U N E S P UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Campus de São José do Rio Preto INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS Programa de Pós-Graduação em Genética MARCOS DE LUCCA JÚNIOR ANÁLISE DE SEQÜÊNCIAS DA REGIÃO INTERGÊNICA ITS-1 DO RDNA EM ESPÉCIES DE DROSOPHILA DO CLUSTER BUZZATII (COMPLEXO BUZZATII, SUBGRUPO MULLERI, GRUPO REPLETA) Tese apresentada para obtenção do Título de Doutor em Genética. Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron São José do Rio Preto – SP 2006 O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética-Bioquímica do Departamento de Química e Ciências Ambientais do Instituto de Biociências , Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, da Universidade Estadual Paulista, sob a orientação do Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron, com o auxílio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Agradecimentos A conclusão deste trabalho somente foi possível graças à colaboração, direta ou indireta, de todos aqueles que, de diferentes formas, estiveram nele envolvidos. Agradeço ao orientador Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron, que desde a graduação me incentivou e deu exemplos de profissionalismo. Além de professor e orientador tornou-se, ao longo dos anos de convivência, grande amigo e companheiro. Aos Prof. Dr. Fábio de Melo Sene e Profa. Dra. Maura Helena Manfrin e todo o pessoal do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, pela atenção e por terem cedido o material genético utilizado no presente estudo. A Profa. Dra. Cláudia Márcia Aparecida Carareto, Natalia de Setta e todo o pessoal do laboratório de Evolução Molecular pela amizade, atenção e grande auxílio na etapa de transformação bacteriana. A Profa. Dra. Paula Rahal, Ana Carolina Gomes Jardim, Érika Babeto e Luis Gustavo Bordinassi pelo auxílio fundamental nos seqüenciamentos. Aos colegas Liliane, Vitor e Rafael, amigos e companheiros de laboratório que sempre me e auxiliaram e proporcionaram momentos de alegria durante nossa convivência. À secretaria do Departamento Rita Beatriz Seixas por sempre atender prontamente em todas as vezes que precisei da sua ajuda. À técnica do laboratório Eliani Nobuco Ikeguchi Ohira pela amizade e pelo auxílio nas atividades e preparação de reagentes. À Direção do IBILCE pelas condições materiais que proporcionaram a realização deste trabalho. Aos demais professores que, através de seu precioso e árduo trabalho, me deram a formação necessária para poder realizar, hoje, o que sempre sonhei em minha vida. À FAPESP, pelo apoio financeiro. Aos meus pais Marcos e Elizabeth. Todo o investimento em carinho, dedicação e sacrifício que depositaram na criação dos filhos resultaram em pessoas felizes, realizadas e plenas. A realização do meu sonho só foi possível por tudo aquilo que vocês fizeram por mim. Todas as palavras seriam insuficientes para demonstrar toda a gratidão. Que Deus me dê saúde e sabedoria para que possa fazer por meus filhos o que vocês fizeram por mim. Aos meus irmãos Marcelo, Carla, Mauro e Juliana por sempre me incentivarem, apoiarem e demonstrarem por mim grande amor e amizade. Sem minha família nada disso teria sentido. Aos meus sobrinhos Murilo, Clara, Flávia e Fernanda pela alegria que completa a minha vida. À minha querida avó Ercília, que sempre foi e será para mim um exemplo de dedicação, lealdade, caráter, bondade e generosidade. Aos meus avós Donato Bulchi, José Antonio de Lucca e Carlota Bertani de Lucca (in memoriam), que, em vida, sempre foram exemplos de honestidade, trabalho, amor e carinho. Se estivessem aqui estariam sorrindo e orgulhosos dessa minha conquista. Tenho certeza que continuam olhando e zelando por mim. À minha esposa Néia pela compreensão da minha ausência, por seu amor, dedicação e pelo seu incondicional apoio em tudo que faço. Ao meu filho Pedro. Quando vejo cada gesto e sorriso seus sinto que tudo vale a pena. A Deus pela saúde, luz e sorte. Obrigado por tudo. Num meio-dia de fim de Primavera Tive um sonho como uma fotografia. Vi Jesus Cristo descer à terra. Veio pela encosta de um monte Tornado outra vez menino, A correr e a rolar-se pela erva E a arrancar flores para as deitar fora E a rir de modo a ouvir-se de longe. Tinha fugido do céu. Era nosso demais para fingir De segunda pessoa da Trindade. No céu era tudo falso, tudo em desacordo Com flores e árvores e pedras. No céu tinha que estar sempre sério E de vez em quando de se tornar outra vez homem E subir para a cruz, e estar sempre a morrer Com uma coroa toda à roda de espinhos E os pés espetados por um prego com cabeça, E até com um trapo a roda da cintura Como os pretos nas ilustrações. Nem sequer o deixavam ter pai e mãe Como as outras crianças. O seu pai era duas pessoas - Um velho chamado José, que era carpinteiro, E que não era pai dele; E o outro pai era uma pomba estúpida, A única pomba feia do mundo Porque não era do mundo nem era pomba. E a sua mãe não tinha amado antes de o ter. Não era mulher: era uma mala Em que ele tinha vindo do céu. E queriam que ele, que só nascera da mãe, E nunca tivera pai para amar com respeito, Pregasse a bondade e a justiça! Um dia que Deus estava a dormir E o Espírito Santo andava a voar, Ele foi à caixa dos milagres e roubou três. Com o primeiro fez que ninguém soubesse que ele tinha fugido. Com o segundo criou-se eternamente humano e menino. Com o terceiro criou um Cristo eternamente na cruz E deixou-o pregado na cruz que há no céu E serve de modelo às outras. Depois fugiu para o Sol E desceu pelo primeiro raio que apanhou. Hoje vive na minha aldeia comigo. É uma criança bonita de riso e natural. Limpa o nariz ao braço direito, Chapinha nas poças de água, Colhe as flores e gosta delas e esquece-as. Atira pedras aos burros, Rouba a fruta dos pomares E foge a chorar e a gritar dos cães. E, porque sabe que elas não gostam E que toda a gente acha graça, Corre atrás das raparigas Que vão em ranchos pelas estradas Com as bilhas às cabeças E levanta-lhes as saias. A mim ensinou-me tudo. Ensinou-me a olhar para as coisas. Aponta-me todas as coisas que há nas flores. Mostra-me como as pedras são engraçadas Quando a gente as tem na mão E olha devagar para elas. Diz-me muito mal de Deus. Diz que ele é um velho estúpido e doente, Sempre a escarrar no chão E a dizer indecências. A Virgem Maria leva as tardes da eternidade a fazer meia. E o Espírito Santo coça-se com o bico E empoleira-se nas cadeiras e suja-as. Tudo no céu é estúpido como a Igreja Católica. Diz-me que Deus não percebe nada Das coisas que criou - "Se é que ele as criou, do que duvido." - "Ele diz, por exemplo, que os seres cantam a sua glória, Mas os seres não cantam nada. Se cantassem seriam cantores. Os seres existem e mais nada, E por isso se chamam seres." E depois, cansado de dizer mal de Deus, O Menino Jesus adormece nos meus braços E eu levo-o ao colo para casa. Ele mora comigo na minha casa a meio do outeiro. Ele é a Eterna Criança, o deus que faltava. Ele é o humano que é natural, Ele é o divino que sorri e que brinca. E por isso é que eu sei com toda a certeza Que ele é o Menino Jesus verdadeiro. E a criança tão humana que é divina É esta minha quotidiana vida de poeta, E é porque ele anda sempre comigo que eu sou poeta sempre. E que o meu mínimo olhar Me enche de sensação, E o mais pequeno som, seja do que for, Parece falar comigo. A Criança Nova que habita onde vivo Dá-me uma mão a mim E a outra a tudo que existe E assim vamos os três pelo caminho que houver, Saltando e cantando e rindo E gozando o nosso segredo comum Que é o de saber por toda a parte ... O Guardador de Rebanhos Alberto Caieiro heterônimo de Fernando Pessoa (1888 - 1935) Sumário I. Introdução 8 II. Objetivos 32 III. Material e Métodos III.1. Linhagens 33 III.2. Extração do DNA 35 III.3. Amplificação da região ITS-1 36 III.4. Seqüenciamento 38 III.5. Análises das seqüências 40 IV. Resultados IV.1. Caracterização da região ITS-1 41 IV.2. Análise das seqüências 43 IV.3. Análises filogenéticas 48 V. Discussão 54 VI. Conclusões 60 VII. Referências Bibliográficas 62 VIII. Resumo 81 IXI. Abstract 83 IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 8 I. INTRODUÇÃO A diversidade bioquímica, comportamental e morfológica, observada dentro de uma população, pode ser interpretada como conseqüência de modificações na composição genética das populações. Essas alterações resultam da incidência de fatores que, ora geram alelos ou genótipos novos, tais como mutação e recombinação gênica, ora promovem a modulação das freqüências alélicas como seleção natural ou deriva genética, ou seja, alelos recém surgidos em uma população podem aumentar sua freqüência ou mesmo serem eliminados de uma população por causas determinísticas ou por efeitos estocásticos. Assim sendo, na medida em que as gerações se sucedem, a composição genética de uma população pode ser alterada drasticamente quando comparada a outras populações intraespecíficas. Estudos envolvendo microevolução procuram analisar as causas e efeitos das alterações intrapopulacionais. Quando a diversidade é elevada ao nível interpopulacional podem ocorrer, como resultados desse processo, eventos de especiação, pelos quais novas espécies derivam a partir de populações pertencentes a espécies ancestrais. Uma vez que há o surgimento de novas espécies, outras possibilidades de exploração de novos nichos surgem também e, assim, as diversas formas de vida podem deixar de competir pelos mesmos recursos. IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 9 I.1 O conceito biológico de espécie Para o entendimento do processo de evolução das espécies, é necessário preliminarmente discutirmos o que se entende por espécie. Dentre os diversos modos de se conceituar uma espécie, o conceito biológico é o de maior relevância, pois trata as espécies como comunidades reprodutivas. Dobzhansky (1937) definiu espécie como "o estágio de progresso evolucionário no qual um antigo conjunto de formas verdadeiramente e potencialmente intercruzáveis torna-se segregado em dois ou mais conjuntos separados, que são fisiologicamente incapazes de intercruzar”. Posteriormente, Mayr (1942) definiu espécie como "grupos de populações naturais verdadeiramente ou potencialmente intercruzantes mas que possuem isolamento reprodutivo de outros grupos". Embora o conceito biológico de espécie seja amplamente aceito, algumas críticas têm sido levantadas com relação a casos de inaplicabilidade do mesmo. Por exemplo, em organismos de reprodução assexuada o pressuposto de isolamento reprodutivo entre as espécies é falho, uma vez que nesse caso não há fluxo gênico nem mesmo entre populações que pertençam à mesma espécie. Outra crítica relaciona-se à impossibilidade de se comparar grupos que ocorreram em tempos distintos. Não é possível afirmar através de comparação de fósseis se havia, ou não, IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 10 isolamento reprodutivo entre indivíduos que morfologicamente são classificados como espécies distintas. E também, o fato de freqüentemente serem observadas espécies que se intercruzam e produzem híbridos férteis, especialmente através de cruzamentos realizados experimentalmente. Outro conceito de espécie, estabelecido mais recentemente é aquele que leva em consideração a história evolutiva compartilhada pelas populações, chamado de conceito filogenético de espécie. Define-se espécie então como “o menor agrupamento diagnosticável de organismos individuais, dentro dos quais há um padrão de ancestralidade e descendência”. Assim a premissa implícita no conceito filogenético é que a classificação deve refletir a relação ramificada entre as espécies, a qual é indicada por um cladograma (Cracraft, 1983). I.2 O Processo de Especiação Os mecanismos de isolamento reprodutivo atuam quando há o impedimento do fluxo gênico entre as populações. Quando uma determinada população se torna reprodutivamente isolada de outras, dentro da mesma espécie, os conjuntos gênicos desses dois grupos passam a divergir devido à atuação particularizada de fatores evolutivos em cada grupo. À medida que são passadas as gerações, diferenças substanciais são IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 11 acumuladas principalmente com relação a características ligadas a reprodução, de modo que as semelhanças que antes permitiam o fluxo gênico entre os indivíduos dos grupos separados, tenderão a diminuir. A partir do momento em que cessa o fluxo gênico entre os grupos separados, considera-se que ocorreu um evento de especiação. Há basicamente dois tipos de barreiras que atuam sobre as populações e que podem conduzir ao isolamento reprodutivo, e podem ser classificadas em pré- e pós-zigóticas. As barreiras pré-zigóticas são assim denominadas por não permitirem a formação do zigoto em qualquer instância, ou seja, impedem que cruzamentos ocorram entre indivíduos pertencentes a espécies distintas através de mecanismos que bloqueiam o acasalamento. Adicionalmente, em casos de “rompimento” desses mecanismos, outras barreiras que impossibilitam a formação do zigoto por incompatibilidade gamética atuam nessas condições. As barreiras pós- zigóticas, resultam em inviabilidade ainda no estágio de zigoto ou infertilidade da prole híbrida e até degeneração do híbrido. A questão é como a incompatibilidade pré- e/ou pós-zigótica pode surgir, se estabelecer e persistir em diferentes modos de especiação. Tais modos são diferenciados de acordo com o grau de contato, potencialmente reprodutivo, entre as populações. Podem ser caracterizados como alopátricos ou simpátricos, caso haja isolamento geográfico (e reprodutivo) ou não, respectivamente. Um modo intermediário, o parapátrico, no qual IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 12 populações que vivem alopatricamente trocam genes, por meio de populações intermediárias contínuas, foi postulado por Smith (1965). Há poucos genes identificados que são explicitamente responsáveis pelo isolamento reprodutivo. A maior dificuldade em se determinar os chamados “genes de especiação” está relacionada com o fato desses genes não evoluírem especificamente para esse fim e participarem de outras funções biológicas. Entretanto, muitos estudos vêm sendo realizados no sentido de se estudar o papel da seleção natural e deriva genética na divergência de tais genes nas populações (Coyne et al., 1994; Barbash et al., 2003; Presgraves et al., 2003; Orr, 2005). I.2.1 Isolamento Pré-zigótico Dobzhansky (1951) classificou os mecanismos de isolamento reprodutivo pré-zigóticos em ecológicos, temporais ou sazonais, etológicos e mecânicos. Em espécies simpátricas de Drosophila os mecanismos de isolamento pré-zigóticos têm evoluído mais rapidamente do que aqueles de isolamento pós-zigótico, enquanto que nas espécies alopátricas esses mecanismos têm evoluído em taxas semelhantes (Coyne e Orr, 1997). IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 13 Essas observações reforçam a teoria de que a seleção sobre fatores genéticos relacionados ao estabelecimento de barreiras ao fluxo gênico é mais acentuada quando espécies relacionadas compartilham a mesma área de ocorrência. Nesse contexto, podem ser citadas como exemplo as espécies D. silvestris e D. heteroneura, que são simpátricas no arquipélago do Havaí, e que exibem forte isolamento quanto aos padrões de corte, além de grandes diferenças com relação ao comportamento agressivo dos machos (Carson et al., 1989). A preferência de acasalamento é outro fator importante a ser considerado para a manutenção do isolamento reprodutivo entre espécies simpátricas. Indivíduos de um dos sexos (geralmente as fêmeas) escolhem seus parceiros conforme características quantificáveis, tais como feromônios de contato, constituídos basicamente de hidrocarbonetos não- voláteis cuticulares (Higgie et al., 2000; Blows, 2002 e Rundle et al., 2005). Outros exemplos da atuação de mecanismos de isolamento reprodutivo pré-zigóticos relacionam-se aos diferentes padrões de sons de corte. Williams et al. (2001) analisaram a base genética da diferença dos sons de corte para acasalamento entre D. pseudoobscura e D. persimilis. Em outro estudo, Yamada et al. (2002) estudaram o controle genético dos diferentes sons de corte associadas ao isolamento reprodutivo entre D. ananassae e D. pallidosa, ambas pertencentes ao complexo de espécies de IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 14 D. ananassae. Análises de híbridos obtidos de cruzamentos entre D. virilis e D. flavomontana mostraram a interação entre genes ligados ao cromossomo X e genes autossômicos na diferenciação de canções de corte entre essas espécies (Päällysaho et al., 2003). Apesar da grande importância do isolamento reprodutivo pré- zigótico como uma barreira primária durante o processo de especiação, pouco se sabe sobre a base genética da discriminação de acasalamentos interespecíficos (Coyne e Orr, 2004). Muitas das questões sobre a genética do isolamento reprodutivo permanecem ainda sem respostas, tais como: os mecanismos de isolamento são baseados em muitos ou poucos genes? Genes para diferenciação na reprodução tendem a ocorrer em regiões similares de cromossomos entre espécies do mesmo grupo? Os mesmos genes contribuem para o estabelecimento do isolamento reprodutivo tanto nos machos quanto nas fêmeas? Qual a função normal dos genes envolvidos no isolamento reprodutivo? Estudos sobre a base genética do isolamento entre espécies, dentre os quais podem ser destacados aqueles que utilizam Drosophila como um modelo, podem trazer importante contribuição na elucidação destas questões. Estudos como o realizado por Moehring et al. (2006), nos quais foram realizados o mapeamento de QTLs que contribuem para o isolamento reprodutivo pré-zigótico nas espécies crípticas D. santomea e D. yakuba, apontam para um novo tipo de análise da base genética do isolamento reprodutivo em Drosophila. IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 15 I.2.2 Isolamento Pós-zigótico Desde o início do último século tem–se tentado determinar a base genética dos mecanismos de isolamento reprodutivo pós-zigóticos. Inicialmente Dobzhansky (1951) classificou esses mecanismos em três classes distintas: inviabilidade dos híbridos de primeira geração (F1), esterilidade dos híbridos e inviabilidade dos híbridos de segunda geração (F2). A inviabilidade dos híbridos de primeira geração (F1) pode ser causada por interações epistáticas deletérias entre genes que funcionam perfeitamente nas espécies parentais. Já em 1922, Haldane observara que “quando na prole F1 de duas raças animais diferentes um dos sexos está ausente, é raro ou é estéril; o mesmo é sempre o heterogamético”. Uma das explicações para a chamada “regra de Haldane”, acima descrita, seria a incompatibilidade que envolve os cromossomos sexuais entre si, ou deles com cromossomos autossômicos. Os mecanismos genéticos da inviabilidade dos híbridos F1 vêm sendo investigados através do estudo de mutações que resgatam a viabilidade dos híbridos. Em Drosophila, as mutações Hmr (do inglês, hybrid male rescue) ligada ao cromossomo X de D. melanogaster, e Lhr (do inglês, lethal hybrid rescue) presente no segundo cromossomo de D. IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 16 simulans permitem a análise da base genética da inviabilidade dos híbridos obtidos entre as espécies citadas (Watanabe, 1979; Hutter and Ashburner, 1987; Hutter et al., 1990; Davis et al., 1996; Orr and Irving, 2000). Estudos sobre a base genética envolvida no isolamento pós-zigótico em Drosophila sugerem que os mecanismos relacionados à inviabilidade da prole híbrida são menos complexos do que aqueles responsáveis pela própria esterilidade dos híbridos e podem estar associados com alterações no ciclo celular (Hutter, 1997). Foi identificado um grupo de genes relacionados ao controle do ciclo celular no cromossomo X de D. melanogaster que se interagem em determinados genótipos híbridos e conduzem à inviabilidade do desenvolvimento dos mesmos (Hutter, 2002). Em relação à esterilidade dos híbridos obtidos entre espécies de Drosophila, a atrofia observada em ovários e testículos se deve à incompatibilidade genética reconhecível precocemente no embrião. Essa incompatibilidade produz defeitos que afetam a proliferação das células da linhagem germinativa (Hollocher et al., 2000). A esterilidade dos machos híbridos é a forma mais comum de mecanismo de isolamento pós-zigótico em Drosophila (Coyne, 1992). A base genética desse tipo de isolamento foi estudada em híbridos obtidos de cruzamentos entre D. subobscura e D. madeirensis, com a utilização de vinte marcadores genéticos em machos retrocruzados. Observou-se um efeito maior nos cromossomos sexuais: machos com cromossomos X e Y derivados de espécies parentais distintas IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 17 tinham testículos pequenos e vazios; enquanto que quando eram obtidos machos com cromossomos X e Y compatíveis os testículos eram normais em relação ao tamanho, mas machos estéreis ainda eram observados. Foi sugerido, então, que seis fatores autossômicos estavam relacionados com a esterilidade dos machos (Khadem and Krimbas, 1991). Noor et al. (2001) estudaram a esterelidade nos híbridos entre D. pseudoobscura e D. persimilis, duas espécies que ocasionalmente se hibridizam na natureza. Esses autores encontraram algumas regiões nos genomas dessas espécies que podem estar relacionadas com o fenômeno da esterilidade dos híbridos. Além disso, nessas espécies, essas regiões estavam associadas a diferentes inversões, reforçando a idéia que as inversões possam contribuir com o processo de especiação. A inviabilidade dos híbridos de segunda geração (F2) pode ser definida como o mecanismo de isolamento reprodutivo que atua quando híbridos são capazes de produzir prole, porém de fertilidade reduzida ou inviável. Inicialmente, os genes envolvidos na determinação da inviabilidade dos híbridos (F2) foram mapeados através da introgressão do cromossomo quatro de D. simulans no background genético de D. melanogaster (Muller e Pontecorvo, 1940). Posteriormente foi observado que os genes relacionados com a esterilidade dos machos híbridos F2, presentes nos cromossomos de D. melanogaster se comportavam como recessivos após a introgressão, e assim faziam com que os genes IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 18 correpondentes de D. simulans para a mesma região fossem hemizigotos (Orr, 1992). Uma análise de aproximadamente 70% do genoma autossômico de D. simulans revelou 20 regiões que levam à letalidade e outras 20 regiões semi-letais nos híbridos. Adicionalmente foi estimado que há aproximadamente 191 regiões genômicas que estão ligadas à incompatibilidade dos híbridos entre D. melanogaster e D. simulans, que agem de modo epistático nesses indivíduos (Presgraves, 2003). I.3) O cluster buzzatii As espécies incluídas no grupo repleta são, na sua maioria, cactofílicas, ou seja, utilizam os cladódios em decomposição de vários tipos de cactos neotropicais para realizar a oviposição e se alimentar de leveduras presentes nesses vegetais (Heed, 1982; Wasserman, 1992; Etges et al.,2001; Tidon-Sklorz e Sene, 2001). Esta adaptação permitiu que um número considerável de espécies do grupo repleta pudesse ocupar os desertos e as zonas áridas do Novo Mundo (Ruiz & Fontdevila, 1981). O grupo repleta está subdividido em 6 subgrupos: mulleri, fasciola, hydei, mercatorum, repleta e inca (Vilela, 1983, Rafael e Arcos, 1989). O IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 19 subgrupo mulleri, por sua vez, está subdividido em 5 complexos de espécies: mulleri, meridiana, anceps, eremophila e buzzatii. No complexo buzzatii foram incluídas 13 espécies, organizadas em 3 clusters, com base em padrões de bandamento cromossômico e morfologia do aparelho reprodutor (Ruiz e Wasserman, 1993): cluster stalkeri (incluindo D. richardsoni e D. stalkeri), está restrito às ilhas do Caribe e Flórida; cluster martensis (D. martensis, D. uniseta, D. venezoelana e D. starmeri), encontrado nos desertos da Colômbia e Venezuela; e finalmente o cluster buzzatii, formado atualmente por 7 espécies (D. buzzatii, D. serido, D. borborema, D. koepferae, D. seriema, D. gouveai e D. antonietae), que são encontradas em vários países da América do Sul, desde as regiões abaixo da Amazônia brasileira até Argentina. D. buzzatii, a espécie que dá nome ao cluster, é considerada atualmente uma espécie sub-cosmopolita (Ruiz et al, 1982; Wasserman & Richardson, 1987; Fontdevila et al., 1988; Tidon- Sklorz e Sene, 2001). Estudos de Ruiz et al. (2000) agruparam 6 das 7 espécies do cluster buzzatii (D. serido, D. borborema, D. koepferae, D. seriema, D. gouveai e D. antonietae) no sibling set serido, baseando-se na comparação da morfologia do edeago. As espécies do cluster buzzatii são encontradas em áreas de ocorrência de seus cactos hospedeiros. As moscas ovipositam sobre cladódios em decomposição, onde as larvas se desenvolvem alimentando- se de leveduras específicas envolvidas neste processo (Pereira et al., 1983). IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 20 A distribuição das cactáceas na América do Sul é descontínua provavelmente em decorrência de mudanças paleoclimáticas e paleogeomorfológicas a partir do final do período terciário (Ab’Saber, 1977a, 1977b; Vanzolini, 1981), fato que contribuiu para o isolamento geográfico atualmente observado para as populações deste cluster. O processo de especiação alopátrica, que é muitas vezes a regra dentro do gênero Drosophila, pode ocorrer de duas formas distintas: ou o isolamento geográfico seguido de diversificação genética lenta e, conseqüentemente, o isolamento reprodutivo das populações; ou por divergência genética rápida, através do isolamento de fundadores em novos ambientes, com “erros de amostragem” do background genético original. Este processo é conhecido como Efeito do Fundador, e constitui a maneira mais provável de especiação das espécies cactofílicas de Drosophila (Wasserman, 1992). Silva e Sene (1991) consideraram a hipótese de que uma variação geográfica observada para a morfologia do edeago poderia representar o início da diferenciação interpopulacional, que eventualmente resultaria em especiação. O mapeamento da distribuição geográfica das espécies do cluster buzzatii tem sido empreendido utilizando-se vários marcadores, como a morfologia da terminália masculina e da asa (Vilela e Sene, 1977; Silva, 1981; Sene et al, 1982, 1988; Silva e Sene, 1991; Tidon-Sklorz e Sene, 1995a, 1995b; Monteiro e Sene, 1995; Monteiro, 1997; Moraes e Sene, IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 21 2004), inversões em cromossomos politênicos (Wasserman, 1962; Tosi, 1982; Tosi e Sene, 1989; Figueiredo e Sene, 1992; Ruiz, et al, 2000), padrão de isoenzimas (Sanchez, 1986; Barker et al., 1985; Barker, 1994; Lapenta et al., 1995, 1998; Morales, 2001, Mateus e Sene, 2003), análise de compatibilidade reprodutiva (Madi-Ravazzi et al., 1997; Machado et al., 2002 e Machado et al, 2006), análise de DNA satélite (Kuhn et al., 1999 e Kuhn e Sene, 2004) e de haplótipos de DNA mitocondrial (Manfrin et al. 2001; de Brito et al., 2002a). Até o presente, a comparação da morfologia do edeago é considerada como a principal característica para a diferenciação das espécies (Vilela, 1983; Silva e Sene, 1991; Tidon-Sklorz e Sene, 1995a). Além disso, as análises das inversões cromossômicas sugerem uma origem monofilética para este cluster (Tosi, 1982; Ruiz e Wasserman, 1993). Drosophila gouveai ocorre em morros rochosos nas regiões sudeste e centro-oeste do Brasil. Devido à associação com cactáceas presentes nessas localizações. Esta espécie apresenta uma distribuição geográfica fragmentada com numerosas populações isoladas, principalmente na região nordeste do Brasil (Tidon-Sklorz e Sene, 2001). Monteiro e Sene (1995) observaram que as populações de D. gouveai podiam ser discriminadas com relação à morfologia do edeago provavelmente devido ao fato dessas populações serem encontradas principalmente em morros, formando verdadeiros isolados. Além disso, foi demonstrado recentemente que IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 22 parâmetros morfométricos para as asas podem ser utilizados como marcadores para diferenciação morfológica entre as populações dessa espécie (Moraes e Sene, 2004). Manfrin et al.(2001), observaram que D. gouveai de Analândia, SP, podia ser agrupada filogeneticamente com populações de D. antonietae, quando analisaram seqüências de DNA mitocondrial. Com base nessas observações, foi sugerido um provável contato secundário entre as duas espécies, no qual poderia ter ocorrido hibridação introgressiva. Além disso, essas observações indicam também que a diferenciação destas populações não se deu exclusivamente durante o último ciclo do quaternário, conforme anteriormente sugerido por Sene et al. (1988). O padrão atual, segundo os autores, indica uma história evolutiva mais longa para as espécies do sibling set serido, isto é, eventos anteriores àqueles sugeridos por Sene et al. (1988) isolaram estas espécies, e outros paleoeventos, como aqueles provocados pelos ciclos do quaternário, em um passado mais recente, propiciaram o contato secundário entre elas. A distribuição geográfica de Drosophila antonietae compreende as regiões sul e sudeste do Brasil e norte da fronteira leste do chaco argentino. As populações estão sempre associadas com Cereus hildmaniannus presente em ilhas de vegetação xerofítica de matas de galeria e florestas mesofíticas (Tidon-Sklorz e Sene, 2001). Essa espécie já foi caracterizada em diversos aspectos: possui morfologia do edeago do tipo D (Silva e Sene, IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 23 1991), inversão cromossômica 2x7 e cariótipo metafásico tipo V (Ruiz, et al, 2000). Análises de haplótipos do DNA mitocondrial permitiram a separação da espécie em dois grupos: um na porção superior e outro na porção inferior da bacia dos rios Paraná-Uruguai (Manfrin et al., 2001). Mateus e Sene (2003), encontraram deficiência de heterozigotos para vários loci aloenzimáticos nas populações de D. antonietae, porém foi descartada a hipótese de endogamia como explicação para esse fato. Em decorrência das populações de D. antonietae distribuírem-se ao longo dos cursos de rios apresentam homogeneidade genética, o que sugere a ocorrência de fluxo gênico entre as mesmas (Monteiro e Sene, 1995). Drosophila seriema tem área de ocorrência restrita a campos rochosos da Cadeia do Espinhaço, nos estados de Bahia e Minas Gerais, em altitudes acima dos 1000 m em relação ao nível do mar, com distribuição populacional esparsa e descontínua dada a paisagem montanhosa entremeada por vales extensos e profundos, que a localidade apresenta (Tidon-Sklorz e Sene, 1995a). As populações de D. seriema apresentam forte isolamento pré copulatório em relação às outras espécies, um padrão característico de esterases (Lapenta et al, 1995), monomorfismo para inversões cromossômicas paracêntricas, porém exibem polimorfismo quando comparadas ao nível de cariótipos metafásicos (Kuhn et al. 1996). Manfrin et al.(2001), em análises que envolviam parte da seqüência do gene mitocondrial Citocromo oxidase – I (COI), observaram que os valores IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 24 de divergência genética interpopulacional eram muito similares àqueles obtidos em análises interespecíficas com as outras espécies do cluster buzzatii, o que poderia indicar eventos prévios de hibridização introgressiva. A introgressão de DNA mitocondrial também já foi sugerido para outras espécies do cluster buzzatii (de Brito et al. 2002a). Contudo Kuhn e Sene (2004), com base na análise de marcadores de DNA satélite encontraram homogeneidade de seqüências para as populações de D. seriema analisadas. Vilela e Sene (1977) descreveram a espécie D. serido a partir de exemplares coletados em Milagres (BA). A distribuição geográfica da espécie compreende toda a área sub-amazônica da América do Sul até à região do chaco argentino. A espécie é constituída por um complexo de populações que exibem elevado polimorfismo em várias características: quanto à morfologia do edeago (Tosi e Sene, 1989; Silva e Sene, 1991); quanto aos tipos de cariótipos metafásicos (Baimai et al, 1983); quanto à variação na seqüência do gene COI do DNA mitocondrial (Manfrin et al., 2001); assim como outros tipos de divergência genética (Ruiz et al., 2000). Segundo as análises realizadas por de Brito et al. (2002a), foi estimada que a distribuição das populações de D. serido pelo território brasileiro poderia ter ocorrido durante o Pleistoceno médio, e que os ciclos climáticos anteriores e que se sucederam pelo período Quaternário provavelmente tiveram um papel preponderante na heterogeneidade encontrada nas IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 25 populações brasileiras de D. serido. Existe uma região de simpatria entre D. serido e D. gouveai na Cadeia do Espinhaço (BA e MG). Entretanto, não foram observados híbridos naturais entre as mesmas (Silva e Sene, 1991). Drosophila buzzatii é a espécie pertencente ao cluster buzzatii que apresenta maior distribuição geográfica, pois pode ser encontrada na Argentina, Bolívia, Paraguai, Brasil e também, após invasão recente, na Europa e na Austrália (Fontdevilla et al, 1981; Barker et al., 1985 e Figueiredo e Sene, 1992). Como sítio de oviposição pode utilizar cactos dos gêneros Opuntia (Pereira et al. 1983), Cereus e Trichocereus (Hasson et al, 1992). O modo pelo qual ocorreu a distribuição populacional de D. buzzatii pelo território brasileiro ainda é motivo de debate (de Brito et al., 2002a). A dispersão das populações brasileiras de D. buzzatii pode ter acontecido de dois modos: ou dispersão passiva, na qual os colonizadores ocuparam o restante do território seguindo o cacto hospedeiro Opuntia, como foi observado na Austrália com a introdução desse vegetal por criadores de gado (Barker et al., 1985); ou dispersão ativa, sem o envolvimento humano, na qual D. buzzatii teria inicialmente colonizado a região sudeste e posteriormente ocupado outras áreas (Figueiredo e Sene, 1992). A distribuição geográfica das populações de D. koepferae compreende a região do nordeste da Argentina e Bolívia, a leste da IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 26 Cordilheira dos Andes. D. koepferae realiza seu ciclo de vida em tecidos de cactáceas em decomposição, principalmente dos gêneros Cereus e Trichocereus (Fanara et al., 1998), de forma semelhante à sua espécie críptica D. buzzatii. Pelo fato de co-explorarem sítios semelhantes para a reprodução, já foi demonstrada a ocorrência de híbridos interespecíficos entre essas espécies (Carvajal et al., 1996; Marin e Fontdevila, 1996). Contudo, em outros estudos foram observadas algumas diferenças entre D. koepferae e D. buzzatii quanto à preferência para sítios de oviposição (Fanara e Hasson, 2001), sistemas genéticos relacionados à inviabilidade dos híbridos (Carvajal et al., 1996) e estudos moleculares comparativos do locus Xdh (Piccinali et al., 2004). Drosophila borborema, outra espécie pertencente ao cluster buzzatii, consiste de uma espécie críptica de D. serido. Suas populações ocupam o nordeste brasileiro, especificamente a região da Serra da Borborema. Possui similaridade de inversões cromossômicas com D. gouveai, entretanto híbridos naturais ainda não foram relatados. Espécies cactofílicas de Drosophila são ideais para estudos intra e interpopulacionais devido sua associação com os cactos hospedeiros, e estes estarem com sua distribuição vinculada às flutuações paleoclimáticas e paleogeomorfológicas. Por essas razões, o cluster buzzatii, e, especificamente o sibling set serido, têm sido alvo de vários estudos em genética evolutiva. As análises entre as espécies do cluster mostram uma IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 27 estrutura populacional com fluxo gênico restrito pela distância, contato secundário entre as espécies resultando em simpatria e introgressão, populações politípicas e acasalamentos interespecíficos obtidos experimentalmente (Manfrin e Sene, 2006). Portanto, o estudo das relações filogenéticas entre os membros deste grupo ainda abre espaço para novas hipóteses, uma vez que com o conjunto de dados obtidos até o momento ainda não foi possível se estabelecer de forma definitiva os eventos de especiação que originaram o grupo. Nesse contexto, o DNA ribossômico tem se constituído numa importante ferramenta para análise da variabilidade genética entre espécies crípticas ou mesmo em estudos interpopulacionais, baseados principalmente na diversidade das suas regiões não codificadoras IGS, ITS- 1 e ITS-2. IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 28 I.4 O DNA ribossômico O DNA ribossômico (rDNA) dos eucariotos é constituído por uma família multigênica, responsável pela síntese dos RNAs ribossomais e está organizado em unidades repetitivas (RU) em tandem nas regiões organizadoras nucleolares (NORs). Cada RU consiste de seqüências altamente conservadas codificadoras dos rRNAs 18S, 5,8S e 28S, intercaladas com regiões não codificadoras menos conservadas. Na maioria dos animais existem de 100 a 500 cópias das unidades repetitivas do rDNA no genoma nuclear (Hoy, 1994). Cada (RU) é composta por uma região promotora ETS (do inglês, External Transcribed Spacer), uma região codificadora do rRNA 18S, uma região interna não codificadora ITS-1 (do inglês, Internal non coding Transcribed Spacer), uma região codificadora do rRNA 5,8S, uma segunda região não codificadora ITS-2, uma região codificadora do rRNA 28S e, finalmente, por uma região não codificadora intergênica IGS (do inglês, Intergenic non Transcribed Spacer). O esquema abaixo sumariza a organização do rDNA em eucariotos (Hillis & Dixon, 1991; Polanco et al., 1998). IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 29 Herwerden, et al. (1999) utilizaram dados do seqüenciamento da região ITS-1 para analisar as relações filogenéticas e a variação intra e interespecífica em espécies do gênero Paragonimus (Trematoda: Digenea). Em carrapatos do gênero Cecidophyopsis diferenças na seqüência da região ITS-1 foram utilizadas para identificar espécies (Kumar et al., 1999). Variações da seqüência da região ITS-1 foram encontradas para dois grupos de peixes ciclídeos indicando uma origem monofilética para os mesmos (Booton, et al., 1999). Em insetos, análises das regiões intergênicas do rDNA e do DNA mitocondrial foram utilizadas para identificar as espécies crípticas em populações do mosquito Anopheles freeborni e A. hermsi (Porter e Collins, 1991). Essas análises ressaltaram as diferenças espécie-específicas que não tinham sido constatadas anteriormente pela análise do DNA mitocondrial em 5 colônias de A. freeborni e em 3 colônias de A. hermsi. Tartarotti e Ceron (2005) constataram a diferenciação entre Triatomíneos dos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus. Em Drosophila, seqüências nucleotídicas da região ITS-1 foram determinadas e utilizadas, juntamente com outras seqüências nucleares e mitocondriais no estabelecimento de uma filogenia para as espécies do grupo saltans. Entretanto, esses dados ainda não resolveram completamente as relações filogenéticas dentro do grupo (O'Grady et al., 1998). IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 30 Trabalhos referentes à região ITS-1 em espécies de Drosophila do grupo repleta são escassos. Estudos em espécies deste grupo demonstraram um polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 envolvendo D. mulleri e D. arizonae, ambas pertencentes ao complexo mulleri. Para D. mulleri o comprimento do fragmento amplificado da região ITS-1 corresponde a 600pb, enquanto que para D. arizonae é de 500pb. Além disso, análises dos híbridos interespecíficos entre D. mulleri e D. arizonae demonstrou que as unidades repetitivas do rDNA nessas espécies estão localizadas no cromossomo X e nos microcromossomos (Baffi & Ceron, 2002). Estudos mais recentes envolvendo a dinâmica evolutiva de elementos transponíveis nos loci do DNA ribossômico foram realizados por Averbeck e Eickbush (2005). Essas análises são concernentes à porcentagem de inserção dos retroelementos R1 e R2 nas unidades do DNA ribossômico presentes no cromossomo X de Drosophila melanogaster após várias gerações, e dessa forma, foi possível se estudar o tipo e a distribuição dos eventos de recombinação que deram origem à evolução em concerto desses loci. Embora as relações filogenéticas entre as espécies do cluster buzzatii já tenham sido amplamente investigadas utilizando-se outros marcadores, análises de seqüências nucleares ainda não foram realizadas. O espaçador intergênico ITS-1 é adequado a esse tipo de análise porque corresponde a uma região não codificadora que apresenta uma alta variabilidade IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 31 interespecífica, e pelo fato de que as espécies do cluster buzzattii compreendem um grupo evolutivo em processo de especiação recente. IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução 32 II. OBJETIVOS No presente estudo propomos uma análise da seqüência da região intergênica ITS-1 nas espécies do cluster buzzatii, com os seguintes objetivos: 1) Identificar eventuais polimorfismos de tamanho da região ITS-1 em várias linhagens das espécies do cluster buzzatii. Essa análise permitirá a observação dos possíveis polimorfismos intra e interespecíficos; 2) Seqüenciar a região ITS-1 em todas as linhagens, e estabelecer uma árvore filogenética para as espécies do cluster buzzatii baseada na comparação dessas seqüências; 3) Comparar as relações filogenéticas encontradas com aquelas já descritas para o cluster buzzatii com a utilização de outros marcadores. Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 33 III. MATERIAL & MÉTODOS III.1. Linhagens As linhagens e procedência das espécies de Drosophila do cluster buzzatii, estão apresentadas na tabela 1. Todas as linhagens nos foram cedidas pelo Prof. Dr. Fábio de Melo Sene, do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, e pela Dra. Maura Manfrin, do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, ambas pertencentes à Universidade de São Paulo. Também foi analisada uma linhagem de D. richardsoni (cluster stalkeri), do complexo buzzatii, obtida pelo Prof. Fábio do Centro de Estoques Bowling Green, Estados Unidos, registrada sob o código 1421, no referido Centro. Tanto amostras do DNA previamente extraídas e estocadas à -20°C, como amostras de DNA obtidas de espécimens vivos ou congelados à - 20°C ou fixados em etanol a 70% foram utilizadas nesse trabalho. Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 34 Tabela 1. Linhagens e procedência das espécies de Drosophila do cluster buzzatii analisadas. Espécie Código da Linhagem Procedência D. serido H49F1M Guaratuba/PR Brasil 1431.3 Milagres/BA Brasil D. seriema D54M Grão Mongol/BA Brasil D40F1M Serra do Cipó/MG Brasil D. koepferae B26D2 Famatina Argentina D. borborema 1281.2 Milagres/BA Brasil D. richardsonia 1421 a: espécie pertencente ao cluster stalkeri do complexo buzzatii Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 35 III.2. Extração do DNA genômico O DNA genômico foi extraído de moscas coletadas dos estoques, de moscas preservadas à -20°C ou material fixado em etanol. A extração do DNA foi realizada com o auxílio do kit Wizard Genomic DNA Purification PROMEGA, seguindo-se as instruções do fabricante. As amostras de DNA extraídas foram armazenadas à -20°C. Todas as amostras de DNA foram obtidas a partir de um único indivíduo. Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 36 III.3 Reação em Cadeia da Polimerase para amplificação das regiões intergênicas ITS-1 As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 50 µL contendo 2,5 unidades de Taq DNA polimerase, tampão de PCR, solução de dNTPs 200 µM, MgCl2 3mM e 4 µL de uma solução contendo 33 ng/µL de oligonucleotídeos iniciadores (primers) 5'CCTAACAAGGTTTCCGTAGG (forward) e 5'CCTAACAAGGTTTCCGTAGG (reverse) que se hibridizam à extremidade 3' do rDNA 18S e ao início da região 5' do rDNA 5,8S, respectivamente. Esse conjunto de oligonucleotídeos permite a amplificação da região intergênica ITS-1 por inteiro, tendo sido inicialmente utilizados para a análise do polimorfismo da região ITS-1 em Drosophila melanogaster e D. simulans (Dr. Jonathan B. Clark, Departamento de Ecologia e Biologia Evolutiva da Universidade do Arizona em Tucson, comunicação pessoal). Esse conjunto também já foi utilizado para a amplificação da região intergênica ITS-1 em Zaprionus indianus (Baffi et al., 2000). As condições para as reações de amplificação foram as seguintes: 3 minutos a 95°C para a desnaturação prévia do DNA, 35 ciclos de reação consistindo cada ciclo de 1 minuto a 95°C para desnaturação da cadeia de Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 37 DNA, 1 minuto a 50°C para a ligação dos oligonucleotídeos iniciadores e 1 minuto a 72°C para a polimerização da cadeia, e em seguida uma extensão final por 2 minutos a 72°C. Os fragmentos amplificados foram então separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corados em solução contendo 0,01% de brometo de etídeo e visualizados sob transiluminação ultravioleta. Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 38 III.4 Seqüenciamento dos fragmentos amplificados O seqüenciamento da região espaçadora ITS-1 foi realizado no Laboratório de Estudos Genômicos do Departamento de Biologia deste Instituto, com a colaboração da Profa. Dra. Paula Rahal Liberatore. As análises foram realizadas utilizando-se de seqüenciador automático ABI Prism 377 da Applied Biosystems Inc. Para as reações de seqüenciamento direto de fragmentos ITS-1 amplificados por PCR, utilizou-se os oligonucleotídeos iniciadores para a região ITS-1 forward (F) e reverse (R) na concentração 10 pmols/µl, em conjuntos de reações em separado, com 2µl da solução de DNA obtida a partir da extração de um único indivíduo e subseqüente marcação fluorescente com o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction da Perkin Elmer. Após a marcação, os produtos amplificados foram precipitados em 100µl de etanol absoluto gelado, 5µl de acetato de amônio 3M e 30µl de água. Em seguida, foram centrifugados por 30 minutos a 3200 rpm a 4°C. Ao precipitado foi adicionado 200µl de etanol 70% para lavagem, seguido de centrifugação por 5 minutos em 3200rpm à 4°C. Esse procedimento foi Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 39 repetido uma vez e o precipitado foi colocado em estufa à 37°C por uma hora para secagem. Para o seqüenciamento, as amostras receberam 1,5µl de loading buffer (formamida e blue dextran) e foram homogeneizadas 25 vezes por inversão. Foram, então, desnaturadas por 2 minutos a 95°C e mantidas no gelo até o momento de aplicação no gel de poliacrilamida à 5% do seqüenciador. Material & MétodosMaterial & MétodosMaterial & MétodosMaterial & Métodos 40 III.5 Análises das Seqüências O alinhamento múltiplo das seqüências foi realizado pelo programa CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Para a determinação das relações filogenéticas entre as seqüências ITS-1 das espécies de Drosophila do cluster buzzatii foi utilizado o software MEGA versão 3.1 (Kumar et al., 2004) em plataforma Windows. Análises filogenéticas das seqüências ITS-1 foram obtidas pelo método neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987) e pelo método da máxima parcimônia utilizando-se o algoritmo branch-and- bound presente no programa MEGA 3.1. Para a determinação dos limites de confiança nos “nós”, os dados foram submetidos ao test de bootstrap (Felsenstein, 1985) para 1000 repetições. ResultadosResultadosResultadosResultados 41 IV. RESULTADOS IV.1. Amplificação e caracterização inicial da região ITS-1 Inicialmente a região intergênica ITS-1 foi amplificada por PCR nas espécies do cluster buzzatii e D. richardsoni (cluster stalkeri), seguindo-se a metodologia descrita em materiais e métodos. Pode ser observado na figura 1 que os fragmentos amplificados, correspondentes à região ITS-1, apresentam tamanhos na faixa de 500 a 600 pb. Amostras dos fragmentos amplificados foram submetidas à digestão com as endonucleases de restrição Eco RI, Alu I, Hind III, Sal I e Hae III. Nenhum sítio de restrição foi encontrado nas seqüências correspondentes à região ITS-1 nessas espécies. ResultadosResultadosResultadosResultados 42 Figura 1. Gel de agarose a 1,5% mostrando o resultado da amplificação por PCR da região intragênica ITS-1 em linhagens do complexo buzzatii. Colunas: 1- Leader 1kb; 2- D. richardsoni 1421.0; 3- D. serido 1431.3; 4- D. borborema 1281.2; 5- D. serido H49F1M; 6- D. seriema D54M; 7- D. seriema D40F1; 8- D. koepferae B26D2; 9- D. buzzatii Ellen 3; 10- controle negativo com água. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ← ITS-1 506 pb→ ResultadosResultadosResultadosResultados 43 IV.2. Análise das seqüências Os produtos amplificados por PCR foram utilizados diretamente para o seqüenciamento. Todas as seqüências foram determinadas pelo método de seqüenciamento de DNA por terminação de cadeia desenvolvido por Sanger, utilizando-se didesóxinucleotídeos fluorescentes além dos desoxinucleotídeos comuns. Os resultados obtidos permitiram o alinhamento das seqüências para a região ITS-1 como mostrado na figura 2. Embora haja divergências das seqüências ITS-1 entre as espécies analisadas, é possível, por outro lado, observar-se algumas regiões conservadas. Para que o alinhamento múltiplo entre as seqüências ITS-1 fosse corretamente estabelecido, foram desconsideradas as extremidades cujos nucleotídeos não eram totalmente alinhados, ou seja, todas as posições nas extremidades que continham intervalos em qualquer uma das seqüências. Este tipo de procedimento não conduz a uma subestimativa na divergência, uma vez que quaisquer alterações nucleotídicas que eventualmente tenham ocorrido nestas regiões seriam desconsideradas no alinhamento múltiplo das seqüências. Assim, dentre as 690 posições analisadas, foram encontrados 152 sítios conservados e 173 sítios informativos para parcimônia considerando- ResultadosResultadosResultadosResultados 44 se todas as seqüências. A composição nucleotídica dessas seqüências pode ser observada na tabela 2. O número médio total de nucleotídeos obtido para alinhamento foi de 493.4, sendo encontrada uma porcentagem superior no conteúdo de A-T, cerca de 71,5%, em relação ao conteúdo de G-C, cerca de 28,5%, em todas as seqüências. ResultadosResultadosResultadosResultados 45 #D._richardsoni ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- #D._koepferae ---------- -----TTCCG AGGA?GCGCC ACGGCTAAGA AGGTTGCCGT #D._borborema ---------- -----CCTGC GGAAGGATCA TTAT?G?A?A ATGTT?TTAT #D._serido_1431.3 ---------- -----CCTG- GGAAGGATCA TTATTGA--A ATGTTTTT-- #D._serido_H49F1M ---------- -----CCTGC GGAAGGATCA TTATTGTATA ATGTTCTTAT #D._seriema_D40F1M ---------- ---------? GAGA?A?GCT ???G?GAACA AGGTTCCC?T #D._seriema_D54M ---------- -----TT?CG ?GGACGCGC- ACG????AGG ----TTCCGT #D._richardsoni -TTT??TC?G G-GA?CTCT? TGGAAATTCG AGGTTAT?G? GGA?GAGAAG #D._koepferae AGG.CGATGA A-..A.G.-G CACCGTAA.A G....T.C.? ATGTCGAT?A #D._borborema CCG.TAATAA A--.AA-AAA ATTTT..ATT .TA.ATGAAA TTTTT.ACGT #D._serido_1431.3 CCG.TAAAAA A--.AA---A ATTTT..ATT .AA.ATAAAA TTTTT.ATGT #D._serido_H49F1M CCG.TAATAA A--.AAGAAA ATTTT..ATT .AA.ATAAAA TTTTT.ATGT #D._seriema_D40F1M AGG?CGATGA AA..A.G.AA CA?CG.?A.T .....T?A?A ?TGT?.ATG. #D._seriema_D54M ??G.CGATGA A-..A.G.AG CATCG?A??A ?...?TC?.? A.?T??ATG? #D._richardsoni CAAGG???TT TGTTTTAGGT ATAAGTC?TT TA?G?CAACG AAA?G?AATA #D._koepferae A?.A-----C ?AAC?GCA.C ?.C.C.TAG. .GAAGA.CAA ...ACA..AC #D._borborema ..-------. .AA??.-AA. G.TTA.TCAC .GTTTTGGT. ..GAAC..A. #D._serido_1431.3 ..-------. .AAA..-AA. G.TTA.TC-C .GTTTTGGT. ..GAAC..A. #D._serido_H49F1M ..-------. .AAA..TAA. G.TTA.TCAC CGTTTTGGT. ...AAC..A. #D._seriema_D40F1M A?.T-----. ??A..?.?.C ?.T.T..A-C .GTTTTGGT. ..GAAC..A. #D._seriema_D54M .?.A???--. .?AACG?T.? ..C?T.TGG. .CT.G?G?.? .TGAA?.??G #D._richardsoni TAAAC?GCG? 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ResultadosResultadosResultadosResultados 46 #D._richardsoni ATAAAAGAT- TTTGTCATAT ACC?TATTTT TATAGATT?T GTAAAACTAA #D._koepferae ..T...TC.A .......... .T.A...... ........A. .......... #D._borborema T.T...CC.A ........G. .T.A...... ........A. .......... #D._serido_1431.3 ..T...CC.A ........G. .T.G...... ........A. .......... #D._serido_H49F1M ..T...CC.A ........G. .T.A...... .......?G? .......... #D._seriema_D40F1M ..T...CC.A ........G. .T.A...... ........A. .......... #D._seriema_D54M ..T...CC.A ........G. .T.A...... ........A. .......... #D._richardsoni G?CATTTCGC AACATTGTTT AGGTATAAAA AA?TTTTTTT TATTGAAGG? #D._koepferae .A........ .......... ......G... ..AA...... --.......A #D._borborema .A........ .......... .......... ?.A.....?. A-..?....A #D._serido_1431.3 .A........ .......... .........T TT-....... A-.......A #D._serido_H49F1M .A........ ?......... ...?....TT ---....... 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TA.CT.GGTT T?C?TAG?.. ?GGAAG.?.? #D._seriema_D40F1M ..T-...... ?....?.... ?A..G?..TT T...AA..AA ....?..... #D._seriema_D54M ..T....... .......... .A..?...TT T...A...?. ?......... #D._richardsoni AAGCGGTGGA TCACTCGGCT CATGGGTCGA TGAAAAAAAA #D._koepferae ......?... .......... ..G....... .......CGC #D._borborema CC..T.A.AT C.?G.TCCTG ---------- ---------- #D._serido_1431.3 ---------- ---------- ---------- ---------- #D._serido_H49F1M CC..T.A.AT CA??..CTG- ---------- ---------- #D._seriema_D40F1M ....?..... ..T....... .....C?..? ....G..C?C #D._seriema_D54M .......... .......... .......... ....G..CGC Figura 2. Alinhamento múltiplo das seqüências ITS-1 nas espécies analisadas de Drosophila do complexo buzzatii. Posições que compartilham nucleotídeos idênticos são marcadas como pontos; as deleções são indicadas como traços e nucleotídeos indeterminados são representados por (?). ResultadosResultadosResultadosResultados 47 Tabela 2. Composição nucleotídica das seqüências ITS-1 obtidas das linhagens do complexo buzzatii. Todas as freqüências são dadas em porcentagem. Total* T C A G D. richardsoni 489 35.2 11.9 34.8 18.2 D. koepferae 529 30.6 13.8 37.4 18.1 D. borborema 505 36.2 13.1 34.5 16.2 D. serido 1431.3 479 39.0 10.4 35.7 14.8 D. serido H49F1M 501 37.5 13.6 33.7 15.2 D. seriema D40F1M 509 34.0 12.6 36.0 17.5 D. seriema D54M 494 34.8 13.6 33.0 18.6 Média 493.4 35.6 12.5 35.9 16.0 (*): corresponde ao número total de nucleotídeos analisados em cada seqüência. ResultadosResultadosResultadosResultados 48 IV.3. Análises filogenéticas O software MEGA 3.1 foi utilizado para a análise filogenética no conjunto de dados. Os métodos da máxima parcimônia e de distância foram utilizados para o estabelecimento das relações filogenéticas entre as seqüências analisadas e demonstraram topologias semelhantes. Dos 690 sítios alinhados, foram encontrados 152 sítios conservados e 173 sítios informativos para parcimônia. Os valores das distâncias estimadas, com base na comparação das seqüências ITS-1, pelo método de Kimura dois-parâmetros (Kimura, 1980) são apresentados na tabela 3, para as espécies do cluster buzzatii e D. richardsoni (cluster stalkeri). Foram incluídas nas análises filogenéticas os dados das seqüências ITS-1 de D. virilis e D. melanogaster, obtidas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), com os códigos de acesso Z28414 (Schloetterer et al., 1994) e J011703 (Semionov & Makova, 1997), respectivamente. A tabela 4 mostra as distâncias obtidas somente para as espécies do cluster buzzatii. A distância estimada média obtida em relação a todas as linhagens analisadas foi de 0.373; e, considerando-se somente as espécies do cluster buzzatii, o valor médio de distância foi de 0.168. Com relação às árvores obtidas pela análise das distâncias entre as seqüências ITS-1 analisadas, empregou-se o algoritmo neighbor-joining ResultadosResultadosResultadosResultados 49 (Saitou & Nei, 1987), que consiste de um algoritmo heurístico para construção de topologias em que o conceito de evolução mínima está implícito e, portanto, realiza a procura pela árvore com menor soma total dos ramos. Nesta análise também utilizou-se o suporte estatístico de bootstrap, com 1000 replicações. Os resultados podem ser observados nas figuras 3.A e 4.A, considerando-se todas as espécies analisadas ou apenas àquelas pertencentes aos cluster buzzatii, respectivamente. Para a análise de máxima parcimônia utilizou-se o algoritmo branch- and-bound (Hendy & Penny, 1982), o qual trata-se de um algoritmo exato que reduz o tempo computacional para um conjunto grande de dados e elimina possíveis árvores obtidas com maior número de passos. Para o suporte estatístico da topologia obtida foi empregado a análise de bootstrap (Felsenstein, 1985) com 1000 replicações. Esses dados são apresentados nas figuras 3.B e 4.B e mostram relações filogenéticas similares àquelas obtidas pelo método de distância. ResultadosResultadosResultadosResultados 50 Tabela 3. Distâncias estimadas pelo método de Kimura dois-parâmetros entre as seqüências ITS-1 das linhagens analisadas do cluster buzzatii, D. richardsoni (cluster stalkeri), D. virilis e D. melanogaster. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (1) D. melanogaster (2) D. virilis 1.035 (3) D. richardsoni 1.066 0.286 (4) D. koepferae B26D2 1.031 0.312 0.180 (5) D. borborema 1282.2 1.054 0.324 0.213 0.217 (6) D. seriema D40F1M 0.967 0.252 0.127 0.119 0.111 (7) D. seriema D54M 1.019 0.307 0.144 0.144 0.162 0.082 (8) D. serido 1431.3 1.017 0.282 0.185 0.166 0.103 0.086 0.136 (9) D. serido H49F1M 1.063 0.341 0.237 0.221 0.040 0.132 0.184 0.083 ResultadosResultadosResultadosResultados 51 Tabela 4. Distâncias estimadas pelo método de Kimura dois-parâmetros entre as seqüências ITS-1 das linhagens analisadas do cluster buzzatii (1) (2) (3) (4) (5) (6) (1) D. koepferae B26D2 (2) D. borborema 1282.2 0.275 (3) D. serido 1431.3 0.239 0.098 (4) D. serido H49F1M 0.274 0.043 0.082 (5) D. seriema D40F1M 0.133 0.154 0.140 0.175 (6) D. seriema D54M 0.146 0.217 0.202 0.240 0.097 ResultadosResultadosResultadosResultados 52 A. D. borborema D. borborema D. borborema D. borborema D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. richardsoni D. richardsoni D. richardsoni D. richardsoni D. viril is D. viril is D. viril is D. viril is D. melanogaster D. melanogaster D. melanogaster D. melanogaster 99 99 85 84 74 48 0.1 B. D. borborema D. borborema D. borborema D. borborema D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. richardsoni D. richardsoni D. richardsoni D. richardsoni D. virilis D. virilis D. virilis D. virilis D. melanogaster D. melanogaster D. melanogaster D. melanogaster 94 96 67 49 55 96 20 Figura 3(A e B). A) Árvore obtida com o algoritmo neighbor-joining para as seqüências ITS-1 das linhagens de Drosophila pertencentes ao cluster buzzatii. B) Árvore obtida pelo método da máxima parcimônia. As espécies D. richardsoni, D. virilis e D. melanogaster, foram utilizadas como grupos externos Os valores de bootstrap (1000 replicações) mostrados abaixo dos “nós” ResultadosResultadosResultadosResultados 53 A. D. borborema D. borborema D. borborema D. borborema D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. koepferae 99 100 99 0.02 B. D. borborema D. borborema D. borborema D. borborema D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido H49F1M D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. serido 1431.3 D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D40F1M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. seriema D54M D. koepferae D. koepferae D. koepferae D. koepferae 91 100 93 10 Figura 4 (A e B). A) Árvore obtida com o algoritmo neighbor-joining para as seqüências ITS-1 das linhagens de Drosophila pertencentes somente ao cluster buzzatii. B) Árvore obtida com o método da parcimônia para as seqüências ITS-1 das linhagens de Drosophila pertencentes somente ao cluster buzzatii. Os valores de bootstrap (1000 replicações) mostrados abaixo dos “nós”. DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 54 V. DISCUSSÃO O DNA ribossômico é constituído por uma família multigênica na qual se repetem em tandem uma série de cístrons ribossômicos que contém as seqüências codificadoras dos RNA ribossômicos 18S, 5,8S e 28S, que por sua vez estão separadas por seqüências intergênicas transcritas, não codificadoras, denominadas ITS-1 e ITS-2. O modo como tais genes evoluíram pode ser explicado pelo fenômeno da evolução em concerto, uma vez que as múltiplas cópias dos genes ribossômicos são muito semelhantes num mesmo indivíduo, mas diferem entre as espécies, principalmente com relação às regiões espaçadoras não-codificantes (Matioli, 2001). As regiões espaçadoras ITS-1 e ITS-2 vêm sendo utilizadas em diversos estudos que visam a análise das relações evolutivas entre classes taxonômicas mais próximas, inclusive em insetos. Em dípteros, do gênero Anopheles, foi realizada a identificação de espécies crípticas utilizando-se dados do seqüenciamento da região ITS-2 (Beebe et al., 1999). Em outro estudo, diversas espécies crípticas de Culex foram diferenciadas através de produtos amplificados correspondentes à região intergênica ITS-1 (Toma et al., 2000). DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 55 Nossos resultados, com base na composição nucleotídica das seqüências da região ITS-1, mostram maior conteúdo de A-T (~70%) em relação ao conteúdo G-C (~30%) para essa região em todas as espécies analisadas. Esses resultados estão em concordância com aqueles obtidos para seqüências ITS-1 no grupo de Drosophila melanogaster, no qual observou-se alta freqüência de conteúdo A-T, com média maior que 70% (Schlöterer et al., 1994). Para espécies do cluster buzzatii, Kuhn e Sene (2005) encontraram conteúdo A-T variável entre 62% em D. antonietae à 71,9% em D. buzzatii, em seqüências de DNA satélite, também presentes em regiões heterocromáticas. Além disso, pudemos também constatar que esta alta quantidade de conteúdo A-T excede a média encontrada para esta característica para outras regiões de DNA não codificantes em Drosophila, cujo valor médio é de ~60% (Moriyama e Hartl, 1993). Uma possível explicação para este alto nível de conteúdo A-T na região espaçadora ITS-1 em relação às outras regiões de DNA não codificantes pode estar relacionado com o fato de que os grupamentos de DNA ribossômico encontram-se em grande maioria na heterocromatina. Altos índices de conteúdo A-T também foram observados para seqüências de DNA satélite, que também se posicionam nesta região do genoma (Strachan et al., 1985). O alinhamento múltiplo das seqüências ITS-1 nos possibilitou verificar a ocorrência de algumas regiões conservadas e outras que exibem grau elevado de divergência, quando analisamos as seqüências ITS-1. DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 56 Análises comparativas anteriores baseadas em regiões ITS-1 do DNA ribossômico de Drosophila também indicaram regiões que exibiam um padrão diferenciado de convergência/divergência. A presença de seqüências conservadas nas regiões espaçadoras ITS entre as espécies analisadas sugere que as mesmas possam desempenhar algum papel funcional importante na estrutura secundária dos transcritos ribossômicos (Schlöterer et al., 1994). As relações filogenéticas determinadas em nossas análises estão em concordância com aquelas mostradas previamente por Ruiz et al. (2000) e Manfrin et al. (2001), que estudaram a sistemática evolutiva das espécies pertencentes ao cluster de D. buzzatii com base na análise de inversões cromossômicas e na comparação de seqüências do gene mitocondrial COI. Nossos resultados mostram que as espécies do cluster buzzatii analisadas constituem um grupo monofilético, e que D. richardsoni (cluster stalkeri) apresenta-se como uma espécie irmã colocada em uma posição basal em relação às espécies do cluster buzzatii. Resultados semelhantes a estes foram também demonstrados por Ruiz e Wasserman (1993), quando investigaram as relações evolutivas entre os três clusters de espécies (stalkeri, martensis e buzzatii) que compõem o complexo buzzatii. A posição basal de D. richardsoni em relação aos outros clusters do complexo buzzatii também foi demonstrada através de análises de seqüências do gene da xantina desidrogenase (Xdh), provenientes de várias DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 57 espécies componentes deste complexo de espécies (Rodriguez-Trelles et al, 2000). Em relação aos resultados apresentados nas figuras 3 e 4 podemos observar que D. borborema posiciona-se mais proximamente a D. serido e D. seriema do que em relação à D. koepferae. Nossas observações estão alinhadas com aquelas obtidas para essas espécies citadas através de análises de inversões cromossômicas (Ruiz et al., 2000), de genes mitocondriais (Manfrin et al., 2001) e também de seqüências de DNA satélite (Kunh e Sene, 2005). A divergência entre as linhagens de D. serido exibida nos resultados apresentados reforça a grande variação populacional intraespecífica, já demonstrada para essa espécie através de diversas características, tais como polimorfismos de cariótipos (Tosi e Sene, 1989), diferenças na constituição da terminália (Silva e Sene, 1991), genes mitocondriais (Manfrin et al., 2001) e análises de cladística “aninhada” (de Brito et al., 2002b). De acordo com os cladogramas apresentados nas figuras 3 e 4, pode- se observar que a linhagem H49F1M de D. serido se posicionou mais proximamente a D. borborema do que em relação à outra linhagem de D. serido (1431.3). Este resultado reforça observações prévias nas quais já havia sido estudada a ampla variabilidade genética exibida pelas populações de D. serido (Ruiz et al., 2000). Além disso, estudos anteriores já demonstraram o grau elevado de proximidade genética entre D. DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 58 borborema e D. serido, inclusive considerando as espécies citadas como sendo espécies irmãs (Manfrin et al., 2001). Com base na análise de cruzamentos interespecíficos e respectivas proles híbridas, Madi-Ravazzi et al. (1997), Machado et al. (2002) e Machado et al. (2006) observaram um certo grau de divergência entre D. koepferae em relação às outras espécies do sibling set serido. Em alguns cruzamentos envolvendo D. koepferae e D. seriema; ou D. koepferae e D. gouveai, não foram observados quaisquer descendentes devido à presença de espermatozóides imóveis nos híbridos. As relações filogenéticas obtidas no presente estudo estão em concordância com os dados mencionados acima, uma vez que a espécie D. koepferae está posicionada em um ramo basal nos cladogramas obtidos. Nas topologias apresentadas nas figuras 3.A e 3.B, pode ser observado que D. melanogaster permaneceu como um grupo externo tanto nas análises de distância quanto na árvore de parcimônia, indicando desse modo o elevado grau de divergência entre essa espécie, pertencente ao subgênero Sophophora, em relação às outras espécies analisadas, as quais estão incluídas no subgênero Drosophila. Ainda com relação às figuras 3.A e 3.B pode-se observar que D. virilis posicionou-se na base da sub-árvore na qual estão colocadas as espécies do complexo buzzatii. Robe et al. (2005) também constataram a divergência das espécies do grupo virilis em relação às espécies do grupo repleta, ambos pertencentes ao subgênero DiscussãoDiscussãoDiscussãoDiscussão 59 Drosophila, através da análise combinada de seqüências do gene α- metildopa, o qual constitui um marcador nuclear; e do gene da citocromo oxidase II, um marcador mitocondrial. Comparações entre análises evolutivas da região ITS com filogenias baseadas em dados de outros marcadores de evolução mais lenta também apresentaram concordância em outros grupos de espécies de Drosophila (Schlötterer et al., 1994; O’Grady et al., 1998; Mukha, et al., 2002). Um aspecto importante a ser ressaltado em relação às relações filogenéticas obtidas através da análise das seqüências do espaçador ITS-1 para as espécies do cluster buzzatii (figuras 4.A e 4.B) é o fato de que foram estabelecidas topologias resolvidas, ou seja, não apresentaram quaisquer politomias entre os ramos, mesmo quando eram comparadas seqüências originadas de espécies nas quais foram obtidos reduzidos valores de distância. Esse é um resultado importante, uma vez que em análises com outros marcadores, as relações filogenéticas obtidas para as espécies do cluster buzzatii freqüentemente apresentam politomias, dado seu grau elevado de proximidade filogenética. ConclusõesConclusõesConclusõesConclusões 60 VI. Conclusões Todas as espécies de Drosophila pertencentes ao cluster buzzatii (complexo buzzatii, grupo repleta) analisadas neste trabalho, respectivamente, D. koepferae, D. seriema, D. serido e D. borborema, além de D. richardsoni (cluster stalkeri, complexo buzzatii, grupo repleta), utilizada como grupo externo, apresentaram um fragmento amplificado por PCR, correspondente à região intergênica ITS-1 do rDNA, com comprimentos de aproximadamente 550pb. A análise de restrição com as endonucleases Eco RI, Alu I, Hind III, Sal I e Hae III, não evidenciou a existência de nenhum sítio de restrição no fragmento amplificado correspondente à região ITS-1 nas espécies acima citadas. As seqüências correspondentes à região ITS-1, em todas as espécies analisadas mostraram alto conteúdo A-T, de acordo com dados já mostrados na literatura para regiões não-codificantes do genoma de Drosophila. As relações filogenéticas obtidas a partir dos dados de seqüência da região ITS-1 indicam que as espécies do cluster buzzatii constituem um grupo monofilético. ConclusõesConclusõesConclusõesConclusões 61 O marcador nuclear baseado na seqüência ITS-1 forneceu relações filogenéticas resolvidas, ou seja, sem politomias, e assim, foi adequadamente utilizado para a análise do cluster buzzatii o qual é constituído por espécies pouco divergentes. Referências BibliográficasReferências BibliográficasReferências BibliográficasReferências Bibliográficas 62 VII. Referências Bibliográficas AB'SABER, A. N. Espaços ocupados pela expansão dos climas secos da América do Sul, por ocasião dos períodos glaciais quaternários. Paleoclimas, v.3, p.1-19, 1977a. AB'SABER, A. N. Os domínios morfoclimáticos da América do Sul. Geomorfologia., v.52, p.1-23, 1977b. AVERBECK, K. T. AND EICKBUSH, T. H. Monitoring the mode and tempo of concerted evolution in the Drosophila melanogaster rDNA locus. 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