RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 26/02/2020. 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA APLICADA (MESTRADO) Pré-tratamento ácido diluído e deslignificação afetam a área superfícial da lignina e a sacarificação enzimática GABRIEL OLIVEIRA DE AZEVEDO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Michel Brienzo. Rio Claro 2018 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA APLICADA (MESTRADO) Pré-tratamento ácido diluído e deslignificação afetam a área superfícial da lignina e a sacarificação enzimática GABRIEL OLIVEIRA DE AZEVEDO Orientador: Prof. Dr. Michel Brienzo Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia Aplicada. Rio Claro 2018 Azevedo, Gabriel Oliveira de Pré-tratamento ácido diluído e deslignificação afetam a área superficial da lignina e a sacarificação enzimática / Gabriel Oliveira de Azevedo. - Rio Claro, 2018 79 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Michel Brienzo 1. Enzimas. 2. Cana-de-açúcar. 3. Lignina. 4. Pré-tratamento ácido diluido. 5. Deslignificação. 6. Hidrólise enzimática. I. Título. 547.758 A994p Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP - Ana Paula Santulo C. de Medeiros / CRB 8/7336 Agradecimentos Ao meu orientador Michel Brienzo, pela paciência e dedicação em me guiar pelos trilhos da ciência. A meus pais Amauri e Roseli, por terem sido minha inspiração até os dias de hoje. A minha namorada Michele, pela paciência e por me acompanhar durante o desenvolvimento deste trabalho. A meus amigos de laboratório, por terem compartilhado um pedaço de suas vidas comigo, e por todo o auxílio no trabalho do dia a dia. Aos professores, Fernando Pagnocca, Jonas Contiero, Márcia Braga e Maria Aparecida Marin Morales, por terem cedido seus espaços de pesquisa em partes fundamentais deste trabalho. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 7 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 9 2.1 Bioetanol e o papel da biomassa lignocelulósica ......................................... 9 2.2 Heterogeneidade da biomassa de cana-de-açúcar ..................................... 11 3. LIGNINA ................................................................................................................ 14 3.1 Definição e Função ........................................................................................ 14 3.2 Impacto da lignina em processos biotecnológicos .................................... 17 3.3 Determinação de lignina ................................................................................ 19 3.4 Aplicações tecnológicas da lignina .............................................................. 22 4. PRÉ-TRATAMENTOS .......................................................................................... 25 4.1 Pré-tratamento ácido ..................................................................................... 25 4.2 Pré-tratamento por explosão de vapor ........................................................ 27 4.3 Pré-tratamento com clorito de sódio - deslignificação ............................... 28 5. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA .................................................................................... 30 6. OBJETIVOS .......................................................................................................... 35 7. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 36 7.1 Separação das frações .................................................................................. 36 7.2 Pré-tratamento com ácido diluído ................................................................ 36 7.3 Deslignificação branda com clorito de sódio (NaClO2) após pré-tratamento com ácido ............................................................................................................. 36 7.4 Determinação da Atividade enzimática ........................................................ 37 7.5 Hidrólise enzimática das amostras .............................................................. 38 7.6 Composição química dos materiais ............................................................. 38 7.7 Preparo do corante Azure B, determinação da absortividade molar e padronização de parâmetros .............................................................................. 39 7.8 Determinação da superfície exposta ou área superficial da lignina (ASL) e área superficial específica da lignina (ASEL) .................................................... 39 8. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 41 8.1 Pré-tratamento ácido diluído ......................................................................... 41 8.2 Deslignificação branda com clorito de sódio do material pré-tratado com ácido ...................................................................................................................... 43 8.3 Composição química das biomassas de cana-de-açúcar .......................... 46 8.4 Área de superfície da lignina ........................................................................ 54 8.4.1 Padronização do tempo, temperatura e agitação na adsorção do corante Azure B em material lignocelulósico. ............................................... 54 8.4.2 Área superficial da lignina (ASL) e específica (ASEL) nas biomassas de cana-de-açúcar pré-tratadas ............................................................................ 56 8.5 Hidrólise enzimática das biomassas de cana-de-açúcar ........................... 63 9. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 69 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 70 Resumo O aproveitamento de resíduos é uma das questões amplamente discutidas no cenário ambiental e econômico no mundo todo. O desenvolvimento de tecnologias que possam dar destinos apropriados a resíduos que seriam descartados de forma imprópria, pode também movimentar a economia com produção de energia e moléculas de valor agregado. O bagaço de cana-de-açúcar é um destes resíduos, utilizado atualmente para a cogeração de energia, agora se apresenta, graças a novas tecnologias desenvolvidas, como uma matéria-prima então empregado para a produção de etanol, polímeros entre outros compostos que possuem valor agregado. Alguns desafios, no entanto, precisam ser superados, a lignina, um dos componentes dessa biomassa como é uma barreira a ação de enzimas que realizam a hidrólise dos polissacarídeos presentes nesse material. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de pré-tratamentos e seu impacto em diferentes frações da biomassa de cana-de-açúcar. Dois diferentes pré-tratamentos foram empregados, um com ácido sulfúrico diluído (5, 10 e 20 % m/m, a 121°C/30 min), seguindo de uma deslignificação branda com clorito de sódio (30 % m/m, a 70°C/1 h). A área superficial da lignina foi determinada o corante catiônico Azure B em solução de 0,1 g/ml. Hidrólises enzimática (15 FPU/g por 24 h – Cellic Cetec 2 – Novozymes) foi aplicada nos materiais para avaliar o rendimento em glicose. O pré-tratamento ácido diluído removeu até 40% da hemicelulose de todas as frações em estudo. A deslignificação branda com clorito de sódio diminui o teor de lignina nos materiais, originando um material rico em celulose. O corante Azure B permitiu determinar a superfície ocupada pela lignina após o pré-tratamento ácido, e a residual após a deslignificação. A fração e condição com maior área superficial total de lignina foi a folha pré-tratada com ácido a 5 % com 52 m²/g de material. A fração externa apresentou a maior área superficial específica (240 m²/g) após a aplicação de deslignificação. Os resultados indicam que a redução na área superficial da lignina impacta positivamente no rendimento em glicose de hidrólise enzimática Palavras chave: cana-de-açúcar, lignina, pseudo-lignina, pré-tratamento ácido diluído, deslignificação, hidrólise enzimática Abstract The reutilization of residues is a contemporary question in the environmental and economic scenario in the world. The development of technologies that could give proper destination to residues that would be discarded, could as well generate income by producing energy and chemical molecules of economic interest. The sugarcane bagasse is one of these sub products, used mostly for energy generation through its burning, presents itself now as an alternative to the production of biofuels due to the development of new strategies and technologies. Some challenges remain nonetheless, lignin, one of lignocellulosic biomass main components acts like a barrier, blocking the interaction between enzymes and the polysaccharides. In this context, the present study aimed to show the effect of two distinct pretreatments and their combination and its impacts in the lignocellulosic biomass digestibility. The pretreatments employed were dilute sulfuric acid (5, 10 and 20 % w/w, at 121°C/30 min), followed by a delignification with sodium chlorite (30 % w/w at 70°C/ 1 h). The lignin surface area was determined by the cationic dye Azure B in solution of 0.1 g/mL. Enzymatic hydrolysis (15 FPU/g for 24 h – Cellic Ctec 2 - Novozymes) of the material was employed to assess the glucose yield. The dilute acid pretreatment removed part of the hemicellulose in all fractions in study. The delignification with sodium chlorite reduced the lignin content in all samples, consequently increasing the overall glucan content. The Azure B dye detected the lignin surface area after the dilute acid pretreatment, and its remaining area after the delignification. The fraction with highest surface area was the leaves pretreated with 5% of diluted acid, resulting in 52 m²/g of material. The external fraction showed the highest specific surface area with 240 m²/g of lignin after the delignification procedure. The results of enzymatic hydrolysis and lignin surface area imply that the reduction of lignin surface area results in an increase in enzymatic hydrolysis for all fractions in study. Keywords: sugarcane, lignin, pseudo-lignin, dilute acid pretreatment, delignification, enzymatic hydrolysis. 7 1. INTRODUÇÃO O resíduo fibroso resultante da remoção do “suco” da cana-de-açúcar (sacarose), e sua maceração é chamado de bagaço de cana-de-açúcar, um dos resíduos de agricultura mais abundantes no planeta (FERNANDES et al., 2017). Diversas aplicações deste resíduo estão descritas como estudo na literatura, as quais vão desde a produção de papel, até a produção de biocombustíveis (LOH et al., 2013). Estratégias de utilização do bagaço para a geração de energia, principalmente na forma de biocombustíveis líquidos vêm sendo estudadas ao longo dos anos. A possibilidade de gerar energia sustentável associado com o baixo custo do bagaço, o tornam um alvo para o desenvolvimento de novas tecnologias nesta área (BEZERRA; RAGAUSKAS, 2016). Porém, o material lignocelulósico é recalcitrante e precisa de pré-tratamento para modificar sua estrutura. Os constituintes principais do bagaço são: celulose, hemicelulose, lignina, extrativos e cinzas, sendo os três primeiros constituintes os presentes em maior quantidade. A alta composição em polissacarídeos favorece a sua aplicação em reações de hidrólise gerando carboidratos simples, os quais são empregados em fermentações para geração de produtos, sendo o principal o etanol (REZENDE et al., 2011). De forma semelhante a outras plantas, os polissacarídeos presentes no bagaço são formados por celulose e hemicelulose, imersos em uma matriz de lignina. A lignina é um composto fenólico amorfo, resistente a ataques enzimáticos e degradação, sendo considerado o principal elemento responsável pela recalcitrância da parede celular a hidrólise enzimática da celulose (HIMMEL et al., 2007; ISIKGOR et al. 2015). Para diminuir a recalcitrância do material lignocelulósico, a qual é devida a composição química em combinação as propriedades físico-químicas (BRIENZO et al., 2015), e aumentar a taxa de conversão enzimática da celulose e hemicelulose a carboidratos simples, diversos pré-tratamentos vem sendo estudados (KUMAR; SHARMA, 2017; KUMAR et al., 2009). Os diferentes pré-tratamentos possuem diferentes características e maneiras de ação distintas, levando, portanto, a diferentes alterações na composição e estrutura do material lignocelulósico. Os pré-tratamentos podem diminuir a cristalinidade e grau de polimerização da celulose, remover parte do conteúdo de lignina ou hemicelulose, ou modificar a estrutura da lignina (KUMAR; SHARNA, 2017). Os pré-tratamentos podem afetar a celulose, levando a 8 despolimerização parcial, dependendo da sua severidade (ZENG et al., 2014). Alguns pontos negativos são possíveis perdas de carboidratos por degradação, com produção de inibidores enzimáticos ou compostos que afetam negativamente o processo subsequente de fermentação (TAHERZADEH; KARIMI, 2008). Os pré-tratamentos físico-químicos mais utilizados na indústria do etanol são a explosão a vapor, os pré-tratamentos de ácido diluído, e os alcalinos, sendo que os efeitos causados por cada um destes variam. Os pré-tratamentos ácidos são considerados mais eficientes e econômicos se comparados com os pré-tratamentos alcalinos ou oxidativos, e são capazes de solubilizar a hemicelulose (na forma de monossacarídeo) e uma pequena fração da lignina. Portanto, é um pré-tratamento bastante utilizado como método de separação de hemicelulose quando seu objetivo é obter um hidrolisado rico em xilose. Pré-tratamentos que utilizam substâncias alcalinas como hidróxido de sódio são capazes de solubilizar hemicelulose e lignina, além de contribuir com melhora na digestão enzimática das fibras de celulose (REZENDE et al., 2011). Por fim, o pré-tratamento por explosão a vapor modifica a estrutura do material lignocelulósico, levando a altas taxas de liberação de glicose por hidrólise enzimática. Porém, este pré-tratamento ocasiona a formação de alguns compostos inibitórios do processo de fermentação (LASER et al., 2002; JÖNSSON; MARTÍN, 2016). Devido aos impactos negativos no rendimento de hidrólise enzimática causados pela presença de lignina (barreira física e adsorção improdutiva de enzimas), sua remoção ou modificação se faz necessária para a conversão de materiais lignocelulósicos em biocombustíveis. Neste contexto, o presente estudo analisou a área superficial referente a lignina total, levando em consideração a ocorrência de depósitos de lignina sobre o material após a aplicação dos pré- tratamentos ácido diluído e sua combinação deslignificação branda com clorito de sódio. As análises foram baseadas na estimativa da área superficial da lignina (total e específica) através da adsorção do corante Azure B. De forma complementar, a adsorção de corante foi relacionada com a composição química do material (lignina residual total) e rendimento em glicose na hidrólise enzimática. 69 9. CONCLUSÃO O pré-tratamento ácido nas concentrações utilizadas (5, 10 e 20 % m/m) foi eficiente em remover seletivamente a lignina, aumentando consequentemente o teor de glicose e lignina das amostras, para todas as frações em estudo, em especial as menos recalcitrantes, o nó e o entrenó. A folha foi a fração cujo teor de lignina se apresentou o maior em todos os casos, porém não a mais recalcitrante, conforme evidenciado pelos resultados de hidrólise enzimática. A conversão de celulose a glicose foi menor na fração externa, que apesar de não ter o maior teor de lignina, apresentou o menor conteúdo de glicose entre todas as frações estudadas. A área superficial total e específica da lignina é modificada pela ação dos pré- tratamentos ácido e a subsequente deslignificação com clorito de sódio. A concentração de ácido utilizado no pré-tratamento tem efeito negativo sobre a superfície total da lignina para todas as frações, a subsequente deslignificação amplifica a redução da área total, enquanto que área específica aumenta para as frações externa, nó e entrenó, conforme a concentração de ácido. A redução na área superficial ocupada pela lignina aparenta ter efeito positivo sobre o rendimento de hidrólise enzimática, aumentando a quantidade de glicose obtida após 24 h de reação para todas as frações. 70 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGRAWAL R, GAUR R, MATHUR A, KUMAR A, GUPTA RP, TULI DK, SATLEWAL A. Improved saccharification of pilot-scale acid pretreated wheat straw by exploiting the synergistic behavior of lignocellulose degrading enzymes. RSC Advances, 5, pp. 71462-71471, 2015. ALLEN, S. E. Chemical Analysis of Ecological Materials. Blackwell Scientific Publications, Oxford, England. 2nd ed. 1989. ALVIRA, P., TOMÁS-PEJÓ, E., BALLESTEROS, M., NEGRO, M. J. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: a review. Bioresource technology, 101(13), pp. 4851-4861. 2010. ALVIRA, P., NEGRO, M. J., BALLESTEROS, I., GONZÁLEZ, A., BALLESTEROS, M. Steam explosion for wheat straw pretreatment for sugars production. 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