, os quais têm sido utilizados para o tratamento de várias doenças e estão se tornando uma área de pesquisa fundamental para a descoberta de novos medicamentos (ENFIELD et al., 2014; MAY, 2014; RAJESH et al., 2015) 19 1.1 Produtos naturais halogenados A ocorrência natural de produtos organohalogênicos já foi considerada no passado como excêntricos químicos raros ou simplesmente como artefatos ocorridos durante o processo de isolamento dos mesmos. Entretanto, recentemente, eles têm assumido um importante papel no campo dos produtos naturais. Assim o número de compostos organohalogênicos identificados na natureza multiplicou-se por volta de 250 vezes durante o período de 1960 até 2000 (GRIBBLE, 2004). A sua importância e prevalência é notavelmente abundante. Em 2004, mais de 4.500 produtos naturais halogenados já tinham sido descobertos. Destes, 2.300 são compostos clorados, 2.100 bromados, 120 compostos iodados e 30 fluorados. A distribuição de organohalogênios é exatamente proporcional em relação à abundância natural dos halogênios disponíveis para uso no ambiente (GRIBBLE, 2004). A incorporação de halogênios em produtos naturais altera suas propriedades físicas, incluindo efeitos eletrônicos e estéricos, que podem ser cruciais para a determinação da afinidade e seletividade das interações com alvos biológicos. Muitos dos genes que codificam enzimas incorporadoras de halogênios, ou halogenases, estão presentes em cluster gênicos de rotas biossintéticas específicas de produtos naturais. A halogenação orgânica ocorre em uma faixa muito diversa de família de compostos, sendo desde terpenos a policetídeos e peptídeos não-ribossomais. Geralmente os átomos de halogênio são incorporados em carbonos alifáticos, centros olefínicos, e em uma larga variedade de anéis aromáticos e heterocíclicos (VAILLANCOURT et al., 2006). A cloração é a modificação predominante, seguida por bromação, enquanto a iodação e a fluoretação são raras. Como a presença dos halogênios modifica as propriedades físicas, eles também produzem profundas influências na atividade biológica destes compostos (NEUMANN; FUJIMORI; WALSH, 2008). Portanto não é surpresa encontrar compostos orgânicos halogenados que são moléculas bioativas, sendo que muitas delas com importantes aplicações clínicas em humanos. A vancomicina (Figura 1E), por exemplo, tem sido utilizada historicamente como antibiótico de ultima escolha contra bactérias Gram-positivas resistentes a meticilina. A presença de dois substituintes de cloro na vancomicina é necessária para que a molécula mantenha a sua conformação biológica ativa. Entretanto, cepas de bactérias resistentes à vancomicina já foram isoladas, o que significa que ocorre a necessidade de descoberta de novas drogas para 20 combater ameaças infecciosas (HARRIS, 1985). Vários outros antibióticos, como diversos glicopeptídeos, a clorotetraciclina (Figura 1C) e o clorafenicol (Figura 1D) também são exemplos de organohalogênicos com interesse terapêutico (VAILLANCOURT et al., 2006). Outras propriedades úteis de alguns produtos naturais clorados incluem: a atividade antitumoral (rebecamicina [Figura1A] a partir da bactéria do solo Lechevalieria aerocolonigenes, salinosporamida A [Figura 1B], spongistatina, e calicheamicina (YEH; GARNEAU; WALSH, 2005); (FENICAL; JENSEN, 2006; NICOLAOU; SMITH; YUE, 1993) e atividade contra o Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (maracen A5, produzido por Sorangium cellulosum). Produtos naturais clorados, também são encontrados em plantas (o romucosine B12 alcalóide de Rollinia mucosa, com atividade anti-agregação plaquetária), insetos (a feromônio sexual 2,6-diclorofenol de carrapatos estrela solitária), e até mesmo vertebrados (composto analgésico epibatidina, extraído do sapo Epipedobates tricolor) ( GRIBBLE, 2004; (BERGER, 1972); (KUO et al., 2001). Figura 1. Compostos naturais clorados. A) Rebecamicina; B) Salinosporamida; C) Clorotetraciclina; D) Cloranfenicol; E) Vancomicina A B C D E Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 21 Muitos compostos bromados são isolados de ambientes marinhos por conta da alta concentração relativa de Br- na água do mar. Um exemplo de composto bromado conhecido é o antitumoral placortamina C ( Figura 2) , encontrado em associação com a esponja marinha Plakortis nigra. Algas marinhas vermelhas são outra fonte prolífica de compostos bromados, tal como o potente inseticida telfairina de Plocamium telfairia. Outro gênero de algas vermelhas, Laurencia, produz uma incrível variedade de esqueletos moleculares bromados, incluindo as moléculas neoirietetraol, japonenina A, laurefucina e lauralena (GRIBBLE, 2003). Apenas alguns compostos bromados são produzidos por organismos terrestres como é o caso do composto conhecido apenas como CJ-19.784, isolado a partir do fungo Acanthostigmella (GRIBBLE, 2004). Um composto bromado particularmente interessante é 2-octil-γ bromoacetoacetato, originalmente isolado a partir de fluido espinal cerebral humano. Embora pouco se saiba sobre sua origem ou biossíntese, esta molécula está relacionada na regulação do sono REM (Movimento Rápido do Olho, do inglês, Rapid Eye Movement) (PATRICELLI et al., 1998). Tiroxina é um conhecido hormônio da tiroide de mamíferos, e o composto iodolactona ocorre nas glândulas da tiroide de cães. Embora os hormônios iodados sejam, provavelmente, os compostos organohalogenados mais conhecidos, há também muitos outros produtos naturais iodados com atividades biológicas úteis (GRIBBLE, 2004; (GRIBBLE, 2003). Um exemplo citado por (AHLERT et al., 2002), é o composto calicheamicina, isolado a partir da bactéria Micromonospora echinospora ssp. calichensis, é um potente agente antitumoral que se liga aos sulcos do DNA e provoca a clivagem oxidativa da cadeia dupla. Apesar da relativamente baixa concentração de iodeto em água do mar em comparação com o brometo e cloreto, vários produtos naturais iodados foram descobertos em amostras marinhas. Tasihalida A (Figura 2), isolado a partir de uma mistura de cianobactéria do género Symploca e uma alga vermelha, é um diterpeno iodado. Outra espécie de alga vermelha, Hypnea valetiae, produz 5'-desoxi-5-iodotubercidina, um inibidor de adenosina quinase que tem sido utilizada para estudar o metabolismo de nucleotídeos. Além disso, nem todos os produtos naturais halogenados contêm apenas um tipo de halogênio. O composto Placohipaforina A, associada à esponja marinha Plakortis simplex e o sesquiterpeno iodado 10-bromo-7-hidroxi-11- iodolaurena da alga marinha Laurenica nana contêm ambos, bromo e iodo com substituintes (WILLIAMS, P. G. et al., 2003); CAMPAGNUOLO, 2003 E IZAC, 1979). 22 Os compostos fluorados não são encontrados em abundancia, até 2004 havia 30 exemplos conhecidos. A toxina fluoracetato descoberta a partir de uma planta da África do Sul, Dichapetalum cymosum, tem sido utilizado no controle de pragas. Muitas outras plantas são conhecidas por produzir compostos fluorados, incluindo Dichapetalum braunii, Dichapetalum toxicarium, Acacia Georginae, e Glycine Max (MURPHY; SCHAFFRATH; O'HAGAN, 2003) A biossíntese de produtos naturais fluorados foi esclarecida através da caracterização da enzima que catalisa a fluoração de S-adensil-L- metionina para produzir 5'-fluoro-5'-desoxiadenosina em Streptomyces cattleya (DONG et al., 2004). Este produto é metabolizado em fluoroacetaoaldeído, que provavelmente serve como um precursor para a maioria de outros compostos fluorados. Ainda não foi conclusivamente mostrado se os metabolitos fluorados produzidos por plantas são sintetizados através de um mecanismo semelhante. Esta via também não leva em consideração a biossíntese do antibiótico fluorado nucleocidina (Figura 2) (GRIBBLE, 2004). Figura 2. Compostos organohalogenados com seus respectivos produtores. Produtos naturais bromados representados por placortamina C e CJ-19.784. Compostos iodados tiroxina e tasihalide A e representando os fluorados, nucleocidina e fluoracetona. 23 1.2 Halogenases O primeiro produto natural halogenado caracterizado foi o 3,5-diiodotirosina, identificado a mais de 200 anos atrás. No entanto, a caracterização da primeira halogenase conhecida, uma haloperoxidase heme-dependente, ocorreu somente na década de 50. Em 1984, a primeira atividade de halogenação de uma enzima vanádio- dependente foi demonstrada no microrganismo marinho Ascophyllum nodosum (NEIDLEMAN; GEIGERT, 1987); DUNFORD, 1999; VILTER, 1984). Ambas as haloperoxidases (vanádio-dependente e heme-dependente) exigem peróxido de hidrogênio e catalisam halogenação de substratos ricos em elétrons. Devido a nenhuma das haloperoxidases ter poder oxidativo para catalisar reações de fluoração, a existências de outras enzimas de halogenação foi proposta por Neidleman e Geigert em 1986. Somente no ano de 1995, uma outra halogenase, do tipo flavino-dependente, relacionada a biossíntede de tetraciclina foi identificada. Essas halogenases requerem a redução de flavina (FADH2) e O2, e com excepcional seletividade e regiosseletividade catalisam halogenações de subtratos ricos em elétrons (DAIRI et al., 1995). Em 2002, a primeira enzima de fluoração, 5'-fluoro-5'-desoxiadenosina sintase (5'-FDAS) foi descoberta e, subsequentemente, caracterizada estruturalmente. 5'-FDAS emprega um mecanismo de halogenação nucleófila e requer o substrato S-adenosil-L- metionina (SAM) (O'HAGAN et al., 2002). Até então, as classes de halogenases conhecidas não poderiam explicar todos os produtos naturais halogenados observados, como no caso do composto tri-clorado barbamida. Em 1999, foi demonstrado que este composto requer um mecanismo de halogenação radical. Em 2005, foi assim, comprovada a atividade das enzimas não-heme ferro-dependente e O2-dependentes, as primeiras enzimas capazes de halogenar carbonos de centros não ativados (HARTUNG, 1999), (VAILLANCOURT et al., 2006). As duas classes de halogenases O2-dependentes, FADH2-dependentes e não- heme ferro-dependente, são conhecidas como sendo responsáveis por uma grande variedade de reações de halogenação. As halogenases flavina-dependente, em particular, são bastante comuns. Existem ainda vários produtos naturais halogenados para o qual o mecanismo de halogenação não está totalmente esclarecido. Um exemplo é o grupo funcional brometo de alquilo do composto jamaicamida A, um produto natural, a partir de Lyngbya majascule (EDWARDS et al., 2004). Ambos os mecanismos de halogenação flavina-dependentes e não-heme ferro-dependente podem ser previsto para 24 a biossíntese deste grupo funcional, uma vez que o cluster gênico contém os dois tipos de enzimas. Um segundo exemplo é o composto fluorado nucleocidina, os quais os genes biossintéticos ainda são desconhecidos. Porém, resta saber se ainda novos métodos de halogenação ou halogenases serão descobertos. A recente caracterização de uma SAM-dependente que emprega um mecanismo nucleofílico indica que ainda há muito a ser descoberto sobre a halogenação enzimática (FUJIMORI et al., 2007); (GALONIC; VAILLANCOURT; WALSH, 2006). 1.2.1 Atividade relacionada à halogenação A importância dos átomos halogênicos para a atividade biológica pôde ser observada em vários compostos naturais. Por exemplo, a eficácia terapêutica da salinosporamida A, que é um inibidor do proteassômico, e que está correntemente em testes clínicos para tratamento de mieloma requer a presença do substituinte clorado para a sua atividade e mecanismo de ação (GROLL; HUBER; POTTS, 2006) assim como para a atividade antimicrobiológica do composto rebeccamicina, cujo derivado descloro perde totalmente sua atividade (PEREIRA et al., 1996). Substituintes halogênicos podem aumentar a lipofilicidade de um composto quando comparado com uma substituinte hidroxila, como evidenciado pelos valores mais positivos de log P (coeficientes de partição hidrofóbica octanol-água). Como exemplo, a atividade da toxina de plantas siringomicina E, a qual depende a inserção na membrana, é completamente abolida se o halogênio é substituído por um grupo hidroxila. A maior lipofilicidade do substituinte cloro pode promover a inserção na bicamada lipídica, enquanto que um grupo hidrofílico, na mesma posição, elimina a sua atividade (GRGURINA et al., 1994). A eletronegatividade dos halogênios e a natureza covalente polar de uma ligação carbono-halogênio podem interferir nas propriedades de um composto. Flúor, em particular, pode ter um efeito fortemente indutivo em aminas vizinhas, diminuindo a sua basicidade e, portanto, aumentando a biodisponibilidade do composto. Há grandes variações nas propriedades dos diferentes halogênios e os seus respectivos efeitos sobre um determinado esqueleto orgânico (MULLER; FAEH; DIEDERICH, 2007). Devido à importância que os halogênios têm sobre os compostos naturais, associada à dificuldade encontrada pelos métodos tradicionais de halogenação química, e também devido à falta de especificidade e regioseletividade, as halogenases 25 apresentam-se como enzimas extremamente promissoras na bioengenharia racional para produção de novos metabólitos utilizando biossíntese combinatorial ou síntese enzimática dentro da crescente área da biologia sintética. A introdução ou alteração de halogênios pode levar ao desenvolvimento de drogas mais eficazes, propriedades farmacocinéticas otimizadas ou mesmo novos mecanismos de ação (NEUMANN et al., 2008). A aplicação de engenharia metabólica utilizando halogenases já tem sido empregada com sucesso para a produção de derivados dos antitumorais indolocarbozoles, rebeccamicina e staurosporina (SANCHEZ et al., 2005). Mais recentemente, Heide e colaboradores, 2008 também obtiveram sucesso na produção de derivados clorobiocina utilizando a halogenase da biossíntese de hormaomicina (HEIDE et al., 2008). 1.2.2 Classes de Halogenases Atualmente, segundo Vaillancourt e colaboradores, 2006, as halogenases podem ser divididas em:  Haloperoxidases:  heme-dependentes vanádio-dependentes,  Halogenases oxigênio-dependentes: flavina-dependentes não-heme ferro-dependentes,  Halogenases nucleofílicas 1.2.2.1 Haloperoxidases: Heme-dependentes As haloperoxidades heme-dependentes são encontradas em plantas, fungos, bactérias e animais. Shaw e colaboradores (1961) isolaram e caracterizam estruturalmente a primeira haloperoxidase do fungo Caldoriomyces fumago, e observaram que ela catalisa a cloração de substratos orgânicos, na presença de íons cloreto e peróxido de hidrogênio, sendo nomeada como cloroperoxidase. No entanto, após esta descoberta, em estudos continuados, foi observado que esta haloperoxidase também utiliza os íons brometo e iodeto nas suas reações de halogenação. Mais tarde, foram detectados e isolados, de algas e algumas bactérias Gram-positivas, várias bromoperoxidases, isto é, enzimas que catalisam a bromação, mas não a cloração, de substratos orgânicos, na presença de peróxido de hidrogênio (BADEN; CORBETT, 1980; MANTHEY; HAGER, 1981; MARSHALL; WRIGHT, 1996; VAN PEE; 26 LINGENS, 1984). Estas bromoperoxidases e cloroperoxidases contêm ferro ligado a uma protoporfirina IX, ou um derivado, como grupo prostético (LITTLECHILD et al., 2002; VAN PEE, 1996). O mecanismo geral das haloperoxidases baseia-se na produção enzimática de ácido hipo-halogenoso (HOX), à custa de um peróxido, habitualmente o peróxido de hidrogênio: X- + H2O2 + H+ → HOX + H2O HOX + HA → AX + H2O Onde X- pode ser o cloreto, brometo, iodeto ou o pseudo-halogeneto SCN- (tiocianogênio) (NEIDLEMAN; GEIGERT, 1987). Assim, na presença de peróxido de hidrogênio, por um processo de transferência eletrônica, produz-se o ácido hipo- halogenoso (LIGTENBARG et al. 2003), intermediário bastante reativo, que pode reagir com um receptor nucleofílico (HA), quando presente, para produzir compostos orgânicos halogenados. O mecanismo de halogenação da cloroperoxidase de Caudariomyces fumago e de outras haloperoxidases heme-dependentes (Figura 3) inicia-se com o peróxido de hidrogênio que fica coordenado ao centro ativo, através da ligação ao ferro (uma protoporfirina IX férrica no centro ativo, Fe III heme) e a um resíduo aminoácido endógeno à proteína, localizado nas proximidades do centro ativo (VAN PEE; UNVERSUCHT, 2003). Este resíduo de aminoácido (que pode ser uma histidina, metionina ou ácido glutâmico) atua como um catalisador ácido-base que primeiro desprotona o peróxido de hidrogênio e subsequentemente protona o peróxido ionizado que se encontra ligado ao ferro hêmico. Após este passo, segue-se uma clivagem heterolítica da molécula de H2O2, com a transferência de dois elétrons do grupo hêmico, originando a formação de uma molécula de água e de um intermediário típico dos peroxidases hêmicos, um complexo radical catiónico oxo-ferril-porfirínico (heme Fe IV=O). Este intermediário instável reage com o íon halogeneto (X-) para formar um hipotético hipo-halogeneto férrico designado por composto X (heme Fe III-O-X). O composto X, também instável, decompõe-se de forma a dar origem à enzima na sua forma nativa e ao ácido hipo-halogenoso (HOX) (HOFRICHTER; ULLRICH, 2006; WAGENKNECHT; WOGGON, 1997). 27 Figura 3. Mecanismo catalítico de haloperoxidases heme-dependente (Adaptado de (NEUMANN et al., 2008). 1.2.2.2 Haloperoxidases: Vanádio-dependentes As haloperoxidases dependentes de vanádio são metaloenzimas que contêm como cofactor o vanádio mononuclear. Tal como as haloperoxidases hémicas, estas enzimas catalisam a oxidação de halogenetos na presença de peróxido de hidrogênio. (ALMEIDA et al. 1998; SCHNEIDER et al. 2007). Atualmente, seis estruturas tridimensionais de haloperoxidases de vanádio são conhecidas:  Cloroperoxidase dos fungos C. inaequalis (MESSERSCHMIDT; WEVER, 1996) e Emblellisia didymospora (BARNETT et al., 1998);  Bromoperoxidases das algas vermelhas Corallina pilulifera (OHSHIRO et al., 2002) e Coralina officinalis (ISUPOV et al., 2000);  Bromoperoxidases das algas castanhas Fucus distichus (VREELAND et al. 1998) e A. nodosum (WEYAND et al., 1999). Através de um estudo comparativo entre estruturas cristalográficas e de diversos estudos cinéticos, biofísicos, genéticos e mutacionais, foi possível elucidar o mecanismo de ação destas enzimas. (LITTLECHILD et al., 2002; MESSERSCHMIDT; PRADE; WEVER, 1997; MESSERSCHMIDT; WEVER, 1996; RENIRIE et al., 2000; ZAMPELLA et al., 2005). O mecanismo proposto para a atuação catalítica das haloperoxidases vanádio- dependente é onde o primeiro substrato, o peróxido de hidrogénio se liga à enzima, formando o peroxicomplexo. Após a ligação do peróxido a enzima, ocorre liberação de 28 uma molécula de H2O e posterior ligação e oxidação do segundo intermediário, um halogeneto (Figura 4). Figura 4. Mecanismo catalítico de haloperoxidases vanádio-dependente (Adaptado de (NEUMANN et al., 2008). Uma característica interessante destas enzimas é o fato do estado de oxidação do vanádio se manter inalterado durante todo o ciclo catalítico, ao contrário do que acontece com o ferro nas haloperoxidases heme-dependentes. As haloperoxidases de vanádio apresentam uma estabilidade operacional notável, podendo reter a sua atividade catalítica durante cerca de um mês, quando armazenados em 60% de metanol, etanol e isopropanol. Mantêm-se ativas quando expostas a temperaturas até 70 ºC e a atividade perdida pode ser recuperadas quando são reequilibradas a temperaturas mais baixas (ALMEIDA et al., 2001); NATÁLIO et al. 2005). As estruturas cristalográficas destas haloperoxidases vanádio-dependente revelaram que estas enzimas apresetam uma forma cilíndrica e compacta. Além disso, suas α-hélices são extremamente hidrofóbicas, o que contribui, por sua vez, para uma enorme estabilidade destas enzimas (MACEDO-RIBEIRO et al., 1999). 1.2.2.3 Halogenases oxigênio-dependentes: FADH2-dependente Na década de 90, estudos evidenciaram a existência de um novo tipo de enzima halogenante. Esta enzima foi descrita para a biossíntese do antibiótico pirrolnitrina (WIESNER; VAN PEE; LINGENS, 1988). Várias perhidrolases de Pseudomonas, produtoras de pirrolnitrina foram isoladas e elas foram consideradas como sendo as responsáveis pelas clorações durante a biossíntese deste antibiótico (ITOH; MORINAGA; NOMURA, 1992; WIESNER; VAN PEE; LINGENS, 1988). No entanto, Kiener et al. (1996) demonstrou que ao deletar o gene da perhidrolase de Pseudomona fluorescens, o produto, pirrolnitrina, era formado e não havia qualquer interferência na biossíntese do antibiótico. Comprovando, então, que esta enzima não estava envolvida na biossíntese. Estudos bioquímicos revelaram que dois dos quatro 29 genes contidos no cluster genênico responsável pela biossíntese da pirrolnitrina estão codificados para a produção de enzimas halogenantes, sugerindo haver novo mecanismo de halogenação uma vez que a hipótese de halogenação via perhidrolases foi descartada (HAMMER et al., 1999). Fazendo uso de um mutante que bloqueia o segundo passo da biossíntese da pirrolnitrina, foi possível demonstrar que o primeiro passo da biossíntese resultava na formação de 7-clorotriptofano e que no terceiro passo biossintético, há a formação de aminopirrolnitrina, a partir da cloração do monodescloroaminopirrolnitrina (Figura 5). Visto que, quando mutantes são bloqueados num dos dois passos de halogenação, não há produção de pirrolnitrina, verificou-se, desta forma, que as duas halogenases não substituem uma a outra, o que levou a concluir que possuem diferentes especificidades relativamente aos substratos que utilizam (KIRNER et al., 1998). Deste modo, foi estabelecido um método para determinar a atividade enzimática destas halogenases, usando os seus substratos naturais. No caso da halogenase que catalisa a cloração do triptofano (PrnA), o substrato foi encontrado com grande facilidade; mas a monodescloroaminopirrolnitrina, o substrato da segunda halogenase (PrnC), foi difícil de se encontrar (VAN PEE, 2001). Figura 5. Biossíntese de pirrolnitrina. Demonstração da atividade enzimática de PrnA, B, C e D. (Adaptado de (KIRNER et al., 1996). Foi observado que estas enzimas necessitam de um cofator para exercerem a sua função de halogenação. Kirner e colaboradores demonstraram em 1996, que a adição de 30 de NADH era indispensável para obtenção de produtos clorados. Mais tarde, na etapa de purificação, verificou-se que também era necessário acrescentar FAD em complemento a adição de NADH. Contudo, constatou-se que, a triptofano-7-halogenase (PrnA) não era capaz de catalisar a reação de cloração, mesmo estando na presença dos cofatores FAD e NADH. Desta forma, notou-se a necessidade de uma segunda enzima, para que houvesse a cloração, ou seja, uma flavina redutase (KIRNER et al., 1998), cuja função é a redução de FAD a FADH2 na presença de NADH. As flavina-redutases presentes em Pseudomonas produtoras de pirrolnitrina podem ser subtituidas pelas enzimas correspondentes em E. coli, demonstrando assim que, as halogenases não necessitam de uma flavina-redutase específica. Embora o FMN seja aceito pelas flavina-redutases, o FMNH2 não é aceito pelas halogenases, ou seja, a substituição de FAD por FMN não resulta na produção de nenhum composto clorado, demonstrando deste modo a especificidade destas enzimas para o FADH2 (VAN PEE, 2001), UNVERSUCHT et al. 2005). A reação catalisada pelas halogenases requer FAD na sua forma reduzida (através da reação: FAD + NADH+ H+  FADH2 + NAD), íon cloreto e oxigênio molecular como co-substratos. O FADH2 gerado pela flavina-redutase liga-se a halogenase, reage com O2, íon cloreto e o substrato, no centro ativo dando origem ao produto clorado (reação: FADH2 + O2 + Cl- + L-Trp + H+ FAD + 7-Cl-L-Trp + 2H2O) (KELLER et al., 2000). De modo semelhantes, as enzimas RebF, uma flavina-redutase, e RebH, uma flavina-halogenase, também demonstraram possuir a capacidade para catalisar a produção de 7-clorotriptofano durante a biossíntese do agente quimioterapêutico rebeccamicina (Figura 6) (VAILLANCOURT et al., 2006). 31 Figura 6. Enzima RebH sendo utilizada na foramação do intermediário 7- cloratriptofano na biossíntesse de rebecamicina (YEH et al., 2005). A maioria das bactérias que produzem compostos halogenados apresenta halogenases do grupo das flavino-dependentes ou não heme ferro-dependentes (VAN PEE; PATALLO, 2006). Algumas enzimas pertencentes a esta família já apresentam sua estrutura cristalográfica resolvida, como para PrnA e a RebH, responsáveis pela adição de átomos de cloro nos compostos pirrolnitrina e rebeccamicina (DONG et al., 2005); (BITTO et al., 2008). Essas proteínas são diméricas e cada monômero apresenta uma região de ligação de flavina no N-terminal com homologia as monooxigenases e uma região de reconhecimento de substrato no C-terminal (BLASIAK; DRENNAN, 2009). (Figura 7). Figura 7. Estrutura de uma flavina dependente clorohalogenase (PrnA). A molécula de FAD e o 7-clorotriptofano (produto desta enzima) é mostrado em stick, à molécula de cloro é mostrado como uma esfera rosa. O domínio de reconhecimento da flavina está em salmão e o domínio de reconhecimento do substrato em azul (DONG et al., 2005). 32 1.2.2.4 Halogenase Oxigênio-Dependente: Não-Heme Ferro-Dependente A atividade de uma halogenase dependente do ferro não-heme foi encontrada pela primeira vez por Vaillancourt em 2005. No sequenciamento de vários clusters de produtores de compostos naturais halogenados, não foram identificados halogenases FADH2-dependentes e as moléculas halogenadas encontradas continham ligações C-Cl em carbonos alifáticos localizados em posições afastadas dos grupos ativadores. O ferro pode ser encontrado em centros catalíticos, como é o caso dos haloperoxidases heme- dependentes ou heme-monooxigenases, exemplificados pelo citocromo P450; contudo enzimas não-heme ferro-dependentes que descarboxilam o co-substrato α-cetoglutarato são frequentemente encontrados em oxigenases microbianas. O segundo grupo das enzimas dependentes de O2 são enzimas de não-heme ferro-dependentes de α- cetoglutarato. (CHANG; BUMPUS, 2001; VAILLANCOURT et al., 2006). A primeira halogenase Fe2+ não-heme dependente a ter sua estrutura cristalina resolvida foi a SyrB2, obtida de Pseudomonas syringae. O Fe (II) está ligado a dois resíduos de histidina e a um terceiro resíduo portador de um grupo carboxilato, que pode ser aspartato ou glutamato. Esta estrutura é conservada em todas as oxigenases ferro não-hêmicos (FLASHMAN; SCHOFIELD, 2007). No mecanismo catalítico (Figura 8), o ferro exclui a molécula de água, deixando uma posição de coordenação livre; possibilitando a ligação do oxigênio molecular, nesta posição livre, ao FeII ; o que leva a desencadear a descarboxilação do α-cetoglutarato complexado, originando a formação do complexo FeIV=O. Esta espécie é a chave do mecanismo (KULIK et al., 2009). Este intermediário abstrai um átomo de hidrogênio do substrato criando um radical carbono-centrado que vai recuperar este radical com um halogênio ou invés de uma hidroxila. Desta maneira, ocorre preferencialmente uma halogenação a uma hidroxilação, e tal seletividade é alcançada devido ao posicionamento do cloro ao subtrato mais próximo bem como o potencial redox inferior de um radical cloro em oposição a um radical hidróxido (BLASIAK et al., 2006). 33 Figura 8. Mecanismo de ação de halogenase não-heme ferro-dependente (Adpatado de (VAILLANCOURT et al., 2006). 1.2.2.5 Halogenases Nucleofílicas Todas as halogenases nucleófilicas conhecidas, utilizam S-adenosil-metionina (SAM) como substrato eletrofílico no qual os halogênios (F, Br, Cl, I) atuam como nucleófilo. Duas classes são conhecidas: metil-haleto-transferses e fluorinasese e clorinase. A classe metil-haleto-transferase ou simplesmente metiltransferases, responsáveis por transferir o grupo metil do (SAM) para um íon cloreto, brometo ou iodeto (Figura 9). Esta classe encontra-se amplamente distribuída em plantas e microrganismos, e tem sido habitualmente utilizadas para fumigação do solo (cloreto de metila e brometo de metila, descobertos pela primeira vez por (WUOSMAA; HAGER, 1990). Alguns destas enzimas são bastante instáveis, tornando, deste modo, a sua purificação e caracterização bastante difíceis. Desde a sua descoberta inicial e a resolução de sua estrutura, a engenharia genética aplicada a estas enzimas tem sido empregada pela indústria, devido ao seu potencial biotecnológico. Em contraste, o segundo tipo de halogenase nucleofílica, uma fluorinase de Streptomyces cattleya e clorinase de Salinispora utilizam de fluoreto e cloreto, respectivamente, para atacar o carbono 5' do SAM, fornecendo 5'-desoxi-5'-haloadenosina (Figura 10). A enzima fluorinase também catalisa a reação inversa, ou seja, a quebra de ligação C-F. O cloreto também pode ser utilizado por esta fluorinase, dando origem ao 5’-cloro-5- deoxiadenosina, sendo este um raro exemplo de uma substituição nucleofílica biológica. Contudo o equilíbrio destas reacções tende para os substratos iniciais não-halogenados (VAILLANCOURT et al., 2006). 34 Figura 9. Reação de catálise de uma metiltransferases (MURPHY et al., 2003). Figura 10. Reação de catálise por um fluorinase (DENG et al., 2006). 1.3 Antibióticos Glicopeptídicos Entre os compostos halogenados, temos também os antibióticos glicopeptídicos (GPAs), os quais são essenciais para o controle de doenças infecciosas causadas por bactérias patogênicas Gram-positivas, principalmente estafilococas resistentes a meticilina (MRSA). Três GPAs estão em uso clínico atualmente: os produtos naturais vancomicina e teicoplanina, e a droga semi-sintética telavancina (Vibativ) aprovado em 2009 pela Food and Drug Administration (FDA) (YIM et al., 2014). A vancomicina foi o primeiro glicopeptídeo a ser descoberto em 1953, obtida da cepa de Amycolatopsis orientalis encontradas em uma amostra de solo. Segundo a etimologia da palavra, vancomicina deriva de “Vanquish” que significa vencer, superar, conter, dominar. Ela foi introduzida no mercado cinco anos mais tarde, pela companhia farmacêutica Eli Lilly e desde então, tem sido um pilar para o tratamento de infecções 35 graves causadas por bactérias Gram-positivas (LEVINE, 2006). Inicialmente, vancomicina era usada de modo brando devido à eficácia de outros antibióticos, como os ß-lactâmicos semi-sintéticos, e também por causa dos efeitos colaterais adversos devido a contaminantes presentes em preparações de vancomicina, uma vez que a obtenção da droga numa forma altamente purificada ainda era difícil de se obter. Com o passar dos anos, melhoras foram obtidas na etapa de purificação e houve um elevado aumento da prevalência de Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Assim no final dos anos 70 houve um aumento exponencial no uso e dependência de vancomicina. Na Europa, o antibiótico lipoglicopeptideo (LGPA) teicoplanina A2 purificado de Actinoplanes teichomyceticus também foi introduzido para uso clínico em meados dos anos 1980. Teicoplanina mostrou atividade antibiótica comparável no espectro de vancomicina, mas com uma atividade superior para enterococos e outros organismos. E foi no final dos anos 80, que se registrou o aparecimento das primeiras cepas de enterococos resistentes à vancomicina, o que veio como uma surpresa para a comunidade clínica que cada vez mais utilizava GPAs para tratar doenças infecciosas (KIRST; THOMPSON; NICAS, 1998; WILLIAMS, A. H.; GRUNEBERG, 1984). Os antibióticos glicopeptídicos interferem no metabolismo de construção da parede celular das bactérias. Para isso, ligam-se na porção terminal D-Ala-D-Ala de um pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano, interferindo na etapa de transglicosilação e subsequente transpeptidação, inibindo a formação da parede celular bacteriana (COURVALIN, 2006). 1.3.1 Classificaçãos dos Antibióticos Glicopeptídicos Quimicamente, os antibióticos glicopeptídeos são moléculas complexas constituídas de um núcleo heptapeptídico (aglicone) que é caracterizado pelos extensivos cross linkings das cadeias laterais aromáticas e decorado com diferentes glicosilações, acilações e halogenações (NAGARAJAN, 1993). Entretanto, com base em sua estrutura química, os antibióticos glicopeptídicos podem ser classificados em 4 diferentes grupos (LANCINI, 1989). Três grupos são distinguidos pela variação dos resíduos de aminoácido que formam o N-terminal do centro peptídico e um quarto grupo pode ser distinguido como um grupo a parte, devido à presença de um ácido graxo não comum aos outros grupos (NAGARAJAN, 1993). Os antibióticos do grupo I, 36 que incluem a vancomicina, apresentam dois aminoácidos alifáticos na posição 1 e 3 do peptídeo central; os do grupo II, representado pela avoparcina, apresentam dois resíduos aromáticos; os do grupo III, na qual a ristocetina é um membro, apesar de apresentarem dois resíduos aromáticos na posição 1 e 3 são diferentes do grupo II por apresentam uma ligação do tipo éter juntando esses aminoácidos; o grupo IV ou teicoplaninas, pode ser considerado um subgrupo do grupo III, uma vez que a única diferença é a presença de um ácido graxo ligado a um aminoaçúcar (NAGARAJAN, 1993); STROHL, 1997). (NICOLAOU et al., 1999). Alguns autores mencionam ainda que os antibióticos glicopeptídeos podem apresentar um grupo V, que seria representado principalmente pela complestatina, por apresentar um triptofano ligado ao aminoácido central (Figura 11). 37 Figura 11. Os cinco diferentes grupos de antibióticos glicopeptídicos. Os retângulos em azul na vancomicina e avoparcina mostram as posições dos resíduos 1 e 3 que são diferentes entre o grupo I e II. Os círculos em vermelho mostram a ligação éter entre os resíduos 1 e 3, que são aromáticos na ristocetina (grupo III) e teicoplanina (grupo IV) e o círculo em verde mostra a presença da cadeia alifática na teicoplanina (grupo IV). O retângulo em verde na complestatina mostra a presença de um triptofano ligado ao aminoácido central. Complestina Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV Grupo V 38 . Os estudos realizados por Harris et al., 1985 mostram que compostos da vancomincina monoclorados ou declorados apresetam uma afinidade consideravelmente reduzida na ligação com o peptídeo D-Ala-D-Ala da parede celular microbiana e conseqüentemente uma perda de atividade de mais de 70% contra S. aureus. Entretanto, sabe-se que as halogenases presentes nos clusters gênicos da biossíntese de antibióticos glicopeptídicos não contém a tríade formada por Asp-His-Ser que são freqüentemente encontradas nas não-heme halogenases sugestionando que ela pode ter um novo mecanismo para sua atividade enzimática. Além disso, a seqüência da ComH (relacionada com a biossíntese da complestatina) mostra que ela tem similaridade com epoxidases que faz sugestionar que talvez ela mimetiza o mecanismo desta enzima (CHIU et al., 2001). 1.3.2 Biossíntese dos glicopeptídeos Muitos clusters gênicos de glicopeptídeos, quase uma dúzia, já foram sequenciados e caracterizados nos últimos 15 anos. Destes, mais da metade foram publicados em anos recentes, são eles: balhimicina (bal), cloroeremomicina (cep), vancomicina (vps), A40926 (dby), A47934 (sta), teicoplamina (tcp/tei) pekiscomicina (pek) e UK-68597 (auk) (YIM et al., 2014). Uma visão abrangente sobre a biossíntese de glicopeptídeos é possível combinando o conhecimento sobre a biossíntese balhimicina, onde quase todas as etapas biossintéticas foram elucidadas, com o conhecimento das reações específicas analisadas em outros produtores (STEGMANN; FRASCH; WOHLLEBEN, 2010). A biossíntese de antibióticos glicopeptídicos pode ser divida em três etapas: 1. Fornecimento de blocos de construção básicos por específicas vias de biossíntese. 2. Ligação de blocos de construção: interligação das cadeias laterais aromáticas e halogenação, todas realizadas provavelmente por um complexo multi enzimático. 3. Modificação do heptapeptído por glicosiltransferases e metiltransferase e, no caso de glicopeptídeos tipo IV, adicionalmente, por aciltransferases e, eventualmente, por sulfotransferases. 39 Todos os genes necessários para a síntese de aminoácidos não-proteinogênicos (ß - Hidroxitirosina [ß-HT], (S)-3,5-dihidroxifenilglicina [Dpg] e L-p-hidroxifenilglicina [Hpg]) estão localizados no cluster. O precursor de ß-HT é a tirosina, carregada no módulo da peptídeo sintetase, a qual é subsequentemente hidroxilada por uma mono- oxigenase (OxyD). Finalmente, uma perhidrolase catalisa a liberação de ß-HT a partir do módulo de peptídeo sintetase. A atividade destas enzimas foi comprovada com a inativação da peptídeo sintetase e verificação da ausência de ß-Ht e posterior suplementação em A. balhimicina, com retorno da produção de balhimicina (MULYANI et al., 2010; PUK et al., 2004). Hpg é um derivado de hidroxifenilpiruvato. Na biossíntese de cloroeremomicina, produzida por A. orientalis, três enzimas (ácido p-hidroximandélico sintase, hidroximandelato oxidase e aminotransferase) são necessárias para esta conversão de hidroxifilpiruvato em Hpg (HUBBARD; THOMAS; WALSH, 2000). O aminoácido não-proteinogênico Dpg é sintetizado através de um mecanismo da policetídeo-sintase (PKSIII). Quatro genes, que formam um operon (dpgABCD), são requeridos para fornecer Dpg. Quando o gene dpgA foi inativado, não foi possível observar a produção de balhimicina. Análises revelaram que DpgA utiliza apenas malonil-CoA como substrato para sintetizar ácido 3,5-di-hidroxifenilacético. O ultimo passo na via de produção de Dpg é a transaminação, assim como na produção de Hpg (PFEIFER et al., 2001). Posteriormente, os aminoácidos não-proteinogênicos (Hpg, Dpg e ß-Ht) e os aminoácidos proteinogênicos (Tyr, Leu, Asn, Ala e Glu) são ligados por um conjunto específico de enzimas (NRPS) de modo a constituir uma sequência de peptídeos, chamado de heptapepitídeo. O heptapepitídeo de antibióticos glicopeptídeos é sintetizado pela Peptídeo Sitetase Não-Ribossomal (NRPS, do inglês nonribosomal peptide synthetase). O complexo enzimático NRPS é multimodular e as enzimas trabalham montando os aminoácidos como uma linha de produção. Cada unidade funcional, ou seja, cada módulo corresponderá a um aminoácido. A sequência primária de peptídeo é ditada pela ordem dos módulos da NRPS. Cada módulo NRPS pode codificar vários domínios. Isto inclui, mas não está limitado, os domínios de condensação (C), adenilação (A), de tiolação (T), também conhecida como proteína carreadora peptidil (PCP), epimerização (E) e tioesterase (TE). Domínios C, A e T são essenciais em cada módulo, ao passo que um único domínio, tioesterase, finaliza a síntese e cliva a cadeia peptídica a partir da montagem pela NRPS. Domínios de 40 adenilação são responsáveis pelo reconhecimento e ativação do substrato, e consequentemente a sua sequência é usada para prever o aminoácido codificado pelo módulo correspondente (MARAHIEL; ESSEN, 2009); (HAHN; STACHELHAUS, 2006). Todos os intermediários da linha de montagem das NRPS formam uma ligação tioéster com o braço 4-fosfopanteteína da PCP. O domínio de condensação catalisa a formação da ligação peptídica entre dois intermediários ligados a PCP adjacentes. O domínio epimerase converte a estereoquímica dos aminoácidos a partir de L- a uma mistura de D- e L- por desprotonação e reprotonação do α-carbono, quando está interligado ao domínio PCP. O domínio condensação é específico para um estereoisômero (MARAHIEL; ESSEN, 2009). Enquanto o peptídeo está covalentemente ligado ao domínio PCP da NRPS, crosslinks oxidativos acorrem. Três genes de oxigenase (chamados oxyA / B / C em A. balhimycina) são encontrados e as sequências são similares as P450 monooxigenases. Estudos têm demonstrado que a inativação das enzimas OxyA-C estão envolvidos nas três etapas de conversão do precursor em uma aglicona linear ciclizado de cadeia lateral, o primeiro intermediário biológico ativo. Os substratos das oxigenases são intermediários que estão vinculados as NRPS: OxyB catalisa o fechamento do anel diariléter. Em seguida, OxyA catalisa a segunda ciclização. OxyC finaliza o anel diariléter (GEIB et al., 2008; STEGMANN et al., 2006; ZERBE et al., 2004). Os glicopeptídeos apresentam diferentes padrões de cloração. A halogenação foi estudada principalmente na biossíntese de balhimicina, que é clorada em ambos resíduos ß-Ht. A inativação do gene de bhaA levou à produção de desclorobalhimicina indicando que a halogenase FADH2-dependente era responsável pela cloração de ambos os ß-Ht. A partir da ocorrência de intermediários clorados de balhimicina produzidos por mutantes de A. balhimycina concluiu-se que os substratos das halogenases são intermediários, os quais estão ligados a NRPS. Assim, as etapas centrais da biossíntese de glicopeptídeos são provavelmente catalisadas por um complexo multi-enzimático que consiste em NRPS, oxigenases e halogenase. Outros clusters da biossíntese de glicopeptídeos demonstraram apresentar uma ou duas halogenases o que corresponde para um estrutura com 1 a 4 cloros. Clusters com uma halogenase são comumente clorados em Bht6 e Tyr/Bht2, enquanto clusters com duas halogenases são observados halogênios em Hpg1, Dpg3 ou Hpg5 (composto A47349 e UK-68597) sugerindo que possa ser predito uma halogenação específica por cada halogenase (WOHLLEBEN; STEGMANN; SUSSMUTH, 2009); (STEGMANN et al., 2010). 41 O heptapeptídeo resultante dos crosslinks, em fase final, pode sofrer ação das enzimas glicosiltranferases, aciltransferases, sulfotransferases e metiltransferases. O cluster biossintético de balhimicina contem três genes que correspondem a glicosiltransferases bgtfA/B/C. Foi comprovado, através de análises mutacionais, que a glicosilação ocorre em uma ordem indefinida. As alterações provenientes das ações destes grupos de enzimas podem influenciar nas propriedades biológicas, solubilidade, dimerização, indução de resistência, etc. (WOHLLEBEN et al., 2009); (TRUMAN et al., 2009). 1.4 Biossíntese combinatorial aplicada a glicopeptídeos A biossíntese combinatória envolve a engenharia genética das vias biossintéticas naturais para a produção de novos compostos usando a maquinaria biossintética existente em cada organismo, especialmente para obtenção de antibióticos derivados policetídeos e peptídeos não ribossomais (WRIGHT; SUTHERLAND, 2007). A complexidade estrutural dos produtos naturais, em muitos casos, faz com que seja difícil produzir análogos com atividades medicinais melhoradas. Em contraste, a biossíntese combinatorial explora a promiscuidade de substratos e emprega enzimas e vias modificadas para produzir novos produtos "não naturais", ampliando substancialmente a diversidade estrutural de produtos naturais com potencial de valor farmacêutico. Existem três vantagens da biossíntese combinatórial para a descoberta de medicamentos. Em primeiro lugar, ela ajuda a enriquecer a originalidade e a diversidade de produtos naturais, o que potencialmente melhora as suas características biológicas. Em segundo lugar, oferece uma forma ambientalmente amigável para produzir análogos de produtos naturais, enquanto a síntese química geralmente envolve múltiplos passos de reações de proteção/desproteção, condições adversas, solventes orgânicos tóxicos e resíduos de subprodutos. Em terceiro lugar, através da biossíntese combinatorial, a expressão heteróloga pode se tornar mais eficiente em alguns hospedeiros geneticamente maleáveis levando a um aumento de quantidade do composto, eventualmente resultando em drogas menos caras (SUN et al., 2015). Em 1985 Hopwood clonou os genes biossintéticos do antibiótico actinorodina de Streptomyces coelicolor nos microrganismos produtores de medermicina e di- hidrogranaticina, respectivamente. O actinomiceto Streptomyces sp. AM-7161 42 modificado geneticamente produziu, além de medermicina, grandes quantidades de uma nova substância mederorrodina, a qual contém um grupo hidroxila adicional característico da actinorodina. Já o Streptomyces violaceoruber Tü 22, modificado para produzir di-hidrogranaticina, produziu uma nova substância, di-hidrogranatirodina, preservando as configurações dos precursores nos estereocentros da nova molécula. Este trabalho representa a primeira utilização do conceito de biossíntese combinatorial de produtos naturais e abriu uma nova perspectiva para a diversificação estrutural de produtos naturais de interesse (HOPWOOD et al., 1985). Outro exemplo mais recente de sucesso para a biossíntese combinatorial foi o trabalho elaborado por (BALTZ et al., 2006), cuja manipulação genética das vias biossintéticas de Streptomyces roseosporus, produtor da daptomicina, originou uma plataforma robusta com mais de 60 novos antibióticos lipopetídicos, os quais seriam dificilmente obtidos por síntese química. Antibióticos glicopeptídicos oferecerem, em particular, uma excelente oportunidade para expansão química através da biossintese combinatorial, pois as rotas bissintéticas são conhecidas e eles possuem esqueleto estrutural conservado, além de uma ampla diversidade enzimática necessária para síntese dos antibióticos as quais podem ser utilizadas para obtenção de novos derivados (THAKER; WRIGHT, 2015). Os clusters de glicopeptídeos sequenciados até o momento revelam a presença de uma ou duas halogenases. Das halogenações que ocorrem em glicopeptídeos, a cloronação é a mais prevalente. Ela influencia na transmissão de estabilidade à molécula durante a fase de montagem e também na dimerização intramolecular de glicopeptídeos em solução. O antibiótico A47934 (Figura 12), um glicopeptídio produzido por Streptomyces toyocaensis possui modificações na estrutura do antibiótico que são decorrentes de duas halogenases e transferases ativas. Entretanto, essas halogenases identificadas no cluster gênico parecem adicionar três substituintes de cloro para os aminoácidos aromáticos do composto. Este antibiótico, que tem uma estrutura peptídica idêntica à teicoplanina, porém é sulfonado no N-terminal do resíduo de p-hidroxifenilglicina e não é glicosilado. O espectro biológico de A47934 é semelhante ao de outro glicopéptideos e inclui atividade contra bactérias aeróbicas e anaeróbicas Gram-positivas. Os dois genes previstos para produzir as halogenases em seu grupo de genes são nomeados staI e staK. A halogenase StaI é homóloga a ORF10 e BhaA de biossíntese de cloroeremomicina e balhimicina, respectivamente (PUK et al, 2002). Assim, acredita-se que a StaI deve ter 43 uma função similar na biossíntese A47934, que catalisa a adição de substituintes de cloro para as posições 2 e 6 do peptídeo intermediário. Experimentos genéticos indicam que -hidroxitirosina não é um substrato para as halogenases livres e, portanto, a halogenação deve ocorrer na cadeia peptídica em crescimento, ou seja, sobre os intermediários peptídicos ligados à tioésteres com o domínio PCP da peptídeo sintase não-ribossomal (NRPS) (PUK et al., 2004). No entanto, a temporização dos passos de halogenação para a biossíntese de glicopeptídeos não têm até agora sido definidos. StaK também é inferida ser uma halogenase, embora a sua semelhança com outras halogenases do cluster gênico da biossíntese de glicopeptideos é muito menor (63%) do que a StaI (88%). Assim, acredita-se que a StaK pode halogenar a posição 5 do heptaptídeo, que não é comum para os outros glicopeptídeos. No entanto, não existe qualquer evidência da especificidade das halogenases StaI e StaK, ou mesmo se as duas enzimas são necessárias para a halogenação do intermediário do A47934. O emprego da técnica de biossíntese combinatorial pode gerar uma boa expectativa na descoberta de novos antibióticos, porém uma das limitações desse método é que o hospedeiro pode não expressar o fragmento de DNA incorporado, ou então, as vias metabólicas concorrentes podem desviar preciosos precursores. Outras dificuldades estão relacionadas à imprevisível especificidade do substrato, eficiência funcional das enzimas de produção, desconhecida especificidade do sistema de efluxo e o potencial de geração de compostos tóxicos incapazes de serem evitados (COATES; HU, 2007). Grandes esforços têm sido feitos no campo da descoberta de drogas, no entanto, a produção de novos compostos ainda é um grande desafio. A biossíntese combinatória é, sem dúvida, uma importante ferramenta a ser explorada para obtenção de produtos naturais. Figura 12. Estrutura do antibiótico A 47934. Setas indicam catálise pelas halogenases StaI e StaK. (Adaptado de POOTOOLAL et al., 2002). 44 2 Objetivos Este trabalho teve como objetivo iniciar estudos funcionais e estruturais sobre halogeneses relacionadas com a produção de antibióticos. Para isso, os objetivos específicos do trabalho foram: - clonar, expressar e purificar 4 halogenases relacionadas com a biossíntese de antibióticos glicopeptídicos:  ComH, halogenase relacionada com a biossíntese da complestatina em Streptomyces lavendulae;  Orf8*, halogenase relacionada com a biossíntese de teicoplanina em Actinoplanes teichomyceticus;  StaK e StaI, halogenases relacionadas com a biossíntese do composto A49734 em Streptomyces toyocaensis; -obter informações espectroscópicas e sobre o estado de oligomerização das amostras destas enzimas; -realizar testes de cristalização para obtenção de estruturas tridimensionais; -realizar modelagem para obtenção de insights sobre suas especificidades; -realizar estudos funcionais preliminares para validação da função das mesmas. Através de uma Bolsa de Estágio em Pesquisa no Exterior (BEPE), obter treinamento em técnicas de biologia molecular e genética de Streptomyces, associados à biossíntese combinatorial, realizando ensaios de complementação para halogenases StaK e StaI a fim de investigar a atuação destas em diferentes microrganismos produtores de glicopeptídeos: -Amycolatopsis orientalis, produtor de vancomicina -Actinoplanes teichomyceticus, produtor de teicoplamina -Amycolatopsis sp. MJM258, produtor de ristocetina 45 3 Materiais e Métodos 3.1 Obtenções de cepas, purificação de DNA genômico e clonagem de halogenases dos clusters gênicos de antibióticos glicopeptídicos (StaI, StaK, Orf8* e ComH) O organismo Streptomyces toyocaensis NRRL 15009, foi adquirido da coleção ARS (NRRL). O organismo Actinoplanes teichomyceticus, organismo produtor da teicoplanina foi obtido pelo laboratório do Prof. Peter Leadlay – University of Cambridge –UK e um gene sintético para a ComH foi obtido junto a empresa GenScript (USA) clonada no plasmídeo pUC57. S. toyocaensis foi crescido em 100 mL de meio líquido TSB (tryptone soya broth) durante aproximadamente 5 dias e posteriormente peletado e armazenados a -20ºC para a extração do DNA genômico, que foi efetuado utilizando o kit de extração de DNA genômico da Promega de acordo com as instruções do fabricante. A reação de PCR foi realizada em termociclador Eppendorf Mastercycler®, empregando-se um volume total de 50 µl. Foram utilizadas as DNA polimerases Hi-Fidelity (Life Technologies), PFX50 (Invitrogen) e Herculase (Promega). As amostras foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante, porém com a adição de 10% de DMSO. Para a amplificação dos genes staI e staK da biossíntese do composto A47934 e do gene orf8* da biossíntese de teicoplanina foram desenhados primers para a clonagem tanto em pET28a(+), bem como em pET20a(+) para a variação da posição da cauda de histidina. Os primers podem ser observados abaixo com os sítios em negrito sendo referentes aos sítios de clivagem para as enzimas de restrição. staI_NdeIATCGATCGCATATGGACGGCTTGAGCGGCGATCCGTTGC staI_XhoI_p28ATCGCTCGAGTCATCCACGGTAGGGAAGCCACTTCATCCC staI_XhoI_p20ATCGCTCGAGTCCACGGTAGGGAAGCCACTTCATCCC staK_NdeIATCGATCGCATATGTCGGCAGAGACGTTCGACGTGGTCG stak_XhoI_p28ATCGCTCGAGTCATCGGGCGTCCTCTCGTTCCTTCGACGC staK_xhoI_p20ATCGCTCGAGTCGGGCGTCCTCTCGTTCCTTCGACGC orf8_ndeIATCGATCGCATATGCCGGTGGAAGAGTTCGACGTGGTGG orf8_xhoI_p28ATGCCTCGAGTCAGGCGGGACGGTAGGGCAGCC Orf8_xhoI_20ATGCCTCGAGGGCGGGACGGTAGGGCAGCC 46 As condições de amplificação foram realizadas com uma desnaturação inicial de 92ºC por 2 minutos, seguida de 30 ciclos constituídos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 72ºC por 1 minuto e extensão a 72ºC por 2 minutos mais uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. Ao final dos ciclos, a reação foi resfriada e mantida a uma temperatura de 4ºC. Os produtos da reação de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% com 2µl de brometo de etídeo (10mg/mL) e tampão TBE (10,8g Tris, 5,5g ácido bórico e 4 ml EDTA 0,5M pH8.0), sendo posteriormente visualizado sob luz UV. Após a análise, e com o resultado desejado, foi realizada uma purificação do produto de PCR através do Kit DNA Purification System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Como para a ligação em pGEM-T é necessário a presença de poli-A no produto de PCR, nos casos em que a amplificação foi efetuada com enzimas com atividade proofreading, como a Herculase e Pfx50, foi realizada um passo extra, na qual o produto de PCR purificado foi incubado a 70ºC na presença dATP e Taq polimerase para a adição de base A ao plasmídeo aberto pGEM-T. Para a ligação no vetor de clonagem foi preparada uma reação com volume final de 10 µl, constituído por 0,5 µl pGEM-T (Promega), 2 µl da reação anterior (produto de PCR purificado), 1 µl tampão 2x concentrado T4 DNA ligase, 1 µl da enzima T4 DNA Ligase, 1 µl ATP e 4,5 µl de água mili-Q. Essa reação foi incubada overnight a temperatura ambiente. A transformação do vetor com inserto foi realizada com o uso de células competentes DH5α por choque térmico. Como controle, foi utilizado X-Gal (20 µl X- Gal 20 mg/mL, 20µl IPTG 100mM (20 µl em 100mL de solução) e 60 µl de água mili- Q) nas placas para seleção de colônias positivas. Os fragmentos gênicos referentes à halogenases StaI, StaK, Orf8* e ComH foram digeridos e inseridos nos vetores pET28a(+) e pET20a(+). Colônias com a presença do plasmídeo foram obtidas, crescidas em meio líquido, os plasmídeos foram extraídos, digeridos pelas mesmas enzimas usadas na clonagem e também posteriormente submetidas ao sequenciamento, sendo possível confirmar a clonagem no vetor de expressão e também a integridade do gene. Inicialmente, foi realizada a transformação e o crescimento de culturas de 10 mL para produção de plasmídeo. Este foi então, digerido com as enzimas NdeI e XhoI e o fragmento gênico referente ao gene comH foi clonado no pET28a(+), também previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição. Colônias foram obtidas e 47 posteriormente crescidas em tubos de cultura com um volume de 10 mL, que foram extraídos também com o Kit isolamento de plasmídeo da Promega. Para a confirmação da clonagem, uma alíquota de plasmídeo foi digerida e após a confirmação do inserto, outra amostra foi submetida ao seqüenciamento, no qual foi possível confirmar a clonagem no vetor de expressão. Optou-se por adquirir um gene sintético para halogenase StaK, junto a empresa GenScript (USA) o qual também foi clonado em pET28a(+), nos mesmo parâmetros referente a clonagem da ComH. 3.2 Expressão e Purificação das halogenases StaI, StaK, Orf8* e ComH Com a intenção de verificar a expressão das enzimas StaI, StaK e Orf8*, foram realizados testes iniciais de expressão em erlenmeyers de 100 mL com os plasmídeos inseridos por transformação por choque térmico em células BL21(DE3). Estes testes foram realizados, pois não há descrito na literatura qualquer experimento de expressão heteróloga para estas enzimas. Para realização deste teste de expressão, pré-inóculos de 10 mL foram preparados em tubos de 15 mL com uma concentração final de 30 ug/mL de kanamicina. Estes 10mL foram adicionados aos erlenmeyers de 100 mL e mantidos a 37ºC a 200 RPM e quando a OD 600nm atingiu valores de 0,6 a 0,8 foram adicionados 20 uL de IPGT a 1 M e a cultura foi mantida a 18ºC a 200 RPM por 20 horas. Após esse tempo, o alíquotas de cultura foram analisadas diretamente em géis de poliacrilamida SDS-PAGE 15% as células foram lisadas através de sonicador ultrassônico e também utilizando BugBuster®Master Mix (Millipore). As frações solúveis e insolúveis foram separadas. Ambos os géis foram corados com Comassie blue brilhante. Para todos os géis de SDS-PAGE feitos neste trabalho foram utilizados marcadores de peso molecular Bio-Rad. Testes de expressão não foram realizados para a enzima ComH, tão pouco para StaK (obtido comercialmente) devido ao gene ser sintético e otimizado para expressão em E. coli na qual se esperava ter alta expressão. Após finalização do teste, realizou-se uma expressão em larga escala com as melhores condições encontradas, na qual foram utilizados pré-inóculos de 250 mL de meio de cultura LB (Luria Bertani) e posteriormente utilizou-se 50 mL desse para 48 inocular frascos contendo um litro de meio LB, que foram mantidos a 37ºC a 200 RPM. Quando a OD atingiu valores de 0,6 a 0,8 foram adicionados 1 mL de IPGT a 0.2 M e a indução foi mantida a 18ºC a 200 RPM por 20 horas. As culturas de células foram centrifugadas a 4000 rpm por 25 minutos e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 100 µl de PMSF, 100 µl lisozima a 10 mg/mL e 100 µl de DNAse a 1 mg/mL, e o pellet foi ressuspendido. Posteriormente foi adicionado o tampão A (50 mM Tris-HCl e 100 mM NaCl, pH 7,8) para todas as construções ou C (50mM CHES e 100 mM NaCl, pH 9,0) para StaI até chegar aproximadamente no volume final de 30 mL. Utilizou-se um sonicador ultrassônico (Branson) por 15 minutos com pulsos de 5 segundos e intervalos de 5 segundos numa frequências de 50% sob banho de gelo para lisar as células. Posteriormente os extratos celulares foram centrifugados a 9000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. Um Akta Pürifier (General Eletric) foi utilizado para purificação das proteínas (FPLC- Fast Protein Liquid Chromatography). Tampão A e tampão B-(50 mM Tris- HCl, 100 mM NaCl e 0,5 M de imidazol, pH 7,8) foram utilizados para purificação de todas as enzimas. Ou ainda no caso da StaI, foram alternativamente utilizados os tampões C e D (50mM CHES e 100 mM NaCl, 500mM de imidazol, pH 9,0). Posteriormente, com informações biofísica obtidas, o tampão para StaI foi alterado para 50 mM de Fosfato de Potássio e 10% de Glicerol, a fim de se obter uma redução na formação de agregados. As purificações foram realizadas em duas etapas, uma por afinidade e outra por exclusão molecular. Para a purificação por afinidade foi utilizada uma coluna HiTrap HP IMAC 5 ml carregada com níquel. Após a injeção da amostra da fração solúvel do lisado celular na coluna e sua lavagem com tampão A ou C (no caso da enzima StaI), foi realizado um gradiente linear com o tampão B ou D (no caso da StaI) de 5 a 100%. As frações correspondentes aos picos foram analisadas através de gel SDS - PAGE 15%. Como controles, também foram adicionados aos géis: pellets, sobrenadantes, flow throughs e lavagens. Uma vez confirmada a presença de proteína e com a massa correta nos picos da purificação por afinidade, realizou-se uma cromatografia por exclusão molecular (gel filtração) utilizando uma coluna HiLoad Superdex 200 (GE) para polimento final das amostras. A pureza das amostras também foi checada em SDS-PAGE e o picos correspondentes as proteínas foram concentrados e armazenados a -20 ºC para realização dos experimentos de cristalização ou biofísicos. 49 3.3 Teste de Expressão das halogenases StaK e Orf8* Foi realizado teste de expressão utilizando diferentes células competentes, sendo elas Rosetta™, Origami (DE3) e ArcticExpress (DE3). Para realização deste teste de expressão, pré-inóculos de 10 mL foram preparados em tubos de 15 mL com uma concentração final de 30 ug/mL de canamicina. Estes foram adicionados as erlenmeyers de 100 mL e mantidos a 37º a 200 RPM e quando a OD atingiu valores de 0,6 a 0,8 foram adicionados 20 uL de IPGT a 1 M e a indução foi mantido a 37º a 200 RPM por 4 horas e a 18º por 20 horas. Para célula ArcticExpress, devido ao protocolo de expressão, a indução foi realizada após três horas de incubação a 30ºC e posteriormente mantida 13º por 24 horas. Após esse tempo, o extrato celular foi analisado diretamente em géis de poliacrilamida SDS-PAGE 15% ou as células foram lisadas através de sonicador ultrassônico e as frações solúveis e insolúveis foram separadas. Ambos os géis foram corados com Comassie blue brilhante. Para todos os géis de SDS-PAGE feito neste trabalho foi utilizado marcadores de peso molecular Bio-Rad. 3.4 Western Blotting com anticorpo anti-His As amostras foram fracionadas em SDS-PAGE, 5% e transferidas eletroforeticamene para uma membrana de PVDF. A membrana foi incubada em solução de bloqueio (PBS 1X 0,01M de NaHPO4; 0,15M de NaCl, pH 7,2; 5% leite em pó desnatado; 0,1% Tween® 20), por 1 hora, sob agitação, à 4 °C. A membrana foi lavada com tampão TBS- T (0,1%) e a mesma solução, foi feita uma diluição de 1:2000 do anticorpo monoclonal anti-histidina (PentaHis HRP conjugate, Qiagen Kit). A membrana foi incubada na solução com anticorpo por 1 hora a temperatura ambiente e, posteriormente, lavada com solução tampão TBS-T (0,1%) por três vezes, 5 minutos de duração cada lavagem. A revelação foi realizada utilizando uma pastilha de uréia e DAB (Diaminobenzina) dissolvida em 15 mL de água desmineralizada. 3.5 Ensaios de Cristalização Os ensaios de cristalização foram realizados através do método de difusão de vapor, usando gota sentada a 18°C com a proteínas nas concentrações de 10, 20 e 30 50 mg/mL, para ComH e StaI em tampão 50mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,8 e posteriormente a 10, 20 e 30mg/ml para StaI, em tampão50mM CHES e 100 mM NaCl, pH 9,0. Foram utilizadas placas de 96 poços e as gotas fora