UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DETECÇÃO DE BRUCELLA SPP. PELA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE EM QUEIJOS MINAS FRESCAL PRODUZIDOS ARTESANALMENTE NA REGIÃO CENTRO OESTE DO ESTADO DE SÃO PAULO VANESSA CRISTINA ALCOLÉA Botucatu - SP 2011 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DETECÇÃO DE BRUCELLA SPP. PELA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE EM QUEIJOS MINAS FRESCAL PRODUZIDOS ARTESANALMENTE NA REGIÃO CENTRO OESTE DO ESTADO DE SÃO PAULO VANESSA CRISTINA ALCOLÉA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária para a obtenção do titulo de Mestre. Orientador: Prof. Ass. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto iii Nome do autor: Vanessa Cristina Alcoléa Título: DETECÇÃO DE BRUCELLA SPP. PELA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE EM QUEIJOS MINAS FRESCAL PRODUZIDOS ARTESANALMENTE NA REGIÃO CENTRO OESTE DO ESTADO DE SÃO PAULO COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Ass. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto Diretor e Orientador Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ – UNESP – Botucatu Profa. Dra. Jane Megid Membro Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP – Botucatu Prof. Luiz Carlos Giarola Membro Departamento de Saúde Pública FM – UNESP – Botucatu Data da defesa: 29 de Abril de 2011. iv Aos meus pais, Paulo e Selma, pelo amor, apoio e estímulo dedico.... v AGRADECIMENTOS A DEUS, sempre presente na minha vida, por me iluminar e mostrar o caminho certo a seguir; Ao meu orientador Prof. José Paes, pela confiança, ensinamentos constantes e amizade; À Profa Jane Megid, pela amizade e orientação e compreensão; Ao Clovis Fonseca, técnico do Laboratório de Biologia Molecular da UNESP – Botucatu pela colaboração e paciência; Ao Prof. Andrey P. Lage e às meninas da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG pela colaboração neste trabalho e ensinamentos; Às amigas Susan Allendorff e Luciana Costa pelas boas horas de convívio, amizade e descontração; À todos os pós graduandos do Laboratório de Biologia Molecular da UNESP – Botucatu pela colaboração; Aos meus pais, pelo esforço , dedicação e apoio; Às minhas amigas, irmãs de coração, Cristina Amorim e Tatiana Reimberg, pela compreensão, pelo ombro amigo e sempre presente; À todos acreditaram neste dia, pela colaboração imprescindível para a conclusão deste trabalho... vi “O importante é sacrificar aquilo que somos para ser aquilo que podemos vir a ser.” (Charles Dubois) vii LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Identificação das amostras coletadas divididas por cidade e data de coleta............................................................................ 18 Tabela 2 - Resultados obtidos através da PCR direta distribuídos de acordo com o local de coleta das amostras............................... 25 Tabela 3 - Prevalência aparente de focos de brucelose bovina no Estado de São Paulo (DIAS et.al. 2004)................................................ 26 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Resultados obtidos através da PCR direta dos queijos Minas Frescal analisados ................................................................... 23 Figura 2 - Mapa da distribuição geográfica de coleta das amostras......... 24 Figura 3 - Mapa do Estado de São Paulo com a divisão em circuitos produtores (DIAS et.al. 2004).................................................... 26 Figura 4 - Mapa 15 – Brucelose Bovina nas propriedades amostradas por Dias et.al. (2004)................................................................. 27 ix LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS μm Micrômetro spp Espécies pH Potencial hidrogeniônico LPS Lipopolissacarídeo CO2 Gás carbônico H2S Gás sulfídrico Ig Imunoglobulina OIE Organização Mundial de Saúde Animal OMS Organização Mundial da Saúde % Porcento MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento PNCEBT Plano Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose PAHO Organização Pan Americana de Saúde WHO Organização Mundial da Saúde ºC Graus Celsius PCR Reação em cadeia pela Polimerase DNA Acido desoxirribonucleico PBS Tampão fosfato salino mL Mililitros TE Tampão Tris EDTA Tris Tris (hidroximetil) amino metano x EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético SDS Sulfato dodecil de sódio TNE Solução Tris NaCl EDTA x Vezes Taq Thermus aquaticus dnTp Desoxirribonucleotídeos mg Miligramas cm Centímetros V Volts bp Base pair et.al. e colaboradores xi SUMÁRIO RESUMO..................................................................................................... 1 ABSTRACT.................................................................................................. 2 1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................... 3 1.1 Etiologia.............................................................................................. 3 1.2 Transmissão e patogenia.................................................................... 4 1.3 Diagnóstico......................................................................................... 6 1.4 Situação Brasileira.............................................................................. 8 1.5 Plano Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose........................................................................................ . 8 1.6 Importância em Saúde Pública........................................................... 9 1.7 Sobrevivência em leite e derivados.................................................... 11 1.8 Pesquisa de Brucella em alimentos.................................................... 12 2 OBJETIVOS............................................................................................. 16 3 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................ 17 3.1. Coleta de amostras............................................................................ 17 3.2 Cultivo Microbológico.......................................................................... 19 3.2.1 Cultivo Microbiológico direto......................................................... 19 3.2.2. Cultivo Microbiológico a partir do enriquecimento em caldo suplementado.............................................................................................. 20 3.3 PCR direto através do protocolo de extração pela Proteinase K....... 20 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 23 5 CONCLUSÕES......................................................................................... 34 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 35 ALCOLÉA, V.C. Detecção de Brucella spp pela Reação em Cadeia pela Polimerase em queijos Minas Frescal produzidos artesanalmente na região Centro Oeste do Estado de São Paulo. Botucatu, 2011. 41p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO O consumo de queijos produzidos artesanalmente, especialmente de queijos frescos, é muito comum no Brasil, principalmente em cidades do interior. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a presença de Brucella spp. em queijos produzidos artesanalmente na região centro oeste do Estado de São Paulo. Um total de 52 amostras foi adquirido de produtores rurais, feiras livres, padarias e outros estabelecimentos comerciais. As amostras foram analisadas por isolamento microbiológico direto, isolamento microbiológico após enriquecimento em caldo suplementado com confirmação das colônias suspeitas pela PCR e também por PCR direta. Brucella spp. não foi detectada no isolamento direto. Porém, 9,61% das amostras foram positivas no isolamento com enriquecimento em caldo suplementado. Já a PCR direta detectou 12 amostras positivas para o agente. A porcentagem significativa de amostras positivas nos queijos avaliados revela um risco para os consumidores e serve de alerta para os serviços públicos responsáveis pela sanidade animal e inspeção de produtos de origem animal. Palavras-chave: Brucella; PCR; Queijo Minas Frescal 2 ALCOLÉA, V.C. Detection of Brucella spp. by Polimerase Chain Reaction in homemade fresh cheeses in the central west of São Paulo State. Botucatu, 2011. 41p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootenia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT The consumption of homemade cheeses, especially fresh cheese, is very common in Brazil, mainly in the small cities. The aim of this study was to evaluate the presence of Brucella spp. in homemade cheeses in the central west of São Paulo State. A total of 52 samples was acquired from farmers, street fairs, bakeries and other shops. Samples were analyzed by direct microbiological isolation, microbiological isolation after enrichment in broth supplemented allowed by PCR for conferenction and direct PCR. Brucella spp. was not detected in the direct isolation. However, 9.61% of samples were positive by isolation with enrichment broth supplemented. The direct PCR detected 12 positive samples to the agent. A significant percentage of positive samples evaluated in the cheeses reveals a risk to consumers and serves to warn the public services responsible for the inspection of animal and animal products. Key-words: Brucella, PCR, Fresh Cheese 3 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA São muitas as patologias passíveis de causarem perdas expressivas na pecuária. Dentre elas, destaca-se a Brucelose, por sua persistência nos rebanhos brasileiros e extrema facilidade de disseminação entre os animais. Outro fato de grande relevância é a frequência de casos de brucelose humana relacionados não somente ao contato com animais, mas também ligados ao consumo de produtos de origem animal sem tratamento industrial, muito comuns no país. De acordo com a FAO (Food and Agriculture Organization), WHO (World Health Organization) e OIE (Organização Mundial de Saúde Animal), a brucelose ainda é a zoonose mais importante no mundo (POESTER, 2002). Desta forma torna-se necessário estudar a presença deste agente em alimentos, de forma a garantir sua qualidade e sanidade. 1.1 Etiologia As bactérias que compõem o gênero Brucella spp. são coco-bacilos Gram-negativos, intracelulares facultativos, com capacidade de se multiplicarem dentro de macrófagos, variando entre 0,4 e 3,0 μm de comprimento e 0,4 a 0,8 μm de largura (HENDERSON, 1971). Podem aparecer em formas isoladas, aos pares ou em pequenas cadeias; não formam esporos nem cápsulas verdadeiras e são invariavelmente imóveis e aflageladas (CORBEL, BRINLEY-MORGAN,1984). São aeróbicas estritas, catalase positivas, quimiorganotróficas, de alta resistência vital e com características diferentes, conforme a espécie a que pertencem (EVANGELISTA, 2001). Brucella spp. tem grande capacidade de sobrevivência se comparada com outras bactérias patogênicas não esporuladas, principalmente em ambiente úmido, contendo matéria orgânica, ao abrigo da luz solar direta e pH neutro. No solo, com luz solar direta, o tempo de sobrevivência desta bactéria é de cerca de quatro horas, porém à sombra, este tempo pode ser dilatado para 4 7 meses. Nos exudatos uterinos pode sobreviver até 200 dias ou mais e no feto abortado até oito meses, dependendo das condições ambientais. Na urina de bovinos sobrevive por até quatro dias (PAULIN, 2006). Anteriormente considerava-se que o gênero era composto por seis espécies: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis e B. neotomae (roedores) (IDF, 1994), sendo a primeira o agente etiológico da Febre Ondulante Bovina, Brucelose Bangiana ou Enfermidade de Bang (EVANGELISTA, 2001). Atualmente, de acordo com o Center of Food Security & Public Health (2007) novas espécies foram descobertas: B. pinnipediae (leões marinhos e morsas) e a B.cetaceae (golfinhos e botos). A doença causada por estas bactérias é caracterizada como uma zoonose crônica disseminada em todo o mundo (POESTER et.al., 2002) e em bovinos é quase sempre causada por B. abortus (JONES; HUNT; KING, 2000). As cepas de Brucella podem ser classificadas morfologicamente em lisas ou clássicas (B. abortus, B. melitensis e B. suis) e as rugosas ou não clássicas (B. ovis, B. canis) em função da presença ou ausência da cadeia O do polissacarídeo (CORBEL, 1997). Nas amostras lisas, a cadeia O esta ligada ao lipopolissacarídeo (LPS) da parede celular, sendo o componente da bactéria que primeiro interage com o sistema imune. Baseado nesta informação, diversos testes sorológicos foram desenvolvidos e a maioria das provas sorológicas de rotina têm por objetivo detectar anticoporpos contra esta cadeia O (DIAZ et al, 1968). No caso da B. abortus, esta pode ser diferenciada das outras espécies por uma combinação de testes como sensibilidade a corantes (fuccina básica e a tionina), requerimento de CO2, produção de H2S e presença de antígenos de superficie (A ou M) (ALTON et al, 1988). 1.2 Transmissão e Patogenia A B. abortus pode se disseminar para animais saudáveis através do contato e ingestão de corrimento uterino, feto abortado ou placenta de animais contaminados (JONES; HUNT; KING, 2000). Neste caso, os animais que frequentam locais onde fêmeas grávidas infectadas pariram, são infectados ao circularem em solo contaminado (transmissão indireta), pois a disseminação da 5 Brucella no solo e nas poeiras é fácil, podendo inclusive, ocorrer contágio por inalação (MEYER; BIBERSTEIN; ZEE, 1990). Após esta ingestão ou contato, o microrganismo chega à corrente circulatória e inicialmente se localiza nos linfonodos regionais. Esta invasão subsequente dos linfáticos e a ocorrência de bacteremia permitem a localização das bactérias em diversos tecidos, tendo particular afinidade por órgãos reprodutores de machos e fêmeas, placenta, feto e glândulas mamárias, fato este que propicia a eliminação da bactéria também pelo leite (JONES; HUNT;KING, 2000). Outro exemplo de transmissão é o caso dos recém nascidos de vacas infectadas que, segundo Martinez (1984), têm uma fraca viabilidade e, apesar de clinicamente se apresentarem sadios, eliminam uma grande quantidade de Brucella durante a primeira semana. Por isso, se forem transportados livremente, sem as condições adequadas podem originar um novo foco de doença e contaminar todo o rebanho. A localização da Brucella spp. no trato reprodutivo de machos e fêmeas tem sido atribuída ao tropismo desta bactéria por tecidos com alta concentração de eritritol. Estudos que comprovam a presença deste açúcar nos tecidos dos órgãos reprodutivos dos ruminantes sugerem ser esta a razão de preferência da bactéria pela colonização destes tecidos. Nos bovídeos destacam-se também produtos de degradação dos hormônios esteróides, as prostaglandinas e o estradiol, além de outras progestinas. Acredita-se que os produtos da degradação destes hormônios sejam utilizados no metabolismo das Brucella, que colonizam e multiplicam-se dentro dos trofoblastos. A replicação intracelular massiva culmina no rompimento do trofoblasto infectado, permitindo que a bactéria acesse diretamente o feto (SMITH, et al., 1962). De acordo com Paulin (2006), esta multiplicação de Brucella abortus no ambiente uterino desencadeia uma reação inflamatória dos placentomas que evolui para necrose e deposição de fibrina entre as vilosidades, podendo causar abortos, aderência e retenção placentária. As lesões também diminuem a circulação materna fetal, comprometendo a respiração e alimentação do produto, levando-o a morte, o que também pode ser causado pelas próprias bactérias, caso estejam em concentração elevada no âmnion. O quadro pode evoluir para metrite ou endometrite crônicas, gerando subfertilidade, infertilidade, ou esterilidade, em geral, apresentando secreção vaginal. Smith (1994) também relata que o abortamento é o principal sintoma clinico da 6 brucelose bovina e comumente ocorre após o quinto mês de gestação, natimortos e nascimento de bezerros fracos. Em torno de duas semanas após o abortamento, como o útero não gravídico não é tão susceptível a B. abortus, outros órgãos em atividade são colonizados, dentre eles a glândula mamaria e linfonodos supramamários, onde permanecerá pelo resto da vida da fêmea, formando granulomas microscópicos no parênquima mamário e sendo excretada constante ou intermitentemente pelo leite durante as lactações (BISHOP; BOSMAN; HERR, 1994; GARCIA-CARRILLO, 1990; OMS, 1986). Frequentemente há retenção placentária e infertilidade temporária ou permanente. Nos rebanhos infectados podem estar presentes a claudicação, mastite ou orquite com consequente infertilidade por diminuição da qualidade espermática (SMITH, 1994). As perdas diretas provocadas pela brucelose para a indústria e pecuária são decorrentes de abortamentos, com queda da produção de carne e leite, aumento do intervalo entre partos (de 11,5 para 20 meses), morte dos bezerros, aumento da taxa de reposição dos animais. Provocam ainda restrições comerciais devido à vulnerabilidade dos produtos a serem comercializados, às barreiras sanitárias, diminuindo a competitividade no comercio exterior (PAULIN, 2006). 1.3 Diagnóstico O diagnostico baseia-se na resposta imune dos bovinos à Brucella abortus que consiste de resposta aguda de IgM e sua duração depende da via de exposição, dose da bactéria e do estado sanitário do animal. Quase que imediatamente após a resposta de IgM se inicia a produção de IgG1 e mais tardiamente, pequenas quantidades de IgG2 e IgA. Devido aos epítopos presentes na camada lipopolissacaridea das Brucella lisas, B. abortus, B. melitensis e B. suis, todos os testes sorológicos utilizam o antígeno da B. abortus recomendado pelo Manual da OIE, enquanto que as espécies rugosas de Brucella são diagnosticadas utilizando antígenos de cada espécie (NIELSEN, 2002). 7 Para o diagnóstico são utilizados métodos indiretos e diretos. Os métodos diagnósticos indiretos são utilizados para o diagnostico massal, pesquisando-se principalmente anticorpos no soro e nos fluidos corpóreos. O teste do Antígeno Acidificado Tamponado é utilizado como prova de triagem, baseado no fato da IgG1 bovina ser menos ativa em pH 7, mudando de comportamento com a acidificação do meio. Neste, a acidificação da suspensão antigênica a um pH de 3,65 +/- 0,05 aumenta o poder de aglutinação da IgG1 além de destruir aglutininas inespecíficas. É um teste qualitativo rápido, prático, de boa sensibilidade, sendo uma das melhores alternativas para o diagnostico massal (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). Entretanto, reações falso negativas podem ocorrer devido a reação cruzada e de anticorpos resultantes da vacinação com B19, sendo necessários outros testes para confirmar os animais reatores como infectados (NIELSEN, 2002). Para isso o teste do 2-mercaptoetanol foi escolhido como teste confirmatório, pois tem sua especificidade aumentada por um processo químico, que consiste no tratamento do soro com o mercaptoetanol. Este degrada a IgM em cinco subunidades monoméricas, por redução das pontes dissulfídicas que estabilizam o polímero. Este procedimento impede a ocorrência da maioria das reações inespecíficas (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). Para confirmação dos resultados duvidosos no 2 – Mercaptoetanol ou no caso de trânsito internacional dos animais, foi preconizada a Reação de Fixação do Complemento. Esta técnica é baseada na habilidade do complexo antígeno-anticorpo em ativar o sistema complemento e com isso detectar precocemente IgG1 no soro em torno do 14º dia, sendo que as provas de aglutinação o fazem ao redor do 30º dia (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). Os métodos diretos são utilizados, na maioria das vezes, nos animais individualizados pelos métodos indiretos e encaminhados para o sacrifício e também nos casos de abortamento, tendo a grande importância na confirmação bacteriológica de foco da doença e a caracterização da estripe circulante (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). Para o monitoramento dos rebanhos leiteiros pode-se utilizar o Teste do Anel do Leite. O teste revela anticorpos da classe IgA , presentes no leite e aderidos às moléculas de gordura pela fração Fc. Quando o anticorpo interage com o antígeno corado (hematoxilina ou tetrazólio), forma-se a malha de 8 aglutinação que flutua junto com a gordura, para a superfície da amostra revelando o anel colorido (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). 1.4 Situação Brasileira No Brasil, de acordo com o último diagnóstico nacional da brucelose bovina que foi realizado em 1975, estimou-se em 4,0% a porcentagem de animais soropositivos na Região Sul, 7,5% na Região Sudeste, 6,8% na Região Centro-Oeste, 2,5% na Região Nordeste e 4,1% na Região Norte. Posteriormente, outros levantamentos sorológicos por amostragem, realizados em alguns estados, revelaram pequenas alterações na prevalência de brucelose: no Rio Grande do Sul a prevalência passou de 2,0%, em 1975, para 0,3% em 1986; em Santa Catarina passou de 0,2%, em 1975, para 0,6% em 1996; no Mato Grosso do Sul a prevalência estimada em 1998 foi de 6,3%, idêntica ao valor encontrado em 1975 para o território Mato-grossense; em Minas Gerais passou de 7,6%, em 1975, para 6,7% em 1980 (BRASIL, 2001). Em um novo levantamento da situação da brucelose em Minas Gerais revelou prevalência próxima a 1% de animais positivos, demonstrando a eficácia de um programa de vacinação bem conduzido. No Paraná, a prevalência estimada em 1975 foi de 9,6%, passando para 4,6% de bovinos positivos em 1989 (BRASIL, 2001). A doença foi relatada em 2005 em um município de Minas Gerais, com prevalência variável entre 0 a 37,5% por Bastianetto et.al. (2005). Kuroda et.al. (2004) isolaram o mesmo microrganismo com prevalência de 3,7% na Serra de Botucatu, São Paulo. 1.5 Plano Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose Com o objetivo de baixar a prevalência e incidência de novos casos de brucelose e tuberculose e criar um número significativo de propriedades certificadas que ofereçam ao consumidor produtos de baixo risco sanitário, foi 9 criado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT). Uma das propostas técnicas do programa é a vacinação de todas as fêmeas das espécies bovina e bubalina, entre três a oito meses de idade com amostras da vacina B 19. Os animais vacinados recebem marcação a ferro quente, contendo a letra V e o ano de vacinação. Em rebanhos certificados, recomenda-se que as bezerras sejam vacinadas com no máximo seis meses de idade, de forma a minimizar a persistência de anticorpos vacinais nos testes de sorodiagnóstico. A vacinação contra brucelose só poderá ser realizada sob responsabilidade de médicos veterinários, que deverão estar cadastrados no Serviço Oficial de Defesa Sanitária Animal de seu estado de atuação. O PNCEBT é complementado pela certificação de propriedades livres de brucelose e tuberculose ou certificação de propriedades monitoradas para brucelose e tuberculose, assim como o controle de transito de reprodutores e e normas sanitárias para a participação em exposições, feiras, leilões e outras aglomerações de animais; o credenciamento e capacitação de médicos veterinários, diagnostico, apoio laboratorial e a educação sanitária (BRASIL, 2001). 1.6 Importância em Saúde Pública Além dos aspectos de saúde animal, dado os prejuízos que causa aos rebanhos e saúde ocupacional, envolvendo trabalhadores pecuários, açougueiros, magarefes e médicos veterinários, que podem adquirir a doença através do contato direto ou indireto com indivíduos e animais contaminados (SOUZA et.al., 1997), a brucelose também é extremamente importante tendo em vista que a maior propagação deste microrganismo ao homem ocorre através do leite ou de seus produtos quando contaminados e sem tratamento térmico adequado (EVANGELISTA, 2001), pois a eliminação do agente pelo leite é intermitente e persiste por meses (ACHA; SZYFRES, 2001). Harrigan (1998) também alerta sobre a grande capacidade do leite cru como veiculo potencial na transmissão da B. abortus. 10 Portanto, ao apresentar-se como doença infecciosa e facilmente transmissível ao homem, de caráter persistente, a brucelose configura-se em um grave problema de saúde pública. Saliente-se que sendo a glândula mamária um local de multiplicação da Brucella, o leite e o queijo tornam-se uma potencial fonte de contaminação que pode ter consequências sérias para a população uma vez que, além do risco de contagio que existe relativamente aos produtores, o patógeno pode também chegar aos consumidores que se encontram longe das explorações (MEYER; BIBERSTEIN; ZEE, 1990). Até o momento foram relacionados à infecção humana as espécies B. melitenisis, B. suis, B. abortus e B. canis, em ordem decrescente de patogenicidade, sendo B. abortus a mais frequente causadora da infecção humana no mundo (ACHA; SZYFRES, 2001). Brucella spp. ingressam no hospedeiro pela mucosas do trato digestivo, genital, respiratório e mucosas conjuntivas ou então por soluções de continuidade da pele, sendo então carreadas até os linfonodos e fagocitadas principalmente por macrófagos, onde permanecem por meses. Através da corrente circulatória chegam aos órgãos de predileção (baço, fígado, linfonodos e reprodutivos), ou seja, naqueles onde há maior disponibilidade de elementos necessários ao seu metabolismo (BISHOP et.al. 1994). Os sinais mais comuns de brucelose em humanos são aqueles observados em casos de infecção generalizada aguda: febre contínua e intermitente, respiração acelerada, calafrios e sudorese noturna profusa de odor característico, fadiga, insônia, cefaléia, artralgia entre outros. O curso tende a cronicidade e são frequentes as recidivas de intensidade variada. Na maioria dos casos a recuperação ocorre em um a dois anos, com ou sem tratamento (PAULIN, 2006). Outros sintomas são a impotência sexual, anorexia, dores articulares. A doença pode prevalecer durante semanas, meses ou anos (ACHA; SZYFRES,1989). Sabe-se que o consumo de alimentos contaminados e o contato ocupacional constituem as fontes mais importantes de infecção humana (CORBEL, 1997). Segundo Gallien et. al. (1998), a transmissão da brucelose para o homem previamente estabelecida pelo contato com os animais domésticos parece estar sendo estendida para a transmissão através de alimentos de origem animal, como ocorreu em uma epidemia em Houston, 11 onde uma infecção foi relacionada ao queijo de leite de cabra não pasteurizado importado do México (THOPAR; YOUNG, 1986). Neste país, de 1990 a 1997, a média anual de ocorrência de brucelose humana foi de 5.363 casos novos, sendo que mais de 94% das pessoas tinham se infectado devido ao consumo de alimentos contaminados, principalmente leite e queijos (PAHO/WHO, 1999). Castell et al. (1996) também relataram uma epidemia com 81 casos de brucelose humana ocorrida na Espanha, onde foi estabelecida uma forte ligação entre a doença e o consumo de queijo cottage caseiro preparado em pequena escala por um produtor de uma vila. Santos-Neto et.al. relataram em 1999 um caso de B. abortus em um homem de 23 anos, funcionário de uma fazenda, que apresentava febre intermitente com calafrios há 3 meses. A febre se associava a queixas de hiporexia, astenia e dores generalizadas, principalmente em membros inferiores. Devido as fortes dores abdominais, foi solicitada tomografia computadorizada, fato que possibilitou a identificação de abcesso esplênico, raro em casos de brucelose humana. Ramos et.al. (2008) estudaram os aspectos epidemiológicos de B. abortus em Tocantins. Para pesquisa sorológica, 645 amostras foram coletadas sendo que 4% delas (26) foram positivas para B. abortus. Dos soro positivos, 3 eram mulheres, todas funcionarias de um frigorífico e 23 homens, dos quais 20 trabalhavam com abate e 3 eram trabalhadores rurais. Olea (2010) relatou um caso de endocardite em Santiago, Chile comprovadamente causado por B. abortus em paciente de 74 anos, trabalhador da área rural. 1.7 Sobrevivência em Leite e Derivados A sobrevivência de B. abortus em leite e derivados varia de acordo com alguns fatores, incluindo o tipo do produto, nível de umidade, temperatura de armazenamento, pH, ingredientes, ação biológica de outras bactérias presentes e processo de maturação. Em leite sobrevivem de 5 a 15 segundos quando expostas a temperatura de 71,7ºC, confirmando a eficiência do 12 processo de pasteurização para este patógeno; sobrevive até 24 horas em temperatura ambiente e por até 18 meses quando armazenado a 0ºC. Resistem no creme de leite refrigerado (4ºC) por até 6 semanas, em sorvetes, conservados a 0ºC, durante 30 dias e em queijos apresentam persistência variável: roquefort, até 60 dias, camembert, menos de 21 dias, cheddar, até 6 meses e no queijo branco, de 1 a 8 semanas (IDF, 1994). B. abortus pode sobreviver muito bem por mais de 6 meses em queijos de massa dura e por até 4 meses em manteiga (HARRIGAN, 1998). Além destes fatores, as concentrações de cloreto de sódio e de gordura também influenciam na sobrevivência da Brucella em derivados de leite. Um aumento da concentração de cloreto de sódio presente em produtos lácteos pode inibir o crescimento da Brucella. Brucella abortus sobrevive 13 meses em manteiga sem sal considerando que o tempo de sobrevivência da mesma espécie foi de, aproximadamente, metade, quando o teor de sal era elevado para 2,3%. Um alto teor de gordura também influencia na sobrevivência deste patógeno; provavelmente representando efeito de proteção na sobrevivência da bactéria (ROBINSON; BATT; PATEL, 2000). 1.8 Pesquisa de Brucella spp. em Alimentos No Brasil, a comercialização de leite cru e derivados elaborados a partir dele ainda constitui-se em um grave problema de saúde pública. Apesar da proibição legal imposta a esta prática, ela tem sido realizada abertamente em diversas cidades de São Paulo, inclusive para populações muitas vezes possuidoras de elevado nível cultural (QUEIROZ, 1995). Dentre estes produtos lácteos, destaca-se a produção do queijo tipo Minas Frescal, produto tipicamente nacional e amplamente consumido pela população (OLIVEIRA; FONSECA; GERMANO, 1999). A pesquisa de Brucella spp. em alimentos esbarra, no entanto, na morosidade dos métodos microbiológicos convencionais, já que a identificação do agente leva de 7 a 14 dias, além de ser um procedimento de risco, por se tratar de uma zoonose (MOLNÁR et.al., 1997; ALTON, 1976). 13 Esta dificuldade tem sido superada com o surgimento de técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) que tem facilitado o diagnóstico direto de doenças infecciosas, através de demonstrações do ácido nucléico do agente, dispensando seu isolamento através dos demorados processos de cultivo microbiológico (MULLIS et. al., 1994). A técnica de PCR, desenvolvida na década de 80 por Mullis e Saiki, permite a amplificação enzimática in vitro de um determinado segmento de DNA. Esta amplificação pode chegar até 107 – 109 cópias partindo de um só molde de DNA; possuindo um alto grau de sensibilidade e de especificidade.(BELAK et al., 1993; MULLIS et al., 1994). A reação em cadeia pela polimerase utiliza o processo de síntese para copiar uma sequência especifica indefinidamente. Misturas de oligonucleotídeos, usualmente denominadas primers (porque elas iniciam a síntese de DNA), são utilizadas na reação para iniciar a síntese de DNA em sítios específicos na fita molde. Os primers são construídos para parear com outra sequência (entre milhares de pares de bases), mas em fitas diferentes, e são orientados para copiar a fita de DNA entre eles. Para cada ciclo de desnaturação pelo calor/pareamento/síntese, a região entre os primers é copiada e acumula-se em abundancia na solução, até que as copias têm exatamente o mesmo comprimento – o comprimento do DNA entre os primers (SILVA e CABRAL, 1997). RODRIGUEZ (1997, apud Silva e Cabral, 1997) revisou a utilização da PCR na detecção de patógenos em animais relatando os trabalhos desenvolvidos para Aftovirus, Influenzavírus, Listéria spp., Bacillus anthracis, Clostridium botulinun, Clostridium perfringens, E. coli enterohemorrágica, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Helicobacter canis, Brucella spp., Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Leptospira spp., Borrelia spp, Chlamydia psittaci, Coxiella brunetti, Leishmania spp, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium spp., Echinoococcus spp., Taenia solium, Taenia saginata, Trichinella spp.. A tecnologia de PCR tem sido aplicada à detecção de contaminação por Brucella em alimentos, principalmente, leite e queijos frescos. Ênfase tem sido dada à sua aplicação em leite, por este se constituir em amostra diagnóstica 14 assim como em alimento, sendo esta a principal forma de aquisição da brucelose humana (BRICKER, 2002). Hamdy e Amin (2002) avaliaram a PCR na detecção de Brucella spp. em leite infectado de bovinos, ovinos, caprinos e camelos positivos a no mínimo um dos testes sorológicos preconizados para o diagnóstico da enfermidade, e observaram maior sensibilidade da PCR comparativamente ao isolamento bacteriano, apresentando adicionalmente como vantagens a rapidez e a segurança por impedir o risco de transmissão durante a manipulação laboratorial. Leal et.al. (1995) utilizaram PCR para detecção de Brucella spp. no sangue e leite de animais contaminados e relataram que a sensibilidade do teste e sua capacidade de detectar o patógeno em amostras de campo revelaram uma promissora técnica no diagnóstico da brucelose em animais e seres humanos. Romero e Lopez-Goni (1999), na intenção de aprimorar a detecção direta de Brucella através dos alimentos, testaram diferentes métodos de extração de DNA bacteriano de leite bovino e obtiveram um limiar de detecção de 5 a 50 UFC/ml de leite. Guido (2003) utilizou a técnica de PCR para detecção do DNA de Brucella abortus em leite bubalino experimentalmente contaminado e destacou que a maior sensibilidade analítica (10 UFC/ml) e a melhor visualização do produto amplificado foram obtidos com a utilização de isotiocianato de guanidina com precipitação imediata em álcool sem adição de Tween 20 na lavagem inicial da amostra. Serpe et.al. (1999) desenvolveram um método de PCR gênero- especifico para detecção de Brucella a partir de queijos mussarela, pecorino e ricota, detectando a bactéria em produtos diluídos em até 1,2 x 105 UFC. Miyashiro (2004) isolou a bactéria em 20,56% (29/141) das amostras de queijo minas frescal e em 15,68% (8/51) das amostras de queijo meia cura analisadas por meio da PCR. Destas 81,08% (30) das amostras eram B19 e 18,92% (7) eram cepas de B. abortus de campo. Tantillo et.al. (2001) através da PCR identificaram Brucella spp. em 46% das 46 amostras de queijo de leite de cabra e ovelha analisadas provenientes de fazendas e queijeiros na Itália, sendo que todas elas foram negativas ao cultivo direto. 15 Assim, tem-se em mão uma ferramenta que pode auxiliar em muito a vigilância epidemiológica no que se refere à detecção de microrganismos patogênicos em alimentos. Paralelamente à possibilidade de utilização desta nova ferramenta de diagnostico laboratorial e levando em consideração a importância da brucelose em nosso país e a grande participação de produtos lácteos informais no mercado varejista (especialmente do queijo minas frescal) torna-se importante a realização de levantamentos sobre a comercialização de alimentos contaminados por este importante agente zoonótico em nossa região. 16 2 OBJETIVOS Avaliar através da Reação em Cadeia pela Polimerase a presença de Brucella spp. em queijos Minas Frescal produzidos artesanalmente em municípios da região Centro Oeste do Estado de São Paulo. 17 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Coleta de amostras Foram coletadas aleatoriamente 52 amostras de Queijo Minas Frescal produzidos de forma artesanal (clandestinos), provenientes de várias cidades da região Centro Oeste Paulista. As amostras foram adquiridas em pontos de venda como feiras livres, padarias, outros estabelecimentos comerciais e também diretamente de produtores rurais. A coleta foi dividida em 2 etapas: 28 amostras foram coletadas em Julho/2010 e 24 coletadas em Agosto/2010, sendo que alguns pontos de venda/produtores foram repetidos na 2ª coleta. .As amostras coletadas foram acondicionadas em isopor contendo gelo reciclável, mantendo uma temperatura inferior a 10ºC, sendo transportadas até a Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus Botucatu. As amostras foram divididas assepticamente em 2 partes e acondicionadas em sacos plásticos próprios para alimentos, devidamente identificados com o número da amostra. Uma porção fresca de cada amostra foi enviada à Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG – Belo Horizonte para isolamento microbiológico. A outra porção permaneceu na UNESP - Botucatu para realização da Reação em Cadeia pela Polimerase e foi conservada congelada à -18ºC até o momento da análise. A tabela 1 descreve a data, local e cidade da coleta do material analisado. 18 Tabela 1 - Identificação das amostras de acordo com a cidade e data de coleta. Data coleta Ponto de coleta Cidade Numeração Amostra 10/jul Produtor 1 Guaranta 1 10/jul Produtor 2 Guaranta 2 11/jul Produtor 3 Lins 3 11/jul Feira Lins Ponto coleta 1 Feira Lins 4 11/jul Feira Lins Ponto coleta 2 Feira Lins 5 11/jul Produtor 4 Getulina 6 11/jul Produtor 5 Getulina 7 11/jul Produtor 6 Getulina 8 11/jul Produtor 7 Getulina 9 11/jul Produtor 8 Getulina 10 11/jul Produtor 9 Getulina 11 11/jul Produtor 10 Getulina 12 11/jul Produtor 11 Getulina 13 11/jul Produtor 12 Getulina 14 11/jul Marechal Rondon 1 Botucatu 15 12/jul Produtor 13 Lins 16 12/jul Produtor 14 Lins 17 12/jul Produtor 15 Lins 18 12/jul Padaria 1 Lins 19 12/jul Produtor 16 Promissão 20 12/jul Produtor 17 Guaimbe 21 12/jul Produtor 18 Lins 22 12/jul Produtor 19 Pongai 23 12/jul Produtor 20 Lins 24 12/jul Produtor 21 Sabino 25 12/jul Produtor 22 Getulina 26 12/jul Produtor 23 Guaranta 27 12/jul Produtor 24 Reginopolis 28 22/ago Produtor 25 Getulina 29 22/ago Produtor 4 Getulina 30 22/ago Produtor 26 Getulina 31 22/ago Produtor 5 Getulina 32 22/ago Produtor 11 Getulina 33 22/ago Produtor 6 Getulina 34 22/ago Padaria 1 Lins 35 22/ago Feira Lins Ponto coleta 1 Lins 36 22/ago Feira Lins Ponto coleta 2 Lins 37 20/ago Produtor 27 Lins 38 20/ago Produtor 14 Lins 39 21/ago Produtor 1 Guaranta 40 22/ago Produtor 3 Lins 41 22/ago Produtor 15 Lins 42 22/ago Produtor 21 Sabino 43 22/ago Produtor 24 Reginopolis 44 22/ago Produtor 20 Lins 45 22/ago Produtor 19 Pongai 46 22/ago Produtor 17 Guaimbe 47 22/ago Produtor 16 Promissão 48 22/ago Produtor 23 Guaranta 49 22/ago Produtor 22 Getulina 50 22/ago Produtor 28 Cravinhos 51 22/ago Produtor 13 Lins 52 19 3.2 Cultivo Microbiológico 3.2.1 Cultivo Microbiológico Direto As amostras de queijo conservadas em temperatura de até 10ºC foram cortadas em fragmentos de aproximadamente 1 cm2 e adicionadas à sacos plásticos estéreis, contendo 100 ml de PBS pH 7,2 esteril. Procedeu-se então a maceração dos fragmentos em homogeneizador de amostras (Modelo MC 1204, ITR, Brasil) durante 5 minutos a 400 golpes/minuto. O isolamento direto foi realizado em duplicata, sendo 100 μL do sobrenadante inoculado em placa de Petri contendo ágar triptose (Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) suplementado com a mistura de antimicrobianos de Farrell (Brucella Selective Supplement SR 0083A, Oxoid, UK). As placas foram incubadas em 5% de CO2 à 37ºC, por no mínimo 21 dias antes de serem descartadas como negativas. Estas analises foram realizadas no laboratório de Bacteriologia Aplicada, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Federal de Minas Gerais, sendo que as colônias foram identificadas de acordo com sua morfologia por Alton et.al. (1988). Aquelas consideradas características no isolamento foram extraídas das placas com auxilio de suabes estéreis e suspendidas em 100 μL de tampão TE, inativadas a 85ºC por 2 horas e submetidas à extração do DNA genômico segundo Pitcher et.al. (1989). A visualização dos produtos amplificados foi realizada em gel agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 1% corado com brometo de etideo a 0,5 mg/ml (Sigma, St. Louis, IL, USA). Foram consideradas positivas apenas as amostras cujas colônias características também apresentaram resultado positivo na PCR. 20 3.2.2 Cultivo microbiológico a partir do enriquecimento em caldo suplementado Do mesmo sobrenadante descrito no item anterior, foram inoculados 100 μL em tubos contendo 10 ml de caldo triptose contendo suplemento antimicrobiano de Farrell. Os tubos foram incubados com a tampa de rosca semi aberta em 5% de CO2 a 37ºC. Após 7 dias de incubação repiques foram realizados a partir deste caldo com o auxílio de suabes estéreis para placas contendo ágar triptose suplementado. Estas placas também foram incubadas em 5% de CO2 a 37ºC. Estas analises também foram realizadas no laboratório de Bacteriologia Aplicada, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Federal de Minas Gerais, sendo as colônias foram identificadas de acordo com sua morfologia por Alton et.al. (1988). Aquelas consideradas características no isolamento foram extraídas das placas com auxilio de suabes estéreis e suspendidas em 100 μL de tampão TE, inativadas a 85ºC por 2 horas e submetidas à extração do DNA genômico segundo Pitcher et.al. (1989). A visualização dos produtos amplificados foi realizada em gel agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 1% corado com brometo de etideo a 0,5 mg/ml (Sigma, St. Louis, IL, USA). Foram consideradas positivas apenas as amostras cujas colônias características também apresentaram resultado positivo na PCR. 3.3 PCR direto através do protocolo de extração pela Proteinase K. Antes do processamento as amostras foram descongeladas em temperatura ambiente. Após o descongelamento, 2,5 gramas de cada amostra de queijo foram coletadas e posteriormente maceradas com 5 ml de solução salina estéril em graal com auxilio de pistilo. Após descanso de 5 minutos para decantação, o sobrenadante foi coletado em tubos eppendorff conservados congelados até o momento da extração. Para este procedimento 200 μL da suspensão tecidual foram adicionados a 400 μL de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 8) em tubo eppendorff. Os tubos foram agitados e centrifugados a 21 13.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e ressuspendendido em 300 μL de solução de lise constituída por 15μL de proteinase K, 30 μL de SDS 10%, 60 μL de TNE 5X (50 mM Tris HCl; 500 mM NaCl; 125 mM EDTA; pH 8) e 195 μL de água MilliQ autoclavada. As amostras foram então inativadas a 56ºC por 2 horas. O DNA obtido foi purificado adicionando-se volume equivalente de fenol saturado (300 μL) e vortexado por 3 minutos. Posteriormente as amostras foram novamente centrifugadas a 13.000 g por 5 minutos. O sobrenadante (300 μL) foi transferido para outro microtubo sendo adicionados 150 μL da solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), ou seja, para cada amostra foram adicionados 75 μL fenol; 72 μL clorofórmio; 3 μL álcool isoamílico. Novamente foram agitadas em vortex e centrifugadas a 13.000 g por 5 minutos. A fase aquosa foi recuperada em um novo tubo (220 μL), desprezando-se a fase fenólica e a interfase. Adicionaram-se então 440 μL de etanol absoluto gelado com incubação em gelo por 1 hora seguido de centrifugação a 12.000 g por 30 minutos, a 4ºC. O etanol foi desprezado, tomando-se cuidado para não desprezar o pellet. Foram adicionados 300 μL de etanol 70% com nova centrifugação a 12.000 g por 15 minutos, a 4ºC. O etanol foi novamente desprezado, porém por exposição ao ar. O DNA foi ressuspendido em 30 μL de TE. Este material foi amplificado utilizando-se o mix para PCR com primer B4 e B5, sendo constituído por: 13,25 μLde H2O 0,75 μL de MgCl2 0,5 μL de taq 2,5 μL de Buffer 10x 2,5 μL de B4 (5´- TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA -3´) 2,5 μL de B5 (5´- CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG -3´) 0,5 μL de dnTp 2,5 μL de DNA As amostras foram colocadas em termociclador e sofreram desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos. Foram empregados 40 ciclos divididos em 3 etapas: desnaturação a 94ºC por 60 segundos, hibridação a 22 60ºC por 60 segundos e extensão a 72ºC por 60 segundos. O 3º e ultimo ciclo foi realizado a 72ºC durante 10 minutos. A visualização dos produtos amplificados foi realizada por eletroforese em gel agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 1% corado com brometo de etideo a 0,5 mg/ml (Sigma, St. Louis, IL, USA) e submetido a voltagem constante de 6-7 V/cm. O gel foi posteriormente fotografado sob luz ultra violeta pelo sistema de foto-documentação e analisado por software especifico, sendo considerado positivo fragmento com 230 pb. 23 4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO Todas as 52 amostras analisadas foram negativas para Brucella spp. no plaqueamento direto em ágar triptose suplementado. Em caldo triptose suplementado por um período de 7 dias e inoculação em placas com ágar triptose suplementado, 5 (9,61%) apresentaram crescimento de colônias características sendo estas confirmadas como Brucella spp. através da PCR. Paralelamente, as 52 amostras foram analisadas pela PCR de forma direta. Nesta técnica para detecção de Brucella spp. com o primer B4/B5, 12 amostras (23,07%) foram positivas. A figura 1 demonstra alguns resultados obtidos pela PCR direta. Figura 1 - Resultados obtidos através de PCR direta dos queijos Minas Frescal analisados L Q45 Q51 C- Q52 C+ C - L Onde: L lader Q queijo(numeração da amostra) C+ controle PCR positivo C- controle PCR negativo 24 O mapa abaixo representa geograficamente a localização das amostras coletadas e a tabela 2 mostra a distribuição dos resultados de acordo com a região de coleta das amostras. Bauru Lins Getulina Guarantã Botucatu Promissão Guaimbê Pongaí Sabino Reginópolis Pompéia Figura 2 - Mapa da distribuição geográfica de coleta das amostras. 25 Tabela 2 - Resultados obtidos através da PCR direta distribuídos de acordo com o local de coleta das amostras. Local de coleta da amostra Numero de amostras coletadas Resultado PCR positivo % amostras positivas por região amostrada Botucatu 1 0 0% Getulina 17 4 23,52% Guaimbê 2 0 0% Guarantã 5 4 80% Lins 18 2 11,11% Pompéia 1 0 0% Pongaí 2 1 50% Promissão 2 0 0% Reginópolis 2 1 50% Sabino 2 0 0% Total amostras 52 12 23,07% De acordo com o ultimo levantamento oficial de prevalência de brucelose no estado de São Paulo, realizado no ano de 2001 por Dias et.al. (2009) em conjunto com técnicos do MAPA e colaboração dos técnicos da Coordenadoria de Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo, o estado foi estratificado em 7 circuitos produtores de bovinos e 150 rebanhos com atividade reprodutiva foram aleatoriamente selecionados em cada um deles. Nestas propriedades as amostras de soro de fêmeas bovinas com mais de 24 meses foram coletadas aleatoriamente. Como resultado, a prevalência estadual estimada de rebanhos com pelo menos um animal soro positivo foi de 9,7%, enquanto a prevalência estimada de animais soro positivos foi de 3,8%. Esta prevalência também foi descrita de acordo com os circuitos produtores. 26 Figura 3 - Mapa do Estado de São Paulo com a divisão em circuitos produtores. No detalhe, a localização do Estado de São Paulo no Brasil (DIAS et.al., 2009). Tabela 3 - Prevalência aparente de focos de brucelose bovina no Estado de São Paulo (DIAS et.al. 2009) Todas as amostras de queijo Minas Frescal coletadas para este trabalho foram provenientes da região Centro Oeste Paulista, descrita por Dias et.al. (2009) como circuito produtor nº3. Nesta região os autores encontraram 15 focos de brucelose bovina em 148 propriedades visitadas onde a prevalência 27 da doença foi de 10,13%, como demonstra a tabela 3. A distribuição dos focos de brucelose nesta região estão descritos na figura 5, abaixo. Desta forma fica comprovado que ainda existem focos de brucelose bovina em todo o Estado de São Paulo, inclusive na região onde as amostras de queijos Minas Frescal foram coletadas para este trabalho. Se compararmos a localização dos focos descritos por Dias et.al. (2009) e a localização das amostras de queijo Minas Frescal positivas na PCR direta podemos observar a grande proximidade entre elas, reforçando o perigo iminente em saúde pública. Dentre as formas de diagnóstico da Brucella spp. o isolamento e identificação é considerada técnica padrão ouro para o diagnóstico da brucelose. No entanto, esta técnica possui algumas dificuldades em função de Brucella spp. ser uma bactéria exigente e fastidiosa para o crescimento, Figura 4 - Mapa 15 - Brucelose bovina nas propriedades amostradas por Dias et.al (2009) 28 requerendo no isolamento primário meios de cultura ricos em nutrientes e em atmosfera enriquecida com dióxido de carbono. Além disso, o cultivo microbiológico depende também da viabilidade do microrganismo, da qualidade da amostra analisada e do tempo transcorrido entre a coleta e seu processamento. O tempo de manutenção das amostras no congelamento também pode causar injurias e danos à bactéria diminuindo a eficiência da técnica bem como da natureza da infecção (ALTON et.al.1988). Outro ponto importante no isolamento é a necessidade do uso de meios ricos suplementados com antibióticos, em função da presença de bactérias secundárias contaminantes que inibem o crescimento de Brucella spp., seja por competirem por nutrientes ou pela produção de substancias tóxicas ou ainda por mascarar colônias de Brucella spp. entre as contaminantes (FARRELL, 1974). Neste trabalho nenhuma das amostras foi positiva no isolamento direto. Porém 5/52 amostras foram positivas no isolamento realizado a partir do enriquecimento das mesmas em caldo triptose suplementado e tiveram as colônias características positivas também na PCR. Devido a todas as dificuldades para o isolamento da bactéria, Minharro (2009) pesquisou a eficiência do caldo triptose suplementado com antibióticos como meio de enriquecimento para o isolamento de Brucella abortus. Segundo a autora, para melhorar a sensibilidade no isolamento é indicado o uso de meio de cultura suplementado com antibióticos para processamento, principalmente de amostras de tecidos que não sejam provenientes de material de aborto, em função do pequeno numero de bactérias viáveis neste tipo de amostra clinica. Uma alternativa eficiente para suplantar o inconveniente do reduzido numero de bactérias em amostras clinicas diferentes de aborto é a utilização de meios de enriquecimento (caldos suplementados com antimicrobianos ou não), permitindo às Brucellas melhores condições de multiplicação e crescimento e, consequentemente, elevando o numero de células bacterianas detectáveis no plaqueamento (ALTON et.al, 1988). Minharro (2009) coletou 187 amostras compostas por linfonodos ilíaco interno, supramamário ou inguinal e lesões do ligamento cervical de bovinos abatidos sabidamente soropositivos para brucelose ou com lesões sugestivas da doença identificadas nas linhas de inspeção de frigoríficos localizados nos estados de Minas Gerais, Para, Rio Grande do Sul e Tocantins. 29 Estas amostras foram submetidas à técnica de isolamento direto, isolamento a partir do caldo enriquecido e também foram submetidas às técnicas de PCR para identificação de Brucella spp. e multiplex PCR AMOS para identificar e diferenciar as espécies. Foram isoladas 74 (39,57%) amostras de Brucella spp.. Deste total de amostras isoladas todas (100%) cresceram após o enriquecimento em caldo triptose suplementado com antimicrobiano de Farrell, com período de enriquecimento variando de 7 a 14 dias antes da inoculação em placas com ágar triptose suplementado. Já o plaqueamento direto possibilitou o isolamento de somente 36/74 (48,64%) das amostras. Desta forma, o enriquecimento proporcionou um aumento da taxa de identificação das amostras clinicas infectadas na ordem de 51,36% (38 amostras). No presente trabalho a eficiência do enriquecimento das amostras em caldo triptose suplementado também foi satisfatório, confirmando os resultados obtidos por Minharro (2009). Porém, devemos levar em consideração o longo período necessário para a identificação definitiva desta bactéria, que geralmente dura duas semanas. Neste período o produtor, o processador de alimentos ou o paciente doente pode estar sujeito à privação desnecessária se a suspeita não for comprovada. Os testes são complexos e devem ser realizados em laboratório autorizado com grau 3 de biossegurança e por pessoal altamente habilitado. A natureza zoonótica da maioria das espécies de Brucella se configura em perigo potencial para o pessoal do laboratório que deve manipular o agente infeccioso durante os testes. Por fim os resultados não são sempre definitivos.(BRICKER, 2002). Neste contexto o desenvolvimento de técnicas seguras e mais rápidas torna-se muito importante. A sensibilidade e especificidade da PCR sugerem que este seja um procedimento alternativo, adequado e confiável para a rotina de triagem e monitoramento microbiológico, embora não seja capaz de discriminar células viáveis e não viáveis. A detecção de DNA pela PCR não depende dos fatores que influenciam o sucesso do isolamento microbiológico; o microrganismo pode estar inviável, as amostras contaminadas com outros microrganismos e pode haver demora no processamento do material (MIYASHIRO, 2004). Como esta técnica promove a amplificação enzimática de um determinado segmento de DNA, podendo chegar até 107 – 109 cópias partindo de um único molde, promove um alto grau de sensibilidade e de 30 especificidade, possibilitando a detecção de pequenas quantidades de DNA (BELAK et al., 1993; MULLIS et al., 1994). Poucos pesquisadores tem desenvolvido protocolos para detecção de Brucella spp. através da PCR para queijos e outros produtos lácteos, embora a presença deste microrganismo seja inaceitável em qualquer alimento independente de sua concentração. Neste trabalho, a PCR realizada diretamente dos queijos permitiu a identificação de Brucella spp. em 12/52 amostras (23,07%). Miyashiro (2004) isolou Brucella abortus em 20,56% (29/141) das amostras de queijo minas frescal e em 15,68% (8/51) das amostras de queijo meia cura analisadas por meio da PCR. Destas amostras positivas a maioria, ou seja, 81,08% (30) das amostras eram originarias da cepa vacinal B19 e apenas 18,92% (7) eram cepas de B. abortus de campo. O fato de Myiashiro (2004) ter identificado que 81,08% (30) das amostras positivas eram originarias da cepa vacinal B19 e apenas 18,92% (7) eram cepas de B. abortus de campo permite concluir que a vacinação contra brucelose bovina não tem sido realizada conforme recomendada pelo PNCEBT em alguns locais, ou seja, pode estar ocorrendo a vacinação de animais mais velhos bem como a revacinação, ou a dosagem pode não estar sendo respeitada, ou ainda, a transmissão do microrganismo pela não higienização das ordenhadeiras mecânicas, provocando sua disseminação pelo rebanho. Como além da presença de anticorpos de origem vacinais em fêmeas adultas, a B19 pode infectar persistentemente o útero dependendo da idade e “status” reprodutivo da fêmea na vacinação, e da dosagem e método de vacinação utilizados, pode ocorrer então a eliminação constante ou intermitente da B19 pelo leite (MYIASHIRO, 2004). Sendo a cepa vacinal perigosa para machos e quaisquer outras espécies incluindo o homem, partimos do principio que tanto a cepa vacinal quanto a cepa de campo são inaceitáveis em quaisquer produtos de origem animal, constituindo risco de saúde pública se ocorrer escape de Brucella spp. viáveis no processamento destes produtos. Desta forma, por considerarmos que a presença de ambas as cepas são passiveis de causar infecção no homem e, portanto, não podem estar presentes em alimentos, não fizemos neste trabalho a diferenciação entre a cepa de campo e cepa vacinal. 31 A alta ocorrência de DNA nas amostras de queijos analisadas, 23,07% (12/52) e a viabilidade do microrganismo comprovada pelo isolamento em 9,61% (5/52) nos desperta para um grande problema: a possibilidade de infecção do homem por Brucella spp. a partir dos queijos analisados. Infelizmente ainda existe a tradição, principalmente em cidades do interior, de consumo de produtos feitos de forma artesanal. Estes consumidores acreditam que os produtos feitos diretamente nas propriedades rurais são mais saudáveis por não passarem por tratamentos industriais, por não terem a adição de conservantes, por serem mais frescos, naturais e saborosos. Por outro lado, a venda destes produtos é uma das principais fontes de renda para alguns pequenos produtores rurais, que os comercializam diretamente ao consumidor. Porém, normalmente estes produtores, que também são fabricantes de queijos e demais derivados do leite de forma caseira, não possuem conhecimento técnico necessário para manipular corretamente o leite e transformá-lo de forma segura em algum derivado. Muitos lançam mão da confecção de derivados apenas como forma de agregar mais valor a matéria prima, que está sempre sobre a ação das leis de mercado e que normalmente não recebe a remuneração esperada pelo pequeno produtor. Após a publicação da Instrução Normativa nº 51 em 2002 pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento que entrou em vigor no ano de 2005, muitas indústrias pressionadas a melhorar a qualidade da matéria prima recebida iniciaram a implantação de programas de melhoria da qualidade do leite e de pagamento vinculado a esta qualidade, politica onde os produtores seriam penalizados ou bonificados de acordo com os resultados obtidos por meio de analises laboratoriais e controle sanitário do rebanho (BRASIL, 2002). Após 6 anos em vigor, é possível perceber que a Instrução Normativa nº 51 obrigou muitos produtores a adotar medidas sanitárias e higiênicas durante todas as etapas de obtenção da matéria prima na propriedade melhorando muito a qualidade do leite, principalmente na questão microbiológica. Porém vários pequenos produtores rurais não aceitaram tais mudanças por não acreditarem que aquele leite retirado em sua propriedade, de um animal que muitas vezes é considerado membro da família, cujo leite é utilizado para alimentar crianças e idosos, possa de alguma forma causar algum prejuízo à saúde humana. Existe grande resistência por parte destes produtores em alterar procedimentos de criação e ordenha que foram herdados 32 de seus pais ou avós. Em alguns casos, o fato de nenhuma doença ocorrida na família ter sido diagnosticada e vinculada ao consumo do leite cru também é uma justificativa para a continuidade dos procedimentos utilizados habitualmente. Devido à exigência legal e consequentemente industrial na melhoria da qualidade do leite, vários pequenos produtores desistiram de vender seu produto para os laticínios preferindo adotar a clandestinidade. Pudemos observar em nossas coletas muitos pontos de venda comerciais expondo os queijos artesanais em destaque. Em alguns destes pontos de venda tivemos que encomendar o produto já que tratava-se de um item extremamente procurado. Não observamos nenhum tipo de preocupação nestes locais com a venda somente de produtos inspecionados, em forma de cumprimento da lei, muito menos preocupação por parte dos consumidores relacionada à qualidade e sanidade do produto. Vale a pena ressaltar que o leite é um produto extremamente perecível e passível de fácil contaminação, que pode começar a partir do momento da ordenha. Vários trabalhos relatam a presença de inúmeros microrganismos patogênicos no leite cru, como Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Escheria coli, Listeria monocytogenes, Brucella spp., Mycobacterium spp. provenientes de falhas no controle sanitário dos animais ou agregados ao leite durante os processos de ordenha e transporte. Para que o leite ou derivados cheguem á mesa do consumidor de forma segura é necessário seguir normas rigorosas de higiene e de qualidade da matéria prima, quanto no seu beneficiamento e estocagem. Falhas nestes processos podem resultar em um produto de má qualidade e em riscos de infecções e intoxicações nos consumidores. A maioria destes microrganismos presentes na matéria prima é eliminada através da pasteurização que, em condições artesanais, não é realizada ou pode não ser efetiva. Zaffari et.al. (2007) pesquisaram a presença de microrganismos indicadores e patogênicos em queijos artesanais vendidos em estabelecimentos de beira de estrada, no estado do Rio Grande do Sul. Das 80 amostras analisadas todas apresentaram contagem de coliformes totais e 62 amostras foram testadas para a presença de coliformes fecais. Destas, 84% apresentaram contagens de coliformes fecais acima do limite máximo previsto em legislação. Das 80 amostras, 16% continham Listeria spp., sendo 3,7% identificadas como Listeria monocytogenes. Neste trabalho não foram isoladas 33 Brucella spp. dos 80 queijos analisados. Frequentemente, a presença de contagens elevadas de microrganismos competidores, como observado, pode dificultar o isolamento de patógenos nas amostras de alimentos. Além disso, esses patógenos não sobrevivem por muito tempo em ambientes de pH ácido, característico dos queijos. Metabólitos inibidores produzidos pela microbiota presente nas amostras provavelmente dificultaram seu isolamento. Contudo, a presença de coliformes totais, fecais e de Listeria spp. indica que patógenos possam estar presentes nos queijos, incluindo a Brucella spp.. Esta alta frequência de coliformes fecais e a presença de Listeria monocytogenes revelam que o consumo destes queijos constitui perigo de infecção à população em geral e especialmente áquelas pessoas imunocomprometidas. Os queijos são os produtos mais relacionados com a contaminação da população por Brucella spp. em países que não utilizam o leite pasteurizado em sua fabricação, sendo a Brucella melitensis a principal espécie envolvida. Embora esta espécie não tenha sido encontrada no Brasil, existem relatos de outras espécies de Brucella spp. presentes no leite e em queijos artesanais, o que constitui perigo ao consumidor (LANGONI et.al., 2000). Levando em consideração a presença de focos de brucelose no Estado de São Paulo, descritos por Dias et.al (2009), o presente trabalho vem se somar aos de Zaffari et.al. (2007), Miyashiro (2004), Tantillo et.al. (2001) e Serpe et.al. (1999) ratificando a presença do agente em derivados elaborados a partir da material prima não pasteurizada, representando desta forma risco em saúde pública. Os resultados apresentados alertam para as práticas de manupulação e manejos inadequados dos animais, bem como as que ocorrem no mercado clandestino de leite e derivados, merecendo atenção especial das autoridades de Defesa Agropecuária, no intuito de garantir o cumprimento do PNCEBT, bem como das autoridades em Vigilância Sanitária, com o propósito de orientar a população e promover o cumprimento da legislação vigente em sua integra. 34 5.0 CONCLUSÂO Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que: A positividade da PCR para Brucella spp. em 23,07% das amostras analisadas e a viabilidade da bactéria observada em 9,61% delas comprovam o risco de infecção por consumidores pelo consumo de queijo minas frescal produzido artesanalmente na região centro oeste do Estado de São Paulo, analisados neste trabalho. A técnica de PCR mostrou-se uma importante ferramenta laboratorial na vigilância epidemiológica da contaminação de queijos por Brucella spp.. 35 6.0 REFERÊNCIAS ACHA, P.N.; SZYFRES, B. Zoonoses et maladies transmissíbles communes à l’homme et aux animaux; 2ª Edição: Office International Epizooties. Paris. v.17, p.26-27, p.33-34, 1989. ACHA, P.N.; SZYFRES, B. Brucellosis zoonosis y enfermidades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Bacteriosis y micosis. 3ª ed. Washington: Organization Panamericana de la Salud, p. 28-56, 2001. ALTON, G.G.; JONES, L.M.; PIETZ, D.E. Las técnicas de laboratório de la brucelosis. OMS. Ser. Monogr., v.55, p.68-133, 1976. ALTON, G.G.; JONES, L.M.; ANGUS, R.D.; VERGER, J.M. Techniques for the brucellosis laboratory. Paris Institut Nacional de la Recherche Agronomique, p. 545, 1988. BASTIANETTO, E.; AMARAL, F.R.; CARVALHO, L.B.; OLIVEIRA, D.A.A; LEITE, R.C. Brucelose em rebanho de búfalos criados na região do Alto de São Francisco – Minas Gerais. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.29, p. 55-56, 2005. Disponível em: www. cbra.org.br. Acesso em 01 jul. 2008. BELÁK, S.; PORDÁNY, A. B. Applification of the polymerase chain reaction (P.C.R.) in veterinary diagnostic virology. Veterinary Research Communications, v.17, p. 55-72, 1993. BISHOP, G.C.; BOSMAN, P.P.; HERR, S. Bovine Brucellosis. Infectious diseases of Livestock. Austin: Texas A&M University Press, College Station, 1994, v. 2, p. 1053-1066. BRASIL. Plano Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal. Ministério da agricultura Pecuária e Abastecimento. 2001 Disponível em: www.agricultura.gov.br. Acesso em: 12 de dez. 2010. 36 BRASIL. Instrução Normativa nº51 de 18 de setembro de 2002. Aprova os Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e Qualidade do leite tipo A, do leite tipo B, do leite tipo C, do leite Pasteurizado e do leite Cru refrigerado e o Regulamento Técnico de Coleta a Granel. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Disponível em: www.extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao Acesso em 20 de jan. 2011. BRICKER, B.J. PCR as a diagnostic tool for brucellosis. Veterinary Microbiology: v.90, p.435-446, 2002. CASTELL, M.J.; RULLAN, J.V.; PEIRO CALLIZO, E.F.; NIETO-SANDOVAL; A.A. Epidemic outbreak of 81 cases of brucellosis following the consumption of fresh cheese without pasteurization. Revista Espanola de Salud Publica, v.70, p. 303-311, May-Jun. 1996. CENTER OF FOOD SECURITY & PUBLIC HEALTH. Brucellosis. July 6, 2007. CORBEL, M.J. Brucellosis: an overview. Emerging Infectious Diseases. v.3, p. 213-221, 1997. CORBEL, M.J.; BRINLEY-MORGAN, W.J. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore: William and Wilkins, 1984. p. 377-388. DIAZ, R; JONES, L.M.; LEONG, D.; WILSON, J.B. Surface antigens of smooth Brucelae. Journal of Bacteriology., v.96, p. 893-901, 1968. DIAS, R.A.; GONÇALVES, V.S.P.; FIGUEIREDO, V.C.F.; LÔBO, J.R.; LIMA, Z.M.B.; PAULIN, L.M.S.; GUNNEWIEK, M.F.K.; AMAKU, M.; FERREIRA NETO, J.S.; FERREIRA, F. Situação Epidemiológica da brucelose bovina no Estado de São Paulo. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.61, supl.1, p. 118-125, 2009. 37 EVANGELISTA, J. Tecnologia de Alimentos. São Paulo: Atheneu, 2001, p.133-134. FARRELL, I.D. The development of a new selective medium for the isolation of Brucella abortus from contaminated sources. Research in Veterinary Science, v.16, p. 220-286, 1974. GALLIEN, P.; DORN, C.; ALBAN, G.; STAAL, C.; PROTZ,D. Detection of Brucella species in organs of naturally infect cattle by polymerase chain reaction. Veterinary Record , v.142, p. 512-514, 1998. GARCIA-CARILLO,C. Animal and human brucellosis in the Amencas. Paris: Office International des Epizooties, 1990. 299p. GUIDO, M.C. Detecção de DNA de Brucella abortus pela PCR em leite bubalino experimentalmente contaminado pela amostra 1119-3. São Paulo, 2003. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo - USP. HAMDY, M.E.R.; AMIN, A.S. Detection of Brucella Species in the Milk of Infected Cattle, Sheep, Goats and Camels by PCR. The Veterinary Journal, v.163, p.299-233, 2002. HARRIGAN, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. California: 1998, p.209-210. HENDERSON, J.L. The Fluid-milk Industry. Connecticut: The Avi Publishing Company, INC., 1971, p.85-88. IDF - INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION. The Significance of pathogenic microorganisms in raw milk. Belgium: IDF, 1994, p.167-183. JONES, T.C.; HUNT, R.D.; KING, N.W. Patologia Veterinária. São Paulo: Manole, 2000, p. 454 – 456. 38 KURODA, R.B.S., PAULIN, L.M.S., NOZAKI, C.N.; SILVA JÚNIOR, F.F.; GERONUTTI, L.; MEGID, J. Prevalência da brucelose bovina na microrregião da Serra de Botucatu – Estudo comparativo dos resultados das técnicas de Soroaglutinação Lenta em Tubos, 2-Mercaptoetanol e Fixação do Complemento. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, n. 2, p.137-142, abr./jun., 2004. LANGONI, H. et.al. Isolation of Brucella spp from milk of brucellosis positive cows in São Paulo and Minas Gerais states. Brazilian Journal of Veterinary Research Animal Science, São Paulo, v.37, p. 444-448, 2000. LEAL, K.D.S; MARTINEZ, V.I.O; LOPEZ, M.A.; MARTINEZ, S.J.P. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals. Journal of Clinical Microbiology. v.33, p.3087-3090, 1995. MARTINEZ, C. Guia del inspector veterinário . Barcelona: 2º ed., v.2, p. 50- 56. 1984. MEYER, M. E; BIBERSTEIN, E.L.; ZEE, Y.C. Review of veterinary microbiology: Blackwell Scientific Publications. Illinois: p. 283-285, 1990. MINHARRO, S.B. Isolamento, Tipificação e Genotipagem de Brucella abortus isoladas de bovinos no Brasil. Capitulo 3 Eficiência do Caldo Triptose Suplementado com Antibióticos como Meio de Enriquecimento para o Isolamento de Brucella abortus. Dissertação (doutorado em Medicina Veterinaria Preventiva) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2009. MIYASHIRO, S. Presença de DNA de B. abortus em subprodutos lácteos clandestinos: diferenciação da origem da cepa vacinal (B19) ou campo pela Reação em Cadeia pela Polimerase. Dissertação (mestrado em Medicina Veterinaria) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2004. 39 MOLNÁR, L.; MOLNÁR, E.; TURY, E.; SOUZA, J.S. Concepções modernas para o diagnóstico da brucelose. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, v.19, p.157-162, 1997. MULLIS, K. B.; FERRÉ, F.; GIBBS, R. A. The polimerase chain reaction. Boston: Brirkhäuser, 1994. 406-12p. NIELSEN, K. Diagnosis of brucellosis by serology. Veterinary Microbiology, v.90, n. 1-4, p. 447-459, 2002. OLEA M, P. Endocarditis por Brucella abortus: Sobrevivir a los 74 años de edad. Revista Chilena de Infectologia. [online]. v.27, n.1, pp. 80-84, 2010. Disponível em: http://portal.revistas.bvs.br/index.php?issn=0716-1018&lang=pt. Acesso em: 16 mar.2010. OLIVEIRA, C. A. F.; FONSECA, L. F. L.; GERMANO, P. M. L. Aspectos relacionados à produção, que influenciam a qualidade do leite. Higiene Alimentar, v.13, p.10-16, 1999. OMS – ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. Comite Mixto FAO/OMS de expertos em brucellosis. Genebra, 1986, 146 p. PAHO/WHO – Pan American Health Organization/World Health Organization. Brucellosis PAHO/WHO Expersts Consulation Meeting on Vaccines and Vaccination Strategies, 1999. PAULIN, L.M.S. Estudo comparativo de diferentes técnicas de sorológicas para diagnóstico de infecções por Brucella abortus em búfalos (Babalus bubalis). Tese (doutorado em Epidemiologia Experimental Aplicada a Zoonoses) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006, 92p. PAULIN, L.M.S.; FERREIRA NETO, J.S. O combate à brucelose bovina. Situação brasileira. Jaboticabal: Funesp, 2003. 154 p. 40 PITCHER, D.G.; SAUNDERS, N.A.; OWEN, R.J. Rapid Extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology, v.8, p. 151-156, 1989. POESTER, F.P.; GONÇALVES, V.S.P.; LAGE, A.P. Brucellosis in Brazil. Veterinary Microbiology, v.90, p.55-62, 2002. QUEIROZ, J.C. Avaliação Sanitária do leite cru distribuído nos municípios de Juquitiba e Itapecerica da Serra. São Paulo, 1990-1992. Tese (doutorado) – 1995 -Faculdade de Saúde Pública, Universidade de São Paulo - USP. RAMOS, T.R.R.; JÚNIOR, J.W.P.; SOBRINHO, P.A.M.; SANTANA, V.L.A.; GUERRA, N.R.; MELO, L.E.H.; MOTA, R.A. Epidemiological aspects of an infection by Brucella abortus in risk occupational groups in the microregion of Araguaína, Tocantins. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v.12, p.133- 138, 2008. ROBINSON, R.K.; BATT, C.A.; PATEL, P.D. Encyclopedia of food microbiology. London: Academic Press, 2000, p. 319-328. ROMERO, C; LOPES-GONI. Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp by PCR. Applied and Environmental Microbiology, v.65, n.8, p. 3735-3737, 1999. SANTOS-NETO, L. L.; COSTA, G. P.; SIMAAN, C. K. e CORREIA-LIMA, F. A. Abscesso esplênico por Brucella abortus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.32, n.1, p. 53-55, 1999. SERPE L.; GALLO, P; FIDANZA, N.; SCARAMUZZO, A.; FENIZIA, D. Single- step method for rapid detection of Brucella abortus in soft cheese by gene- specific polymerase chain reaction. Journal of Dairy Research, v.2, n.66, p. 313-317, 1999. 41 SILVA, A.V.; CABRAL, K.G. Aplicações da biologia molecular no diagnostico das zoonoses. Botucatu, 1997. Seminário – Curso de Pós Graduação Vigilância Sanitária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”. SMITH, B.P. Tratado de medicina interna de grandes animais. São Paulo: Manole, 1994, p.1394 – 1395. SMITH, H.; WILLIAMS, A.E.; PEARCE, J.H.; KEPPIE, J. Foethal erytritol: a cause of the localization of Brucella abortus in bovine contagious abortion. Nature, v. 193, p. 47-49, 1962. SOUZA, A.P.; MOREIRA FILHO, D.C.; FÁVERO, M. Investigação da brucelose em bovinos e em consumidores humanos de leite. Revista de Saúde Pública, v.11, p. 238-247, 1997. TANTILLO, G.; PINTO, A.D.; VERGARA, A.; VOGLIA, C.B. Polymerase Chain Reaction for the Direct Detection of Brucella sp in Milk and Cheese. Journal of Food Protection, v. 64, p.164-167, 2001 THOPAR, M.K.; YOUNG, E.J. Urban outbreak of goat cheese brucellosis. Pediatric Infection Diseases, v.5, p. 640-643, , 1986. ZAFFARI, C.B.; MELLO, J.F.; COSTA, M. Qualidade Bacteriológica de queijos artesanais comercializados em estradas do litoral norte do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v.37, p. 862-867, 2007. CAPA FOLHA DE ROSTO COMISSÃO EXAMINADORA DEDICATÓRIA AGRADECIMENTOS EPÍGRAFE LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 Etiologia 1.2 Transmissão e Patogenia 1.3 Diagnóstico 1.4 Situação Brasileira 1.5 Plano Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose 1.6 Importância em Saúde Pública 1.7 Sobrevivência em Leite e Derivados 1.8 Pesquisa de Brucella spp. em Alimentos 2 OBJETIVOS 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Coleta de amostras 3.2 Cultivo Microbiológico 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÂO REFERÊNCIAS