RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 22/02/2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA EXPRESSÃO GÊNICA E PROTEICA DE APC, E-CADERINA, β- CATENINA E CAVEOLINA-1 NO PROCESSO CARCINOGÊNICO DA PRÓSTATA CANINA E SUAS METÁSTASES PRISCILA EMIKO KOBAYASHI BOTUCATU_SP FEVEREIRO-2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ”JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA EXPRESSÃO GÊNICA E PROTEICA DE APC, E-CADERINA, β- CATENINA E CAVEOLINA-1 NO PROCESSO CARCINOGÊNICO DA PRÓSTATA CANINA E SUAS METÁSTASES PRISCILA EMIKO KOBAYASHI Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador(a): Prof.Dr. Renée Laufer Amorim Nome do Autor: Priscila Emiko Kobayashi Título: Expressão gênica e proteica de APC, E-caderina, β-catenina e Caveolina-1 no processo carcinogênico da próstata canina e suas metástases. COMISSÃO EXAMINADORA ProfªDrª Renée Laufer Amorim Presidente e Orientadora Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu Prof.Dr. Sandra Aparecida Drigo Linde Membro Departamento de Urologia FM– UNESP – Botucatu Prof.Dr. Sebastião Roberto Taboga Membro Departamento de Biologia IBILCE- UNESP- São José do Rio Preto Data da Defesa: 22 de fevereiro de 2016. Agradecimentos Primeiramente à Deus e minha família, pilares que me fortalecem todos os dias, e sem esse apoio não chegaria tão longe. Obrigada pelos ensinamentos de vida, muito mais importante do que qualquer teoria aprendida durante anos de estudo na faculdade. Agradeço a paciência, respeito e todo o esforço dos meus pais durante toda trajetória. Obrigada pelo amor único e incondicional, minha gratidão será eterna. À Professora Renée Laufer Amorim, não somente pela orientação durante o trabalho, mas pelo envolvimento e comprometimento com cada orientado de uma forma humanista. Obrigada por considerar nosso lado pessoal e ser essa pessoa tão amorosa durante toda nossa jornada. Aos professores Julio e Noeme que também participaram da minha formação acadêmica nesta área da Patologia, e junto com a professora Renée, me mostraram o início e a beleza desse longo caminho. À Carlos Alexei Pereira de Carvalho pelo companheirismo e injeção de ânimo nos momentos que mais precisei. Obrigada por estar disposto para caminharmos na mesma direção, acrescentar novas visões ao meu mundo, o qual faz parte. Além de tudo, obrigada por dividir as experiências para crescermos juntos como casal. Ao mais que colega de trabalho, Carlos Eduardo Fonseca Alves, pelo apoio em todos os momentos, por me tranquilizar nos momentos desesperadores, mostrando que é sempre possível quando se faz com vontade e amor ao trabalho. Com certeza, essa inspiração que transmite às pessoas nos torna pessoas melhores no mundo acadêmico ou fora dele. À Marcela Marcondes Pinto Rodrigues pelas palavras de sabedoria nos meus momentos introspectivos, mas acima de tudo pela alegria que tanto me identifico e pela boa energia que traz consigo. Obrigada “miguxa”! À Sarah, Clau e Dani, amigas que a Universidade me apresentou e mesmo com a distância compartilhamos ótimo momentos de descontração e risadas. À Juliano, Isamery, Diogo, Rafael, Claudia, Luga, Thalita, Mauricio, Haline, Tália e a nova integrante Jaque pelas risadas e ótima convivência, pois sem esse ambiente agradável, o trabalho seria muito mais difícil durante os dias. Aos residentes Caio, Maira e Fabrício que além de dividirem o ambiente de trabalho, ajudaram nas coletas, compartilharam conhecimento, dividiram casos clínicos para discussões proveitosas. À Sra. Val que é obrigada a aguentar as amolações desses jovens. Obrigada por auxiliar no processamento dos materiais, e aos conselhos e cuidados de mãe, nessa nossa segunda casa. Ao Maury e Claudinei, que ajudam e muito nas necropsias, animam a sala de trabalho com música diária e boas piadas. Aos amigos verdadeiros que a aliança da amizade se mantém forte apesar da distância. À todos os animais que contribuíram e que contribuirão para meu aprendizado durante todo ciclo de estudos. Muito obrigada a todos que passaram pelo meu caminho e contribuíram direta ou indiretamente durante a evolução do meu trabalho e pessoal. Obrigada! Lista de figuras Figura 1- Escore de Gleason modificado------------------------------------- Pág 9 Figura 2- Via WNT canônica ativada ----------------------------------------- Pág 12 Figura 3 - Via WNT canônica desativada ------------------------------------- Pág 12 Figura 4- Metilação do gene APC --------------------------------------------- Pág 16 Figura 5- Consequências da metilação do gene APC -------------------- Pág16 Lista de abreviações APC Adenomatou polyposis coli CAV-1 Caveolina-1 CaP Carcinoma prostático PIA Atrofia inflamatória proliferativa PIN Neoplasia intraepitelial prostática INCA Instituto Nacional do Câncer NCI National Cancer Institute AR Receptor de Andrógeno SUMÁRIO CAPÍTULO 1 .................................................................................................... 14 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 14 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 15 CAPÍTULO 2- TRABALHOS CIENTÍFICOS ..................................................... 28 CAPÍTULO 3 .................................................................................................... 76 DISCUSSÃO GERAL ....................................................................................... 76 CONCLUSÕES GERAIS.................................................................................. 79 KOBAYASHI,P.E. Expressão gênica e proteica de APC, E-caderina, β- catenina e Caveolina-1 no processo carcinogênico da próstata canina e suas metástases. Botucatu, 2016. 87p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO As alterações na expressão de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 nas células epiteliais prostáticas têm sido estudados em humanos como mecanismos relacionados com progressão tumoral, invasão e metástase. Estas proteínas estão envolvidas no processo de adesão celular e ativação da via WNT canônica. No cão, a perda da expressão proteica de E-caderina e a translocação da -catenina da membrana para o citoplasma/núcleo foram descritas anteriormente em lesões prostáticas caninas. No entanto, nenhum estudo correlacionou alterações de expressão dessas proteínas com as proteínas APC e Caveolina-1. Devido ao prognóstico desfavorável do carcinoma prostático (CaP) no cão e a importância da identificação de novos marcadores prognósticos e preditivos, o presente estudo visou avaliar as expressões gênica e proteica de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 em diferentes lesões prostáticas caninas, além de avaliar o padrão de metilação do gene APC. Foram utilizados neste estudo 10 CaPs, 4 metástases de carcinoma prostático, 10 amostras de atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e 10 próstatas normais de cães para análise imuno-histoquímica. Para a técnica de RT-qPCR forma utilizados 11 próstatas normais, 11 PIA, 17 CaPs e 3 metástases. Para análise de metilacão foram utilizadas seis próstatas normais, seis próstatas com PIA e 12 CaPs. Este estudo revelou aumento de expressão gênica e proteica de Caveolina-1 nas amostras de CaP e metástases, além de menor expressão nas amostras de carcinoma com escore de Gleason mais baixos. Identificou-se marcação membranosa de E-caderina e - catenina nas próstatas normais e perda heterogênea nas lesões estudadas. A expressão de - catenina apresentou diferença estatística (P<0,05) entre os grupos, e somente as amostras de carcinoma prostático e metástases apresentaram marcação citoplasmática e/ou nuclear. Discreta perda na expressão proteica de APC foi observada nos CaP, porém não houve alteração na análise de metilação da ilha CpG da região promotora do gene APC, sugerindo mecanismos diferentes de regulação do APC no homem e no cão. Estes resultados sugerem uma participação e interação das referidas proteínas durante a carcinogênese e metástase prostática. Palavras-chave: via WNT, adesão celular, metástase, cão. KOBAYASHI,P.E. APC, E-cadherin, β-catenin and Caveolin-1 gene and protein expression in canine prostate carcinogenic and metastatic process. Botucatu, 2016. 87p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT Altered expression of E-cadherin, -catenin, APC and Caveolin-1 in prostate epithelial cells has been studied in humans as mechanisms related with tumor progression, invasion and metastasis. These proteins are envolved in cell-cell cohesion and participate in the activation of the canonical WNT pathway. In dogs, membranous E-cadherin loss and translocation of -catenin from the membrane to cytoplasm/nucleus were described previously in canine prostatic lesions. However, studies correlating these genes have not been reported their proteins with APC and Caveolin-1 expressions in canine prostatic lesions. Due to poor prognosis in canine prostate carcinoma (PC) and the need to develop new prognostic and predictive biomarkers, this study aimed to evaluate gene and protein expression of E-cadherin, -catenin, APC and Caveolin-1 in different canine prostatic lesions, and the methylation status of APC gene. We used 10 PC, 4 prostate metastasis, 10 proliferative inflammatory atrophy(PIA) and 10 canine normal prostates tissues for immunohistochemistry. For RT-qPCR we used 11 normal prostate, 11 PIA, 17 PC and 4 metastasis. For methylation analysis, we used six normal prostates, 6 PIA and 13 PC. This study revealed increased Caveolin-1 gene and protein expression in PC and metastasis and lower expression were found in tumors with lower Gleason score. Membranous E-cadherin and - catenin staining was observed in normal prostate samples whereas heterogenous loss was detected in other samples. - catenin expressions was statistical difference (P<0,05) between the groups, only PC and metastasis had cytoplasmic and/or nuclear pattern. Discrete loss of APC protein expression in prostate carcinomas was observed with no alteration in methylation status of APC promoter CpGs islands, suggesting men and dogs have different regulatory mechanisms of APC. These results suggest a participation and interaction of these proteins in carcinogenesis and prostate metastasis. Key words: WNT pathway, cell adhesion, metastasis, dog. 14 CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO O câncer de próstata é uma doença que se desenvolve por processos complexos e multifatorial (KELLER et al., 2013), o qual tem aumentado sua prevalência no homem (EMAMI; COREY, 2007). De acordo com os dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA), são esperados no Brasil para o ano de 2016, 61.200 mil novos casos, sendo a segunda neoplasia mais incidente em homens, ficando atrás apenas do câncer de pele não melanoma (INCA, 2015). Nos Estados Unidos de acordo com o National Cancer Institute (NCI), estima- se 180.890 mil novos casos e 26.120 mil casos de morte decorrente desta neoplasia (SIEGEL et al., 2015). Uma das vias de sinalização amplamente estudada na oncologia humana é a WNT/β-Catenina canônica, que participa de processos importantes na embriogênese e patogênese (VERRAS; SUN, 2006; YU et al., 2009). A desregulação da sinalização da WNT ativa, de forma desordenada, alguns genes alvo desta via (JAMIESON et al., 2012), podendo levar a múltiplas síndromes hereditárias e câncer, inclusive o prostático (LI et al., 2012). O passo chave para essa regulação, envolve um complexo de destruição da -catenina, principal mediador da via WNT no núcleo ( YU et al., 2009; LI et al., 2012). Quando não há sinalização WNT este complexo, que se constitui pelo APC (adenomatous polyposis coli) e outras proteínas, degrada a -catenina presente no citosol e impede seu acúmulo ( YU et al., 2009; STAMOS; WEIS, 2013). A metilação do APC na próstata humana é uma das alterações epigenéticas estudadas e associadas com mortalidade (RICHIARDI et al., 2009), e possivelmente correlacionada com a não degradação da - catenina no citoplasma, em humanos (WANG et al., 2014). A -catenina também é um componente essencial no complexo de adesão celular com a E-caderina na superfície celular, sendo importante na formação e função da glândula prostática (KYPTA; WAXMAN, 2012). Durante a carcinogênese, a ausência de E- caderina e -catenina na membrana está associada com invasão ao tecido adjacente e metástase, observado em cães (FONSECA-ALVES et al., 2015) e humanos (SCHMALHOFER et al., 2009). Em cães, também é abordada a dinâmica da E-caderina durante o ciclo celular e 15 carcinogênese, em que pode ocorrer perda e ganho de expressão durante o desenvolvimento do câncer prostático (FONSECA-ALVES et al., 2013). Além disso, a entrada no ciclo celular para posterior proliferação se dá com a diminuição da E-caderina, o que poderia ocorrer na proliferação de células do CaP e não em células em repouso cancerígenas, justificando assim a heterogeneidade de expressão nos CaP (FONSECA-ALVES et al., 2013). O papel da E-caderina em cães também é demonstrada em lesões pré- neoplásicas as quais são semelhantes em humanos, com perda de expressão membranosa quando comparada às próstatas normais e hiperplásicas (RODRIGUES et al., 2013a). A Caveolina-1 (CAV-1) pertence a outra família de proteínas de membrana, as caveolinas, componentes estruturais da superfície das cavéolas. Estas por sua vez, são invaginações na membrana plasmática e possuem funções de transporte, sinalização, adesão celular e mecanotransdução de membrana ( YANG et al., 2005; QUEST et al., 2012; NASSAR et al., 2013). No processo de carcinogênese a CAV-1 apresenta papel importante por regular a proliferação celular (GUMULEC et al., 2012), ativa a via de sinalização PI3-K- AKT e genes alvo do AKT envolvidos na inibição de apoptose (YANG et al., 2012); e esta função anti apoptótica auxilia no processo de metástase (YANG et al., 2005). 79 CONCLUSÕES GERAIS Nossos resultados foram, por vezes, semelhantes aos relatados em carcinomas prostáticos humanos, revelando similaridades entre o proposto modelo de estudo canino e o homem. Sendo assim, a Caveolina- 1, APC, E-caderina e β- catenina, proteínas envolvidas na via de sinalização WNT canônica e adesão celular, indicam papéis fundamentais na carcinogênese e metástase prostática canina. Devido essas semelhanças, o estudo em cães pode favorecer o entendimento sobre a clínica, tratamento, marcadores moleculares e prognóstico no homem sobre o CaP e metástases. 80 BIBLIOGRAFIA AKTER, S. H. et al. Different Growth Patterns of Canine Prostatic Carcinoma Suggests Different Models of Tumor-Initiating Cells. Veterinary Pathology, v. 52, n. 6, p. 1027– 1033, 1 nov. 2015. ALSHENAWY, H. A.; ALI, M. A. E.-H. A. E.-A. Differential caveolin-1 expression in colon carcinoma and its relation to E-cadherin–β-catenin complex. Annals of Diagnostic Pathology, v. 17, n. 6, p. 476–482, dez. 2013. ANASTAS, J. N.; MOON, R. T. WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer. Nature Reviews Cancer, v. 13, n. 1, p. 11–26, 21 dez. 2012. BAETKE, S. C. et al. 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