RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 26/02/2020 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Carmélia Isabel Vitorino Lobo Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro Araraquara 2018 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Carmélia Isabel Vitorino Lobo Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara para obtenção do título de Mestre em Reabilitação Oral, na Área de Prótese Orientadora: Marlise Inêz Klein Araraquara 2018 Lobo, Carmélia Isabel Vitorino Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro / Carmélia Isabel Vitorino Lobo. – Araraquara: [s.n.], 2018 69 f. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado em Reabilitação Oral) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Marlise Inêz Klein 1. Biofilmes 2. Streptococcus mutans 3. Candida albicans I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ana Cristina Jorge, CRB-8/5036 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Carmélia Isabel Vitorino Lobo Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro Comissão julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Reabilitação Oral Presidente e orientadora: Profa. Dra. Marlise Inêz Klein 2ª Examinadora: Profa. Dra. Josimeri Hebling Costa 3ª Examinadora: Profa. Dra. Cristiane Duque Araraquara, 26 de Fevereiro de 2018 DADOS CURRICULARES Carmélia Isabel Vitorino Lobo NASCIMENTO: 25 de fevereiro de 1989 – Cidade de Maputo – Maputo FILIAÇÃO: Josethe Maria Amado Vitorino e Augusto Francisco Lobo 2006/2010 – Licenciatura em Medicina Dentária pelo Instituto Superior de Ciências e Tecnologia de Moçambique – Moçambique 2011/2014 - Atuação como Médica Dentista no Hospital Rural de Angoche; Responsável de Saúde Oral e Escolar do Distrito de Angoche – Ministério da Saúde de Moçambique; 2014/2016 – Atuação como Médica Dentista no Hospital Central de Nampula - Ministério da Saúde de Moçambique (atualmente com licença para a realização do mestrado). Especial para ti querida avó Francisca (Chica), pelo carinho, amor, orações que sempre fizeste por mim e por teres me dado a última benção antes da tua partida (o céu ganhou mais uma estrela); a avó Isabel (minha Belinha) pelo amor infinito, sei que do céu me guia e protege; ao avô Luíz pelo exemplo de homem íntegro, pelas conversas e histórias partilhadas (sei que Deus te levou para seres seu melhor e fiel amigo); avô Albano pelo amor e educação; aos meus pais Josethe e Augusto pelo amor, puxões de orelhas e por apoiarem as minhas decisões e estarem sempre do meu lado; à minha irmã Erica pela amizade e por ter se tornado essa menina mulher forte. Obrigada por acreditarem ‘comigo’ Com vocês do meu lado, tudo posso Amo vocês AGRADECIMENTOS A Deus que está sempre comigo e nunca me falta; Aos meus pais Josethe Maria Amado Vitorino e Augusto Francisco Lobo por me terem concebido, garantido a minha educação, por darem sempre o seu melhor; Aos meus avós Francisca Elvira de Sousa Pinto, Isabel Maria Amado Vitorino, Luíz de Gonzaga Lobo e Albano João Vitorino pelo amor, carinho, mimos e cuidados; A minha irmã Erica Célcia Jessen muito paciente; À minha orientadora Marlise Inêz Klein por me aceitar como sua orientada, pela paciência e profissionalismo ao mesmo tempo e pela amizade. Sinto-me honrada por fazer parte do ‘team Marlise’ e sou muito grata por tudo que fez e faz por mim. O meu carinho e admiração. A professora Ana Cláudia Pavarina, pela carta de aceite; As professoras Janaína Habib Jorge e Josimeri Hebling Costa, por terem participado da minha banca de qualificação; As professoras Cristiane Duque e Josimeri Hebling Costa, por terem gentilmente aceito fazer parte da minha banca de defesa; Ao Hospital Central de Nampula, Direção Provincial de Nampula e Ministério da Saúde de Moçambique por permitirem que eu continuasse com os estudos; Ao Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese da Faculdade de Odontologia de Araraquara; Ao Laboratório de Microbiologia Aplicada do Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese da Faculdade de Odontologia de Araraquara pela disponibilidade de utilização do espaço e equipamentos; Ao Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese da Faculdade de Odontologia do Campus de Araraquara pela disponibilidade de utilização do espaço e equipamentos; Ao Laboratório de Microscopia de Fluorescência Confocal da Faculdade de Odontologia de Araraquara pela disponibilidade de utilização do Microscópio de Fluorescência Confocal. A todos os professores; técnicos e funcionários da Faculdade de Odontologia de Araraquara (em especial aos do Programa de Reabilitação Oral); Ao José Alexandre Garcia, Tarcísio Rodrigues da Silva, Cristiano Lamounier e Renan César Palomino pelas orientações antes e após a minha chegada ao Brasil; Ao ‘team Marlise’ pelo companheirismo em especial ao Guilherme Roncari Rocha e ao Elkin Jahir Florez Salamanca pelo treinamento, amizade e paciência; A Luana Sales pela colaboração e parceria; A Paula Aboud Barbugli pela colaboração; As minhas queridas alunas de iniciação científica Chiara Mikaella Somogyi Christiano (Bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico PIBIC/CNPq) e Talita Baptista Rinaldi (Bolsista da Fundação de Amparo à Pesquisa FAPESP 2016/108338); A Maria Inês Carlos pelo carinho e amizade; Aos meus queridos amigos gringos pelos momentos partilhados, minha família estrangeira; Aos meus queridos amigos brasileiros, que me receberam e acolheram, estão no meu coração; Ao Lucas Portela Oliveira, meu grande amigo em Araraquara, pelas conversas, risadas, trocas, o meu muito obrigado por tudo. Aos meus familiares e amigos moçambicanos e estrangeiros espalhados pelo mundo pela força. Ao Ministério de Ciência e Tecnologia, Ensino Superior e Técnico Profissional de Moçambique pela concessão e financiamento da Bolsa de mestrado. Lobo CIV. Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro [Dissertação de Mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. RESUMO O objetivo foi avaliar quais são os mecanismos de Streptococcus mutans e de Candida albicans que contribuem para aumentar a patogenicidade do biofilme misto. Biofilmes mistos e simples das cepas S. mutans UA159 (Sm) e C. albicans SC5314 (Ca) foram formados sobre discos de hidroxiapatita com película salivar, na presença de sacarose. O pH do meio de cultura foi aferido em diversas fases de desenvolvimento do biofilme. Após 43h de crescimento, foram realizadas análises bioquímicas (peso seco, proteinas, composição da matriz extracelular) e de população microbiana. A estrutura dos biofilmes foi avaliada por microscopia confocal em 19 e 43h. A expressão de genes de vias metabólicas de ambas espécies foi verificada em 28h. Os dados foram avaliados por métodos estatísticos considerando α=0,05. Verificou-se diferença do pH do meio para os três biofilmes nos tempos 19, 27 e 43h (p<0,001; ANOVA dois critérios, Tukey). Biofilmes de Sm e misto foram mais ácidos em 19 e 43h, enquanto biofilmes de Ca mantiveram o pH neutro (p>0,05). As quantidades do peso seco e de proteínas de biofilme misto foram maiores comparadas aos biofilmes simples, e menores para Ca (p=0,001; ANOVA um critério). Não houve diferença na quantidade de exopolissacarídeos solúveis entre biofilmes Sm e misto, porém o biofilme Ca apresentou menor quantidade (p<0,001; Kruskal-Wallis, Dunn). Houve maior quantidade de exopolissacarídeos insolúveis em biofilme misto (p=0,002). Verificou- se mesmo comportamento populacional para Sm em biofilmes mistos e simples (p=0,404; Mann Whitney); porém, para Ca o biofilme misto apresentou maior população versus o simples (p<0,001; Teste t). Em 43h, a estrutura tridimensional demonstrou microcolônias maiores em biofilmes mistos comparado à Sm, e ausência dessas estruturas em biofilme simples de Ca. Em biofilmes mistos, as células de Ca estavam localizadas ao redor de conjuntos de células de Sm. Ainda, a distribuição de exopolissacarídeos insolúveis derivados de exoenzimas de Sm foi diferente em biofilmes mistos e simples de Sm. Em 19h, a presença de polissacarídeos derivados de Ca foi melhor observado em biofilme simples de Ca comparada ao biofilme misto. Em 28h, a expressão dos genes de Sm gtfB (síntese de exopolissacarídeos insolúveis) e nox1 (estresse oxidativo) foi maior em biofilme simples de Sm (p≤0,021); não houve diferença para a expressão de atpD (estresse ácido). Para Ca, o nível de expressão dos genes de BGL2 e PHR1 (síntese de polissacarídeos), SOD1 (estresse oxidativo) também foi maior em biofilme simples (p≤0,043); e não houve diferença para PHR2 (estresse ácido). Assim, a fase em que a expressão gênica foi avaliada demostrou que biofilmes simples de ambas espécies apresentaram maior atividade metabólica em relação ao biofilme misto. Portanto, a associação de Sm e Ca resulta em maior complexidade funcional e organização tridimensional de biofilmes mistos (comparados à simples) via produção de exopolissacarídeos pelas duas espécies, mas principalmente por Sm. Palavras – chave: Biofilmes. Streptococcus mutans. Candida albicans. Lobo CIV. Interaction of Streptococcus mutans and Candida albicans in in vitro biofilms [Masters Dissertation]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. ABSTRACT The objective was to evaluate the mechanisms of Streptococcus mutans and Candida albicans that contribute to increasing the pathogenicity of the mixed-species biofilm. Mixed and single-species biofilms of the strains S. mutans UA159 (Sm) and C. albicans SC5314 (Ca) were formed on saliva-coated hydroxyapatite discs in the presence of sucrose. The pH values of the culture media were verified at distinct developmental phases of biofilms. After 43h of growth, the biofilms were subjected to distinct assays biochemical (dry weight, proteins, the composition of extracellular matrix) and microbiological (colony forming units), analyzes. The biofilm´s structure was verified via confocal microscopy at 19 and 43h. Gene expression of metabolic ways from both species was evaluated at 28h. The data were assessed by statistical methods (α=0,05). There was a difference in the media pH for the three biofilms at times 19, 27 and 43h (p<0,001; two-way ANOVA, Tukey). Sm and mixed-species biofilms were acidic at 19 and 43h, while Ca biofilms maintained a neutral pH (p>0,05). The amounts of dry weight and proteins were higher for mixed-species biofilm compared to single- species biofilms, being lower for Ca (p=0,001; one-way ANOVA). The quantity of soluble exopolysaccharides was similar for Sm and mixed-species biofilms but Ca presented a lower amount than those biofilms (p<0,001; Kruskal-Wallis, Dunn). There was a higher amount of insoluble exopolysaccharides in mixed-species biofilm (p=0,002). There was no difference in Sm population in single- and mixed-species biofilms (p=0,404; Mann Whitney); however, the mixed-species biofilm presents a higher population of Ca versus the single-species biofilm (p<0,001; t-Test). The three- dimensional structure analysis showed larger microcolonies in mixed-species biofilms versus Sm biofilm, and absence of these structures in Ca biofilm. In mixed-species biofilms, Ca cells were located around clusters of Sm cells. Also, distribution of exopolysaccharides was different in mixed-species and Sm biofilms, but this component was not present in Ca biofilms. The presence of Ca-derived polysaccharides was better observed in single-species biofilms (versus mixed-species biofilms). In 28h gene expression levels of Sm, gtfB (insoluble exopolysaccharides) and nox1 (tolerance to oxidative stress) were higher for Sm single-species biofilm (p=0,021; p<0,001); while there was no difference for atpD (tolerance to acid stress). The expression level of Ca genes BGL2 and PHR1(polysaccharides), and SOD1 (tolerance to oxidative stress) were also higher for Ca single-species biofilm (p=0,043; p=0,005; p<0,005); while PHR2 (tolerance to acid stress) was similar for both biofilms. Thus, the gene expression phase evaluated indicates lower metabolic activity in both single-species biofilms in comparison with the mixed-species biofilm, which presents higher amounts of metabolic products (e.g., insoluble exopolysaccharides). Therefore, the association of Sm and Ca results in greater functional complexity and three- dimensional organization of mixed-species biofilms (versus single-species biofilms) via production of exopolysaccharides by both species, primarily by Sm. Keywords: Biofilms. Streptococcus mutans. Candida albicans. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................12 2 PROPOSIÇÃO ..................................................................................14 2.1 Objetivos Específicos...................................................................14 3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................15 3.1 Cárie Dentária ...............................................................................15 3.2 Epidemiologia da Cárie Dentária ................................................15 3.3 Interação entre S. mutans e C. albicans para a formação de biofilme ..........................................................................................16 3.4 Outros Fatores de Virulência ......................................................25 4 MATERIAL E MÉTODO ...................................................................29 4.1 Formação de Biofilmes in vitro ...................................................29 4.2 Análises dos Biofilmes ...............................................................32 4.2.1 Análises bioquímicas (colorimétricas) e método microbiológico ...........................................................................32 4.2.2 Organização estrutural tridimensional do biofilme via microscopia confocal de varredura a laser .............................34 4.2.3 Expressão gênica de S. mutans e de C. albicans ...................36 4.2.3.1 Isolamento de RNA .................................................................38 4.2.3.2 Síntese de cDNA .....................................................................39 4.2.3.3 Quantificação da expressão gênica utilizando RT-qPCR ...39 4.3 Análise Estatística ........................................................................41 5 RESULTADOS .................................................................................42 5.1 pH do Meio de Cultura .................................................................42 5.2 População Microbiana .................................................................43 5.3 Peso Seco (Biomassa ou peso seco insolúvel) ........................43 5.4 Proteínas no Biofilme ...................................................................44 5.5 Exopolissacarídeos na Matriz Extracelular ................................45 5.6 Estrutura Tridimensional dos Biofilmes .....................................46 5.7 Expressão Gênica de S. mutans e de C. albicans em Biofilmes .......................................................................................51 6 DISCUSSÃO ....................................................................................53 7 CONCLUSÃO ..................................................................................56 REFERÊNCIAS ................................................................................57 ANEXO ...................................................................................................... 64 12 1 INTRODUÇÃO A cárie dentária é uma doença infecciosa e de natureza biofilme-dieta- dependente, caracterizada pela desmineralização dos dentes por ação de ácidos produzidos por microrganismos via metabolização de carboidratos da dieta e associada à higiene deficiente1. Os biofilmes são comunidades de células microbianas altamente dinâmicas, estruturadas e organizadas; as células estão cobertas e imersas em uma matriz extracelular (MEC) tridimensional (3D) de substâncias poliméricas tais como exopolissacarídeos (EPS), proteínas e ácidos nucléicos2. EPS são os principais componentes da matriz de biofilmes cariogênicos, sendo reconhecidos como fatores de virulência essenciais para o desenvolvimento da cárie3-5. Porém, outros constituintes como DNA extracelular (eDNA) e ácidos lipoteicóicos (ALT) extracelulares são detectados em quantidades elevadas em biofilmes cariogênicos6,7. A bactéria Streptococcus mutans é o principal microrganismo associado a presença de cárie, pois coordena a construção do biofilme cariogênico controlando a formação da MEC rica em EPS insolúveis8, além de ser acidogênico (produtor de ácido) e acidúrico (sobrevive me ambiente ácido)9,10. EPS insolúveis dificultam a neutralização pela saliva dos ácidos produzidos pelos microrganismos, levando a desmineralização do esmalte e da dentina11. Ainda, o fungo Candida albicans também tem sido encontrado frequentemente em números elevados de unidades formadoras de colônia (UFC / mL) em biofilmes cariogênicos (por exemplo em biofilmes de cárie precoce da infância)12-15. Esta espécie de fungo também é acidogênica (produz ácido pirúvico, ácido acético, ácido málico) e acidúrica, o que pode contribuir para a cariogenicidade do biofilme16. Uma associação bactéria-fungo pode ser de comensalismo cooperativa ou antagonista. É cooperativa quando os microrganismos fornecem substratos e/ou metabólitos ou estimulam o crescimento um do outro. Por exemplo, C. albicans não metaboliza a sacarose com eficiência, sendo beneficiada por produtos degradados da sacarose por S. mutans (glicose e frutose); por outro lado, a presença de C. albicans no biofilme, altera o ambiente físico do mesmo, propiciando o aumento de EPS e consequentemente, o acúmulo e formação de microcolônias por S. mutans17. S. mutans produz exoenzimas glicosiltransferases (Gtfs) que são responsáveis por produzir EPS. Na presença de sacarose, existe aumento de EPS produzido por Gtfs sobre as superfícies dentárias e microbianas, promovendo ligações fortes com 13 diversos microrganismos garantindo a formação e coesão do biofilme18. Essas ligações entre EPS e S. mutans são mais fortes porque essa espécie possui proteínas responsáveis pela organização estrutural de EPS – as proteínas ligantes de glicano ou glucan binding proteins: GBPs)8. C. albicans e S. mutans tem interação simbiótica mediada pelas exoenzimas Gtfs, principalmente GtfB, além disso, a presença da C. albicans em biofilmes mistos induz a expressão de genes gtfs de S. mutans18,19. Esta interação única aumenta a capacidade de ambos os organismos colonizarem os dentes, aumentando drasticamente a quantidade de EPS na matriz do biofilme, e sinergisticamente potencializando a virulência e a ocorrência de lesões de cárie severa (similares às lesões em cárie precoce da infância) em um modelo animal da doença20. É conhecida a participação de C. albicans na formação e patogenicidade do biofilme, no entanto, existe a necessidade de um entendimento mais avançado da patogênese dessa doença, quando esse fungo está presente, para o desenvolvimento de novas terapias efetivas. Por outro lado, um estudo in vitro sugeriu que C. albicans poderia prevenir a cárie dentária ao aumentar pH do meio (reduzindo a perda de minerais da estrutura dentária). Isso ocorre porque ao metabolizar sacarose, este fungo produz etanol (que não influencia no pH do meio), e em períodos de escassez/hipóxia é forçado a utilizar o ácido lático como fonte de carbono (energia), corroborando com a eliminação de ácidos em biofilmes mistos e consequente redução da desmineralização dentária21. Entretanto, este estudo é o único a propor uma relação antagonista entre S. mutans e C. albicans, e essa discrepância pode ser devida aos modelos in vitro utilizados. Assim, este estudo objetivou investigar os mecanismos pelos quais a matriz EPS e outras vias metabólicas induzidas quando estas duas espécies estão juntas, visando fornecer informações adicionais no processo da doença (i.e., patogenicidade). Este conhecimento é importante para o desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas. 56 7 CONCLUSÃO A associação de S. mutans e C. albicans resulta em maior complexidade funcional e organização 3D de biofilmes mistos via produção de exopolissacarídeos pelas duas espécies, mas principalmente por S. mutans. 57 REFERÊNCIAS 1. Hajishengallis E, Parsaei Y, Klein MI, Koo H. Advances in the microbial etiology and pathogenesis of early childhood caries. Mol Oral Microbiol. 2017; 32 (1): 24-34. 2. Flemming H-C, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 2010; 8 (9): 623- 33. 3. Yamashita Y, Bowen WH, Burne RA, Kuramitsu HK. Role of the Streptococcus mutans gtf genes in caries induction in the specific-pathogen-free rat model. Infect Immun. 1993; 61 (9): 3811-7. 4. Mattos-Graner RO, Smith DJ, King WF, Mayer MP. Water-insoluble glucan synthesis by mutans streptococcal strains correlates with caries incidence in 12- to 30-month- old children. 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Disponível no site da Biblioteca: http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao- atualizado.pdf http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf 58 14. Yang XQ, Zhang Q, Lu LY, Yang R, Liu Y, Zou J. Genotypic distribution of Candida albicans in dental biofilm of Chinese children associated with severe early childhood caries. Arch Oral Biol. 2012; 57 (8): 1048-53. 15. Xiao J, Moon Y, Li L, Rustchenko E, Wakabayashi H, Zhao X, et al. Candida albicans carriage in children with severe childhood caries (S-ECC) and maternal relatedness. PLoS One. 2016; 11 (10): 1-16. 16. Klinke T, Kneist S, de Soet JJ, Kuhlisch E, Mauersberger S, Forster A, Klimm W. Acid production by oral strains of Candida albicans and lactobacilli. Caries Res. 2009; 43 (2): 83-91. 17. Kim D, Sengupta A, Niepa THR, Lee B-H, Weljie A, Freitas-Blanco VS, et al. 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