UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Angélica Letícia Reis Pavanelli Efeito do tratamento sistêmico com tanshinona na modulação da doença periodontal experimental: estudo em camundongos Araraquara 2022 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Angélica Letícia Reis Pavanelli Efeito do tratamento sistêmico com tanshinona na modulação da doença periodontal experimental: estudo em camundongos Orientador: Prof. Dr. Rafael Scaf de Molon Coorientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli Araraquara 2022 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia - Área de Concentração em Periodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como pré-requisito para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Angélica Letícia Reis Pavanelli Efeito do tratamento sistêmico com tanshinona na modulação da doença periodontal experimental: estudo em camundongos Comissão julgadora Dissertação para obtenção do título de Mestre em Odontologia Presidente e orientador: Prof. Dr. Rafael Scaf de Molon 2° Examinador: Prof. Dr. Pedro Paulo Chaves de Souza 3° Examinador: Prof. Dr. João Paulo Steffens 4° Examinador: Prof.ª Drª. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga 5° Examinador: Prof. Dr. Jônatas Caldeira Esteves Araraquara, 30 de março de 2022. DADOS CURRICULARES Angélica Letícia Reis Pavanelli NASCIMENTO: 31 de dezembro de 1990 – Araraquara – SP FILIAÇÃO: Valdinei Rodrigues Reis Ana Paula Mutti Reis 2011-2015 Graduação em Administração pelo Centro Universitário Estácio 2016-2019 Curso de Graduação em Odontologia pela Universidade de Araraquara – UNIARA 2020-2022 Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Periodontia, Nível de Mestrado na Faculdade de Odontologia pela Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Dedico este trabalho... A Deus, pelo dom da vida, por me guiar até aqui. Por me mostrar que tudo posso, pois é Ele quem me fortalece. Por estar presente nos meus momentos de angústia e de alegria. Sou imensamente grata pela oportunidade que Ele me proporcionou em cursar Odontologia, um sonho que se tornou realidade. Agradeço pelas pessoas que Deus colocou na minha vida ao longo dos estudos. Aos meus pais, Ana Paula e Valdinei, sou grata pela educação e ensinamentos na fé cristã, por todas as leituras bíblicas e tardes nas quais nos reuníamos na sala de casa para meditar na palavra e agradecer a Deus. Pelo incentivo nos estudos desde cedo, por todo esforço que fizeram para que eu e meus irmãos pudéssemos ter o melhor e sempre nos mostrando o caminho correto a seguir, Cristo! Eu amo vocês. Aos meus irmãos, Mateus e André Thiago, por todo carinho, incentivo, apoio. Por sete anos fui filha única, mas quando vocês chegaram a minha vida de fato se completou e teve mais alegria. Eu amo vocês! Ao meu esposo, Braian Por todo apoio, compreensão e carinho durante meus estudos. Por ter sido o primeiro a me incentivar a cursar a graduação, mestrado e futuro doutorado. Por todas as palavras de carinho e amor, por dar sentido e fazer a diferença na minha vida. Tudo com você ao meu lado é mais fácil, mais leve, você é meu porto seguro. Eu te amo. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu orientador Prof. Dr. Rafael Scaf de Molon Muito obrigada querido professor. Obrigada pelos ensinamentos, pela confiança pela paciência em ensinar e me conduzir nesse trabalho. Agradeço a Deus por permitir tê-lo como meu orientador, por confiar no meu potencial, por me encorajar a crescer na vida acadêmica. Sou grata pela sua sinceridade em todo nosso caminhar, pelo seu exemplo como pessoa e profissional. Meu muito obrigada professor, sempre terei o carinho, admiração e respeito. Ao meu coorientador Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli Pelas orientações, ensinamentos durante o trabalho científ ico. Por ser tão acolhedor e prestativo em todos os momentos que precisei de esclarecimentos com relação ao mestrado. Por me ensinar a importância de se anotar tudo durante o desenvolvimento do trabalho, por me ensinar a ter paciência e fé nos estudos. Sou grata pela oportunidade que tive de conviver com o senhor, um exemplo de pessoa e profissional. Meu muito obrigada professor. A Profª. Drª. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga Minhas primeiras aulas no mestrado foram com a professora e eu nunca vou me esquecer da nossa conversa no último dia da disciplina de genética. Professora, você fez toda a diferença para que eu continuasse com os meus estudos. Como a professora mesmo disse “Meu conselho para você não é como professora e sim como mãe!” Obrigada, obrigada pelo carinho, pela atenção, por me ensinar a fazer extração e quantificação de RNA e as demais análises de PCR. Eu aprendi muito com você professora, aprendi a ter fé em primeiro lugar e me dedicar em tudo. A Sâmmea Por toda parceria durante as atividades desenvolvidas no biotério, por compartilhar comigo momentos de choro e risos. Por ser tão compreensiva e dizer sempre “Fé que vai dar tudo certo.” Você foi a primeira pessoa com quem tive contato no mestrado e foi um prazer poder fazer esse trabalho científico com você. Espero ter essa amizade para toda vida. Meu muito obrigada minha amiga. Ao Ângelo Por toda ajuda, apoio durante o mestrado, pela amizade que espero levar para toda a vida. A Camila Camila, você foi minha orientadora, minha professora, mentora e minha amiga de fato. Obrigada por todos os ensinamentos, dedicação, carinho e atenção para comigo. Sempre se mostrando extremamente prestativa e atenciosa, obrigada pelos conselhos, dicas, pelas conversas e risadas. Obrigada por me acolher, tenho certeza de que nossa amizade permanecerá ao longo de nossas vidas. Aos amigos da pós-graduação Aos meus amigos, Ísis de Fátima Balderrama, Maria Eduarda Scordamaia Lopes, Álvaro Pelegrin, Barbara Roque da Silva, Ana Flávia Cassiano, Vitória Fiscarelli, Bruno Graciliano Silva, pela amizade, pelas trocas de experiências e aprendizados. AGRADECIMENTOS À Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP Ao Diretor Prof. Dr. Edson Alves de Campos e a Vice-Diretora, Profa. Dra. Patrícia P. Nordi Sasso Garcia. À Coordenação do Pós-Graduação em Odontologia, Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, representada pelo coordenador Prof. Dr. Paulo Sergio Cerrie pela Vice-coordenadora Profª. Drª. Morgana Rodrigues Guimarães- Stabili. Pela enorme admiração, pela competência, dedicação, responsabilidade e exemplo de conduta e profissionalismo. Aos docentes do curso de Pós-Graduação em Odontologia, Periodontia da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP Obrigada por toda formação, orientação e exemplo de dedicação e conduta profissional. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior, CAPES: o presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001 e recursos constantes do Processo CEUA nº 19/2020. A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP A todas as pessoas que participaram direta ou indiretamente na realização desse trabalho, e que não estão citadas nominalmente, meus sinceros agradecimentos. “Sabemos que Deus age em todas as coisas para o bem daqueles que o amam, dos que foram chamados de acordo com o seu propósito”. Romanos 8,28  Bíblia de Jerusalém. Romanos, 8, 28. Nova edição, revista e ampliada. 10ª impressão. São Paulo: Paulus, 2002 Pavanelli ALR. Efeito do tratamento sistêmico com tanshinona na modulação da doença periodontal experimental: estudo em camundongos [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2022. Resumo A periodontite é uma doença inflamatória crônica, altamente prevalente, de etiologia multicausal e que se desenvolve como resultado de complexas interações parasita- hospedeiro. Se não tratada, ela resulta na reabsorção do tecido conjuntivo mineralizado e não mineralizado ao redor dos dentes. O processo inflamatório próximo ao esqueleto leva a um fenótipo clínico de perda óssea, observado em diversas patologias, como artrose, artrite reumatoide e doença periodontal (DP). Esse processo é dependente da diferenciação e atividade de osteoclastos, as células responsáveis por reabsorver o tecido ósseo. Desta forma, a inibição da diferenciação ou da atividade dessas células é uma estratégia viável para o controle da reabsorção óssea. A Tanshinona é uma substância natural da Salvia miltiorrhiza (Danshen) que emergiu recentemente como fármacos promissores na redução do fenótipo osteoporótico em camundongos. Tais compostos são capazes de inibir especificamente a atividade colagenolítica da catepsina K, enzima secretada pelos osteoclastos que participa da degradação da fase orgânica da matriz óssea, sem interferir na diferenciação de osteoclastos. Porém, os efeitos desses fármacos na inibição da perda óssea causada por inflamação não estão bem elucidados. Sendo assim, o presente estudo apresenta como objetivo avaliar os efeitos desses fármacos como tratamento sistêmico na modulação da DP experimental. Para isto, foram utilizados camundongos C57BL6/J, machos distribuídos em 4 grupos experimentais (n=10), conforme descritos: grupo doença periodontal (DP), grupo tanshinona TIIA (TIIA), grupo tanshinona T06 (T06), e o Grupo Controle (C). Os animais dos grupos DP, TIIA e T06 receberam indução experimental de DP por meio da colocação de ligaduras. As tanshinonas foram administradas diariamente por 10 dias para o grupo TIIA e T06, e o Grupo DP obteve o tratamento com solução veículo (água) por meio de gavagem oral. Após esse período os animais foram eutanasiados. As amostras obtidas foram utilizadas para avaliação do processo imuno-inflamatório presente no tecido gengival, por meio de análise de RT-PCR em tempo real. A avaliação da perda óssea alveolar foi avaliada por microtomografia computadorizada (μCT). O grupo DP apresentou significante perda óssea alveolar, no período de 10 dias, comparado ao grupo controle e os demais grupos TIIA e T06. Houve aumento significante na expressão gênica do mediador inflamatório IL-1b e na catepsina K envolvida no processo de osteoclastogênese para o grupo DP em relação ao grupo controle. Essas expressões se mostraram menores nos grupos TIIA e T06 comparados ao grupo DP. Com base nos achados do presente estudo, sugere-se que as tanshinonas (TIIA e T06) são estratégias promissoras na modulação da DP experimental em camundongos. Palavras - chave: Catepsina K. Doenças periodontais. Perda do osso alveolar. Osteoclastos. Pavanelli ALR. Effect of systemic treatment with tanshinone on the modulation of experimental periodontitis: study in mice [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2022. Abstract Periodontitis is a highly prevalent chronic inflammatory disease of multicausal etiology that develops as a result of complex host parasite interactions. If left untreated, it results in the resorption of mineralized and non-mineralized connective tissue of the teeth. The inflammatory process near the skeleton leads to a clinical phenotype of bone loss, observed in several pathologies, such as arthrosis, rheumatoid arthritis and periodontal disease (PD). This process is dependent on the activity of osteoclasts, the cells responsible for the resorption of the bone tissue. This process is dependent on the differentiation and activity of osteoclasts, the cells responsible for resorbing bone tissue. Thus, inhibition of differentiation or activity of these cells is a viable strategy to control bone resorption. Tanshinone is a natural substance from Salvia miltiorrhiza (Danshen) that has appeared as promising drugs in reducing the osteoporotic phenotype in mice. Such compounds are capable of specifically inhibiting the collagenolytic activity of cathepsin K, an enzyme secreted by osteoclasts that participates in the degradation of the organic phase of the bone matrix, without interfering with osteoclast differentiation. However, the effects of these drugs in inhibiting bone loss caused by inflammation are not well understood. Therefore, the present study aims to evaluate the effects of these drugs as a systemic treatment in the modulation of experimental PD. For this, C57BL6/J male mice were distributed into 4 experimental groups (n=10), as described: periodontal disease (PD) group, TIIA tanshinone group (TIIA), T06 tanshinone group (T06), and the control Group. (C). The animals in the PD, TIIA and T06 groups received experimental induction of PD through the placement of ligatures. The tanshinones were administered daily for 10 days for the TIIA and T06 groups, and the DP group was treated with vehicle solution (water) through oral gavage. After this period, the animals were euthanized. The samples obtained were used to evaluate the immuno- inflammatory process present in the gingival tissue by means of real-time RT-PCR analysis. Assessment of alveolar bone loss was evaluated by micro computed tomography (μCT). The PD group showed significant alveolar bone loss within 10 days, compared to the control group and the other TIIA and T06 groups. There was a significant increase in the gene expression of the inflammatory mediator IL-1b and in the cathepsin K involved in the osteoclastogenesis process for the PD group compared to the control group. These expressions were lower in the TIIA and T06 groups compared to the PD group. Based on the findings of the present study, it is suggested that tanshinones (TIIA and T06) are a promising strategy in modulating experimental periodontal disease in mice. Keywords: Cathepsin K. Periodontal diseases. Alveolar Bone Loss. Osteoclasts. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 14 2 PROPOSIÇÃO ............................................................................................................. 18 2.1Objetivo geral ............................................................................................................ 18 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 18 3 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 19 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 23 4.1 Tanshinonas ............................................................................................................. 23 4.2 Desenho experimental ............................................................................................. 23 4.3 Indução da doença periodontal................................................................................ 24 4.4 Administração das tanhinonas TIIA e T06 (sódio sulfonato) ................................... 25 4.5 Sacrifício e coleta das amostras .............................................................................. 25 4.6 Análise microtomográfica ........................................................................................ 26 4.7 Reação de polimerase em cadeia (RT-qPCR) .......................................................... 27 4.8 Análise estatística .................................................................................................... 28 5 RESULTADOS ............................................................................................................. 30 5.1 Anélise de μCT ......................................................................................................... 30 5.2 RT-qPCR ................................................................................................................... 33 6 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 34 7 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 37 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 38 ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA............................................................................... 45 APÊNDICE A – PUPLICAÇÃO ................................................................................ 46 14 1 INTRODUÇÃO A doença periodontal (DP) é uma doença inflamatória crônica, de origem multicausal que se desenvolve a partir de complexas interações parasito-hospedeiro associado a presença de um biofilme disbiótico, e que se caracteriza pela destruição das estruturas de suporte do dente como gengiva, ligamento periodontal, osso alveolar e cemento1, 2. O início e a progressão da DP estão relacionados a múltiplos fatores etiológicos e de risco, sendo o biofilme bacteriano o principal fator etiológico e o desequilíbrio entre uma infecção localizada e uma resposta inflamatória exagerada do hospedeiro, desempenha papel importante na determinação dos danos as estruturas de suporte dentário3. A periodontite é a principal causa de perda dentária em todo o mundo e um fator de risco significativo para doenças sistêmicas, como diabetes, doenças cardíacas, artrite reumatoide, obesidade, aterosclerose3, 4. Diversas moléculas e citocinas pró-inflamatórias desempenham papéis importantes no processo da DP, como por exemplo a Interleucina-1b (IL-1b) e o Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α). A IL-1b pertence à família IL-1 e é produzida principalmente por monócitos, macrófagos e células dendríticas. IL-1b induz a ativação transcricional do gene Factor Nuclear kappa B (NF-kb) para expressar moléculas de adesão e citocinas. Também aumenta a expressão de moléculas de adesão endotelial, promovendo o acúmulo de outras células inflamatórias no endotélio5. TNF-α além de inibir e matar células tumorais, pode estimular a resposta inflamatória e aumento da expressão de outras citocinas pró-inflamatórias. Linfócitos estimulados por antígenos como células B e T também são importantes no processo da DP. As funções dos linfócitos T incluem ativar fagócitos, causar apoptose em células infectadas e auxiliar as células B, que além de produzir anticorpos, também são responsáveis por apresentar antígenos às células T6, 7. Na doença periodontal, o processo reabsorção óssea pode ser observado com o avanço da doença. Esse processo é constituido de várias etapas que começa com a proliferação de precursores de osteoclastos imaturos, depois a diferenciação e maturação desse tipo de célula e, finalmente, a degradação da matriz orgânica e inorgânica do tecido ósseo8. A osteoclastogênese é mediada por diversos eventos incluindo moléculas pró-inflamatórias e citocinas assim como o envolvimento do eixo RANKL/RANK/OPG, os quais realizam funções em lesões patológicas envolvendo inflamação crônica. O RANKL trata-se de uma proteína importante na 15 osteoclastogênese, pois ele liga-se ao RANK na superfície dos pré-osteoclastos e osteoclastos, motivando a diferenciação dos pré-osteoclastos e a ativação dos osteoclastos maduros, impossibilitando assim a apoptose dos osteoclastos maduros9, 10. A OPG, uma proteína solúvel que age como receptor e tem propriedades adversa ao RANKL, acaba impedindo sua ligação ao RANK, e consequentemente a diminuição da osteoclastogênese. RANKL e OPG super regulados tem se mostrado envolvidos em diversas doenças, como osteoporose, artrite reumatoide, DP. Na doença periodontal quando um desequilíbrio entre essas citocinas ocorre, ocasiona uma produção maior de RANKL, resultando em um aumento da reabsorção óssea e consequentemente na perda dos dentes11. O tratamento da DP inclui mudança de comportamento por parte do paciente como instruções de higiene bucal, cessação do tabagismo, controle de doenças sistêmicas e sequencialmente, o tratamento periodontal não cirúrgico. Este consiste em raspagem e alisamento radicular (RAR) para remoção da placa e cálculo afim de controlar a infecção periodontal e interromper a progressão da doença12, 13. No entanto, mesmo após a conclusão do tratamento não cirúrgico, alguns pacientes podem não apresentar um resultado satisfatório, necessitando assim do uso de terapias adjuvantes. Estudos têm investigado o uso de fármacos que modulam a resposta imune, como terapia adjuvante para as doenças periodontais14, 15. A catepsina K é uma protease cisteína que está envolvida na regulação da reabsorção óssea e pode ser encontrada em osteoclastos. Elas degradam colágeno tipo I e tipo II, componentes predominantes da matriz extracelular óssea16, 17. Estudos têm evidenciado que poder controlar a expressão da catepsina K frente a reabsorção óssea, pode gerar um efeito terapêutico satisfatório para o sistema ósseo durante a progressão da periodontite18, 19. Agentes moduladores da resposta imune tem se destacado recentemente devido a sua ação inibitória frente a catepsina K, como o odanacatib, e os inibidores de cistatinas20-22. As administrações de compostos naturais como terapia complementar para as DPs têm se mostrado favorável no decorrer dos últimos anos e estudos avaliando os efeitos benéficos do curcumin, fitocistatina, e suplementação com ômega-3 na modulação da resposta imune do hospedeiro, apontaram seus efeitos anti- inflamatório, antirreabsortivo e reparador, o que pode classificar tais compostos naturais como possíveis abordagens terapêuticas adjuvantes para doenças periodontais23-27, como por exemplo a Salvia miltiorrhiza, que é uma planta 16 originaria da China e suas raízes podem ser utilizadas após serem secas, obtendo- se um pó. Seu uso segundo a tradicional medicina chinesa pode ser direcionado para o coração, fígado, para tratar distúrbios menstruais, reumatismo, osteoporose, entre outras doenças28. As Tanshinonas são quinonas diterpenóides lipossolúveis isoladas das raízes secas da Salvia miltiorrhiza29. As principais tanshinonas isoladas são: 15,16-di-hidrotanshinona (DT), tansinona I (TI), criptotansinona (CT) e tansinona IIA (TIIA)30, 31. Estudos têm investigado a ação das tanshinonas32-34 sendo que um deles relatou que a hidrotanshinona (DT) poderia bloquear seletivamente a atividade da colagenase da Catepsina K sem interferir na atividade da protease e osteoclastogênese32. Já a TIIA e CT em um experimento in vitro mostraram que possuem efeito anti-inflamatório devido a sua ação em inibir a ativação da via do fator nuclear kappa B (NF-κB)33, apontando assim o potencial das tanshinonas como um agente anti-osteoporótico. Figura 1 - Estrutura molecular das principais Tanshinonas Fonte: Elaboração própria. Recentemente, um derivado solúvel da Tanshinona IIA (TIIA), a Tanshinona- IIA sulfonato (T06), foi sintetizado e caracterizado em relação à sua atividade de inibir a reabsorção óssea34. Tal composto se mostrou eficaz na redução do fenótipo osteoporótico em camundongos fêmeas ovariectomizadas, sem inibir a diferenciação dos osteoclastos, o que torna esse composto bastante promissor34. Em contraste, estudo prévio utilizando a Tanshinona IIA demonstrou o potencial deste composto em inibir osteoclastogênese35. Sua eficácia também foi observada em um estudo in vitro utilizando-se macrófagos da medula óssea de camundongos estimulados por lipopolissacarídeo (LPS). A TIIA inibiu a geração de espécies reativas de oxigênio, destacando sua ação anti-inflamatória por meio da regulação metabólica e redox36. Há estudos sobre a ação efetiva da TIIA na inibição da 17 atividade da renina e na redução da expressão de angiotensina II (ANG II), uma enzima que desempenha função na indução do desenvolvimento de osteopenia e osteoporose. Tal redução contribuiu para a melhora na densidade mineral óssea em camundongos diabéticos37. Já na consolidação de fraturas, estudo in vitro e in vivo demonstraram que a TIIA possui efeito benéfico, contribuindo para o aumento da deposição de cálcio, atividade de fosfatase alcalina (ALP), colágeno tipo I e aumento da área de calo ósseo. Esses resultados demonstram que a TIIA tem ação positiva também sobre os osteoblastos38. O mecanismo de proteção da TIIA na diferenciação de osteoclastos foi avaliado por Cheng et al39 em camundongos C57BL/6 fêmeas com ovariectomia. Esse estudo identificou que o tratamento com tanshinona IIA inibiu a ativação mediada por RANKL das vias de sinalização de NF-κB, MAPK (Proteínas Quinases Ativadas por Mitogênio) e Akt (Proteína quinase B) durante a osteoclastogênese39. Embora alguns estudos in vitro e in vivo tenham indicado as propriedades anti- inflamatórias e anti-osteolíticas da administração sistêmica das tanshinonas, especialmente para o tratamento de doenças ósseas metabólicas como a osteoporose28, 37, 40, nenhum estudo, até o momento, têm demonstrado os efeitos da administração sistêmica das tanshinonas sobre a reabsorção óssea inflamatória, como no caso das doenças periodontais. Portanto, considerando as características sítio-especifica e a natureza inflamatória da DP, e a capacidade antirreabsortiva e anti-inflamatória da Tanshinona, este estudo foi delimitado com o objetivo de avaliarmos o efeito do tratamento sistêmico das tanshinonas TIIA e T06 na modulação da doença periodontal experimental em camundongos. 18 2 PROPOSIÇÃO 2.1 Objetivo geral O objetivo geral desse estudo foi avaliar o potencial das tanshinonas TIIA e T06 em inibir a reabsorção óssea e o processo inflamatório em modelo de periodontite induzido por ligadura em camundongos. 2.2 Objetivos específicos Determinar o efeito das tanshinonas TIIA e T06 na progressão da perda óssea experimental induzida pela colocação de ligadura por meio de análise microtomográfica. Foi avaliado a densidade mineral óssea (BMD), a microarquitetura trabecular (Tb.Th, Tb.N, Tb.Sp) e o volume ósseo (BV/TV) nas maxilas. Avaliar a influência das tanshinonas sobre a expressão de marcadores de reabsorção óssea (catepsina K, IL-1ß, TNF-a e RANKL) em nível de mRNA, através de RT-qPCR. 19 3 REVISÃO DE LITERATURA Diversos estudos tem demonstrado os benefícios das tanshinonas perante as doenças inflamatórias41, 42, 43 como a osteoartrite ou artrose que é uma doença que se caracteriza pelo desgaste da cartilagem articular e por alterações ósseas e que está associada também ao envelhecimento que envolve inflamação crônica44, degradação da matriz na cartilagem e formação anormal de aglomerados de condrócitos45. Essa doença limita os movimentos do paciente e atividades simples como camilhar, movimentar os braços, afetando a qualidade de vida. Os tratamentos atuais para a osteoartrite visam o controle da dor e em casos mais severos pode ocorrer a substituição da articulação afetada por meio de cirurgias46 . Nesse contexto, Wang et al. avaliaram a ação da tanshinona I na osteoartrite, utilizando células de condrócitos CHON-001. As células CHON-001 foram tratadas com IL-1β (10 ng / mL) durante 72 horas para induzir o modelo de osteartrite, depois foram pré-tratadas com 20 μM de Tansinona I por 24 horas e em seguida estimuladas com IL-1β (10 ng / mL) por mais 72 horas. Análises foram realizadas por meio de ensaios de CCK-8, imunofluorescência, citometria de fluxo e Western blotting. Os resultados mostraram que a Tansinona I inibiu a degradação da cartilagem articular in vitro. O estudo mostrou que a expressão de NF-κB estava aumentada em células CHON-001 estimuladas por IL-1β, e foram revertidos por meio do tratamento com Tansinona I, apontando assim, que a Tanshinona I pode aliviar a progressão da osteoartrite por meio da supressão do nível de NF-κB42. Já Zhang et al. avaliaram o efeito protetor da tansinona IIA contra a desdiferenciação de condrócitos. O estudo foi realizado com condrócitos coletados das articulações dos joelhos de ratos, utilizando o método de digestão com colagenase. Os condrócitos foram cultivados em meio basal com várias concentrações de TIIA, 100, 200 e 400 µg / mL. Foram realizadas análises histológicas e de RT-qPCR e os resultados mostraram que a TIIA inibiu a regressão de condrócitos e ocasionou proliferação e a viabilidade dos condrócitos nas concentrações para todas as concentrações. O estudo sugere que o efeito da TIIA pode ser mediado por vários mecanismos regulatórios como SOX6, um fator de transcrição importante para o desenvolvimento da cartilagem37. Jia et al. também avaliaram a tanshinona TIIA na degradação da cartilagem articular em um modelo de osteoartrite de rato e demonstraram que a tansinona IIA preveniu a degradação 20 da cartilagem articular por meio da inibição da apoptose de condrócitos e secreção de citocinas inflamatórias e também aumentou os níveis de expressão de TGF-β (Fator de crescimento transformador beta) e de proteínas morfogenéticas ósseas47. Medicamentos como prednisona, dexametasona são glicocorticóides muito utilizados devido aos seus efeitos anti-inflamatórios48. Estudo relatam que a ingestão de glicocorticóides em altas doses e por um longo período, acaba agindo como um dos principais contribuintes para apoptose de osteócitos49, 50. Li et al. avaliaram a hipótese de que TIIA antagoniza a apoptose induzida por glicocorticóides, por meio da inibição da produção de ROS em células MC3T3-E1 (pré-osteoblastos de murinos) e investigaram também, qual mecanismo é responsável por esse efeito. O estudo buscou fornecer uma nova estratégia para a prevenção contra a osteoporose induzida por glicocorticóides. Assim sendo, utilizaram células MC3T3-E1 e a apoptose de osteoblastos foi induzida por dexametasona. Após a indução, realizaram o tratamento com 1 μM de TIIa por 24 h. Análises por meio de ensaios de MTT e Tunel, Western blot, ROS e análise de apoptose por citometria de fluxo foram realizadas nas amostras. Os resultados mostraram que a TIIA inibiu a apoptose celular induzida por glicocorticóide por meio da inativação de Nox4 (enzima NADPH oxidase) que é uma enzima expressa abundantemente em osteoblastos, mostrando assim os benefícios das tanshinonas como possível farmaco para doenças que causam de reabesorção óssea51. A osteoclastogênese é o processo pelo qual as células da linhagem hematopoiética se diferenciam em osteoclastos maduros. Um desequilíbrio na ação dos osteoclastos favorece uma maior reabsorção óssea, o que pode levar a osteoporose, uma doença óssea sistêmica que causa perda e deterioração óssea, levando à fragilidade óssea e risco de fraturas52, 53. No processo da reabsorção óssea podemos destacar três moléculas principais; o Receptor Ativador do Fator Nuclear Kappa (RANK), Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear Kappa(RANKL) e Osteoprotegerina(OPG)54. RANK trata-se de um receptor expresso por pré-osteoclastos e osteoclastos. Já o RANKL é uma proteína produzida por osteoblastos e células estromais da medula, ele se liga ao RANK na superfície dos pré-osteoclastos e osteoclastos, induzindo assim a diferenciação das células progenitoras ósseas e estimulando a função dos osteoclastos maduros. OPG é um receptor regulador da sinalização de RANKL e atua bloqueando a ligação com seu receptor RANK, interferindo assim no processo de 21 diferenciação dos osteoclastos. Compreender as vias de sinalização e mecanismo da osteoclastogênese é importante para que se possa avaliar possíveis alvos terapêuticos para tratamento de doenças que acometem o tecido ósseo55, 56. O Denosumab é um farmaco que atua de forma semelhante ao OPG, que é um receptor para RANKL. Denosumab se liga ao RANKL e o impede de se ligar ao seu receptor RANK, de modo que a via de sinalização RANK não é ativada, prejudicando a diferenciação, função e ocasionando apoptose de precursores de osteoclastos, resultando na inibição da reabsorção óssea57. Os Bisfosfonatos diferentemente do Denosumab, atuam nos osteoclastos e não nos seus precursores. Eles são internalizados em osteoclastos e inibem a FPP sintase, uma enzima chave na via de sinalização do mevalonato. Isso resulta em prenilação proteica intracelular prejudicada, afetando a função dos osteoclastos e levando à apoptose, dessa forma, a reabsorção óssea é inibida58. No entanto, a aplicação clínica dos Bisfosfonatos é limitada devido o risco de desenvolvimento de osteonecrose dos maxilares após sua administração59. Outro farmaco que apresentou notáveis resultados perante a inibição da reabsorção óssea foi o Odanacatib, inibindo a Catepsina K (CatK), uma protease degradadora de colágeno ósseo em osteoclastos. Dessa forma o Odanacatib manteve a formação óssea sem alterações, porém seus ensaios clínicos foram encerrados em razão ao aumento dos efeitos colaterais cardiovasculares associados, como derrames60-62. Panwar e colaboradores em um estudo buscando um inibidor para doenças de reabsorção óssea criaram um novo conceito de inibição para a CatK. Nesse novo conceito denominado ectosterico que difere de alostérico, ocorre a inibição seletiva da catepsina K e não da célula toda (osteoclasto), pois observaram que produzir um composto muito seletivo como o caso Odanacatib, não foi vantajoso uma vez que, isso afetou as demais funções da CatK34. Assim sendo Panwar at al. realizaram um estudo com a Tanshinona IIA sulfonato (T06) em camundongos fêmeas ovariectomizadas, para analisarem os efeitos da T06 como inibidora da CatK. Os animais receberam por meio de gavagem a T06 na dosagem de 40 mg / kg durante 3 meses. Após esse período, os animais foram sacrificados e o tecido do útero, fêmur esquerdo e a vértebra lombar (L5) foram coletados para análises. O fêmur direito e o tecido do útero foram analisados por histologia, o sangue também foi coletado por punção cardíaca e usado para determinar a concentração plasmática de CTx-1 por meio de ELISA, a parte óssea também foi analisada por Micro-Ct. Os 22 resultados mostraram um aumento de volume ósseo e maior número trabecular nas regiões analisadas, assim como aumento no número de osteoblastos por perímetro ósseo e da concentração plasmática de pró-colágeno-1. Isso devido a ação que a T06 exerceu em bloquear a atividade da colagenase da catepsina K, exercendo a atividade antirreabsortiva34. Cui et al. também avaliaram o tratamento com tanshinona em ratas fêmeas com osteoporose induzida por ovariectomia e os dados obtidos nesse estudo sugerem que os efeitos protetores da tanshinona diminuíram a superfície de osteoclastos nas ratas ovariectomizadas devido a supressão da reabsorção óssea aumentada pela depleção de estrogênio. Os animais receberam uma dosagem de 200 mg/kg de tansinona total, administrada por via oral por um período de 10 semanas. Após o periodo foram sacrificados e a quarta vértebra lombar (L4) e metáfises proximais da tíbia foram coletadas para análises por meio de histomorfométria óssea e histologia. Os resultados mostraram um aumento de volume ósseo / volume de tecido e redução de osteocalcina / superfície óssea e da porcentagem de superfície de osteoclastos na quarta vértebra lombar e nas metáfises proximais da tíbia63. Outro estudo que avaliou os efeitos da TIIA em ratas Sprague Dawley com osteoporose induzida por ovariectomia, apontou que a possível regulação positiva de PHGDH pederia ser suficiente para atrasar o envelhecimento celular e suprimir a osteoporose primária64. O uso das tanshinonas tem se mostrado uma alternativa interessante para inibição da perda óssea. Todos os estudo ralizados com as tanshinonas podem ajudar a modular a resposta inflamatória do hospedeiro e melhorar a progressão da doença experimental, podendo ser um farmáco futuro para o tratamento de doenças que causam perda óssea como a doença periodontal. 23 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Tanshinonas A tanshinona TIIA (T4952) e a tanshinona T06 (sódio sulfonato) (SML2517) foram obtidas diretamente da empresa Sigma-Aldrich. A tanshinona-sulfonato (T06) é um derivado solúvel da tanshinona IIA diferindo-se apenas pela adição dos canais de potássio na molécula, conforme demonstrado nas imagens abaixo. Figura 2 – Estrutura molecular da Tanshinona TIIA e T06. Tanshinona TIIA Tanshinona IIA sulfonato (T06) Fonte: Elaboração própria. 4.2 Desenho experimental Para este estudo foram utilizados 40 camundongos C57BL6/J obtidos do biotério da Faculdade de Medicina de Botucatu (FM – UNESP) com 8 semanas de idade e com peso médio de 18-25g. Ao longo do período experimental, os camundongos foram mantidos nas instalações para animais do biotério da faculdade de Odontologia da UNESP de Araraquara com temperatura controlada (23° C ± 2° C), e humidade controladas, e com um ciclo de claro/escuro de 12 horas. Os animais foram alojados em gaiolas de plástico, alimentados com uma dieta de laboratório (Labina / Purina) e com água ad libitum. Os animais foram randomicamente distribuídos em 4 grupos experimentais, conforme descrito abaixo: 24 - Grupo C (controle) – Os animais não receberam nenhuma intervenção cirúrgica e nenhuma intervenção terapêutica; - Grupo DP – Os animais receberam indução da DP por meio da colocação de ligaduras e foram submetidos ao tratamento com solução veículo (água); - Grupo TIIa – Os animais receberam indução de DP por meio da colocação de ligaduras e foram submetidos ao tratamento diário com TIIa (40mg/kg); - Grupo T06 – Os animais receberam indução de DP por meio da colocação de ligaduras e foram submetidos ao tratamento diário com T06 (40mg/kg). As drogas foram administradas por gavagem 1x ao dia, durante todo o curso do experimento. A via de administração e dosagem foi escolhida baseada em estudos anteriores com TIIA (35). 4.3 Indução da doença periodontal A indução da DP pela colocação de ligaduras foi realizada como descrito previamente65,66. Após a anestesia geral com Quetamina (80 mg/kg) e Xilasina (10 mg/kg) administrada por injeção intramuscular, os animais foram posicionados em decúbito dorsal sobre o aparato cirúrgico e, com auxílio de um suporte, a boca permaneceu aberta ao longo da manipulação. Com a boca aberta e língua imobilizada, uma sonda periodontal foi inserida entre o primeiro e segundo molar superior a fim de proporcionar espaço para a colocação do fio. Assim, com o uso de uma pinça adaptada, o fio de nylon (Ethicon 6.0) foi inserido entre os molares e, após seu posicionamento correto, foi amarrado ao redor da cervical do dente (Figura 3). O ressecamento da língua e dos olhos do animal, devido ao tempo que permaneceu parado com os olhos e boca abertos, foi controlado com irrigação com solução salina (NaCl 0,9%). As ligaduras foram instaladas no início do experimento. Todas as ligaduras permaneceram na sua posição e não houve necessidade de recolocação. 25 Figura 3 - Procedimento para indução da DP por meio da colocação de ligaduras Fonte: Arquivo pessoal da autora. 4.4 Administração das tanhinonas TIIA e T06 (sódio sulfonato) Para a diluição da Tanshinona T06 (5mg/ml) foi utilizada água destilada (2,3ml), aquecida a 45°C e posteriormente agitada com auxílio do vórtex por 2 minutos. A Tanshinona TIIA (5mg/ml) foi diluída utilizando polissorbato 20 (Tween 20) (15 % volume/volume), etanol (2 % v/v) e água q.s.p (quantidade suficiente) em 2ml. A mistura foi homogeneizada em vórtex e mantida em banho ultrassônico por 10 minutos até o momento do seu uso. Para os procedimentos de administração do medicamento por gavagem, foi utilizada uma cânula de metal (cânulas de gavagem para camundongo em inox com diâmetro de 1mm com esfera de 1,7 mm, raio de 40 mm e comprimento de 31 mm) e 200μL de cada uma das doses das tanshinonas ou da água destilada foram administradas diariamente, 1 vez ao dia, durante 10 dias, iniciando-se no mesmo dia da instalação das ligaduras. 4.5 Sacrifício e coleta das amostras Após o período experimental de 10 dias, os animais de cada um dos grupos experimentais foram sacrificados por deslocamento cervical (Figura 4). As maxilas foram cuidadosamente removidas, e subdivididas em duas hemimaxilas, no qual a hemi-maxila do lado esquerdo teve o tecido gengival ao redor dos primeiros e segundos molares removidos para extração de mRNA (qPCR em tempo real). Para esta finalidade, os tecidos coletados foram armazenados em nitrogênio líquido logo após sua remoção e em seguida transferidos para o freezer -80°C até o momento do processamento para as análises. As hemi-maxilas do lado direito foram fixadas em 26 parafolmaldeído 4% por 48h, e transferidas para etanol 70% para avaliação da perda óssea por microtomografia computadorizada. Figura 4 - Momento após o sacrifício dos animais e coleta da maxila Fonte: Arquivo pessoal da autora. 4.6 Análise microtomográfica Antes do escaneamento, as amostras da maxila foram lavadas em água destilada e armazenadas em solução salina a 0,9% durante a noite para reidratação das peças. As amostras ósseas foram envoltas em papel húmido para evitar artefatos como consequência da desidratação durante o processo de digitalização. Amostras ósseas da maxila foram escaneadas utilizando-se um sistema de microtomografia computadorizada (μCT Skyscan 1176; Skyscan, Kontich, Belgium). Os parâmetros de escaneamento foram escolhidos com base em trabalhos publicados anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa65, 66. Brevemente, os parâmetros utilizados foram: gerador de raios-X operado a 50 kVp, feixe de corrente em 500 μA, filtração de alumínio de 0,5 mm de espessura em uma resolução de imagem de 12,45 μm; passo de rotação de 0,5°. As amostras foram colocadas no microtomógrafo em um cilindro de espuma sob a cama de carbono. Para reconstrução das amostras (NRecon 1.6.1.5; Bruker), os seguintes parâmetros foram utilizados: defect-pixel masking: 10%; beam-hardening: 20%, smoothing: 1, e calculado individualmente os valores de compensação de desalinhamento. Após as reconstruções, para a realização das análises lineares, dados volumétricos foram importados no software Data Viewer (Skyscan, Kontich, Belgium) para geração de imagens reconstruídas multiplanares. Na maxila, a distância da 27 junção cemento-esmalte até a crista óssea alveolar foi mensurada na superfície mesial e distal do primeiro molar e mesial do segundo molar utilizando-se cortes sagitais. Análises volumétricas foram realizadas após a aquisição das mensurações lineares. Para isso, volume ósseo (BV), tecido ósseo (TV) e fração de volume ósseo (BV/TV) foram analisados utilizando-se o software CTAn (CT Analyzer 1.12.0.0 - Skyscan, Kontich, Belgium) em cortes axiais (1024 x 1024). Todos as imagens foram salvas no Dataviewer (Dataviewer 1.4.3 – Skyscan, Kontich, Belgium). Para isso, uma região de interesse (ROI) foi delineada a partir dos ápices das raízes até a crista alveolar, e a partir da raiz mesial do primeiro molar até a raiz distal do segundo molar. Em detalhe, o ROI consistiu em 60 cortes na maxila da porção apical do dente até a junção cemento-esmalte. O limite inferior foi definido quando apareceram os ápices das raízes mesial do primeiro molar e distal do terceiro molar. O tecido ósseo foi manualmente desenhado em intervalos regulares com um método baseado em fatia a cada 10 planos utilizando-se uma ferramenta interpolada. Subsequentemente, as raízes foram desenhadas manualmente nos 60 cortes selecionados e foram excluídos do osso. Assim, a área óssea inteira sem as raízes e ligamento periodontal foi incluída no ROI. Tons de cinza para quantificação dos parâmetros foram determinados usando o algoritmo de limiarização. Usando processamento personalizado, manchas brancas (menores que 30 voxels) foram removidas. Mensurações da arquitetura óssea na maxila também foi realizada utilizando o software CTAn para avaliação do número de trabéculas (Tb.N), separação de trabéculas (Tb.Sp) e espessura de trabéculas (Tb.Th). A densidade mineral óssea (BMD) também foi avaliada. Para isso, a calibração do software CTAnalyzer foi realizada pela determinação dos valores de hidroxiapatita de cálcio (CaOH) dos dois phantoms contendo 0,25 e 0,75 g de CaOH/cm3. Os phantoms foram escaneados de acordo com os parâmetros utilizados para o escaneamento e reconstrução das maxilas, conforme previamente descrito24. 4.7 Reação de polimerase em cadeia (RT-qPCR) O RNA total foi extraído de amostras de tecido gengival usando o kit RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. A pureza e quantidade de RNA foram determinadas em espectrofotômetro pela leitura da absorbância a 260 nm e da 28 relação entre as absorbâncias a 260 e 280 nm, respectivamente. 142,5 ng de RNA total foram utilizados para a síntese de cDNA utilizando random hexamers como primers e seguindo as instruções do fabricante (High capacity cDNA synthesis kit, Applied Biosystems). A expressão dos genes inflamatórios selecionados foi determinada por RT-qPCR tempo real usando sondas e reagentes Taqman (TaqMan Gene Expression Assays, TaqMan Universal master mix, Applied Biosystems) em um sistema de PCR Tempo Real StepOne (Applied Biosystems). As reações foram feitas em placas de 96 poços com um volume final de 3,5 μL que inclui Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems) para cada gene: (catepsina K, IL-1ß, TNF-a e RANKL) e a expressão de GAPDH foi utilizada para normalização dos resultados, que foram analisados pelo método delta (delta Ct). Os genes alvos, Assay ID #, Acession # e amplicon de cada TaqMan Gene Expression Assay estão descritos na Tabela 1. Tabela 1 – Informações sobre os conjuntos de primers TaqMan pré-otimizados para PCR em Tempo Real (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems) Gene alvo Assay ID Acession # Amplicon (bp) GAPDH Mm 99999915 gl NM_001289726.1 107 Ctsk Mm00484039_m1 NM_007802.4 73 IL-1b Mm01336189_m1 NM_008361.3 63 TNF – α Mm00443259_g1 NM_013693.3 81 RANKL Mm01205928_ml NM_011613.3 75 Fonte: Elaboração própria. 4.8 Análise estatística Para o estudo in vivo, o cálculo do tamanho da amostra foi calculado utilizando-se o software G*Power 3.1 e foi baseado em estudo previamente publicado111. A Reabsorção inflamatória do osso alveolar foi estabelecida como sendo o desfecho primário do estudo. O tamanho do efeito foi calculado considerando um erro alpha de 0.05 (α=0,05 – erro do tipo II) e poder de teste de 80% (1-β=0,80 – erro tipo I) para detectar uma diferença de aproximadamente 10% de perda óssea alveolar entre o grupo teste e controle. Assim, o tamanho do efeito foi determinado como sendo de 2.91. O número mínimo de 7 animais por grupo foi 29 considerado necessário. Considerando que poderia haver alguma morte inesperada, 10 animais por grupo foram incluídos. Os dados obtidos nas diferentes análises foram analisados utilizando-se o software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Ind., San Diego, CA, EUA). O objetivo da análise foi comparar os resultados de cada desfecho de acordo com os tratamentos. A normalidade dos dados foi verificada utilizando-se o teste de Shapiro- Wilk. De acordo com a distribuição dos dados, foi utilizado ANOVA com teste post- hoc de Tukey para comparações pareadas, ou o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn para dados não paramétricos. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p <0,05) em todas as análises. 30 5 RESULTADOS 5.1 Análise de μCT Para analisar a quantidade de perda óssea nos grupos com doença periodontal, foi medida a distância da junção cemento-esmalte (JCE) à crista alveolar (CA) na superfície mesial e distal do primeiro molar e mesial do segundo molar. Quando se observa um aumento da JCE-CA pode-se dizer que a um aumento da perda óssea. A análise linear demonstrou que houve aumento na distância JCE-CA significativa para todos os grupos doentes, sendo a maior distância observada no grupo DP quando comparados com os demais grupos (Figura 5 A). A fração de volume ósseo (BV/TV) foi significativamente diminuída no grupo DP em comparação com o grupo Controle, TIIA e T06 (Figura 5 B). A densidade óssea alveolar (BMD) não apresentou diferenças significativas entre o grupo Controle, TIIA e T06 quando comparados com o grupo DP o qual obteve uma maior perda estatisticamente. (Figura 5 C). Figura 5 - Imagens representativas de cada grupo experimental obtidas nos planos sagital, axial, coronal, e plano 3D Fonte: Elaboração própria. 31 As mensurações da arquitetura óssea na maxila realizada para avaliação do número de trabéculas (Tb.N), separação de trabéculas (Tb.Sp) e espessura de trabéculas (Tb.Th) apontaram que o Tb.N se mostrou estatisticamente menor no grupo DP quando comparado com grupo Controle. Pode-se notar uma diferença relativamente menor também entre o grupo Controle e o grupo TIIA e T06 (Figura 5 D). Para Tb.Sp o grupo DP se mostrou menor quando comparado aos demais grupos. Já o grupo das tanshinonas TIIA e T06 também apresentaram valores menores para separação de trabéculas comparados ao grupo Controle e houve uma diferença estatisticamente entre a TIIA e a T06 (Figura 5 E). Diferente de Tb.Th, onde o grupo TIIA e T06 não apresentaram diferenças estatísticas entre si, apenas quando comparadas com o grupo Controle e grupo DP o qual mostrou maior perda para espessura de trabéculas (Figura 5 F). Figura 6 - Análise gráfica da perda óssea alveolar linear (A), da fração de volume ósseo (BV/TV) (B), densidade óssea alveolar (BMD) (C), do número de trabéculas (Tb.N) (D), da separação de trabéculas (Tb.Sp) (E) e da espessura de trabéculas (Tb.Th) (F). 32 *Diferença estatistica do grupo controle (p <0.05) #Diferença estatistica do grupo DP (p <0.05) @Diferença estatística do grupo T06 (p <0.05). Fonte: Elaboração própria. 33 5.2 RT-qPCR A expressão dos genes RANKL e IL 1b foi maior no grupo DP em relação aos demais grupos, e pudemos observar uma diferença concisa entre os grupos TIIA e T06 para RANKL (Figura 7A). Por outro lado, o grupo tanshinona (TIIA e T06) apresentou os menores valores de expressão de IL1b em relação ao grupo DP, e o grupo TIIA foi o mais próximo do grupo controle (Figura 7B). No entanto, o grupo T06 apresentou menor expressão gênica de catepsina K e TNFa em relação aos demais grupos (Figura 7 C e D). Figura 7 - Análise gráfica RT-qPCR das expressões de RANKL (A), IL1b (B), Catepsina K (C), TNFa (D). *Diferença estatistica do grupo controle (p <0.05) @Diferença estatística do grupo TIIA (p <0.05). Fonte: Elaboração própria 34 6 DISCUSSÃO As tanshinonas têm sido estudadas atualmente devido ao seu potencial de inibição da reabsorção óssea em doenças metabólicas crônicas como a osteoartrite, osteoporose e artrite reumatoide29, 35, 37. Trabalhos anteriores mostraram que o mecanismo de ação das tanshinonas age na resposta imuno-inflamatória bem como através da inibição da enzima Catepsina K, os quais inibem especificamente a sua atividade colagenolítica nos osteoclastos32, 34. Porém, há uma escassez de estudos que avaliam a ação das tanshinonas no processo de reabsorção óssea inflamatória, como nas DPs. Com base nesse fato, nosso trabalho teve como objetivo avaliar in vivo o efeito do tratamento sistêmico com tanshinona na modulação da doença periodontal experimental. De maneira geral, os resultados do presente estudo demonstraram que tanto a administração sistêmica da tanshinona IIA, bem como da tanshinona sulfonato T06 resultou em uma redução estatisticamente significante da perda óssea alveolar em camundongos submetidos a DP experimental. Além disso, a expressão genica de IL- 1b, uma citocina pró-inflamatória relacionada diretamente com a perda óssea alveolar, foi significativamente diminuída após o tratamento sistêmico com tanshinona IIA e T06. Houve também uma redução da expressão gênica de RANKL nos grupos tratados, mas que não demonstraram significância estatística. Esses resultados sugerem que as tanshinonas possuem um efeito positivo na modulação da resposta inflamatória e óssea na DP experimental, nas condições estudadas. A análise da perda óssea por meio de microtomografia computadorizada demonstrou que os grupos administrados com tanshinona tiveram uma redução em torno de 50% na perda óssea alveolar quando comparado com o grupo DP. Além disso, houve um aumento na densidade mineral óssea nos grupos tratados, os quais obtiveram valores semelhantes aos do grupo controle (sem doença). Embora estudos anteriores não tenham sido realizados objetivando avaliar os efeitos do tratamento sistêmico da tanshinona durante a progressão da perda óssea alveolar, um estudo pré-clínico em camundongos com osteoporose induzida demonstrou que esse tratamento sistêmico resulta na diminuição da perda de massa óssea e da densidade mineral óssea34. Embora a osteoporose e a DP tenham etiologia completamente distintas, ambas resultam na perda de massa óssea por meio de um 35 desequilíbrio entre formação e reabsorção óssea, havendo um desequilíbrio favorecendo o processo de reabsorção. Nesse contexto, o uso das tanshinonas para modular a perda óssea pode ser considerada como uma alternativa viável para o tratamento de doenças ósseas crônicas. A inibição da perda óssea alveolar encontrada neste estudo pode estar relacionada com a diminuição da expressão genica de IL-1b e RANKL. Durante a progressão da periodontite, esses mediadores pró-inflamatórios são produzidos em grande escala e são amplamente disseminados no organismo, os quais influenciam o metabolismo e a resposta imuno-inflamatória67-69. Estudos anteriores relataram que a tanshinona IIA age na diferenciação osteogênica de células-tronco do ligamento periodontal por meio de indução Runx2 dependente de ERK1/236, já a tanshinona T06 pode bloquear a atividade colagenolítica da Catepsina K, exercendo a atividade antirreabsortiva34, o que pode ser observado em nossa análise de RT- qPCR, onde a T06 se mostrou mais eficaz para diminuir a expressão genica de Catepsna K e TNFa quando comparada aos demais grupos. Outro fator que pode evidenciar a ação inibitória das tanshinonas na reabsorção óssea é a sua regulação perante a ação dos osteoclastos, isso ocorre por meio de um ajuste da razão do fator de diferenciação da osteoprotegerina (OPG) e osteoclastos70. Neste estudo foi administrado uma dosagem de 40 mg/kg de TIIA e T06 diariamente durante todo o período experimental, de acordo com estudo previamente descrito na literatura34. É importante destacar que análise histológica e imunohistoquimica estão sendo conduzidas no momento para a avaliação do processo imuno-inflamatório e para a marcação de osteoclastos e catepsina K para elucidar os fatores que podem contribuir para diminuição da perda óssea alveolar no modelo de periodontite experimental. Portanto, embora os resultados micro-tomográficos tenham sido favoráveis a inibição da perda óssea inflamatória, é importante mencionar que este trabalho ainda está em andamento e que novas metodologias para avaliação do processo inflamatório estão sendo desenvolvidas para avaliar através de quais mecanismos esses compostos bloqueiam a perda óssea alveolar. Outro fator que deve ser levado em consideração é que este estudo apresenta algumas limitações às inferências clínicas. O modelo animal utilizado não mimetiza propriamente o que acontece na DP em humanos. Além disso, fatores de interferência importantes como a influência dos fatores de risco sistêmicos e a progressão aguda do modelo de perda óssea 36 alveolar, precisam ser levados em consideração em estudos futuros. Por fim, estudos comparando diferentes dosagens para as tanshinonas devem ser realizados, bem como em diferentes modelos de perda óssea inflamatória (como nos modelos osteolíticos em calvaria), a fim de nos ajudar a entender o comportamento farmacológico das tanshinonas. Outro fator que poderá ser investigado é a possibilidade de utilizar diferentes vias de administração das tanshinonas, com potencial para uso local com dispositivos de liberação lenta e controlada, para atuar de maneira mais eficaz no tratamento de uma doença de natureza sitio-especifica. Essas questões devem ser abordadas em estudos futuros. 37 7 CONCLUSÃO De acordo com os dados apresentados nesse estudo, sugere-se que as tanshinonas TIIA e T06 são eficazes na modulação da doença periodontal experimental in vivo, nas condições estudadas. 38 REFERÊNCIAS 1. Kinane DF, Stathopoulou PG, Papapanou PN. Periodontal diseases. Nat Rev Dis Primers. 2017; 3: 17038. 2. Natto ZS, Abu Ahmad RH, Alsharif LT, Alrowithi HF, Alsini DA, Salih HA et al. Chronic Periodontitis Case Definitions and Confounders in Periodontal Research: A Systematic Assessment. Biomed Res Int. 2018; 2018: 4578782. 3. Tonetti MS, Greenwell H, Kornman KS. Staging and grading of periodontitis: Framework and proposal of a new classification and case definition. J Periodontol. 2018; 89(1):159-72. 4. Hajishengallis G, Chavakis T, Lambris JD. Current understanding of periodontal disease pathogenesis and targets for host-modulation therapy. Periodontol 2000. 2000; 84(1): 14-34. 5. Becerra-Ruiz JS, Guerrero-Velázquez C, Martínez-Esquivias F, Martínez-Pérez LA, Guzmán-Flores JM. Innate and adaptive immunity of periodontal disease. From etiology to alveolar bone loss. Oral Dis. 2021. 6. Hajishengallis G, Korostoff JM. Revisiting the Page & Schroeder model: the good, the bad and the unknowns in the periodontal host response 40 years later. Periodontol 2000. 2017; 75 (1): 116-51. 7. Zanatta FB, Antoniazzi RP, Rösing CK, Miranda LA. T helper cells participation on chronic periodontitis. R. Periodontia. 2009; 19(2): 7-13. 8. Seymour GJ, Gemmell E, Reinhardt RA, Eastcoot J, Taubman MA. Immunopathogenesis of chronic inflamatory periodontal disease: Celular and molecular mechanisms. J Periodont Res. 1993; 28(6): 478-86. 9. Andrade FR, Sousa DP, Mendonça EF, Silva TA, Lara VS, Batista AC. Expression of bone resorption regulators (RANK, RANKL, and OPG) in odontogenic tumors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2008; 106(4): 548-55.  De acordo com o Guia de Trabalhos Acadêmicos da FOAr, adaptado das Normas Vancouver. Disponível no site da Biblioteca: http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao- atualizado.pdf http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf 39 10. Lu HK, Chen YL, Chang HC, Li CL, Kuo MY. Identification of the osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand system in gingival crevicular fluid and tissue of patients with chronic periodontitis. J Periodontal Res. 2006; 41(4): 354-60. 11. Crotti T, Smith MD, Hirsch R, Soukoulis S, Weedon H, Capone M, Ahern MJ, Haynes D. Receptor activator NF kappaB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) protein expression in periodontitis. J Periodontal Res. 2003; 38(4): 380-7. 12. Cochran DL. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J Periodontol. 2008; 79(8): 1569-76. 13. Balta MG, Papathanasiou E, Blix IJ, Van Dyke TE. Host Modulation and Treatment of Periodontal Disease. J Dent Res. 2021; 100(8): 798-809. 14. Prietto NR, Martins TM, Santinoni CDS, Pola NM, Ervolino E, Bielemann AM, Leite FRM. Treatment of experimental periodontitis with chlorhexidine as adjuvant to scaling and root planing. Arch Oral Biol. 2020; 110: 104600. 15. Muniz FW, de Oliveira CC, de Sousa Carvalho R, Moreira MM, de Moraes ME, Martins RS. Azithromycin: a new concept in adjuvant treatment of periodontitis. Eur J Pharmacol. 2013; 705(1-3): 135-9. 16. Drake MT, Clarke BL, Oursler MJ, Khosla S. Cathepsin K Inhibitors for Osteoporosis: Biology, Potential Clinical Utility, and Lessons Learned. Endocr Rev. 2017; 38(4): 325-350. 17. Zeng GZ, Pan XL, Tan NH, Xiong J, Zhang YM. Natural biflavones as novel inhibitors of cathepsin B and K. Eur J Med Chem. 2006; 41(11): 1247-52. 18. Lecaille F, Kaleta J, Brömme D. Human and parasitic papain-like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design. Chem Rev. 2002; 102(12): 4459-88. 19. Wen X, Yi LZ, Liu F, Wei JH, Xue Y. The role of cathepsin K in oral and maxillofacial disorders. Oral Dis. 2016; 22(2): 109-15. 20. Stralberg F, Henning P, Gjertsson I, Kindlund B, Souza PP, Persson E, et al. Cysteine proteinase inhibitors regulate human and mouse osteoclastogenesis by interfering with RANK signaling. FASEB J. 2013; 27(7): 2687-701. 40 21. Str.lberg F, Kassem A, Kasprzykowski F, Abrahamson M, Grubb A, Lindholm C, et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced osteoclast formation and bone resorption in vitro and in vivo by cysteine proteinase inhibitors. J Leukoc Biol. 2017; 101(5): 1233-43. 22. Martinez M, Santamaria ME, Diaz-Mendoza M, Arnaiz A, Carrillo L, Ortego F, et al. Phytocystatins: Defense Proteins against Phytophagous Insects and Acari. Int J Mol Sci. 2016; 17(10): 1747. 23. Leguizamon NDP, Rodrigues EM, de Campos ML, Nogueira AVB, Viola KS, Schneider VK, et al. In vivo and in vitro anti-inflammatory and pro-osteogenic effects of citrus cystatin CsinCPI-2. Cytokine. 2019; 123: 1547-60. 24. Da Ponte Leguizamón, N et al. Phytocystatin CsinCPI-2 Reduces Osteoclastogenesis and Alveolar Bone Loss. Journal of dental research. 2022; 101(2): 216-225. 25. Curylofo-Zotti FA, Elburki MS, Oliveira PA, Cerri PS, Santos LA, Lee HM, et al. Differential effects of natural Curcumin and chemically modified curcumin on inflammation and bone resorption in model of experimental periodontitis. Archives of oral biology. 2018; (91): 42-50. 26. de Almeida Brandão D, Spolidorio LC, Johnson F, Golub LM, Guimarães-Stabili MR, Rossa C Jr. Dose-response assessment of chemically modified curcumin in experimental periodontitis. Journal of periodontology. 2019; 90(5): 535-45. 27. Kujur SK, Goswami V, Nikunj AM, Singh G, Bandhe S, Ghritlahre H. Efficacy of omega 3 fatty acid as an adjunct in the management of chronic periodontitis: A randomized controlled trial. Indian J Dent Res. 2020; 31(2): 229-35. 28. Guo Y, Li Y, Xue L, Severino RP, Gao S, Niu J, et al. Salvia miltiorrhiza: an ancient Chinese herbal medicine as a source for anti- osteoporotic drugs. J Ethnopharmacol. 2014; 155(3): 1401-16. 29. Liu QY, Zhuang Y, Song XR, Niu Q, Sun QS, Li XN, et al. Tanshinone IIA prevents LPS-induced inflammatory responses in mice via inactivation of succinate dehydrogenase in macrophages. Acta Pharmacol Sin. 2021; 42(6): 987-997. 30. Dong Y, Morris-Natschke SL, Lee KH. Biosynthesis, total syntheses, and antitumor activity of tanshinones and their analogs as potential therapeutic agents. Nat Prod Rep. 2011 Mar;28(3):529-42. 41 31. Li YG, Song L, Liu M, Hu ZB, Wang ZT. Advancement in analysis of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen). J Chromatogr A. 2009 Mar 13;1216(11):1941-53. 32. Panwar P, Søe K, Guido RV, Bueno RV, Delaisse JM, Brömme D. A novel approach to inhibit bone resorption: exosite inhibitors against cathepsin K. Br J Pharmacol. 2016; 173(2): 396-410. 33. Xing L, Tan ZR, Cheng JL, Huang WH, Zhang W, Deng W, et al. Bioavailability and pharmacokinetic comparison of tanshinones between two formulations of Salvia miltiorrhiza in healthy volunteers. Sci Rep. 2017; 7(1): 4709. 34. Panwar P, Xue L, Soe K, Srivastava K, Law S, Delaisse JM, et al. An Ectosteric Inhibitor of Cathepsin K Inhibits Bone Resorption in Ovariectomized Mice. J Bone Miner Res. 2017; 32(12): 2415-30. 35. Kwak HB, Yang D, Ha H, Lee JH, Kim HN, Woo ER, et al. Tanshinone IIA inhibits osteoclast differentiation through down-regulation of c-Fos and NFATc1. Exp Mol Med. 2006; 38(3): 256-64. 36. Liu QY, Zhuang Y, Song XR, Niu Q, Sun QS, Li XN, Li N, Liu BL, Huang F, Qiu ZX. Tanshinone IIA prevents LPS-induced inflammatory responses in mice via inactivation of succinate dehydrogenase in macrophages. Acta Pharmacol Sin. 2021; 42(6): 987-97. 37. Zhang J, Cai Z, Yang M, Tong L, Zhang Y. Inhibition of tanshinone IIA on renin activity protected against osteoporosis in diabetic mice. Pharm Biol. 2020; 58(1): 219-24. 38. Wang Y, Chen H, Zhang H. Tanshinone IIA exerts beneficial effects on fracture healing in vitro and in vivo. Chem Biol Interact. 2019; 310: 108748. 39. Cheng L, Zhou S, Zhao Y, Sun Y, Xu Z, Yuan B, et al. Tanshinone IIA attenuates osteoclastogenesis in ovariectomized mice by inactivating NF-Kb and Akt signaling pathways. Am J Transl Res. 2018; 10(5): 1457-68. 40. Gao Z, Lu Y, Halmurat Upur, Jing J, Xu D. Study of osteoporosis treatment principles used historically by ancient physicians in Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 2013; 19(11): 862-8. 42 41. Ren ZH, Tong YH, Xu W, Ma J, Chen Y. Tanshinone II A attenuates inflammatory responses of rats with myocardial infarction by reducing MCP-1 expression. Phytomedicine. 2010; 17(3-4): 212-8. 42. Wang X, Fan J, Ding X, Sun Y, Cui Z, Liu W. Tanshinone I Inhibits IL-1β- Induced Apoptosis, Inflammation And Extracellular Matrix Degradation In Chondrocytes CHON-001 Cells And Attenuates Murine Osteoarthritis. Drug Des Devel Ther. 2019; 13: 3559-68. 43. Zhou B, Li LH, Tan LM, Luo WB, Xiong H, Lu XL et al. Tanshinone IIA Ameliorates Inflammation Response in Osteoarthritis via Inhibition of miR-155/FOXO3 Axis. Pharmacology. 2021; 106(1-2): 20-8. 44. Rychel JK. Diagnosis and treatment of osteoarthritis. Top Companion Anim Med. 2010; 25(1): 20-5. 45. Taruc-Uy RL, Lynch SA. Diagnosis and treatment of osteoarthritis. Prim Care. 2013; 40(4): 821-36. 46. Abramoff B, Caldera FE. Osteoarthritis: Pathology, Diagnosis, and Treatment Options. Med Clin North Am. 2020; 104(2): 293-311. 47. Jia PT, Zhang XL, Zuo HN, Lu X, Li L. Articular cartilage degradation is prevented by tanshinone IIA through inhibiting apoptosis and the expression of inflammatory cytokines. Mol Med Rep. 2017; 16(5): 6285-89. 48. Lin H, Wei B, Li G, Zheng J, Sun J, Chu J et al. Sulforaphane reverses glucocorticoid-induced apoptosis in osteoblastic cells through regulation of the Nrf2 pathway. Drug Des Devel Ther. 2014; 8: 973-82. 49. Hsu E, Nanes M. Advances in treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2017; 24(6): 411-17. 50. Weinstein RS. Clinical practice. Glucocorticoid-induced bone disease. N Engl J Med. 2011; 365(1): 62-70. 51. Li J, He C, Tong W, Zou Y, Li D, Zhang C et al. Tanshinone IIA blocks dexamethasone-induced apoptosis in osteoblasts through inhibiting Nox4-derived ROS production. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8(10):13695-706. 43 52. Chen Z, Buki K, Vääräniemi J, Gu G, Väänänen HK. The critical role of IL-34 in osteoclastogenesis. PLoS One. 2011 Apr 8;6(4):e18689. 53. Stark Z, Savarirayan R. Osteopetrosis. Orphanet J Rare Dis. 2009 Feb 20;4:5. 54. McDonald MM, Khoo WH, Ng PY, Xiao Y, Zamerli J, Thatcher P et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 2021; 184(5): 1330-47. 55. Boyce BF, Xing L. Biology of RANK, RANKL, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 2007; 9 Suppl 1(Suppl 1):S1. 56. Martin TJ, Sims NA. Osteoclast-derived activity in the coupling of bone formation to resorption. Trends Mol Med. 2005; 11(2): 76-81. 57. Hanley DA, Adachi JD, Bell A, Brown V. Denosumab: mechanism of action and clinical outcomes. Int J Clin Pract. 2012; 66(12): 1139-46. 58. Ruggiero SL. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw: an overview. Ann N Y Acad Sci. 2011; 1218: 38-46. 59. Ristow O, Gerngroß C, Schwaiger M, Hohlweg-Majert B, Kehl V, Jansen H et al. Effect of antiresorptive drugs on bony turnover in the jaw: denosumab compared with bisphosphonates. Br J Oral Maxillofac Surg. 2014; 52(4): 308-13. 60. Eisman JA, Bone HG, Hosking DJ, McClung MR, Reid IR, Rizzoli R et al. Odanacatib in the treatment of postmenopausal women with low bone mineral density: three-year continued therapy and resolution of effect. J Bone Miner Res. 2011; 26(2): 242-51. 61. Gauthier JY, Chauret N, Cromlish W, Desmarais S, Duong LT, Falgueyret JP et al. The discovery of odanacatib (MK-0822), a selective inhibitor of cathepsin K. Bioorg Med Chem Lett. 2008; 18(3): 923-8. 62. Brömme D, Panwar P, Turan S. Cathepsin K osteoporosis trials, pycnodysostosis and mouse deficiency models: Commonalities and differences. Expert Opin Drug Discov. 2016;11(5):457-72. 63. Cui L, Wu T, Liu YY, Deng YF, Ai CM, Chen HQ. Tanshinone preventscancellous bone loss induced by ovariectomy in rats. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25(5): 678- 84. 44 64. Wang L, Cheng L, Zhang B, Wang N, Wang F. Tanshinone prevents alveolar bone loss in ovariectomized osteoporosis rats by up-regulating phosphoglycerate dehydrogenase. Toxicol Appl Pharmacol. 2019; 376: 9-16. 65. de Molon RS, Mascarenhas VI, de Avila ED, Finoti LS, Toffoli GB, Spolidorio DM, et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clin Oral Investig. 2016; 20(6): 1203-16. 66. de Molon RS, de Avila ED, Boas Nogueira AV, Chaves de Souza JA, Avila-Campos MJ, de Andrade CR, et al. Evaluation of the host response in various models of induced periodontal disease in mice. J Periodontol. 2014; 85(3): 465-77. 67. Cekici A, Kantarci A, Hasturk H, Van Dyke TE. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 2014; 64(1): 57-80. 68. Pan W, Wang Q, Chen Q. The cytokine network involved in the host immune response to periodontitis. International journal of oral science. 2019; 11(3): 30. 69. Hienz SA, Paliwal S, Ivanovski S. Mechanisms of Bone Resorption in Periodontitis. Journal of immunology research. 2015; (2015): 615486. 70. Teitelbaum, S L. Bone resorption by osteoclasts. Science (Nova York, NY). 2000; 289(5484): 1504-8. 45 ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA 46 APÊNDICE A – PUBLICAÇÃO Pharmacological therapies for the management of inflammatory bone resorption in periodontal disease. A review of pre-clinical studies Angelica Leticia Reis Pavanelli,1 Bruna Silva de Menezes,2 Erica Bianca Barbosa Pereira; Fabio Assuncao de Souza Morais,2 Joni Augusto Cirelli,1 Rafael Scaf de Molon1,2 1Department of Diagnosis and Surgery, São Paulo State University - UNESP, School of Dentistry, Araraquara SP, 14801-930, Brazil 2Department of Clinical Dentistry, Federal University of Rio de Janeiro. Rio de Janeiro – RJ 21941-617, Brazil. Correspondence Prof. Dr. Rafael Scaf de Molon Department of Clinical Dentistry Federal University of Rio de Janeiro Rua Prof. Rodolpho Paulo Rocco, 325. Cidade Universitária, Rio de Janeiro – RJ, 21941-617 Phone: +55 16 99730-9293 Email: rafael.molon@unesp.br; rafael.molon@odonto.ufrj.br  Artigo redigido segundo as normas do periódico Hindawi para o qual foi submetido. mailto:rafael.molon@odonto.ufrj.br 47 Abstract Periodontitis, a highly prevalent multicausal chronic inflammatory and destructive disease, develops as a result of complex host-parasite interactions. Dysbiotic bacterial biofilm in contact with the gingival tissues initiates a cascade of inflammatory events, mediated and modulated by the host's immune response, which is characterized by increased expression of several inflammatory mediators such as cytokines and chemokines in the connective tissue. If periodontal disease (PD) is left untreated, it results in the destruction of the supporting tissues around the teeth, including periodontal ligament, cementum, and alveolar bone, which leads to a wide range of disabilities and poor quality of life, thus imposing significant burdens. This process depends on the differentiation and activity of osteoclasts, the cells responsible for reabsorbing the bone tissue. Therefore, the inhibition of differentiation or activity of these cells is a promising strategy for controlling bone resorption. Several pharmacological drugs that target osteoclasts and inflammatory cells with immunomodulatory and anti-inflammatory effects, such as bisphosphonates, anti- RANK-L antibody, strontium ranelate, cathepsins inhibitors, curcumin, flavonoids, specialized pro-resolving mediators, and probiotics were already described to manage inflammatory bone resorption during experimental PD progression in pre-clinical studies. Meantime, a growing number of studies have described the beneficial effects of herbal products in inhibiting bone resorption in experimental PD. Therefore, this review summarizes the role of several pharmacological drugs used for PD prevention and treatment and highlights the targeted action of all those drugs with antiresorptive properties. In addition, our review provides a timely and critical appraisal for the scientific rationale use of the antiresorptive and immunomodulatory medications in pre-clinical studies, which will help to understand the basis for its clinical application. Keywords: Alveolar bone; animal model; antiresorptive agents; bone; periodontal disease; osteoclast. 48 Introduction Periodontal disease (PD), a chronic inflammatory condition of the supporting tissues around the teeth, is characterized by the loss of supporting structures of the tooth, such as gingiva, periodontal ligament, alveolar bone and cementum [1-3]. This condition leads to an irreversible loss of the dental structures and might result in teeth loss if left untreated [1, 4]. The etiology of PD is multifactorial in which the presence of a dysbiotic biofilm in intimate contact with the gingival margin initiates the inflammatory immune response [3, 5]. Indeed, PD is the sixth-most prevalent disease globally [6] and is considered the most important cause of teeth loss in the adult population [7]. PD is modulated and mediated by the immune host system, which plays an important role in disease severity and progression. During the initiation and progression of PD, environmental conditions (smoking), systemic comorbidities (diabetes mellitus and rheumatoid arthritis), and genetic polymorphisms (IL-1ß) are important factors involved in [8-10]. In the initiation phase of PD, there is an activation of the inflammatory response, which is characterized by increased vascular permeability of the junctional epithelium, increased gingival crevicular fluid, and an influx of inflammatory cells (leukocytes), especially the polymorphonuclear neutrophils (PMN) that tends to diminish the insult caused by the dysbiotic biofilm [4]. All of these events are protective, and in most patients, the immune system is capable of controlling the disease progression. However, innate and adaptive responses in susceptible patients lead to the aggravation of periodontal tissue destruction. The activation of leucocytes and T cells in the connective tissue lead to the production of multiple inflammatory mediators, degrading enzymes such as matrix metalloproteinases (MMP), and the increased expression of the nuclear factor-kappa B ligand (RANKL), which is the primary activation factor for osteoclasts [11], leading to periodontal inflammation and finally cause the loss of bone supporting tissue (Figure 1) [12-14]. 49 Fig. 1 - The pathogenesis of PD. The bacteria that compose the dental biofilm trigger the process of local inflammation generated by the increase of cytokines such as IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a, PGE2 and inflammatory cells. Such inflammatory environment leads to the activation of osteoclasts, the cells responsible to resorb the bone tissue. Consequently, the signs and symptoms of PD occurs. The primary treatment of PD is through scaling and root planning (SRP) to remove the attached biofilm from the root surface. However, removing bacterial biofilm does not imply a return to homeostasis and regeneration of lost tissues [15, 16], and SRP targeting only microorganisms does not accomplish favorable results in all patients [17]. Adjunctive treatments such as systemic local antibiotics, non-steroidal anti-inflammatory drugs, and low doses of doxycycline have been used as host modulating agents in order to control the progression of PD [18-21]. Despite the clinical benefits of those approaches, their effects are limited in the context of inflammation-induced alveolar bone loss [22]. The major challenge for successfully treating PD is the difficulty in finding a target that can inhibit tissue 50 inflammation and consequently alveolar bone destruction [23]. Therefore, the adjunct use of complementary therapies that aim to modulate the destructive events of the immune response has been proposed as a potential therapeutic strategy for PD treatment targeting inflammatory mediators and bone-resorbing osteoclasts. In recent decades, the use of pharmacological drugs and natural compounds (herbal medicine) aiming to suppress bone destruction during experimental PD in animal models has been extensively reported [24-33]. Interestingly, several studies have shown that inhibition of bone loss can be targeted intervened by innumerous pharmacological drugs, such as alendronate [34-37], OPG-Fc [25], resolvin [38-41], strontium ranelate [26, 42], Curcumin [16, 30, 43-46], cathepsins inhibitors [28, 47], and others. Therefore, in this review, we comprehensively summarize the roles of several therapeutic drugs during the progression of PD, and provide the main findings of each included study leading to the prevention of experimental PD. In this review, the pharmacological products discussed below are examined through many experiments for their anti-osteoclastic activity. The in vivo studies included in this review are based on well-established experimental models of PD, such as ligature-induced bone loss [48-52], lipopolysaccharide (LPS) injections [53-55], and oral inoculation of periodontopathogenic bacteria into the animal mouth [49, 53-55]. Primary methods used to evaluate the inhibition of bone loss were assessed by microcomputed tomography (micro- CT) and histopathological analyses. Oral gavage, palatal injections and intraperitoneal injections represent the major intervention method in in vivo testing. Humanized mouse models, subcutaneous bacterial injections or other animal models were not investigated in this review. We have described the objective, study design, main findings and conclusions of all the included studies, according to Table 1-9. Cathepsin K inhibitors Cathepsin K (CtsK) is a member of the papain superfamily (C1 protein family) of cysteine protease that plays an important role in the innate immune response and osteoclast-mediated bone resorption [23, 56]. It was previously identified as an osteoclast selective protease CtsK [57] abundantly expressed in human osteoclasts, osteoblasts, periodontal ligament cells, osteocytes, and fibroblasts. In the bone tissue, CtsK can cleave the triple helix and the telopeptides from the type I collagen fibers that constitute 90% of the bone organic matrix 51 [58]. In addition, this protease can also activate MMP-9 [59] and degrade type II collagen [60], osteonectin and osteopontin, thus inhibiting the activity of osteoclasts [58]. It is important to mention that CtsK inhibitors are able to prevent bone resorption without affecting osteoblastic activity. Therefore, the crosstalk between osteoblast and osteoclast is maintained, which is beneficial during bone remodeling [61]. A summary of main study outcomes is described down below (Table 1). Previous studies have described selective CtsK inhibitors that effectively reduce osteoclast resorption both in vitro and in vivo [62-64]. Furthermore, CtsK has been shown to be an efficient therapeutic strategy in pre-clinical studies, including inflammatory, metabolic and 52 autoimmune diseases, such as high fat acid-induced obese mice [65], experimental periodontitis [23, 24, 66] and collagen-induced arthritis (CIA) [66]. However, although CtsK inhibitor has potent inhibitory effects on osteoclast-mediate bone resorption, it has also been associated with some adverse side effects and undesired drug-drug interactions [61, 66, 67]. Researches have long held that inflammation and bone breakdown are the two major pathological features of periodontitis and rheumatoid arthritis (RA); consequently, prevention or reduction of these damaging events should be a main therapeutic objective. In this regard, Yue et al. [66] recently investigated the effect of CtsK inhibition on the course of a combined animal model of CIA and experimental PD through oral infection with P. gingivalis, a known periodontopathogenic bacteria. The results of this study have demonstrated that inhibition of CtsK by transfection of small interfering RNA (siRNA) resulted in diminished destruction of articular tissue and alveolar bone, and decreased macrophage numbers and inflammatory cytokine expression in the synovium, suggesting that CtsK inhibition might be implicated as a potential therapeutic strategy in future research of experimental PD and RA [66]. A previous study also demonstrated that inhibition of CtsK effectively suppresses autoimmune inflammation of the joints as well as osteoclastic bone resorption in autoimmune arthritis [68]. Pan et al. [69] have used an experimental periodontitis model through oral bacterial inoculation combined with CIA in DBA/1J mice. One week before establishing the combined diseases, animals were treated with CtsK inhibitor BML-244. The data demonstrated that the alveolar bone resorption and paw swelling were more severe when these two comorbidities were present simultaneously. Furthermore, inhibition of CtsK reduced inflammatory cytokine production and infiltration by dendritic cells and T cells. Consequently, bone loss in PD and RA was abrogated as measured by bone erosion in periodontal lesions and cartilage destruction in knee joints. Inhibition of CtsK also decreased the expression of Toll-like receptor (TLR) 4 and TLR9 in vivo [69]. As previously stated, CtsK also has functions in dendritic cells through the TLR9, which plays a pivotal role in innate immunity recognition of microbial products and in the 53 activation of immune host defense [23, 68]. In this context, Hao et al. [23] evaluated whether inhibition of CtsK would benefit both the immune system and bone system during the progression of bacteria-induced periodontitis in a mouse model. A small molecular inhibitor, odanacatib, was orally administered into the mouse mouth one week prior to experimental PD establishment. This study demonstrated that oral application of odanacatib decreased the number of osteoclasts, T cells and macrophages, and toll-like receptors, thus preventing bone loss and exacerbated immune response during the progression of PD [23]. Another study evaluated the inhibition of CtsK through adeno-associated virus (AAV) expressing CtsK small hairpin to silence CtsK [24]. Experimental PD was induced by oral gavage with P. gingivalis. AAV-sh-CtsK was administered locally into the palatal gingival tissue. The data demonstrated that inhibiting CtsK drastically protected the mice from P. gingivalis-induced bone loss (>80%) and significantly reduced inflammation in the gingival tissue. The authors suggested that inhibition of CtsK can target both inflammation and bone resorption and efficiently protect against periodontal bone destruction. Indeed, the use of CtsK inhibitors for the treatment of osteolytic diseases remains promising. However, in contrast to current anti-resorptive agents, which target the osteoclast cells, CtsK inhibitors can cause effects in other tissues, as the enzyme is not only present in bone cells but also engages in several other metabolic processes and regulatory pathways. The challenge, then, is to develop more specific inhibitors, which act on the osteolytic activity of the CtsK, without affecting the activity of other enzyme catalytic sites, decreasing the chance of side effects [61, 70]. CtsK activity is regulated by endogenous cysteine proteinase inhibitors, such as cystatin C, which has a high binding affinity to cysteine proteinases [71]. These proteins are capable of inhibiting osteoclastogenesis and bone resorption in vitro and in an ex vivo model [72, 73]. Recently, our group demonstrated that natural inhibitors of cysteine peptidase derived from Citrus sinensis, named phytocystatin CsinCPI-2 was effectively in decrease the gene expression levels of cathepsin K, cathepsin B, IL-1β, and TNF-α. In addition, CsinCPI-2 significantly inhibited in vivo the activity of TNF-α in the blood of rats, previously stimulated by E. coli lipopolysaccharide (LPS). These data suggested that CsinCPI-2 has a potential anti-inflammatory effect during bacteria infection in rats [74]. Moreover, we have just showed that the phytocystatin CsinCPI-2 was able to control the inflammatory process 54 and inhibit osteoclastogenesis and loss of alveolar bone in a mouse model of ligature-induced experimental PD [75]. Bisphosphonates Bisphosphonates, particularly nitrogen-containing ones, such as zolendronate and alendronate, are antiresorptive agents commonly used to treat bone metabolic diseases such as osteoporosis and bone neoplasia, Paget disease and multiple myeloma. Bisphosphonates inhibit functioning osteoclasts by impairing differentiation, disrupting the cytoskeleton, decreasing intracellular transport, and inducing apoptosis, and does so through the inhibition of farnesyl diphosphate synthase in the cholesterol biosynthesis pathway, which prevents prenylation of small guanosine triphosphatase signaling proteins [76-78]. Some of the described studies is described in table 2. Despite its beneficial effects in inhibiting bone resorption in osteolytic diseases, the use of bisphosphonates, especially intravenous administration of high doses of zolendronate, are associated with adverse side effects. The most significant effect associated with 55 bisphosphonate administration is the osteonecrosis of the jaw (ONJ), a condition defined as an area of exposed bone in the maxillofacial region that does not heal after 8 weeks in patients receiving antiresorptive therapies [79, 80]. Furthermore, atypical fractures are also related to the long-term use of bisphosphonate due to its high maintenance of the drug into the bone tissue. On the other hand, the oral administration of alendronate to treat osteoporosis has shown to have a 0% to 0.4% chance of inducing ONJ [81]. Consequently, several studies have investigated the beneficial effects of alendronate administration to manage experimental periodontitis in rats [34, 36, 82, 83] and PD in clinical trials [84-86]. One of the first studies that have used alendronate as adjunctive therapy to manage experimental PD was conducted by Brunsvold et al. in 1992 [87]. In this study, the authors have induced experimental PD in monkeys by placing a ligature around the mandibular premolars and molars followed by oral inoculation of P. gingivalis one week after alendronate administration. Alendronate was administered intravenously for 16 weeks, and clinical and radiographical analyses were performed. The authors demonstrated that 0.05 mg/kg alendronate treatment reduced the progression of PD, suggesting its use to treat PD. Similarly, Moreira et al. [35] have shown that 2.5 mg/kg alendronate administration in rats with experimental PD reduced the activity of osteoclasts and significantly decreased the resorption of the alveolar bone crest. However, after 21 days of treatment, some animals developed signs of ONJ due to the reduced activity of osteoclast. The authors pointed out that using alendronate to treat experimental PD in rats might increase the risk of ONJ development. The use of alendronate as adjunctive to scaling and root planning (SRP) in rats with induced PD was evaluated by de Almeida et al. [34]. Rats with ligature induced-PD received SRP after ligature removal associated with topical application of alendronate. The animals assigned to receive SRP plus alendronate showed less local inflammation and better tissue repair, associated with higher expression of osteoprotegerin (OPG) immunolabeling, suggesting that the treatment employed might be effective in the treatment of PD in rats. A recent systematic review investigated the potential use of bisphosphonate as an adjuvant to SRP in 13 clinical trials [88]. The results of this systematic literature review demonstrated 56 that locally or systemically administered alendronate reduced probing pocket depth and resulted in a gain of clinical attachment level and improved radiographic assessment. Indeed, bisphosphonate as an adjuvant to SRP may result in clinical benefits in patients with PD. However, the risk to ONJ development after bisphosphonate administration limits their clinical use. OPG-Fc and RANKL inhibitors The discovery of the RANK, RANK ligand (RANKL) and OPG axis has revealed its pivotal role in regulating bone metabolism and created a new field for the study of bone-related diseases [11]. Binding of RANKL to RANK results in the differentiation and maturation of osteoclast precursor cells to activated osteoclasts. Therefore, blocking the interaction between RANK and RANKL is accountable for inhibiting osteoclast differentiation, and it is considered an interesting alternative to inhibit bone loss in osteolytic lesions. Acting as a soluble decoy receptor for RANKL, OPG binds to RANKL and inhibits osteoclast development preventing it from binding to RANK. OPG has been evaluated in pre-clinical studies of experimental PD as a therapeutic compound for counteracting bone loss (Figure 2). 57 Fig. 2 - Denosumab acts similarly to OPG, which is RANKL's natural decoy receptor; Denosumab binds to RANKL, preventing the binding of RANKL to its receptor, RANK, on the surface of osteoclasts and also on osteoclast precursors. Thus the RANK signaling pathway is not activated, resulting in impaired osteoclast precursor differentiation and function and possibly osteoclast apoptosis. All these effects lead to inhibition of bone resorption. Bisphosphonates act on osteoclasts, but not on their precursors. Bisphosphonates are internalized into osteoclasts possibly by endocytosis. Subsequently, Bisphosphonates inhibit FPP synthase, a key enzyme in the mevalonate signaling pathway. This leads to impaired intracellular protein prenylation impairing osteoclast function and apoptosis. Thus, bone resorption is inhibited. The pioneering study that has used OPG to treat experimental PD was performed by Teng et al. in 2000 [89]. Using an oral inoculation infection model with A. actinomycetemcomitans in mice, the authors demonstrated that in vivo inhibition of RANKL function with OPG treatment reduces alveolar bone loss and decreases the number of osteoclasts after microbial challenge. These data imply that OPG treatment may thus have therapeutic value to prevent alveolar bone and/or tooth loss in human periodontitis. These findings parallel observation made by Mahamed et al. [90] that showed reversal of alveolar bone loss in diabetic mice treated with the RANKL antagonist OPG. Using an acute model of ligature-induced bone loss, Jin et al. [25] demonstrated protective effects of OPG-Fc during experimental PD with significant preservation of alveolar bone. Therefore, OPG revealed robust preventive effects on alveolar bone resorption in experimental PD, thus showing a promising therapeutic potential of OPG for PD treatment. Moreover, an anti-RANKL monoclonal antibody denominated denosumab has been developed and used to treat bone metabolic diseases such as osteoporosis and metastatic bone cancers and other osteolytic bone conditions such as periodontitis and arthritis. Denosumab binds directly to the RANKL to prevent its interaction with RANK on osteoclasts. This binding inhibits osteoclast formation, differentiation, and function [78], and thus inhibiting bone resorption. Denosumab does not bind to mouse RANKL; therefore, studies have used an anti-mouse monoclonal RANKL to investigate its potential effects on mice. In this context, Kuritani et al. [91] investigated the effects of systemic administration of anti-RANKL during the progression of ligature-induced bone loss in mice. The study 58 findings showed that anti-RANKL antibody strongly suppressed alveolar bone loss associated with periodontitis in a ligature mouse model. However, similar to bisphosphonates, the potential risk of development of medication-related osteonecrosis of the jaw [92-95], the use of denosumab or RANKL inhibitors as an adjunctive treatment for PD is not indicated. Table 3 depict the main study outcomes with RANK-L inhibitors. Strontium ranelate (SR) SR, an antiresorptive compound mainly used for osteoporosis treatment, is a silver-white and soft metallic chemical element. It is placed primarily in areas where mineralization of new bone occurs, such as regions experiencing intramembranous or endochondral ossification [96]. SR is located in the periodic table right down the calcium, and for this reason, it possesses structural and functional similarity to the bone tissue. SR is known as a 59 divalent cation that has atomic and ionic properties related to calcium and is also considered as a dual-acting agent that diminishes bone resorption by decreasing osteoclastic activity and stimulating bone formation by replication of preosteoblast, and secondarily increasing the activity of functional cells and synthesis of bone matrix and collagen [97, 98]. This dual- acting mechanism of SR (concomitant anti-resorptive and osteoanabolic dual biological activity) represents an advantage over bisphosphonates. Thus, SR is able to increase biomechanical and structural properties of bone, such as mineral density [99]. There are two possible mechanisms of action presented in literature about SR: 1) activating calcium- sensing receptor or another cation-sensing receptor, and 2) increasing expression of OPG in addition to decreasing RANKL expression by osteoblasts [100]. One of the first studies investigating the efficacy of SR in preventing bone resorption was made by Marie et al. [101]. This study tested low SR doses on bone loss induced by estrogen deficiency in female rats. Treatment for 60 days with SR resulted in a dose-dependent increase in plasma, urine, and bone strontium concentrations without any deleterious effect on total or skeletal growth. Furthermore, treatment of OVX rats with SR prevented bone loss and bone mineral content was restored to the values in sham rats. Moreover, SR treatment increased the trabecular bone volume up to 30%. On the other hand, two other studies showed that SR administration did not counteract the loss in bone architecture and bone strength in ovariectomized rats [102, 103]. These contradictory findings lead to a deeper investigation of the potential role of SR in other inflammatory diseases such as PD. In this context, Karakan et al. [26] investigated the effects of SR administration in rats with ligature-induced PD. Three different dosages of SR were used: 300, 625 and 900 mg/kg and the administration was performed daily by oral gavage. The rats were euthanized 11 days after ligature placement. The results indicated that SR leads to decreased bone loss and reduced osteoclast number. In addition, the number of osteoblast cells was significantly increased after SR treatment. Collectively, t