UNESP – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” LQOF & RMN – Laboratório de Química Orgânica Fina e Ressonância Magnética Nuclear POSMAT – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais EDUARDO HENRIQUE ZAMPIERI ESTUDO POR RMN E DRX DAS REAÇÕES DE BROMAÇÃO DE GUANIDINAS COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTILEISHMANIA Orientador: Prof. Dr. Eduardo René Pérez González Presidente Prudente 2024 Eduardo Henrique Zampieri ESTUDO POR RMN E DRX DAS REAÇÕES DE BROMAÇÃO DE GUANIDINAS COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTILEISHMANIA Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutor à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Programa de Pós- graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais (POSMAT), área de concentração Química dos Materiais, sob a orientação do Prof. Dr. Eduardo René Pérez González. Presidente Prudente 2024 Zampieri, Eduardo Henrique. Estudo por RMN e DRX das reações de bromação de guanidinas com potencial atividade antileishmania / Eduardo Henrique Zampieri, 2024 126 f. : il. Tese (Doutorado)–Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências, Bauru Orientador: Eduardo René Pérez González 1. Guanidinas. 2. Bromação. 3. NBS. 4. SCDRX. 5. RMN. 6. Estudo conformacional. I. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências. II. Título. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Bauru ATA DA DEFESA PÚBLICA DA TESE DE DOUTORADO DE EDUARDO HENRIQUE ZAMPIERI, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATERIAIS, DA FACULDADE DE CIÊNCIAS - CÂMPUS DE BAURU. Aos 17 dias do mês de outubro do ano de 2024, às 14:00 horas, por meio de Videoconferência, realizou-se a defesa de TESE DE DOUTORADO de EDUARDO HENRIQUE ZAMPIERI, intitulada Estudo por RMN e DRX das reações de bromação de guanidinas com potencial atividade antileishmania. A Comissão Examinadora foi constituida pelos seguintes membros: Prof. Dr. EDUARDO RENE PEREZ GONZALEZ (Orientador(a) - Participação Virtual) do(a) Departamento de Química e Bioquímica / Faculdade de Ciências e Tecnologia - Unesp/Câmpus de Presidente Prudente, Prof. Dr. MARCUS TULLIUS SCOTTI (Participação Virtual) do(a) Departamento de Química / Universidade Federal da Paraíba - UFPB , Prof. Dr. SERGIO ANTONIO MARQUES DE LIMA (Participação Virtual) do(a) Departamento de Física, Química e Biologia / Faculdade de Ciências e Tecnologia - Unesp/ Câmpus de Presidente Prudente, Prof. Dr. LUIZ CARLOS DA SILVA FILHO (Participação Virtual) do(a) Departamento de Química / Faculdade de Ciências - Unesp/Câmpus de Bauru, Prof. Dr. PAULO NORONHA LISBOA FILHO (Participação Virtual) do(a) Departamento de Fi ́sica / Faculdade de Ciências - Unesp/Câmpus de Bauru. Após a exposição pelo doutorando e arguição pelos membros da Comissão Examinadora que participaram do ato, de forma presencial e/ou virtual, o discente recebeu o conceito final:_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ . Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelo(a) Presidente(a) da Comissão Examinadora. Prof. Dr. EDUARDO RENE PEREZ GONZALEZ Faculdade de Ciências - Câmpus de Bauru - Eng. Luiz Edmundo Carrijo Coube, 14-01, 17033360, Bauru - São Paulo http://www.fc.unesp.br/#!/posmatCNPJ: 48.031.918/0028-44. APROVADO AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus, pela força, sabedoria e serenidade concedidas durante toda esta trajetória. Ao meu orientador, Eduardo R. P. González, pela orientação incansável, pelos conselhos valiosos e pela insistência durante todo o processo. Suas orientações foram fundamentais para o desenvolvimento e conclusão desta tese. Agradeço também ao coorientador, Alviclér Magalhães, por suas contribuições e suporte. Agradeço profundamente ao Prof. Dr. Javier Ellena e ao pós-doutorando Pedro Henrique de Oliveira Santiago por suas valiosas colaborações que contribuíram significativamente para o avanço deste trabalho. Aos meus amigos do laboratório, pelas conversas produtivas, brincadeiras descontraídas e pelo apoio moral. A convivência com vocês tornou esta jornada mais leve e inspiradora. Agradeço também à empresa Bruker® e a todos que colaboraram com a instalação do equipamento de Ressonância Magnética Nuclear e os ensinamentos tanto sobre o equipamento quanto ao seu uso, em especial ao David, Mábio e Guilherme. Aos professores e funcionários da UNESP, que sempre se mostraram solícitos e dispostos a ajudar em todas as necessidades administrativas e acadêmicas. Suas contribuições foram essenciais para o andamento deste trabalho. Agradeço especialmente à minha família, por todo amor, compreensão e suporte. Aos meus pais, Otavino e Rosilei, por acreditarem em mim e me apoiarem incondicionalmente. Ao meu irmão, Gabriel, pelo encorajamento e por estarem sempre ao meu lado. A minha esposa, Lorena, por sua paciência, compreensão e amor inabalável durante os momentos mais desafiadores desta jornada. Sua presença foi fundamental para que eu pudesse chegar até aqui. Aos meus amigos, pela compreensão nas ausências, pelo apoio emocional e pelas palavras de incentivo nos momentos de dúvida e cansaço. Agradeço ao Programa de Pós-Graduação de Ciência e Tecnologia de Materiais. Agradeço a Capes pelo suporte financeiro. Por fim, agradeço a todas as pessoas e instituições que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. A cada um de vocês, minha sincera gratidão. Quando você sair da tempestade, você não será a mesma pessoa que era quando entrou. Esse é o objetivo dessa tempestade. - Haruki Murakami RESUMO As leishmanioses são um complexo de doenças infecciosas tropicais negligenciadas, causadas por protozoários parasitas, que afetam milhares de pessoas anualmente, representando uma grande preocupação para a saúde global. Entre as manifestações, a leishmaniose visceral é a forma mais grave. Os tratamentos disponíveis para leishmaniose são baseados em medicamentos antigos, frequentemente associados a graves efeitos tóxicos. Além disso, o surgimento de cepas resistentes tornou urgente a busca por novos tratamentos que sejam seguros e eficazes. Compostos guanidínicos têm demonstrado resultados promissores no combate à leishmaniose, como é o caso dos compostos LQOF-G2, que possui um átomo de bromo na posição para da porção anilina, e LQOF-G6, que contém um grupo terc-butil na mesma posição. Ambos mostraram eficácia significativa em ensaios in vivo contra Leishmania amazonensis e in vitro contra Leishmania infantum. A presença do átomo de bromo no LQOF- G2 parece estar associada a uma atividade antileishmania expressiva, tanto in vitro quanto in vivo. Com o objetivo de entender melhor a influência dos átomos de bromo nos compostos guanidínicos, este estudo avaliou como a quantidade e a posição desses átomos afetam a dinâmica estrutural e conformacional dos compostos. Para isso, foi realizada reação de bromação nos compostos guanidínicos utilizando N-Bromosucinimida (NBS) ativado por luz infravermelha (IV) de 150 Watts em diclorometano como solvente, durante 12 horas de exposição. Os resultados confirmaram a eficiência do método, com até dois átomos de bromo sendo adicionados a uma única molécula. A caracterização dos compostos bromados foi realizada por ressonância magnética nuclear (RMN – 500 MHz) de 1H, 13C, e 15N e, quando possível, por difração de raios X de monocristais (SCDRX). Observou-se que a bromação foi seletiva para a porção de anilina em todas as guanidinas estudadas. Com o aumento do número de átomos de bromo, ocorreu uma inversão preferencial de conformação dos compostos, passando do isômero Z para o isômero E. A proporção de cada isômero foi determinada por RMN de 1H em solução a -10°C. O SCDRX corroborou a inversão preferencial para o isômero E em compostos polibromados no estado sólido. Os compostos polibromados foram avaliados preliminarmente quanto à sua atividade antileishmania e apresentaram baixa eficácia. Esses resultados sugerem que o aumento no número de átomos de bromo na fração anilina das guanidinas investigadas e as consequentes mudanças conformacionais, não contribuíram para a melhoria da atividade biológica. Palavras-chave: Guanidinas. Bromação. NBS. SCDRX. RMN. Estudo conformacional. ABSTRACT Leishmaniasis is a complex of neglected tropical infectious diseases caused by parasitic protozoa that affect thousands of people annually and represent a major concern for global health. Among the manifestations, visceral leishmaniasis is the most severe form. Available treatments for leishmaniasis are based on old drugs, often associated with severe toxic effects. In addition, the emergence of resistant strains has made it urgent to search for new treatments that are safe and effective. Guanidine compounds have shown promising results in combating leishmaniasis, such as the compounds LQOF-G2, which has a bromine atom in the para position of the aniline moiety, and LQOF-G6, which contains a tert-butyl group in the same position. Both showed significant efficacy in in vivo assays against Leishmania amazonensis and in vitro against Leishmania infantum. The presence of the bromine atom in LQOF-G2 appears to be associated with significant antileishmanial activity, both in vitro and in vivo. To better understand the influence of bromine atoms in guanidine compounds, this study evaluated how the quantity and position of these atoms affect the structural and conformational dynamics of the compounds. For this purpose, a bromination reaction was performed on the guanidine compounds using N-Bromosuccinimide (NBS) activated by infrared (IR) light of 150 Watts in dichloromethane as solvent, for 12 hours of exposure. The results confirmed the efficiency of the method, with up to two bromine atoms being added to a single molecule. The characterization of the brominated compounds was performed by nuclear magnetic resonance (NMR – 500 MHz) of 1H, 13C, and 15N and, when possible, by single crystal X-ray diffraction (SCDRX). It was observed that the bromination was selective for the aniline moiety in all guanidines studied. With the increase in the number of bromine atoms, a preferential inversion of the conformation of the compounds occurred, passing from the Z isomer to the E isomer. The proportion of each isomer was determined by 1H NMR in solution at -10°C. SCDRX corroborated the preferential inversion to the E isomer in polybrominated compounds in the solid state. The polybrominated compounds were preliminarily evaluated for their antileishmania activity and showed low efficacy. These results suggest that the increase in the number of bromine atoms in the aniline fraction of the investigated guanidines, along with the resulting conformational changes, did not contribute to the improvement of biological activity. Keywords: Guanidines; Bromination; NBS; SCXRD; NMR; Conformational Study. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Ciclo de transmissão da leishmaniose. ....................................................................... 18 Figura 2 – Representação esquemática geral do núcleo guanidínico. ............................................. 21 Figura 3 – Estruturas dos compostos guanidínicos LQOF-G2 e LQOF-G6, promissores no combate à leishmaniose. ......................................................................................................................... 22 Figura 4 – Estruturas tautoméricas de interconversão em equilíbrio químico do núcleo guanidínico.. 23 Figura 5 – Estabilização dos isômeros E e Z de compostos guanidínicos por meio da formação de um pseudociclo de seis membros. .................................................................................................. 24 Figura 6 – Estruturas dos isômeros (E) e (Z) do acetato de Guanabenz. ......................................... 25 Figura 7 – Estruturas dos isômeros (E) e (Z) dos compostos aminoalquil indenos 4 (R = H) e 5 (R = Me). ..................................................................................................................................... 25 Figura 8 – Estrutura do composto bromado 12 com atividade antileishmania e antimalárica. ........... 26 Figura 9 – Estruturas dos compostos bromados com maior atividade antiparasitária. ...................... 27 Figura 10 – Estrutura geral das guanidinas previamente sintetizadas no LQOF............................... 28 Figura 11 – Densidade de cargas parciais na estrutura do NBS. .................................................... 29 Figura 12 – Mecanismo de bromação por reação de adição com formação do íon bromônio. ........... 30 Figura 13 – Bromação através do mecanismo de radical livre. ..................................................... 31 Figura 14 – Mecanismo de bromação via substituição eletrofílica. ................................................ 32 Figura 15 – Esquema reacional da síntese das guanidinas com formação das tiouréias intermediárias. ............................................................................................................................................ 36 Figura 16 – Esquema reacional da bromação das guanidinas. ....................................................... 37 Figura 17 – Esquema reacional de proteção da benzilamina com Boc2O de ambos os métodos testados e seus rendimentos. ................................................................................................................. 45 Figura 18 – Mecanismo da reação de proteção do grupo amino com Boc....................................... 45 Figura 19 – Proposta de mecanismo de fragmentação para o composto benzilamina protegida com Boc e seu Espectro EI-MS (70 eV). ................................................................................................. 47 Figura 20 – Espectro de RMN do composto benzilamina protegido com Boc, a 25oC em CDCl3. A) 1H RMN; B) 13C RMN. ................................................................................................................ 48 Figura 21 – Espectro de HRESI-MS (70 eV) do composto Benzilamina protegido com Boc após reação de bromação com NBS ativado por luz infravermelha. ................................................................ 50 Figura 22 – Espectro de RMN do composto benzilamina protegido com Boc bromado, a 25oC em DMSO-d6. A) 1H RMN; B) 13C DEPT-135 RMN. ...................................................................... 50 Figura 23 – Esquema da reação de bromação dos compostos guanidínicos com NBS ativada por luz infravermelha. ........................................................................................................................ 52 Figura 24 – Mecanismo de formação da espécie in situ Br2 para bromação através da N- Bromosucinimida (NBS) ativada por irradiação infravermelha. .................................................... 53 Figura 25 – Esquema geral para as estruturas dos compostos guanidínicos estudados, com a conformação predominante em solução a -10°C indicada entre parênteses (E/Z). .............................................. 54 Figura 26 – Proposta de mecanismo de fragmentação dos principais íons presentes em todas as guanidinas estudadas, m/z 91, m/z 105 e m/z 122 e o espectro EI-MS (70 eV) do composto LQOF-G2 comum para os compostos LQOF-G35 e LQOF-G36. ................................................................. 56 Figura 27 – Espectro de EI-MS (70 eV) do composto LQOF-G36-Br. .......................................... 57 Figura 28 – Espectro de EI-MS (70 eV) do composto LQOF-G6. ................................................. 58 Figura 29 – Espectro de EI-MS (70 eV) do composto LQOF-G6-Br. ............................................ 58 Figura 30 – Espectro de EI-MS (70 eV) do composto LQOF-G35-Br. .......................................... 59 Figura 31 – Espectro de HRESI-MS do composto LQOF-G35-Br. ............................................... 60 Figura 32 – Representação estrutural dos isômeros E/Z para o composto guanidínico LQOF-G2. ..... 62 Figura 33 – Espectros de RMN de hidrogênio (1H) do composto LQOF-G2 variando a temperatura de 25oC à -10oC em CDCl3. ......................................................................................................... 63 Figura 34 – Espectro de RMN de hidrogênio (1H) do composto LQOF-G2 à -10oC em CDCl3. ........ 63 Figura 35 – Espectros de RMN de carbono (13C) do composto LQOF-G2 variando a temperatura de 25oC à -10oC em CDCl3. ......................................................................................................... 64 Figura 36 – Espectro de RMN de carbono (13C) do composto LQOF-G2 à -10oC em CDCl3. A) Espectro total; B) Zoom na região aromática entre 118,0 ~ 142,0 ppm. ...................................................... 65 Figura 37 - Espectro de RMN HMBC 1H-15N do composto LQOF-G2 à -10oC em CDCl3. .............. 66 Figura 38 – Espectro de RMN Seletive-HSQC 1H-13C do composto LQOF-G2 à -10oC CDCl3. A) Zoom na região alifática do núcleo de carbono; B) Zoom na região aromática do núcleo de carbono (setas vermelhas representam as correlações diretas C-H do isômero minoritário E). ............................... 66 Figura 39 – Espectro de RMN Seletive-HMBC 1H-13C do composto LQOF-G2 à -10oC em CDCl3. A) Zoom na região alifática do núcleo de carbono; B) Zoom na região aromática do núcleo de carbono. 68 Figura 40 – Espectros de RMN bidimensionais NOESY 1H-1H do composto LQOF-G2 à -10oC em CDCl3. .................................................................................................................................. 71 Figura 41 – Representação estrutural dos isômeros E e Z para o composto guanidínico LQOF-G35.. 72 Figura 42 – Espectro de RMN do composto LQOF-G35 à -10oC em CDCl3. A) 1H RMN; B) 13C RMN; C) 13C RMN zoom na região aromática. .................................................................................... 73 Figura 43 – Espectro de RMN HMBC 1H-15N do composto LQOF-G35 à -10oC em CDCl3. ............ 75 Figura 44 – Espectro de RMN do composto LQOF-G35 à -10oC em CDCl3. A) Seletive-HSQC 1H-13C; B) HMBC 1H-13C. .................................................................................................................. 75 Figura 45 – Espectro de RMN NOESY 1H-1H do composto LQOF-G35 à -10oC em CDCl3. ........... 76 Figura 46 – Estrutura química do composto guanidínico LQOF-G35, em sua conformação predominante, isômero Z, à -10oC, as setas representam as principais correlações espaciais NOE. .... 77 Figura 47 – Espectro de RMN de 1H do composto LQOF-G35-Br à -10oC em CDCl3. .................... 79 Figura 48 – Espectro de RMN do composto LQOF-G35-Br à -10oC em CDCl3. A) HSQC 1H-13C; B) HMBC 1H-13C. ....................................................................................................................... 80 Figura 49 – A) Espectro de RMN de NOESY 1H-1H para o composto LQOF-G35-Br à -10oC em CDCl3. B) Comparação entre as correlações espaciais mais intensas para os compostos LQOF-G35 e LQOF- G35-Br. ................................................................................................................................. 81 Figura 50 – Representação tipo ORTEP da unidade assimétrica do LQOF-G35, com elipsóides térmicos representados com 50% de probabilidade. Os átomos de hidrogênio ligados aos átomos de carbono foram omitidos para maior clareza. ........................................................................................... 86 Figura 51 – Representação tipo ORTEP da unidade assimétrica do LQOF-G35-Br. Os elipsóides térmicos são representados com 50% de probabilidade. ............................................................... 87 Figura 52 – Superfície de Hirshfeld do LQOF-G35 mapeada com dnorm. As moléculas nomeadas na análise SCDRX sem sufixo e com os sufixos a e b foram denominadas Molécula 1, 2 e 3, respectivamente. .................................................................................................................... 88 Figura 53 – Superfície de Hirshfeld do LQOF-G35-Br mapeada com dnorm. ................................ 89 Figura 54 – Rede unidimensional para LQOF-G35-Br obtida através das interações intermoleculares N H···O e Br···π, visualizadas na direção [010]. ............................................................................ 90 Figura 55 – Padrões DRX calculados e experimentais dos compostos guanidínicos LQOF-G35 (isômero Z) e LQOF-G35-Br (isômero E). .............................................................................................. 91 Figura 56 – Mecanismo proposto para alterações conformacionais de LQOF-G35 para LQOF-G35-Br na bromação com NBS. ........................................................................................................... 92 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Principais correlações espaciais e troca química observadas por NOESY 1H-1H do composto LQOF-G2 em diferentes temperaturas e diferentes tempos de mistura. .......................................... 69 Tabela 2 – Deslocamentos químicos (ppm) obtidos por RMN (500 MHz) de 1H e 13C dos compostos guanidínicos, a -10oC em CDCl3. .............................................................................................. 83 Tabela 3 – Proporção dos isômeros E/Z (%) dos compostos guanidínicos calculados por RMN 1H a 253K (-10oC). ........................................................................................................................ 84 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS DNDi: Iniciativa de Medicamentos para Doenças Negligenciadas ASMQ: combinação terapêutica de Artesunato e Mefloquina para malária OPAS: Organização Pan-Americana da Saúde OMS: Organização Mundial da Saúde LC: Leishmaniose Cutânea LM: Leishmaniose Mucocutânea LV: Leishmaniose Visceral FDA: Food and Drug Administration LQOF: Laboratório de Química Orgânica Fina RMN: Ressonância Magnética Nuclear IV: Infra-vermelho DRX: Difração de Raios X SCDRX: Difração de Raios X de monocristal NBS: N-Bromo Succinimida CHCl3: clorofórmio CH2Cl2: diclorometano CDCl3: clorofórmio deuterado DMSO: Dimetilsulfóxido ESI-MS: Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray HRESIMS: Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray de Alta Resolução TOF: analisador de tempo de voo. ESI: ionização por eletrospray. EI: Ionização Eletrônica DI: Introdução Direta eV: elétron Volt. m/z: relação massa/carga v/v: razão volume/volume m/m: razão massa/massa IC50: mínima concentração necessária para inibir 50% CC50: concentração que implica em 50% da viabilidade celular (citotoxicidade) RMN de 1H: Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN de 13C: Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono TMS: tetrametilsilano δ = deslocamento químico (em RMN) E/Z: isômeros de tipo Entgegen e Zusammen. IFAs: ingrediente farmacêutico ativo µs: microssegundos SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 16 1.1 Doenças Negligenciadas ......................................................................................... 16 1.1.1 Leishmaniose .................................................................................................... 17 1.2 Guanidinas ........................................................................................................... 20 1.2.1 Classificação das guanidinas .............................................................................. 21 1.3 Principais utilizações para compostos guanidínicos ................................................. 21 1.4 Isomerismo E/Z ..................................................................................................... 23 1.5 Compostos Bromados ............................................................................................ 26 1.6 Guanidinas alvo .................................................................................................... 27 1.7 Estudo da reação de bromação em compostos guanidínicos ..................................... 28 2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 34 2.1 Objetivo geral ....................................................................................................... 34 2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 34 3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 35 3.1 Materiais .............................................................................................................. 35 3.2 Síntese das guanidinas ........................................................................................... 35 3.3 Reação de Bromação com NBS ativada por irradiação IV. ...................................... 36 3.4 Cristalização ......................................................................................................... 37 3.5 Ponto de fusão ....................................................................................................... 37 3.6 Análise de Ressonância Magnética Nuclear. ........................................................... 38 3.7 Análise de Difração de Raios X. ............................................................................. 38 3.7.1 Difração de raios X de monocristal (SCDRX) ..................................................... 39 3.7.2 Análises de superfície de Hirshfeld ..................................................................... 39 3.8 Análise de Espectrometria de Massas ..................................................................... 40 3.8.1 Espectrometria de massa de ionização eletrônica ................................................ 40 3.8.2 HRESIMS ......................................................................................................... 40 3.9 Dados dos compostos ............................................................................................. 41 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 44 4.1 Estudo de bromação da benzilamina ...................................................................... 44 4.2 Reações de bromação dos compostos guanidínicos .................................................. 51 4.3 Estudo dos compostos guanidínicos por EI-MS. ...................................................... 54 4.3.1 Estudo EI-MS dos compostos guanidínicos monobromados ................................. 55 4.3.2 Estudo EI-MS dos compostos guanidínicos dibromados. ..................................... 57 4.3.3 Estudo EI-MS dos compostos guanidínicos tribromados. .................................... 59 4.4 Estudo dos compostos guanidínicos por RMN. ....................................................... 61 4.5 Estudo dos compostos guanidínicos por DRX. ........................................................ 85 5 CONCLUSÕES ............................................................................................................. 93 6 PERSPECTIVAS FUTURAS ......................................................................................... 94 7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 95 APÊNDICE A: Seção de espectros. ...................................................................................... 104 16 1 INTRODUÇÃO 1.1 Doenças Negligenciadas As doenças negligenciadas são aquelas causadas por agentes infecciosos ou parasitas que afetam predominantemente populações de baixa renda em regiões tropicais, como África, Ásia e América Latina. Exemplos dessas doenças incluem a malária, doença de Chagas, doença do sono (tripanossomíase humana africana), leishmaniose, filariose linfática, dengue e esquistossomose [1,2]. Essas enfermidades são responsáveis por uma alta carga de morbidade e mortalidade, incapacitando ou matando milhões de pessoas a cada ano, sendo que a doença de chagas, a doença do sono e a leishmaniose visceral são as três com as mais altas taxas de morte [3,4]. Apesar de sua gravidade, as doenças negligenciadas recebem pouca atenção e investimento em comparação com outras enfermidades, como AIDS, tuberculose e malária [5]. Esse desinteresse das indústrias farmacêuticas ocorre porque o mercado para essas doenças, predominantemente em países pobres, não oferece um retorno financeiro significativo. Como resultado, as indústrias privadas preferem focar em doenças globais para as quais medicamentos podem ser produzidos e comercializados com lucro [2,5]. Diante desse cenário, foi criada em 2003 a iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi), uma organização de pesquisa e desenvolvimento sem fins lucrativos. A DNDi trabalha para oferecer novos tratamentos para doenças negligenciadas e colabora com diversos parceiros, incluindo a Fiocruz, e possui um escritório regional na América Latina, localizado no Rio de Janeiro. Um dos marcos dessa colaboração foi a transferência de tecnologia do medicamento ASMQ (artesunato (AS) e mefloquina (MQ)), uma combinação terapêutica para malária, para a empresa farmacêutica Cipla, na Índia. Além disso, a DNDi e seus parceiros estão envolvidos em estudos clínicos para avaliar novos tratamentos para doenças negligenciadas, incluindo um medicamento para malária cerebral [5]. Em 2024, a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) convocam líderes e comunidades a "Participar, Agir e Eliminar" as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) para melhorar as condições de vida para as comunidades. No Brasil, o Ministério da Saúde, com apoio da OPAS, promove um seminário em janeiro com profissionais de saúde, pesquisadores e organizações que têm contribuído significativamente no enfrentamento dessas doenças. A OPAS apoia os países das Américas no fortalecimento da implementação, monitoramento e avaliação de programas para controlar e eliminar as doenças tropicais negligenciadas. Isso é feito por meio de cooperação técnica, desenvolvimento de diretrizes, capacitação, além da doação de medicamentos e ferramentas médicas, como testes 17 diagnósticos. A Organização também lidera uma iniciativa para eliminar cerca de 30 doenças infecciosas e condições relacionadas até 2030 [6,7]. 1.1.1 Leishmaniose A leishmaniose é uma doença grave que continua sendo um problema de saúde significativo em quatro regiões ecoepidemiológicas: Américas, África Oriental, Norte da África e, Oeste e Sudeste Asiático. Nas Américas, as leishmanioses são doenças zoonóticas transmitidas por vetores com um ciclo de transmissão complexo, envolvendo uma variedade de parasitas, reservatórios e vetores. Elas são causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania, transmitidos a animais e humanos pela picada de insetos da família Psychodidae, conhecidos como mosquitos-palha [8-10]. Existem três formas principais da doença: leishmaniose visceral, cutânea e mucocutânea. A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar, é a forma mais grave, caracterizada por febre irregular, perda de peso, hepatoesplenomegalia e anemia, podendo levar à morte em mais de 90% dos casos não tratados. A leishmaniose mucocutânea, se não tratada, pode causar a destruição das membranas mucosas do nariz e da boca, resultando em grave incapacidade. A leishmaniose cutânea é a forma mais comum, provocando lesões ulcerativas que deixam cicatrizes permanentes [10]. A transmissão ocorre quando flebotomíneos fêmeas infectadas picam humanos, principalmente à noite, injetando a forma infectante do parasita (promastigota) no hospedeiro. O ciclo de transmissão é demonstrado na Figura 1. No interior do corpo, os promastigotas são fagocitados por macrófagos, onde se transformam em amastigotas e se multiplicam, rompendo as células hospedeiras e disseminando a infecção. O ciclo se completa quando outro mosquito se alimenta de um hospedeiro infectado, ingere as amastigotas, que se diferenciam em promastigotas no inseto e, posteriormente, são transmitidos a um novo hospedeiro durante a próxima picada [10]. 18 Figura 1 – Ciclo de transmissão da leishmaniose. Fonte: Adaptado de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) [10]. Anualmente, estima-se que ocorram 1,3 milhões de novos casos de leishmaniose, resultando em 20 a 30 mil mortes, afetando principalmente populações pobres em áreas tropicais e subtropicais, onde a doença está associada à desnutrição, sistema imunológico enfraquecido e condições precárias de moradia e saneamento [8-10]. A leishmaniose cutânea (LC) é a forma mais comum da doença, caracterizada por úlceras nas áreas expostas do corpo, como rosto, braços e pernas. Essas úlceras podem ser numerosas e resultar em cicatrizes permanentes, causando incapacidades graves e estigmatização social. Estima-se que entre 0,7 e 1,2 milhão de novos casos de LC ocorram anualmente em todo o mundo, principalmente nas Américas, na bacia do Mediterrâneo, no Oriente Médio e na Ásia Central. Em 2021, um total de 51 países notificaram à Organização Mundial de Saúde cerca de 222.000 novos casos. Dez países, incluindo Brasil, Colômbia e Peru, respondem por 70-75% dos casos globais de LC [9,11,12]. Nas Américas, a epidemiologia da leishmaniose cutânea é complexa, com variações nos ciclos de transmissão, espécies de parasitas, hospedeiros e mosquitos vetores, além de diferenças nas manifestações clínicas e na resposta ao tratamento. Essa diversidade torna o controle da doença um grande desafio na região. 19 A leishmaniose mucocutânea (LM), outra forma da doença, é mais grave e pode levar à destruição parcial ou total das membranas mucosas do nariz, boca e garganta, causando deficiências severas. Aproximadamente 90% dos casos de leishmaniose mucocutânea ocorrem na Bolívia, Brasil e Peru [11,12]. A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como calazar, é uma doença parasitária grave que pode ser fatal em mais de 95% dos casos se não tratada. Ela é caracterizada por febre irregular, perda de peso, aumento do baço e do fígado, e anemia. A maioria dos casos ocorre no Brasil, África Oriental e Índia, com estimativas de 50.000 a 90.000 novos casos anuais, dos quais apenas 25-45% são notificados à Organização Mundial da Saúde (OMS) [11]. A LV é transmitida pela picada de fêmeas infectadas de flebotomíneos, como o mosquito-palha, no Brasil, a principal espécie responsável pela transmissão é a Lutzomyia longipalpis. Afeta principalmente crianças menores de cinco anos, adultos maiores de 50 anos, e pessoas com imunidade comprometida, como portadores de HIV. Os agentes etiológicos da LV são protozoários tripanosomatídeos do gênero Leishmania, parasita intracelular obrigatório sob forma aflagelada ou amastigota das células do sistema fagocítico mononuclear. Dentro do tubo digestivo do vetor, as formas amastigotas se diferenciam em promastigotas. Nas Américas, a Leishmania chagasi é a espécie comumente envolvida na transmissão da LV [13,14]. Nos últimos cinco anos, foram registrados, em média, 2.850 casos de LV, com uma taxa de letalidade de 8,2%. Embora 93% dos casos de LV ocorram no Brasil, a doença está se expandindo para áreas urbanas de médio e grande porte, o que deve acarretar um aumento do número de casos. Mesmo com o tratamento disponível gratuitamente pelo Sistema Único de Saúde (SUS), ele não elimina completamente o parasita em humanos e cães, e a eutanásia de cães infectados é recomendada como medida de controle [13,14]. A infecção de leishmania em humanos é causada por cerca de 21 das 30 espécies que infectam mamíferos. Estes incluem o complexo L. donovani com 3 espécies (L. donovani, L. infantum e L. chagasi); o complexo L. mexicana com 3 espécies principais (L. mexicana, L. amazonensis e L. venezuelensis); L. tropical; L. maior; L. aethiopica; e o subgênero Viannia com 4 espécies principais (L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) peruviana). As diferentes espécies são morfologicamente indistinguíveis, mas podem ser diferenciadas por análise isoenzimática, métodos moleculares ou anticorpos monoclonais. [10] O tratamento das leishmanioses é desafiador devido à diversidade de espécies e manifestações clínicas. Existem cerca de 25 compostos com atividade antileishmania, mas apenas alguns são aprovados para uso humano. Os antimoniais pentavalentes (antimoniato de N-metilglucamina e estibogliconato de sódio) foram o tratamento principal por quase 75 anos, mas a resistência e a toxicidade grave 20 desses medicamentos geraram a necessidade de alternativas. A anfotericina B é uma opção de segunda linha, administrada em três doses semanais de até 1 mg/kg/dia, e é usada quando a terapia com antimoniais falha ou não é indicada, especialmente em pacientes com problemas renais ou gestantes. A pentamidina é outro fármaco de segunda linha e também está associada a efeitos tóxicos, incluindo problemas renais, hepáticos e cardíacos, além de efeitos adversos como dor no local da aplicação, abscessos, náuseas e tontura [15,16]. Em 2014, a FDA (do inglês: Food and Drug Administration) aprovou a miltefosina, um fármaco oral, para tratamento de LC, LM e LV causadas por espécies específicas de Leishmania em pacientes com pelo menos 12 anos e 30 kg. Outros medicamentos, como desoxicolato de anfotericina B e isetionato de pentamidina, estão disponíveis nos EUA, mas não têm indicações aprovadas para leishmaniose. No Brasil, o antimoniato de meglumina (Glucantime) é o principal tratamento para leishmanioses, com a anfotericina B e a pentamidina como alternativas, todas essas drogas têm toxicidade considerável. O estibogliconato de sódio, embora utilizado globalmente, não está disponível no Brasil, apesar de ser padronizado pela OMS [15,16]. Recentemente, Ferreira et al. (2024) identificaram no Brasil uma cepa de Leishmania amazonensis resistente à anfotericina B. O caso envolveu um paciente com leishmaniose cutânea difusa, uma forma rara e difícil de tratar, agravada pela coinfecção com HIV. O paciente havia sido tratado com antimoniato de meglumina e anfotericina B, ambos comumente usados no Brasil, sem sucesso. Foram realizados ensaios in vitro e in vivo com a cepa isolada. Em testes com camundongos, a cepa resistente mostrou resistência à anfotericina B, enquanto reagiu de forma semelhante à cepa sensível quando tratada com miltefosina e paromomicina. Esses resultados destacam a necessidade urgente de novos fármacos para tratar leishmaniose cutânea difusa no Brasil, uma vez que a anfotericina B, uma das poucas opções disponíveis, falhou no tratamento desta cepa resistente [17]. 1.2 Guanidinas A classe de compostos conhecidos como guanidinas é caracterizada pela presença do núcleo guanidínico (Figura 2) em sua estrutura, que consiste em um carbono quaternário ligado covalentemente a outros três átomos de nitrogênio. Esses compostos podem ser encontrados na natureza [18] e possuem grande importância na ciência de materiais, com diversas aplicações. 21 Figura 2 – Representação esquemática geral do núcleo guanidínico. Esta classe de compostos é conhecida há mais de 150 anos, a primeira síntese descrita foi preparada em 1861 por A. Strecker, que oxidou guanina com ácido clorídrico e clorato de potássio [19]. 1.2.1 Classificação das guanidinas As estruturas guanidínicas podem ser classificadas em três tipos, de acordo com a substituição dos grupamentos R observados na Figura 2: monossubstituídas, dissubstituídas e trissubstituídas. No presente trabalho, optou-se por estudar as guanidinas tri substituídas. Além dos parâmetros de substituição, não há classificações mais específicas. Contudo, ao explorar o assunto, observa-se uma divisão baseada no tipo de substituinte empregado e no foco de aplicação. Os substituintes podem variar amplamente, incluindo grupamentos benzílicos [20,21], alifáticos [22], sulfônicos [23,24], fosfóricos [25,26,27], acilas [28,29], entre outros, além de estruturas químicas mais elaboradas e complexas. 1.3 Principais utilizações para compostos guanidínicos Os diferentes compostos guanidínicos despertam interesse tanto científico quanto comercial devido à sua alta diversidade de aplicações. Resultados positivos publicados relatam usos variados, como na captura de CO2 [30-32] e como potentes inibidores da arginase 1 em humanos [33]. Guanidinas do tipo bicíclica, monocíclica e acíclica são destacadas como poderosos organocatalisadores [34-37]. Guanidinas contendo tiazol e acetil-guanidinas são úteis no tratamento de doenças cognitivas, Alzheimer, neurodegeneração e demência [38]. Além disso, são empregadas como ativos farmacêuticos (IFAs) em medicamentos, incluindo dilatadores cardiovasculares [39], anti-histamínicos e antidiabéticos [40], agentes anti- inflamatórios [41,42], anticancerígenos [43-46], bactericidas [47-50], antifúngicos [51,52], antiprotozoários [53,54], antiparasitários [55] e antivirais [56,57]. 22 Com o objetivo de buscar novos potenciais fármacos contra doenças negligenciadas, mais especificamente, contra leishmaniose, em trabalhos anteriores realizados no nosso grupo de pesquisa, LQOF, foram sintetizadas guanidinas tri substituídas e testadas contra diferentes tipos de leishmaniose [20,58-60], apresentando resultados promissores. Dentre os compostos de guanidina já estudados pelo grupo de pesquisa LQOF destacam-se os compostos LQOF-G2 e LQOF-G6, cujas estruturas estão representadas na Figura 3. Figura 3 – Estruturas dos compostos guanidínicos LQOF-G2 e LQOF-G6, promissores no combate à leishmaniose. Espírito Santo et al. (2019) investigaram a atividade leishmanicida de uma série de compostos guanidínicos. Dentre os dez compostos analisados, todos contendo uma estrutura guanidínica com grupos benzoíla, benzila e fenil substituídos, o composto LQOF-G2, que possui um átomo de bromo na posição "para" da porção anilina, demonstrou resultados promissores em ensaios in vivo contra Leishmania amazonensis. Esse composto apresentou valores de IC50 de 19,6 µM em promastigotas e 5,6 µM em amastigotas, além de baixa citotoxicidade para células hospedeiras, evidenciada pelo seu alto índice de seletividade. Em comparação à anfotericina B, atualmente utilizada no tratamento da leishmaniose, o LQOF-G2 mostrou maior eficácia e seletividade [20]. Almeida et al. (2023) investigaram os efeitos citotóxicos de compostos guanidínicos em Leishmania infantum nas formas promastigota e amastigota in vitro, bem como sua citotoxicidade em células humanas. As guanidinas LQOFG-2 e LQOFG-6 demonstraram valores de IC50 de 12,7 µM e 24,4 µM, respectivamente, em promastigotas. Esses compostos também mostraram atividade citotóxica em amastigotas, com valores de 26,1 µM e 21,1 µM, 23 respectivamente. Importante destacar que não foi observada citotoxicidade aparente desses compostos em células de doadores saudáveis [58]. Moreira et al. (2022) investigaram a ação do composto LQOF-G6, que demonstrou inibição seletiva da cisteína protease LmCPB2.8ΔCTE (CPB) de Leishmania major. O composto inibiu a enzima em aproximadamente 73%, com um IC50 de 6,0 µM, e não apresentou sinais de citotoxicidade em concentrações de até 200 µM [59]. Dos Anjos et al. (2024) investigaram o impacto de sete compostos guanidínicos no parasita Leishmania (Viannia) braziliensis e na infecção in vitro de macrófagos por esse parasita, além de avaliar a citotoxicidade em modelos in vitro de células e tecidos hospedeiros de mamíferos. Os compostos LQOF-G2 e LQOF-G6 demonstraram resultados promissores, com valores de IC50 de 5,4 μM e 5,9 μM contra promastigotas, e 5,0 μM e 4,3 μM contra amastigotas, respectivamente. Notavelmente, não foi observada toxicidade em linhagens celulares humanas, como HEK-293, CaCo-2 e A549, em concentrações superiores a 500 μM. Esses dados fornecem evidências claras da eficácia desses compostos contra L. (V.) braziliensis, um dos agentes causadores da Leishmaniose Tegumentar e da Leishmaniose Mucocutânea na América [60]. Os dados até o presente momento sugerem que os compostos de guanidina são potenciais moléculas antileishmania, e mais estudos precisam ser realizados para entender completamente seu mecanismo de ação uma vez que esses compostos podem se tornar medicamentos. 1.4 Isomerismo E/Z Substâncias biologicamente importantes podem apresentar isomerização, e conhecer as formas isoméricas dessas substâncias é crucial na elaboração de novos fármacos. A partir da ligação π presente no núcleo guanidínico, somada à sua capacidade de estabilizar carga positiva (Figura 4), ocorrem estruturas isoméricas do tipo E/Z (entgegen, do alemão "oposto"; zusammen, do alemão "junto"). Figura 4 – Estruturas tautoméricas de interconversão em equilíbrio químico do núcleo guanidínico. 24 A compreensão estrutural e conformacional de compostos é essencial para o entendimento de inúmeras funções biológicas e do funcionamento de sistemas in vivo. Isso é particularmente importante devido à especificidade de interação fármaco-receptor. No caso das guanidinas, apesar da estabilização das estruturas tautoméricas pelo efeito de ressonância, a configuração dos isômeros E/Z é determinada pela dupla ligação entre o carbono central do núcleo guanidínico e o nitrogênio ligado à carbonila. Os isômeros E e Z são ambos estabilizados pela formação de uma ligação de hidrogênio entre o átomo de oxigênio e o hidrogênio de uma das aminas, resultando em um pseudociclo de seis membros, conforme ilustrado na Figura 5. Figura 5 – Estabilização dos isômeros E e Z de compostos guanidínicos por meio da formação de um pseudociclo de seis membros. N O N N Br H H LQOF-G2 isômero Z (93%) LQOF-G2 isômero E (7%) N O N N H Br H Xie et al. (2021) [61] relataram pela primeira vez um método confiável e sensível por LC-MS/MS para a determinação simultânea dos isômeros (E)- e (Z)-guanabenz (estruturas apresentadas na Figura 6). Este método foi completamente validado em plasma de camundongos, utilizando um procedimento simples e de baixo volume de precipitação de proteínas no plasma, apoiando o estudo farmacocinético nesses animais. O método bioanalítico desenvolvido foi aplicado com sucesso para explorar os perfis DMPK (Metabolismo de Medicamentos e Farmacocinética) de (E)-GA e (Z)-GA, tanto in vitro quanto in vivo. Este é também o primeiro relatório que documenta os comportamentos DMPK do (Z)-guanabenz, distinguindo-o do já bem estudado (E)-guanabenz. 25 Figura 6 – Estruturas dos isômeros (E) e (Z) do acetato de Guanabenz. Fonte: Retirado de Xie, J. et al. (2021) [61]. P. H. Reggio et al. (1998) [62] relataram a diferença na atividade dos isômeros E/Z em relação aos receptores canabinoides, que são parte do sistema endocanabinoide dos vertebrados, pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G e possuem sete domínios transmembranares. Existem dois subtipos principais de receptores: CB1, expresso principalmente no cérebro, pulmões, fígado e rins; e CB2, encontrado principalmente no sistema imunológico, células hematopoiéticas e algumas partes do cérebro. Nos compostos aminoalquil indenos estudados, os isômeros geométricos E dos compostos 4 (R = H) e 5 (R = Me) apresentam maior afinidade e valores médios de potência farmacológica mais elevados no receptor CB1 em comparação com seus correspondentes isômeros geométricos Z. Da mesma forma, os resultados mostram que os isômeros geométricos E também possuem maior afinidade no receptor CB2 do que seus isômeros Z correspondentes. As estruturas dos compostos estão ilustradas na Figura 7. Figura 7 – Estruturas dos isômeros (E) e (Z) dos compostos aminoalquil indenos 4 (R = H) e 5 (R = Me). 26 Fonte: Retirado de P. H. Reggio, et al. (1998) [62]. Diversos estudos relatam diferenças na atividade de isômeros geométricos do tipo E/Z, demonstrando que essa variação não se restringe apenas a compostos guanidínicos. Portanto, entender e identificar qual isômero E/Z é predominante em cada situação é fundamental para modelar com precisão a interação fármaco-receptor [63,64]. 1.5 Compostos Bromados Diversos estudos têm demonstrado o potencial de compostos bromados no combate à Leishmania, incluindo guanidínicos como o composto já citado LQOF-G2. Carballeira, N. M. et al. (2019) realizaram uma comparação entre análogos de ácidos 2-alil-3-halo-2- nonadecenoicos, contendo Bromo e Cloro. O composto bromado mostrou citotoxicidade seletiva contra amastigotas de Leishmania infantum (IC50 = 2,5 μM) em relação às promastigotas (IC50 > 25 μM), enquanto o análogo clorado apresentou menor eficácia (IC50 = 18,5 μM em amastigotas e IC50 > 250 μM em promastigotas) [65]. Galbiati, A. et al. (2021) investigaram 23 compostos potenciais para o tratamento da malária e leishmaniose, incluindo L. infantum e L. tropica. Dentre esses, o composto bromado 12 destacou-se por sua atividade micromolar contra Leishmania e potência nanomolar contra malária [66]. Figura 8 – Estrutura do composto bromado 12 com atividade antileishmania e antimalárica. Fonte: Adaptado de Galbiati, A. et al. (2021) [66]. 27 Scala et al. (2010) avaliaram a atividade in vitro de compostos bromados contra quatro protozoários parasitas: Trypanosoma brucei rhodesiense, T. cruzi, Leishmania donovani e Plasmodium falciparum (uma cepa de malária resistente à cloroquina). Os compostos longamida B (8) e dibromopalau’amina (11) mostraram-se promissores como agentes tripanocidas e antileishmania, enquanto dispacamida B (3) e espongiacidina B (6) apresentaram significativa atividade antimalárica, com baixa ou nenhuma toxicidade para células de mamíferos [67]. Figura 9 – Estruturas dos compostos bromados com maior atividade antiparasitária. Fonte: Adaptado de Scala et al. (2010) [67]. 1.6 Guanidinas alvo Considerando que o composto bromado LQOF-G2 e o composto não bromado LQOF- G6, dentre todos os compostos de guanidina estudados pelo grupo de pesquisa LQOF, se destacam, juntamente com outros compostos bromados promissores relatados na literatura, este trabalho foca no estudo de guanidinas trissubstituídas que já possuem átomos de bromo em suas estruturas, conforme mostrado na Figura 10. Além disso, foram realizadas reações de bromação para introduzir átomos de bromo adicionais nesses compostos. 28 Figura 10 – Estrutura geral das guanidinas previamente sintetizadas no LQOF. N O NH NH R R 2 R 1 LQOF-G2 R=R1=H R2=Br LQOF-G6 R=R1=H R2=t-Bu LQOF-G35 R1=R2=H R=Br LQOF-G36 R=R2=H R1=Br LQOF-G30 R1=H R=R2=Br Essas guanidinas foram previamente sintetizadas no Laboratório de Química Orgânica Fina e Ressonância Magnética Nuclear (LQOF-RMN) sob a coordenação do Professor Dr. Eduardo René Pérez González, localizado na UNESP (Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”) campus de Presidente Prudente. 1.7 Estudo da reação de bromação em compostos guanidínicos O processo de bromação se caracteriza pela reação química resultante na adição de um ou mais átomos de bromo em um composto orgânico, conferindo ao produto novas propriedades. Essa reação é amplamente utilizada em diversas indústrias químicas como um passo intermediário em inúmeras sínteses. A adição de um átomo de bromo ao composto inicial permite sua substituição futura por outros grupos funcionais ou até mesmo por um esqueleto de carbono [68]. Portanto, a reação de bromação é empregada em larga escala na produção de compostos químicos em geral [69-72]. As ligações entre os átomos de carbono-bromo (C-Br) são formadas a partir do ataque eletrofílico a ligações π (duplas ou triplas) quando esse processo é realizado por reações de adição eletrofílica. A molécula de bromo (Br2) é um eletrófilo moderadamente forte cuja reatividade pode ser aumentada com ácidos ou agentes oxidantes fortes. A oxidação pode ser uma reação colateral nas bromações eletrofílicas. O bromo pode ser introduzido por meio de mecanismos do tipo SN2 usando fontes de ânion brometo ou, mais comumente, via desoxibromação. A reação de bromação radical também é uma via comum para brometos de alila e benzila. Vários reagentes de bromação podem atuar como fontes eletrofílicas e radicais de "Br", dependendo das condições de reação e da presença ou ausência de iniciadores radicais [73]. 29 A molécula de bromo (Br2) dificilmente é utilizada como fonte de bromo devido às suas propriedades físicas e químicas indesejáveis: é um líquido denso (3,1 g/cm³), fumegante (alta pressão de vapor), com odor desagradável e sufocante, além de ser corrosivo para o tecido humano na forma líquida e seus vapores irritarem os olhos e a garganta. A inalação de vapores de bromo é altamente tóxica, causando tosse, queimação na garganta, respiração ofegante e até asfixia [69]. Em busca de métodos mais seguros e "verdes" para realizar reações de bromação, que evitem o excesso molar de bromo e utilizem uma fonte de bromo menos reativa, um processo reacional com menores problemas de segurança e geração controlada de resíduos perigosos, o NBS (N-bromo succinimida) se destaca. NBS é um sólido cristalino branco com ponto de fusão de 175-180 °C, fácil de manusear e frequentemente utilizado como agente de bromação e oxidação em várias reações de adição eletrofílica, adição radicalar e substituição eletrofílica [73-75]. No entanto, a utilização de NBS também cria subprodutos, como a succinimida e o ácido bromídrico, além de ter uma economia de átomos reduzida, já que apenas um átomo de bromo dos 12 átomos totais na molécula de NBS é utilizado na bromação. Devido à maior eletronegatividade do nitrogênio, o átomo de bromo do NBS fica parcialmente carregado positivamente e, portanto, eletrofílico, pronto para ser atacado por um nucleófilo (por exemplo, um alceno). A figura abaixo ilustra a densidade de carga na ligação N-Br. Figura 11 – Densidade de cargas parciais na estrutura do NBS. Este método proporciona um meio mais seguro e ambientalmente amigável para realizar reações de bromação, minimizando os riscos e resíduos associados ao uso de Br2. O mecanismo da reação de bromação pode ocorrer de diferentes maneiras: por adição, por um mecanismo de radical livre ou por substituição eletrofílica. A bromação por meio de uma reação de adição [55] ocorre em compostos insaturados através do intermediário íon bromônio. Esta reação é comumente utilizada para verificar a presença de insaturação em compostos. 30 Figura 12 – Mecanismo de bromação por reação de adição com formação do íon bromônio. CH3 CH3 CH3 CH3 Br Br + Br – íon bromônio CH3 CH3 Br + CH3 CH3 C C CH3 CH3 Br Br CH3333333333333333333333 CH3 Fonte: Mecanismo adaptado de Slebocka-Tilk, H. et al. 1985 [76]. A reação bromação realizada por meio do mecanismo de radical livre [77,78] pode ocorrer em compostos tanto saturados quanto insaturados e depende da formação do bromo radicalar, que pode ser realizada através de aquecimento ou radiação luminosa. Na etapa de iniciação, a ligação Br-Br da espécie bromo in situ sofre fissão homolítica, resultando na formação de dois radicais de bromo. Nessa etapa, a fonte de irradiação ou calor atua como agente ativador. Na etapa de propagação, um radical de bromo é protonado pelo composto reagente, formando ácido bromídrico e o composto reagente radicalar. Em seguida, o composto radicalar abstrai um átomo de bromo de uma molécula de bromo, produzindo o composto bromado. Esta etapa está associada à regeneração dos átomos de bromo e é repetida várias vezes até a reação chegar ao término. Na etapa de terminação, um átomo de bromo pode se combinar com outro átomo de bromo para produzir Br2, um átomo de bromo pode reagir com o composto radicalar para formar o composto bromado, ou ainda, dois compostos reagentes radicalares podem se ligar entre si para produzir um novo composto. 31 Figura 13 – Bromação através do mecanismo de radical livre. Br Br UV ou IR (hu) Br + BrIniciação Propagação - 01 H NH2 + Br C NH2 + BrH C NH2 Propagação - 02 + Br Br Br NH2 + Br Terminação - 01 Br + Br Br Br C NH2 Br+ Br NH2 Terminação - 02 Terminação - 03 NH2 NH2 C NH2 + C NH2 Fonte: Adaptado de McMillen, D. W. et al. 1994 [78]. Por fim, na reação de bromação por um mecanismo de substituição eletrofílica [79], o composto reagente atua como nucleófilo e a fonte de bromo como eletrófilo. Como já comentado, o bromo na molécula de NBS está parcialmente carregado positivamente devido à alta eletronegatividade do nitrogênio e, portanto, pode atuar como eletrófilo. O benzeno, por exemplo, no composto reagente, é rico em elétrons e pode atacar o bromo eletrofílico. Esta etapa produz um carbocátion intermediário. Por fim, o anel é desprotonado pela própria succinimida para restaurar sua aromatização. 32 Figura 14 – Mecanismo de bromação via substituição eletrofílica. N OO Br NH2 + CH + Br H NH2 complexo p-molecular N OO Br Br NH2 + + BrH Br NH2 N OO Br + 2 Br NH2 Br Br composto polibromado Fonte: Adaptado de R. S. Brown. 1997 [79]. Esta revisão detalha os mecanismos fundamentais da bromação, ressaltando as diferentes etapas e processos envolvidos, proporcionando uma compreensão abrangente das reações químicas associadas. Além disso, foi relatado que a bromação com NBS na presença de um catalisador ácido frequentemente ocorre via mecanismo de substituição eletrofílica em compostos aromáticos [80]. Para as reações de bromação dos compostos guanidínicos, optou-se pelo uso do NBS como fonte de bromo, devido às suas vantagens em relação ao uso direto da espécie in situ Br2. O uso do NBS é oportuno devido à sua ampla aplicação em bromações de compostos orgânicos insaturados na posição alílica ou benzílica (ou na posição α da cadeia lateral de outros compostos aromáticos) [81]. A literatura cita a utilização de NBS combinado com o cátion tritil (TrBF4) como organocatalisador seletivo, ativado por irradiação de luz fluorescente (55W FL) à temperatura ambiente [82]. Também é mencionada a bromação de hidrocarbonetos com CBr4 como fonte de bromo, induzida por irradiação com diodo emissor de luz (LED) sem a necessidade de aditivos, catalisadores, aquecimento ou condições inertes [83]. Outra reação de bromação benzílica relatada utiliza NBS e é ativada por LED em reatores de fluxo contínuo, conforme descrito por David Cantillo et al. [84], usando acetonitrila como solvente, a reação se completa em minutos sob condições suaves, sem a necessidade de iniciadores radicais. Como podemos observar, há uma ampla possibilidade de ativação da reação de bromação utilizando NBS. Além disso, existe uma grande variedade de procedimentos 33 publicados que empregam diferentes solventes, como CCl4, CHCl3, CH2Cl2, hexano, ciclohexano, DMF, CH3CN, CH3OH e THF [85-90]. Para a ativação da reação de bromação com NBS, optou-se pela utilização de uma lâmpada de infravermelho de 150 Watts. Apesar da necessidade de energia, essa lâmpada simula a radiação solar, sendo que já foi reportado que, com o auxílio de lentes convergentes, foi possível realizar a bromação de compostos com NBS à luz solar [91]. 34 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Elucidar questões estruturais e conformacionais de compostos guanidínicos através de estudos de ressonância magnética nuclear (RMN) e difração de raios X de monocristal (SCDRX). 2.2 Objetivos específicos • Realizar a bromação dos compostos guanidínicos. • Caracterizar os compostos guanidínicos utilizando RMN e SCDRX. • Medir a proporção (%) entre os isômeros E/Z para cada composto em solução, sem a necessidade de atingir temperaturas muito baixas. • Avaliar a influência dos grupos substituintes na dinâmica estrutural dos compostos. • Aumentar a quantidade de átomos de bromo nos compostos guanidínicos através de reações de bromação. 35 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais Os compostos guanidínicos alvos deste trabalho foram sintetizados no Laboratório de Química Orgânica Fina e Ressonância Magnética Nuclear (LQOF e RMN) sob a coordenação do professor Dr. Eduardo René Pérez González. Os reagentes e solventes utilizados nas sínteses foram obtidos da Sigma-Aldrich e utilizados sem nenhuma purificação prévia. Para as análises de RMN foi utilizado o equipamento de ressonância magnética nuclear RMN – AVANCE-III HD – BRUKER ® – 500 MHz, de campo magnético de 11,746 teslas. Como solvente deuterado para realização das análises foi utilizado clorofórmio CDCl3, 99,8% atom %D, contendo 0,03% de tetrametilsilano (TMS) adquirido da Sigma-Aldrich. 3.2 Síntese das guanidinas As guanidinas utilizadas neste estudo já haviam sido sintetizadas previamente no nosso grupo de pesquisa LQOF. Contudo para as guanidinas LQOF-G35 e LQOF-G6 foi necessária a realização de nova síntese. Para a síntese das guanidinas é realizada a síntese das tiouréias intermediárias. Em um balão de fundo redondo, isotiocianato de amônio (10 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (~ 20 mL) e então adicionou-se lentamente o cloreto de benzoíla (1.40 g, 10 mmol). Em poucos instantes observou-se a formação de um sólido branco (cloreto de amônio), e então deixou-se a mistura resultante sob agitação e refluxo por 1 hora a 75oC. Ao término do tempo, a solução foi filtrada utilizando um funil de Buchner e papel de filtro, removendo-se o cloreto de amônio formado. Em seguida, adicionou-se 10 mmol de uma das anilinas sobre a solução de isotiocianato de benzoíla em acetonitrila. Em poucos instantes, nota-se a formação de um precipitado (que corresponde à respectiva tiouréia). A mistura reacional ficou sob agitação e refluxo por duas horas, quando a agitação foi interrompida e deixou-se esfriar até atingir a temperatura ambiente. Então o balão foi colocado no congelador por 10 minutos e realizou-se a filtragem utilizando-se um funil de Buchner e papel de filtro. O sólido no papel de filtro foi lavado com pequenas porções de acetonitrila gelada, e então obteve-se o resíduo cru em bons rendimentos. A partir da tiouréia intermediaria segue-se com a síntese da respectiva guanidina. Para uma solução de 1 mmol de tiouréia dissolvido em 5 mL de DMF, foi adicionado 2 mmol de benzilamina, 4 mmol de trietilamina e 1 mmol de Bi(NO3)3.5H2O. A solução ficou preta após poucos minutos e a mistura foi aquecida e agitada por 24 horas a 120oC. Após o tempo de reação, esperou-se a solução atingir temperatura ambiente e a suspensão foi filtrada usando um 36 bloco de celite em um funil de Buchner de vidro com placa porosa. Esse bloco foi lavado com ~ 20 mL de diclorometano. O filtrado foi transferido para um funil de separação onde se realizou a remoção das impurezas através de extração com água (4 x 15 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro, e após filtragem foi evaporada. O resíduo cru obtido após a evaporação do solvente foi recristalizado em uma mistura éter etílico/éter de petróleo (4:1 v/v). Figura 15 – Esquema reacional da síntese das guanidinas com formação das tiouréias intermediárias. Cl O + NH 4 NCS Acetonitrila 75oC, 1h NCS O + NH 4 Cl NCS O + NH2 Y X LQOF-G35 LQOF-G6 X = Br X = H Y = H Y = t-bu 75oC 2h NH O NH S Y X tiouréia NH O NH S Y X + NH2 Bi(NO 3 ) 3 .5H 2 O Et 3 N, DMF 130oC, 24h N O NH NH X Y guanidina Fonte: Adaptado de Cunha S. et al. (2002) [92]. 3.3 Reação de Bromação com NBS ativada por irradiação IV. Para as reações de bromação dos compostos, foi utilizado o reagente N- bromossuccinimida (NBS) com ativação por infravermelho. A ativação da reação foi realizada utilizando uma lâmpada infravermelha de 150 Watts, posicionada a 10 cm do balão de reação, durante o tempo de reação. A razão molar guanidina utilizada foi de 1,0 mol de guanidina para 1,4 mol de NBS. Para cada guanidina foi utilizado aproximadamente 1mmol, ou seja, para LQOF-G2, LQOF-G35 e LQOF-G36 foi utilizado 400 mg, LQOF-G6, 380 mg e, LQOF-G30, 480 mg em cada reação bromação. Após 12 horas, a mistura reacional foi resfriada a 10°C e lavada com água. Em seguida, a camada orgânica (diclorometano) foi separada e seca sobre 37 sulfato de magnésio. A solução orgânica seca foi filtrada, o solvente evaporado, e o produto purificado a partir de uma mistura de éter de petróleo e éter dietílico (9:1 v/v). A suspensão resultante foi filtrada e o sólido seco sob pressão reduzida. O produto foi então solubilizado em etanol com auxílio de ultrassom e cristalizado em etanol [93]. Figura 16 – Esquema reacional da bromação das guanidinas. N O NH NH R R 3 R 2 R 1 Guanidinas de partida Guanidinas bromadas LQOF-G2 R=R1=H R2=Br LQOF-G2-Br R1=H R=R2=R3=Br LQOF-G6 R=R1=H R2=t-Bu LQOF-G6-Br R1=H R2=t-bu; R=R3=Br LQOF-G35 R1=R2=H R=Br LQOF-G35-Br R1=H R=R2=R3=Br LQOF-G36 R=R2=H R1=Br LQOF-G36-Br R=R2=H R1=R3=Br LQOF-G30 R1=H R=R2=Br + NH O O N O NH NH R R 2 R 1 + N O O Br Luz infravermelha 12h, temp. amb. Fonte: Autoria própria. 3.4 Cristalização Para a obtenção de monocristais dos compostos guanidínicos e posterior análise por SCDRX, cada composto, previamente purificado e seco (~30 mg), foi dissolvido em etanol (~5 mL) dentro de um béquer. A solubilização completa foi alcançada utilizando um banho de ultrassom com aquecimento a 50°C por aproximadamente 30 minutos. Após a dissolução, um vidro de relógio foi colocado sobre o béquer para minimizar a evaporação do etanol, e a solução foi armazenada em um congelador frost free (<4°C) por cerca de 15 dias. Os cristais formados foram então coletados, secos e preparados para as análises subsequentes. 3.5 Ponto de fusão Os pontos de fusão (pf) foram determinados usando um aparelho Quimis Q-340 M com microprocessador WRS-2. As amostras foram colocadas em tubos capilares fechados em uma das extremidades. As temperaturas de pré-aquecimento e final da rampa foram selecionadas como 60 ºC e 300 ºC, respectivamente. A taxa de aquecimento utilizada foi de 2,0 ºC/min. 38 3.6 Análise de Ressonância Magnética Nuclear. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma ferramenta essencial na ciência para a identificação, elucidação e quantificação de compostos em fases líquida e sólida. Permite determinar a estrutura química dos compostos e também fornece informações sobre a conectividade dos átomos, as configurações espaciais e até mesmo as dinâmicas moleculares em solução [20,93-96]. O equipamento de RMN utilizado foi o Bruker Avance III-HD – 500 MHz, com campo magnético de 11,746 teslas. A sonda utilizada nas análises foi a Smart Probe BBFO-Z plus broadband, com diâmetro de 5 mm para amostras líquidas, capaz de analisar núcleos de 1H, 13C, 15N, 19F e 31P. O equipamento possui gradiente de campo magnético e opera na faixa de temperatura de -40 a 80°C. Este equipamento de RMN está localizado no Laboratório de Química Orgânica Fina e RMN, na UNESP, campus de Presidente Prudente, sob a responsabilidade do professor Dr. Eduardo R. P. González. Todas as análises foram realizadas pelo próprio aluno. Os espectros de RMN de 1H, 13C e 15N foram obtidos a 500,16 MHz, 125,765 MHz e 50,681 MHz, respectivamente. Os deslocamentos químicos para os espectros de 1H e 13C foram referenciados utilizando tetrametilsilano (TMS). As análises foram realizadas em solução de CDCl3, com variação de temperatura para cada experimento. Todos os sinais (deslocamentos químicos) foram reportados em ppm. Os dados foram apresentados da seguinte forma: deslocamento químico (δ), multiplicidade (s = singlete, d = dublete, dd = dubleto de dubletes, t = triplete, qua = quadruplete, qu = quintete, m = multiplete, br s = singlete largo), integração e constante de acoplamento (em Hertz). Para a determinação das proporções entre os isômeros E/Z em solução para cada composto guanidínico, inicialmente foi preciso determinar com precisão o deslocamento dos sinais dos hidrogênios do centro guanidínico para cada isômero (NH1 e NH2 para o isômero Z; NH1' e NH2' para o isômero E). Esses sinais foram confirmados por meio de correlações heteronucleares 1H-13C. A proporção de cada isômero em solução foi então obtida a partir das integrais absolutas de cada sinal, ou seja, somaram-se as integrais dos hidrogênios do centro guanidínico de ambos os isômeros, e, posteriormente, calculou-se a porcentagem de cada isômero individualmente. 3.7 Análise de Difração de Raios X. As análises de Difração de Raios X foram realizadas em parceria com o Professor Javier Alcides Ellena, do Instituto de Física de São Carlos (IFSC) da Universidade de São Paulo 39 (USP). O aluno de pós-doutorado Pedro Henrique de Oliveira Santiago foi o responsável pelas análises de DRX, bem como pelo tratamento dos resultados. 3.7.1 Difração de raios X de monocristal (SCDRX) A difração de raios X (DRX) é uma técnica poderosa e amplamente utilizada para a caracterização estrutural de materiais cristalinos. Baseia-se no princípio de que, quando raios X incidem sobre um material cristalino, eles são difratados pelos átomos dispostos em padrões regulares, gerando um padrão característico de reflexões que pode ser analisado para determinar a estrutura atômica tridimensional do material [93]. As análises de DRX de monocristais foram realizadas a 100 K utilizando um difratômetro Rigaku XtaLAB Synergy-S Dualflex equipado com detector HyPix 6000HE e radiação Cu Kα (1,54184 Å). A coleta de dados, refinamento celular, redução de dados e correção de absorção foram realizadas utilizando o software CrysAlisPro [81]. O método de faseamento intrínseco do programa SHELXT-2018/2 [82] foi utilizado para resolver as estruturas, enquanto o refinamento dos átomos não-hidrogênio foi realizado com minimização não linear de mínimos quadrados em F2, utilizando o programa SHELXL-2019/2 [83], considerando parâmetros de deslocamento anisotrópico. Os átomos de hidrogênio foram posicionados em locais idealizados utilizando o modelo de equitação, e suas posições, especialmente as dos hidrogênios ligados aos átomos de nitrogênio do grupo guanidina, foram confirmadas por meio de análises dos mapas de densidade eletrônica. O software Olex2 [84] foi utilizado tanto para a solução e refinamento das estruturas quanto para a geração das ilustrações gráficas. Os dados cristalográficos dos compostos estudados encontram-se em arquivos CIF para os compostos LQOF-G35 e LQOF-G35-Br que foram depositados no Cambridge Structural Data Base, CCDC 2320314 e 23200315, respectivamente. Esses dados podem ser obtidos gratuitamente via http://www.ccdc.cam.ac.uk/conts/retrieving.html. 3.7.2 Análises de superfície de Hirshfeld As superfícies de Hirshfeld das guanidinas e seus gráficos de impressões digitais 2D foram gerados a partir dos Arquivos de Informações Cristalográficas (CIFs), utilizando o pacote de programas CrystalExplorer 17.5 [97]. As superfícies foram mapeadas usando o parâmetro dnorm, nas escalas de -0,56 (vermelho) a 1,61 (azul) para LQOF-G35, e de -0,21 (vermelho) a 1,30 (azul) para LQOF-G35-Br. Os gráficos de impressões digitais 2D foram obtidos combinando as distâncias di e de, usando uma escala de 0,4 a 3,0 Å. 40 3.8 Análise de Espectrometria de Massas 3.8.1 Espectrometria de massa de ionização eletrônica A espectrometria de massas é uma técnica analítica poderosa utilizada para identificar compostos químicos com base na massa molecular e na estrutura de suas moléculas. Ela opera pelo princípio de ionizar a amostra, separar e detectar íons com base em suas massas e razões massa/carga, permitindo a identificação precisa de compostos, mesmo em misturas, e proporcionando informações detalhadas sobre sua composição molecular e estrutural. Os espectros de massa das guanidinas foram adquiridos por introdução direta (DI) utilizando a espectrometria de massas com um equipamento Shimadzu QP-2010 Plus equipado com ionização eletrônica (EI). Os parâmetros da análise foram configurados da seguinte forma: temperatura da interface a 240 °C; câmara de ionização a 300 °C; tempo de corte do solvente de 0,5 minutos; tempo inicial de 0,7 minutos; tempo final de 25 minutos. O programa de temperatura DI foi iniciado a 50 °C, com um aquecimento de 20 °C/min até 350 °C, seguido por um tempo de espera de 10 minutos. A análise foi realizada utilizando acetonitrila e diclorometano como solventes, e a energia de ionização aplicada foi de 70 eV. 3.8.2 HRESIMS As análises de espectrometria de massas com ionização por eletrospray de alta resolução (HRESIMS) foram conduzidas em colaboração com o Professor Dr. Eduardo Cilli Maffud do Instituto de Química da UNESP de Araraquara. A análise UPLC-ESI-QTOF-MS/MS foi realizada utilizando um sistema UHPLC Waters, composto por uma bomba quaternária QSM Acquity® HClass, um amostrador automático Acquity® Sample Manager – FTM e um detector de arranjo de diodos Acquity® PDAeλ, acoplado ao espectrômetro de massas Waters Xevo® G2-XS. Este espectrômetro é equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI), um analisador quadrupolo, uma célula de colisão e um analisador de tempo de voo (TOF). A separação cromatográfica foi realizada em modo gradiente, utilizando uma solução de ácido fórmico a 0,1% (v/v) como fase móvel, com água ultrapura (componente A) e acetonitrila acidificada com ácido fórmico a 0,1% (v/v) como componente B. As corridas cromatográficas foram conduzidas com uma vazão de 0,5 mL/min, começando com 5% do componente B. A força de eluição foi programada para aumentar o %B para 100% ao longo de 5 minutos. A separação foi realizada em uma coluna de fase reversa Waters Acquity® UPLC HSS T3 (C18), com partículas de 1,8 μm, 2,1 mm de diâmetro interno e 100 mm de comprimento. 41 O volume de injeção foi de 0,2 μL. Os espectros foram adquiridos no modo positivo, na faixa de m/z 100 a 1500. As tensões capilares de eletropulverização e cone de transferência foram ajustadas para +2,5 kV e 20 V, respectivamente. As temperaturas da fonte ESI e do gás de dessolvatação foram configuradas para 120,0 °C e 350,0 °C, respectivamente. A aquisição dos espectros MS/MS foi realizada no modo Fast DDA (Data Dependent Acquisition), com fragmentação de íons somente para aqueles com intensidade acima de 100. A fragmentação foi conduzida aplicando uma rampa de tensão, variando de 10 a 40 eV para m/z 100 e de 40 a 70 eV para m/z 1500. 3.9 Dados dos compostos terc-butil benzil carbamato (Benzilamina+Boc). Rendimento do produto isolado 95%. MM: 207.27 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 54.6-55.3 °C. 1H RMN 298K (500.16 MHz, CDCl3) δ = 7.32 – 7.22 (m, 5H), 4.99 (s, 1H), 4.28 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 155.9 (C=O), 139.0 (C), 128.6 (CH), 127.4 (CH), 79.4 (C), 44.6 (CH), 28.4 (CH). EI-MS (m/z 192). terc-butil [(2-bromofenil)metil]carbamato (Benzilamina+Boc+Br). Rendimento 60%. MM: 285.03 g.mol-1. Sólido translúcido. Ponto de fusão: 162,5 e 164,3 ºC. 1H RMN 298K (600.13 MHz, DMSO-d6) δ = 11.03 (s, 2H), 5.71 (s, 1H), 4.20 (s, 2H), 2.55 (s, 9H). 13C DEPT 135 RMN (39.51 MHz, DMSO-d6) δ = 179.7 (C), 29.7 (C). (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(4-bromofenil)guanidina LQOF-G2). Rendimento do produto isolado 69%. MM: 407.06 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 101.5-101.8 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.21 (s, 1H), 8.28 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.50 (q, 2H), 7.44 (t, 3H), 7.40 – 7.34 (m, 4H), 7.33 (m, 1H), 7.16 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5.23 (t, 1H), 4.82 (d, J = 4,2 Hz, 2H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 177.8 (C=O), 158.2 (C=N), 138.2 (C), 137.9 (C), 134.6 (C), 133.2 (CH), 131.4 (CH), 129.0 (CH), 128.8 (CH), 128.7 (CH), 127.9 (CH), 127.6 (CH), 127.3 (CH), 127.2 (CH), 120.1 (C-Br), 45.1 (N-CH2). δ E isômero = 11.25 (s, 1H). EI-MS (m/z 406). (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(2-bromofenil)guanidina (LQOF-G35). Rendimento do produto isolado 83%. MM: 407.06 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 103-104 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.33 (s, 1H), 8.30 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7.69 42 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7.50 (q, 2H), 7.43 (t, 3H), 7.41 – 7.34 (m, 4H), 7.31 (m, 1H), 7.16 (t, 1H), 5.19 (t, 1H), 4.84 (d, J = 5,4 Hz, 2H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 177.7 (C=O), 158.1 (C=N), 138.2 (C), 137.8 (C), 134.6 (C), 134.0 (CH), 131.4 (CH), 129.1 (CH), 128.8 (CH), 128.7 (CH), 127.9 (CH), 127.6 (CH), 127.5 (CH), 127.4 (CH), 121.2 (C-Br), 45.0 (N-CH2). δ E isômero = 11.28 (s, 1H). EI-MS (m/z 406). ESI(+)-MS m/z encontrado 408.0705, m/z calculado [C21H18BrN3O + H]+: 408.0706; ESI(+)-MS/MS: M+H – C6H5CONH2]+ m/z 287.0175, [M+H–C15H12N2O]+ m/z 171.9757, [M+H–C13H12BrN2]+ m/z 122.0603. (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(2,4-dibromofenil)guanidina (LQOF-G30). Rendimento do produto isolado 71%. MM: 487.19 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 130.6 – 131.4 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.34 (s, 1H), 8.31 (d, 2H), 7.84 (s, 2H), 7.71 – 7.24 (m, 19H), 5.10 (t, 1H), 4.83 (d, 2H), 4.67 (t, 2H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 177.9 (C=O), 157.9 (C=N), 138.0 (C), 137.8 (C), 136.4 (C), 134.0 (CH), 131.7 (CH), 129.1 (CH), 128.8 (CH), 128.3 (CH), 127.9 (CH), 127.7 (CH), 127.1 (CH), 122.1 (CH), 121.0 (C-Br), 45.2 (N-CH2). δ E isômero = 11.37 (s, 1H). LC-UV/MS: 99.82%; ESI(+)-MS: m/z encontrado 485.9812, m/z calculado [C21H16Br2N3O+H]+: 487.9790; ESI(+)-MS/MS [M+H– C6H5C(O)NH2]+ m/z 366.9258. (E)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(2,4,6-tri-bromofenil)guanidina (LQOF-G35-Br). Rendimento do produto isolado 60%. MM: 566.09 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 148- 149 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ E isômero 9.64 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.29 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 7.78 – 7.64 (m, 4H), 7.61 – 7.53 (m, 4H), 7.53 – 7.22 (m, 20H) 7.16 (t, 1H), 5.31 (t, 1H), 4.83 (d, J = 3,8 Hz, 2H); δ Z isômero 12.26 (s, 1H), 5.31 (s, 1H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 166.8 (C=O), 144.4 (C=N), 143.3 (C-Br), 138.0 (C), 134.5 (CH), 133.2 (CH), 132.6 (C), 129.1 (CH), 128.6 (CH), 127.9 (CH), 127.6 (CH), 127.0 (CH), 119.3 (C), 115.4 (2C- Br), 45.0 (N-CH2). δ Z isomer = 12.26 (s, 1H), 5.31 (s, 1H). EI-MS (m/z 565): 77, 91, 105, 122, 285, 406, 486. HRESI-MS m/z encontrado 565.8898 [M+H]+ (calculado C21H16Br3N3O1, 566.091, Δ= -0.2012 ppm). Fragmento iônico observado ESI(+)-MS/MS: [M+H– C14H11BrN2O]+ m/z 486.5555. (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(4-t-butilfenil)guanidina (LQOF-G6). Rendimento do produto isolado 70%. MM: 385.51 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 122-125 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12,09 (s, 1H), 8,29 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,50 – 7,46 (m, 1H), 7,44 – 7,41 (m, 4H), 7,38 (m, 4H), 7,31 (s, 1H), 7,20 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,35 (s, 1H), 4.79 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 1.31 (s, 9H); 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 177.4 (C=O), 158.7 43 (C=N), 150.1 (C), 138.6 (C), 138.2 (C), 132.5 (C), 131.2 (CH), 128.9 (CH), 128.6 (CH), 127.8 (CH), 127.5 (CH), 127.4 (CH), 127.0 (CH), 125.4 (CH), 44.8 (N-CH2), 34.5 (C), 31.1 (CH3). EI-MS (m/z 384). (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(2,6-dibromofenil 4-t-butilfenil)guanidina (LQOF-G6-Br). Rendimento do produto isolado 60%. MM: 543.30 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 195.3-195.9 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.29 (s, 1H), 8.43 (d, 2H), 7.61 – 7.25 (m, 10H), 5.05 (s, 1H), 4.80 (d, 2H). 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 178.0 (C=O), 158.4 (C=N), 154.6 (C), 138.3 (C), 138.2 (C), 138.0 (C), 132.9 (CH), 131.3 (CH), 130.3 (CH), 129.6 (CH), 128.6 (CH), 127.8 (CH), 127.6 (CH), 127.2 (CH), 124.2 (C), 118.6 (C), 45.1 (N-CH2), 30.9 (CH3), 29.7 (C). δ E isômero = 8.43 (s, 1H). EI-MS (m/z 543). (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(4-bromofenil)guanidina (LQOF-G36). Rendimento do produto isolado 72%. MM: 407.06 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 86.2-86.6 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.30 (s, 1H), 8.25 (s, J = 7,3 Hz, 2H), 7.48 (m, 3H), 7.42 (m, 1H), 7.41 (m,1H), 7.39 (m, 1H), 7.37 (m, 4H), 7.31 (m, 1H), 7.19 (s, 1H), 4.78 (d, J = 5,3 Hz, 2H); 13C NMR (125.765 MHz, CDCl3) δ ppm = 178.02 (C=O), 158.34 (N=C), 138.22 (C), 131.42 (C), 131.19 (C), 129.21 (2CH), 128.91 (3CH), 127.94 (2CH), 127.78 (1CH), 127.58 (3CH), 45.34 (CH2). δ E isômero = 11.25 (s, 1H). EI-MS (m/z 406); LC- UV/MS: 99.65%; ESI(+)-MS m/z encontrado 408.0705, m/z calculado [C21H18BrN3O+H]+: 408.0706; ESI(+)-MS/MS: M+H–C6H5CONH2]+ m/z 287.0169, [M+H–C15H12N2O]+ m/z 171.9755, [M+H–C13H12BrN2]+ m/z 122.0602. (Z)-N-benzoil-N’-benzil-N”-(3,6-dibromofenil)guanidina (LQOF-G36-Br). Rendimento do produto isolado 63%. MM: 487.19 g.mol-1. Sólido branco. Ponto de fusão: 124.6 – 128.6 °C. 1H RMN 263K (500.16 MHz, CDCl3) δ Z isômero = 12.42 (s, 1H), 9.33 (s, 2H), 8.28 (d, 2H), 7.61 – 7.28 (m, 17H), 5.36 (s, 1H), 4.83 (s, 2H), 13C RMN (125.765 MHz, CDCl3) δ = 178.3 (C=O), 138.3 (C=N), 157.9 (C), 157.7 (C), 154.4 (C), 138.0 (C), 137.4 (C), 135.6 (C), 133.2 (CH), 132.7 (CH), 131.6 (CH), 129.1 (CH), 128.8 (CH), 127.9 (CH), 127.6 (CH), 127.4 (CH), 126.4 (CH), 125.6 (CH), 45.2 (N-CH2). δ E isômero = 11.40 (s, 1H), 4.58 (s, 2H). EI-MS (m/z 487). 44 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Em trabalhos anteriores no grupo LQOF, R. D. E. Santo et al. (2013) [98] estudaram o isomerismo E/Z de compostos guanidínicos tri substituídos utilizando técnicas de RMN (HSQC, HMBC e NOESY) a temperaturas de -60°C, e encontraram que para a molécula LQOF- G2, o isômero Z é predominante. Concluíram que compostos com p-substituintes na porção anilina, como p-Cl e p-Br, existem principalmente como isômeros Z, com uma pequena proporção do isômero E. Diante desses resultados iniciais, decidimos expandir a investigação sobre derivados guanidínicos, focando na influência do bromo nesses compostos. Assim, sintetizamos os compostos LQOF-G2, LQOF-G6, LQOF-G30, LQOF-G35 e LQOF-G36, anteriormente preparados pelo grupo de pesquisa LQOF. Realizamos a bromação desses compostos utilizando NBS ativado por luz infravermelha de 150 Watts (Seção 3.3) para examinar a influência da quantidade e posição dos átomos de bromo no isomerismo E/Z de cada composto. 4.1 Estudo de bromação da benzilamina Antes de iniciar os estudos de caracterização dos compostos guanidínicos, tanto antes quanto após a reação de bromação com NBS, decidimos por estudar o composto de partida utilizado na síntese das guanidinas trissubstituídas propostas neste trabalho: a benzilamina. O objetivo de estudar a benzilamina por meio da reação de bromação é avaliar a possibilidade de bromação no carbono benzílico. Devido ao tamanho reduzido da molécula, a visualização da formação de um produto bromado quiral seria mais facilitada, caso ocorresse. Para realizar o estudo de bromação na benzilamina, protegemos o grupo amina utilizando Boc2O, uma estratégia amplamente utilizada na química orgânica para evitar reações indesejadas no grupo funcional durante etapas subsequentes de síntese. A proteção de aminas com Boc2O é um procedimento bem estabelecido e confiável, sendo uma etapa crítica para assegurar o teste de seletividade da reação de bromação. Decidimos testar dois métodos eficientes para a proteção da amina com Boc2O, ambos já descritos na literatura. Esses métodos foram escolhidos com base em sua eficiência e em suas condições experimentais, que são compatíveis com os compostos guanidínicos. No primeiro método escolhido, descrito por V. Perron et al. (2009) [99], a proteção da benzilamina é realizada utilizando o agente protetor di-tert-butyl pyrocarbonate (Boc2O). A reação ocorre em uma mistura de solventes Dioxano/Acetato de Acila (1:1), sob condições de temperatura ambiente e agitação contínua por 15 horas. Após o término da reação, o produto protegido é obtido através da evaporação do solvente para concentrar a solução. Em seguida, o 45 produto é purificado por extração com diclorometano, um processo que ajuda a remover impurezas e a isolar o composto protegido. No segundo método escolhido, descrito por S. V. Chankeshwara e A. K. Chakraborti (2006) [100], a proteção da benzilamina também é realizada com o di-tert-butyl pyrocarbonate (Boc2O), mas utiliza-se água (H2O) como solvente. A reação ocorre em temperatura ambiente e sob agitação por apenas 10 minutos. Ao final da reação, o produto protegido, que é insolúvel em água, precipita-se em sua forma pura. Este método simplifica o processo de purificação, pois o produto pode ser diretamente filtrado e seco, eliminando a necessidade de etapas adicionais de purificação com solventes orgânicos. Figura 17 – Esquema reacional de proteção da benzilamina com Boc2O de ambos os métodos testados e seus rendimentos. NH2 O O O O O + NH O O + CO2 CH3 CH3 CH3OH + Método 01: reação 5 mL Dioxano/Ac Etila (1:1 v/v) agitação, 15 horas, tem. amb. Purificação: Diclorometano Método 02: reação 5 mL H 2 O agitação, 10 minutos, tem. amb. Precipitado puro Benzilamina 5 mmol (546,0uL) Boc 2 O 5,5 mmol (1,27mL) Rendimento Método 01: 60% Método 02: 95% Fonte: Adaptado de V. Perron et al. (2009) [99] e S. V. Chankeshwara e A. K. Chakraborti. (2006) [100]. Na Figura 18, podemos observar o mecanismo da reação de proteção utilizando Boc2O na formação do composto benzilamina protegido. Figura 18 – Mecanismo da reação de proteção do grupo amino com Boc. Fonte: Adaptado de S. V. Chankeshwara e A. K. Chakraborti. (2006) [100]. 46 A benzilamina protegida com Boc utilizando o método 01 apresentou um rendimento inferior (60%) em comparação ao método 02, que alcançou um rendimento de 95%. No entanto, após a purificação, ambos os produtos mostraram características semelhantes, incluindo pontos de fusão próximos: 54,6 – 55,3 ºC para o método 01 e 54,0 – 56,8 ºC para o método 02. Com as análises realizadas por EI-MS (Espectrometria de Massas por Ionização Eletrônica) e RMN (Ressonância Magnética Nuclear), foi possível verificar que, para ambos os métodos de proteção do grupo amina com Boc, o produto desejado foi efetivamente formado e purificado. No entanto, o método utilizando água (H2O) como solvente [100] demonstrou ser mais eficiente, uma vez que exigiu menos tempo de reação e não necessita o uso de solvente orgânico, além de resultar em um produto já cristalino sem a necessidade de métodos de recristalização. Na análise por EI-MS, a identificação da benzilamina protegida foi confirmada a partir do fragmentograma da Figura 19, que também ilustra os mecanismos propostos para a formação dos fragmentos por clivagem. A fragmentação da molécula revelou um pico de íon base em m/z 57, correspondente ao cátion 2-metilpropano, originado pela quebra da ligação C-O, além de um fragmento em m/z 150, resultante da perda do grupo terc-butil. Ambos os íons competem com probabilidades semelhantes. A soma das massas desses fragmentos principais corresponde à massa molecular da benzilamina protegida com Boc, m/z 207. O fragmento em m/z 192 resulta da perda de um grupo metil. Devido à alta energia envolvida na técnica de ionização eletrônica, a clivagem de grupos metil (–CH3) é um processo comum, pois as ligações C–C adjacentes a grupos metil são relativamente fracas. Isso torna a perda de metil uma fragmentação frequente em compostos que possuem uma abundância desses grupos. Adicionalmente, o íon em m/z 91 corresponde ao íon tropílio, enquanto o fragmento em m/z 106 resulta da clivagem entre o grupo amina e o carbono carbonílico. 47 Figura 19 – Proposta de mecanismo de fragmentação para o composto benzilamina protegida com Boc e seu Espectro EI-MS (70 eV). NH C + CH3 CH3 CH3 NH O O m/z 57 NH O O CH3 CH3 CH3 CH2 + m/z 91 m/z 106 - C O O CH3 CH3 CH3 m/z 150 - CH + m/z 91 + - - NH O O C CH3 CH3 CH3 NH O O CH3 CH3 CH3 m/z 192 - m/z 207 . CH3 NH O O C + CH3 CH3 + + 48 Figura 20 – Espectro de RMN do composto benzilamina protegido com Boc, a 25oC em CDCl3. A) 1H RMN; B) 13C RMN. O estudo de RMN confirmou a estrutura e a pureza do composto protegido, com todos os sinais de 1H e 13C sendo observados e corretamente atribuídos (Figura 20). A análise detalhada dos espectros permitiu validar a formação do produto protegido e assegurar sua 49 qualidade. Os sinais de 1H correspondentes aos nove hidrogênios dos grupos metileno foram observados em 1,45 ppm. O sinal do hidrogênio da amina, com integral 1, foi identificado em 4,99 ppm, confirmando a inserção do grupo protetor Boc na amina. Os sinais de 13C correspondentes aos grupos metileno foram observados em 28,4 ppm, enquanto o carbono quaternário C8 foi observado em 79,4 ppm. O objetivo de estudar a benzilamina por meio da reação de bromação é avaliar a possibilidade de bromação no carbono benzílico. Devido ao tamanho reduzido da molécula, a visualização da formação de um produto bromado quiral seria mais facilitada, caso ocorresse. Após a proteção do grupamento amina da benzilamina com Boc₂O, foi realizado um estudo de bromação do composto utilizando diclorometano como solvente. Para a reação, foram utilizados 1 mmol de benzilamina protegida (0,208 g) e 1,4 mmol de N-bromossuccinimida (NBS) (0,249 g). A purificação foi conduzida por lavagem com o próprio diclorometano, uma vez que o produto se tornou insolúvel no solvente. Antes da bromação, a benzilamina protegida apresentava-se como um sólido branco, com ponto de fusão de 54,6–55,3 ºC. Após a bromação, o produto adquiriu um aspecto de cristais translúcidos, com ponto de fusão na faixa de 162,5–164,3 ºC. De acordo com a literatura, compostos de benzilamina protegida com Boc e monobromados em diferentes posições do anel benzênico (orto, meta e para) apresentam coloração amarela e pontos de fusão específicos: 50–54 ºC na posição orto (CAS No. 162356- 90-3), 59–60 ºC na posição meta (CAS No. 171663-13-1), e 86–88 ºC na posição para (CAS No. 68819-84-1). Com base nesses dados, pode-se inicialmente inferir que a bromação ocorreu, mas o produto obtido não é monobromado, podendo tratar-se de um composto polibromado no anel aromático ou de um derivado resultante da bromação no carbono benzílico. Para confirmar essas hipóteses, foram realizadas análises por espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear. A análise por HRESI-MS revelou um espectro com uma mistura complexa de sinais, tornando impossível identificar com precisão a posição ou as posições dos átomos de bromo no composto após a reação de bromação. O sinal do íon molecular não foi assegurado, o que pode ser atribuído à formação de múltiplos produtos de reação. 50 Figura 21 – Espectro de HRESI-MS (70 eV) do composto Benzilamina protegido com Boc após reação de bromação com NBS ativado por luz infravermelha. Para complementar esses dados demos sequência com o estudo por RMN, a caracterização foi realizada em um equipamento de RMN - 600 MHz e foi conduzida à 298 K (25°C) em DMSO-d6. Figura 22 – Espectro de RMN do composto benzilamina protegido com Boc bromado, a 25oC em DMSO-d6. A) 1H RMN; B) 13C DEPT-135 RMN. 51 A análise do espectro de 1H RMN revelou sinais de fácil atribuição, como os hidrogênios metilênicos H11, com uma integral de 9. Um sinal pequeno em 5,71 ppm atribuído ao hidrogênio lábil H2, ligado ao nitrogênio. Os hidrogênios benzílicos H3 aparecem sobrepostos ao sinal residual do solvente. Na região aromática em 11,0 ppm, observa-se um único sinal com integral 2, atribuído à equivalência dos hidrogênios H6 e H8. Essa evidência sugere que o produto mais provável da reação de bromação é um composto tribromado no anel aromático. Na análise de 13C DEPT-135 RMN, foram observados os sinais dos carbonos ligados a hidrogênios. Em 29,7 ppm, identificou-se o carbono C11, com um único sinal. O sinal de C3, assim como o H3, ficou sobreposto ao sinal do solvente DMSO. Na região aromática, foi observado um único sinal em 179,7 ppm, atribuído aos carbonos equivalentes C6 e C8. Esses resultados são importantes, pois indicam que não houve bromação no carbono benzílico para este composto, assim como não ocorreu com as guanidinas estudadas, o que será discutido em detalhes na seção 4.3. Além disso, a tribromação do composto foi confirmada. No entanto, com base no espectro de HRESI-MS, espera-se a presença de subprodutos. A polibromação também foi observada nos compostos guanidínicos. 4.2 Reações de bromação dos compostos guanidínicos Como mencionado na Seção 3.3, as reações de bromação foram realizadas utilizando NBS como fonte de bromo, ativada por luz infravermelha de 150 Watts durante todo o tempo 52 reacional. O esquema da reação pode ser observado na Figura 23, onde é utilizado um condensador para evitar a perda de solvente e uma armadilha com peneira molecular no topo para impedir a entrada de água na reação. Durante todo o processo, a solução é mantida em agitação constante. Figura 233 – Esquema da reação de bromação dos compostos guanidínicos com NBS ativada por luz infravermelha. Fonte: Autoria própria. O uso de NBS (N-Bromosuccinimida) como fonte de bromo foi escolhido para induzir a monobromação dos compostos guanidínicos. A NBS é amplamente reconhecida como um método eficaz para a bromação de compostos orgânicos, tanto alifáticos quanto aromáticos [101-103]. Como já discutido na Seção 1.5, seu mecanismo de ação pode ocorrer por mecanismo de adição, substituição eletrofílica ou através da formação de radicais livres. Com a ativação do NBS pela energia da radiação infravermelha é esperado que ocorra a geração in situ da espécie Br2 [104], como ilustrado na Figura 24. Este método de bromação, conhecido como bromação de Wohl-Ziegler, envolve a adição eletrofílica através da espécie Br2 em solução. Para garantir a eficiência da reação, foi utilizado NBS em excesso. 53 Figura 244 – Mecanismo de formação da espécie in situ Br2 para bromação através da N- Bromosucinimida (NBS) ativada por irradiação infravermelha. Fonte: Adaptado de Incremona, J.H. e Martin, J.C. (1970) [104]. Com o mecanismo ilustrado, podemos observar que a irradiação com luz infravermelha inicia a reação, gerando espécies radicalares de bromo que tendem a formar in situ a espécie Br2. A succinimida radicalar é estabilizada por suas estruturas de ressonância e, mesmo com essas variações, forma um produto não radicalar ao reagir com outra succinimida radicalar. Desta forma, temos a espécie de bromo in situ formada e pronta para reagir com os compostos guanidínicos. Para estudar melhor a reação de bromação em compostos guanidínicos, optamos por utilizar solventes polares e apolares. Já foi reportado que a seletividade da ligação do bromo em carbonos alifáticos é favorecida pelo uso de solventes apolares, tais como cicloexano, benzeno e hexano, enquanto a bromação em carbonos aromáticos é favorecida por solventes polares, como diclorometano, clorofórmio e tetracloreto de carbono [101,103]. Para a primeira guanidina bromada, LQOF-G2, que possui um bromo na posição para do anel anilínico, testamos duas reações utilizando diclorometano (polar) e cicloexano (apolar) como solventes. Observamos que a variação da polaridade do solvente não interferiu na formação do produto bromado para essa classe de guanidinas, resultando no mesmo produto em ambos os solventes. Para a segunda guanidina bromada, LQOF-G35, que possui um bromo na posição orto do anel anilínico, realizamos reações utilizando diclorometano (polar) e acetonitrila (polar) como solventes. Embora tenhamos obtido o mesmo produto bromado em ambos os solventes, a purificação foi mais rápida e fácil quando utilizamos diclorometano em comparação com 54 acetonitrila. É importante ressaltar que as guanidinas LQOF-G2 e LQOF-G35 resultaram no mesmo produto bromado em todas essas reações [93]. Diante desses resultados, optamos por realizar as demais reações de bromação das guanidinas utilizando diclorometano como solvente. Essa escolha se deve à eficiência observada na formação do produto e à facilidade de purificação proporcionada por este solvente. Os resultados dos compostos bromados serão discutidos com mais detalhes nas Seções subsequentes. 4.3 Estudo dos compostos guanidínicos por EI-MS. As estruturas dos compostos guanidínicos antes e após a reação de bromação podem ser observadas no esquema geral da Figura 25, logo abaixo. Com este estudo, foi possível observar que os compostos não bromados (LQOF-G6) e monobromados (LQOF-G2, LQOF-G35 e LQOF-G36) existem principalmente como isômero Z. Após a reação de bromação desses compostos, a quantidade de átomos de bromo na porção anilínica das guanidinas aumentou, resultando em um aumento significativo da proporção do isômero E, chegando a inverter a preferência para o isômero E dos compostos LQOF-G6-Br e LQOF-G35-Br. Essas proporções foram determinadas através do estudo por RMN e será mais bem discutido na Seção 4.4. Figu