UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Igor Paulino Mendes Soares Scaffolds nanofibrilares de policaprolactona/nano-hidroxiapatita para regeneração do complexo dentino-pulpar: síntese, caracterização e avaliação em células pulpares humanas Araraquara 2021 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Igor Paulino Mendes Soares Scaffolds nanofibrilares de policaprolactona/nano-hidroxiapatita para regeneração do complexo dentino-pulpar: síntese, caracterização e avaliação em células pulpares humanas Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara, para obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Reabilitação Oral Orientadora: Prof.ª Dr.a Josimeri Hebling Araraquara 2021 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Odontologia, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. S676s Soares, Igor Paulino Mendes Scaffolds nanofibrilares de policaprolactona/nano-hidroxiapatita para regeneração do complexo dentino-pulpar: síntese, caracterização e avaliação em células pulpares humanas / Igor Paulino Mendes Soares. -- Araraquara, 2021 80 p. : il., tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Orientadora: Josimeri Hebling 1. Nanofibras. 2. Engenharia tecidual. 3. Biomineralização. 4. Capeamento da polpa dentária. 5. Expressão gênica. I. Título. Igor Paulino Mendes Soares Scaffolds nanofibrilares de policaprolactona/nano-hidroxiapatita para regeneração do complexo dentino-pulpar: síntese, caracterização e avaliação em células pulpares humanas Comissão julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Odontologia Presidente e orientador: Prof.ª Dr.a Josimeri Hebling 2º Examinador: Prof. Dr. Bruno das Neves Cavalcanti School of Dentistry – University of Michigan Department of Cariology, Restorative Sciences and Endodontics 3º Examinador : Prof.ª Dr.a Gisele Faria Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr – Unesp) Departamento de Odontologia Restauradora Araraquara, 08 de junho de 2021. DADOS CURRICULARES Igor Paulino Mendes Soares NASCIMENTO: 01/10/1996 – Bebedouro – SP FILIAÇÃO: Davi Mendes Soares e Necinei Paulino Soares 2014/2018 Graduação em Odontologia pela Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. 2019/2021 Mestrado Acadêmico em Odontologia, área de Reabilitação Oral, pela Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. Dedico este trabalho Aos meus pais Davi e Necinei, Por iluminação Divina e sem medir esforços, vocês guiam e fortalecem meu caminho com amor, carinho, dedicação, sabedoria e compreensão em todos os momentos. Por vocês cultivo os mais generosos sentimentos: respeito, amor e admiração. Se ao longo da minha vida posso colher frutos, foi porque vocês me fizeram florescer. À minha irmã Laís Por ser companheira e me ensinar que amor é multiplicar. Embora em algum momento eu possa parecer exemplo pra você como irmão mais velho, saiba que é você, com sua personalidade e doçura que me inspiram. AGRADECIMENTOS À minha querida orientadora, Professora Jô (Josimeri Hebling), por ter me acolhido no meu último ano de graduação como seu aluno de Iniciação Científica e ter permitido que eu participasse de sua jornada. A senhora demonstra a todo momento a essência do que é ser pesquisador e docente. Sua humildade, serenidade, honestidade e dedicação ao trabalho e à família me inspiram todos os dias. A confiança que deposita em mim me motiva todos os dias a buscar cada vez mais conhecimento de uma forma extremamente prazerosa. Ao professor Beto (Carlos Alberto de Souza Costa), por ser mais que um professor e me orientar em muitos sentidos da vida profissional e pessoal. Agradeço por ter aberto as portas de seus laboratórios solidificados ao longo de tantos anos de trabalho duro e honesto. Mais que isso, por ter confiado suas conquistas a mim, proporcionando experiências de vida ímpares que levarei comigo para sempre. Admiro o senhor e tenho prazer em poder contribuir sempre com o que precisar. À minha irmã de coração Caroline Anselmi de Oliveira, por ter me acompanhado desde o primeiro ano de Graduação e ter permanecido após isso: este trabalho é mais uma de nossas aventuras. Acredito que nossas personalidades tão opostas e complementares possam ser o grande motivo da nossa boa relação: muito do que falta em mim encontro em você. É um prazer poder compartilhar minha vida pessoal e profissional, seja em momentos de felicidade, tristeza, importantes ou fúteis. Independentemente de qualquer circunstância, sei que você sempre esteve, está e estará lá. E eu também por você. À Malu (Maria Luísa de Alencar e Silva Leite), quem me recebeu como um colega de trabalho e se tornou uma amiga de coração com quem posso contar. Agradeço imensamente por ter compartilhado tantos conhecimentos e experiências comigo, sejam profissionais ou pessoais. Este trabalho é também fruto seu e de toda sua dedicação em ensinar. Saiba que você é uma pessoa admirável em todos os sentidos e ilumina os lugares que passa. Ao meu companheiro Vinicius Krieger Costa Nogueira, pelo privilégio de compartilhar sua vida comigo há mais de 7 anos. Obrigado por tanta paciência, carinho e amor. Você me inspira, conforta, incentiva e faz com que meus dias comecem e terminem leves, quer esteja perto ou longe. Admiro e me espelho em muitas de suas virtudes pessoais e profissionais. Aos meus amigos Rafael Antonio de Oliveira e Fernanda Ali Kitagawa, por serem mais que colegas de trabalho. Vocês são pessoas tão iluminadas que aceitaram compartilhar desafios comigo com muito bom humor, paciência, dedicação e cumplicidade. Vocês são muito especiais e foram fundamentais para que este trabalho fosse possível. A tantos colegas e parceiros que já convivi ou ainda convivo nos laboratórios: Uxua, Isabela, Laís, Marlon, Beatriz, Lays, Carla, Fernanda, Taísa, Gabriel, Cristiano, Maitê. Todos vocês me proporcionaram experiências e trocas de conhecimento muito valiosas durante o Mestrado que vou levar para toda a vida. Dentre essas pessoas, destaco Giovana Anovazzi, quem me coorientou durante a Iniciação Científica e me introduziu aos experimentos com cultura de células: foi um prazer trabalhar com você, sinto saudade. Ainda, agradeço pela oportunidade de coorientar e trabalhar com as alunas de Iniciação Científica Isabela, Rafaella, Lídia e Giovanna: com vocês só tive trocas muito boas, obrigado por sempre estarem presente ajudando com tudo, também estou aqui por vocês. A todas essas pessoas desejo o bem e um futuro brilhante. A todos os meus familiares e amigos que, independentemente da distância, me incentivam, acolhem, confortam, divertem e fazem minha vida ser especial e ter sentido. Incluo aqui também, as pessoas com quem dividi ou divido moradia em Araraquara, os colegas e professores da pós-graduação e todos que de alguma forma me ajudaram e trocaram experiências pessoais e profissionais ao longo de tantos anos. Peço desculpas por não listar nomes (são muitos!), mas vocês sabem que têm meu coração. Aos professores da Graduação e Pós-graduação, por tantos ensinamentos sobre Odontologia, Docência, Pesquisa e sobre a vida. Agradecimento especial aos professores do Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese. Não posso deixar de citar as professoras Juliana Alvares Duarte Bonini Campos e Lívia Nordi Dovigo, que me proporcionaram conhecimentos sobre bioestatística essenciais para o desenvolvimento deste trabalho, construindo uma base sólida para meu crescimento como pesquisador. Mais que isso, vocês me reafirmaram o quanto o conhecimento é valioso, porque ninguém pode tirar da gente. Obrigado por tanto. Às Professoras Fernanda Gonçalves Basso e Marlise Inêz Klein Furlan pela participação como comissão examinadora dos Exames de Pré-qualificação e Qualificação deste trabalho. O conhecimento de vocês fortaleceu muito o desenvolvimento e conclusão desta Dissertação. Muito obrigado pela disposição. Ao Laboratório de Patologia Experimental e Biomateriais aos cuidados do Professor Beto, por oferecer a estrutura necessária para que este e tantos outros estudos pudessem ser realizados. Aproveito para agradecer ao Departamento de Fisiologia e Patologia pela disponibilidade de outros laboratórios complementares para a realização deste trabalho, também pela ajuda da secretária Carla e dos técnicos Zé e Juliana. Ao Laboratório de Pesquisa do Departamento de Morfologia e Clínica Infantil, aos cuidados da Professora Jô, por ter dado suporte a este e muitos outros trabalhos desenvolvidos ao longo do meu Mestrado. Agradeço também a todos os funcionários do departamento, em especial à Dulce e Flávia pela disponibilidade e parceria; e ao Pedrinho do Laboratório de Histologia, por ter se prontificado a me ensinar com muita dedicação seus conhecimentos sobre processamento histológico. À Unesp, em especial à Faculdade de Odontologia de Araraquara, por ser uma casa muito querida que permite meu crescimento pessoal e profissional há tantos anos. Agradeço a todos que nela trabalham: desde à Reitoria, à Diretoria desta faculdade representada pelo Diretor Prof. Dr. Edson Alves de Campos (Edinho) e à Vice-Diretora Prof.ª Dr.ª Patrícia P. Nordi Sasso Garcia, pessoas especiais que sempre me apoiaram e me deram o privilégio de trocar muitos conhecimentos e experiências profissionais e pessoais; aos funcionários técnico-administrativos, da limpeza e todos que são essenciais para que tudo aconteça. Também ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, em especial à Área de Reabilitação Oral. Aos pacientes atendidos nas clínicas da faculdade, aos voluntários desconhecidos que doaram seus dentes para esta e outras pesquisas e à população como um todo, que financia indiretamente esta e outras pesquisas ao pagar impostos, contribuindo para o avanço do conhecimento. À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo nº 2019/07400-0) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa. “Escolas que são gaiolas existem para que os pássaros desaprendam a arte do voo. Pássaros engaiolados são pássaros sob controle. Engaiolados, o seu dono pode levá-los para onde quiser. Pássaros engaiolados sempre têm um dono. Deixaram de ser pássaros. Porque a essência dos pássaros é o voo. Escolas que são asas não amam pássaros engaiolados. O que elas amam são os pássaros em voo. Existem para dar aos pássaros coragem para voar. Ensinar o voo, isso elas não podem fazer, porque o voo já nasce dentro dos pássaros. O voo não pode ser ensinado. Só pode ser encorajado.” Rubem Alves  Alves R. Por uma educação romântica. Brasil: Papirus Editora; 2013. Soares IPM. Scaffolds nanofibrilares de policaprolactona/nano-hidroxiapatita para regeneração do complexo dentino-pulpar: síntese, caracterização e avaliação em células pulpares humanas [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2021. RESUMO Visando uma terapia citocompatível e bioativa para aplicação sobre o tecido pulpar exposto, neste estudo foram desenvolvidos e caracterizados scaffolds nanofibrilares de policaprolactona (PCL) incorporados com nano-hidroxiapatita (nHA) e foi avaliada a resposta de células da polpa dental humana (HDPCs) semeadas sobre esses scaffolds. Soluções de PCL (10% m/v em clorofórmio/dimetilformamida) foram incorporadas ou não com nHA (0,5; 1,0; ou 2,0% m/v) e eletrofiadas em scaffolds. Os scaffolds foram caracterizados quanto à morfologia (MEV), composição (EDS), solubilidade (alteração de massa), liberação de cálcio/fosfato (espectrofotometria) e modulação do pH do meio. HDPCs foram cultivadas na superfície dos scaffolds e avaliadas quanto à viabilidade (Live/Dead e alamarBlue) e adesão/espalhamento celular (F-actina) ao longo do tempo. A expressão dos genes COL1A1, ALPL, DSPP e DMP1 (RT-qPCR), dosagem de proteínas totais (PT; Lowry) e a atividade de fosfatase alcalina (ALP; timolftaleína) foram investigadas aos 14 e 21 dias. A formação de matriz mineralizada (Alizarin Red) foi avaliada em 21 dias. Os dados foram analisados com ANOVA a um ou dois fatores, complementada por Tukey, Games- Howell ou Sidak (α=0,05). Todas as formulações originaram fibras variando entre 600 a 900 nm de diâmetro, com disposição aleatória. A identificação de cálcio e fósforo nas fibras foi concentração-dependente, confirmando a incorporação de nHA ao polímero. Concentrações mais altas de nHA tornaram as superfícies das nanofibras irregulares. PCL+0,5% nHA ampliou o diâmetro da nanofibra, enquanto PCL+2%nHA aumentou os espaços interfibrilares. PCL+1%nHA ou PCL+2%nHA promoveram significativa liberação de cálcio e fosfato, porém a modulação de pH não excedeu o valor 8,0. A viabilidade de HDPCs não foi afetada pela adição de nHA, enquanto adesão/espalhamento celular foram favorecidas. A expressão de DSPP e DMP1 foi regulada positivamente em 14 dias, e COL1A1, ALPL e DMP1 em 21 dias pelas formulações PCL+1%nHA e PCL+2%nHA. Maior quantidade de proteínas foi identificada em scaffolds contendo nHA no período mais tardio e a presença de nHA aumentou a atividade de ALP em 14 e 21 dias. A formação de matriz mineralizada foi dependente da concentração de nHA, cerca de 9× maior para PCL+2%nHA em comparação ao controle. Em conclusão, scaffolds nanofibrilares de PCL incorporados com nHA foram citocompatíveis, estimularam a adesão, espalhamento, proliferação e o potencial odontogênico de HDPCs. A formulação PCL+2%nHA é uma estratégia bioativa de engenharia tecidual para terapia pulpar vital. Palavras – chave: Nanofibras. Engenharia tecidual. Biomineralização. Capeamento da polpa dentária. Expressão gênica. Soares IPM. Polycaprolactone/nanohydroxyapatite nanofibrous scaffolds for the dentin-pulp complex regeneration: synthesis, characterization, and evaluation on human dental pulp cells [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2021. ABSTRACT Targeting a cytocompatible and bioactive therapy for the application on the exposed pulp tissue, this study developed and characterized polycaprolactone (PCL) nanofibrous scaffolds incorporated with nano-hydroxyapatite (nHA) and evaluated the response of human dental pulp cells (HDPCs) seeded on their surface. PCL-based solutions (10% w/v in chloroform/dimethylformamide) were incorporated or not with nHA (0.5; 1.0; or 2.0 % w/v) and electrospun into nanofibrous scaffolds. The scaffolds were characterized for morphology (SEM), composition (EDS), solubility (mass change), release of calcium/phosphate (spectrophotometry), and pH medium modulation. HDPCs were cultured on the surface of the scaffolds and evaluated for cell viability (Live/Dead and alamarBlue) and adhesion/spreading (F-actin) over time. The expression of COL1A1, ALPL, DSPP, and DMP1 genes (RT-qPCR), total protein synthesis (TP; Lowry), and alkaline phosphatase activity (ALP; thymolphthalein assay) were investigated at 14 and 21 days. The formation of a mineralized matrix (Alizarin Red) was assessed at 21 days. Data were analyzed with one- or two-way ANOVA complemented with Tukey, Games-Howell, or Sidak post-hocs (α=0.05). All formulations generated fibers ranging from 600 to 900 nm in diameter, with random arrangement. The incorporation of nHA into the nanofibers was dose-dependent. Higher nHA concentrations roughened nanofibers surfaces. PCL+0.5%nHA enlarged fiber diameter whereas PCL+2%nHA increased interfibrillar spaces. PCL+1%nHA or PCL+2%nHA promoted greater release of calcium and phosphate, but the medium pH was maintained below 8.0. HDPCs viability was not affected by the addition of nHA, while adhesion/spreading were favored. The expression of DSPP and DMP1 was upregulated in 14 days, and COL1A1, ALPL, and DMP1 in 21 days by the PCL+1%nHA and PCL+2%nHA formulations. The incorporation of nHA promoted higher protein synthesis and increased ALP activity. The formation of a mineralized matrix was concentration-dependent, about 9× higher for the PCL+2%nHA in comparison to the control. In conclusion, nanofibrous PCL scaffolds incorporated with nHA were cytocompatible, stimulated adhesion, spreading, proliferation, and the odontogenic potential of HDPCs. The PCL+2%nHA formulation is a bioactive tissue engineering strategy for vital pulp therapy. Keywords: Nanofibers. Tissue engineering. Biomineralization. Dental pulp capping. Gene expression. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 15 2 PROPOSIÇÃO ....................................................................................... 18 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................. 19 3.1 Complexo Dentino-Pulpar: Estrutura e Dinâmica ............................. 19 3.2 Terapia Pulpar Vital ............................................................................. 21 3.3 Engenharia Tecidual e Regeneração do Complexo Dentino-Pulpar 24 3.4 Scaffold Nanofibrilar para Aplicação sobre a Polpa Exposta ......... 26 3.5 Funcionalização de Scaffolds com Fases Minerais .......................... 31 4 MATERIAL E MÉTODO ....................................................................... 34 4.1 Síntese e Caracterização Físico-Química dos Scaffolds ................ 34 4.1.1 Síntese de nanofibras ......................................................................... 34 4.1.2 Caracterização morfológica e da incorporação de nHA ................. 35 4.1.3 Confecção dos scaffolds nanofibrilares ........................................... 36 4.1.4 Solubilidade, modulação de pH do meio, liberação de cálcio e fosfato .......................................................................................................... 36 4.2 Avaliação da Citocompatibilidade e Resposta de Células da Polpa Dental Humana (HDPCs) Semeadas em Contato com os Scaffolds........... 38 4.2.1 Estabelecimento e caracterização da cultura primária ................... 38 4.2.2 Cultura de HDPCs sobre a superfície dos scaffolds ........................ 40 4.2.3 Avaliação da citocompatibilidade ...................................................... 42 4.2.4 Regulação da expressão gênica ........................................................ 43 4.2.5 Dosagem de proteínas totais e atividade de fosfatase alcalina ...... 44 4.2.6 Formação de matriz mineralizada ...................................................... 45 4.3 Análise dos Dados .............................................................................. 45 5 RESULTADOS ...................................................................................... 47 5.1 Síntese e Caracterização Físico-Química dos Scaffolds ................. 47 5.2 Avaliação Biológica dos Scaffolds com HDPCs ................................ 52 6 DISCUSSÃO ......................................................................................... 61 7 CONCLUSÃO ....................................................................................... 67 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 68 ANEXO ................................................................................................... 77 15 1 INTRODUÇÃO Quando a integridade estrutural da dentina é rompida, o tecido pulpar vital exposto deve ser submetido a uma Terapia Pulpar Vital (TPV), cujo objetivo é estimular o potencial reparador deste tecido conjuntivo altamente especializado para produzir dentina reparadora1. Atualmente, os materiais de escolha para aplicação direta sobre o tecido pulpar são baseados na liberação de hidróxido de cálcio2,3. Entretanto, a elevada concentração de íons hidroxila liberada por esses materiais resulta em efeitos indesejáveis, incluindo morte celular e perda tecidual, reação inflamatória local exacerbada, formação de uma zona necrótica superficial e mineralização distrófica decorrente de necrose2-4. O avanço da engenharia tecidual abriu novas perspectivas para o desenvolvimento de scaffolds como estratégia regenerativa para manter a vitalidade e restabelecer a funcionalidade tecidual de forma bioativa5-7. Considerando a aplicação dessa estratégia para a regeneração do complexo dentino-pulpar, scaffolds devem permitir a migração e abrigar células multipotentes residentes na polpa, estimulando a proliferação e a expressão do fenótipo odontoblástico para promover a formação de uma barreira mineralizada semelhante à dentina5,6,8,9. Para tanto, os materiais utilizados devem, idealmente, ser capazes de replicar as características da matriz extracelular (MEC) nativa para sustentar e modular a função celular10. A eletrofiação (ou electrospinning) tem sido destacada como uma técnica favorável para criar, a partir de soluções poliméricas, fibras sólidas majoritariamente na escala nanométrica (nanofibras) altamente personalizadas, mimetizando o microambiente da MEC10,11. Assim, a característica estrutural de fibras interconectadas observada em scaffolds obtidos por eletrofiação tem mostrado estimular a interação celular ativa, sendo promissora para aplicação em processos regenerativos8,10,12. Biocompatibilidade, biodegradabilidade, reprodutibilidade e processabilidade são propriedades indispensáveis para polímeros usados em engenharia tecidual13. Policaprolactona (PCL) é um polímero sintético de baixo custo que apresenta tais características14. Facilmente processável por eletrofiação, PCL apresenta aprovação de agências reguladoras para aplicações 16 médicas e tem mostrado permitir a regeneração de diversos tecidos, além de ser utilizado como veículo biocompatível para sistemas de liberação controlada de fármacos em função de sua baixa taxa de degradação14-16. Essa última característica o torna interessante para aplicação como material de capeamento pulpar direto, visto que pode atuar como barreira física duradoura, reduzindo a difusão de componentes tóxicos lixiviados dos materiais restauradores para o tecido pulpar. Apesar da conhecida compatibilidade celular, o baixo grau de hidrofilia do PCL não favorece interações celulares, sendo necessário melhorar as propriedades de superfície para aplicações médicas14,17. Assim, a incorporação de outros agentes tem sido investigada como estratégia para facilitar e induzir os processos de adesão, proliferação celular e expressão de fenótipos específicos para formar o tecido desejado17-20. As cerâmicas de fosfato de cálcio (CFC), também conhecidas como biocerâmicas, têm se destacado na regeneração óssea pelas propriedades de osteocondução e osteoindução21,22. Dentre as biocerâmicas, a nano- hidroxiapatita (nHA) foi amplamente difundida na engenharia de tecidos mineralizados por apresentar alta similaridade com estruturas originais, sendo biocompatível sem causar reações inflamatórias21,23. Outras propriedades favoráveis incluem baixa taxa de degradação, adsorção de proteínas à sua estrutura e liberação local controlada de íons cálcio e fosfato que atuam em processos de diferenciação celular e biomineralização21,23-26. Como a friabilidade, dificuldade de adaptação e manutenção das nanopartículas isoladas no local da injúria tecidual limitam sua utilização, a incorporação de nHA à matriz polimérica de PCL foi sugerida como estratégia para confecção de scaffolds bioativos para a regeneração óssea21,23. Scaffolds de PCL incorporados com nHA têm demonstrado resultados promissores para formação de tecido ósseo por células de osteossarcoma humano (SaOS-2)27, pré-osteoblastos derivados da calvária de camundongos (MC3T3-E1)28, células- tronco mesenquimais de camundongos (mMSC)29, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (BMSC)30, derivadas do tecido adiposo humano (ADSC)30, derivadas da polpa dental humana (DPSC)30, e células-tronco isoladas da polpa de camundongo (mDPSC)31. 17 Dessa maneira, os resultados favoráveis obtidos para a regeneração óssea instigam a utilização dessa associação para aplicações voltadas à regeneração do complexo dentino-pulpar. Até o momento, poucos estudos investigaram a resposta das células pulpares ao PCL puro ou associado à hidroxiapatita para a formação de tecido dentinário31,32. Recentemente, foi demonstrado que membranas de PCL incorporadas com hidroxiapatita foram capazes de estimular a expressão do fenótipo odontoblástico por células mesenquimais indiferenciadas isoladas de dentes humanos com diagnóstico de pulpite irreversível (IDPSCs, inflamed dental pulp stem cells)32. Uma vez que os materiais atuais disponíveis para VPT ainda carecem de propriedades ideais, a investigação de novas estratégias regenerativas é necessária para induzir a formação fisiológica de dentina de forma previsível e limitar a necrose pulpar33,34. Assim, este estudo investigou scaffolds nanofibrilares de PCL incorporados com nHA para funcionar um material citocompatível, com propriedades físico- químicas adequadas que estimulem o potencial regenerativo intrínseco do tecido pulpar mediado por células indiferenciadas residentes no tecido sem causar danos indesejáveis. 18 2 PROPOSIÇÃO A proposta do presente estudo foi desenvolver e caracterizar scaffolds nanofibrilares de PCL incorporados com nHA, assim como avaliar o efeito biológico desses scaffolds sobre células pulpares humanas. Para tanto, foram definidos dois objetivos específicos: 1. Sintetizar, por meio de eletrofiação, e caracterizar scaffolds nanofibrilares de PCL associados ou não com nHA quanto ao diâmetro das fibras, espaços interfibrilares, incorporação das nanopartículas, solubilidade, liberação de íons cálcio e fosfato e modulação do pH do meio; 2. Avaliar a citocompatibilidade dos scaffolds e seu efeito sobre a diferenciação odontogênica de células da polpa dental humana, por meio da viabilidade celular, adesão/espalhamento, proteínas totais, atividade de fosfatase alcalina, formação de matriz mineralizada e expressão de genes marcadores da diferenciação 19 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Complexo Dentino-Pulpar: Estrutura e Dinâmica O dente é formado por tecidos que apresentam composição e características morfológicas distintas. A dentina é um tecido conjuntivo mineralizado semipermeável de estrutura tubular que constitui maior parte do dente. Em peso, a dentina apresenta 70% de conteúdo inorgânico, 20% de conteúdo orgânico e 10% de água35. Na porção coronária, a dentina é recoberta por esmalte, um tecido de origem epitelial altamente mineralizado (96% em peso), enquanto na raiz, é recoberta por cemento, estrutura responsável pela integração do dente ao tecido ósseo35. Juntas, essas estruturas protegem a polpa dental, um tecido conjuntivo frouxo não mineralizado localizado subjacente à dentina, que contém terminações nervosas e uma rede vascular conectadas com os tecidos circundantes35. Apesar de composição e características distintas, dentina e polpa apresentam a mesma origem mesenquimal, ou seja, células que migram da crista neural até o local dos futuros arcos dentários36. Esses dois tecidos são interligados por células secretoras denominadas odontoblastos, que compreendem uma camada pseudoestratificada disposta por toda a extensão da interface dentina-polpa33,36. Essa característica torna esses tecidos interdependentes, configurando a denominação complexo dentino-pulpar. Odontoblastos são células pós-mitóticas derivadas da crista neural, terminalmente diferenciadas e altamente especializadas36. Durante a odontogênese, a interação epitélio-mesenquimal da lâmina dentária mobiliza uma subpopulação de células mesenquimais, que estendem processos citoplasmáticos em direção à membrana basal, conformando-se em odontoblastos primários36. Essas células alongadas apresentam núcleo em uma posição excêntrica e numerosas organelas em sua área supra nuclear oposta responsáveis pela síntese e deposição extracelular de pré-dentina, uma matriz composta majoritariamente por fibrilas de colágeno tipo I36. A subsequente mineralização dessa matriz origina a dentina por meio um processo complexo envolvendo proteínas não colagenosas também secretadas por odontoblastos35,36. Fosfatase alcalina tecido não-específica (TNAP ou ALP), 20 proteína da matriz dentinária-1 (DMP-1) e sialofosfoproteína da dentina (DSPP) são as principais proteínas responsáveis por regular a concentração extracelular de cálcio e fosfato, promover a nucleação mineral e formação dos cristais de hidroxiapatita no interior e ao longo das fibrilas de colágeno que compõem a matriz dentinária35-39. Durante o desenvolvimento dentário, a formação dentinária ocorre ativamente (~4 µm/dia), originando a dentina tubular denominada primária40,41. Após a irrupção do dente na cavidade oral, a função secretora dos odontoblastos é reduzida em torno de 10 vezes por autofagia, um processo de manutenção que degrada alguns dos componentes intracelulares para preservar a funcionalidade e garantir a sobrevivência celular40,41. Nesse estágio, os odontoblastos produzem dentina secundária, que é depositada lenta e fisiologicamente ao longo de toda a vida, mantendo a característica tubular40. À medida que a mineralização ocorre, os odontoblastos migram para a porção mais interna da polpa e prolongamentos citoplasmáticos ficam projetados no interior da pré- dentina e dos túbulos da dentina mineralizada36. A presença desses prolongamentos no interior dos túbulos dentinários torna os odontoblastos principais responsáveis pela transmissão de estímulos sensoriais e regulação da defesa celular primária contra a difusão de agentes tóxicos de patógenos, materiais odontológicos e injúrias acometidas nos tecidos sobrejacentes33,36,40. Frente a estímulos de baixa intensidade, a deposição de dentina por odontoblastos subjacentes é aumentada, culminando na formação de uma dentina terciária reacional que objetiva reduzir a permeabilidade do complexo dentino-pulpar e afastar os corpos celulares do agente agressor33,42. No entanto, estímulos mais intensos podem levar os odontoblastos subjacentes à morte, desencadeando o recrutamento de células indiferenciadas presentes na polpa para o local da injúria, subsequente proliferação e diferenciação em células com fenótipo odontoblástico (odontoblastoides); essas células assumem uma morfologia mais alongada e passam a secretar uma matriz mineralizada amorfa denominada dentina terciária reparadora, visando restabelecer a integridade estrutural do complexo dentino-pulpar33,35,43. 21 A resposta do complexo dentino-pulpar a injúrias não se limita apenas às células pulpares. Componentes aprisionados na matriz extracelular dentinária mineralizada apresentam atividade biológica significativa, conferindo à dentina um caráter bioativo que contesta a visão de um tecido inerte com função majoritariamente mecânica44. Além de proteínas colágenas e não colagenosas relacionadas à mineralização, a matriz extracelular dentinária também contém fatores de crescimento, fatores neurotróficos, e proteínas do plasma45. Essas moléculas podem ser solubilizadas frente a processos de desmineralização dentinária, incluindo lesões de cárie, condicionamento ácido em procedimentos restauradores e realização de preparos cavitários33,45. Uma vez solubilizados, esses componentes atuam em diversos processos mediadores da reparação tecidual, incluindo a regulação da atividade secretória dos odontoblastos primários, recrutamento de células indiferenciadas, indução da diferenciação em células odontoblastoides, controle da atividade dessas células diferenciadas e estimulação de angiogênese; todos esses eventos visam manter a homeostasia, integridade e funções do complexo dentino-pulpar33,44,45. 3.2 Terapia Pulpar Vital A integridade estrutural dos tecidos mineralizados dentários pode ser comprometida por diferentes causas, como lesões de cárie, traumas ou durante preparos cavitários, podendo culminar em exposição do tecido pulpar2. Nesse cenário, qualquer tratamento que visa preservar ou recuperar a estrutura e função da polpa vital é denominado de Terapia Pulpar Vital (TPV)1. Clinicamente, esses tratamentos são classificados em capeamento pulpar indireto, direto ou pulpotomia. O capeamento pulpar indireto é um procedimento realizado em cavidades muito profundas, nas quais um material biocompatível é colocado sobre um delgado remanescente de dentina, visando estimular os odontoblastos subjacentes a depositarem uma dentina terciária reacional2,42,43. Já o capeamento pulpar direto é um tratamento minimante invasivo realizado quando há exposição do tecido pulpar, sobre o qual é colocado um material para facilitar a formação de barreira mineralizada protetora por células odontoblastoides2,33. 22 A pulpotomia difere do capeamento pulpar apenas porque uma porção da polpa remanescente é removida antes da aplicação do material de capeamento2. Clinicamente, a polpa vital pode se encontrar em três condições a depender dos sinais e sintomas apresentados: polpa normal, pulpite reversível e pulpite irreversível. A polpa normal não apresenta sintomas clínicos; a pulpite reversível apresenta sensibilidade térmica de curta duração, que cessa imediatamente assim que a estimulação térmica for removida; já a pulpite irreversível geralmente apresenta dor espontânea, prolongada e/ou referida2. Atualmente, a TPV com capeamento pulpar direto é indicada para tratamento da polpa exposta de dentes jovens que apresentem as condições de polpa normal ou pulpite reversível1,2. Radiograficamente, a região apical não deve apresentar alterações patológicas e respostas a testes de percussão, palpação e sondagem periodontal devem apresentar condições normais2. Além disso, é recomendável que a região de exposição compreenda um diâmetro inferior a 1 mm e a hemorragia local seja controlada previamente à colocação direta do material de capeamento pulpar2. Caso esses requisitos não puderem ser satisfeitos, o procedimento de capeamento pulpar com materiais disponíveis atualmente não é recomendado em vista da necessidade iminente de tratamento endodôntico posterior1,2. Idealmente, o material para capeamento da polpa exposta deve apresentar propriedades como: biocompatibilidade e manutenção da vitalidade pulpar; estimulação da formação de dentina reparadora; adesão à dentina e aos materiais restauradores sobrejacentes; resistência ao procedimento restaurador subsequente e às forças mastigatórias; ação bactericida e/ou bacteriostática; vedação contra recontaminação microbiana; ser passível de esterilização e radiopaco1,46. Nos últimos 100 anos, uma ampla variedade de materiais foi proposta para utilização no capeamento pulpar direto, com destaque para formulações de hidróxido de cálcio e silicatos de cálcio3. Entretanto, nenhum desses materiais apresenta todas as características listadas acima. O hidróxido de cálcio (HC) tem sido considerado padrão-ouro para capeamento pulpar direto2. Quando aplicado diretamente sobre o tecido pulpar 23 exposto, o HC se dissocia em íons cálcio e hidroxila, induzindo uma necrose superficial de coagulação em resposta ao dano químico imediato e de curta duração causado pela elevada alcalinidade (pH ~12)4. Concomitantemente, a matriz dentinária mineralizada é parcialmente solubilizada, liberando componentes bioativos que, juntamente com os íons cálcio, contribuem para mediar atividades celulares envolvidas no processo de reparação tecidual47-49. O reparo se inicia com a migração, adesão e proliferação de fibroblastos, células endoteliais e inflamatórias para combater o agente irritante causador da necrose4. Na presença de inflamação, os fibroblastos são capazes de modular seu fenótipo para produzir focos de mineralização como resposta reparadora, conferindo um processo inicial de formação de barreira mineralizada por calcificação distrófica50,51,52. Durante esse processo, células mesenquimais indiferenciadas também são atraídas e estimuladas a se diferenciarem em células odontoblastoides, continuando a formação da barreira mineralizada com a deposição de matriz dentinária4,33,52. A injúria tecidual provocada pela exposição pulpar associada ao processo inflamatório gerado após capeamento com HC promove uma considerável perda de tecido pulpar saudável, que resulta na formação de uma barreira mineralizada convexa projetada para o interior da polpa52. Como consequência, o tecido mineralizado formado é heterogêneo, composto por uma primeira camada de calcificação distrófica formada sob a camada de necrose com característica osteoide, amorfa, fibrosa e com inclusões vasculares e celulares; e outra camada que apresenta um tecido tubular mais semelhante à dentina secundária revestido por células odontoblastoides52. A configuração da barreira mineralizada formada associada à falta de adesão à estrutura dentária e elevada solubilidade do HC contribuem para a formação de um espaço vazio susceptível à microinfiltração e recontaminação microbiana, tornando o selamento de exposições pulpares imperfeito2,52-54. Como reflexo clínico, as taxas de sucesso atuais do capeamento pulpar direto com cimento à base de HC diminuem consideravelmente ao longo do tempo, reduzindo de 76% após 6 meses até 56% após 4 a 5 anos desse tratamento realizado após exposição pulpar por cárie55. 24 Materiais à base de silicatos de cálcio, como o agregado de trióxido mineral (MTA) e o Biodentine, compreendem outra classe empregada atualmente para o capeamento pulpar direto3. Majoritariamente compostos por silicato dicálcico (2CaO•SiO2) e silicato tricálcico (3CaO•SiO2), esses materiais originam um cimento a partir da hidratação dos silicatos2. Quando misturados com a água no momento da aplicação, os silicatos de cálcio no pó produzem um gel de silicato de cálcio hidratado e altas concentrações de cálcio e hidroxila são liberadas como subproduto da reação2. Portanto, esses materiais também apresentam mecanismo de ação cáustico semelhante aos materiais compostos por HC baseado em indução de necrose superficial e solubilização de moléculas bioativas33,45,52. Além disso, materiais à base de silicato de cálcio apresentam longos tempos de presa (3-4 horas), dificuldade de manipulação, possibilidade de alteração de cor da estrutura dental remanescente e falta de adesão à dentina2,33,56. Por outro lado, a característica de cimento permite ao material tomar presa, limitando a área de perda tecidual, gerando menor resposta inflamatória e induzindo a formação de uma barreira dentinária mais uniforme e espessa em curto prazo (menos que 3 meses)3,57. Apesar disso, a integridade e espessura da barreira mineralizada formada não apresentam associação com sucesso clínico, que diz respeito à manutenção da vitalidade pulpar a longo prazo e ausência de sintomatologia57. Em vista do cenário exposto, o desafio de restabelecer a dinâmica do complexo dentino-pulpar em exposições pulpares com os materiais disponíveis atualmente reaviva a necessidade de desenvolver novas estratégias para essa finalidade. 3.3 Engenharia Tecidual e Regeneração do Complexo Dentino-Pulpar Por definição, a restauração de tecidos perdidos ou danificados por meio da deposição de um tecido fibroso cicatricial caracteriza um processo de reparo tecidual58. Em função da ocorrência de necrose seguida por calcificação distrófica, o tecido mineralizado formado após aplicação dos materiais disponíveis para capeamento pulpar direto configura um processo de reparo33,50. 25 Em contraste, a restituição de estruturas originais a partir da deposição de tecido com características similares ao que foi perdido caracteriza um processo de regeneração tecidual58. Com base nos avanços nas áreas de ciências dos materiais, biologia celular e molecular, novas abordagens terapêuticas visam mediar processos regenerativos em vista de maior segurança e eficácia5. Particularmente sobre a regeneração dentinária, novas propostas buscam desenvolver biomateriais citocompatíveis e bioativos que estimulem a formação de um novo tecido dentinário depositado majoritariamente por células odontoblastoides recém-diferenciadas residentes no tecido pulpar, permitindo a formação contínua de uma dentina com conformação tubular e caráter sensorial59. Essas estratégias regenerativas são fundamentadas em conceitos de engenharia tecidual, um campo do conhecimento descrito no início da década de 1990 que integra princípios de engenharia e biologia para desenvolver substitutos funcionais para tecidos perdidos60. A engenharia tecidual baseia-se em três elementos principais: células capazes de produzirem o tecido perdido ou danificado; scaffolds como biomateriais para suporte dessas células; e moléculas bioativas que sinalizam às células para a formação do novo tecido60. A identificação de uma população de células indiferenciadas no tecido pulpar de dentes permanentes adultos abriu novas perspectivas para terapias regenerativas craniofaciais6,61. Essa população majoritariamente localizada na periferia dos vasos sanguíneos exibe características de células mesenquimais indiferenciadas, apresentando intensa atividade proliferativa, clonogênica, capacidade de autorrenovação e potencial de diferenciação multilinhagem34,61. A capacidade de se diferenciar em células odontoblastoides, formar nódulos de mineralização in vitro e produzir dentina tubular quando transplantadas de forma ectópica in vivo, evidencia a capacidade regenerativa intrínseca do tecido pulpar61. Portanto, a utilização de materiais que apresentem a capacidade de induzir a mobilização dessas células para o local da injúria tem se mostrado uma possibilidade clinicamente viável de aplicação dos conceitos de engenharia tecidual para TPV6,59,62. 26 Considerando o capeamento pulpar e a pulpotomia como procedimentos regenerativos nos quais o tecido pulpar remanescente serve como uma fonte de células indiferenciadas residentes, a busca por protocolos de tratamento modificados para otimizar a capacidade regenerativa intrínseca do tecido pulpar se torna uma alternativa para aumentar a chance de sucesso dessas terapias6. Ainda em casos de estágios avançados de pulpite ou necrose pulpar em que a fonte celular é perdida, o recrutamento, abrigo e estímulo adequado de outras células indiferenciadas da região periapical por meio de scaffolds bioativos podem ser estratégias viáveis para a regeneração do complexo dentino-pulpar no futuro6-8,62,63. Fatores de crescimento aprisionados na dentina, como o fator de crescimento transformador beta (TGF-β), podem ser liberados e atuar como quimioatraentes para células indiferenciadas6. Ainda, moléculas de sinalização podem ser incorporadas a esses biomateriais permitindo uma liberação controlada e bioatividade duradoura para sinalizar a formação do novo tecido de forma citocompatível5-8,62-64. Essas células poderiam aderir ao scaffold, proliferar, diferenciar e restaurar as estruturas perdidas, restabelecendo a composição e estrutura fisiológica do complexo dentino-pulpar5-8,62-64. A aplicação dos conceitos de engenharia tecidual para TPV está esquematizada na Figura 1. 3.4 Scaffold Nanofibrilar para Aplicação sobre a Polpa Exposta Dentre os elementos essenciais na engenharia tecidual, o scaffold é a estrutura tridimensional que simula a matriz extracelular capaz de abrigar células e permitir a formação de um novo tecido60. As características físico-químicas dos scaffolds, como composição, morfologia, taxa de porosidade, interconectividade dos poros e biodegradabilidade são importantes para sua biocompatibilidade e influenciam diretamente no comportamento celular e formação de tecido5,13,65. Várias opções têm sido investigadas para comporem scaffolds, incluindo componentes da matriz extracelular, como proteínas, glicosaminoglicanos, polissacarídeos e peptídeos; além de polímeros naturais, sintéticos, biocerâmicas e, recentemente, a associação destes materiais5,8. Cada 27 componente é capaz de oferecer características personalizadas aos scaffolds, conferindo caráter bioativo para regenerar tecidos específicos5. Figura 1 – Esquema da aplicação dos conceitos de engenharia tecidual para terapia pulpar vital (TPV). (A) Exposição pulpar após preparo cavitário; (B) Capeamento direto da exposição pulpar com scaffold contendo moléculas sinalizadoras bioativas e restauração da cavidade; (C) Liberação de moléculas bioativas que mediam processos de migração, proliferação e diferenciação de células indiferenciadas da polpa em células odontoblastoides; (D) Formação de tecido dentinário no local da exposição por células odontoblastoides. Fonte: Elaboração própria Scaffolds buscam replicar as características da matriz extracelular (MEC) nativa para abrigar e modular a função celular como ocorre em condições fisiológicas10. A MEC é a rede nano estruturada composta por proteínas, 28 glicosaminoglicanos e glicoproteínas que envolve as células, oferecendo suporte mecânico e sinalizando suas interações no tecido66. Por esse motivo, scaffolds com arquitetura nanofibrilar têm ganhado destaque na engenharia tecidual por favorecer a adesão, espalhamento e arranjo celular, estimulando a manutenção morfológica e modulando o padrão de expressão gênica12. Os mecanismos envolvidos nestes eventos biológicos incluem aumento da adsorção de proteínas (como laminina, vitronectina e fibronectina), regulação positiva da expressão de integrinas e modulação da via quinase de adesão focal (FAK), que media a ativação de outras vias relacionadas a processos de diferenciação10,67,68. Diversos métodos têm sido explorados para sintetizar scaffolds capazes de mimetizar adequadamente a MEC nativa. Dentre eles, a eletrofiação (ou electrospinning) tem sido destacada por ser uma técnica economicamente acessível, versátil, simples, e reprodutível para fabricar fibras em nano/micro escala projetadas em camadas10,11. O processo de eletrofiação produz nanofibras sólidas a partir de uma solução polimérica introduzida em uma seringa acoplada a uma bomba de ejeção automática, com velocidade ajustada de acordo com a viscosidade da solução11. A bomba é posicionada a uma distância pré-determinada de um coletor metálico e uma agulha é acoplada à seringa contendo a solução, sobre a qual é aplicada alta voltagem11. O polo negativo é acoplado ao coletor metálico, criando um campo elétrico que excede a tensão superficial da solução11. A gota de polímero então se alonga devido à instabilidade elétrica, originando uma estrutura cônica denominada Cone de Taylor, por meio da qual o polímero é pulverizado em direção ao coletor11. Durante esse processo, o solvente é evaporado, projetando fibras poliméricas sólidas em camadas11. O coletor pode ter diferentes conformações, como cilindro rotatório para produzir uma orientação alinhada das fibras, ou plano para coletar fibras em orientação aleatória10. Além disso, por meio da eletrofiação é possível associar diferentes polímeros, incorporar moléculas bioativas (como fármacos) e também compostos inorgânicos (como partículas)11. A eletrofiação pode ser usada para produzir matrizes nanofibrilares a partir de diversos polímeros sintéticos e naturais, originando estruturas que atuam como scaffolds para adesão e proliferação celular, por mimetizarem as 29 microestruturas da MEC, como fibrilas de colágeno10. Polímeros naturais apresentam elevada biocompatibilidade e bioatividade, características que favorecem adesão e proliferação celular18. No entanto, eles são difíceis de processar por diferentes técnicas incluindo a eletrofiação, apresentam risco de contaminação, imunogenicidade, propriedades mecânicas desfavoráveis, elevada solubilidade e variabilidade entre lotes5,18. Dentre os polímeros naturais utilizados para confecção de scaffolds para a regeneração do complexo dentino- pulpar destacam-se, dentre outros, colágeno, gelatina, ácido hialurônico, fibrina, alginato e quitosana5. Especificamente para a engenharia tecidual dentinária, scaffolds porosos de quitosana têm se destacado como estratégias bioativas promissoras9,69-72. Polímeros sintéticos têm ganhado popularidade por apresentarem composição química padronizada, fácil processamento por diversas técnicas, incluindo eletrofiação, e capacidade de modificação para atingir propriedades físico-químicas desejadas para aplicações específicas5,18. Outras vantagens incluem custo acessível, propriedades mecânicas favoráveis, resistência à degradação, capacidade de produção em larga escala de maneira uniforme e tempo de prateleira mais longo18. No entanto, apresentam biocompatibilidade e bioatividade inferiores quando comparados aos polímeros naturais18. São exemplos de polímeros sintéticos aplicados na engenharia tecidual o ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA), copolímeros de ácido poli-láctico- glicólico (PLGA) e policaprolactona (PCL). Dentre os polímeros sintéticos, PCL recentemente atraiu muita atenção para aplicações biomédicas, incluindo engenharia de tecidos mineralizados, em função de suas propriedades físico- químicas e capacidade de carregamento com moléculas bioativas para utilização como sistema de liberação controlada18,19. Poli(ε-caprolactona) ou poli(6-hidroxihexanoato), convencionalmente conhecido apenas por policaprolactona (PCL), é um poliéster alifático sintético, sintetizado por abertura do anel da ε-caprolactona via catálise (Figura 2)18. Com temperatura de fusão entre 59 e 64 °C, à temperatura fisiológica o PCL apresenta uma fase semicristalina borrachoide, resultando em propriedades mecânicas favoráveis, porém com tempo de biodegradação mais longo dentre os poliésteres 30 (2 a 4 anos)14,19. Por esse motivo, esse polímero sintético biocompatível e biodegradável foi extensivamente utilizado para confecção de suturas reabsorvíveis e biomateriais para liberação controlada de fármacos nas décadas de 1970 e 198014. O surgimento de polímeros com tempos de degradação mais curtos e, portanto, considerados mais vantajosos, fez com que o PCL fosse praticamente esquecido por quase duas décadas14. No entanto, o baixo custo, fácil processabilidade, propriedades físico-químicas e aprovação concedida por agências regulatórias como a Food and Drug Administration (FDA) impulsionaram o retorno do PCL como biomaterial para aplicações em engenharia de tecidos como pele, cartilagem, músculos, ossos, vasos sanguíneos, nervos e, mais recentemente, o uso como preenchedor dérmico para bioestimulação de colágeno14,16,73. Figura 2 – Fórmula estrutural do polímero policaprolactona (PCL) e apresentação comercial em pastilhas (seta branca). Fonte: Elaboração própria Com relação à regeneração do complexo dentino-pulpar, scaffolds nanofibrilares de PCL têm demostrado permitir considerável adesão, espalhamento e proliferação de células da polpa dental e da papila apical humanas, o que viabiliza sua utilização para restabelecer os tecidos dentinário e pulpar63,74. Apesar da sua notável citocompatibilidade, o polímero PCL por si só é quimicamente inerte e apresenta baixo grau de hidrofilia (90º<θ<150º), características que o tornam limitado para permitir processos adequados de adesão e proliferação celular em aplicações clínicas14,16,19. Por outro lado, a valiosa capacidade do PCL de permitir associação a outros polímeros sintéticos 31 ou naturais, moléculas bioativas e compostos inorgânicos permitem a alteração de suas propriedades físico-químicas, o que o torna uma escolha vantajosa como material para confecção de scaffolds16. Nesse contexto, a incorporação de materiais à base de cálcio e fosfato têm demonstrado ser uma ferramenta de funcionalização do PCL para favorecer a formação de tecidos mineralizados em estratégias regenerativas18. 3.5 Funcionalização de Scaffolds com Fases Minerais Cerâmicas de fosfato de cálcio (CFC), também denominadas biocerâmicas, são uma classe de materiais proposta para neoformação de tecido ósseo por apresentar propriedades de osteocondução e osteoindução, ou seja, favoráveis para adesão, proliferação e formação de tecido mineralizado21,22. Além disso, apresentam capacidade de induzir células mesenquimais a se diferenciarem em osteoblastos, com potencial de promover formação óssea em sítios ectópicos sem a presença de fatores de crescimento específicos75. Esses efeitos são mediados principalmente pela composição, rugosidade superficial, solubilidade e energia livre de superfície das CFC, que favorecem adsorção de proteínas e formação de complexos adesivos focais estáveis, conduzindo posteriormente a diferenciação osteoblástica via interações entre células e MEC25,26. Biocerâmicas com elevada solubilidade alteram facilmente o pH local por liberar uma elevada concentração de íons, influenciando negativamente na adesão e conformação estrutural de proteínas; em contraste, biocerâmicas estáveis e pouco solúveis apresentam baixa troca iônica com o microambiente, permitindo maior adesão e estabilidade conformacional de proteínas por interação eletrostática local76-80. Dentre as CFC, a hidroxiapatita cristalina (Figura 3) é um dos biomateriais mais seguros por apresentar baixa taxa de dissolução e composição mais semelhante às estruturas mineralizadas do corpo humano (relação Ca/P = 1,67), sendo amplamente investigada em estratégias para regeneração óssea21-23. Mais especificamente, a nano-hidroxiapatita (nHA; partícula <200 nm; Figura 3) é uma forma de apresentação bastante interessante para aplicações 32 regenerativas devido ao aumento da área de superfície das partículas que permite, simultaneamente, a manutenção das propriedades de superfície relacionadas à adesão de proteínas e também melhora a bioatividade por favorecer taxa de dissolução lenta e contínua21,23,79-81. A dissolução da nHA é capaz de aumentar a concentração local de íons cálcio e fosfato, ativando vias de sinalização que mediam a diferenciação celular, expressão de genes e síntese de proteínas relacionadas aos processos de mineralização, como colágeno tipo I, fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, osteonectina, dentre outras21,24,81-84. Figura 3 – Fórmula estrutural da hidroxiapatita e apresentação comercial em nanopartículas (<200 nm). Fonte: Elaboração própria Por fornecer um microambiente favorável para induzir a adesão celular e formação de tecido ósseo, a incorporação de nHA à matriz polimérica de scaffolds de nanofibras tem sido investigada. A suspensão de 0,5 e 1% (m/v) de nHA em solução de 12% (m/v) de PCL permitiu a eletrofiação de nanofibras que favoreceram maior e mais rápida adesão e proliferação de células de osteossarcoma humano (SaOS-2) em comparação ao PCL puro, com destaque para a maior concentração avaliada que também proporcionou maior atividade de fosfatase alcalina27. Nanofibras contendo 12% (m/v) de PCL e 1% (m/v) de nHA também foram avaliadas com pré-osteoblastos derivados da calvária de 33 camundongos (MC3T3-E1), demonstrando aumentar a atividade de fosfatase alcalina, além da expressão gênica e síntese de osteocalcina e maior deposição de matriz mineralizada28. A associação de PCL/nHA também apresentou bioatividade com diferentes células mesenquimais humanas, incluindo células mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSC), células mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSC), células mesenquimais derivadas da polpa dental (DPSC), sendo essas últimas as que apresentaram maior deposição de matriz mineralizada quando cultivadas sobre o biomaterial30. Ainda, nanofibras de PCL incorporadas com 2,5% (m/v) de nHA regularam positivamente a expressão de Dspp e Dmp1 em cultura de células mesenquimais isoladas da polpa dental de camundongos e quando implantadas em subcutâneo de camundongos, evidenciando o potencial desta associação em induzir células indiferenciadas da polpa a expressarem um fenótipo odontoblástico31. Juntas, estas evidências encorajam a investigação de formulações de scaffolds nanofibrilares de PCL incorporados com nHA para utilização como estratégia bioativa para aplicação sobre o tecido pulpar exposto. 34 4 MATERIAL E MÉTODO 4.1 Síntese e Caracterização Físico-Química dos Scaffolds 4.1.1 Síntese de nanofibras Nanofibras foram sintetizadas por meio da técnica de eletrofiação63,74. Soluções de clorofórmio e dimetilformamida (8:2; Neon Comercial Ltda, Suzano, SP, Brasil) foram preparadas sob agitação magnética à temperatura ambiente. Em seguida, concentrações de 0,5%, 1% ou 2% (m/v) de nano-hidroxiapatita (nHA; <200 nm; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA) foram adicionadas aos solventes, seguido pela adição de grânulos de PCL (10% m/v; Sigma-Aldrich) sob agitação. Solução de PCL (10% m/v) sem nHA foi usada como controle para todos os experimentos. Após 24 h de homogeneização, cada solução polimérica foi transferida para uma seringa de 5 mL equipada com uma agulha de aço inoxidável (18 gauge, Anhui Easyway Supplies Co., Tianchang, Anhui, China) e disposta em uma bomba de ejeção automática (KD Scientific, Holliston, MA, EUA) atuando à velocidade de 1 mL/h. Uma fonte de alta tensão foi usada entre 12 e 13 kV para projetar nanofibras sobre um coletor plano de alumínio, posicionado verticalmente a 15 cm da ponta da agulha (Figura 4). As formulações experimentais estão descritas no Quadro 1. Quadro 1 – Formulações experimentais da primeira fase do estudo. Formulação Descrição da composição dos scaffolds PCL (Controle) PCL (10% m/v) sem adição de nHA PCL+0,5%nHA PCL (10% m/v) com adição de 0,5% (m/v) nHA PCL+1%nHA PCL (10% m/v) com adição de 1% (m/v) nHA PCL+2%nHA PCL (10% m/v) com adição de 2% (m/v) nHA nHA: nano-hidroxiapatita (<200 nm) Fonte: Elaboração própria 35 Figura 4 – Estação de trabalho utilizada para o processo de eletrofiação das nanofibras. Fonte: Elaboração própria 4.1.2 Caracterização morfológica e da incorporação de nHA A morfologia das nanofibras foi avaliada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e a incorporação de nHA foi verificada por Espectroscopia por Energia Dispersiva (EDS). Após 30 min de eletrofiação sobre lâmina (coletor) de alumínio, quatro amostras foram obtidas de áreas aleatórias, padronizadas em 2 mm de diâmetro utilizando um punch dermatológico (Kolplast, Itupeva, SP, Brasil) (Figura 5). As amostras foram fixadas com fita de carbono em stubs metálicos, recobertas com ouro e as análises de MEV/EDS foram realizadas sob alto vácuo a 20 kV (FEI Inspect S50, FEI, Hillsboro, OR, EUA). Três imagens foram obtidas de diferentes áreas de cada amostra em aumentos de 2000× e 4000× (n=12/grupo). O diâmetro de 50 nanofibras de cada imagem foi medido digitalmente (ImageJ, Instituto Nacional de Saúde - NIH, Bethesda, MD, EUA) e o número total de nanofibras avaliadas por grupo (n=600) foi utilizado para analisar a distribuição do diâmetro. Para a comparação entre os grupos, primeiro foi calculada a média de diâmetro para cada imagem, seguida pelo cálculo da média das 12 imagens. A proporção de espaços interfibrilares (%) também foi avaliada digitalmente (ImageJ). 36 Figura 5 – (A) Eletrofiação de nanofibras sobre lâmina (coletor) de alumínio. (B) obtenção das amostras para caracterização morfológica com punch dermatológico, os quais foram (C) montados em stubs metálicos para caracterização estrutural em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Fonte: Elaboração própria 4.1.3 Confecção dos scaffolds nanofibrilares Previamente às demais análises, scaffolds foram sintetizados a partir da eletrofiação de nanofibras, como descrito anteriormente, durante 1 h, sobre lamínulas de vidro de 13 mm de diâmetro (Perfecta, São Paulo, SP, Brasil), aderidas com 2 μL de água deionizada ao coletor de alumínio plano (Figura 6). Para a realização dos protocolos seguintes, apenas as lamínulas que estavam uniformemente cobertas por nanofibras foram selecionadas. Após o término do processo de eletrofiação, as amostras foram submetidas à evaporação do solvente residual em um dessecador contendo sílica por um período de 72 h. Ainda, os scaffolds foram submetidos a um protocolo de lavagem e desinfecção63 com 500 µL de soluções de etanol-água (50% etanol - uma aplicação de 10 min e 70% etanol - três aplicações de 20 min), seguido por imersão em 500 µL de solução tampão fosfato-salina esterilizada (PBS; 0,14M NaCl, 0,0017M KH2PO4, 0,003M KCl, 0,01M Na2HPO4; pH~7; duas aplicações de 10 min). 4.1.4 Solubilidade, modulação de pH do meio, liberação de cálcio e fosfato A solubilidade das formulações de scaffolds foi avaliada por degradação hidrolítica. Para isso, scaffolds (n=6) foram hidratados em 500 µL de água deionizada (pH~7) por 2 h. Após secagem a 37 °C por 30 min, a massa de cada amostra foi aferida em balança de alta precisão (XS105 Dual Range, Mettler 37 Toledo, Toledo, OH, EUA) para obter a massa inicial (M0). Após nova imersão em água deionizada por 1, 7, 14, 21 e 28 dias, as amostras foram novamente secas por 30 min para aferição da massa seca (Mx). Assim, a porcentagem de alteração da massa em cada período foi determinada por meio da equação: % alteração de massa =100-(Mx×100/M0). Figura 6 – Confecção dos scaffolds de nanofibras sobre lamínulas de vidro. (A) Lamínulas de vidro (13 mm de diâmetro) fixadas sobre o coletor de alumínio (setas) e (B) cobertas com as nanofibras após eletrofiação do polímero. Fonte: Elaboração própria 38 Para avaliação da modulação do pH do meio, scaffolds (n=6) foram armazenados em 300 µL de água ultrapura (pH~7) e o pH foi medido após 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 28 dias (Hanna HI 2221; Hanna Instruments, Woonsocket, RI, EUA), sendo a água coletada e renovada a cada 24 horas. Ainda, durante esses períodos, a liberação de cálcio (Ca2+) e fosfato inorgânico (Pi) foi determinada. Para quantificação de Ca2+, 100 µL da água coletada em cada período foi submetida a uma reação de ponto final com o-cresolftaleína complexona (Cálcio Liquiform, Labtest Diagnóstico S/A, Lagoa Santa, MG, Brasil) seguindo as recomendações do fabricante, sendo a absorbância resultante da reação determinada a 570 nm (Synergy H1, BioTek, Winooski, VT, EUA). A liberação de Pi foi mensurada com 100 µL da água coletada por meio de uma reação de ponto final com molibdato de amônio (Fósforo, Labtest) seguindo as recomendações do fabricante, sendo a absorbância resultante determinada a 650 nm (Synergy H1). As concentrações de Ca2+ e Pi (mM) foram determinadas usando padrões disponibilizados pelo fabricante a partir das concentrações de 0; 0,03; 0,06; 0,12; 0,25; 0,49; e 0,98 mM para Ca2+ (R2=0,99); e 0; 0,008; 0,016; 0,032; 0,065; 0,131; 0,263 mM para Pi (R2=0,94). 4.2. Avaliação da Citocompatibilidade e Resposta de Células da Polpa Dental Humana (HDPCs) Semeadas em Contato com os Scaffolds 4.2.1 Estabelecimento e caracterização da cultura primária O tecido pulpar de dois terceiros molares hígidos foi coletado imediatamente após exodontia e consentimento dos voluntários (dois doadores de 18 anos; CAAE 18083819.0.0000.5416, Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Araraquara/UNESP, São Paulo, SP, Brasil – ANEXO). Após a extração, os dentes foram acondicionados imediatamente em tubos contendo meio de cultura completo composto por 90% de α-MEM, 10% de soro fetal bovino (SFB), 100 UI/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 2 mmol/L de glutamina e 0,25 g/mL de anfotericina B (todos do fabricante Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). Os dentes foram envolvidos em gaze esterilizada embebida em PBS a 4 °C e fraturados com um martelo cirúrgico. Em 39 uma capela de fluxo laminar sob condições assépticas, o tecido pulpar foi cuidadosamente removido com limas endodônticas e fracionado com tesoura cirúrgica. Os fragmentos foram submetidos à digestão enzimática utilizando solução de colagenase tipo I (3 mg/mL, Worthington Biochem, Freehold, NJ, EUA) em placa de cultivo celular (Kasvi, São José dos Pinhais, PR, Brasil) durante 3 h. As células aderidas provenientes dos dois dentes foram subcultivadas por tripsinização (0,25% Tripsina-EDTA, Gibco), agrupadas na passagem #2 e expandidas em meio de cultura α-MEM completo a 37 °C e 5% de CO2 em ambiente umidificado. A cultura obtida foi caracterizada quanto à presença de alguns marcadores identificados em células mesenquimais indiferenciadas por meio de imunofluorescência34,63. Para tanto, células provenientes da passagem #3 (6×104) foram cultivadas sobre lamínulas de vidro (Perfecta) até confluência de 70%. Em seguida, as células foram fixadas em formaldeído (4% em PBS) por 15 min, lavadas com PBS a 4 °C e tratadas com Triton-X 100 (0,1% em PBS; Sigma- Aldrich) por 10 min, para permeabilização da membrana celular. O bloqueio de ligações inespecíficas foi realizado por tratamento com albumina de soro bovino (BSA; 5% em PBS; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) por 30 minutos, Em seguida, as células foram incubadas com anticorpos monoclonais primários dirigidos contra NANOG, OCT-4, STRO-1, CD146 e CD44 (1:50 em BSA 5%; Santa Cruz Biotechnology), por 12 h a 4 °C. Após este período, as células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC; 1:100; Santa Cruz Biotechnology) por 1 h, seguido por incubação com Hoescht 33342 (1:5000; Invitrogen, Life Technologies) por 15 min, para contra fluorescência nuclear. As células foram analisadas em magnificação de 10× em microscopia de fluorescência (Leica DM 5500B; Leica, Austin, TX, EUA). A marcação positiva para os antígenos avaliados (Figura 7) demonstra a presença de uma população de células com capacidade de autorrenovação e de diferenciação em outros tipos celulares especializados presentes na cultura estabelecida. 40 Figura 7 – Painel de imagens de imunofluorescência (10×) de marcadores identificados em células mesenquimais indiferenciadas (NANOG, OCT-4, STRO- 1, CD146 e CD44) expressos em células presentes na cultura estabelecida. Fluorescência verde (FITC) indica marcação pelos anticorpos e a fluorescência azul demonstra os núcleos (Hoescht). Como controle negativo (FITC, células foram incubadas apenas com anticorpo secundário. Fonte: Elaboração própria 4.2.2 Cultura de HDPCs sobre a superfície dos scaffolds Scaffolds confeccionados durante 1 h de eletrofiação e submetidos ao protocolo de lavagem e desinfecção mencionado anteriormente foram embebidos em 500 µL de meio de cultura completo em placas de 24 poços (Kasvi) (Figuras 8A e 8B). Após 12 horas, células (passagens #3 a #6) foram cultivadas em uma área de 63,6 mm2 padronizada com um anel de aço inoxidável de 9 mm de diâmetro interno esterilizado posicionado sobre a superfície das amostras (Figuras 8C a 8F). A densidade do cultivo celular variou de acordo com o experimento e o meio de cultura foi renovado a cada 2 dias durante os períodos de cultura para cada protocolo experimental (Quadro 2). 41 Figura 8 – Disposição dos scaffolds em placas de cultura e padronização do cultivo celular. (A) Scaffolds em placa de 24 poços; (B) detalhe da imagem anterior; (C) limitação da área de cultivo celular no scaffold (9 mm) com anel metálico; (D) detalhe da imagem anterior; (E) cultivo celular sobre a superfície dos scaffolds; e (F) visão geral de alguns poços da placa com meio de cultura. Fonte: Elaboração própria Quadro 2 – Densidade do cultivo e períodos de análise em função do protocolo experimental. Protocolos em cultura celular Densidade do cultivo (células/amostra) Período de análise (dias) 1 3 7 14 21 Adesão/espalhamento celular 3×104 X X X Viabilidade/proliferação celular 3×104 X X X Regulação da expressão gênica 5×104 X X Determinação de proteínas totais 5×104 X X Atividade de fosfatase alcalina 5×104 X X Formação de matriz mineralizada 5×104 X Fonte: Elaboração própria 42 4.2.3 Avaliação da citocompatibilidade Para validar a citocompatibilidade do polímero PCL, um grupo experimental no qual as células foram cultivadas sobre lamínulas de vidro (Perfecta) foi delineado para os ensaios de adesão, espalhamento, viabilidade e proliferação celular63. A viabilidade celular foi avaliada indiretamente por meio de uma reação fluorimétrica de oxirredução proporcional à atividade metabólica celular nos períodos de 1, 7 e 14 dias de cultura. Nesses períodos, células cultivadas sobre scaffolds ou lamínula (n=8) foram incubadas com 300 µL do reagente alamarBlue (Invitrogen, Life Technologies) em meio α-MEM sem SFB (1:10) por 3 h a 37 °C e 5% de CO2. Após este período, a fluorescência de 100 µL das soluções foi determinada com 560 nm de excitação e 590 nm de emissão (Synergy H1). A média de fluorescência do grupo PCL (controle) no dia 1 foi considerada como 100% de viabilidade celular. Nos mesmos períodos de análise, viabilidade e proliferação de HDPCs também foram avaliadas por meio de microscopia de fluorescência. Células foram cultivadas sobre scaffolds (n=4) por 1, 7 ou 14 dias. Decorridos os períodos, as amostras foram lavadas com PBS e incubadas com 200 µL de α- MEM sem SFB suplementado com 4 μM de homodímero de etídio-1 (EthD-1) e 2 μM de Calceína AM (Live/Dead kit de viabilidade/citotoxicidade; Invitrogen, Life Technologies). Após 30 min de incubação, as amostras foram avaliadas em fluorescência direta sob magnificação de 10× (Leica DM 5500B). Adesão e espalhamento de HDPCs sobre scaffolds e lamínula de vidro (n=4) foi avaliada por meio da marcação (sonda fluorescente vermelha) dos filamentos de actina presentes no citoesqueleto (1:20 em BSA a 2%; reagente ActinRed 555 ReadyProbes; Invitrogen, Life Technologies, Eugene, OR, EUA). Após 1, 3 ou 7 dias de cultivo, as células foram fixadas com formaldeído (4% em PBS/15 min) e a membrana celular foi permeabilizada com Triton X-100 (0,1% em água; Sigma-Aldrich). As superfícies dos scaffolds foram analisadas sob aumento de 10× em microscópio de fluorescência, com Hoescht 33342 (fluorescência azul) (1:5000 em PBS; Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) usado como contra corante nuclear (Leica DM 5500B). 43 4.2.4 Regulação da expressão gênica A diferenciação odontogênica foi estimulada pela suplementação do meio de cultura completo com 5 mM de β-glicerofosfato (Santa Cruz Biotechnology) e 50 μg/mL de ácido ascórbico (Fisher Chemical, NJ, EUA) após o segundo dia de cultivo celular, sendo renovado a cada 2 dias para as análises seguintes69. A regulação da expressão gênica relacionada ao fenótipo odontoblástico foi avaliada aos 14 e 21 dias do cultivo de HDPCs sobre os scaffolds (n=6). Nesses períodos, o meio de cultura foi aspirado e os espécimes foram lavados em PBS. O RNA total foi extraído imediatamente usando 300 µL de solução de tiocianato de guanidínio e purificado em um sistema de colunas de afinidade, incluindo tratamento com DNase I, seguindo protocolos do fabricante (RNAqueous Micro Total RNA Isolation Kit; Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Após purificação, a quantidade total e a pureza do material genético foram verificadas por espectrofotometria e valores de densidade óptica relativa A260/A280 entre 1,9 e 2,1 foram considerados adequados (BioTek Take3 Application/Synergy H1). A transcrição reversa em 20 µL de cDNA foi realizada com 500 ng de RNA utilizando primers randômicos e transcriptase reversa MultiScribe, seguindo as recomendações do fabricante (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA, EUA). As reações em cadeia da polimerase foram realizadas pelo método quantitativo (qPCR) utilizando de 1 µL a 2 µL de cDNA e ensaios com concentrações otimizadas de primers e sondas de hidrólise (TaqMan Gene Expression Assays; Applied Biosystems, Life Technologies) para amplificação de COL1A1 (ID:Hs01076756_g1), ALPL (ID:Hs01029144_m1), DSPP (ID:Hs00171962_m1) e DMP1 (ID:Hs01009391_g1). As reações foram conduzidas no sistema StepOnePlus (Applied Biosystems, Life Technologies) seguindo condições de termociclagem otimizadas pelo fabricante dos ensaios de expressão gênica e do Master Mix (TaqMan Fast Advanced Master Mix; Applied Biosystems, Life Technologies): incubação de Uracil-DNA glicosilase a 50 °C por 2 min, ativação da DNA polimerase a 95 °C por 2 min, e 50 ciclos de qPCR com desnaturação a 50 °C 44 por 1 s e hibridização a 60 °C por 20 s. A expressão gênica foi calculada pelo método do ciclo de quantificação (Cq) comparativo (2-ΔΔCq) utilizando a expressão do gene de referência GAPDH (ID:Hs02786624_g1) pré- estabelecido, sendo apresentada relativamente (Fold change) ao grupo PCL (controle). 4.2.5 Dosagem de proteínas totais e atividade de fosfatase alcalina Células foram cultivadas sobre scaffolds (n=8) por 14 ou 21 dias em meio suplementado para diferenciação odontogênica. Nesses períodos, a lise celular foi realizada com aplicação de 150 µL de solução de lauril sulfato de sódio (0,1% em água; Sigma-Aldrich) por 40 min sob agitação. A dosagem de proteínas presentes foi determinada usando o método de Lowry a partir de uma curva padrão (0; 8; 16; 24; 32; e 40 μg/mL) com BSA (R2=0,96). Para tanto, 25 µL dos extratos homogeneizados obtidos de cada amostra foram misturados com o reagente de Lowry (1:1; Sigma-Aldrich) por 20 min, diluídas em reagente de Folin-Ciocauteau por 30 min (1:4; Sigma-Aldrich) e a absorbância final foi determinada a 655 nm (Synergy H1). Simultaneamente, a atividade de fosfatase alcalina foi quantificada. Para tanto, os extratos lisados restantes (125 µL) foram incubados com 10 µL de substrato de timolftaleína monofosfato (22 mM; Reagente nº 1; Fosfatase Alcalina; Labtest) e 100 µL de solução tampão (300 mM; pH 10.1; Reagente nº 2; Fosfatase Alcalina; Labtest) a 37 °C. Após 10 minutos de incubação, 200 µL de reagente de cor (94 mM de carbonato de sódio e 250 mM de hidróxido de sódio; Reagente nº 3; Fosfatase Alcalina; Labtest) foram adicionados e 100 µL foram coletados para determinação da absorbância a 590 nm (Synergy H1). A atividade enzimática (μmol de timolftaleína/min=U) foi calculada a partir de uma curva padrão (R2=0,98) com as concentrações de 0; 0,007; 0,015; 0,031; 0,062; 0,125; e 0,250 U/L de ALP (Reagente nº 4; Fosfatase Alcalina; Labtest) e os dados foram normalizados com a quantidade total de proteínas, sendo expressos em U/μg. 45 4.2.6 Formação de matriz mineralizada Este parâmetro foi avaliado após 21 dias de cultura de HDPCs sobre scaffolds (n=8) cultivados em meio de diferenciação odontogênica. As células foram fixadas com etanol (70% em água; Sigma-Aldrich) a 4 °C por 1 h e coradas com solução de Alizarin Red S (40 mM em água deionizada, pH~4,2; Sigma- Aldrich) por 15 min sob agitação. A coloração de fundo (background) foi removida após cinco lavagens com 1 mL de água deionizada e a formação de matriz mineralizada foi visualizada (15×) em um estereomicroscópio (SZ2-ILST, Olympus, Tóquio, Japão) acoplado a uma câmera (E-330, Olympus). Quinhentos microlitros de solução de cloreto de cetilpiridínio (10% em PBS; pH~7; Sigma- Aldrich) a 37 °C foi usada para solubilizar a matriz mineralizada durante 20 min sob agitação, sendo a absorbância da solução resultante determinada a 570 nm (Synergy H1). Como as formulações contendo nHA apresentam cálcio em sua composição, scaffolds sem células cultivadas (n=6) foram processados e utilizados como desconto nos valores de absorbância para cada grupo e o valor médio do grupo PCL (controle) foi considerado como 100% de formação de matriz mineralizada. 4.3 Análise dos Dados Todos os experimentos foram realizados em pelo menos duas ocasiões para minimizar erros sistemáticos e permitir observar reprodutibilidade. O tamanho de amostra para os experimentos foi baseado em estudos prévios e ajustado para a obtenção de no mínimo 80% de poder calculado pelo software G*Power versão 3.1 (Universidade Dusseldorf, Dusseldorf, Alemanha). As imagens de fluorescência foram analisadas descritivamente. As variáveis degradação, modulação do pH e liberação de Ca2+ e Pi foram inferidas por intervalos de confiança. Os demais desfechos foram inferidos por testes de hipóteses calculados pelo software SPSS versão 26.0 (IBM Inc., Chicago, IL, EUA). Para cada conjunto de dados foi avaliada a distribuição amostral (Shapiro- Wilk) e homogeneidade de variâncias (Levene). Análises de variância foram calculadas considerando um ou dois fatores, sendo eles: “formulação” (4 ou 5 níveis correspondentes às 4 formulações de scaffolds e lamínula de vidro) e 46 “período de análise” (2 ou 3 níveis). Para modelo com medidas repetidas, a esfericidade foi avaliada pelo teste de Mauchly e, quando não atendida, ajustes foram feitos com Greenhouse-Geisser. Comparações múltiplas foram calculadas com Sidak para análises a dois fatores e Tukey para análises a um fator. Em caso de heterocedasticidade, o método de Welch era aplicado para correção da ANOVA e comparações múltiplas calculadas com Games-Howell. Todas as inferências foram feitas considerando significância pré-estabelecida de 5%. 47 5 RESULTADOS 5.1 Síntese e Caracterização Físico-Química dos Scaffolds A partir das imagens obtidas em MEV foi possível observar que todos os grupos resultaram na formação de nanofibras uniformes e com disposição aleatória (Figura 9). Figura 9 – Caracterização morfológica das nanofibras. Da esquerda para a direita: imagens de MEV da superfície dos scaffolds em aumentos de 2000×, 4000× e gráfico de distribuição (%) de diâmetros das fibras (n=600) para as formulações: (a) PCL (controle), (b) PCL+0,5%nHA, (c) PCL+1%nHA e (d) PCL+2%nHA. Fonte: Elaboração própria 48 A frequência de diâmetro das fibras prevaleceu em 800 nm para as formulações de PCL+0,5%nHA e PCL+1%nHA, e em 600 nm para a formulação controle e PCL+2%nHA. Houve diferença significativa entre os grupos quanto ao diâmetro das nanofibras (F=13,44; p<0,001; ANOVA de Welch; Tabela 1). Nanofibras com maior diâmetro foram observadas para a formulação PCL+0,5%nHA em comparação aos demais grupos, os quais não diferiram entre si (p<0,001; Games-Howell; Tabela 1). Dentre as concentrações avaliadas, somente a formulação PCL+2%nHA teve efeito sobre a porcentagem de espaços interfibrilares (F=5,59; p<0,001; ANOVA de Welch), aumentando essa porcentagem em relação ao controle e aos demais grupos (p=0,006; Games- Howell; Tabela 1). Tabela 1 – Diâmetros de fibras e espaços interfibrilares de acordo com a formulação de scaffolds. Formulação Diâmetro da fibra (nm) (n=600) Espaços interfibrilares (%) (n=12) PCL 670,9 (65,6)a 26,4 (1,9)a PCL+0,5%nHA 886,2 (99,8)b 26,5 (4,7)a PCL+1%nHA 741,4 (62,6)a 25,8 (3,1)a PCL+2%nHA 712,4 (42,5)a 32,0 (4,5)b Nota. Os valores representam médias (desvios-padrão). Dentro de cada coluna, os números identificados com a mesma letra não diferem estatisticamente (ANOVA de Welch e Games-Howell; α=5%). Fonte: Elaboração própria A incorporação das diferentes concentrações de nHA à matriz polimérica dos scaffolds foi confirmada por EDS, demonstrado pelo aumento da detecção de espectros compatíveis com os elementos cálcio e fósforo (Figura 10). Ainda, a partir das mesmas imagens analisadas, é possível observar em detalhe a topografia de superfície das fibras, com aumento da irregularidade superficial proporcional à concentração de nHA incorporada (Figura 10). 49 Figura 10 – (a) Painel de imagens de MEV (16000×) das formulações de scaffolds e espectrogramas de EDS realizados (b) na região toda da imagem e (c) no ponto indicado com asterisco (). Setas indicam a detecção de picos compatíveis com cálcio (Ca) e fósforo (P) provenientes da nHA incorporada ao polímero PCL (indicado pelos espectros compatíveis com os elementos C e O). A detecção dos elementos Al e Au correspondem, respectivamente, à folha de alumínio sobre a qual as nanofibras foram sintetizadas e o ouro do processo de metalização das amostras para análise em MEV. Fonte: Elaboração própria 50 O ensaio de degradação hidrolítica mostrou um padrão lento e semelhante de solubilidade para todas as formulações, sem diferenças significativas entre os diferentes períodos de avaliação. A formulação sem adição de nHA apresentou o maior valor médio de perda de massa (3,3%) após 28 dias de imersão em água (Figura 11). Figura 11 – Gráfico de linhas representando a solubilidade das formulações de nanofibras avaliadas em diferentes períodos. Pontos representam os valores médios por período e barras de erro indicam intervalos de confiança de 95%. Fonte: Elaboração própria O pH do meio de armazenamento dos scaffolds foi mantido próximo ao neutro para todos os grupos durante o período de 28 dias de análise. De modo geral, os valores de pH variaram entre 6,8 e 7,7 (Figura 12). Entretanto, modulação significante do pH foi observada para as formulações incorporadas com nHA entre o terceiro e sétimo dia. Maiores valores de pH foram observados no dia 3 para todos os grupos, com valor máximo de 7,6 (IC95%: 7,5 – 7,7) para as formulações PCL+1%nHA e PCL+2%nHA, com diferença significante em comparação à formulação PCL+0,5%nHA (Figura 12). 51 Figura 12 – Gráfico de linhas representando modulação de pH do meio promovida pelas formulações de nanofibras avaliadas em diferentes períodos. Pontos representam os valores médios por período e barras de erro indicam intervalos de confiança de 95%. Fonte: Elaboração própria A presença de nHA promoveu liberação de Ca2+ significativa para o grupo com a maior concentração de nHA (PCL+2%nHA) desde o primeiro dia de análise até o décimo quarto dia (Figura 13a), com pico de liberação ao terceiro dia, atingindo valor médio máximo de 1,8 mM (IC95%: 1,7 – 2,0). As formulações PCL+0,5%nHA e PCL+1%nHA foram capazes de liberar concentrações significativas somente entre o terceiro e o quinto dia, porém inferiores quando comparadas à formulação PCL+2%nHA (Figura 13a). Com relação à liberação de Pi, foi possível observar efeito significativo somente para os grupos PCL+1%nHA e PCL+2%nHA, do primeiro ao sétimo dia de análise (Figura 13b), com maior liberação para a formulação PCL+2%nHA no primeiro dia de análise. 52 Figura 13 – Gráficos de linhas representando (a) liberação de cálcio (Ca2+) e (b) liberação de fosfato inorgânico (Pi) pelas formulações de nanofibras avaliadas em diferentes períodos. Pontos representam os valores médios por período e barras de erro indicam intervalos de confiança de 95%. Fonte: Elaboração própria 5.2. Avaliação Biológica dos Scaffolds com HDPCs Para validar internamente a citocompatibilidade do PCL, sem adição de nHA, inicialmente foi realizada uma comparação da viabilidade e proliferação celular (alamarBlue) entre scaffolds de PCL e a superfície de lamínulas de vidro (Figura 14). A ANOVA a dois fatores revelou efeito significante da variável 53 formulação (PCL ou vidro; F=60,13; p<0,001), do período (F=55,49; p<0,001) e de interação (F=16,97; p<0,001). Comparando os efeitos da interação, o PCL apresentou maiores valores de viabilidade independentemente do período de análise em comparação à lamínula de vidro (p≤0,004; Sidak; Figura 14). Houve aumento significante da viabilidade de HDPCs para o grupo PCL ao longo dos 3 períodos de análise (p≤0,009; Sidak; Figura 14), enquanto para células semeadas sobre lamínulas de vidro, esse aumento foi observado apenas em sete dias. Figura 14 – Viabilidade de HDPCs ao longo de 1, 7 e 14 dias do cultivo sobre lamínulas de vidro e scaffolds. Números representam média (desvio-padrão) de porcentagem calculadas com base nos valores do controle em 1 dia, também representados pelas colunas e barras de erro, respectivamente. Letras maiúsculas comparam a mesma superfície nos períodos de avaliação e letras minúsculas comparam as superfícies para o mesmo período. Letras diferentes indicam diferença estatística (ANOVA com medidas repetidas e Sidak; n=8; α=5%). Fonte: Elaboração própria Comparando os efeitos das diferentes formulações contendo nHA com o controle (PCL; Figura 15), foi possível verificar apenas efeito do período de avaliação (F=150,23; p<0,001), com ausência de efeito para a formulação (F=1,37; p=0,286) e ausência de interação (F=1,54; p=0,189). Assim, houve aumento progressivo e significante para todas as formulações em função do tempo de análise (p≤0,002; Figura 15). 54 Figura 15 – Viabilidade de HDPCs ao longo de 1, 7 e 14 dias do cultivo sobre as formulações de scaffolds. Colunas representam médias e barras de erro indicam os desvios-padrão de porcentagem calculadas com base nos valores do controle em 1 dia, também representados pelas colunas e barras de erro, respectivamente. Letras maiúsculas comparam as formulações entre os períodos de avaliação e letras minúsculas comparam as formulações para o mesmo período. Letras diferentes indicam diferença estatística (ANOVA com medidas repetidas e Sidak; n=8; α=5%). Fonte: Elaboração própria Ao longo de todos os períodos de análise, as imagens de fluorescência obtidas pelo ensaio Live/Dead mostraram grande e crescente quantidade de células viáveis para todas as formulações de scaffolds avaliadas, com uma baixa quantidade de células em processo de morte (Figura 16). Da mesma forma, maior quantidade de focos de adesão celular sobre as superfícies dos scaffolds em comparação à lamínula de vidro foi observada em todos os períodos avaliados (Figura 17). Ainda, a presença de nHA promoveu maior espalhamento do citoplasma pelas nanofibras já no primeiro dia, fenômeno que foi intensificado ao longo dos demais períodos de análise, resultando em focos de adesão maiores e confluentes (Figura 17). - 55 - Figura 16 – Painel de imagens de fluorescência direta (10×) do ensaio de viabilidade celular (Live/Dead). Cultivo de HDPCs por 1, 7 e 14 dias (linhas) sobre lamínula de vidro e formulações de scaffolds (colunas). Fluorescência verde marca células viáveis (Calceína AM) e vermelha marca células em processo de morte (EthD-1). Fonte: Elaboração própria - 56 - Figura 17 – Painel de imagens de fluorescência direta (10×) do ensaio de adesão e espalhamento celular. Cultivo de HDPCs por 1, 3 e 7 dias (linhas sobre lamínula de vidro e formulações de scaffolds (colunas). Fluorescência vermelha marca os filamentos de actina presentes no citoesqueleto (ActinRed), enquanto a fluorescência azul marca o núcleo celular (Hoechst). Fonte: Elaboração própria 57 A regulação da expressão gênica de marcadores da diferenciação odontogênica aos 14 e 21 dias está apresentada na Figura 18. Figura 18 – Expressão gênica de COL1A1, ALPL, DSPP e DMP1 por HDPCs cultivadas sobre as formulações de scaffolds em (a) 14 e (b) 21 dias de cultura (colunas). Colunas representam médias e barras de erro indicam os desvios- padrão de Fold changes (2-ΔΔCq). Letras diferentes indicam diferença estatística (ANOVA e Tukey; n=6; α=5%). ns: sem diferença estatística significante. Fonte: Elaboração própria 58 Aos 14 dias, não houve efeito significativo da formulação dos scaffolds sobre a expressão de COL1A1 (F=2,69; p=0,073; ANOVA) e ALPL (F=1,53; p=0,238; ANOVA). Por outro lado, a expressão de DSPP foi afetada (F=16,41; p<0,001; ANOVA), aumentando em torno de 2,7× no grupo PCL+1%nHA (p=0,009; Tukey) e 3,7× no grupo PCL+2%nHA (p<0,001; Tukey) em comparação ao controle (Figura 18a). Com relação ao gene DMP1, houve efeito da composição do scaffold (F=26,88; p<0,001; ANOVA) somente para a concentração de PCL+2%nHA, a qual promoveu aumento de aproximadamente 3× da expressão gênica em comparação à expressão observada para o grupo controle (p<0,001; Tukey) (Figura 18a). Aos 21 dias de cultura (Figura 18b), somente a expressão de DSPP não foi afetada pelas diferentes formulações (F=1,60; p=0,22; ANOVA). Expressão de COL1A1 (F=7,84; p<0,001; ANOVA) e ALPL (F=9,53; p<0,001; ANOVA) foram afetadas significativamente somente no grupo PCL+2%nHA, que promoveu aumentos em torno de 3,3× e 2,4× (p<0,001; Tukey), respectivamente, quando comparados ao controle. Ainda, a expressão de DMP1 foi afetada (F=3,76; p=0,027; ANOVA) pelas formulações PCL+1%nHA e PCL+2%nHA, que aumentaram sua expressão por volta de 2,5× em relação ao controle (p≤0,042; Tukey) (Figura 18b). Para dosagem de proteínas totais (Figura 19a), houve efeito de interação entre os fatores (F=3,07; p=0,035; ANOVA a dois fatores). Comparando os efeitos da interação, apenas a formulação PCL+2%nHA apresentou maior quantidade de proteínas totais aos 21 dias em relação ao período anterior (p<0,001; Sidak; Figura 19a). Dentro do mesmo período, aos 21 dias as diferentes formulações de scaffolds apresentaram efeito significativo (F=6,62; p=0,001; ANOVA a dois fatores), concentração-dependente, e as formulações PCL+1%nHA e PCL+2%nHA apresentaram maior quantidade de proteínas (p≤0,026; Sidak). Para a atividade de fosfatase alcalina (Figura 19b), não houve efeito de interação entre os fatores (F=2,42; p=0,075; ANOVA a dois fatores). A comparação entre os efeitos principais indicou que o efeito da formulação foi significante (F=5,19; p=0,003; ANOVA a dois fatores) e, em geral, houve 59 aumentou da atividade de fosfatase alcalina na presença de nHA, sem diferenças entre as concentrações avaliadas (p≤0,009; Sidak). Ainda, a atividade enzimática foi sempre maior aos 21 dias de análise (F=75,24; p<0,001; ANOVA a dois fatores). Figura 19 – Gráfico de barras representando (a) dosagem de proteínas totais (µg/mL) e (b) atividade de fosfatase alcalina (U/µg) de HDPCs cultivadas sobre os scaffolds nos períodos de 14 e 21 dias. Números representam média (desvio- padrão), também representados pelas colunas e barras de erro, respectivamente. Letras maiúsculas comparam as formulações entre os períodos de avaliação e letras minúsculas comparam as formulações para o mesmo período. Letras diferentes indicam diferença estatística (ANOVA a dois fatores e Sidak; n=8; α=5%). Fonte: Elaboração própria 60 Os scaffolds formulados tiveram efeito significativo sobre a produção de matriz mineralizada por HDPCs (F=236,59; p<0,001; ANOVA de Welch; Figura 20). Todas as concentrações de nHA promoveram aumento significativo na produção de nódulos de mineralização em relação ao controle (p<0,001; Games- Howell) de maneira concentração-dependente (p<0,001 para todas as comparações múltiplas; Games-Howell), com a maior magnitude (aproximadamente 9 em relação ao controle) observada para o grupo PCL+2%nHA (Figura 20). Figura 20 – (a) Formação de matriz mineralizada (% relativa ao controle) após 21 dias do cultivo de HDPCs sobre as formulações de scaffolds. Números representam média (desvio-padrão), também representados pelas colunas e barras de erro, respectivamente. Letras diferentes indicam efeito significativo (ANOVA de Welch e Games-Howell; n=8; α=5%). (b) Painel de imagens (15) representativas dos scaffolds submetidos à coloração com Alizarin Red. Notar a presença de matriz mineralizada em scaffolds submetidos à cultura celular e a ausência em amostras que não entraram em contato com células. Fonte: Elaboração própria 61 6 DISCUSSÃO Em busca de novas estratégias para a TPV, este estudo investigou a incorporação de nHA em scaffolds nanofibrilares de PCL para estimular de forma citocompatível o potencial regenerativo de células pulpares. Os parâmetros de eletrofiação utilizados neste estudo produziram fibras com disposição aleatória, altamente interconectadas, que permitiram adesão, espalhamento e proliferação de HDPCs. A citocompatibilidade do PCL foi comprovada no presente estudo por meio dos testes de viabilidade, proliferação, adesão e espalhamento celular, assim como em estudos prévios63,74. Ademais, quando HDPCs foram semeadas sobre a superfície nanofibrilar houve aumento expressivo de viabilidade em comparação as células semeadas sobre lamínulas de vidro. Biomateriais com nano a micro topografia fibrilar favorecem diversas funções celulares, uma vez que o aumento da área de superfície e uma rede interconectada estimula trocas metabólicas, mudanças morfológicas e modulação da expressão gênica ao simular a MEC10,12,65. A topografia nanofibrilar interconectada dos scaffolds sintetizados no presente estudo foi confirmada em MEV, independentemente da incorporação da fase mineral. Para que scaffolds à base de PCL promovam processos regenerativos, é imprescindível melhorar suas propriedades físico-químicas de acordo com as demandas do tecido perdido18. Assim, diferentes concentrações de nHA foram incorporadas a solução polimérica de PCL previamente ao processo de eletrofiação para gerar scaffolds nanofibrilares funcionalizados. Concentrações maiores de 2% interferem negativamente na eletrofiação devido a aglomeração excessiva de partículas29,31,85,86. A incorporação da nHA foi confirmada por EDS, a qual resultou em nanofibras com superfície mais rugosa devido à maior aglomeração de partículas, sugerindo que a intensidade dessa característica seja diretamente proporcional à concentração de nHA incorporada. Morfologia, diâmetro e distribuição das nanofibras são fatores importantes para a regeneração tecidual. Scaffolds devem propiciar um microambiente adequado para a ancoragem celular e permitir trocas de nutrientes e metabólitos entre as células e o meio, assim como sinalização intercelular10. O diâmetro e a 62 porcentagem de espaço interfibrilar observados para o grupo PCL sem adição de nHA estão de acordo com a literatura63,74, confirmando sua reprodutibilidade por eletrofiação. Dentre as formulações, PCL+0,5%nHA promoveu ampliação significativa do diâmetro fibrilar, enquanto PCL+2%nHA aumentou os espaços da malha interfibrilar. A suspensão de quantidades diferentes de nanopartículas e o tipo de solvente podem modular a condutividade da solução polimérica submetida a eletrofiação87,88. Como a hidroxiapatita apresenta uma característica de condutor aniônico unidimensional89, o aumento da concentração de partículas de nHA pode aumentar diretamente a condutividade elétrica da solução, favorecendo a eletrofiação de fibras menos calibrosas90. Essa característica pode justificar a alteração da frequência do número de fibras com diâmetro em torno de 800 nm para 600 nm, em função do aumento da concentração da fase mineral. Além disso, o aumento nos espaços interfibrilares para a formulação PCL+2%nHA pode ser explicado por oscilações de campo elétrico promovidas pela maior concentração de nHA, que pode contribuir para fornecer um perfil de disposição espaçado entre camadas de fibras com diâmetros variados90. O comportamento de solubilidade dos scaffolds é relevante para permitir a sua substituição gradual pelo novo tecido5. Todas as formulações avaliadas apresentaram um perfil de degradação equivalente às taxas de degradação in vitro e in vivo previamente relatadas para PCL, que variam de 2 a 4 anos14,18,91. Sob condições fisiológicas no corpo humano, o principal mecanismo de degradação do PCL ocorre por hidrólise não enzimática das ligações éster19. Embora a incorporação nHA aumente o grau de hidrofilia do PCL em função da presença de íons hidroxila86,88, partículas inorgânicas podem retardar o processo de degradação de polímeros sintéticos por atuarem como uma barreira física para o transporte de massa92. Isso pode explicar o comportamento lento e semelhante de degradação independente da concentração de nHA incorporada. Ainda, as formulações de scaffolds obtidas neste estudo podem ser adequadas para permitir a formação de um tecido mineralizado e manter o selamento da exposição a longo prazo2. 63 Componentes bioativos liberados dos materiais à base de silicato de cálcio indicados para capeamento pulpar direto são capazes de modular a expressão gênica de HDPCs e favorecer o processo de mineralização93. Uma propriedade de destaque do PCL é a sua permissividade para a incorporação desses componentes14. Uma vez incorporadas na matriz polimérica, os scaffolds devem permitir a liberação gradativa das moléculas bioativas para o microambiente13. Portanto, no presente estudo também foi investigada a liberação de íons Ca2+ e Pi provenientes das partículas de nHA e a subsequente modulação do pH do meio. A maior e mais duradoura liberação de Ca2+ foi