RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 27/08/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Paola Gyuliane Gonçalves Avaliação da deleção de MTAP no desenvolvimento e resposta a terapia e imunoterapia em glioblastomas Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Patologia. Orientador (a): Prof. Dr. Lucas Bidinotto Botucatu 2025 2 Paola Gyuliane Gonçalves Avaliação da deleção de MTAP no desenvolvimento e resposta a terapia e imunoterapia em glioblastomas Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Patologia. Orientador: Prof. Dr. Lucas Bidinotto Botucatu 2025 3 Ficha catalográfica 4 Impacto potencial desta pesquisa Impacto científico esperado: Considerando que os glioblastomas (GBM), tumores cerebrais extremamente agressivos e com prognóstico ruim associado a resistência aos tratamentos convencionais, possuem alta frequência de deleção de MTAP, a relevância clínica reside na possibilidade exploratória desta característica na busca de um tratamento mais efetivo. Caracterizamos o fenótipo dos tumores e exploramos tratamentos alternativos baseado na deleção ou não deste gene. Os resultados encontrados apontam para a combinação de duas drogas que podem alterar o crescimento das células neoplásicas, deletadas para MTAP, com pouco impacto nas células MTAP positivas, teoricamente não-neoplásicas. Importante, mostramos que a combinação destas drogas pode ser utilizada em tumores cerebrais, pois é capaz de cruzar a barreira hematoencefálica. Por fim, caracterizamos o microambiente dos tumores, baseado na deleção de MTAP, e sugerimos uma coorte de pacientes que não seriam elegíveis a imunoterapia, dado as características intrínsecas destes tumores. Impacto social: No momento, o tratamento padrão para glioblastoma (GBM) utiliza a mesma abordagem a todos os pacientes, e geralmente está associado a alta morbimortalidade. Baseado no conceito de tratamento personalizado, nossos resultados sugerem que futuramente a deleção de MTAP, que ocorre em quase 60% dos pacientes diagnosticados com GBM, pode ser utilizada como um biomarcador de resposta a tratamentos alternativos mais eficazes e na seleção de pacientes para futuros estudos de imunoterapia. Em última instância, isso poderá implicar na sobrevida e/ou qualidade de vida dos pacientes. Impacto econômico: Nossos estudos sugerem que a expressão de MTAP pode ser utilizada como biomarcador de resposta a terapias alternativas à padrão para o tratamento de glioblastoma (GBM). Esta expressão pode ser conferida de maneira simples e barata, como uma reação de imuno-histoquímica, e, caso os tratamentos sejam mais efetivos, em última instância, esperamos que a utilização deste biomarcador pode impactar economicamente o Sistema de Saúde, já que um tratamento mais efetivo pode levar a melhor resposta, logo, menos gastos com hospitalização, reinternação e cirurgias para tumor residual. 5 6 Dedico este trabalho a todos os camundongos que deram a vida para este estudo. Obrigado por contribuírem para minha formação e para o conhecimento científico, espero que um dia esse sacrifício seja revertido em melhorias no tratamento do câncer. 7 Agradecimentos Este trabalho se iniciou em março de 2020, juntamente com a covid-19 no Brasil. Isso trouxe ainda mais inseguranças e problemas a um doutorado que já não é conhecido por ser fácil. Foi quase um ano e meio afastada do laboratório, assistindo diariamente na TV o pânico que acometia o mundo, e o medo crescia juntamente com o número de mortes. Tenho comigo que ninguém passou imune a esse período, seja pela perda de um ou mais pessoas queridas, ou pelos problemas que a pandemia trouxeram. Eu mesma perdi alguém muito especial para mim, que sei que está orgulhosa de onde cheguei mesmo não estando aqui presencialmente. Então meu agradecimento neste trabalho é um pouco diferente, quero agradecer aos profissionais de saúde que se arriscaram naquele momento, que foram verdadeiros heróis e prestaram um serviço sem igual. A ciência e seus pesquisadores que conseguiram em tempo recorde criar vacinas e imunizar o mundo. As pessoas de serviços essenciais que não puderam parar e se colocaram em risco. Sem essas pessoas e suas contribuições eu não poderia ter dado continuidade a este trabalho, então a minha gratidão é para com elas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 88887.481047/2020-00 e CAPES-PRINT projeto de cooperação internacional 88887.310757/2018-00. 8 Taylor Swift – You are on your own kid. 9 RESUMO Glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral altamente agressivo e letal, caracterizado por crescimento rápido, resistência à terapia e prognóstico ruim. Estudos recentes enfatizaram o papel central da metiltioadenosina fosforilase (MTAP), uma enzima no metabolismo de purina e metionina, em vários tipos de câncer. Entretanto, o impacto do silenciamento do MTAP no GBM ainda não está claro. Neste estudo, investigamos os efeitos do silenciamento de MTAP no crescimento de GBM usando linhagens de células de glioblastoma e um modelo de xenoenxerto. O knockout de MTAP mediado por CRISPR-Cas9 em células de glioblastoma, implantadas em camundongos imuno deficientes, demonstrou que o silenciamento de MTAP atrasou significativamente o crescimento do tumor (p<0,001) e alterou a celularidade (p<0,009), fibrose (p<0,006) e necrose (p<0,0003) em xenoenxertos em camundongos imuno deficientes. Mecanicamente, a perda de MTAP interrompeu a proliferação (p<0,001), a migração (p<0,001) e a formação de colônias (p<0,001) em estudos in vitro. Além disso, o acúmulo de metiltioadenosina (MTA) no microambiente tumoral (TME) promoveu um ambiente imunossupressor e aumentou a angiogênese (p<0,0001), o que facilitaria a progressão do tumor. Também exploramos o potencial terapêutico da síntese de purina e dos inibidores de MAT2A no GBM deficiente em MTAP, sugerindo que a 2-Fluoroadenina (2-FA) inibiu a migração celular (p<0,0001), a formação de colônias (p<0,0001) e a viabilidade do tumor, particularmente em células com MTAP deletado. Além disso, na presença de MTA houve letalidade sintética apenas em células MTAP-/-, revertendo a citotoxicidade da droga nas células MTAP+/+. Entretanto, nenhuma letalidade sintética foi observada com pemetrexede ou AG-270. Essas descobertas destacam o silenciamento de MTAP como um potencial alvo terapêutico no GBM e sugerem que direcionar o metabolismo da purina pode oferecer uma estratégia promissora para tumores deficientes em MTAP. Mais estudos são necessários para validar esses resultados in vivo e avaliar a eficácia dos inibidores da via relacionada ao MTA no tratamento do GBM. Palavras-chave: Glioblastoma, MTAP, deleção, MTA, 2-FA, pemetrexede, AG-270. 10 ABSTRACT Glioblastoma (GBM) is a highly aggressive and lethal brain tumor, characterized by rapid growth, resistance to therapy, and poor prognosis. Recent studies have emphasized the role of methylthioadenosine phosphorylase (MTAP), an enzyme in purine and methionine metabolism, in various cancers. However, the impact of MTAP silencing in GBM remains unclear. In this study, we investigated the effects of MTAP silencing on GBM growth using glioblastoma cell lines and a xenograft model. CRISPR-Cas9-mediated MTAP knockout in glioblastoma cells, implanted into immunodeficient mice, demonstrated that MTAP silencing significantly delayed tumor growth (p<0.001) and altered cellularity (p<0.009), fibrosis (p<0.006), and necrosis (p<0.0003) in immunodeficient mouse xenografts. Mechanistically, MTAP loss disrupted proliferation (p<0.001), migration (p<0.001), and colony formation (p<0.001) in in vitro studies. Furthermore, Methylthioadenosine (MTA) accumulation within the tumor microenvironment (TME) promoted an immunosuppressive environment and enhanced angiogenesis (p<0.0001), which could, in turn, facilitate tumor progression. We also explored the therapeutic potential of purine synthesis and MAT2A inhibitors in MTAP-deficient GBM, finding that 2-FA inhibited cell migration (p<0.0001), colony formation (p<0.0001), and tumor viability, particularly in MTAP-deleted cells. Furthermore, in the presence of MTA there was synthetic lethality only in MTAP-/- cells, reversing the cytotoxicity of the drug in MTAP+/+ cells. However, no synthetic lethality was observed with PRMT5 inhibitors or AG-270. These findings highlight MTAP silencing as a potential therapeutic target in GBM and suggest that targeting purine metabolism may offer a promising strategy for MTAP-deficient tumors. Further studies are needed to validate these results in vivo and assess the efficacy of MTA-related pathway inhibitors in GBM treatment. Key-words: Glioblastoma, MTAP, deletion, MTA, 2-FA, pemetrexed, AG-270. 11 Sumário CAPÍTULO I ..................................................................................................... 12 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 12 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 15 ROLE OF MTAP IN HUMAN CANCERS: A REVIEW ........................................................ 17 OBJETIVOS ..................................................................................................... 37 CAPÍTULO II .................................................................................................... 38 MTAP SILENCING INHIBITS GLIOBLASTOMA CELL PROLIFERATION AND IN VIVO TUMOR GROWTH ...................................................................................................................... 38 INHIBITORS OF PURINE SYNTHESIS AND MAT2A AS A TARGET THERAPY TO MTAP DELETED GLIOBLASTOMA .................................................................................................. 56 MTA ACCUMULATION LEADS TO MICROENVIRONMENTAL CHANGES IN GLIOBLASTOMA ........ 73 CONCLUSÃO ................................................................................................... 86 ANEXOS.......................................................................................................... 87 12 Capítulo I Revisão da literatura Gliomas são responsáveis por aproximadamente 70% dos tumores cerebrais (1) e, embora representem menos de 2% dos tumores em geral, são considerados um importante problema de saúde pública, por caracterizarem a segunda maior causa de morte por câncer em pacientes na idade pediátrica e alta morbimortalidade nas demais idades (2). Estes tumores são divididos em astrocíticos, oligodendrogliais e ependimais, de acordo com a sua origem, e são separados em distintos graus de malignidade segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS). O Glioblastoma (GBM) corresponde à metade dos casos de glioma (1,2) e pode manifestar-se em qualquer idade. Geralmente afeta adultos, com um pico de incidência entre 45 e 75 anos de idade (3–5). Os GBMs são tumores letais, com uma média de sobrevida de aproximadamente 14 meses, e menos de 10% dos pacientes vivem dois anos após o diagnóstico (5,6). A barreira hematoencefálica e algumas mutações garantem às células alta resistência aos medicamentos de rotina e a sua grande capacidade de infiltração no parênquima cerebral geralmente impede a ressecção cirúrgica completa (4). Além da cirurgia, a terapia padrão foi proposta por Stupp e colaboradores, através de radioterapia com quimioterapia concomitante, a temozolamida (5). Temozolamida é um agente alquilante oral que possui atividade antitumoral comprovada no tratamento de glioblastoma, entretanto, mesmo com o uso da droga, a média de vida dos pacientes é de 14 meses (5). Além disso, déficits cognitivos e repercussões endócrinas acompanham os pacientes durante o tratamento (7), e taxa de cura dos casos de GBM continua muito baixa. Portanto, novos estudos acerca de suas bases moleculares e a melhor compreensão da gênese destes tumores pode levar ao desenvolvimento de novas opções terapêuticas (7,8). Alterações no número de cópias (CNAs) de pequenas ou grandes porções 13 do genoma (instabilidade cromossômica) podem levar à amplificação de oncogenes ou deleção de genes supressores tumorais. Nosso grupo de pesquisa perfilou as CNAs mais frequentemente encontradas em gliomas na população Brasileira, tais como ganho do cromossomo (chr) 7, amplificação de EGFR, perdas em chr9, chr10, chr13 e deleção homozigótica na região chr9p22.1-p21.3 (9), e estes achados estão de acordo com as alterações descritas na literatura mundial (10). A deleção em chr9p22.1-21.3, região detentora dos supressores tumorais CDKN2A e CDKN2B, foi encontrada em aproximadamente 50% dos glioblastomas na população Brasileira (9). Análises in silico, usando o The Cancer Genome Atlas (TCGA), também demonstraram frequência de deleção maior que 50% desta região em glioblastomas (11). A deleção de CDKN2A passou a ser utilizada na classificação da OMS em 2021 - se um astrocitoma difuso mutante IDH exibir deleção homozigótica dos genes CDKN2A/B, ele é designado como um glioma de alto grau, mesmo que características histológicas de malignidade, como necrose e proliferação microvascular, estejam ausentes (1). Além de CDKN2A/B, análises in silico demonstraram outros potenciais genes supressores tumorais presentes nesta região, tais como PTPLAD2, ELAVL2, MLLT3, KIAA1797, vários genes da família dos interferons e MTAP (11). O gene MTAP codifica a enzima metiltioadenosina fosforilase (MTAP), que é essencial para os processos de reciclagem de adenina e metionina formados durante a degradação dos nucleotídeos. A enzima catalisa o processo de clivagem do subproduto 5’-deoxi-5’-metiltioadenosina (MTA), gerado durante a biossíntese de poliaminas, em adenina e 5-metil-tioribiose- 1-fosfato (MTR-1-P) (Figura 1) (12). Este servirá de substrato para formar metionina. Adenina será convertida em adenosina monofosfato (AMP) pela enzima adenina fosforribosil transferase (APRT), utilizando o grupo fosforribosil do monossacarídeo fosforribosil pirofosfato (PRPP) e, por fim, 16 targeted therapies. Trends Molecular Medicine. 2009;15(11):519–30. 5. Stupp R. 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