UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL EFEITO SUBLETAL DO DIPEL EM Helicoverpa armigera (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Helvio Campoy Costa Junior Engenheiro Agrônomo 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL EFEITO SUBLETAL DO DIPEL EM Helicoverpa armigera (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) Helvio Campoy Costa Junior Orientador: Prof. Dr. Ricardo Antônio Polanczyk Dissertação apresentada à faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Entomologia Agrícola) 2017 Costa Junior, Helvio Campoy C837e Efeito subletal do Dipel em Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) / Helvio Campoy Costa Junior. – – Jaboticabal, 2017 x, 78 p. : il. ; 29 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2017 Orientadora: Maria Aparecida Pessôa da Cruz Centurion Banca examinadora: Paulo Henrique Caramori, Pedro Luís da Costa Aguiar Alves Bibliografia 1. Bacillus thuringiensis. 2. Controle biológico. 3. Efeito subletal. 4. Helicoverpa armigera. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 595.78:632.937 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR HELVIO CAMPOY COSTA JUNIOR – Nascido em 07 de março de 1984, na cidade de Bauru, São Paulo, Brasil. Engenheiro Agrônomo graduado pela Universidade Estadual do Norte do Paraná, UENP/Campus Bandeirantes – PR, em dezembro de 2009. As atividades de pesquisa em entomologia, com ênfase em controle de pragas e experimentação agrícola, iniciaram-se durante estágios realizados em instituições e empresas de destaque na atividade, desde novembro de 2005. Participante no desenvolvimento de projetos de tecnologias que se destacaram no controle de pragas em culturas como Cana-de-açúcar e Cereais, desde dezembro de 2009. Atualmente é o Pesquisador responsáveis pelas ações destinadas a pesquisa e desenvolvimento de inseticidas na empresa Ourofino Agrociência, desde maio de 2011. Iniciou, em março de 2015, o Mestrado em Agronomia (Entomologia Agrícola), na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP/Campus Jaboticabal – SP. “Todos os seus sonhos podem se tornar realidade se você tiver coragem de persegui-los.” Walt Disney A minha esposa, Cintia pelo apoio e incentivo. Aos meus pais, Helvio e Neici, que me proporcionaram a oportunidade de alcançar meus sonhos, e as minhas irmãs, Karina e Kamila, por participarem de todas as minhas conquistas. Por todo amor, carinho e confiança! DEDICO. AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal e ao Departamento de Fitossanidade, pela oportunidade de realização do curso de pós-graduação. À empresa Ourofino Agrociência pelo incentivo e apoio para realização do curso de pós-graduação. Ao Prof. Dr. Ricardo Antônio Polanczyk, pela orientação, disponibilidade, paciência e ensinamentos, durante estes anos de boa convivência e na realização deste trabalho. Ao Giovani Smaniotto, doutorando do laboratório de controle microbiano, pelo apoio, companheirismo e auxilio nas etapas importantes deste trabalho. À Alessandra Marieli Vacari, pós-doutoranda do Laboratório de Biologia e Criação de Insetos, pela paciência e auxílio nas análises estatísticas deste trabalho. Aos professores, funcionários e alunos do Departamento de Fitossanidade, pela convivência e auxílio sempre que necessário. E a todos que, de alguma forma, colaboraram para a realização deste trabalho i SUMÁRIO Página RESUMO ............................................................................................................................... ii ABSTRACT .......................................... ................................................................................. iii LISTA DE DE FIGURAS ............................... ....................................................................... iv LISTA DE TABELAS .................................. ........................................................................... v 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................. ............................................................. 2 2.1 Helicoverpa armigera ................................................................................................ 2 2.1.1 Classificação taxonômica ................................................................................... 2 2.1.2 Distribuição geográfica ....................................................................................... 3 2.1.3 Hábito alimentar e potencial de danos ............................................................... 3 2.1.4 Controle químico e resistência a inseticidas ..................................................... 4 2.2 Bacillus thuringiensis (Bt) ........................................................................................ 5 2.2.1 Histórico, nomenclatura e taxonomia ................................................................ 5 2.2.2 Utilização de Bacillus thuringiensis no manejo de pragas ............................... 7 2.2.3 Utilização de Plantas Bt no manejo de pragas. ............................................... 11 2.2.5 Efeito subletal de Bacillus thuringiensis .......................................................... 17 3. Material e métodos ................................ ..................................................................... 18 3.1 Criação de insetos e condições do experimento .................................................. 18 3.2 Contagem de esporos .............................................................................................. 18 3.3 Bioensaio para determinação das concentrações suble tais ............................... 20 3.4 Avaliação dos parâmetros biológicos ................................................................... 22 3.5 Análise estatísticas ................................................................................................. 23 4. Resultados e discussão ............................ ................................................................. 23 4.1 Estimativa das concentrações subletais ........ ........................................................ 23 4.2 Efeito subletais das concentrações empregadas n o bioensaio ........................... 25 5. Conclusões ........................................ ......................................................................... 33 6. Referências ....................................... .......................................................................... 33 ii EFEITO SUBLETAL DO DIPEL EM Helicoverpa armigera (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) RESUMO O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito subletal causado pelo bioinseticida Dipel em lagartas de Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae). Bacillus thuringiensis (Bt) é um entomopatógeno amplamente utilizado no controle de pragas, porém pouco se sabe sobre seus efeitos em concentrações subletais, que podem ocorrer em campo devido à diferença na distribuição da calda de aplicação ao longo do dossel das culturas ou diferenças na concentração da expressão de toxinas Bt em tecidos de plantas geneticamente modificada. Neste estudo foi utilizado o bioinseticida Dipel na formulação SC, nas concentrações de 3,67 x 106; 6,85 x 106; 6,85 x 107; 1,37 x 108 e 6,85 X 108 esporos.mL-1, além do tratamento controle, no qual recebeu aplicação de apenas água deionizada para instalação do bioensaio para estimativa das concentrações subletais. Para cada concentração foram utilizadas dezesseis lagartas e três repeticões. A análise de Probit, foi utilizada para estimar as concentrações letais; CL10, CL15, CL20 e CL25, que são consideradas concentrações subletais por apresentarem mortalidade abaixo de 25%. Posteriormente, foi instalado outro bioensaio para avaliar alguns parâmetros biológicos, tais como: período de duração da fase larval, peso de indivíduos na fase larval, peso de indivíduos na fase de pupa e razão sexual. Em todas as concentrações foi observado um aumento significativo no período larval, com destaque para CL25 que apresentou o maior período, chegando a mais de 36 dias. Também foram observadas diferenças significativas no peso de lagartas, peso de pupas. Apenas a concentração CL10 não apresentou diferença significativa em relação ao tratamento controle no parâmetro peso de pupas. Concentrações subletais de Bt são capazes de interferir no desenvolvimento de indivíduos de H. armigera, podendo contribuir para reduzir os prejuízos causados por essa praga. Palavras chaves: Bacillus thuringiensis, controle biológico, efeito subletal, Helicoverpa armigera iii SUBLETAL EFFECT OF DIPEL IN Helicoverpa armigera (HÜBNER) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) ABSTRACT The objective of this research was to evaluate the sublethal effect caused by Dipel bioinsecticide on Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) caterpillars. Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogen widely used in pest control, but little is known about its effects on sublethal concentrations, which may occur in the field due to the difference in distribution of the application along the canopy of the crops or differences in concentration expression of Bt toxins in genetically modified plant tissues. In this study, the Dipel bioinsecticide was used in the SC formulation, at concentrations of 3.67 x 106; 6.85 x 106; 6.85 x 107; 1.37 x 108 and 6.85 X 108 spores.mL-1, in addition to the control treatment, in which it received application of only deionized water to install the bioassay to estimate the sublethal concentrations. Sixteen caterpillars and three replicates were used for each concentration. Probit analysis was used to estimate lethal concentrations; LC10, LC15, LC20 and LC25, which are considered sublethal concentrations because they present a mortality below 25%. Later, another bioassay was installed to evaluate some biological parameters, such as: duration period of the larval phase, weight of individuals in the larval stage, weight of individuals in the pupal phase and sexual ratio. All the concentrations showed a significant increase in the larval period, with highlight to LC25 that presented the longest period, reaching more than 36 days. There were also significant differences in the weight of caterpillars and pupal weight. Only LC10 concentration showed no significant difference in relation to the control treatment in the pupae weight parameter. Sublethal Bt concentrations are capable of interfering in the development of H. armigera individuals, and may contribute to reduce the damage caused by this pest. Keywords: Bacillus thuringiensis, biological control, Helicoverpa armigera, subletal effect iv LISTA DE DE FIGURAS Figura 1. Células de Bacillus thuringiensis mostrando o esporo Fonte: Allende et al. (2016, p. 33)……………………………………………...………………………………..... 5 Figura 2. Cristais de Bacillus thuringiensis (Bacillales: Bacillaceae) (VALICENTE; SOUZA, 2004) ............................................................................................................ 6 Figura 3. Esquema explicativo sobre o modo de ação de Bacillus thuringiensis. Fonte: Jurat-Fuentes ([2016?]).................................................................................. 15 Figura 4. Ilustração explicativa do modo como foram realizadas as diluições do produto Dipel, para a posterior contagem da quantidade de esporos...................... 19 Figura 5. Descrição do microscópio utilizado para a contagem dos esporos de Bt na formulação do produto comercial Dipel.......................................................................................................................... 19 Figura 6. Momento da contagem dos esporos, onde os mesmos podem ser observados sobre a câmara de Neubauer................................................................ 20 Figura 7. Bandejas utilizadas para a condução dos bioensaios............................... 21 Figura 8. Ilustração da curva de dose-resposta de Helicoverpa armigera a Bacillus thuringiensis (Dipel)................................................................................................... 27 Figura 9. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre o peso lagartas de primeiro instar de H. armigera................................................................................................. 28 Figura 10. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre o peso de pupas de H. armigera.................................................................................................................... 29 Figura 11. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre a duração do periodo de H. armígera.................................................................................................................... 30 Figura 12. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre a razão sexual de H. armigera.................................................................................................................... 30 v LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores estimados das concentrações sub-letais do Dipel lagartas de primeiro ínstar de Helicoverpa armigera................................................................... 26 Tabela 2. Parâmetros biológicos de lagartas de primeiro instar de Helicoverpa armigera submetidas a concentrações subletais do bioinseticida Dipel................... 32 1 1. INTRODUÇÃO A praga Helicoverpa armigera (Hübner, 1805) (Lepidoptera: Noctuidae) pode se alimentar de folhas e hastes, mas tem preferência pelas estruturas reprodutivas, como espigas e inflorescências, causando deformações ou podridões que acarretam na queda das mesmas (CZEPAK et al., 2013). A ausência de medidas de controle adequadas a H. armigera torna seu manejo no campo difícil de ser realizado de forma satisfatória (CHOUGULE et al., 2005). O uso intenso de inseticidas tem proporcionado o desenvolvimento de populações resistentes dessa praga, principalmente aos inseticidas do grupo químico dos piretróides, além de outros ingredientes ativos pertencentes a outros grupos químicos, como fipronil, clorfenapir, indoxacarbe e spinosad (AHMAD et al., 2003; WU, 2007). Em complemento aos inseticidas químicos, o uso de plantas geneticamente modificadas que expressam as toxinas Cry de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) estão sendo amplamente adotadas, principalmente em culturas como algodão, milho e soja. Com o crescente risco de contaminação ambiental e os insucessos no controle de pragas com inseticidas químicos, é real a necessidade da utilização de entomopatógenos como agentes alternativos de controle. Essa necessidade estimulou consideravelmente o interesse da utilização de bioinseticidas, tornando-se então, de fundamental importância para proteção de culturas e florestas (SALAMA, 1984). A tendência de reduzir a utilização dos inseticidas sintéticos na agricultura, nas florestas e na saúde humana, renovou o interesse em B. thuringiensis como uma alternativa ambientalmente desejável (MOLLA et al., 2011). Formulações comerciais baseadas nesta bactéria, vem sendo utilizadas desde 1970, e tem recebido atenção especial como ferramenta para o manejo de pragas, em uma agricultura que busca a sustentabilidade, preservando o meio ambiente e garantindo aumentos de produção (POLANCZYK; van FRANKENHUYZEN; PAULI, 2017). Além do mais, devido ao aumento do custo de produção alavancados pelos novos inseticidas (GLARE, et. al, 2012) e o aumento do número de registros de resistência (TABASHNIK, et. al, 2014), esses bioinseticidas 2 são uma importante alternativa para o garantir o crescimento exponencial dos sistemas de manejo integrado de pragas. Fatores ambientais como chuva, radiação solar e temperatura são os principais determinantes para a diminuição do residual do Bt (FRYE et al., 1973). Portanto, existem várias possibilidades que podem gerar efeito subletal que precisam ser consideradas para melhor compreensão da eficácia e do impacto ecológico que podem gerar formulações de inseticidas a base de Bt (FRYE et al., 1973). O efeito subletal pode ser de grande contribuição para o manejo de H. armigera, pois, esse efeito é capaz de interferir negativamente na biologia da praga e pode ser passado para as gerações seguintes contribuindo para a prevenção do surgimento de populações resistentes (SEDARATIAN et al., 2012). Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito subletal do bioinseticida Dipel® na formulação SC, nas concentrações CL10, CL15, CL20 e CL25 em lagartas de H. armigera. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Helicoverpa armigera 2.1.1 Classificação taxonômica A espécie Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) pertence a uma das famílias mais abundantes em Lepidoptera (ZAHIRI, 2010, 2011, 2012, 2013) caracterizada, principalmente, pela presença do órgão timpânico localizado na porção posterior do tórax, e a redução ou ausência da veia M2 na asa posterior (FIBIGER; LANFONTAINE, 2004; LANFONTAINE; FIBIGER, 2006). Espécies dessa família são consideradas importantes pragas agrícolas. (MITCHELL et al., 2006). A subfamília Heliothinae, na qual H. armigera faz parte, é considerada cosmopolita e constituída por cerca de 400 espécies, que são igualmente diversificadas quanto a seus hábitos, tamanho, que varia de pequeno a médio e 3 preferindo habitats de climas secos e quentes (MITTER et al., 1993; MATOV et al., 2008). O que se conhece sobre a morfologia e fisiologia do grupo se baseia em estudos esparsos e superficiais, como por exemplo, a presença de esporões tibiais nos três pares de pernas, com suposta função de auxiliar o adulto recém-emergido, a cavar o solo e chegar à superfície (HARDWICK, 1958; FIBIGER; LANFONTAINE, 2004). O gênero Helicoverpa foi descrito por Hardwick (1965) para 11 novas espécies: H. atacammae, H. bracteae, H. confusa, H. fletcheri, H. helenae, H. minuta, H. pacifica, H. pallida, H. tibetensis, H. titicacae e H. toddi; e atualmente com 17 espécies: H. assulta (Guenée, 1852), H. armigera (Hübner, 1805), H. gelotopoen (Dyar, 1921), H. hawaiiensis (Quaintance; Brues, 1905), H. punctigera (Wallengren, 1860) e H.zea (Boddie, 1850). 2.1.2 Distribuição geográfica Helicoverpa armigera é endêmica da África, Europa, Ásia continental, Ceylão, Japão, ilhas Canton e Fiji, Nova Zelândia, Nova Caledônia, Austrália, Nova Guine, leste da Indonésia, Kiribati e Polinésia (HARDWICK, 1965) e, mais recentemente no Novo Mundo (CZEPAK et al., 2013; SPECHT et al., 2013). Em 17 de junho de 2015, três mariposas da praga H. armigera foram coletadas no estado da Florida, sendo este o primeiro relato da espécie em solo americano (HAYDEN; BRAMBILA, 2015). Pelo pouco que se conhece da morfologia do grupo, essa espécie apresenta forte estrutura corporal com tórax amplo (ALI et al., 2009), como característica adaptativa para alcançarem voos mais altos facilitando assim o alto índice de migração em diversos tipos de culturas e em diversas regiões do mundo (FITT, 1989; CUNNINGHAM et al., 1998). 2.1.3 Hábito alimentar e potencial de danos A fase larval alimenta-se de flores e frutos de plantações economicamente importantes, dentre elas: soja, milho e algodão, trazendo inúmeros prejuízos para as 4 lavouras (KITCHING; RAWLINS, 1998; BODY et al., 2008; BURKNESS et al., 2010). Czepak et al. (2013) salientam que os danos podem ocorrer tanto na fase vegetativa quanto na fase reprodutiva da planta. Fato importante na alimentação desta espécie é a utilização por parte dos adultos e imaturos de flores e frutos das plantações, como recursos que sustentam as populações, o que faz do ambiente agrícola o ideal para esta espécie, atualmente praga com alto grau de impacto (ZALUCKI et al., 1986). Por apresentar acentuado desempenho devido adaptações a diversos tipos de culturas, um rápido ciclo de vida, diapausa facultativa e alta capacidade migratória fez com que H. armigera se dissipasse rapidamente e em escala global, trazendo inúmeros prejuízos agrícolas e econômicos (FITT, 1989; JADHAV et al., 2013), inclusive para o Brasil (SPECHT et al., 2013). A espécie, até então não registrada para a América do Sul, adentrou no Brasil, trazendo uma problemática para os agricultores de diversas culturas economicamente importantes (CPEZAK et al., 2013; SPECHT et al., 2013; THOMAZONI et al., 2013). Os representantes destas espécies, além de se alimentarem de variados tipos de plantas, possuem altas taxas de fecundidade e dispersão e, constroem câmaras no solo para pupação (MITTER et al., 1993). 2.1.4 Controle químico e resistência a inseticidas A ausência de medidas de controle adequadas a H. armigera torna seu controle no campo difícil de ser realizado de forma satisfatória (CHOUGULE et al., 2005). O uso intenso de inseticidas tem proporcionado o desenvolvimento de resistência de populações desta praga, principalmente aos inseticidas do grupo químico dos piretróides, além de outros ingredientes ativos pertencentes a outros grupos químicos, como fipronil, clorfenapir, indoxacarbe e spinosad (AHMAD et al., 2003; WU, 2007). Wyckhuys et. al. (2013) destacam que 640 casos de resistência a inseticidas de populações da referida praga foram relatados no mundo. De acordo com “Arthropod pesticide resistance database”, atualmente os relatos de resistência de H. armigera a inseticidas biológicos e químicos chegaram a 763 casos de resistência relatados a 49 princípios ativos. 5 2.2 Bacillus thuringiensis (Bt) 2.2.1 Histórico, nomenclatura e taxonomia A microflora bacteriana dos insetos, confinada no intestino, é rica, diversa e compreende bactérias Gram positivas e negativas. Muitas delas auxiliam na digestão dos alimentos, porém algumas são patogênicas e recebem grande atenção dos pesquisadores devido ao seu potencial para o controle de pragas agrícolas e urbanas (PRIEST, 2000). Entre estes patógenos destaca-se B. thuringiensis (Bt) (Bacillaceae), bactéria em forma de bastonete, formadora de esporos e capaz de produzir inclusões cristalinas durante a esporulação, que são responsáveis pela atividade tóxica desta espécie (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000) (Figuras 1 e 2). Figura 1. “Células de Bacillus thuringiensis mostrando o esporo (Setas vermelhas), de coloração mais clara; e o cristal bipiramidal (Setas verdes), de coloração mais escura”. Allende et al. (2016, p. 33) 6 Figura 2. Cristais de Bacillus thuringiensis (Bacillales: Bacillaceae) (VALICENTE; SOUZA, 2004). O Bt foi pela primeira vez descrito por Berliner em 1911 quando este pesquisador isolou o bacilo de Anagasta kuehniella. Posteriormente, ele o nomeou B. thuringiensis em homenagem à província de Thuringia (Alemanha), onde o primeiro inseto infectado foi encontrado. Embora esta seja a primeira descrição utilizando o nome de B. thuringiensis, não foi o primeiro isolamento deste patógeno. Em 1901, o biólogo S. Ishiwata isolou a bactéria que era agente causal da “sotto- disease”. Em 1908, Iwabuchi a denominou como B. sotto Ishiwata, que posteriormente foi considerado nome inválido e o nome mais recente (B. thuringiensis) foi mantido (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000). Embora geralmente o termo B. thuringiensis seja empregado para uma única espécie, na verdade ela pertence a um complexo de várias espécies (B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, Bt e B. weihenstephanesis) denominado B. cereus. Bt e B. cereus, por exemplo, mostram características fenotípicas e bioquímicas comuns, mas por definição, Bt pode ser diferenciado pela presença dos cristais (LUTHY; WOLFERSBERGER, 2000), visíveis em microscopia de contraste de fase, embora este seja um critério com pouco valor taxonômico (LYSENKO, 1983). Os métodos moleculares como hibridização do DNA cromossômico, análise de ácidos graxos e fosfolipídeos, comparação da sequência 16S rRNA, entre outros, mostram que estas duas espécies são, na verdade, somente uma. Esta semelhança é devida à transferência de plasmídeos que codificam as δ-endotoxinas de Bt para B. cereus e, por outro lado, o Bt pode perder a capacidade de produzir estas toxinas, “tornando- 7 se B. cereus”. Portanto, a distinção entre estas espécies não é clara e continua sendo assunto de interesse de muitos taxonomistas (SCHNEPF et al., 1998; GLARE; O’CALLAGHAM, 2000; HANSEN; SALAMITOU, 2000). 2.2.2 Utilização de Bacillus thuringiensis no manejo de pragas Bacillus thuringiensis (Bt) está presente em amostras de solos de áreas cultivadas com culturas anuais ou perenes, áreas desérticas, ambientes aquáticos, superfície e interior de plantas, restos vegetais, insetos e pequenos mamíferos mortos, teias de aranha, grãos armazenados e locais inabitados (BERNHARD et al., 1997; FORSYTH; LOGAN, 2000; BIZZARRI; BISHOP, 2007; HERNÁNDEZ et al., 2007; KONECKA et al., 2007; THAMMASITTIRONG; ATTATHOM, 2008; AZAMBUJA et al., 2009; ABOUSSAID et al., 2011; ASSAEEDI et al., 2011; PRABHAKAR; BISHOP, 2011; PATEL et al., 2013; SWIECICKA et al., 2013; ARGÔLO-FILHO; LOGUERCIO, 2014). Devido à sua adaptação a diferentes habitats Bt produz uma grande gama de substâncias que podem ser utilizadas para diversos fins, como por exemplo, controle de doenças fúngicas em plantas (CHOI et al., 2007; AKRAM et al., 2013), biorremediação (OZTURK, 2007; OVES et al., 2013; MANDAL et al., 2013; WU et al., 2013) e para tratar células cancerígenas humanas (OHBA et al., 2009; POORNIMA et al., 2010). Esta bactéria é bem conhecida pela sua habilidade de produzir inclusões cristalinas (cristais), que têm atraído atenção de pesquisadores em todo mundo devido a sua atividade inseticida (SCHNEPF et al., 1998). Desde a clonagem e sequenciamento dos primeiros genes das proteínas Cry (também chamadas de toxinas Cry) na década de 1980, muitos outros foram caracterizados e classificados de acordo com a nomenclatura de Crickmore et al. (2008). Bioinseticidas à base de Bt são utilizados com sucesso no controle de pragas desde a segunda metade do século XX (ROSAS-GARCIA, 2009; SANAHUJA et al., 2011; SANCHIS, 2011; POLANCZYK et al., 2012). Esta bactéria entomopatogênica tem efeito letal e/ou subletal na fase jovem e/ou adulta de diversas ordens de insetos de importância agrícola: Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Isoptera, Lepidoptera 8 e Orthoptera (PORCAR et al., 2009; Van FRANKENHUYZEN, 2009; ABOUSSAID et al., 2010; BLANCO et al., 2010; OPPERT et al., 2011; BRAVO et al., 2012; BERGAMASCO et al., 2013; PANIZI, 2013; van FRANKENHUYZEN, 2013; ZHANG et al., 2013; SCHÜNEMANN et al., 2014). A sua atividade biológica também foi relatada para algumas espécies de ácaros praga, nematoides, Ascaris suum (Goeze, 1782) (Ascaridida: Ascarididae); Blatta orientalis Linnaeus, 1758 (Blattaria: Blattidae); Leishmania major Yakimoff & Schokhor, 1914 (Trypanosomatida: Trypanosomatida); Schistosoma japonicum (Katsurada, 1904) (Strigeiformes: Schistosomatidae) (GUTIÉRREZ; GONÇALVES, 2006; PORCAR et al., 2006; RADWAN, 2007; AMANCHI; HUSSAIN, 2008; EL- SADAWY et al., 2008; SILVEIRA et al., 2011; BERLITZ et al., 2013; URBAN Jr. et al., 2013). Embora os produtos comerciais à base de Bt sejam utilizados contra lepidópteros, dípteros e coleópteros, mais de 1.000 espécies de insetos, pertencentes a diversas ordens de insetos, são suscetíveis a este patógeno (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000). Dos 572 lepidópteros suscetíveis ao Bt elencados por estes autores, 83 (14,5%) são noctuídeos. O bioinseticida à base de Bt com maior alcance no mercado mundial é o Dipel (Bt kurstaki HD-1). Este produto, pouco tóxico para ácaros, coleópteros, dípteros e hemípteros é altamente eficiente contra mais de 170 lepidópteros-praga (BEEGLE; YAMAMOTO, 1992; GLARE; O’CALLAGHAM, 2000). Fiuza et al. (2017) relataram as recentes descobertas que os estudos envolvendo bactérias de Bt para controle de pragas que os efeitos dessa bactéria ainda não eram conhecidos, tais como: Acromyrmex crassispinus (Forel) (Hymenoptera: Formicidae), A. lundi (Guering) (Hymenoptera: Formicidae), Euschistus heros (Fabricius, 1798) (Hemiptera: Pentatomidae), Meloidogyne spp. (Nematoda: Meloidogynidae) entre outras. Essas descobertas criaram expectativa de utilizar Bt como fermenta de controle de diferentes pragas, podendo ser empragado em sistemas de manejo integrado em diferentes culturas. A eficácia e especificidade das cepas de Bt e suas toxinas no controle de insetos praga, favoreceram a formulação de bioinseticidas à base deste patógeno e 322 produtos à base de Bt são responsáveis por 53% do mercado mundial de bioinseticidas, gerando um faturamento anual de US$ 210 milhões. A participação dos 9 bioinseticidas à base de Bt no mercado mundial de bioinseticidas vem diminuindo desde 2000. Naquele ano a participação era de 90%, diminuindo para 60% em 2005 e para 53% em 2010. Esta redução ocorreu devido ao grande incremento no uso de vírus entomopatogênicos (+100%) e fungos entomopatogênicos (+52%) no controle de pragas agrícolas, enquanto que o mercado de produtos à base de Bt aumentou apenas 36%. (CAB INTERNACIONAL CENTRE, 2010). Polanczyk, van Frankenhuyzen e Pauli (2017), ressaltaram o aumento da adoção de Bt em sistemas de manejo integrado de pragas no Brasil, após a entrada e rápida dispersão da praga H. armigera e após o aumento significativo da praga que era considerada como secundária, Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae), em lavouras de soja, devido ao grande potencial de ocasionar danos e pela dificuldade de controle que essas pragas vêm mostrando nas últimas safras. Juntas essas pragas alavancaram consideravelmente o mercado de produtos contendo Bt em suas formulações, devido sua grande eficiência comprovada em campo, onde apenas no ano de 2016, foram observadas as entradas de empresas nesse mercado com as marcas comerciais Best®, Costar® e BtControl®. A quantidade de produtos a base de Bt quase duplicou nos últimos quatro anos, onde atualmente, existem 12 produtos com registro no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e mais de 10 produtos estão atualmente registrados em caráter emergêncial para a praga H. armigera. Devido à maioria dos bioinseticidas terem esta bactéria como ingrediente ativo, o uso de Bt bioinseticidas marca o início da substituição dos inseticidas convencionais em várias áreas, com a retomada da utilização de agentes entomopatogênicos em grandes áreas agrícolas. Na década de 1980, o surgimento de novas técnicas, especialmente aquelas voltadas para a tecnologia do DNA recombinante, e manifestações públicas a respeito do uso abusivo dos inseticidas convencionais, levaram a um aumento cada vez mais crescente do interesse dos órgãos de pesquisa e indústrias sobre a utilização do Bt na agricultura e saúde pública (van FRANKENHUYZEN, 1993). Na América do Norte, produtos à base de Bt são muito utilizados para o controle de pragas florestais, principalmente Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Erebidae), Choristoneura fumiferana Lederer, 1859 (Lepidoptera: 10 Tortricidae) e Choristoneura occidentalis Freeman, 1967 (Lepidoptera: Tortricidae). Nos EUA, de 1980 até 1995, cerca de dois milhões de hectares de florestas foram tratados com Bt kurstaki (Btk) para o controle de L. dispar, em alguns casos resultando na erradicação da praga. A partir da década de 90, a aplicação contra C. fumiferana nos EUA e Canadá praticamente cessou, devido ao sucesso obtido na década anterior (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000; van FRANKENHUYZEN, 2000). Durante 35 anos, desde sua primeira utilização em 1980, Btk em sido aplicado para suprimir populações de pragas desfolhadoras e na erradicação de pragas florestais invasoras, acumulando um total de 11.3 milhões de hectares tratados no Canada, e 6.2 milhões de hectares nos Estados Unidos (POLANCZYK; van FRANKENHUYZEN; PAULI, 2017). A América Latina, Cuba e México lideram a utilização dos bioinseticidas à base de Bt, especialmente para o controle de pragas em algodão, banana, batata, citros, hortaliças, fumo, milho, pastagens. No Brasil são utilizados produtos à base de Bt para o controle de cerca de 30 pragas de importância agrícola, porém a área total em que esses produtos são aplicados é apenas a terça parte do México e semelhante à de Cuba, ou seja, cerca de 150.000 hectares (POLANCZYK et al., 2012). Recentemente houve um grande incremento no comércio de Bt bioinseticidas no Brasil, principalmente devido a surtos de H. armigera (dados não publicados). A China é o maior mercado de bioinseticidas na Ásia, seguido por Índia e Japão. A maioria dos produtos disponíveis para uso nesses países foi desenvolvido e fabricado localmente ainda que, muitas vezes, com assistência de ONGs ou do governo. China, Rússia, Bielorrússia e, em menor intensidade, Índia e Tailândia, também se tornaram produtores importantes de bioinseticidas à base de Bt. Em outros países como Israel, Indonésia, Malásia, Índia e países da África Ocidental, a utilização deste entomopatógeno no controle de pragas está em fase inicial de pesquisa (CAB INTERNATIONAL CENTRE, 2010). Gelernter e Schab (1993) e Navon (2000) afirmam que diversos fatores limitam a utilização dos referidos bioinseticidas: o seu custo, que na maioria das vezes é superior ao dos inseticidas químicos; a baixa persistência em campo da maioria das formulações; o baixo espectro de ação, a ineficácia contra pragas de solo e endofíticas. Os autores enfatizam que estão sendo desenvolvidas pesquisas 11 para minimizar essas desvantagens. As pesquisas estão voltadas principalmente para: identificação de novos genes cry, desenvolvimento de novas formulações, plantas expressando genes cry e ampliação dos conhecimentos das interações com outros entomopatógenos, predadores, parasitóides e mesmo os inseticidas químicos. 2.2.3 Utilização de Plantas Bt no manejo de pragas. A primeira geração de plantas transgênicas resistentes a insetos desenvolveu-se com o uso de genes codificadores de proteínas Cry de Bt (FISCHHOFF, 1987; VAECK et al., 1987). Os genes Cry de Bt são talvez os exemplos mais conhecidos de genes exógenos para os quais tem sido difícil obter um nível satisfatório de expressão em plantas transgênicas (DIEHN et al., 1996). Os estudos iniciais se basearam em plantas como tabaco e tomate (BARTON et al., 1987; FISCHHOFF et al., 1987; VAECK et al., 1987) devido às facilidades de transformação, cultivo em casa de vegetação e crescimento rápido. Vários genes quiméricos contendo um gene promotor de origem vegetal; a seqüência completa do gene Cry e uma região de poliadenilação foram introduzidas em tabaco e tomate, porém nenhuma expressão foi detectada em tabaco e níveis muito baixos foram observados em tomate (PERLAK et al., 2001). A truncagem da seqüência codificadora do gene Cry por eliminação da metade 3’ desta seqüência aumentou a expressão para níveis detectáveis de proteína e mRNA (ESTRUCH et al., 1997). Os primeiros testes de campo com versões truncadas do gene Cry foram eficientes no controle de H. zea no caso do tomate (PERLAK; FISCHHOFF, 1993), porém sem eficiência no controle de Heliothis virescens Fabricius, 1781 (Lepidoptera: Noctuidae) na cultura do algodão (JENKINS et al., 1993). Os resultados mais efetivos foram obtidos utilizando genes sintéticos (PERLAK et al., 1990; PERLAK et al., 2001; van der SALM et al., 1994). Embora em todo mundo 20 genes Cry tenham sido introduzidos para transformar 14 plantas de interesse econômico tornando-as resistentes contra aproximadamente de 40 pragas de importância econômica, os principais alvos são as culturas de milho e algodão (FIUZA; PINTO, 2009/2010; JAMES, 2013). Em 2013 12 um total de 185,1 milhões de hectares foi cultivado com plantas geneticamente modificadas (“biotech crops”) por aproximadamente 18 milhões de agricultores em 26 países (19 países em desenvolvimento e 7 países industrializados). Os países com maior área plantada são EUA (72,9 milhões de hectares), Brasil (49,1 milhões de hectares) e Argentina (23,8 milhões de hectares). As principais plantas transgênicas cultivadas no mundo são soja, milho, algodão e canola com 50%, 33%, 12% e 5% da área total, respectivamente (JAMES, 2016). No Brasil, a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) aprovou até o ano de 2016 a liberação comercial de 3 tecnologias de plantas transgênicas Bt de soja, 35 de milho Bt, 8 de algodão Bt e uma planta de cana-de-açúcar para o controle de pragas (CTNBIO, 2015). O Brasil foi o país que apresentou maior incremento em termos de área plantada com plantas transgênicas entre 2015 e 2016 (4,9 milhões de hectares) O desenvolvimento de plantas expressando mais uma característica, como por exemplo, a soja resistente a insetos e tolerante a herbicida (RI/TH) alavancou o aumento da área com plantas transgênicas no Brasil que no momento é de 32,0 milhões de hectares enquanto que nos EUA a área cultivada com estas plantas foi de 32,1 milhões de hectares, juntos esses países representam 43% da área mundial (JAMES, 2016). Em 2016, o Brasil apresentou o maior crescimento (11%) em termos de plantio de plantas transgênicas. Do total de 49,3 milhões de hectares; 32,7 milhões de hectares foram cultivados com soja (96,5 % do total das áreas); 15,7 milhões de hectares com milho (aumento de 16,1% em relação a 2015) e 0,79 milhões de hectares com algodão (aumentando 6,3% em relação a 2015). A soja intacta, resistente a insetos e tolerante a herbicida (RI/TH), foi cultivada em aproximadamente 11,9 milhões de hectares no Brasil na safra 15/16 (JAMES, 2016). Na cultura da soja em 2016, os agricultores brasileiros plantaram 32,87 milhões de hectares de soja transgênica, sendo que deste total 12,43 milhões de hectares foi de soja TH (36,7%) e 20,25 milhões de hectares de soja TH/RI (59,8%). Com relação à cultura do milho, 88,4% da área foi cultivada com transgênicos (15,67 milhões de hectares), sendo 20,7% com milho RI (3,67 milhões de hectares) e 63,9% com milho RI/TH (11,32 milhões de hectares). O algodão transgênico foi cultivado em 790 mil hectares, apresentando uma taxa de adoção de 78,3% de um 13 total de 1,01 milhões de hectares, sendo destes 12,1% (120 mil hectares) RI e 42,3% (320 mil hectares) RI/TH (JAMES, 2016). Os genes Bt têm fornecido uma contribuição significativa em conferir resistência a uma ampla gama de pragas nas principais culturas agrícolas mundiais, incluindo milho (a principal), algodão e importantes hortaliças, como por exemplo, berinjela. Tanto os países industrializados como EUA e Canadá como os países pobres como Burkina Faso e Bangladesh têm sido beneficiados com os genes Bt e o potencial de uso futuro é enorme (JAMES, 2016). Dr. Anthony M. Shelton da Cornell University ressalta em JAMES (2013): “A comercialização de plantas expressando as proteínas Cry com atividade inseticida revolucionaram a agricultura e tornaram-se a principal estratégia de programas de Manejo Integrado de Pragas (MIP) (SHELTON et al., 2002; ROMEIS et al., 2008). Em 2011, a plantas Bt foram cultivadas em mais de 66 milhões de hectares e reduziram o uso de inseticidas (SHELTON et al., 2002; QAIM et al, 2008; KATHAGE; QAIM, 2012; LU et al., 2012), controlaram populações de pragas em regiões específicas (CARRIERE et al., 2003; WU et al., 2008), preservaram os inimigos naturais (NARANJO, 2009) e promoveram o uso do controle biológico (LU et al., 2012) ”. 2.2.4 Modo de ação de Bacillus thuringiensis Em 1915, Berliner notou presença de inclusões parasporais nas células de Bt e em 1953, Hannay sugeriu a associação entre a patogenicidade desta bactéria e presença das inclusões cristalinas (cristais) formadas nas células durante a esporulação. Em 1968, Angus demonstrou que a hipótese de Hannay era válida (GLARE; O´CALLAGHAM, 2000) o que despertou o interesse por estudos sobre o modo de ação desta bactéria. De acordo com Bravo et al. (2017), B. thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram- positiva que produz diferentes proteínas inseticidas, denominadas Cry, Vip, e Cyt, durante sua fase de crescimento e esporulação. Bt representa a estratégia de controle biológico de insetos mais utilizada atualmente em todo o mundo. As proteínas inseticidas produzidas por Bt são tóxicas a diferentes ordens de insetos, 14 tais como Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, e Mallophaga, bem como nematoides. Bt produz diferentes tipos de proteínas inseticidas. Cerca de 950 genes de diferentes toxinas foram clonados e classificados em 74 grupos de proteínas Cry, 3 grupos de proteínas Cyt e 3 grupos de proteínas Vip (CRICKMORE et al., 2016). No final do século passado, a sequência de eventos da patologia do Bt que causam a morte do inseto após a ingestão das proteínas Cry pareciam ser relativamente simples e bem definidos, pelo menos em termos gerais (RAJAMOHAN et al., 1998; SCHNEPF et al., 1998; VACHON et al., 2012). As proteínas do cristal são inicialmente ingeridas como protoxinas que são solubilizadas e proteoliticamente convertidas em polipeptideos menores e estáveis no intestino médio do inseto. Estas toxinas ativadas ligam-se a receptores específicos na superfície das células epiteliais do intestino médio, permitindo que as proteínas se insiram na membrana e formem poros que são seletivos a pequenas moléculas como íons inorgânicos, aminoácidos e açúcares (CARROLL; ELLAR, 1993; KIROUAC et al., 2002). A presença destes poros na membrana plasmática interfere com a fisiologia da célula modificando os gradientes iônicos o que pode causar a lise das células devido a grande entrada de solutos a partir do lúmen do intestino médio (KNOWLES; ELLAR, 1987). Posteriormente, a destruição das células resulta em grandes danos ao tecido epitelial do intestino médio e a morte da lagarta intoxicada. Este pode ser definido como o “modo de ação clássico de Bt”. O “modelo da ligação sequencial” conforme ilustrado na figura 3, tem sido muito estudado (BRAVO et al., 2007, 2011; SOBERÓN et al., 2007; 2009; 2010; BRAVO; SOBERÓN, 2008; JIMÉNEZ-JUÁREZ et al., 2008; PARDO-LÓPEZ et al., 2013). Este modelo descreve um mecanismo hipotético de formação do poro que é baseado principalmente em pesquisas com a toxina Cry 1Ab e Manduca sexta (LINNAEUS, 1763) (Lepidoptera: Sphingidae). As toxinas Cry1Aa e Cry1Ac, Cry1Ab possuem certa semelhança por se ligarem a pelo menos dois receptores específicos na membrana das células epiteliais do intestino médio: uma proteína semelhante à caderina e uma aminopeptidase N GPI (GÓMEZ et al.,2007; PIGOTT; ELLAR, 2007; LIKITVIVATANAVONG et al., 2011). 15 Figura 3. Esquema explicativo sobre o modo de ação de Bacillus thuringiensis. Jurat- Fuentes ([2016?]). Uma vez ativada pelas proteases intestinais, as toxinas se ligam a uma caderina. Isto por sua vez causa uma alteração conformacional que favorece a clivagem proteolítica ao nível do resíduo F50, localizado dentro da alça que liga as hélices a1 e a2, as primeiras hélices da região terminal N do domínio formador do poro da molécula da toxina. Posteriormente, a remoção da hélice a1 permite que o restante da toxina oligomerize e forme uma estrutura denominada “estrutura pré poro” (GÓMEZ et al., 2002). Este oligômero se liga a um receptor aminopeptidase que possui uma afinidade muito maior por esta proteína do que a toxina monomérica (BRAVO et al., 2004). Finalmente, a ligação a uma aminopeptidase favorece a inserção do pré poro na membrana que fica mais permeável em função do poro resultante. Em uma modificação deste modelo Pacheco et al. (2009) propuseram uma etapa adicional em que a toxina monomérica primeiramente se liga a uma aminopeptidase, com baixa afinidade, porém elevada capacidade, antes de interagir com a caderina, que está presente em pequenas quantidades na membrana, como foi salientado por Pigott e Ellar (2007), mas se liga a toxina com elevada afinidade. 16 Porém, o modelo de ligação sequencial simplesmente ignora mais de duas décadas de pesquisas sobre as toxinas Cry de Bt (VACHON et al., 2012). Como discutido anteriormente por Schwartz e Laprade (2000), a formação do poro foi demonstrada inequivocamente e várias vezes usando uma série de modelos experimentais, incluindo a condutância em membranas lipídicas planas de duas camadas, bioensaios de permeabilidade baseados em medições de difusão ótica ou fluorescência nas microvilosidades apicais das células colunares do intestino médio, na medição de potencial da membrana em intestino médio isolado, e em bioensaios de turgescência osmótica em células de insetos. No entanto, Vachon et al. (2012) ressaltaram que o mérito deste modo de ação reside no fato de que a interação das toxinas com células sensíveis, sem dúvida, tem consequências importantes no metabolismo celular e sua regulação. Como demostrado anteriormente em estudos que foram totalmente ignorados; o grande efeito de toxinas Cry inseticidas sobre os níveis de cálcio intracelular (MONETTE et al., 1994, 1997). O intestino dos insetos suscetíveis geralmente possui um pH elevado, o que evita a germinação dos esporos ingeridos do patógeno. Porém as δ-endotoxinas causam a paralisia do intestino, retendo os esporos e destruindo a parede do intestino. O conteúdo do intestino mistura-se ao da hemolinfa, reduzindo o pH e fornecendo nutrientes para iniciar a germinação dos esporos. O inseto morto serve então como fonte de alimento para o crescimento vegetativo da bactéria (KNOWLES, 1994). Devido à importância do esporo na patogenicidade desta bactéria, a maioria dos produtos comercializados possui os esporos e as toxinas, visando aumentar sua atividade tóxica (COPPING; MENN, 2000). Uma cepa de Bt pode produzir um ou mais cristais e estes, por sua vez, podem conter uma ou mais toxinas com peso molecular variado. A forma do cristal é determinada pelo número de δ-endotoxinas presentes, e uma relação parcial entre composição da proteína e sua estrutura molecular foi estabelecida por Glare e O’Callagham (2000) e Lereclus et al. (1993). A inclusão cristalina pode ser responsável por mais de 25% do peso seco das células. A quantidade de toxina produzida em laboratório (aproximadamente 0,5 mg de proteína/mL de meio de cultura) e o tamanho dos cristais indicam que cada célula tem que sintetizar de 106 a 17 2 x 106 moléculas de δ-endotoxina para formar o cristal (AGAISSE; LERECLUS, 1995). 2.2.5 Efeito subletal de Bacillus thuringiensis Os efeitos da intoxicação subletal de Bt e o custo adaptativo de pragas alvo é uma área pouco estudada. Moreau e Bauce (2003) mostraram que as concentrações subletais de Bt kurstaki (Btk) aumentou significativamente o período de larvas e diminuição do peso de pupa de C. fumiferana. Além disso, os efeitos subletais de Btk em L. dispar e o parasitóide Tachinidae Compsilura concinnata (Meigen) (Dip.: Tachinidae) foram relatados por Erb et al. (2001). Os efeitos subtletais de Btk no desenvolvimento larval de Sesamia nonagrioides Lefebvre (Lepidoptera: Noctuidae) foram investigados por Eizaguirre et al. (2005). Além disso, a interação sinérgica entre doses subletais de Btk e Campoletis chlorideae Uchida (Hymenoptera.: Ichneumonidae) no manejo H. armigera foi investigado por Mohan et al. (2008). Segundo Sedaratian et al. (2013), o efeito subletal pode ser de grande contribuição para o manejo de H. armigera, pois, esse efeito é capaz de interferir negativamente na biologia da praga e pode ser passado para as gerações seguintes contribuindo para a prevenção do surgimento de populações resistentes. Porém o conhecimento do efeito subletal como prevenção do surgimento de populações resistentes não descartam a adoção das estratégias de manejo de resistência. 18 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Criação de insetos e condições do experimento Os experimentos foram conduzidos na Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Fitossanidade, no Laboratório de Controle Microbiano em Jaboticabal, SP, e na Empresa Ourofino Agrociência, Laboratório de Entomologia em Guatapará, SP, onde foram mantidos em condições de laboratório com temperatura de 25 ±1° C, umidade relativa de 70 ± 5% e a 16 horas de fotofase : 8 horas de escotofase. As lagartas de H. armigera foram provenientes da criação da empresa Pragas.com, coletadas em algodão a três gerações, as mesmas foram fornecidas ainda na fase de ovos para o laboratório de controle microbiano, onde foram acondicionados em recipientes contendo redes de tecido com ovos e ao fundo do recipiente continha dieta artificial descrita por Shorey e Hale (1965), garantindo a sobrevivência dos indivíduos da eclosão até o estádio L1 (aproximadamente 1 dia após a eclosão), posteriormente, essas lagartas foram utilizadas para a instalação dos experimentos. Todos os equipamentos utilizados na condução do experimento foram devidamente descontaminados em solução de hipoclorito de sódio a 5%, álcool 70% e câmara de esterilização com radiação Ultravioleta germicida. 3.2 Contagem de esporos Para possibilitar a instalação dos bioensaios em laboratório, se fez necessário realizar a contagem dos esporos de Btk presentes no produto comercial Dipel® formulação SC 33,6 g.L-1 (Sumitomo Chemical do Brasil Repres. Ltda.). A contagem foi realizada preparando diluições na ordem de 1:9, ou seja, uma parte do produto comercial para nove partes de água e posteriormente a mesma taxa de diluição foi empregada para cada calda gerada na diluição anterior (Figura 4), onde após o preparo, cada diluição foi submetida a agitação por cerca de um minuto, para garantir homogeneização adequada. 19 A contagem dos esporos de Bt foi realizada com o auxilio de equipamentos específicos, tais como, 4 erlenmeyers graduados com volume de 200 mL, um agitador, uma câmara de Neubauer, uma lamínula de microscópio, uma pisseta e um microscópio trinocular marca Zeiss modelo AXIO IMAGER A2 (Figura 5). Foram utilizadas para a contagem, a terceira e a quarta diluição, devido a quantidade de esporos que possibilitaram a contagem. Após a visualização dos esporos sobre os quadrantes da câmara de Neubauer, os mesmos foram contabilizados e submetidos ao cálculo de determinação da concentração conforme descrito por Alves e Moraes (1998), onde foram obtidos os valores de 1,3 x 107 esporos.mL-1 na terceira diluição e 3,67 X 106 esporos.mL-1 na quarta diluição (Figura 6). Figura 4. Ilustração explicativa do modo como foram realizadas as diluições do produto Dipel, para a posterior contagem da quantidade de esporos. 20 Figura 5. Microscópio da marca Zeiss modelo AXIO IMAGER A2, utilizado para a realização da contagem dos esporos de Bt na formulação do produto comercial Dipel. Figura 6. Imagem capturada no momento da contagem, onde os esporos podem ser observados sobre a câmara de Neubauer. Setas brancas indicam os esporos na imagem. 3.3 Bioensaio para determinação das concentrações s ubletais As concentrações utilizadas no experimento que possibilitou a estimativa das concentrações subletais, foram obtidas através de bioensaios previamente realizados, empregando concentrações conhecidas a partir de diluições realizadas, tendo como referência as concentrações determinadas na etapa de contagem dos esporos. Com a instalação de quatro bioensaios realizados previamente foi possível determinar com melhor precisão as concentrações que foram utilizadas no bioensaio para determinação das concentrações subletais, que foram as seguintes: T1 = Controle, T2 = 3,67 x 106, T3= 6,85 x 106, T4 = 6,85 x 107, T5 = 1,37 x 108 e T6 = 6,85 X108 esporos.mL-1. O bioensaio para estimativa das concentrações subletais foi instalado no dia 13 de abril de 2017, com delineamento experimental inteiramente ao acaso, contendo três repetições e seis tratamentos, que foram dispostos da seguinte maneira: as unidades experimentais foram células individualizadas de uma bandeja 21 fabricada pela empresa Advento do Brasil, que continha 16 células ao todo (Figura 7), onde cada célula media 3,5 cm largura por 5,5 comprimento, posteriormente foram adicionados 5,0 mL de dieta descrita por Shorey e Hale (1965) em cada uma das células. Após o preparo da dieta as bandejas foram acondicionadas em câmara contendo radiação UV para esterilização de possíveis contaminantes por 1 hora. Após a descontaminação da dieta, foi realizada a aplicação das concentrações com o auxílio de uma micropipeta, onde foi aplicado 300 µL da suspensao em cada célula sobre a superfície da dieta. Após a aplicação, a suspensão foi espalhada cuidadosamente realizando agitação nas referidas bandejas, de maneira a garantir cobertura em toda a superfície aplicada. Cada tratamento constituiu de três bandejas, sendo considerada uma bandeja por repetição. Para o tratamento controle, foi aplicada somente água deionizada. Após a completa secagem da calda aplicada sobre a dieta, as lagartas de Helicoverpa armigera, no estádio L1, foram transferidas para as células das bandejas com o auxílio de um pincel macio, como movimentos cuidadosos, de maneira a não causar nenhum tipo de injúria nas mesmas, onde cada célula da bandeja recebeu apenas uma lagarta. Figura 7. Bandeja de 16 células utilizadas para a condução dos bioensaios. Após a instalação do bioensaio, os tratamentos foram submetidos a avaliação de mortalidade no dia 18 de abril de 2017, aos cinco dias após a aplicação das concentrações, após feito isso, os dados foram submetidos a análise de Probit segundo (Haddad 1998), com auxilio do programa SAS 9,0, para a estimativa das concentrações letais CL10, CL15, CL20 e CL25. 22 3.4 Avaliação dos parâmetros biológicos Os parâmetros biológicos, peso de lagartas, período larval (que compreende o período de eclosão das lagartas até a fase de pupa de cada tratamento), peso de pupas e razão sexual, foram avaliados em outro bioensaio, instalado utilizando as concentrações subletais CL10 (5,3 X 105 esporos.mL-1), CL15 (9,7 X 105 esporos.mL- 1), CL20 (1,5 X 106 esporos.mL-1) e CL25 (2,3 X 106 esporos.mL-1), onde essas concentrações e o tratamento controle foram aplicadas no dia 06 de julho de 2017 e mantidos sob as condições de laboratório com temperatura de 25 ±1° C, umidade relativa de 70 ± 5% e a 16 horas de fotofase : 8 horas de escotofase. Para a realização dos bioensaios foi adotado o mesmo procedimento do item 3.3. Para a avaliação do peso de lagartas foram avaliadas quatro bandejas, empregando então o delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos e quatro repetições. Para a avaliação dos demais parâmetros biológicos, foi empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos (T1 = Controle; T2 = CL10; T3 = CL15; T4 = CL20 e T5 = CL25) com seis repetições. Para a realização das avaliações de peso de lagartas de H. armigera, as mesmas foram submetidas a pesagem em balança analítica marca Adventurer Ohaus modelo AR1530, de acordo com seus respectivos tratamentos, na data do dia 18 de julho de 2017, ou seja, 12 dias após a instalação do experimento e posteriormente os dados foram submetidos a análise estatística. As avaliações do peso de pupas, foram realizadas com auxílio de balança analítica, 24 horas após a formação completa das mesmas, nessa mesma data, foram realizadas também a determinação do sexo de cada indivíduo, logo após sua pesagem. Essas avaliações possibilitaram a coleta dos dados para posterior análise estatística do peso de pupas e razão sexual observados em cada tratamento. As avaliações do período larval em cada tratamento foram realizadas contabilizando o período, em dias, que compreenderam entre a eclosão dos ovos e 23 a formação de pupas de cada indíviduo avaliado, onde posteriormente foram submetidos a análise estatística. 3.5 Análise estatísticas Para todas as análises estatísticas dos dados, foi utilizado o software SAS 9,0 para a obtenção das análises de variância e testes de comparação de médias segundo Tukey a 5 % de probabilidade. A determinação de Probit também foi realizada utilizando o mesmo programa. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Estimativa das concentrações subletais Os resultados obtidos com as concentrações subletais do bioinseticida Dipel® aplicado sobre a dieta artificial para as lagartas de primeiro ínstar de H. armígera, onde a mortalidade dos indivíduos foi avaliada aos cinco dias após a aplicação, estão apresentados na Tabela 1. As concentrações letais estimadas, abaixo de 25%, consideradas concentrações subletais, foram: CL10 (5,3 X 105 esporos.mL-1), CL15 (9,7 X 105 esporos.mL-1), CL20 (1,5 X 106 esporos.mL-1) e CL25 (2,3 X 106 esporos.mL-1). Podemos notar que o teste apresentou valores significativos pois o valor de (P = 0,0604) foi superior ao limite de 0,05 que determina a validade da análise com as concentrações empregadas e resultados obtidos. Ainda podemos notar que o coeficiente angular foi de CA = 0,96 e graus de liberdade GL = 7,3927. O coeficiente angular nos permite interpretar a potencia inseticida que o produto comercial Dipel exerceu sobre as lagartas nas condições do bioensaio realizado. 24 Tabela 1. Valores estimados das concentrações sub-letais do Dipel lagartas de primeiro ínstar de Helicoverpa armigera. Concentrações sub-letais (Esporos.mL -1) LC10 LC15 LC20 LC25 (CA ± EP)a χ 2 (GL)c P 5,39 X 105 9,68 X 105 1,54 X 106 2,30 X 106 0,96 ± 0,19 7,3927 (3) 0,0604 (2,91 X 102 - 3,54 X 106)b (1,40 X 103 - 5,28 X 106) (4,85 X 103 - 7,33 X 106) (1,40 X 104 - 9,81 X 106) a Coeficiente angular ± erro padrão b 95% erro padrão c Graus de liberdade 25 Com a posse dos dados após a análise de probit foi possível a construção de um gráfico de dose-resposta que está representado na Figura 8, pode-se observar a probabilidade das mortalidades de acordo com as concentrações de Dipel e os respectivos valores de Probit. Figura 8. Curva de dose-resposta de Helicoverpa armigera a Bacillus thuringiensis (Dipel). 4.2 Efeito subletais das concentrações empregadas n o bioensaio As concentrações testadas afetaram o peso de lagartas (F=77,84; GL=4, 16; P<0,0001), onde, com base no teste de separação de médias, notamos que todos os tratamentos se diferenciaram do tratamento controle e o tratamento CL25 foi o que apresentou maior diferença em comparação ao tratamento controle, não atingindo a média de peso de 10 gramas contra 222,5 gramas no tratamento controle, evidenciando o efeito dessa concentração subletal. Ainda para esse tratamento, foi possível observar diferença significativa em comparação ao tratamento CL10, porém Log da concentração (esporos/mL) 1e+6 1e+7 1e+8 1e+9 1e+10 P ro ba bi lid ad e 2 5 10 20 30 50 70 80 90 95 98 99 99,8 99,9 99,95 99,99 P ro bi t 4 5 6 7 8 9 26 não foram observadas diferenças entre os tratamentos CL15, CL20 e CL25; e CL10, CL15 e CL20, como podemos observar na Tabela 2 e Figura 9. Figura 9. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre o peso lagartas de primeiro instar de H. armigera. Médias seguidas da mesma letra não se diferenciam pelo teste de Tukey a 5%. Nas avaliações do peso de pupas, podemos observar que as concentrações apresentaram efeitos significativos (F=19,7; GL=4, 16; P<0,0001), onde com base no teste de separação de médias, notamos que apenas o tratamento CL10, não apresentou diferenças significativas em relação ao tratamento controle, porém, os tratamentos CL15, CL20 e CL25 apresentaram diferenças em relação aos tratamentos controle e CL10. Os tratametos CL15, CL20 e CL25 não apresentaram diferenças entre si, porém o menor peso obtido foi observado para CL25 que apresentou valor de 229,42 gramas. A* B BC BC C 27 Figura 10. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre o peso de pupas de H. armigera. Médias seguidas da mesma letra não se diferenciam pelo teste de Tukey a 5%. Para as avaliações do período larval, podemos observar que as concentrações apresentaram efeitos significativos (F=97,58; GL=4, 16; P<0,0001), com destaque para o tratamento CL25 que apresentou valor médio de 33,6 dias contra um valor médio de 22,8 dias no tratamento controle. Os tratamentos CL15 e CL20 não apresentaram diferenças significativas entre si, onde os valores médios em dias obtidos foram 32,4 e 32,2 respectivamente, como podemos observar na Tabela 2 e Figura 11. A* A B B B 28 Figura 11. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre a duração do período larval de H. armigera. Médias seguidas da mesma letra não se diferenciam pelo teste de Tukey a 5%. D* C B B A 29 A razão sexual não foi afetada pelos tratamentos (F=1,56; GL=4, 16; P>0,05), conforme Tabela 2 e Figura 12. Figura 12. Efeito subletal do bioinseticida Dipel sobre a razão sexual de H. armigera. Médias seguidas da mesma letra não se diferenciam pelo teste de Tukey a 5%. A* A A A A 29 Tabela 2. Parâmetros biológicos de lagartas de primeiro instar de Helicoverpa armigera submetidas a concentrações subletais do bioinseticida Dipel. Características Controle CL10 CL15 CL20 CL25 Peso lagartas (mg) 222,5 ± 15,66 a1 54,6 ± 10,08 b 26,6 ± 10,16 bc 35,9 ± 3,84 bc 9,7 ± 4,42 c Peso pupas (mg) 367,2 ± 8,63 a 318,3 ± 8,24 a 258,3 ± 16,43 b 238,6 ± 17,83 b 229,42 ± 12,05 b Período larval (dias) 22,8 ± 0,10 d 27,1 ± 0,19 c 32,4 ± 0,41 b 32,2 ± 0,64 b 36,3 ± 0,88 a Razão sexual 0,45 ± 0,08 a 0,37 ± 0,05 a 0,59 ± 0,06 a 0,39 ± 0,07 a 0,42 ± 0,09 a 1Médias ± erro padrão seguidas de mesma letra na linha não diferem pelo teste de Tukey (P > 0,05). 30 De acordo com a hipótese de que concentrações subletais de um bioinseticida a base de B. thuringiensis poderia causar interferências negativas no desenvolvimento biológico de H. armigera, foi instalado o presente trabalho fornecendo as concentrações subletais em dieta artificial onde foram aplicadas as concentrações correspondentes as concentrações letais CL10, CL15, CL20 e CL25, do bioinseticida Dipel®. Baseado nos resultados obtidos, três parâmetros avaliados apresentaram resultados significativos com relação a interferência dos tratamentos contendo as concentrações subletais, sendo eles, peso de lagartas, peso de pupas e período larval. Segundo Sedaratian et al. (2012), considerar a mortalidade como único parâmetro para mensurar o efeito de um bioinseticida pode subestimar os efeitos reais observados no inseto alvo, pois é evidente que o efeito subletal, afeta o desenvolvimento biológico do inseto e esse efeito precisa ser levado em consideração. O mesmo autor observou consequências severas no desenvolvimento biológico de H. armigera, após o fornecimento de concentrações subletais de B. thuringiensis, em lagartas neonatas, onde a exposição a essas concentrações prolongou significativamente o período larval. Alem disso, sugeriu que, embora especulativo, estes relatatos de atraso no desenvolvimento larval após intoxicação Bt, podem refletir em alterações fisiológicas resultantes de complexas interações entre toxinas Btk e o epitélio intestinal. Retnakaran et al. (1983) descreveu que a morte dos enterócitos pela ação de toxinas Cry ativa mecanismos de cicatrização do intestino médio, que podem ser regulados por proteínas, e estas são capazes de controlar o desenvolvimento larval. Além disso, a redução da capacidade de utilizar alimentos digeridos, devido aos níveis de alteração das proteases, também podem interferir no desenvolvimento larval de H. armigera após exposição a Bt, portanto esse efeito foi proposto para a explicação do prolongamento do período larval (MARTINEZ-RAMIREZ et al., 1999; GUJAR et al., 2001). Sendo assim, larvas expostas precocemente em seu desenvolvimento pode ter um período de crescimento mais longo para compensar os custos associados com a recuperação da exposição subletal, tais como aumento 31 na atividade de alimentação, que podem contribuir para a reversao da resistência dos indivíduos (SEDARATIAN et al., 2012). O prolongamento do período larval pode causar consequencias biológicas em campo, incluindo a o aumento da probabilidade de predação ou parasitismo (WESELOH, 1984). Além do mais, o prolongamento do período larval pode reduzir a sobrevivencia e fecundidade por forçar as lagartas a completarem seu desenvolvimento em folhagens mais envelhecidas, portanto não contendo a qualidade dos nutrientes necessárias para um desenvolvimento normal (ERB et al. 2001). Os resultados do presente do estudo corroboram com os resultados que foram obtidos em publicações com a mesma espécie, realizados por Salama et al. (1981) e Zhang et al. (2000). Outras espécies de Lepidoptera, tais como C. includens, Spodoptera exigua (Hübner) e L. dispar, também apresentaram atrasos no desenvolvimento larval (NYOUKU et al. 1996; STAPEL et al. 1998; GILES et al. 2000; ERB et al. 2001). Eizaguirre et al. (2005), também obtveram resultados semelhantes, onde o atraso no período larval foi observado ao avaliarem o efeito subletal em condições de laboratório, de B. thuringiensis sobre o desenvolvimento larval de Sesamia nonagrioides (Lefèvbre) (Lepidoptera: Noctuidae). No presente estudo observa-se uma diminuição significativa do peso de pupas de H. armigera, expostas as concentrações subletais. Tais resultados também foram encontrados em muitos estudos envolvendo espécies de insetos pragas, provando o efeito adverso do Dipel no peso de pupas (ALFORD; HOLMES, 1986; VAN FRANKENHUYZEN; NYSTROM, 1987; PEDERSEN et al., 1997; ERB et al., 2001). Resultados publicados por Khalique e Ahmed (2002) e Aly et al. (2011), relataram a diminuição do peso de pupas de H. armigera e Sesamia cretica (Lerderer, 1857), respectivamente, após a exposição ao Dipel. Polanczyk e Alves (2005), descreveram os efeitos subletais de Bt em lagartas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Os autores constataram efeitos negativos, no peso de lagartas e pupas fêmeas, além disso as interferências negativas foram observadas ao longo de todo o ciclo de vida da espécie estudada, afetando a capacidade de oviposição e fecundidade dos ovos. 32 Mascarenhas e Luttrell (1997), observaram redução no peso de lagartas de H. zea alimentadas com algodão Bt, o qual expressa a endotoxina Cry1A, em comparação aos insetos alimentados com uma cultivar convencional de algodão. Pedersen et al. (1997) e Moreau e Bauce (2003) verificaram que doses subletais de Bt afetaram o desenvolvimento de Choristoneura fumiferana (Clemens, 1865) (Lepidoptera: Tortricidae), reduzindo o peso das pupas. Efeitos subletais de Bt causando a redução do peso de lagartas e pupas de H. zea, também foram relatados por Santos Júnior et al. (2009). Sedaratian et al. (2012), reportou o efeito subletal de do bioinseticida Bt Biolep® WP no comprimento de lagartas, pré-pupa e pupas em H. armigera. Apesar de ser comprovado o efeito subletal em espécies de pragas de importância agrícola, é importante ressaltar que doses recomendadas para o controle de tais espécies precisam ser respeitadas e que o emprego da técnicas de aplicação adequadas devem garantir o contato do produto com o alvo que se deseja controlar. Este aspecto é fundamental para o sistema de manejo integrado de pragas, e o efeito subletal deve ser considerado secundário, tanto para as estratégias de manejo de resistência de insetos quanto para estratégias de controle. Porem o efeito subletal pode ocorrer afetando populacões de H. armigera em campo e o aumento no período larval pode expor a praga a outros agentes de controle (parasitoides e predadores), visto que as lagartas que sofrem o efeito subletal apresentam uma menor mobilidade, ficando desprotegidas do ataque desses agentes de controle. Para um melhor entendimento dos efeitos subletais em populações de campo são necessarios estudos sobre o custo adaptativo de H. armigera, pois o conhecimento desses efeitos subletais podem auxiliar no emprego de táticas de manejo de resistência. Outro fator importante é um melhor conhecimento desses efeitos subletais utilizando plantas contendo tecnologias Bt. Estudos demográficos de populações são requeridos como uma medida desejável para avaliar a toxicidade total causada pelo efeito subletal nessas populações. A toxicidade total causada pelo efeito subletal poderá ser de extrema importância, causando impacto na população total da praga em uma determinada região, portanto esse entendimento pode ser util e capaz de suportar 33 recomendações de manejo em sistemas de intensa suscessão de culturas, capazes de hospedar a mesma população da praga na região, fato que pode acarretar na manutenção de altos níveis populacionais. 5. CONCLUSÕES O bioinseticida Dipel apresentou efeito subletal em Helicoverpa armigera, afetando o periodo larval e peso de lagartas e pupas. 6. REFERÊNCIAS ABOUSSAID, H.; EL-AOUAME, L.; EL-MESSOUSSI, S.; OUFDOU, K. Biological Activity of Bacillus thuringiensis (Berliner) strains on larvae and adults of Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera:Tephritidae). Journal of Environmental Protection , Irvine, v. 1, p. 337-345, 2010. Disponível em: DOI:10.4236/jep.2010.14040. ABOUSSAID, H.; VIDAL-QUIST, J.C.; OUFDOU, K.; EL MESSOUSSI, S.; CASTAÑERA, P.; GONZÁLEZ-CABRERA, J. 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