UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL AÇÃO DE FÁRMACOS NAS CONTRAÇÕES DA MUSCULATURA DA CÉRVIX DE SUÍNOS 2015 Luciana Cristina Padilha Nakaghi Médica Veterinária UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL AÇÃO DE FÁRMACOS NAS CONTRAÇÕES DA MUSCULATURA DA CÉRVIX DE SUÍNOS Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária, área de Reprodução Animal. 2015 Luciana Cristina Padilha Nakaghi Orientador: Prof. Dr. Wilter Ricardo Russiano Vicente Coorientadoras: Profa. Dra. Maria Emilia Franco Oliveira Profa. Dra. Erika da Silva Carvalho Morani Padilha-Nakaghi, Luciana Cristina P123a Ação de fármacos nas contrações da musculatura da cérvix de suínos / Luciana Cristina Padilha Nakaghi. – – Jaboticabal, 2015 xii, 66 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente Coorientadoras: Maria Emilia Franco Oliveira, Erika da Silva Carvalho Morani Banca examinadora: Eliandra Antonia Pires Buttler, Luís Guilherme de Oliveira, Giuliano Queiroz Mostachio, Fabiana Azevedo Voorwald Bibliografia 1. Banho de órgão. 2. Colo do útero. 3. Contração neurogênica. 4. Contração espontânea. 5. Relaxamento. 6. Porca. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:636.082:636.4 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Luciana Cristina Padilha Nakaghi nasceu em Campinas – SP, no dia 02 de agosto de 1983, filha de Glória Regina Candolo Padilha e Nivaldo Padilha. É Médica Veterinária graduada em 2007 pela Universidade Estadual de Londrina – PR. Durante a graduação realizou duas iniciações científicas na área de Reprodução Animal, sendo monitora da disciplina de “Teriogenologia de Pequenos Animais”. Do período de Fev/2008 até Jan/2010 foi residente do setor de Obstetrícia Veterinária e Reprodução Animal do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal – SP. Em Fev/2010 ingressou no Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, área de Reprodução Animal, nesta mesma unidade, obteve o título de Mestre em Fev/2012 e iniciou o Doutorado em Março do mesmo ano e no mesmo programa. Até hoje continua atuando no setor de Obstetrícia Veterinária e Reprodução Animal. “A nossa maior glória não reside no fato de nunca cairmos, mas sim em levantarmo-nos sempre depois de cada queda.” (Oliver Goldsmith) DEDICO, Aos meus pais, sempre... Ao meu marido, meu companheiro e meu amor... Ao meu avô Luiz, saudades... AGRADECIMENTOS As palavras muitas vezes não saem da maneira exata como queremos e as lágrimas que correm antes delas, embaçam tudo. Então, a todos que aqui estão escritos, meus sinceros agradecimentos, por mais que eu não consiga me expressar como gostaria. A Deus pelas tantas oportunidades que me deu e me dá nesta vida, sendo a conclusão deste trabalho mais uma delas. Deus não nos desampara, e por tudo que passei nestes anos de doutorado Ele esteve em todos os momentos me confortando e me dando forças para continuar. Aos meus pais, Nivaldo e Glória, meus heróis... tudo que lhes posso oferecer é muita gratidão, amor e respeito. Obrigada por esta família maravilhosa que construíram, pela união, pela educação, pelos princípios e pelo apoio que sempre me deram. Sou feliz pela certeza que sempre estarão ao meu lado. Amo vocês! Aos meus queridos irmãos, Maura e Guilherme, meu cunhado Robinson e às minhas amadas sobrinhas Julia e Luiza, obrigada por tornarem esta família ainda melhor e mais feliz. Tudo que sou e construí também devo a vocês. Mais uma vez, a certeza do apoio e que estaremos sempre juntos me faz seguir em frente sem medo. Amo vocês! Ao meu marido, pessoa maravilhosa, de generosidade imensurável, de coração enorme e que aprendo tanto a cada dia... aprendo a ser uma pessoa melhor e que é possível amar cada dia mais. Quando acho que já amo tudo o que é possível, no dia seguinte consigo amá-lo mais e mais... eternamente... A sua ajuda e apoio em todos os momentos foram essenciais para conclusão deste trabalho. Agradeço mais ainda pelo nosso já tão amado filho, Kenzo, que veio para nos completar e tornar nossa família ainda mais feliz. A toda minha família, avós, tias, tios, primas e primos, que são meus anjos da guarda. O meu muito obrigada por esta família maravilhosa, de princípios, de coração enorme e de muita felicidade. Estaremos sempre juntos! A família Okada e Nakaghi (Nakaji, Nakage...), pela qual tenho muito respeito e gratidão. Em especial ao Sr Edson, D. Laura, Leonardo e Ricardo, que desde o primeiro momento me acolheram com tanto carinho. Sou muito grata e feliz de poder fazer parte dessa família! Ao meu querido e eterno orientador, Professor Wilter. Parabéns pela sua carreira brilhante, honrosa e de muito sucesso. A certeza desse caminho, traçado com esforço, mas simplesmente pela pessoa maravilhosa que é, nota-se pelo imenso carinho, gratidão, respeito e orgulho que nós, seus orientados, filhos e amigos, sentimos pelo senhor. Em todos esses anos de Unesp, o senhor sempre esteve ao meu lado, apoiando-me e sendo meu porto-seguro. Tudo que aprendi e amadureci devo ao senhor, que sempre me mostrou o caminho e as oportunidades. Com toda sinceridade e do fundo do meu coração: muito obrigada! As minhas também queridas coorientadoras Maria Emília e Erika Morani que sempre me ajudaram prontamente. Obrigada por toda dedicação, apoio e ensinamentos que me dispensaram. Vocês foram essenciais para conclusão deste trabalho. Ao Professor Vincent Wilson, da “University of Nottingham” pela receptividade e oportunidade. Meus sinceros agradecimentos por todos os ensinamentos dentro e fora do laboratório. Esta experiência foi maravilhosa graças a sua paciência e generosidade. Um exemplo de pessoa e pesquisador. Os meus agradecimentos se estendem à sua esposa Marylin e, em especial à nossa amiga Maria Augusta, uma pessoa excepcional, que foi essencial para que minha estadia em Nottingham fosse possível e incrível. Aos meus queridos amigos que me ajudaram na realização do doutorado e que passamos bons momentos, risadas e “almoços” juntos no sítio: Beatrice, Efigênia, Felipe, Guilherme “Bolado”, Giovanna, Leandro, Maria Emília, Naka, Renata, Ricardo Uscategui, Ricardo Perecin, Victor e estagiários. À Fabiana, Caio e Eliandra, também queridos amigos que me ajudaram muito no laboratório. Complemento meus agradecimentos a todos os amigos do Setor de Obstetrícia Veterinária e Reprodução Animal, que também sempre estiveram pronto para me ajudar e que me proporcionaram momentos muito felizes e agradáveis: Alanna, Ana Paula Perini, Ana Paula Simões, Arnildo, Beatriz “Migalha”, Carla D’Amato, Edson, Elaine, Guilherme Rossi, Isabel, Ivo, D. Izilda, Juliana Borges, Lindsay, Marina Brito, Marina Ragagnin, Marcus, Milena Montans, Naiara, Patrícia Monteiro, Pedro Paulo, Priscila, Roberta Vantini e Valeska. A duas pessoas que sentaram comigo e incansavelmente lutaram para tornar este trabalho possível: Ricardo Uscategui e Maria Emília. Muito obrigada por toda ajuda! Um agradecimento especial aos meus grandes amigos que me ajudaram muito desde a época da residência e que persistimos juntos neste caminho: Ana Paula Gering, Aracélle, Beatrice, Caio, Diogo, Eliandra, Fabiana, Giuliano, Marco Augusto, Mariana, Maricy, Paula Savi, Raquel e Tathiana. Muito obrigada por todo carinho e amizade! A Eli, Paulinha e Tathi pelas longas horas de trabalho, conversas, desabafos, “papo furado”, guloseimas e risadas. Vocês são amigas muito especiais! A Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp, em especial à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias e ao Programa de Pós- graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade de realizar meu doutorado em uma renomada universidade. A CAPES pela concessão da bolsa de doutorado no Brasil e no exterior. Aos Professores do departamento de Reprodução Animal: Cesar Roberto Esper, Francisco Guilherme Leite, Gilson Hélio Toniollo, Joaquim Mansano Garcia, Lindsay Unno Gimenez, Paulo Henrique Franceschini, Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, meus sinceros respeito e gratidão. Obrigada por todo ensinamento e convivência com mestres que muito me ajudaram a crescer. A todos os professores e funcionários do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” que tive o prazer de conviver, adquirir conhecimentos e dividir experiências desde a residência. Tenho muito carinho por todos. A Professora Laura Nakaghi, meus sinceros agradecimentos por sempre disponibilizar seu laboratório para ajudar em nossos estudos. Sua generosidade e apoio foram essenciais! As minhas amigas-irmãs de Campinas: Bia, Bianca, Dani, Letícia, Lu Souza, Patrícia, Paula, Tânia, Tati e Valéria e amigos-irmãos Caio, Rubens e Zaia. São mais de 25 anos (perdi as contas...) de amizade pura, verdade e sincera. Sei que sempre me acompanham e apoiam mesmo de longe. Verdadeiras amizades não acabam com o tempo e a distância, são para a vida toda. Vocês estão no meu coração! Aos amigos conquistados durante minha estadia em Nottingham, Alaa, Ayla, Daniel, Hamidah, Fawaz, Robert e Pui San, meus sinceros agradecimentos pela acolhida e amizade que foram essenciais durante essa experiência. A todos os animais, seres divinos, que me ensinam tanto e são a razão de eu ser tão feliz na minha profissão. Um agradecimento especial aos meus três “pequenos”, que possuem um amor muito puro e que demonstram isso todos os dias: Boca, Maia e Sombra. Muito obrigada a todos!! i SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................... iii LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. v LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ vi RESUMO ............................................................................................................................................... xi ABSTRACT .......................................................................................................................................... xii 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................................... 3 2.1. Aspectos morfofisiológicos da cérvix .......................................................................... 3 2.2. Inervação autônoma da cérvix e útero .................................................................................. 6 2.2.1. Efeito dos receptores adrenérgicos e muscarínicos sobre a musculatura lisa ........ 7 2.2.1.1.Receptores adrenérgicos ............................................................................................... 7 2.2.1.2.Receptores muscarínicos .............................................................................................. 8 2.2.2. Farmacologia da musculatura lisa uterina e cervical ................................................... 9 2.2.2.1.Receptores adrenérgicos ............................................................................................. 10 2.2.2.2. Receptores muscarínicos ........................................................................................... 12 2.2.2.3.Mediadores intracelulares ............................................................................................ 14 3. HIPÓTESE ...................................................................................................................................... 15 4. OBJETIVOS .................................................................................................................................... 15 4.1 Geral .......................................................................................................................................... 15 4.2 Específicos ................................................................................................................................ 15 5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................. 16 5.1. Local ......................................................................................................................................... 16 5.2. Material utilizado ..................................................................................................................... 16 5.3. Colheita de material ............................................................................................................... 17 5.4. Preparação do material.......................................................................................................... 18 5.5. Protocolos ................................................................................................................................ 21 5.5.1. Curva de resposta às frequências (CRF) .................................................................... 22 5.5.2. Curvas de resposta-concentração (CRC) ................................................................... 24 5.6. Pesagem dos segmentos ................................................................................................... 25 5.7. Análise de dados .................................................................................................................... 25 ii 5.8. Análise estatística ................................................................................................................... 26 6. RESULTADOS ............................................................................................................................... 26 6.1. Contrações espontâneas ....................................................................................................... 26 6.1.1. Análises qualitativas........................................................................................................ 26 6.1.2. Análises quantitativas ..................................................................................................... 29 6.2. Respostas de contração neurogênica à estimulação elétrica de 10Hz e 2-32Hz (CRF) ........................................................................................................................................................... 30 6.2.1. Análise qualitativa............................................................................................................ 30 6.2.2. Análise quantitativa ......................................................................................................... 33 6.3. Curvas de Respostas às Frequências – Cérvix ................................................................. 37 6.3.1. Atropina ............................................................................................................................. 37 6.3.2. Atropina e Fentolamina .................................................................................................. 39 6.3.3. L-NAME ............................................................................................................................. 40 6.4. Curvas de respostas-concentração ..................................................................................... 40 6.4.1. Prazosina e fenilefrina .................................................................................................... 40 6.4.2. Fenoxibenzamina e carbacol ......................................................................................... 41 6.4.3. Isoprenalina, Diltiazem e Papaverina ........................................................................... 43 6.4.4. UK114542 e RP73401 .................................................................................................... 46 6.5. Pesagem dos segmentos ...................................................................................................... 48 7. DISCUSSÃO ................................................................................................................................... 48 8. CONCLUSÃO ................................................................................................................................. 54 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................................... 55 10. REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 56 APÊNDICE .......................................................................................................................................... 66 iii LISTA DE ABREVIATURAS µM – micromolar (10-6); % - porcentagem; °C – Grau Celsius; AC – adenilato ciclase; ACh – Acetilcolina; AChE – Aceticolinesterase; AMPc - 3’-5’ adenosina monofosfato cíclico; ATP - Trifosfato de adenosina; Ca2+ - Íon cálcio; CaCl2.2H2O - Cloridrato de cálcio hidratado; ChAT – Colina acetiltrasnferase; CO2 – Dióxido de carbono; CRC - Curva de resposta-concentração; CRF - Curva de resposta às frequências; DAG – Diacilglicerol; EFE – Estimulação de força elétrica; g – Grama; GPCRs – Receptores acoplados à proteína G; Hz –Hertz; IP3 – Trifosfato inositol; KCl – Cloreto de potássio; KCLM – Cadeias leves de miosina; KH2PO4 - Ortofosfato diidrogenado de potássio; L-NAME - N-nitro-L-arginina-metil-ester; iv Log – logarítimo; mA – Miliampere; MC – Músculo liso circular; mg – Miligrama; mL – Mililitro; ML – Músculo liso longitudinal; mm – Milímetro; mM – Milimolar (10-3); M – Molar; MgS04.7H2O - Sulfato de magnésio hidratado; Min – Minuto; NaCl - Cloreto de Sódio; NaHCO3 - Bicarbonato de sódio; O2 - Gás oxigênio; PDE – Fosfodiesterase; PKA - Proteína quinase dependente de AMPc; RP73401 - 3-cyclopentyloxy-N-(3,5-dichloro-4-pyridl)-4-methoxybenzamine; s – Segundo; SNC – Sistema Nervoso Central; UK114542 - 5-[2-ethoxy-5-(morpholinylacetyl)phenyl]-1,6-dihydro-1-methyl-3-propyl- 7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one methanesulfonate monohydrate. v LISTA DE TABELAS Tabela 1: Ação principal dos fármacos utilizados nos experimentos.................................................................................... 17 Tabela 2: Contrações espontâneas (média ± erro padrão) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corno e corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs-Henseleit: força de contração (magnitude em g) e frequência das contrações (nº de contrações/5 min). Nottingham, 2014......................................... 29 Tabela 3: Respostas (média ± erro padrão) força de contração de contração neurogênica (magnitude em g) à estimulação elétrica de 10, 2, 4, 8, 16 e 32 Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs-Henseleit. Os segmentos que responderam à respectiva frequência estão apresentados em proporção. Nottingham, 2014.......................................................... 34 Tabela 4: Período de tempo (média ± erro padrão) em segundos (s) após resposta de contração neurogênica à estimulação elétrica de 10, 2, 4, 8, 16 e 32Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs-Henseleit. Nottingham, 2014............. 36 Tabela 5: Peso dos segmentos isolados das musculaturas lisas longitudinais (ML) e circulares (MC) da cérvix e útero (corno e corpo) de suínos utilizados nos experimentos com banho de órgão. Todos os segmentos foram secos da mesma maneira previamente à pesagem. Nottingham, 2014.................................... 48 vi LISTA DE FIGURAS Figura 1: Imagem fotográfica de peça anatômica do trato reprodutivo de fêmea suína pré-púbere, indicando ovários, útero (corpo e cornos), cérvix e parte cranial da vagina (Arquivo pessoal)......... 18 Figura 2: Imagens fotográficas ilustrando: A - Segmento de musculatura lisa do útero ou cérvix de suínos (seta), com ligaduras de fios de algodão atadas em cada extremidade, sendo uma das extremidades presa a suporte de acrílico entre dois eletrodos paralelos de platina. B - Segmento de musculatura lisa do útero ou cérvix de suínos (seta) suspenso verticalmente em banhos de órgão isolado de 20 mL, contendo solução modificada de Krebs-Henseleit (pH 7,4), gaseificada com 95% O2: 5% CO2 a 37°C (Arquivo pessoal)................................................................. 19 Figura 3: Imagens fotográficas ilustrando: A – Banhos de órgão isolado de 20mL cada, onde os segmentos ficavam suspensos verticalmente e imersos em solução modificada de Krebs- Henseleit. B – Circulador e aquecedor de água para a manutenção da temperatura em 37°C nos banhos de órgão. C – Amplificador com 4 canais (Arquivo pessoal)............................ 20 Figura 4: Protocolo inicial comum para todos os experimentos. Primeiro, as preparações ficaram 30 min na solução, sem aplicação de tensão; segundo, foi aplicado 15g de tensão (seta) sob os segmentos e aguardado que fosse estabilizada uma tensão entre 2-3g por 30 min; terceiro, adicionado KCl (60mM; seta) à solução; quarto, após 15 min, foi feita a 1ª lavagem (seta) dos os banhos de órgão com solução modificada de Krebs- Henseleit, e após 5 min, a 2ª lavagem (seta); quinto, foi permitido o equilíbrio por mais 40 min.......................................... 21 Figura 5: Esquema ilustrativo dos protocolos realizados: curva de resposta às frequências (CRF) e curva de resposta- concentração (CRC)..................................................................... 22 vii Figura 6: Esquema do protocolo de curva de resposta às frequências, aplicado nas camadas de musculatura lisa do útero e cérvix de suínos em solução modificada de Krebs-Henseleit em banhos de órgão....................................................................................... 23 Figura 7: Traços representativos ilustrando aplicação inicial de tensão (15g) seguida de relaxamento, adição de KCl produzindo contração rápida e então retorno das contrações espontâneas das camadas da musculatura lisa do corno do útero de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min................................................................................................ 27 Figura 8: Traços representativos ilustrando aplicação inicial de tensão (15g) seguida de relaxamento, adição de KCl produzindo contração rápida e então retorno das contrações espontâneas das camadas da musculatura lisa de suínos: a) Circular do corpo do útero; b) Longitudinal do corpo do útero; c) Circular da cérvix; d) Longitudinal da cérvix. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min........................................................................................... 28 Figura 9: Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do corno uterino de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam relaxamento do músculo pós-estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min................................................................................ 31 Figura 10: Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do corpo uterino de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam período de quiescência muscular pós-estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min...................................................... 32 Figura 11: Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do corpo uterino de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam período de quiescência muscular pós-estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min...................................................... 33 viii Figura 12: Representação gráfica do efeito da estimulação de força elétrica (2-32Hz) na musculatura lisa longitudinal (a) e circular (b) do útero e cérvix de suínos. As respostas estão expressas em média±erro padrão.................................................................. 35 Figura 13: Representação gráfica do período de tempo (média ± erro padrão) após resposta de contração neurogênica à estimulação elétrica de 2-32Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (a) e circular (b) do corpo do útero e da cérvix de suínos............................................................................................ 37 Figura 14: Representação gráfica de comparação de respostas de contração da musculatura lisa circular (a) e longitudinal (b) da cérvix de suínos após exposição de 0,3µM do fármaco atropina. As respostas estão apresentadas em média ± erro padrão das observações em 9 de 12 animais diferentes................................ 38 Figura 15: Traços representativos da atividade contrátil da musculatura lisa circular da cérvix de suínos em resposta a estimulação de força elétrica (32Hz, 300mA, 30s) antes (a) e após (b) à exposição de 0,3µM do fármaco atropina. A atropina aboliu as contrações neurogênicas em todas as frequências, porém não afetou as contrações espontâneas. Escala: magnitude 2g e tempo 10 min................................................................................ 39 Figura 16: Traço representativo mostrando a ausência de efeito do L- NAME (100µm) sobre a resposta neurogênica (32Hz) e espontânea no músculo circular liso de suínos. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min...................................................... 40 Figura 17: Representação gráfica da curva de resposta-concentração ao fármaco prazosina (0,01-3μM) nas musculaturas lisas longitudinal (ML) e circular (MC) da cérvix de suínos. Os resultados estão expressos em porcentagem de média±errro padrão em relação à última média da resposta de contração à 32Hz (medida antes da adição da primeira concentração da 41 ix prazosina). Não houve efeito sobre as contrações neurogênicas (p>0,05)......................................................................................... Figura 18: Traços representativos ilustrando a atividade da musculatura lisa circular da cérvix de suínos em resposta a estimulação elétrica (32Hz) e contrações espontâneas antes (a) e após (b) a exposição à 10µM de fenoxibenzamina. É possível observar redução das contrações neurogênicas e ausência das contrações espontâneas. Escala: magnitude 5g e tempo 5 min.. 42 Figura 19: Representação gráfica do efeito do aumento das concentrações do fármaco fenoxibenzamina (1-10μM) sobre a musculatura lisa circular da cérvix de suínos em relação às respostas de contração ao estímulo elétrico de 32Hz, antes e após remoção do fármaco. É possível observar que o efeito da fenoxibenzamina continua mesmo pós- lavagem.................................................................... 43 Figura 20: Representação gráfica dos efeitos dos fármacos isoprenalina (a), diltiazem (b) e papaverina (c) sobre as contrações neurogênicas (32Hz, 300mA, 30seg) das camadas da musculatura lisa longitudinal e circular da cérvix de suínos. As respostas estão expressas em porcentagem da resposta neurogênica a 32Hz sem o fármaco em média ± erro padrão........................................................................................... 44 Figura 21: Traços representativos da curva de resposta-concentração aos fármacos a) Isoprenalina (0,1-10µM), b) Diltazem (0,1-10µM) e c) Papaverina (0,3-30µM) sobre as respostas neurogênicas (32Hz, 300mA, 30s) da musculatura lisa circular da cérvix de suínos. Os pontos pretos significam as concentrações crescentes (sequencialmente em 0,5-log) dos fármacos adicionados em cada preparação. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min................................................................................ 45 x Figura 22: Representação gráfica dos efeitos dos fármacos UK114542 e RP73401 sobre as contrações neurogênicas (32Hz, 300mA, 30s) das camadas da musculatura lisa longitudinal (a) e circular (b) da cérvix de suínos. As respostas estão expressas em porcentagem da resposta neurogênica a 32Hz sem o fármaco em média ± erro padrão. Não houve efeito sobre as contrações neurogênicas (p>0,05).................................................................. 47 xi AÇÃO DE FÁRMACOS NAS CONTRAÇÕES DA MUSCULATURA DA CÉRVIX DE SUÍNOS RESUMO – A manipulação farmacológica da cérvix possui potencial importante na assistência à biotécnicas da reprodução, como inseminação artificial e transferência de embriões, em espécies que o acesso transcervical ao útero é muito difícil e, portanto, necessitam de procedimento cirúrgico para aumentar as taxas de concepção. Por meio de estudos básicos das propriedades mecânicas e farmacológicas da cérvix, objetivou-se com este estudo fornecer maior conhecimento da atividade da musculatura lisa da cérvix e então apresentar e discutir possibilidades de fármacos que possam relaxá-la e, portanto facilitar a passagem transcervical. Segmentos do músculo liso circular (MC) e longitudinal (ML) foram dissecados do útero (corno e corpo) e cérvix de suínos e preparados para tensão isométrica em banhos de órgão isolados de 20mL de solução modificada de Krebs-Henseleit (pH 7,4) gaseificada com 95% O2: 5% CO2 a 37°C. Os segmentos da cérvix apresentaram maiores respostas mecânicas do que os uterinos, mas exibiram menor atividade espontânea. Todas as preparações responderam de maneira dependente à frequência de estimulação de força elétrica (EFE, 2Hz – 32Hz, 300mA, por 30s). Especialmente na cérvix, após as respostas neurogênicas, houve um período de quiescência muscular importante até que as atividades espontâneas retornassem ao normal. Na maioria das preparações cervicais (MC e ML) a atropina aboliu as contrações neurogênicas, destacando um maior envolvimento para inervação colinérgica e receptores muscarínicos, mas uma pequena proporção das preparações se mostraram resistente à atropina. Estas respostas não foram afetadas pela fentolamina, e nem pela prazosina e fenilefrina, sugerindo a ausência de receptores alfa-adrenérgicos. L-NAME (N-nitro-L-arginina- metil-ester) não teve nenhum efeito sobre a atividade muscular cervical, excluindo o envolvimento de óxido nítrico. Diltiazem, paraverina e isoprenalina inibiram as contrações neurogênicas dos MC e ML da cérvix, consistente com importante envolvimento dos canais de cálcio sensíveis à voltagem, fosfodiesterase e receptores beta-adrenérgicos, respectivamente. Entretanto, RP73401 (3- cyclopentyloxy-N-(3,5-dichloro-4-pyridl)-4-methoxybenzamine) e UK114542 (UK114542 - 5-[2-ethoxy-5-(morpholinylacetyl)phenyl]-1,6-dihydro-1-methyl-3-propyl- 7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one methanesulfonate monohydrate) não tiveram efeito nenhum sobre a musculatura lisa cervical. Exposição prolongada à fenoxibenzamina reduziu as respostas neurogênicas e atividade espontânea da cérvix. Ainda, estes efeitos se mostraram irreversíveis e consistentes com a ação conhecida desta droga em ambos receptores muscarínicos e canais de cálcio, além de ser antagonista de receptores alfa-adrenérgicos. Esta ação irreversível da fenoxibenzamina pode ser particularmente útil para estudos posteriores no auxílio à penetração cervical e aumento das taxas de concepção. Palavras-chave: banho de órgão, colo do útero, contração neurogênica, contração espontânea, porca, relaxamento xii ACTION OF DRUGS IN THE CONTRACTIONS OF SWINE CERVICAL MUSCLE ABSTRACT – Pharmacological manipulation of cervix has a potentially important role for aiding either artificial insemination or embryo transfer in species requiring surgical procedures to aid conception. By studying basic pharmacological and mechanical properties of the cervix, we aimed with this study to provide a better knowledge about cervical smooth muscle activity and then present and discuss insights into possible drugs for the pig that could facilitate biotechnological procedures for reproduction. Circular (CM) and longitudinal (LM) smooth muscle strips were dissected from porcine uterus (cornu and corpus) and cervix and prepared for isometric tension recording in organ-bath of 20mL of modified Krebs Henseleit solution (pH 7.4) maintained at 37oC and gassed with 95% O2 and 5% CO2. Cervical strips produced larger mechanical responses than the uterine segments, but exhibited less spontaneous activity. All preparations responded in a frequency-dependent manner to electrical field stimulation (EFS, 2Hz-32Hz, 300mA for 30s) with a contraction. Especially in cervix, after neurogenic responses, there was a period of important muscular quiescence until the resume of normal spontaneous activity. In most cervical preparations (CM and LM) atropine abolished neurogenic contractions, highlighting a major role for cholinergic nerves and muscarinic receptors, but a small proportion of preparations exhibited atropine- resistant responses. These responses were not affected by phentolamine, and neither by prazosina and phenylephrine suggesting no role for alpha-adrenoceptors. L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-ester) did not affect the cervical smooth muscle activity, excluding the role of nitric oxide. Diltiazem, papaverine and isoprenaline inhibited neurogenic contractions in CM and LM strips of the cervix, consistent with important roles for voltage-sensitive calcium channels, phosphodiesterase and beta- adrenoceptors, respectively. However, RP73401 (3-cyclopentyloxy-N-(3,5-dichloro-4- pyridl)-4-methoxybenzamine) and UK114542 (UK114542 - 5-[2-ethoxy-5- (morpholinylacetyl)phenyl]-1,6-dihydro-1-methyl-3-propyl-7H-pyrazolo[4,3- d]pyrimidin-7-one methanesulfonate monohydrate) did not present effect in cervical smooth muscle. Prolonged exposure to phenoxybenzamine reduced cervical neurogenic responses and spontaneous activity. Interestingly, these effects were irreversible and consistent with known action of this drug at both muscarinic receptors and calcium channels, besides being alfa-adrenoceptor antagonist. This atypical, irreversible, action of the phenoxybenzamine may be particularly useful for further studies in aiding cervical penetration and increasing conception rates. Keywords: organ bath, cervix, neurogenic contraction, spontaneous contraction pig, laxity 1 1. INTRODUÇÃO O esclarecimento da fisiologia e inervação da musculatura do útero (corpo e cornos) e da cérvix é importante para melhor entendimento dos mecanismos de contração, relaxamento e quiescência, até mesmo em condições patológicas. Este conhecimento permite estudos específicos da manipulação destes músculos, ferramenta essencial, sobretudo, no auxílio à gestação e parto. Além disso, é importante para o uso em biotecnologias da reprodução, principalmente na medicina veterinária, como inseminação artificial e transferência de embriões, com intuito de melhorar as taxas de sucesso e preservar o bem-estar animal durante os procedimentos. Algumas espécies, como ovinos, cervídeos, canídeos e felídeos, a manipulação cervical é extremamente difícil, seja pelo tamanho do animal ou pela estrutura complexa da cérvix, o que impede auxiliar na melhoria do manejo reprodutivo (MORROW et al., 2009; THOMASSEN; FARSTAD, 2009; CANDAPPA; BARTLEWSKI, 2014; MACEDO et al., 2012; ROMAGNOLI; LOPATE, 2014). Muitas vezes, portanto, a única opção para ter acesso ao útero é submeter estes animais a procedimentos cirúrgicos onerosos, de baixa repetibilidade e que causam prejuízos ao bem-estar do indivíduo. Assim, a indução do relaxamento da cérvix que torne a aplicação prática viável de técnicas, como inseminação artificial e transferência de embriões e manejo reprodutivo com acesso ao útero (parto, lavagem uterina etc), é de extrema importância. A cérvix é uma porção do útero, porém, os dois possuem funções específicas durante toda vida reprodutiva dos animais, trabalhando de diferentes modos ao mesmo tempo, seja relaxando ou contraindo suas musculaturas. Durante a gestação, por exemplo, o útero caracteriza-se pela falta de sincronicidade muscular com a cérvix tanto na atividade mecânica quanto na elétrica (LAMMERS et al., 1994); é um período de quiescência da musculatura lisa uterina e de uma musculatura lisa cervical não responsiva e sobrecarregada (DARIOS et al., 2012). Em contrapartida, durante o parto, uma ação coordenada da função dos músculos lisos ativos de ambas as porções uterinas é essencial para seu progresso e 2 subsequente sucesso, sendo que enquanto o útero contrai vigorosamente para expulsão do feto e placenta, a cérvix precisa estar relaxada e responsiva (LAMMERS et al., 1994; DARIOS et al., 2012). Durante o ciclo reprodutivo, os músculos do útero e da cérvix estão em constantes mudanças e “desafios”, uma vez que têm que estar preparados, por exemplo, para receber e transportar os espermatozoides e embriões e manter a gestação e parto (HUNTER, 1973; DROBNIS; OVERSTREET, 1992). Adicionalmente, pesquisas demonstraram que o comportamento por meio de amostras da musculatura lisa do útero e cérvix dependem tanto da fase do estral quanto da orientação circular ou longitudinal do músculo liso (GARCIA-VILLAR et al., 1982; TOUTAIN et al., 1985; TROEDSSON et al., 1993; HIRSBRUNNER et al., 2002; KAUFMANN et al., 2008). Técnicas in vitro da atividade mecânica de segmentos isolados de músculo liso de diferentes órgãos em repouso e em resposta a estimulação transmural mostraram ser eficientes para compreensão do comportamento muscular. Tais análises em diferentes espécies animais também sugeriram que as camadas dos músculos lisos, de diferentes orientações, longitudinais e circulares, possuem características mecânicas e receptores distintos entre si. Utilizando banhos de órgão isolado e estimulação de força elétrica em amostras de músculos lisos uterinos de suínos, Taneike e colaboradores (1991; 1994; 1995) observaram que há inervação específica para cada região (corno e corpo uterinos e cérvix) e também para as diferentes camadas musculares do miométrio. Adicionalmente, esse grupo de pesquisadores, baseando-se nas diferentes camadas musculares, apresentou informações sugerindo diferenças na função de alguns receptores no miométrio, como ocitocina (KITAZAWA et al., 2001a), beta-adrenérgicos, receptores de serotonina (KITAZAWA et al., 2001b) e prostanoides (CAO et al., 2004). Entretanto, até o momento, as pesquisas se concentravam principalmente na musculatura uterina e, portanto, há uma deficiência de informações acerca das diferenças funcionais das camadas musculares da cérvix, apesar da evidência emergente em suínos (RODRIGUEZ-ANTOLIN et al., 2012) e ratos (FERLAND et al., 2015) da função conectiva anatômica entre as duas regiões do trato reprodutivo por meio das células de músculos lisos. 3 Como características fundamentais deste projeto, destaca-se seu mérito técnico científico para biotecnologia da reprodução. Foram utilizadas peças reprodutivas de suínos, como modelo experimental para estudo do comportamento fisiológico e inervação autônoma principalmente da musculatura lisa da cérvix, objetivando a manipulação da mesma para transpor barreiras da biotecnologia reprodutiva, especialmente com intuito de relaxamento cervical. Do ponto de vista técnico, a busca por soluções eficientes e práticas promove um substancial incremento na reprodução das espécies. Quanto ao aspecto científico, grande quantidade de dados foi gerada, com expectativas altamente promissoras para o conhecimento da reprodução como um todo. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Aspectos morfofisiológicos da cérvix A cérvix é parte mais baixa do útero, ou colo do útero, e atua como barreira defensiva contra patógenos externos, principalmente durante a gestação, e permanece compactamente fechada, exceto durante o estro, quando relaxa levemente, permitindo a entrada dos espermatozoides no útero, e durante o parto, quando dilata consideravelmente para dar espaço para passagem do feto (HAFEZ; HAFEZ, 2004; TIMMONS et al. 2010; RODRIGUEZ-ANTOLIN et al., 2012). Anatomicamente, a cérvix é separada do corpo do útero por uma junção fibromuscular, um orifício interno que separa a cérvix fibrosa do corpo muscular (JORDAN, 2006). Ela conecta o útero com a vagina, entretanto, sua estrutura histológica é diferente. A cérvix é composta predominantemente por tecido conjuntivo com pequenas quantidades de músculo liso e epitélio, caracterizada por uma espessa parede e um lúmen constrito (WINN et al. 1993, 1994; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Morfologicamente se assemelha a um órgão tubular, sendo delimitada por quatro camadas, do lúmen para periferia: mucosa (epitélio e lâmina própria), submucosa, muscular e túnica adventícia (RODRIGUEZ-ANTOLIN et al., 2012). Embora haja diferenças de detalhes neste órgão entre os mamíferos, o canal 4 cervical é caracterizado por várias proeminências, chamadas pregas ou anéis, podendo ser simples (caninos e felinos) ou múltiplas (bovinos, ovinos, suínos e equinos). Na vaca e na ovelha, estes anéis são especialmente proeminentes, formando interdigitações que se adaptam um ao outro, ocluindo a cérvix com segurança. Na porca, os anéis dispõem-se em formato de saca-rolhas, os quais se justapõem a extremidade torcida em espiral do pênis do macho. Na égua são características as pregas da mucosa que se projetam para dentro da vagina e tornam-se macias durante o estro (SENGER, 2003; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Na cadela e gata, a cérvix não possui proeminências elaboradas e é relativamente lisa. O epitélio da cérvix é simples cilíndrico com muitas células mucigênicas, algumas células caliciformes e uma pequena proporção das células epiteliais é ciliada em determinadas espécies. Glândulas tubulares simples são observadas nos pequenos ruminantes e na porca. As glândulas uterinas não se estendem até a cérvix, na maior parte das espécies, e os elementos glandulares presentes são em sua maioria, mucossecretores. A lâmina própria consiste em tecido conjuntivo denso irregular, que se torna edematoso e assume uma estrutura frouxa durante o estro. Muitos pequenos feixes de fibras nervosas, ligeiramente mielínicos ou amielínicos estão presentes na lâmina própria-submucosa e na túnica muscular (DKALNS, 1982). O estroma cervical é composto principalmente por tecido fibrocolágeno e músculo liso e numerosos vasos sanguíneos. A túnica muscular consiste em uma camada muscular lisa circular interna e uma camada longitudinal externa. Fibras elásticas são proeminentes na camada circular, e tanto as fibras musculares quanto as elásticas são importantes no restabelecimento da estrutura cervical após o parto. As camadas musculares da cérvix são contínuas com as do corpo do útero e as da vagina, sendo que a camada circular da cérvix, da qual projetam os anéis ou pregas, apresenta formatos variados nas diferentes espécies, como exposto anteriormente. A túnica adventícia da cérvix é constituída de tecido conjuntivo frouxo (DKALNS, 1982). A substância fundamental do estroma cervical contém proteoglicanos e ácido hialurônico, sulfato de condroitina-4,6, sultafo de dermatana, sulfato de heparana e sulfato de queratana associados às proteínas. Os constituintes fibrosos incluem 5 colágeno, elastina e reticulina, uma proteína resistente que se organiza em fibras e feixes. Os elementos celulares compreendem mastócitos e fibroblastos. Os padrões de reticulinas, elastinas e substâncias de regiões interfibrosas facilitam a dilatação da cérvix durante o parto. A dissociação das fibras colágenas, as quais estão separadas uma das outras, determina o afrouxamento do tecido cervical e aumenta os espaços entre os feixes de colágeno (HAFEZ; HAFEZ, 2004). A cérvix pode ser dividida em duas regiões: uterina e vaginal (WINN et al. 1993, 1994). Apesar das características histológicas serem similares, é possível identificar algumas peculiaridades de cada região. Um estudo realizado por Rodriguez-Antolin e colaboradores (2012), sobre as características morfológicas da cérvix de suínos, deu suporte a hipótese de que cada região cervical possui funções específicas que estão intimamente relacionadas com a sua composição histológica. Os anéis ou pulvino cervical foram observados distribuídos por todo canal cervical, mas tornam-se mais proeminentes no sentido caudal, terminando discretamente na vagina. As glândulas acinosas foram localizadas na região uterina da cérvix que coincidem com as glândulas da mucosa. Na submucosa observou-se predominante tecido conjuntivo frouxo com abundantes fibras de colágenos, fibroblastos, vasos sanguíneos e numerosas glândulas acinosas, as quais foram delimitadas por cápsula de tecido conjuntivo. O número dessas células secretórias diminuiu em sentido caudal e foram observadas somente nos primeiros dois terços da cérvix uterina. A camada muscular interna consistiu de fibras de músculo liso orientadas, assim como, de fibras colágenas entremeadas com fibras musculares. Ainda no mesmo estudo, maior vascularização foi observada na região vaginal da cérvix em comparação com a região uterina, o que pode estar envolvido na proteção contra agentes externos. Na lâmina própria, observou-se tecido conjuntivo denso e, na submucosa, tecido conjuntivo frouxo com fibras de colágeno. A camada muscular foi mais grossa e continha vasos sanguíneos entremeados com subcamadas internas e externas, sendo a orientação das fibras de músculos liso similar à da cérvix uterina. Notou-se que a distância entre as fibras de músculo liso era maior por causa da alta densidade de fibras de colágeno (RODRIGUEZ- ANTOLIN et al., 2012). Entretanto, há diferenças entre alguns estudos histológicos acerca da cérvix, o que provavelmente se deve ao número de partos vaginais das 6 fêmeas estudadas, como por exemplo, a quantidade de colágeno e fibras elásticas aumenta, enquanto ocorre a diminuição das fibras musculares (WINN et al. 1993, 1994; ROCHA et al., 2007). 2.2. Inervação autônoma da cérvix e útero O útero e a cérvix são inervados pelo sistema nervoso autônomo, o qual é responsável pela ação de contratilidade ou relaxamento destes. Os feixes de fibras nervosas unem-se e formam plexos na superfície do órgão, enviando fibras que penetram juntamente com os vasos sanguíneos. Na intimidade do órgão separam-se para novamente formarem plexos, que por sua vez, se distribuem pela musculatura e nas paredes dos vasos e na mucosa. No endométrio as fibras nervosas seguem até os epitélios de revestimento e glandular, onde terminam livres, entre as células. No miométrio, finas fibras amielínicas terminam nas células musculares. Essas fibras fazem parte das duas subdivisões do sistema nervoso autônomo: o sistema nervoso simpático e o parassimpático. As fibras nervosas simpáticas e parassimpáticas, por sua vez, secretam substâncias neurotransmissoras como a noradrenalina e a acetilcolina (Ach), respectivamente. As que secretam Ach são chamadas colinérgicas e as que secretam noradrenalina e adrenalina, adrenérgicas (GUYTON; HALL, 1996). Inervação adrenérgica e colinérgica foram encontradas em útero de ovelhas (ALEXANDER, 1945), mulheres (MORIZAKI et al., 1989) e roedores (MATUCCI et al., 1997). Estudos em bovinos mostraram a presença de inervação adrenérgica no útero (ALEXANDER 1945; TANEIKE et al. 1999), entretanto a existência de inervação colinérgica ainda foi contraditória (TANEIKE et al., 1999). A inervação específica de cada camada da musculatura lisa uterina e cervical tem sido explorada em várias espécies, como roedores, suínos e em menor número bovinos e ovinos. Taneike et al. (1991) pesquisaram a inervação das camadas do miométrio de suínos e observaram que a atividade da dopamina β-hidroxilase (indicador de neuroatividade adrenérgica) foi 2,5 vezes maior no músculo liso longitudinal (ML) comparado ao músculo liso circular (MC). Entretanto, a atividade da colina acetiltransferase (ChAT - indicador de neuroatividade colinérgica) foi muito 7 maior no MC. Assim, estes autores descreveram que a atividade adrenérgica está mais relacionada com a musculatura longitudinal, enquanto a atividade colinérgica está mais relacionada com a musculatura circular do útero. Estas observações corroboram com os achados de Thilander e Rodriguez-Martinez (1989), os quais relataram que as fibras nervosas do MC da cérvix de suínos foram predominantemente colinérgicas. 2.2.1. Efeito dos receptores adrenérgicos e muscarínicos sobre a musculatura lisa 2.2.1.1.Receptores adrenérgicos Receptores adrenérgicos são um grupo de receptores de membrana, responsáveis pela intermediação dos neurotransmissores noradrenalina e adrenalina (catecolaminas) entre as ações centrais e periféricas, ou seja, antes que o transmissor secretado nas terminações nervosas autônomas possa estimular o órgão efetor. Os neurotransmissores liberados têm que primeiro se ligar a receptores específicos nas células efetoras, ou seja, as fibras nervosas noradrenérgicas secretam adrenalina ou noradrenalina no terminal nervoso pré-sináptico, e o neurotransmissor se liga aos receptores adrenérgicos na terminação pós-sináptica. Estes receptores pertencem à superfamília dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A principal classificação farmacológica divide os receptores adrenérgicos em alfa e beta (GARCÍA-SAÍNZ et al., 2000; CALZADA; ARTIÑANO, 2001), que por sua vez são divididos em três maiores subtipos, baseado em suas afinidades farmacológicas, seus acoplamentos nas vias de transmissão e suas sequências de aminoácidos: alfa1, alfa2 e beta (HIEBLE et al., 1995). Receptores alfa-adrenérgicos intercedem na maioria das funções excitatórias (vasoconstrição, contração da musculatura uterina, contração da uretra, dilatação de pupila etc) e em uma importante função inibitória (relaxamento intestinal). Já os receptores beta-adrenérgicos fazem a mediação da maioria das funções inibitórias (vasodilatação, relaxamento da musculatura uterina, broncodilatação etc) e em uma função excitatória (função cardíaca) (CALZADA; ARTIÑANO, 2001). Os receptores alfa1 ativam a fosfolipase C, produzindo assim, trifosfato inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG) como segundos mensageiros. Consequentemente, o DAG ativa a proteína quinase C, enquanto que IP3 interage 8 com canais de cálcio e aumenta o íon cálcio (Ca2+) intracelular, levando a subsequente contração do músculo liso (GARCÍA-SAÍNZ et al., 2000). Os receptores alfa-2 inibem a adenilato ciclase (AC - enzima intracelular aderida à membrana plasmática que catalisa a formação de 3’-5’ adenosina monofosfato cíclico – AMPc - a partir do trifosfato de adenosina - ATP) e, portanto, diminuem a formação de AMPc e também o relaxamento do músculo liso (DOCHERTY, 1998). Os receptores beta são ainda divididos em subtipos beta1, beta2 e beta3. Todos estes estimulam a AC via proteínas Gs e aumentam, pois, os níveis de AMPc , o qual ativa a proteína quinase A e subsequentemente fosforila diferentes proteínas associadas com o relaxamento do músculo liso (TANAKA et al., 2005). 2.2.1.2.Receptores muscarínicos Os receptores muscarínicos, da mesma maneira que os adrenérgicos, também são receptores de membrana e atuam via ativação das proteínas G. Entretanto, intercedem efeitos inibitórios e excitatórios por meio da Ach. Os receptores muscarínicos são encontrados em todas as células efetoras estimuladas pelos neurônios pós-ganglionares do sistema nervoso parassimpático, bem como os estimulados pelos neurônios pós-ganglionares colinérgicos do sistema simpático (GUYTON; HALL, 1996). A Ach é um mediador químico de sinapses no sistema nervoso central (SNC), no sistema nervoso periférico e também na junção neuromuscular. Seus receptores e o aparato enzimático responsável por sua síntese e degradação constituem o sistema de neurotransmissão colinérgica. A ChAT é a enzima responsável pela síntese da Ach a partir de acetil-coenzima A e colina. Uma vez sintetizada, parte da Ach é transportada e armazenada em vesículas sinápticas. Após ser liberada inteiramente por exocitose, a Ach interage especificamente com os receptores colinérgicos presentes nas membranas pré- e pós-sinápticas. A ação deste mediador cessa quando é hidrolisado em acetato e colina pela enzima acetilcolinesterase (AChE), presente na fenda sináptica (VENTURA et al., 2009). Os receptores muscarínicos também são amplamente distribuídos por diversos sistemas biológicos, onde participam de várias funções vitais. A ativação 9 desses receptores no sistema nervoso periférico tem ações que incluem a redução da frequência e força da contração cardíaca, o relaxamento de vasos sanguíneos periféricos e a constrição das vias respiratórias (brônquios e bronquíolos). No SNC, estão envolvidos no controle da função extrapiramidal, vestibular, em funções cognitivas como memória, aprendizado e atenção, em respostas emocionais, na modulação do estresse, no sono e na vigília (VENTURA et al., 2009). Na musculatura lisa, a Ach produz aumento da permeabilidade a todos os íons, que resulta em despolarização da membrana celular, além de também aumentar a frequência de potenciais de ação espontânea (WESTFALL, 1979). Os receptores muscarínicos são divididos em cinco tipos: M1, M2, M3, M4 e M5, segundo suas propriedades farmacológicas e funcionais. Todos os subtipos pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G. M1, M3 e M5 acoplam à proteína Gq e ativam a fosfolipase C que, por sua vez, ativa a cascata de IP3 e aumenta consequentemente o Ca2+ intracelular e a proteína quinase C, similar aos receptores alfa1-adrenérgicos. Já os M2 e M4 acoplam à proteína Gi e inibem a atividade da AC, reduzindo a produção de AMPc (CAULFIELD, 1993; ISHII; KURACHI, 2006; VENTURA et al., 2009). 2.2.2. Farmacologia da musculatura lisa uterina e cervical Estudos de eletromiografia e farmacologia acerca do útero e da cérvix sugeriram que estes são porções uterinas diferentes funcionalmente (PAJNTAR et al., 1998; DARIOS et al., 2012). O conhecimento destas diferenças funcionais é importante na manipulação da cérvix, principalmente quando esta se encontra contraída e também, na manipulação do útero, quando este está relaxado (FERLAND et al., 2015). Apesar de existir considerável literatura sobre a musculatura lisa uterina em relação aos estímulos de contração e relaxamento (LÓPEZ-BERNAL, 2007; WRAY, 2007), pouco ainda se sabe sobre a função do músculo liso da cérvix (BRYMAN et al., 1986; DARIOS et al., 2012). Contudo, poucos estudos que investigaram a farmacologia da cérvix isolada ressaltaram escassez de trabalhos realizados nesta área (HOLLINGSWORTH; ISHERWOOD, 1978; PETERSEN et al., 1991; DARIOS et al., 2012). 10 Acredita-se que a atividade uterina é regulada por complexas e mútuas interações entre hormônios sexuais, contratilidade do miométrio e neurotransmissores (KITAZAWA et al., 2000). Estudos funcionais no útero com estimulação elétrica e extrínseca nervosa evidenciaram inervação colinérgica excitatória bem como adrenérgica excitatória (receptores alfa) e/ou inibitória (receptores beta) (NAKANISHI; WOOD, 1971; MORIZAKI et al., 1989; SATO et al., 1989; TANEIKE et al., 1991, 1994). 2.2.2.1.Receptores adrenérgicos Em várias espécies, foi demonstrado que o útero contém ambos receptores adrenérgicos alfa e beta, mediando, respectivamente, respostas excitatórias e inibitórias às catecolaminas (ALHQUIST, 1948; MARSHALL, 1970). Acredita-se que respostas excitatórias são mediadas por receptores alfa-adrenérgicos devido ao aumento intracelular de Ca2+, enquanto que respostas inibitórias são mediadas pelos receptores beta devido ao aumento de AMPc, como já explicado anteriormente. Agonistas dos receptores alfa-adrenérgicos provocaram respostas excitatórias na cérvix de humanos (BRYMAN et al., 1986) e de ovinos (MARNET et al., 1987) e no miométrio de roedores (ACRITOPOULOU-FOURCROY; MARCAIS-COLLADO, 1988), suínos (TANEIKE et al., 1991; KITAZAWA et al., 2001a) e ovinos (HAWK; CONLEY, 1985; TANEIKE et al., 1995). Já agonistas dos receptores beta- adrenérgicos promoveram respostas inibitórias na cérvix (TANEIKE et al. 1991) e útero de suínos (TANEIKE et al. 1991; KITAZAWA et al. 2001a) e humanos (TYSON et al. 2009). Bryman et al., (1986) observaram o efeito de agonistas de receptores alfa- adrenérgicos sobre as contrações espontâneas da cérvix de humanos em trabalho de parto. Tais contrações foram promovidas por noradrenalina e abolidas por fenoxibenzamina (antagonista irreversível de receptores alfa-adrenérgicos), e não aumentaram quando na presença de propranolol (antagonista não seletivo de receptores beta-adrenérgicos). No mesmo estudo, a fenilefrina (agonista seletivo de receptores alfa1-adrenérgicos) provocou contrações espontâneas e, mais uma vez, essas foram totalmente abolidas pela fenoxibenzamina. 11 Taneike et al. (1995) pesquisaram a função dos subtipos de receptores alfa- adrenérgicos no miométrio de porcas no proestro, utilizando fármacos seletivos para receptores alfa1- e alfa2-adrenérgicos. O fármaco ioimbina (antagonista de receptores alfa2-adrenérgico) promoveu diminuição da contração do ML causada pela noradrenalina, enquanto que a prazosina (antagonista de receptores alfa1- adrenérgico) não teve efeito sobre a contração. Já a clonidina (agonista de receptor alfa2-adrenérgico) promoveu contrações no ML, mas somente na presença de Ca2+. Entretanto, no MC não obteve resposta, assim como a fenilefrina (agonista de receptor alfa1-adrenérgico), mesmo em altas concentrações. Ainda, utilizando radioligantes específicos para localização de receptores alfa1- e alfa2-adrenérgicos ([3H]-prazosina e [3H]-rauwolscine, respectivamente), os autores observaram que a distribuição de receptores alfa-adrenérgicos foi específica para cada camada muscular, sendo que o número de ambos os tipos destes receptores foi quatro vezes maior no ML do que no MC. Assim, este estudo mostrou que, apesar do miométrio de suíno conter tanto alfa1 quanto alfa2, este último foi predominante e amplamente responsável por mediar resposta excitatória à noradrenalina na musculatura lisa longitudinal. Além da distribuição de receptores adrenérgicos no músculo liso ser dependente da camada muscular, a concentração também possui variação entre as espécies. Taneike et al. (1999) verificaram que no miométrio de vacas a quantidade de receptores alfa1–adrenérgicos em ML foi a mesma que em MC. Entretanto, a de alfa2 foi 2,6 vezes maior no ML que no MC e que o conteúdo de noradrenalina (indicador da densidade de inervação adrenérgica)foi cinco vezes maior em ML que em MC. Adrenalina e dopamina não foram detectadas em nenhuma das camadas. Já em miométrio de porcas, o conteúdo de noradrenalina no ML foi 2,5 vezes maior que no MC e a evidência de inervação colinérgica foi oito vezes maior no MC do que no ML (TANEIKE et al. 1991). Receptores alfa-adrenérgicos no útero são regulados por esteróides ovarianos, mas variações existem entre as espécies. Em coelhos, tratamento com estrógenos aumentaram seletivamente receptores alfa2-adrenérgicos (HOFFMAN et al., 1980). Por outro lado, tratamento com progesterona em ovelhas ovariectomizadas aumentou a concentração de receptores alfa, provavelmente 12 também do subtipo alfa2 (REXROAD, 1981). Semelhantemente, em porcas, tais receptores foram mais numerosos durante a fase luteal (REXROAD; GUTHRIE, 1983). Adicionalmente, foi demonstrado que os receptores beta-adrenérgicos fazem a mediação dos efeitos inibitórios sobre a musculatura lisa: isoprenalina (agonista de receptor beta1-adrenérgico) reduziu as contrações espontâneas no miométrio (TANEIKE et al., 1991; KITAZAWA et al., 2001b) e na cérvix de suínos (KITAZAWA et al., 2001b), assim como agonistas de receptores beta2-adrenérgicos, como salbutamol (TYSON et al., 2009) e clenbuterol (KITAZAWA et al., 2001b) também promoveram diminuição das contrações espontâneas no miométrio de mulheres e porcas, respectivamente. 2.2.2.2. Receptores muscarínicos No miométrio de camundongos, humanos e suínos, fibras colinérgicas têm função reguladora na contratilidade (TANEIKE et al., 1994). Entretanto, estudo realizado em bovinos (TANEIKE et al., 1999) evidenciou que a administração de atropina não inibiu as contrações miometriais induzidas por estímulo elétrico, excluindo assim a inervação colinérgica funcional no útero dessa espécie. Foi observado que a Ach tem papel na coordenação da contração espontânea no útero de roedores (HOLLINGSWORTH; ISHERWOOD, 1978; KAZARYAN et al., 2013). Hollingsworth e Isherwood et al. (1978), em estudo com camundongos gestantes, relataram que o corno uterino desenvolvia duas vezes o máximo de tensão comparado com a cérvix na presença de Ach. Entretanto, os autores indagaram que este fato pode estar relacionado com a relativa proporção de músculo liso em cada região. Kazaryan et al. (2013) pesquisaram camundongos não gestantes e observaram que a Ach também aumentou a contrações espontâneas, e que esta atividade variou dependendo da área do útero. Controle colinérgico no miométrio de camundongos em estro também diferiu entre as camadas musculares lisas longitudinais e circulares (HOUDEAU et al., 2003). Estudos in vitro mostraram que as contrações das musculaturas lisas cervicais e uterinas promovidas por estimulação elétrica foram principalmente no 13 MC. Técnica de imunohistoquímica confirmou que a predominância no MC foi devido à distribuição específica de fibras colinérgicas nas camadas musculares lisas. Todas as contrações neurogênicas foram abolidas pela tetrodoxina (neurotoxina bloqueadora de canais de sódio voltagem-dependentes) ou atropina (antagonista de receptor colinérgico) no corpo uterino. Estes mesmos fármacos também cessaram as contrações induzidas por estímulo elétrico do músculo liso cervical, sendo o mesmo observado no MC do útero de porcas, indicando que a Ach endógena liberada pelas fibras colinérgicas atua nos receptores muscarínicos da musculatura e causam contração (KITAZAWA et al., 1999). Apesar de contrações sensíveis a atropina sugerirem a presença de receptores muscarínicos, o subtipo de receptor que intercede à contração do miométrio em camundongos, coelhos e humanos não foi bem definida (EGLEN 1996). O receptor muscarínico M2 foi observado como subtipo dominante na musculatura lisa uterina de porquinho-da-Índia (DOODS et al., 1993) e camundongos (PENNEFATHER et al., 1994) e mostrou-se ser funcional ao mediar a contração de agonistas de receptores muscarínicos neste órgão (DÖRJE et al., 1990; LEIBER et al., 1990). Já em estudos com miométrio de suínos sugeriram a presença somente de receptor muscarínico do subtipo M3 nesta musculatura lisa e este desempenha função nas contrações induzidas por Ach, tanto exógena quanto endógena (KITAZAWA et al., 1999). Tais conclusões foram baseadas na observação das ações inibitórias da atropina e antagonistas dos cincos subtipos de receptores muscarínicos (pirenzepina, AF-DX116, 4-DAMP, himbacina e tropicamida). A densidade dos receptores muscarínicos e a resposta do útero são influenciadas pelos hormônios sexuais femininos, assim como os receptores alfa- adrenérgicos. Brandes e Ruggieri (1995) mostraram uma menor densidade dos receptores muscarínicos em útero de coelhas prenhas do que em adultas férteis. O tratamento com estrógeno, por oito semanas em coelhas ovariectomizadas, induziu a um aumento da afinidade e da densidade destes receptores no útero, em relação a animais apenas histerectomizados (BATRA, 1990). Entretanto, o tratamento estrogênico por quatro dias de cobaias imaturas diminuiu a densidade, mas não alterou a afinidade dos receptores muscarínicos, no útero de animais ovariectomizados tratados com estrógeno, em comparação aos histerectomizados 14 tratados com progesterona (RUZYCK; CRANKSHAW, 1988). Outro estudo, utilizando ratas tratadas com estrógeno durante 24h, apresentou uma maior afinidade dos receptores muscarínicos, sem alteração da densidade, quando comparadas com animais em estro natural. Além disso, foi mostrada também uma modulação pelo estrógeno das vias de sinalização intracelular acopladas à ativação dos receptores M2 e M3 (ABDALLA et al., 2000). 2.2.2.3.Mediadores intracelulares Os efeitos intracelulares do AMPc e Ca2+ não são somente mediados por receptores adrenérgicos e muscarínicos. Níveis intracelulares de AMPc são também regulados pela AC e fosfodiesterase (PDE). As ACs são ativadas por GPCRs e degradada pelas PDEs, assim, a ativação de AC gera produção de AMPc enquanto que o aumento de níveis de PDE a inibe. O AMPc promove o relaxamento da musculatura lisa uterina pela ativação da proteína quinase dependente de AMPc (PKA). Esta proteína fosforila a quinase das cadeias leves da miosina (KCLM), reduzindo a afinidade da KCLM pelo complexo cálcio/calmodulina. A PKA também inibe a ativação da fosfolipase C. Agonistas que aumentam o AMPc intracelular induzem o relaxamento do miométrio, tais como forscolina (ativador direto da AC), relaxina e inibidores de PDE (PRICE; BERNAL, 2001). O relaxamento induzido pela forscolina foi observado no miométrio e na cérvix de camundongos (DARIOS et al., 2012), na aorta de camundongos, artéria coronária de bovino e canino e intestino de coelho (MULLER; BAER, 1983), no músculo liso da traquéia de porquinho-da-Índia (TSUKAWAKI et al., 1987) e no músculo uretral de ovinos (GARCIA-PASCUAL; TRIGUERO, 1994). Estudos realizados com relaxina observaram que sua função, de aumentar os níveis de AMPc, reduz a contração do miométrio em camundongos (OSA et al., 1991; DOWNING; HOLLINGSWORTH, 1993). Ambas as forscolina e relaxina, também mostraram evidências na redução de contrações musculares induzidas por estímulo elétrico, indicando efeito direto delas no músculo liso (OSA et al., 1991; GARCIA-PASCUAL; TRIGUERO, 1994). 15 Os inibidores de PDE foram estudados em mulheres gestantes. O efeito antiespasmódico do cloridrato de drotaverine e brometo de valetamato (inibidores de PDE) mostraram acelerar o trabalho de parto pela dilatação cervical (SINGH et al., 2004). Entretanto, estes fármacos possuem efeitos colaterais a serem considerados, como risco de hemorragia no pós-parto (SHARMA et al., 2001). 3. HIPÓTESE Fármacos que atuam em receptores muscarínicos, adrenérgicos e mediadores intracelulares são capazes de contrair ou relaxar a musculatura lisa da cérvix de suínos. 4. OBJETIVOS 4.1 Geral Prover maiores informações sobre a ação de fármacos na musculatura lisa da cérvix de suínos, com a finalidade de manipulação deste órgão (contração e relaxamento). 4.2 Específicos - Comparar a atividade de contrações espontâneas e resposta neurogênica da musculatura lisa do útero e cérvix; - Avaliar o mecanismo colinérgico e adrenérgico das musculaturas lisas longitudinal e circular da cérvix; - Verificar os efeitos de inibidores, já conhecidos na função da musculatura lisa do miométrio, nas propriedades mecânicas da cérvix. 16 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Local O experimento foi realizado no laboratório de farmacologia da “School of Life Sciences, The University of Nottingham, Medical School, Queen’s Medical Centre”, em Nottingham, Inglaterra. 5.2. Material utilizado Os componentes para a preparação da solução modificada de Krebs- Henseleit (Apêndice) e os seguintes fármacos utilizados foram obtidos da Sigma- Aldrich Company Ltd (Poole, Dorset, Reino Unido): sulfato de atropina, hidrocloridrato de diltiazem, cloreto de carbacol, hidrocloridrato de fenoxibenzamina, noradrenalina bitartrate, hidrocloridrato de fenilefrina, hidrocloridrato de isoprenalina, hidrocloridrato de papaverina e L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-ester). Mesilato de fentolamina (Rogitine) foi obtido da farmácia do “Queen’s Medical Centre”. UK114542 (5-[2-ethoxy-5-(morpholinylacetyl)phenyl]-1,6-dihydro-1-methyl-3-propyl- 7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one methanesulfonate monohydrate) foi obtido da Pfizer Sandwich, Reino Unido. RP73401 (3-cyclopentyloxy-N-(3,5-dichloro-4-pyridl)- 4-methoxybenzamine) foi obtido da Aventis, Dagenham Research Centre, Reino Unido. As ações resumidas dos fármacos sobre os receptores que atuam estão apresentadas na Tabela 1. 17 Tabela 1. Ação principal dos fármacos utilizados nos experimentos. Fármaco Ação farmacológica Atropina Antagonista de receptor muscarínico Carbacol Agonista de receptor muscarínico Diltiazem Bloqueador de canal de cálcio Fenilefrina Agonista de receptor alfa1- adrenérgico Fenoxibenzamina Antagonista de receptores alfa- adrenérgico e muscarínicos, bloqueador de canal de cálcio Fentolamina Antagonista de receptor alfa- adrenérgico inespecífico Isoprenalina Agonista de receptor beta-adrenérgico L-NAME Inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase (NOS) Papaverina Inibidor não seletivo de PDE Prazosina Antagonista de receptor alfa1- adrenérgico RP73401 Inibidor de PDE4 UK114542 Inibidor de PDE5 5.3. Colheita de material O trato reprodutivo de 215 fêmeas suínas nulíparas, de raças e cruzamentos variados e de aproximadamente 6 meses de idade, foram obtidos de abatedouros e transportados ao laboratório em caixa térmica contendo gelo. De acordo com avaliação macroscópica dos ovários e suas estruturas (presença de folículos e ausência de corpos lúteos), o trato reprodutivo foi julgado como de animais pré- púberes (RECH et al. 2013, Figura 1). O útero e a cérvix foram isolados e armazenados “overnight” a 4°C em solução modificada de Krebs-Henseleit (Apêndice A), pH 7,4, gaseificada com 95% O2: 5% CO2. 18 Figura 1. Imagem fotográfica de peça anatômica do trato reprodutivo de fêmea suína pré-púbere, indicando ovários, útero (corpo e cornos), cérvix e parte cranial da vagina (Arquivo pessoal). 5.4. Preparação do material No dia subsequente, o material isolado foi retirado da geladeira (4°C) e mantido em ambiente externo até atingir a temperatura ambiente (25°C). Foram coletadas amostras do corpo (imediatamente acima da cérvix) e do corno uterino (próximo a tuba uterina), das quais, por meio de dissecção fina, foram separados segmentos (10 x 2 x 2 mm) de músculo liso longitudinal (ML, corpo n=15; corno n=6) e circular (MC, corpo n=15; corno n=6). A musculatura lisa da cérvix também foi dissecada, utilizando-se as mesmas dimensões, em camadas longitudinal (ML, n=87) e circular (MC, n=128). Ligaduras de fios de algodão foram atadas em cada extremidade dos segmentos de músculo liso, sempre respeitando que a orientação das fibras musculares ficasse verticalmente, e uma das extremidades foi presa a um suporte de acrílico entre dois eletrodos paralelos de platina (Figura 2A). A outra extremidade 19 foi conectada a um transdutor isométrico de força Grass FT-031. Subsequentemente, os segmentos foram suspensos verticalmente em banhos de órgão isolado de 20 mL, contendo solução modificada de Krebs-Henseleit (pH 7,4), gaseificada com 95% O2: 5% CO2 a 37°C (Figura 2B, 3A e 3B). O transdutor estava conectado a um amplificador MacLab Bridge2 (Figura 3B) e ligado via uma unidade MacLab de quatro canais a um computador Macintosh LC II com Chart 3.53. Figura 2. Imagens fotográficas ilustrando: A - Segmento de musculatura lisa do útero ou cérvix de suínos (seta), com ligaduras de fios de algodão atadas em cada extremidade, sendo uma das extremidades presa a suporte de acrílico entre dois eletrodos paralelos de platina. B - Segmento de musculatura lisa do útero ou cérvix de suínos (seta) suspenso verticalmente em banhos de órgão isolado de 20 mL, contendo solução modificada de Krebs-Henseleit (pH 7,4), gaseificada com 95% O2: 5% CO2 a 37°C (Arquivo pessoal). 1 Grass Technologies, WestWarwick, RI, EUA. 2 AD Instruments, Chalgrove, Reino Unido. 3 AD Instruments, Chalgrove, Reino Unido. 20 Figura 3. Imagens fotográficas ilustrando: A – Banhos de órgão isolado de 20mL cada, onde os segmentos ficavam suspensos verticalmente e imersos em solução modificada de Krebs-Henseleit. B – Circulador e aquecedor de água para a manutenção da temperatura em 37°C nos banhos de órgão. C – Amplificador com 4 canais (Arquivo pessoal). Inicialmente, as preparações foram submetidas a um período de equilíbrio de 30 minutos na solução, sem aplicação de tensão. Subsequentemente, 15 gramas (g) de tensão foi aplicado sob os segmentos e aguardado até que fosse estabilizada uma tensão entre 2-3g por 30 min e então adicionado 60mM de cloreto de potássio (KCl) à solução. O KCl foi adicionado para verificar viabilidade de contração do tecido, sendo que aqueles que não responderam ao KCl não foram utilizados nos experimentos. Após 15 min, os banhos de órgão foram lavados duas vezes com a solução modificada de Krebs-Henseleit, com 5 min de intervalo entre cada lavagem, reposta nova solução e, se necessário, a tensão era reajustada para 2-3g novamente, e permitido o equilíbrio por mais 40 min (Figura 4). 21 Figura 4. Protocolo inicial comum para todos os experimentos. Primeiro, as preparações ficaram 30 min na solução, sem aplicação de tensão; segundo, foi aplicado 15g de tensão (seta) sob os segmentos e aguardado que fosse estabilizada uma tensão entre 2-3g por 30 min; terceiro, adicionado KCl (60mM; seta) à solução; quarto, após 15 min, foi feita a 1ª lavagem (seta) dos os banhos de órgão com solução modificada de Krebs-Henseleit, e após 5 min, a 2ª lavagem (seta); quinto, foi permitido o equilíbrio por mais 40 min. 5.5. Protocolos Foram utilizados dois protocolos: curva de resposta às frequências (CRF) e curva de resposta-concentração (CRC) (Figura 5). A comparação entre corpo e corno uterino e cérvix foi somente para protocolos sem adição de fármacos, ou seja, para comportamento espontâneo ou em resposta à estimulação de força elétrica (EFE). A adição de fármacos foi realizada somente para os segmentos da cérvix, não sendo o objetivo do trabalho verificar tais substâncias na musculatura uterina pela ampla literatura existente. 22 Figura 5. Esquema ilustrativo dos protocolos realizados: curva de resposta às frequências (CRF) e curva de resposta- concentração (CRC). 5.5.1. Curva de resposta às frequências (CRF) Foram realizadas várias EFE para excitar os nervos autônomos intramurais presentes nos segmentos musculares. A CRF de EFE foi realizada tanto na musculatura lisa do corpo e corno do útero, quanto na cérvix, e foi comum para cada experimento e realizado sempre previamente ao fármaco adicionado. 23 Após os 40 minutos de equilíbrio, foi aplicada EFE por meio dos eletrodos de platina em cada segmento (a cada 10 min, 30 s de duração e 300 mA). A frequência inicial aplicada foi de 10Hz por 4 estimulações, para estabelecer a viabilidade do tecido, segundo experiência prévia do laboratório, e subsequentemente¸ 2, 4, 8 e 16Hz por uma estimulação cada e então 32Hz por 3 estimulações (Figura 6). Figura 6. Esquema do protocolo de curva de resposta às frequências, aplicado nas camadas de musculatura lisa do útero e cérvix de suínos em solução modificada de Krebs-Henseleit em banhos de órgão. Nas preparações controle (de igual n) o mesmo procedimento foi realizado, porém sem o fármaco, ou seja, havia um canal com o respectivo segmento do mesmo animal no qual foi submetido aos mesmos procedimentos do canal que recebia o fármaco, só que sem a adição do fármaco. Este controle foi feito para acompanhar a viabilidade do segmento, diferenciando possíveis alterações eminentes do próprio tecido e não em relação ao fármaco isoladamente. Para os protocolos descritos a seguir foi utilizada somente a musculatura lisa da cérvix. Os fármacos atropina e L-NAME foram testados dentro de uma CRF para verificar a presença de um ou mais neurotransmissores envolvidos nas repostas neurogênicas. Atropina Após CRF, a EFE foi desligada e então adicionado 0,3µM de atropina em cada preparação (MC, n=12; ML, n=9) e após 40 min de equilíbrio, foi realizada novamente CRF na presença do fármaco. Em preparações nas quais apresentaram respostas resistentes à atropina, ou seja, naquelas nas quais as respostas de contração neurogênica não foram abolidas, 3µM de fentolamina (n=4) foi adicionada na sequência, repetindo somente a EFE de 32Hz por 4 estimulações. 24 L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-ester) Foi adicionado 100µM de L-NAME em cada preparação (n=3) e então a CRF repetida na presença do fármaco. 5.5.2. Curvas de resposta-concentração (CRC) Para os protocolos descritos a seguir foi utilizada somente a musculatura lisa da cérvix. Após CRF, EFE permaneceu em 32Hz e, somente se citado o contrário, cada fármaco foi adicionado sequencialmente em 0,5-log (em concentrações crescentes) na mesma amostra e observadas as respostas de contração dos tecidos em relação às diferentes concentrações dos fármacos. Nas preparações controle (de igual n) o mesmo procedimento foi realizado, porém sem o fármaco, da mesma forma como explicado anteriormente, ou seja, com um canal com o respectivo segmento do mesmo animal, no qual era submetido aos mesmos procedimentos do canal que recebia o fármaco, só que sem a adição do fármaco. Adicionalmente, a última resposta neurogênica de 32Hz da CRF, sem adição do fármaco, foi utilizada como referência (em porcentagem) às respostas dos tecidos à mesma frequência em relação aos fármacos, como será explicado no tópico 5.7. Prazosina/Fenilefrina Cada concentração de prazosina (0,01-3µM) foi seguida por 2 estimulações elétricas. No final, uma única dose de fenilefrina (30µM) foi adicionada e observado por 10 min (n=6). Fenoxibenzamina e carbacol Uma única concentração do fármaco fenoxibenzamina foi adicionada em cada preparação (1,0-10µM, n=6), ou seja, sem adicionar sequencialmente, e aguardado 60 min antes de lavar 3 vezes consecutivas com solução modificada de Krebs- Henseleit, com 5 min de intervalo entre cada lavagem. Após 40 minutos a EFE foi desligada e o fármaco carbacol foi adicionado em cada preparação (0,1-10µM). 25 Isoprenalina Foi realizada somente uma única estimulação elétrica para cada concentração de isoprenalina (0,03-3,0µM; n=5). Diltiazem Foi realizada somente uma única estimulação elétrica para cada concentração de diltiazem (0,1-10µM; MC n=5; ML n=6). Papaverina Foi realizada somente uma única estimulação elétrica para cada concentração de papaverina (0,1-10µM; MC n=9; ML n=8). RP73401/UK114542 Estes fármacos foram adicionados (0,01-3,0µM), isoladamente, em cada preparação e foi realizada uma estimulação elétrica para cada concentração (MC n=6; ML n=2). 5.6. Pesagem dos segmentos Para correlação entre a massa (peso em mg) do segmento e a força de contração das contrações espontâneas e neurogênicas, o protocolo de CRF foi realizado nos músculos lisos de corno (n=6) e corpo (n=6) do útero e da cérvix (MC n=58; ML n=20). Antes da pesagem todos os segmentos foram secados da mesma maneira: retirados do banho de órgão e do suporte e cortado os fios de algodão. Na sequência, foram colocados no meio de papel toalha e por cima foi colocado um peso de 100g por 30 s e então pesados. 5.7. Análise de dados Contrações espontâneas e neurogênicas do útero e da cérvix foram expressas em pico de resposta ou magnitude (força de contração máxima em g) relativa ao tônus basal. Adicionalmente, a frequência das contrações espontâneas no início do experimento (antes da EFE) foi anotada durante 15 min e expressa em 26 número de contrações por 5 min (nº/5min). Para avaliar o efeito inibitório dos fármacos, a média da força de contração foi determinada pelo tempo e expressa como porcentagem da resposta controle, sendo utilizada a resposta à frequência de 32Hz. No caso da fenoxibenzamina, a resposta ao carbacol foi avaliada baseada na média de resposta pelo último um min de exposição (relativo à resposta neurogênica a 32Hz). 5.8. Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas pelo software SAS 9.2 (2002-2011). Após a confirmação da homoscedasticidade e normalidade dos dados foi feita a análise de variância (ANOVA). Os dados expressos em média e erro padrão da média foram analisados por regressão logística, utilizando o Proc GLIMMIX. As variáveis consideradas para inclusão no modelo foram: porção do órgão, camada muscular, frequência elétrica e concentração do fármaco. O nível de significância considerado foi de p<0,05. 6. RESULTADOS 6.1. Contrações espontâneas 6.1.1. Análises qualitativas Traçados representativos ilustram características não-quantitativas das respostas de contração espontânea. É possível observar na Figura 7 e 8 que todos os tecidos relaxaram após a aplicação inicial de tensão (15g); 60 mM de KCl produziu uma contração de rápido aumento de tensão, seguida de relaxamento para uma resposta sustentada. Nos tecidos uterinos (Fig. 7a,b e 8a,b), as contrações espontâneas demonstraram uma natureza mais tônica e uma maior frequência do que os tecidos cervicais, enquanto que estas últimas apresentaram maior magnitude (Fig. 8c e d). 27 Figura 7. Traços representativos ilustrando aplicação inicial de tensão (15g) seguida de relaxamento, adição de KCl produzindo contração rápida e então retorno das contrações espontâneas das camadas da musculatura lisa do corno do útero de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. 28 Figura 8. Traços representativos ilustrando aplicação inicial de tensão (15g) seguida de relaxamento, adição de KCl produzindo contração rápida e então retorno das contrações espontâneas das camadas da musculatura lisa de suínos: a) Circular do corpo do útero; b) Longitudinal do corpo do útero; c) Circular da cérvix; d) Longitudinal da cérvix. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. 29 No retorno das contrações espontâneas após a remoção de KCl do meio, nos tecidos uterinos, foi possível observar maior magnitude e variação das contrações espontâneas no MC ao se comparar a ML. Já na cérvix, esta força mostrou-se mais estável e similar entre as camadas musculares. 6.1.2. Análises quantitativas Na Tabela 2 estão os resultados das forças (g) e da frequência (nº de contrações/5min) das contrações espontâneas das camadas do corno e corpo uterino e cérvix. Dos segmentos do corno uterino e da cérvix, 75% (9/12) e 63,72% (137/215), respectivamente, exibiram contrações espontâneas quando na solução de Krebs-Henseleit, enquanto que do corpo do útero todas as preparações (n=29) apresentaram tais contrações. Os segmentos que não apresentaram contração espontânea também foram incluídos na análise. Tabela 2. Contrações espontâneas (média ± erro padrão) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corno e corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs-Henseleit: força de contração (magnitude em g) e frequência das contrações (nº de contrações/5 min). Nottingham, 2014. CORNO UTERINO CORPO UTERINO CÉRVIX ML MC ML MC ML MC Proporção 4/6 5/6 14/14 15/15 45/87 92/128 Magnitude (g) 1,10±0,41 2,84±0,96 4,06±0,93 5,10±0,67 5,38±0,58 5,88±0,36 Frequência (Nº/5 min) 2,08±0,44bA 9,20±4,62aA 4,50±1,0aB 4,80±0,70aB 1,60±0,20bA 2,80±0,20aC abLetras minúsculas diferem entre sí entre camada muscular diferente do mesmo órgão (p<0.05). ABCLetras maiúsculas diferem entre sí entre mesma camada muscular de diferente órgão (p<0.05). A magnitude das contrações não diferiu entre as três porções uterinas nem entre as camadas musculares, entretanto houve diferença significativa entre as frequências das contrações espontâneas entre os músculos lisos do útero e da cérvix. Com exceção do corpo uterino, o MC apresentou maior frequência de 30 contração do que o ML. As camadas musculares do uterinas, tanto longitudinal quanto circular, se contraíram mais rapidamente do que as cervicais, com exceção da camada longitudinal do corno uterino, a qual não teve diferença em relação a respectiva camada da cérvix. O ML do corpo do útero apresentou maior frequência do que o ML do corno e da cérvix. Já o MC do corno uterino teve mais contrações que o MC do corpo e cérvix. 6.2. Respostas de contração neurogênica à estimulação elétrica de 10Hz e 2-32Hz (CRF) 6.2.1. Análise qualitativa Analisando a Figura 9, pode-se observar a natureza tônica e alta frequência das contrações espontâneas dos músculos lisos do corno uterino, sendo estas de força similar às respostas de contração neurogênica no MC e menores no ML. As contrações induzidas por EFE foram seguidas por subsequente relaxamento em ML (8Hz ou mais) e menos acentuado em MC (16 e 32Hz somente) e o tempo para voltarem a linha basal anterior aumentou com a frequência de EFE. Também é possível observar que, ao contrário do ML, o aumento do EFE não aumentou claramente a magnitude da resposta contrátil no MC, além da óbvia diferença na magnitude entre a contração pela EFE e espontânea no ML. Altas frequências (16 e 32Hz) parecem reduzir a força de contração das respostas espontâneas (Figura 9a). 31 Figura 9. Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do corno uterino de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam relaxamento do músculo pós-estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. Em relação às contrações neurogênicas entre as camadas musculares lisas longitudinais e circulares do corpo do útero, essas pareceramm ter respostas similares a todas as frequências expostas e mais fortes conforme aumentava a estimulação, sem alterar claramente as contrações espontâneas (Figura 10). Entretanto, ao contrário do observado no corno do útero, no corpo, a linha basal permaneceu estável, ou seja, a EFE não promoveu relaxamento após a contração do músculo em todas as preparações. Mesmo assim, houve um período de quiescência após a estimulação elétrica, observando que o músculo liso ficou um tempo sem resposta de contração espontânea imediatamente após o término da resposta do estímulo elétrico. 32 Figura 10. Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do corpo uterino de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam período de quiescência muscular pós- estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. Na Figura 11 é possível observar que na cérvix, da mesma maneira que no corno e corpo do útero, a EFE induziu respostas contráteis que aumentaram com a frequência de estimulação. A amplitude das contrações espontâneas no ML parece diminuir conforme aumenta a EFE e após estimulação de 32Hz (Figura 11b), o que não se observa no MC. Assim como no corpo do útero, não foi observado relaxamento após a resposta neurogênica, mas sim um período de quiescência da musculatura após o estímulo elétrico, muito mais evidente nas preparações cervicais longitudinais. Vale a pena ressaltar, que é possível observar que este retorno das contrações espontâneas é gradativo em alguns tecidos, voltando com contrações mais fracas antes de ficarem estáveis. 33 Figura 11. Traços representativos da contração neurogênica após estimulação elétrica das musculaturas lisas do cérvix de suínos: a) Circular; b) Longitudinal. Setas indicam período de quiescência muscular pós- estimulação elétrica. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. 6.2.2. Análise quantitativa Comparando as respostas neurogênicas entre corno do útero e a cérvix nas frequências expostas, houve somente diferença significativa entre os MC da cérvix e corno, nas frequências de 16 e 32Hz, sendo a resposta da musculatura cervical maior que a do corno (p<0,05). Nenhum MC do corno uterino exibiu resposta às frequências de 2, 4 e 8Hz, enquanto que o ML somente não houve resposta na frequência de 2Hz. Na tabela 3 estão apresentados os dados das respostas de contração neurogênica à EFE de 10Hz e de 2 a 32Hz entre o corpo do útero e a cérvix. Todas as preparações que responderam ao EFE mostraram contrações dependentes da frequência. O ML do corpo uterino apresentou respostas de contrações 34 neurogênicas de maneira significativamente menor que da mesma camada cervical, enquanto que o MC não contraiu de maneira diferente entre estas porções. Ainda, foi possível observar que quanto menor as frequências de EFE, menor a proporção de tecidos que apresentaram resposta neurogênica, principalmente no corpo uterino, sendo que menos de 50% das preparações responderam na frequência de 2Hz. Tabela 3. Respostas (média ± erro padrão) da força de contração neurogênica (magnitude em g) à estimulação elétrica de 10, 2, 4, 8, 16 e 32 Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs-Henseleit. Os segmentos que responderam à respectiva frequência estão apresentados em proporção. Nottingham, 2014. Frequência (Hz) Magnitude da contração (g) CORPO ÚTERO CÉRVIX ML MC ML MC 10 2,93±0,78A (11/14) 6,17±0,89 (15/15) 8,03±0,86cB (81/87) 8,69±0,48ab (121/127) 2 0,71±0,39A (4/14) 2,13±0,94 (7/15) 5,48±0,80cB (62/87) 4,00±0,41c (83/127) 4 0,93±0,49A (5/14) 2,98±1,18 (8/15) 7,7±0,85cB (71/87) 5,86±0,47bc (99/127) 8 1,69±0,59A (8/14) 5,27±1,00 (14/15) 8,32±0,89bcB (81/87) 7,66±0,51ab (113/127) 16 2,83±0,60A (12/14) 6,12±0,96 (15/15) 10,41±0,69aB (83/87) 9,19±0,53a (120/127) 32 3,18±0,65A (12/14) 6,35±1,00 (15/15) 10,21±0,92abB (85/87) 9,70±0,56a (121/127) abcLetras minúsculas diferem entre sí na mesma camada muscular do mesmo órgão entre frequências (Hz) (p<0,05). ABLetras maiúsculas diferem entre sí na mesma camada muscular entre diferentes órgãos (p<0,05). *Valores que diferem entre sí nas camadas no mesmo órgão e mesma frequência (Hz) (p>0,05). 35 Como representado na Figura 12, a musculatura cervical demonstrou respostas neurogênicas mais expressivas que a uterina, principalmente no ML. a) b) Figura 12. Representação gráfica do efeito da estimulação de força elétrica (2-32Hz) na musculatura lisa longitudinal (a) e circular (b) do útero e cérvix de suínos. As respostas estão expressas em média±erro padrão. Na tabela 4 estão os dados em relação ao tempo (em segundos) que o músculo liso demorou em apresentar a primeira contração espontânea após a resposta neurogênica ao EFE. Como o corno uterino apresentou relaxamento pós- estimulação, e não período de quiescência, ele não foi incluído nesta análise. 36 Comparando as diferentes frequências na mesma camada muscular e no mesmo tecido, no MC da cérvix este tempo foi significativamente maior nas frequências de 8, 16 e 32Hz, e no ML para as frequências de 10, 16 e 32Hz. Entretanto, entre as camadas da cérvix, o tempo de retorno do ML mostrou-se significativamente diferente na frequência de 10Hz. Entre as mesmas camadas da cérvix e do útero, o MC da cérvix demorou mais tempo para retornar a atividade em todas as frequências, com exceção da de 2Hz, já no ML este tempo foi maior somente nas frequências de 8, 10, 16 e 32Hz. Tabela 4. Período de tempo (média ± erro padrão) em segundos (s) após resposta de contração neurogênica à estimulação elétrica de 10, 2, 4, 8, 16 e 32Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (ML) e circular (MC) do corpo do útero e da cérvix de porcas em solução de Krebs- Henseleit. Nottingham, 2014. Frequência (Hz) Tempo até retorno da contração espontânea (s) CORPO ÚTERO CÉRVIX ML MC ML MC 10 83,3±19,6i 53,4±17,4i 244±21,6cdAii 175,1±12,0aBii 2 76,3±20,6 57,9±28,1 155,0±24,1a 118,1±11,7a 4 85,3±20,9 62,3±31,6i 186,2±23,9ab 157,2±13,9aii 8 76,5±16,8i 54,2±17,8i 221,8±22,8bcii 184,8±14,4abii 16 114,1±18,6i 68,6±19,4i 232,7±21,3cdii 224,6±13,7bii 32 137,9±19,2i 82,8±20,4i 265,5±19,5dii 236,5±14,9bii abcLetras minúsculas diferem entre sí na mesma camada muscular do mesmo órgão entre frequências (Hz) (p<0,05). ABLetras maiúsculas diferem entre sí entre camadas musculares diferentes do mesmo órgão (p<0,05). i,iiSímbolos minúsculos diferem entre sí na mesma camada muscular entre diferentes órgãos (p<0,05). O período de quiescência após a estimulação elétrica, em segundos, entre o fim da resposta à EFE e o retorno da primeira contração espontânea do músculo, foi significativamente maior na cérvix comparado ao útero, particularmente no ML. Na frequência de 32Hz, o tempo até o retorno da primeira contração espontânea em ML cervical foi quase duas vezes maior que o ML uterino e três vezes para o MC. Na 37 cérvix, quanto maior a frequência de estimulação, maior o tempo de quiescência uterina após a resposta de contração, o que não é muito evidente no útero (Figura 13). a) b) Figura 13. Representação gráfica do período de tempo (média ± erro padrão) após resposta de contração neurogênica à estimulação elétrica de 2-32Hz (300mA, 30s) das camadas de músculo liso longitudinal (a) e circular (b) do corpo do útero e da cérvix de suínos. 6.3. Curvas de Respostas às Frequências – Cérvix 6.3.1. Atropina A presença da atropina (0,3µM) aboliu as contrações neurogênicas em oito de 12 preparações do MC da cérvix (Figura 14a), porém sem afetar as contrações 38 espontâneas (Figura 15). Efeito similar foi observado em seis de nove preparações do ML da cérvix, entretanto as três restantes foram resistentes à atropina em todas as frequências avaliadas (Figura 14b). a) b) Figura 14. Representação gráfica de comparação de respostas de contração da musculatura lisa circular (a) e longitudinal (b) da cérvix de suínos após exposição de 0,3µM do fármaco atropina. As respostas estão apresentadas em média ± erro padrão das observações em 9 de 12 animais diferentes. 39 Figura 15. Traços representativos da atividade contrátil da musculatura lisa circular da cérvix de suínos em resposta a estimulação de força elétrica (32Hz, 300mA, 30s) antes (a) e após (b) à exposição de 0,3µM do fármaco atropina. A atropina aboliu as contrações neurogênicas em todas as frequências, porém não afetou as contrações espontâneas. Escala: magnitude 2g e tempo 10 min. Nas frequências abaixo de 8Hz todos os tecidos do MC foram totalmente sensíveis à atropina e as respostas de contração reduziram mais de 60% em frequências de 16 e 32Hz. No ML não afetou as contrações induzidas por EFE de 2, 4 ou 8Hz, porém reduziu significativamente as contrações em 41.5±14.7% a 32Hz. 6.3.2. Atropina e Fentolamina Os tecidos que exibiram resistência à atropina foram selecionados (5,94±1,01 g, n=4) e então foi adicionada fentolamina (3µM). Este fármaco falhou em alterar significativamente as respostas no MC da cérvix (5,54±1,4 g, n=4). A fentolamina foi similarmente inefetiva em respostas neurogênicas resistentes a atropina em preparações do ML da cérvix (4,50±1,6 g, n=4). 40 6.3.3. L-NAME L-NAME não teve efeito nem na frequência (32Hz) nem na magnitude das respostas contráteis nas camadas de músculo liso da cérvix, como representado na Figura 16. Figura 16. Traço representativo mostrando a ausência de efeito do L-NAME (100µm) sobre a resposta neurogênica (32Hz) e espontânea no músculo circular liso de suínos. Escala: magnitude 5g e tempo 10 min. 6.4. Curvas de respostas-concentração 6.4.1. Prazosina e fenilefrina Como representado na Figura 17, o fármaco prazosina não apresentou efeito nas respostas de contrações ao EFE de 32Hz entre as camadas da musculatura lisa da cérvix (n=6), uma vez que o comportamento do tecido na presença do fármaco foi similar ao controle, ou seja, no tecido sem o fármaco. A adição de uma única concentração de fenilefrina (30μM) no final do experimento também não teve efeito nas respostas de contração de ambas as camadas de musculaturas lisas. 41 Figura 17. Representação gráfica da curva de resposta-concentração ao fármaco prazosina (0,01-3μM) nas musculaturas lisas longitudinal (ML) e circular (MC) da cérvix de suínos. Os resultados estão expressos em porcentagem de média±errro padrão em relação à última média da resposta de contração à 32Hz (medida antes da adição da primeira