RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 10/09/2020. UNESP - Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araraquara José Francisco Santos Simões da Rocha Efeito do processo de envelhecimento sobre propriedades físicas e biológicas de biomateriais utilizados como abutments Araraquara 2018 1 UNESP - Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araraquara José Francisco Santos Simões da Rocha Efeito do processo de envelhecimento sobre propriedades físicas e biológicas de biomateriais utilizados como abutments Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Reabilitação Oral, Área de Concentração – Prótese. Orientadora: Profa Dra Janaina Habib Jorge Araraquara 2018 2 Rocha, José Francisco Santos Simões da Efeito do processo de envelhecimento sobre propriedades físicas e biológicas de biomateriais utilizados como abutments / José Francisco Santos Simões da Rocha. -- Araraquara: [s.n.], 2018 67 f. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado em Reabilitação oral) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Janaína Habib Jorge 1. Próteses e implantes 2. Propriedades físicas 3. Biofilmes 4. Técnicas de cultura de células I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação 3 UNESP - Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araraquara José Francisco Santos Simões da Rocha Efeito do processo de envelhecimento sobre propriedades físicas e biológicas de biomateriais utilizados como abutments COMISSÃO JULGADORA DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM REABILITAÇÃO ORAL Presidente e Orientadora: Profª. Drª. Janaina Habib Jorge 2º Examinador: Prof. Dr. Gelson Luis Adabo 3º Examinador: Profª. Drª. Vanessa Migliorini Urban Araraquara, 10 de setembro de 2018 4 DADOS CURRICULARES José Francisco Santos Simões da Rocha Nascimento: 24 de julho de 1987 Filiação: Pai: Francisco Simões da Rocha Mãe: Sandra Regina dos Santos Rocha 2006-2010: Curso de Graduação em Odontologia na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP 2013-2015: Curso de Pós-Graduação Lato Sensu em Implantodontia. 2016 a 2017: Estágio Docência nas Disciplinas de Prótese Parcial Removível I e II na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP 5 Dedico este trabalho a Deus, que nos ensina o caminho da partilha compartilhando conosco a Vida. 6 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, pela vida e por sempre colocar pessoas boas ao meu lado. Aos meus pais, Francisco e Sandra, que sempre me amaram e se preocuparam muito com a minha educação, apesar da difícil condição financeira. Aos meus irmãos, Mateus e Lucas, pelo companheirismo e amizade que sempre tivemos. Sinto-me grato por ter duas pessoas tão íntegras e “do bem” como irmãos. À minha namorada, Debora, por ter tornado minha vida muito mais bonita! Agradeço por ter uma pessoa tão linda e amorosa caminhando ao meu lado. Também sou grato por todo seu companheirismo, apoio e paciência durante esse período de mestrado. À minha orientadora, Profª. Drª. Janaína Habib Jorge, por sua orientação, paciência, compreensão e ajuda neste trabalho. Aos professores da minha banca, Prof. Dr. Gelson Luis Adabo e Profª. Drª. Vanessa Migliorini Urban, pela disponibilidade e contribuição para melhoria deste trabalho. Também sou grato ao Prof. Gelson pela solicitude e gentileza em todos os momentos que precisei de sua ajuda, incluindo para o uso do Laboratório do Departamento de Materiais Dentários e Prótese. Ao Prof. Dr. Francisco de Assis Mollo Júnior, pela parceria na pesquisa e ajuda para obtenção de materiais. Também sou grato pela sua contribuição como professor membro da banca de qualificação desse trabalho. À Profª. Drª. Marlise Inês Klein, pela sua contribuição para a qualificação desse trabalho e pelo seu exemplo de professora pesquisadora comprometida com a Ciência e com o bem-estar da sociedade. Levarei sempre comigo seu exemplo de cientista. À Profª. Drª. Maria Silvia Maurício Rigolin, pela orientação e solicitude em todos os momentos que precisei. Também sou grato pela parceria nos experimentos e pela boa energia que me transmitiu. À Profª. Drª. Paula Aboud Barbugli, por compartilhar seus conhecimentos de forma tão gentil. Agradeço por todo apoio dado para realização desse trabalho. 7 Ao Prof. Dr. Danny Omar Mendoza Marin, pela ajuda na interpretação dos resultados. À Profª. Drª. Érica Dorigatti D'Ávila, pela ajuda na realização desse trabalho. Aos colegas Maria Isabel, Jacqueline, Vinicius e Camila Foggi pelos ensinamentos técnicos de laboratório e pela boa convivência. À Lígia, pelo apoio técnico e pela amizade. Ao Prof. João Victor Schiavon, pela gentileza de me permitir usar o laboratório da Faculdade de Química de Araraquara (UNESP). À Conexão Sistemas de Próteses Ltda., pela doação dos corpos de prova utilizados nesta pesquisa. Ao Ministério da Educação e à CAPES, por terem me dado apoio financeiro durante o período de mestrado. Enfim, agradeço a todos os professores, colegas, técnicos, funcionários e entidades que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho. 8 “Quando o mundo estiver unido na busca do conhecimento, e não mais lutando por dinheiro e poder, então nossa sociedade poderá enfim evoluir a um novo nível.” Le Livros 9 Rocha JFSS. Efeito do processo de envelhecimento sobre propriedades físicas e biológicas de biomateriais utilizados como abutments [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia de Araraquara da UNESP; 2018. RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do envelhecimento de materiais comumente usados como pilares de próteses implanto-suportadas (abutments) sobre suas características físicas de superfície (rugosidade, energia livre de superfície e molhabilidade) e propriedades biológicas (metabolismo de fibroblastos orais e formação de biofilme fúngico). Para isso, discos (N=62) com rugosidade inferior a 0,2 µm foram confeccionados em zircônia (ZrO2) do tipo Y-TZP (yttrium- stabilized tetragonal zirconia polycrystalline) e em titânio (Ti) comercialmente puro, e foram submetidos a um processo de envelhecimento simulado em autoclave a 134ᵒC (pressão de 2 bar) por 20 horas. ZrO2 e Ti envelhecidos foram comparados aos seus homólogos não envelhecidos. Os materiais também foram comparados entre si, nas condições envelhecida e não envelhecida. Para os testes biológicos, os grupos também foram comparados a um controle positivo de poliestireno. Todos os testes, exceto o de rugosidade, foram realizados após a formação de película salivar sobre os discos. Os testes biológicos utilizados foram de Alamar Blue (n=9) para avaliar o metabolismo de fibroblastos da gengiva humana (FGH) e de contagem de colônias viáveis (n=9) para verificar a formação de biofilme de uma cepa padrão de Candida albicans (ATCC90028) sobre os materiais. Além disso, microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n=2) foi realizada para avaliação da morfologia dos fibroblastos e dos microrganismos. Para a análise estatística, foram utilizados os testes paramétricos t-teste para amostras pareadas para a rugosidade, t-teste para amostras independentes para energia livre de superfície, molhabilidade e metabolismo dos fibroblastos, e ANOVA one-way com correção de Welch e teste post-hoc de Games-Howell para contagem de colônias viáveis. Utilizou-se um nível de significância de α = 0,05 para todas as análises de inferência. Os resultados mostraram que o processo de envelhecimento não alterou a rugosidade dos materiais testados (ZrO2 e Ti), mas aumentou a energia livre de superfície e a molhabilidade de ambos. Além disso, o envelhecimento não teve efeito sobre o metabolismo dos fibroblastos FGH nem alterou a quantidade de colônias viáveis dos biofilmes de Candida albicans cultivados sobre os discos de ZrO2 ou Ti. Quando os materiais foram comparados entre si, a ZrO2 apresentou menores valores de rugosidade em comparação ao Ti. Além disso, a ZrO2 apresentou maior energia livre de superfície e maior molhabilidade. Para os testes biológicos, não houve alteração do metabolismo de fibroblastos FGH entre os materiais, porém ocorreu menor crescimento de Candida albicans sobre a ZrO2. A análise das imagens de MEV confirmou os resultados encontrados nos testes biológicos. Concluiu-se que o processo de envelhecimento simulado em autoclave não influenciou o crescimento de fibroblastos FGH ou de Candida albicans sobre ZrO2 ou Ti, mas a ZrO2 apresentou menor formação de biofilme fúngico em comparação com o Ti. Palavras-chave: Próteses e implantes. Propriedades físicas. Biofilmes. Técnicas de cultura de células. 10 Rocha JFSS. Effect of the aging process on physical and biological properties of biomaterials used as abutments [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia de Araraquara da UNESP; 2018. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of aging of commonly used abutments on their surface physical characteristics (roughness, surface free energy and wettability) and biological properties (oral fibroblasts metabolism and formation of fungal biofilm). For this purpose, discs (N=62) with roughness less than 0.2 μm were made in yttrium-stabilized tetragonal zirconia polycrystalline (Y-TZP) zirconia (ZrO2) and in commercially pure titanium (Ti), and underwent a simulated aging process in autoclave at 134 °C (pressure of 2 bar) for 20 hours. ZrO2 and Ti were compared to their unaged counterparts. The materials were also compared to each other in the aged and unaged conditions. For the biological tests, the groups were also compared to a positive control of polystyrene. All tests, except roughness, were performed after the formation of salivary film on the discs. The biological tests used were Alamar Blue (n=9) to evaluate the metabolism of human gingival fibroblasts (HGF) and colony counting test (n=9) to verify the biofilm formation of a reference strain of Candida albicans (ATCC90028) on the materials. In addition, scanning electron microscopy (SEM) (n=2) was performed to evaluate the morphology of fibroblasts and microorganisms. For statistical analysis, the t-test for paired samples was used for roughness, t-test for independent samples was used for surface free energy, wettability and fibroblasts metabolism, and one-way ANOVA with Welch correction and Games-Howell post-hoc test was used for colony counting test. A significance level of α = 0.05 was used for all inference analyzes. The results showed that the aging process did not alter the roughness of the tested materials (ZrO2 and Ti), but it increased their surface free energy and wettability. In addition, aging had no effect on the metabolism of HGF fibroblasts nor did it change the amount of viable colonies of Candida albicans biofilms cultured on ZrO2 or Ti discs. When the materials were compared to each other, ZrO2 presented lower roughness values in comparison to Ti. In addition, ZrO2 presented higher surface free energy and wettability. For the biological tests, there was no alteration in the metabolism of HGF fibroblasts between the materials, but there was a lower growth of Candida albicans on ZrO2. SEM analysis confirmed the results found in the biological tests. It was concluded that the autoclave aging process did not influence the growth of HGF fibroblasts or Candida albicans on ZrO2 or Ti, but ZrO2 presented less fungal biofilm formation compared to Ti. Keywords: Prostheses and implants. Biofilms. Cell culture techniques. Physical properties. 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................12 2 PROPOSIÇÃO ..................................................................................15 3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................16 4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................31 4.1 Materiais Testados .......................................................................31 4.2 Grupos Experimentais .................................................................31 4.3 Delineamento do Estudo .............................................................31 4.4 Limpeza dos Corpos de Prova ....................................................32 4.5 Envelhecimento dos Corpos de Prova .......................................32 4.6 Coleta de Saliva para Formação de Película Salivar .................33 4.7 Propriedades Físicas ...................................................................33 4.7.1 Rugosidade superficial média (Ra) ..........................................33 4.7.2 Energia livre de superfície (ELS) .............................................34 4.7.3 Molhabilidade ............................................................................35 4.8 Propriedades Biológicas .............................................................35 4.8.1 Esterilização dos corpos de prova ..........................................35 4.8.2 Metabolismo de fibroblastos gengivais cultivados sobre as amostras de Ti e ZrO2 ...........................................................35 4.8.3 Formação de biofilme de Candida albicans sobre as amostras de Ti e ZrO2 ................................................................36 4.9 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ..............................38 4.10 Análise Estatística ......................................................................38 5 RESULTADOS ..................................................................................40 5.1 Propriedades Físicas ...................................................................40 5.1.1 Rugosidade superficial média (Ra) ..........................................40 5.1.2 Energia livre de superfície (ELS) .............................................41 5.1.3 Molhabilidade ............................................................................43 5.2 Propriedades Biológicas .............................................................44 5.2.1 Metabolismo de fibroblastos gengivais cultivados sobre as amostras de Ti e ZrO2 ...........................................................44 5.2.2 Formação de biofilme de Candida albicans sobre as amostras de Ti e ZrO2 ................................................................45 5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ..............................47 6 DISCUSSÃO .....................................................................................50 7 CONCLUSÃO ...................................................................................55 REFERÊNCIAS ....................................................................................56 ANEXO A .............................................................................................64 12 1 INTRODUÇÃO O implante dentário tem sido uma importante ferramenta para a substituição de dentes perdidos. Sua indicação vai desde casos com grande demanda estética, como a substituição de um único elemento anterior, até casos com grande demanda funcional, atuando na retenção de próteses totais fixas ou removíveis. Nos casos de reabilitação fixa, pilares intermediários (abutments) são parafusados sobre os implantes para fixação da prótese. Esses pilares geralmente são confeccionados com material metálico e/ou cerâmico, ambos apresentando adequada biocompatibilidade1. Para que o implante se mantenha em função ao longo do tempo, é fundamental que alguns fatores sejam observados, entre eles, a presença de um bom selamento promovido pelo tecido gengival junto à superfície do pilar2. Esse selamento evita a infiltração de microrganismos, prevenindo o aparecimento de inflamação na gengiva (mucosite) e no osso (peri-implantite)3. Assim, é desejável que as superfícies dos abutments favoreçam a adesão de células para formação do epitélio juncional, responsável pelo selamento biológico, e que essas superfícies tenham características que dificultem a colonização por microrganismos, evitando a ocorrência de doenças peri-implantares. As doenças peri-implantares envolvem diversos microrganismos, com predomínio de bactérias anaeróbias Gram-negativas4. Dentre os microrganismos presentes na peri-implantite, pode-se destacar as chamadas bactérias do “complexo vermelho”, Porphyromonas gingivalis5-11, Treponema denticola,7-9,11,12 e Tannerella forsythia6,8,9,11,12. Também são encontradas bactérias do gênero Prevotella spp.5,13,14 principalmente as espécies Prevotella intermedia,6,7,9,12 e Prevotella nigrescens6,8,12. Além dessas, bactérias dos gêneros Streptococcus spp.5,6,8,14,15, , Staphylococcus spp.9,12,14 e Fusobacterium spp.13,15, como a espécie Fusobacterium nucleatum12,5,6,8, são frequentemente associadas à peri-implantite. Microrganismos oportunistas como a Candida spp.6,12,16-18 também podem estar presentes. Candida albicans é o fungo mais prevalente na cavidade oral, e sua ocorrência está associada com estomatite protética19. Próteses totais removíveis retidas por implantes (overdentures) podem ser removidas para a higienização, ao contrário dos implantes e abutments que permanecem in sito, favorecendo a infecção por espécies fúngicas. Candida albicans tem sido relatada como uma 13 espécie oportunista nas lesões peri-implantares17,18 e a formação de biofilmes nessas superfícies pode acarretar em infecções com subsequente morbidade, uma vez que os biofilmes fúngicos são difíceis de tratar devido à sua maior resistência a agentes antimicrobianos. Por essa razão, as infecções fúngicas associadas ao uso de próteses sobre implantes podem levar à remoção dos materiais implantados e consequente perda da prótese. A superfície do abutment pode fornecer o substrato necessário para a formação de biofilmes fúngicos e, portanto, pode ser considerada um potencial reservatório para infecção por Candida albicans20. Adicionalmente, alguns estudos20,21 enfatizam a relevância da película salivar e seus constituintes no processo de adesão fúngica inicial. De acordo com Bürgers et al.20, a mucina pode servir como um receptor para a adesão de Candida albicans, enquanto que a albumina pode atuar como agente bloqueador no complexo processo de adesão. Além disso, os materiais com diferentes composições e propriedades hidrofóbicas apresentam diversas maneiras de absorção de mucina salivar, adesão inicial e posterior formação de biofilme21. Normalmente, a película salivar sobre os biomateriais aumenta a energia livre de superfície, reduzindo o número de células aderidas22,23. Devido à capacidade de adesão dos microrganismos nas superfícies de abutments24, a barreira formada pelo tecido gengival ao redor dos mesmos deve ser efetiva para que não ocorra a perda precoce do implante por deficiência no processo de osseointegração. Além disso, essa barreira deve permanecer com esta efetividade ao longo do tempo mesmo com a renovação celular e envelhecimento dos biomateriais, para que não haja a perda tardia, como resultado de doença peri- implantar. A adesão de microrganismos e de células epiteliais aos biomateriais envolve uma série de fatores, entre os quais as características da superfície desses materiais, como energia livre, molhabilidade e rugosidade22,23,25-35. Energia livre é uma característica de superfície relacionada à diferença que existe na força de atração entre as moléculas que estão no interior de uma substância e as moléculas que estão na superfície. As moléculas da superfície realizam menor número de interações, o que faz com que possuam maior energia média em relação às moléculas do interior do líquido. Uma das formas de medir a energia livre de uma superfície é através do ângulo de contato formado por gotas de líquidos depositadas sobre a mesma. Molhamento é a capacidade de um líquido se espalhar por uma 14 superfície. O molhamento completo da superfície acorre quando as forças de adesão são superiores às forças de coesão. Forças de adesão são aquelas que fazem com que partículas de um material atraiam partículas de outros materiais, enquanto que forças de coesão são aquelas que fazem com que as partículas de um mesmo material permaneçam unidas. Rugosidade é o conjunto das irregularidades microgeométricas presentes em uma superfície, e pode ser medida através de um aparelho chamado rugosímetro. Ao longo do tempo, os materiais protéticos podem ter suas propriedades físicas alteradas quando expostos na cavidade oral em função da umidade, acidez, temperatura e cargas mecânicas da mastigação36. Assim, o processo de envelhecimento ocorre naturalmente e pode acarretar em alterações nas propriedades superficiais dos biomateriais, tais como: rugosidade superficial, hidrofilicidade e energia livre de superfície36. Alguns estudos simulam o envelhecimento de materiais através de técnicas como a ciclagem mecânica ou a ciclagem hidrotérmica37-42. O presente estudo consistiu na investigação da influência do envelhecimento por ciclagem hidrotérmica de materiais usados como pilares de próteses implanto- suportadas (zircônia e titânio) sobre as propriedades físicas (rugosidade, energia livre de superfície e molhabilidade) desses materiais, assim como sobre as propriedades biológicas de adesão, morfologia e metabolismo de células humanas e capacidade de formação de biofilme de Candida albicans. A literatura apresenta poucos estudos avaliando a adesão de diferentes células às superfícies protéticas submetidas ao envelhecimento, especialmente após a formação de película salivar. Assim, a relação entre o processo de envelhecimento, características superficiais de biomateriais e propriedades biológicas de células gengivais e fúngicas ainda permanece controversa, justificando a importância do presente estudo. 55 7 CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos e considerando as limitações do presente estudo, foi possível concluir que o processo de envelhecimento simulado em autoclave: 1. Não alterou a rugosidade dos materiais avaliados (zircônia e titânio). Porém, a zircônia apresentou menores valores em relação ao titânio; 2. Aumentou a energia livre de superfície e reduziu o ângulo de contato com a água para ambos os materiais. A zircônia apresentou maiores valores de energia livre de superfície e menores valores de ângulo de contato em comparação com o titânio; 3. Não teve efeito sobre o metabolismo de fibroblastos da gengiva humana (FGH). O tipo de material (zircônia ou titânio) também não influenciou esse fator de estudo. Além disso, imagens de microscopia mostraram que a adesão e a morfologia das células não foram alteradas pelo envelhecimento nem pelo tipo de material; 4. Não alterou a quantidade de colônias viáveis de biofilmes de Candida albicans sobre zircônia ou titânio. Porém, a zircônia apresentou valores menores de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) em relação ao titânio. As imagens de microscopia também confirmaram esses resultados. 56 REFERÊNCIAS 1. Abrahamsson I, Berglundh T, Glantz PO, Lindhe J. The mucosal attachment at different abutments. J Clin Periodontol. 1998; 25(9): 721-27. 2. Humphrey S. Implant maintenance. Dent Clin North Am. 2006; 50(3): 463-78. 3. Kawahara H, Kawahara D, Mimura Y, Takashima Y, Ong JL. Morphologic studies on the biologic seal of titanium dental implants. Report II. In vivo study on the defending mechanism of epithelial adhesion/attachment against invasive factors. Int J Oral Maxillofac Implants. 1998; 13(4): 465-73 4. 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