UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP 

INSTITUTO DE QUÍMICA -  ARARAQUARA 

DEPARTAMENTO BIOQUÍMICA E QUÍMICA ORGÂNICA 

 

 

 

MARCUS VINICIUS DE SÁ GONÇALVES DA SILVA  

 

 

 

Investigação metabólica dos fungos endofíticos isolados de Tagetes patula e bioatividades 

utilizando a abordagem OSMAC e o UNIFI 

 

 

 

Orientador: Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ARARAQUARA 

2023 



 
 

MARCUS VINICIUS DE SÁ GONÇALVES DA SILVA 

 

 

 

 

 

 

Investigação metabólica dos fungos endofíticos isolados de Tagetes patula e 

bioatividades utilizando a abordagem OSMAC e o UNIFI 

 

 

 

 

Tese apresentada ao Instituto de 

Química, Universidade Estadual 

Paulista como parte dos requisitos 

para obtenção do título de Doutor em 

Química 

 

 

Orientador: Prof. Dr. Ian Castro-

Gamboa 

 

 

 

 

 

 

 

 

ARARAQUARA 

2023 



 
 

Ficha catalográfica 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 



 
 

DADOS CURRICULARES 

FORMAÇÃO ACADÊMICA: 

2018-2023 

Doutorado em Química 

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Unesp, Araraquara-SP. 

Título: Investigação metabólica dos fungos endofíticos isolados de Tagetes patula e 

bioatividades utilizando a abordagem OSMAC e o UNIFI 

Orientador: Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa 

Bolsista: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) 

 

2016-2018 

Mestrado em Química 

Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Uberlândia-MG. 

Título: Composição química e atividade larvicida contra Aedes aegypti do óleo essencial de 

Eugenia calycina 

Orientador/Coorientador: Prof. Dr. Sérgio Antônio Lemos de Morais/ Prof. Dra. Raquel Maria 

Ferreira de Sousa 

 

2016-2018 

Graduação em Química Industrial 

Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Uberlândia-MG. 

 

FORMAÇÃO ACADÊMICA COMPLEMENTAR 

 

2015 

Estágio docência 

Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Uberlândia-MG. 

Curso de Graduação em: Química 

Nome da disciplina: Química Orgânica IV – Prática 

Carga Horária Total: 60 horas 

Professor Responsável pela Disciplina: Sérgio Antônio Lemos de Morais 

 

2019-2020 

Supervisão Científica 

Aluno: Pietro Cotta Galvão (Iniciação Científica) 

Título do Projeto: Exploração racional de Collectotrichum gloesporioides, visando a produção 

e isolamento de metabólitos bioativos e processos scale-up. 

(Graduando em Engenharia Química), Instituto de Química, Unesp – Araraquara. 

Bolsista: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). 

 

2021 

Estágio docência 

Universidade Estadual Paulista (Unesp Araraquara) 

Disciplina: Química Orgânica II 

Curso: Engenharia Química 

 

 

 

 



 
 

DISCIPLINAS CURSADAS DURANTE O DOUTORADO 

 

1. Bioenergia e Quimiometria – A 

2. Chemistry Education Research: Current Perspectives of the Field – A 

3. Planejamento de Experimentos – A 

4. Metodologias Modernas Aplicadas a Síntese Orgânica - B 

5. Estereoquímica e Reatividade dos Compostos Orgânicos – C 

6. Biossíntese de Produtos Naturais - C 

 

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS 

1. ROCHA, E.O.; CUNHA, L. C. S.; SILVA, FREITAS, T.; NASCIMENTO, E. A.; 

SILVA, L. O.; SILVA, C. H. G.; AQUINO, F, J. T.; CHANG, R.; MORAIS, S. A. L. 

Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of flowers from 

Banisteriopsis campestres (A. Juss.) Little. Revista Virtual de Química, v. 10, n. 5, p. 

1562-1577, 2018. 

 

2. SILVA, M. V. S. G.; SILVA, S. A.; TEIXEIRA, T. L.; OLIVEIRA, A.; MORAIS, A. 

L.; SILVA, C. V.; ESPINDOLA, L. S.; SOUSA, R. M. F. Essential oils from leaves os 

Eugenia calycina (Cambes): Natural larvicidal against Aedes aegypti. Journal of the 

Science of the food and agriculture, 2020. 

 

ARTIGOS SUBMETIDOS 

 

 

 

 

ARTIGOS EM ANDAMENTO 

 

1. SILVA, M. V. S. G.; SILVA, R. V.; LUSTOSA, M. C. G.; PURGATO, G. A.; VASO, 

C. O.; BILA, N. M.; ALMEIDA, A. M. F.; ALMEIDA, L. C.; GIANNINI, M. J. S. M.; 

DIAZ, M. A. N.; LOTUFO, L. V. C.; CASTRO-GAMBOA, I. Target analysis using 

UNIFI approach and identification of phytotoxins with anticâncer and antifungal 

properties of Tagetes patula endophytic fungi. Fungal Ecology. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

APRESENTAÇÃO DE TRABALHOS 

 

1. SILVA, M. V. S. G. A importância dos óleos essenciais. Escola Estadual Léa de Freitas 

Monteiro. (Apresentação oral/ Palestra (18 nov. 2021)). 

 

2. SILVA, M. V. S. G.; SILVA, S. A.; TEIXEIRA, T. L.; OLIVEIRA, A.; MORAIS, A. 

L.; SILVA, C. V.; ESPINDOLA, L. S.; SOUSA, R. M. F. Essential oils from leaves os 

Eugenia calycina (Cambes): Natural larvicidal against Aedes aegypti. 2nd International 

Conferente on Agriculture, Food Sciences and Aquaculture (Apresentação 

Oral/Congresso (22-23 nov. 2021)). 

 

3. SILVA, M. V. S. G. Minicurso de Produção de cerveja artesanal em casa. 52ª Semana 

da Química (Unesp de Araraquara). (Apresentação Oral/Feira (4 horas)). 

 

4. SILVA, M. V. S. G.; SILVA, S. A.; SOUSA, R. M. F.; OLIVEIRA, A.; MENDES, J; 

MORAIS, A. L.; SILVA, C. V.; ESPINDOLA, L. S. New sesquiterpenes isolated of 

essential oil from Eugenia calycina (Myrtaceae) and larvicidal activity against Aedes 

aegypti. 6th BCNP Brazilian Congress On Natural Products (Apresentação de 

trabalho/Congresso (05-08 nov. 2017)). 

 

5. Identificação dos constituintes voláteis do óleo essencial das folhas da espécie 

Banisteriopsis campestris (A. Juss). Little. XXIV Simpósio de Plantas Medicinais do 

Brasil. (Apresentação de trabalho/ Simpósio (2016)). 

 

6. Identificação da composição química da fase aquosa e oleosa da hidrodestilação do óleo 

essencial das folhas de Eugenia calycina Cambess (Myrtaceae). XXX Encontro 

Regional da Sociedade Brasileira de Química. (Apresentação de trabalho/Encontro 

(2016)). 

 

7. Adsorção de azul de metileno utilizando fibras de bagaço de cana de açúcar modificadas 

quimicamente. 52º Congresso Brasileiro de Química. (Apresentação de 

trabalho/Congresso (2012)).  

 

PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CONGRESSOS, EXPOSIÇÕES E FEIRAS 

1. Caravana Embrapa de Uberaba (07 de julho de 2022)/(Evento/4horas). 

2. Avaliador no Congresso de Iniciação Científica da Unesp do IQ/Araraquara (28 e 29 de 

outubro de 2021). 

3. Avaliador no Congresso de Iniciação Científica da Unesp do IQ/Araraquara (20, 21 e 22 

de outubro e 24 e 25 de novembro de 2020). 

4. 1º Workshop de Química de Microrganismos PROCAD-AM (17 de setembro de 2020 – 

8 horas). 

5. Curso HPLC sem mistério -Fundamentos de Cromatografia líquida para a Indústria 

farmacêutica (Prof. Miller Rufino). (Evento/8horas). 



 
 

6. Minicurso de Sequenciamento Sanger (Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Unesp 

de Araraquara). (Evento/2021) 

7. Microbiologia para Cervejeiros (Saccharobier). (Evento/2-5 nov.2020 – 8 horas). 

8. Minicurso de Produção de Fitocosméticos (UFV). (Evento/10 nov.2020 – 4 horas). 

9. 1º Workshop de Química de Microrganismos (PROCAD-AM). (Evento/17 set. 2020). 

10. I Semana de Bioquímica Aplicada (UFV). (Evento/09-13 nov.2020 – 12 horas). 

11. Minicurso “Ecologia microbiana: diversidade genética e funcional de fungos da 

decomposição vegetal”. IX Simpósio de Microbiologia Aplicada. Instituto de 

Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”), 2019, Rio 

Claro-SP. (Congresso/15-17 maio 2019). 

12. Semana Nacional da Ciência e Tecnologia (SNCT), 2018, Araraquara-SP. (Evento: 18-

20 outubro 2018). 

13. Semana Nacional da Ciência e Tecnologia (SNCT), 2018, São Pedro-SP. (Evento: 13-

15 agosto 2019). 

14. Adsorção de azul de metileno utilizando fibras de bagaço de cana de açúcar 

modificadas quimicamente. 4º Congresso da Rede Brasileira de Tecnologia de Biodiesel. 

(Exposição/Congresso (2012). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico esta tese a Deus. 

Á minha família em especial, 

aos meus pais Mário e Maria 

Eugênia. 

Aos meus irmãos Pedro 

Henrique (in memoriam) e 

Gustavo. 

A minha esposa Kamilla 

Soares. 

Nubbe. 

Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

AGRADECIMENTOS 

 Agradeço, 

à Deus. 

ao Prof. Ian por ter me aceitado como seu aluno de doutorado no NuBBe no Instituto de 

Química na Unesp de Araraquara. 

à bolsa de doutorado de 3 anos concedida pelo INCT BioNat, processo# 

88887.307549/2018-00. 

Aos técnicos de laboratório João Bronzel e a Juliana Rodrigues pelo apoio, treinamento 

e pelas orientações nas análises cromatográficas 

ao NuBBe. 

ao Nivaldo e a Sílvia pelas análises de RMN. 

aos professores do Nubbe, em especial ao Prof. Ian, Professor Alberto e a Prof. Vanderlan 

pelo carinho e companheirismo. 

a Dra. Leticia Lotufo e a Larissa Almeida do ICB-USP pelas análises de citotoxicidade. 

a Dra. Laila Espindola pelas análises larvicidas frente ao Aedes Aegypti. 

ao grupo de Pesquisa Castro-Gamboa Team 

as alunas de doutorado Carolina Vaso e Niura Madalena pelos ensaios antifúngicos e pela 

amizade. 

a Dra. Maria Eugênia da Embrapa pelos ensaios nematicidas, e por ser uma excelente mãe 

também. 

à minha família pelo apoio de sempre. 

à minha esposa Kamilla Soares pela resiliência, paciência e amor para a finalização desta 

tese. 

aos meus sócios Ítalo Félix, Gabriel Terra e Victor Giffoni. 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

RESUMO 

 Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde os tempos imemoriais, 

principalmente no alívio de dores e cura de doenças. A partir dos levantamentos 

etnofarmacológicos, as plantas medicinais começaram a ter respaldo científico influenciando a 

propagação do conhecimento químico. O surgimento de equipamentos e técnicas analíticas 

complexas proporcionou uma investigação metabólica completa dedicada à busca de alvos 

moleculares e de compostos biologicamente ativos. Neste sentido, este trabalho tem como alvo 

de estudo os fungos Alternaria sp. e Collectotrichum sp. isolados como organismos endofíticos 

das folhas e raízes de Tagetes patula, pertencente ao bioma Cerrado. Estas espécies de 

microrganismos produzem metabólitos de interesse farmacológico e também apresentam 

muitos estudos químicos. Desta forma, a partir de um estudo bioguiado foi utilizada a 

abordagem OSMAC (One Strain Many Compounds) para a verificação da diversidade 

metabólica destes endófitos. Foram investigadas as atividades nematicida, antifúngicos, 

antibacteriana e citotóxica dos extratos destes microrganismos. Foram verificadas 

concentrações inibitórias mínimas (MIC) de 125 e 62,5 µg.mL-1 para os extratos dos endófitos 

frente a Candida albicans, e uma inibição de 92% e 99% frente às células HCT-116, referente 

à Collectotrichum sp. e Alternaria sp., respectivamente. Para o co-cultivo destes microrganimos 

foi constatado forte atividade antifúngica com MIC’s entre 15,6 a 31,25 µg.mL-1 frente aos 

patógenos dos gêneros Tricophyton e Cryptococcus e atividade anticâncer com inibição celular 

superior a 98%. Neste sentido, foram utilizadas ferramentas do estado da arte como 

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC/MS), cromatografia líquida de 

alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD), cromatografia líquida 

de alta performance acoplada ao detector de tempo de vôo. (UPLC-qTOF-MS) e ressonância 

magnética nuclear (RMN). Em posse destes dados, foi empregada a análise na Plataforma 

Científica da Waters (UNIFI), e, foram anotados 35 metabólitos. Através do fracionamento 

utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência de média pressão (MPLC-DAD) 

juntamente com o auxílio do Dionex-DAD, do UPLC/qTof-MS e dos experimentos de RMN 

foi proposta uma estrutura denominada 1,2,3,4-tetrahidro-5-hidróxinaftaleno-1-carbaldeído. 

Esta substância ainda não havia sido relatada em um fungo endofítico ou em plantas, e não 

existem estudos a respeito da sua biossíntese. Desta forma, pode-se dizer que as técnicas 

analíticas utilizadas neste estudo bioguiado foram essenciais para a determinação estrutural da 

estrutura proposta, bem como na identificação dos metabólitos secundários produzidos pelos 

endófitos. 

 



 
 

Palavras-chave: fungos endofíticos, cromatografia líquida de alta eficiência, Candida 

albicans, espectrometria de massas, antifúngicos. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

ABSTRACT 

 

Natural products have been used by mankind since morial times, and they are used not 

immemorial for diseases and curing diseases. From the surveys, medicinal plants began to 

influence research and chemical knowledge. The study of molecular equipment and specific 

molecular analysis of comprehensive research of fully integrated molecular equipment and 

molecular research. In this sense, this work aims to study the fungi Alternaria sp. and 

Collectotrichum sp. isolated as endophytes from the leaves and roots of Tagetes patula, 

belonging to the Cerrado biome. Species of microscopic microorganisms are also the 

metabolites of chemical interest and present many chemical studies. Thus, a bioguided study 

used the OSMAC (One Strain Many Compounds) approach to verify the metabolic diversity 

(endophytes). The nematicidal, antifungals, antibacterial and cytotoxic activities of the extracts 

were investigated. Minimum inhibirory concentrations (MIC) of 125 and 62,5 µg.mL-1 were 

verified for the endophyte extracts against Candida albicans, and a inhibition of 92% and 99% 

against HCT-116 cells, referring to Collectotrichum sp. and Alternaria sp., respectively. For 

the co-cultivation of these microrganisms, Strong antifungal activity was found with MIC’s 

range 15,6 and 31,25 µg.mL-1 against pathogens Tricophyton and Cryptococcus genera and 

anticâncer activity with cell growth greater than 98%. In this sense, use state-of-the-art tools 

such as gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS), high performance liquid 

chromatography coupled to a diode array detector (HPLC-DAD), high performance liquid 

chromatography coupled to the detector of flight time. (UPLC/Qtof-MS) and nuclear magnetic 

resonance (NMR). In possession of these data, analysis was performed on the Waters Scientific 

Platform (UNIFI), and 35 metabolites were recorded. Through the fractionation using in 

pressure media high performance liquid chromatography (MPLC-DAD) and other techniques 

such as Dionex-DAD, UPLC/qTof-MS and NMR experiments was proposed a structure named 

1,2,3,4-tetrahydro-5-hydroxinaphtalene-1-carbaldehyde. This substance had not been reported 

in na endophytic fungus or in plants, and there are no studies about its biosynthesis. Thus, it 

can be said that the analytical techniques used in this bioguided study were essential for the 

structural determination of the proposed structure, as well as the identifcation of secondary 

metabolites produced by endophytes. 

 

 



 
 

Keywords: endophytic fungi, high performance liquid chromatography, Candida albicans, 

mass spectrometry, antifungals. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE ABREVIATURAS 

 

RMN Ressonância Magnética Nuclear 

UPLC/qTOF-MS Cromatografia líquida de ultra eficiência com 

detector de tempo de vôo acoplado ao 

espectrômetro de massas 

GC/MS Cromatografia gasosa acoplada à 

espectrometria de massas 

HPLC-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência 

acoplada ao detector de arranjo de diodos 

MPLC-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência e 

média pressão acoplada ao detector de 

arranjo de diodos 

OSAAC One Many Strain Compound 

GMD Golm Metabolome Database 

ESI Ionização por eletrospray 

MSE Energia de colisão no modo MS 

BDA Batata Dextrose Ágar 

UV/VIS Espectro da região Ultra violeta e do Visível 

CL50 Concentração letal para inibir 50% do 

crescimento do patógeno 

IS Índice de seletividade 

IC50 Índice citotóxico para inibir 50% da 

viabilidade celular 

ITZ Itraconazol 

FLZ Fluconazol 

CLSI Chemical Laboratory Standards Institute 

MH Mueller Hinton 

DMSO Dimetilsulfóxido 

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium 

MTT Tetrazólio de metil tiazol 

FBS Soro fetal bovino 



 
 

NIST Nacional Institute Standards and Technology 

MIC Concentração inibitória mínima 

SEM 

CoA 

AADC 

FAZ 

FAR 

P 

ATA 

FMO 

ICS 

HS 

MD 

FR 

SD 

GLOX 

FAL 

TD 

TO 

R 

AAT 

AT 

FH 

LO 

HL 

OR 

β-CAASe 

9M 

13M 

CCM 

9CZ 

Desvio Padrão 

Coenzima A 

Aminoácido carboxilase aromática 

Fenil acetato sintase 

Fenil acetaldeido redutase 

Fosfato 

Amino Transferase Aromática 

Monooxigenase flavina 

Isocorismato sintase 

Hidroxilase salicílica 

Malato desidrogenase 

Fumarato redutase 

Succinato desidrogenase 

Glioxima oxidase 

Fenilananina amônia sintase 

Tirosina descarboxilase 

Tirosina oxidase 

Redutase 

Ácido aminotransferase 

Amino transferase 

Floretina hidrolase 

Lipooxigenase 

Hidroperóxido liase 

Oxirredutase 

β-ceto acil acil sintase 

Collectotrichum sp. cultivado em malte 

Alternaria sp. cultivado em malte 

Co-cultivo em malte 

Collectotrichum sp. em Czapek 



 
 

13CZ 

CCCZ 

9A 

13A 

CCA 

RM 

 

AE 

H/I (6:4) 

 

Alternaria sp. em Czapek 

Co-cultivo em Czapek 

Collectotrichum sp. em arroz parbolizado 

Alternaria sp. em arroz parbolizado 

Co-cultivo em arroz parbolizado 

Microrganismo isolado da raiz e cultivado 

em malte 

Extração com Acetato de etila 

Extração com Hexano/Isopropanol (6:4) 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE FIGURAS 

Figura 1. Estrutura da penicilina................................................................................................26 

Figura 2. Estruturas de metabólitos secundários de isolados de fungos endofíticos...................27 

Figura 3. Foto da espécie Tagetes patula. .................................................................................32 

Figura 4. Estrutura da Tagetona A e Tagetona B.......................................................................33 

Figura 5. Foto de trás e da frente da placa de Petri com Collectotrichum sp. .............................35 

Figura 6. Foto de trás e da frente da placa de Petri com Alternaria sp. .......................................36 

Figura 7. Obtenção dos dados e desenvolvimento da metodologia no UNIFI..........................40 

Figura 8. Parte da planta selada com vela. .................................................................................43 

Figura 9. Imersão em NaClO 1% e etanol. ................................................................................44 

Figura 10. Imersão nas águas de lavagem.................................................................................44 

Figura 11. Parte de interesse da planta cortada em placa de Petri. .............................................44 

Figura 12. Parte de interesse da planta disposta em placa de Petri. ...........................................45 

Figura 13. Crescimento dos endófitos em placa de Petri. ..........................................................45 

Figura 14. Repique dos endófitos. ............................................................................................45 

Figura 15. Estrias realizadas nos endófitos. ..............................................................................46 

Figura 16. Foto da parte de baixo e de cima da placa de petri com as linhagens puras dos 

endófitos das folhas (10) e da raiz (1) de Tagetes patula. ..........................................................59 

Figura 17. Teste de viabilidade celular com células HepG2. .....................................................63 

Figura 18. Ensaio de viabilidade frente as células HCT-116. ....................................................65 

Figura 19. Cromatograma do meio líquido de malte sem o inóculo de microrganismos..........66 

Figura 20. Estrutura química do maltol. ...................................................................................66 

Figura 21. Espectro de massas do maltol...................................................................................67 

Figura 22. Fragmentações propostas para o maltol....................................................................67 

Figura 23. Cromatograma do endófito Alternaria sp. em meio líquido de malte......................68 

Figura 24. Estruturas dos metabólitos de Alternaria sp. no meio líquido de malte.....................69 

Figura 25. Espectro de massas do 2-pentanol. ..........................................................................69 

Figura 26. Fragmentações propostas para o 2-pentanol. ...........................................................70 

Figura 27. Biossíntese do 2-pentanol. .......................................................................................71 

Figura 28. Espectro de massas do álcool feniletílico. ................................................................71 

Figura 29. Fragmentações propostas para álcool 2-feniletilico. ................................................72 



 
 

Figura 30. Biossíntese do álcool 2-feniletilico...........................................................................73 

Figura 31. Espectro de massas do D-galactose-2,3,4,5,6-pentaquis(ol). ...................................73 

Figura 32. Fragmentações propostas para a D-galactose...........................................................73 

Figura 33. Espectro de massas da octadecenamida. ..................................................................74 

Figura 34. Propostas de fragmentação da octadecenamida........................................................74 

Figura 35. Biossíntese da octadecenamida................................................................................75 

Figura 36. Cromatograma do endófito Collectotrichum sp. cultivado no meio líquido de 

malte..........................................................................................................................................76

Figura 37. Estruturas dos metabólitos produzidos pelo fungo Collectotrichum sp. no meio de 

malte..........................................................................................................................................77 

Figura 38. Espectro de massas do ácido lático..........................................................................78 

Figura 39. Propostas de fragmentação do ácido lático. .............................................................78 

Figura 40. Biossíntese do ácido lático........................................................................................79 

Figura 41. Espectro de massas do glicerol.................................................................................79 

Figura 42. Fragmentações propostas para o glicerol..................................................................80 

Figura 43. Biossíntese do glicerol..............................................................................................81 

Figura 44. Espectro de massas do ácido fenilacético..................................................................81 

Figura 45. Fragmentações propostas para o ácido fenilacético.................................................82 

Figura 46. Biossíntese do ácido fenilacético..............................................................................83 

Figura 47. Espectro de massas do catecol..................................................................................83 

Figura 48. Fragmentações propostas do catecol.........................................................................83 

Figura 49. Biossíntese do catecol...............................................................................................84 

Figura 50. Espectro de massas do ácido butanodióico..............................................................84 

Figura 51. Fragmentações propostas para o ácido butanodióico................................................85 

Figura 52. Biossíntese do ácido butanodióico...........................................................................86 

Figura 53. Espectro de massas do ácido glicérico......................................................................86 

Figura 54. Fragmentações propostas do ácido glicérico.............................................................86 

Figura 55. Biossíntese do ácido glicérico...................................................................................87 

Figura 56. Espectro de massas do ácido benzopropanóico.........................................................88 

Figura 57. Fragmentações propostas para o ácido benzopropanóico.........................................88 

Figura 58. Biossíntese do ácido benzopropanóico.....................................................................89 

Figura 59. Espectro de massas do ácido 3,4-hidróxibutanóico...................................................90 



 
 

Figura 60. Propostas de fragmentação para o ácido 3,4-hidróxibutanóico.................................90 

Figura 61. Biossíntese do ácido 3,4-hidróxibutanóico...............................................................91 

Figura 62. Espectro de massas do tirosol...................................................................................91 

Figura 63. Propostas de fragmentação para o tirosol..................................................................92 

Figura 64. Biossíntese do tirosol................................................................................................93 

Figura 65. Espectro de massas do ácido 3-fenil lático................................................................93 

Figura 66. Propostas de fragmentação ácido 3-fenil lático.........................................................94 

Figura 67. Biossíntese do ácido 3-fenil lático............................................................................95 

Figura 68. Espectro de massas do ácido 4-hidróxi benzenoacético............................................95 

Figura 69. Propostas de fragmentação ácido 4-hidróxi benzenoacético.....................................96 

Figura 70. Biossíntese do ácido 4-hidróxi benzenoacético........................................................97 

Figura 71. Espectro de massa do ácido florético........................................................................97 

Figura 72. Propostas de fragmentação para o ácido florético...................................................98 

Figura 73. Biossíntese do ácido florético..................................................................................99 

Figura 74. Espectro de massas do ácido azeláico.....................................................................100 

Figura 75. Fragmentações propostas para o ácido azeláico......................................................100 

Figura 76. Biossíntese do ácido azeláico..................................................................................101 

Figura 77. Espectro de massas do 3- benzilhexapirrol-1,2-pirazina-1,4-diona........................102 

Figura 78. Fragmentações propostas para o 3- benzilhexapirrol-1,2-pirazina-1,4-diona.........102 

Figura 79. Biossíntese do 3- benzilhexapirrol-1,2-pirazina-1,4-diona.....................................102 

Figura 80. Cromatograma do co-cultivo dos microrganismos no meio líquido de malte.........103 

Figura 81. Estruturas químicas do endófito Alternaria sp........................................................105 

Figura 82. Fragmentações propostas para o 3-3metil-3-epiradicinol.......................................106 

Figura 83. Fragmentações propostas para a 7-dehidrobrefeldina A.........................................107 

Figura 84. Estruturas químicas do endófito Collectotrichum sp..............................................109 

Figura 85. Fragmentações propostas para o altenueno.............................................................110 

Figura 86. Fragmentações propostas para a coletofragarona A1..............................................111 

Figura 87. Estruturas químicas do co-cultivo dos endófitos Collectotrichum sp. e Alternaria 

sp.............................................................................................................................................112 

Figura 88. Fragmentações propostas para a altenina................................................................113 

Figura 89. Cromatograma do endófito Collectotrichum sp. utilizando a fase móvel ACN.H2O 

(5-70%)/55min (1ml.min-1) ....................................................................................................113 



 
 

Figura 90. Cromatograma do endófito Alternaria sp. utilizando a fase móvel ACN.H2O (5-

47%)/40min (1ml.min-1) .........................................................................................................114 

Figura 91. Cromatograma do co-cultivos dos endófitos utilizando a fase móvel ACN.H2O (5-

100%)/45min (1ml.min-1) .......................................................................................................114 

Figura 92. Fracionamento no MPLC-DAD do endófito Alternaria sp. cultivado no meio líquido 

de malte...................................................................................................................................115 

Figura 93. Cromatograma da Fração 27 obtida no Dionex-DAD.............................................115 

Figura 94. Espectro de massas da Fração 27............................................................................116 

Figura 95. Estrutura proposta do 1,2,3,4-tetrahidro-5-hidróxinaftaleno-1-

carbaldeído..............................................................................................................................116 

Figura 96. Espectro de massas do 1,2,3,4-tetrahidro-5-hidróxinaftaleno-1-carbaldeído 

.................................................................................................................................................117 

Figura 97. Fragmentações propostas para o 1,2,3,4-tetrahidro-5-hidróxinaftaleno-1-

carbaldeído..............................................................................................................................118 

Figura 98. Espectro de RMN de 1H (CD3OD, 600 MHz).......................................................120 

Figura 99. Espectro de RMN de DEPTQ (CD3OD, 600 MHz)..............................................120 

Figura 100. Espectro de RMN de HSQC (CD3OD, 600 MHz)................................................121 

Figura 101. Espectro de RMN de HSQC (CD3OD, 600 MHz)...............................................122 

Figura 102. Espectro de RMN de HMBC (CD3OD, 600 MHz)...............................................122 

Figura 103. Correlação do espectro de HMBC........................................................................123 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE TABELAS 

 

Tabela 1. Exemplos de antibióticos de origem microbiana........................................................26 

Tabela 2. Metabólitos isolados de fungos endofíticos e suas plantas hospedeiras .....................29 

Tabela 3. Atividades biológicas dos fungos endofíticos isolados de plantas............................30 

Tabela 4. Massas dos extratos obtidos após a extração com acetato de etila e hexano/isopropanol 

(6:4), e atividade frente a C. albicans........................................................................................60 

Tabela 5. Bioatividades após a aplicação da abordagem OSMAC...........................................62 

Tabela 6. Índices de seletividade calculados para os extratos dos microrganismos 9M, 13M e 

CCM..........................................................................................................................................63 

Tabela 7. Testes de viabilidade frente a células HT-29..............................................................64 

Tabela 8. Compostos voláteis identificados no endófito Alternaria sp......................................68 

Tabela 9. Compostos voláteis identificados no endófito Collectotrichum sp............................76 

Tabela 10. Compostos anotados para o endófito Alternaria sp. ESI +.....................................104 

Tabela 11. Compostos anotados para o endófito Collectotrichum sp. ESI +............................108 

Tabela 12. Compostos anotados para o co-cultivo dos endófitos Collectotrichum sp. e 

Alternaria sp. ESI +.................................................................................................................111 

Tabela 13. Elucidação estrutural da substância proposta 1,2,3,4-tetrahidro-5-hidróxinaftaleno-

1-carbaldeído...........................................................................................................................119 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE ESQUEMAS 

 

Esquema 1. Esquema para a obtenção dos extratos dos fungos cultivados em pequena 

escala.........................................................................................................................................47 

Esquema 2. Sequenciamento Sanger dos endófitos selecionados..............................................48 

Esquema 3. Cultivo no meio de Arroz parbolizado....................................................................48 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE APÊNDICES 

 

Apêndice 1 - Levantamento bibliográfico (em inglês) dos compostos produzidos por 

Collectotrichum sp..................................................................................................................138 

Apêndice 2 - Levantamento bibliográfico (em inglês) dos compostos produzidos por Alternaria 

sp.............................................................................................................................................142 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

SUMÁRIO 

1.0 INTRODUÇÃO.................................................................................................................25 

1.1 Produtos naturais de plantas e a importância dos microrganismos endofíticos............25 

1.2 Fungos endofíticos.............................................................................................................28 

1.3 Espécies Tagetes.................................................................................................................32 

1.4 Tagetes patula....................................................................................................................33 

1.5 Espécies de fungos endofíticos estudados: Alternaria sp. e Collectotrichum sp.............34 

1.6 Utilização de ferramentas do estado da arte na caracterização de metabólitos 

secundários..............................................................................................................................38 

2.0 OBJETIVO........................................................................................................................42 

2.1 Objetivos gerais..................................................................................................................42 

2.2 Objetivos específicos..........................................................................................................42 

3.0 Procedimento experimental..............................................................................................43 

3.1 Seleção e coleta da espécie vegetal.....................................................................................43 

3.2 Obtenção e cultivo do endófito..........................................................................................43 

3.3 Cultivo dos fungos em escala analítica no meio líquido de malte...................................46 

3.4 Identificação dos fungos endofíticos enviados ao Sequencimento Sanger.....................49 

3.4.1 Extração do DNA............................................................................................................49 

3.4.2 Amplificação do DNA.....................................................................................................49 

3.4.3 Reações de Sequenciamento..........................................................................................50 

3.4.4 Análise dos resultados....................................................................................................50 

3.5 Ensaio nematicida/nematostático.....................................................................................50 

3.5.1 Multiplicação e extração de Meloidogyne incognita.....................................................50 

3.5.2 Ensaio de mortalidade de J2..........................................................................................51 

3.6 Avaliação da atividade larvicida.......................................................................................51 

3.7 Cepas e condições de cultivo para o gênero Candida.......................................................52 

3.7.1 Ensaio de susceptibilidade para as leveduras...............................................................52 

3.7.2 Ensaio de susceptibilidade para os fungos filamentosos..............................................53 

3.8 Atividade citotóxica frente as células HepG2, HT-29 e HCT-116........................54 

3.9 Atividade antibacteriana frente a Enterobcater ATCC 29004 e Citrobacter 

freundii.....................................................................................................................................55 

3.10 Estudos químicos.............................................................................................................56 



 
 

3.10.1 Análise por Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-

EM)...........................................................................................................................................56 

3.10.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado ao detector de 

arranjo de diodos HPLC-DAD e MPLC-DAD......................................................................57 

3.10.3 LC/MS-qTOF................................................................................................................57 

3.10.4 Análise de Ressonância Magnética Nuclear...............................................................57 

3.10.5 Análise de dados no UNIFI..........................................................................................57 

4.0 Resultados e discussão.......................................................................................................59 

4.1 Isolamento dos microrganismos e screening de atividades biológicas...........................59 

4.2 Análise dos extratos por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas 

(GC/MS)...................................................................................................................................65 

4.2.1 Cromatograma do meio de cultivo de malte (branco).................................................66 

4.2.2 Cromatograma do endófito Alternaria sp. no meio líquido de malte.........................67 

4.2.3 Cromatograma do endófito Collectotrichum sp. no meio líquido de malte...............76 

4.2.4 Cromatograma do co-cultivo dos microrganismos em meio de malte......................103 

4.2.5 Plataforma Científica da Waters – UNIFI..................................................................104 

4.2.6 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD e MPLC-DAD)...................104 

5.0 Conclusões........................................................................................................................124 

6.0 Referências Bibliográficas..............................................................................................125



25 

 

1.0 INTRODUÇÃO 

 

1.1 Produtos naturais de plantas e a importância dos microorganismos endofíticos 

Os produtos naturais têm sido utilizados pelos homens há muitos anos, e o alívio e a 

cura de determinadas doenças foram as primeiras propostas da utilização de produtos naturais 

na medicina. A história das civilizações ocidental e oriental são exemplos da utilização destes 

produtos naturais. O principal exemplo da utilização dos produtos naturais na cura de doenças, 

foi na medicina tradicional chinesa. Dessa forma, surge a importância da realização de um 

estudo científico aliado à descoberta de novos ativos químicos (VIEGAS JR. & BOLZANI, 

2006). 

Guiada pela química, cada vez mais fomentada pela farmacologia, a pesquisa de 

medicamentos contribuiu muito para o progresso da medicina durante o século passado. A 

biologia molecular teve um impacto profundo na descoberta de novos medicamentos. A ciência 

genômica, aliada as ferramentas de bioinformática, permitiram determinar a base genética de 

doenças multifatoriais e definir mais precisamente os pontos de ataque adequados para o 

desenho de futuros medicamentos, aumentando assim o número de opções de tratamento. Este 

intenso avanço na pesquisa sobre moléculas bioativas estabeleceu uma relação entre a academia 

e as empresas farmacêuticas reforçando as mudanças na base institucional (DREWS, 2000). 

As doenças causadas por microrganismos patogênicos como vírus, bactérias e fungos 

afetam uma parcela significativa da população mundial, principalmente devido a questão 

socioeconômica nos países em desenvolvimento. Os expressivos avanços na química e biologia 

e a compreensão das vias bioquímicas e alvos moleculares permitiram a descoberta de 

inovações terapêuticas notáveis, proporcionando melhorias de vida significativa de muitas 

populações do mundo (GUIDO, ANDRICOPULO & OLIVA, 2010). 

No que diz respeito a descoberta de novas drogas com relação a complexidade, 

diversidade química e as propriedades biológicas, os produtos naturais desempenharam um 

papel importante e decisivo no desenvolvimento de novos medicamentos. Desta forma, foi 

possível introduzir novas técnicas de bioensaios, métodos de biotecnologia, estudos de fito-

química bio-guiados e métodos de análise analítica de alto desempenho (VIEGAS JR. & 

BOLZANI, 2006). 

Dentre os produtos microbianos fabricados comercialmente, os antibióticos estão entre 

os mais importantes. Cerca de 7.000 antibióticos são conhecidos, sendo a penicilina (Figura 1) 

o primeiro metabólito descoberto para tratar infecções (AWAD et al., 2012). Este composto, 



26 

 

marcou a idade de ouro dos antibióticos. A partir deste foi possível investigar outras infestações 

parasitárias bem como agentes anticâncer (DEMAIN, 1999). 

 

Figura 1. Estrutura da penicilina 

N

S

O

OH

H
N

O

HN

O

                           

Fonte: Retirado de Barreiro, 2009. 

 

A ação seletiva exercida sobre bactérias patogênicas e fungos por metabólitos 

microbianos secundários proporcionou a origem de outros antibióticos como cefalosporinas, 

tetraciclinas, aminoglicosídeos, clorafenicol e macrolídeos, dentre outros (DEMAIN, 1999), 

como mostrado na Tabela 1. 

 

Tabela 1. Exemplos de antibióticos de origem microbiana 

Metabólito Produto comercial Microrganismo produtor 

Penicilina Penicilina G, 

Meticilina, 

Amoxilina 

Penicillium spp., Aspergillus spp. 

Cefalosporina Ceclor, Ceftin Emericellopsis spp., Streptomyces clavuligerus 

Eritromicina Erythrocin Saccharopolyspora erythraera 

Fosfomicina Monuril Streptomyces fradiae 

Ácido fusídico Fusidin Leo Fusidium griseum 

Daptomicina Cubicin Streptomyces roseosporus 

Adaptado de DEMAIN, 1999. 



27 

 

Muitas pesquisas apontam que organismos endofíticos são uma nova e potencial fonte 

de produtos naturais para a exploração na medicina moderna, na agricultura e na indústria. A 

triagem de compostos antimicrobianos de endófitos é uma maneira promissora de se superar a 

crescente ameaça de cepas resistentes. Estes metabólitos pertencem a diversas classes 

estruturais que incluem terpenoides, fenóis, quinonas, alcaloides, peptídeos e esteroides (YU et 

al., 2010). Os principais exemplos de metabólitos de interesse biotecnológico (Figura 2) 

incluem a penicilina, β-lactamas e as lovastatinas (BORUTA, 2017). 

 

Figura 2. Estruturas de metabólitos secundários de isolados de fungos endofíticos. 

O

O

OH

NHO

OO

O

OH

O

O

O

H

O
OH

O

Taxol

O

OOH

O OH

OH

OH

OH

Altersolanol

O

N

HNN

NH

N

HN

HN

O

NH

O

O

Beauvericina

OHOH O

OH OHO

OH

OH

Hiperina

 

Fonte: Adaptado de Silva, 2014. 

 

 

 

 



28 

 

1.2 Fungos endofíticos 

 

Fungos endofíticos são considerados mutualistas de plantas e que vivem no interior de 

seus tecidos assintomaticamente. Eles recebem nutrição e proteção da planta hospedeira, 

enquanto a mesma pode se beneficiar de habilidades competitivas aprimoradas as quais incluem 

resistência a herbívoros, patógenos e outros tipos de stress abióticos. Estas evidências também 

indicam que os endófitos podem influenciar a dinâmica de populações como a diversidade da 

comunidade de plantas e as funções de um ecossistema (SAIKKONEN et al., 1998). 

As plantas e os fungos são fontes ricas de milhares de metabólitos secundários. As 

múltiplas possibilidades de codificação genética para a produção destes determinam o tipo de 

interação entre a planta e o endófito bem como a patogenicidade (PUSZTAHELIY, HOLB & 

PÓCSI, 2015)  

O número de endófitos isolados de uma espécie hospedeira é geralmente grande, porém 

poucas cepas são dominantes. Estes fungos produzem enzimas para a colonização dos tecidos 

vegetais e a quantidade de metabólitos produzida são significativamente afetadas por condições 

específicas do local (Tabela 2) (ZHAO et al., 2011). 

Estes endófitos podem produzir uma infinidade de substâncias que podem ser utilizadas 

na medicina moderna, agricultura e indústria. Novos antibióticos, antimicóticos, 

imunossupressores e compostos anticâncer foram encontrados após o isolamento, cultura, 

purificação e caracterização destes fungos. As perspectivas em potencial de se encontrar novas 

drogas que possam ser candidatas efetivas ao tratamento de novas doenças nos seres humanos, 

plantas e animais são promissoras (STROBEL, DAISY & CASTILLO, 2015). 

Um produto natural diterpenoide conhecido como Taxol® surgiu como uma droga no 

combate a múltiplas formas de câncer com ação e eficácia comprovada (HAO; PAN & 

ZHU,2013). Inicialmente, a única fonte deste composto era a casca de Taxus brevifolia, no 

entanto, o Taxol® é um metabólito formado de teixos de árvores diferentes e em pequenas 

quantidades. Todo o procedimento de isolamento desta substância foi um processo árduo e 

obteve-se um rendimento de 1kg de substância pura a partir de 10 toneladas de cascas de T. 

brevifolia. Isso significa que 3000 árvores deveriam ser cortadas para realizar-se tal feito. É de 

suma importância destacar que 1kg de Taxol® é suficiente somente para 500 pacientes e esta é 

uma das árvores que apresenta um dos crescimentos mais lentos do mundo (ZWAWIAK & 

ZAPRUTKO, 2014). A produção industrial atual do fármaco por semi-síntese com a extração 

de precursores de Taxol® dos teixos das árvores não são suficientes para atender a demanda do 



29 

 

mercado. Sendo assim, uma das alternativas utilizadas é a fermentação fúngica para a produção 

deste metabólito (HAO, PAN & ZHU,2013). Na literatura são descritos outros compostos como 

a lignana podofilotoxina, que é precursora de drogas anticâncer clinicamente úteis 

(EYEBERGER, DONDAPATI & PORTER, 2006). 

Os fungos são utilizados industrialmente para produzir medicamentos de alto valor 

agregado como imunossupressores, alcaloides, antibióticos e estatinas. A lovastatina e a 

compactina são estatinas naturais produzidas por espécies de Aspergillus e Penicillium, 

seguindo uma via de policetídeos. A lovastatina foi umas das primeiras drogas redutoras do 

colesterol e ainda é utilizada para a produção da sinvastatina. Esta última além de ter a mesma 

ação de sua precursora trata vários tipos de distúrbios como doenças degenerativas e câncer 

(SUBHAN, FARYAL & MACREADIE, 2017). 

As estatinas também demostraram seu potencial antifúngico frente a outras cepas 

filamentosas e isto indica seu potencial na aplicação na combinação com outras drogas no 

tratamento destas doenças. Essas combinações sinérgicas estabelecem uma base para uma nova 

terapia com segurança aplicável (GALGÓCZY et al., 2011). 

 

Tabela 2. Metabólitos isolados de fungos endofíticos e suas plantas hospedeiras. 

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabólito secundário 

Acremonium sp. Huperzia serrata Huperzina A 

Alternaria sp. Catharanthus roseus Vinblastina 

Aspergillus fumigatus Davidia involucrata Flavonoides 

Fusarium oxysporum Catharanthus roseus Vincristina 

Metarhizium anisopliae Taxus chinensis Paclitaxel 

Rhizopus oryzae Iris germanica α-irona 

Fonte: Adaptado de ZHAO et al., 2011. 

 

A diversidade de espécies de fungos e a diversificação de aglomerados de genes 

biossintéticos ressaltam um potencial quase ilimitado de variação metabólica e um recurso 

inexplorado para a descoberta de novos produtos naturais. Grande parte do sucesso ecológico 

de fungos filamentosos se deve à sua capacidade de implantar seus metabólitos secundários de 

acordo com seu modo de vida penetrativo. Estes compostos exibem atividades biológicas que 

foram desenvolvidos em medicamentos e agroquímicos que salvam vidas (BILLS & GLOER, 

2016). 



30 

 

O estudo das interações planta-endófito e endófito-endófito fornece informações sobre 

mutualismo e produção de metabólitos secundários que ajudam a planta hospedeira a resistir ao 

estresse biótico e abiótico. Estes microrganismos podem ser membros dos filos Ascomiceta, 

Basidiomiceta, Zigomiceta e Oomiceta (RAJAMANIKYAM et al., 2017).  

Os metabólitos secundários obtidos a partir destes organismos representam potenciais 

fontes de compostos bioativos, em função da marcante diversidade química, sendo sua atividade 

relacionada a mecanismos de adaptação e/ou defesa desenvolvidos pelo organismo produtor 

(PEREIRA et al., 2017). 

Grande parte das informações disponíveis na literatura dão enfoque a patologia e as 

interações com os hospedeiros destes fungos, com poucos estudos relacionados a aplicação em 

indústrias ou em processos de biotransformação, sendo organismos com bastante potencial, mas 

muito pouco explorado ainda (JAYAWARDENA et al., 2016). 

As propriedades antibióticas de extratos orgânicos obtidos de diferentes endófitos com 

a perspesctiva de encontrar microrganismos que são produtores de novos compostos bioativos 

foram avaliados nas últimas décadas, comprovando seu potencial para o desenvolvimento de 

protótipos que podem ser utilizados pela indústria farmacêutica (Tabela 3) (MARTINEZ-

KLIMOVA, RODRÍGUEZ-PEÑA & SÁNCHEZ, 2017). 

 

Tabela 3. Atividades biológicas dos fungos endofíticos isolados de plantas. 

Espécie da 

planta 

Endófito Composto 

isolado 

produzido 

Atividade contra Referência 

 

Viguiera 

arenaria 

Diaporthe 

phaseolorum 

e 

Phomopsis sp 

 Trypanosoma 

Cruzi e 

Leishmania 

tarentolae 

Guimarães et al., 

2008. 

 

Vitex  

negundo 

 

Colletotrichum 

gloeosporioides 

  

S. aureus, B. 

subtillis, E. coli, 

P. aeruginosa 

 

Arivudainambi 

et al.,2011. 

  

 

   

 



31 

 

Aegiceras 

corniculatum, 

Avicennia 

alba, 

Avicennia 

officinalis 

 

 Diaporthe sp., 

Hypoxylon sp., 

Pestalotiopsis sp., 

Phomopsis sp., 

e Xylaria sp. 

ATCC25923 

MRSA-SK1, M. 

gypseum, C. 

neoformans, 

C. albicans e P. 

aeruginosa 

Buatong, 

Rukashaisirikul 

& Sakayroj, 

2011. 

Buatong, 

Rukashaisirikul 

& Sakayroj, 

2011. 

 

 

 

Aquilaria 

sinensis 

 

 

Fusarium equiseti, 

Phaeoacremonium 

rubrigenum, 

Fusarium 

avenaceum e 

Phaeoacremonium 

rubrigenum 

 

 

 

 

 

S. aureus, 

E. coli, B. 

subtilis, A. 

fumigatus 

 

 

 

Cui, Guo & 

Xiao   2011. 

Phleum 

pratense 

Epichloe typhina Epichlicin germinação de 

esporos de C. 

phlei 

Seto et al., 2007. 

     

Catunaregam 

tomentosa 

Curvularia 

geniculata 

Curvularídeo B C. albicans Chomcheon et 

al., 2010. 

Fonte: O autor. 

Dessa forma, estudos científicos recentes têm sido voltados para a bioprospecção de 

metabólitos secundários dos microrganismos com especial ênfase na pesquisa de agentes 

antimicrobianos naturais produzidos pelos fungos endofíticos (MARTINEZ-KLIMOVA, 

RODRÍGUEZ-PEÑA & SÁNCHEZ, 2017). 

Entre as aplicações biotecnológicas conhecidas, destacam-se a produção de herbicidas, 

para o controle de ervas daninhas, controle de insetos, produção e liberação de toxinas, 

síntese de moléculas orgânicas, processos de biotransformação e a produção de metabólitos 

secundários com propriedades farmacológicas (JAYAWARDENA et al., 2016). 

Conclusão 



32 

 

Neste sentido, este trabalho visa estudar os microrganismos endofíticos de Tagetes 

patula, bem como realizar sua identificação através do Sequenciamento de Sanger, 

prospecção metabólica frente as análises espectroscópicas e espectrométricas e ensaios in 

vitro para a verificação de suas bioatividades. 

 

1.3 Espécies Tagetes 

 

O gênero Tagetes compreende cerca de 50 espécies de plantas herbáceas anuais e 

perenes. É encontrada no México e em outras partes de clima quente na América. Estas plantas 

podem atingir até 20 cm de altura (ISMAIL, 2017). 

As espécies Tagetes (Figura 3) são pertencentes a família Asteraceae são usadas em 

diferentes áreas como preparação de cosméticos, medicamentos e ornamentais. São encontradas 

em diferentes cores e fragrâncias, e, sendo que a mais comum delas é amarela. A luteína é um 

oxicarotenoide comum encontrado nas flores deste gênero. As folhas são relatadas por serem 

eficazes no combate as hemorroidas, problemas renais, dores musculares, úlceras e feridas. A 

flor é útil em febres, ataques epilépticos, adstringentes, sarna, queixas do fígado e estômago, e, 

doença nos olhos (PRIYANKA, SHALINI & NAVNEET, 2013). 

 

Figura 3. Foto da espécie Tagetes patula. 

 

Fonte: O autor. 

 



33 

 

Nas flores deste gênero já foram isolados dois diterpenoides com atividade nematicida 

comprovada conhecidos como Tagetona A e Tagetona B (Figura 4) (IBRAHIM & 

MOHAMED, 2017). 

Figura 4. Estrutura da Tagetona A e Tagetona B. 

O

O

O
O

O

HO

 

Fonte: IBRAHIM & MOHAMED, 2017. 

Estas espécies demonstram diferentes atividades farmacológicas como atividade 

fungicida (PÉREZ et al., 2011), antibacteriana, antimicrobiana, hepatoprotetora, inseticida, 

nematicida, cura de feriadas, analgésica, larvicida (PRIYANKA, SHALINI & NAVNEET, 

2013), influenciando o estudo dos microrganismos endofíticos das folhas e raízes. 

Sendo assim, foi escolhida a espécie Tagetes patula para o presente estudo, uma vez que 

quando ela é plantada em co-cultura com outras plantas como cenoura ou tomate, suas raízes 

produzem metabólitos tóxicos derivados do α-tertienil que combate os nematoides Meloydogine 

e Pratylechus (BHATTACHARYYA, 2017). 

 

1.4 Tagetes patula 

A espécie Tagetes patula é popularmaente conhecida como cravo-de-defunto. Esta espécie 

é conhecida por controlar a infestação de vermes do solo denominados nematoides (DIAS et 

al., 2022) que trazem prejuízos a várias culturas. Além disso, ela é classificada como uma planta 

ornamental e aromática que possui um aroma característico de cravo e chinchilho (LORENZI 

& MATOS, 2008). 

Diversas pesquisas relataram a utilização desta planta no manejo de fitopatógenos como 

nematoides, insetos, ácaros, bactérias, fungos e vírus (MARTOWO & ROHAMA, 1987; ABID 

& MAGBOOL, 1980; GOMMERS, 1981; ZAVALATAMEJIA & GOMES, 1995), onde foram 

verificados que os metabólitos secundários responsáveis por estas atividades são pertencentes 

as classes dos monoterpenos, sesquiterpenos, flavonoides e tiofenóis (ZYGLADO & GARCIA, 

1990). 



34 

 

Apesar dos diversos efeitos conferidos a esta planta existem muitas lacunas relacionadas a 

ação biológica dos extratos produzidos pelos microrganismos endofíticos desta planta no 

manejo fitossanitário (Meloydogine incognita e Aedes aegypti) e antifúngico. 

Na literatura é relatado somente um trabalho de identificação e caracterização de micorrizas 

arbusculares de T. patula. pertencentes aos gêneros Glomus, Aucalospora, Sclerocystis, 

Gigaspora e Entrophospora (KUMAR, BHATTI & AGGARWAL, 2012). Além disso, não 

existem trabalhos relacionados a identificação, cultivo e co-cultivo de microrganismos 

endofíticos desta espécie. 

Desta forma, objetivou-se isolar e realizar uma prospecção metabólica dos extratos 

produzidos pelos fungos endofíticos de T. patula em diferentes meios de cultivo frente a um 

screening de atividades biológicas propostas, visando a busca de novos agentes terapêuticos. 

Neste trabalho, primeiramente foi verificada a atividade nematicida/nematostática no 

combate ao nematoide da espécie Meloydogine incognita afim de verificar se os metabólitos 

secundários produzidos pelos endófitos também eram responsáveis pela mortalidade destes 

vermes.  

Em seguida, foi investigada a atividade frente a Aedes aegypti, pois existem substâncias 

conhecidas como patuletina e patulitrina nos extratos das plantas que causam a mortalidade 

dessas pragas (KRZYANIAK et al., 2017). Em um estudo recente realizado por Garcia e 

colaboradores (2022), verificou a presença do metabólito ácido 3-nitropropiônico isolado do 

endófito Phomopsis sp. com efeito larvicida. 

Os microrganismos apresentam uma ampla variedade de compostos químicos e que podem 

ser usados para a prospecção de substâncias de interesse farmacológico. Desta forma, é 

necessário realizar a triagem microbiológica para se determinar a atividade de interesse. 

Neste sentido, foram avaliados o potencial antifúngico e citotóxico dos extratos dos 

microrganismos endofíticos Alternaria sp. e Collectotrichum sp., isolados das folhas de 

Tagetes patula, frente as cepas Candida, Cryptococcus e Trichophyton, bem como em células 

HeP-G2, HT-29 e HCT-116, respectivamente. 

 

1.5 Espécies de fungos endofíticos estudados: Alternaria sp. e Collectotrichum sp. 

 

Um dos fungos endofíticos deste trabalho chamado Collectotrichum sp. (Figura 5) (Família: 

Glomerellaceae; Ordem: Glomerellales; Classe: Sordariomycetes; Divisão: Ascomycota) é um 



35 

 

importante fitopatógeno que causam doenças conhecidas como antracnoses que ocorrem em 

diversas espécies de plantas (MENEZES, 2006).  

 

Figura 5. Foto de trás e da frente da placa de Petri com Collectotrichum sp. 

 

Fonte: O autor. 

De acordo com Menezes e Hanlin (1996) o fungo Collectotrichum sp. possui fruitificações 

setosas, chamados de acérvulos que podem possuir a cor creme. Neste gênero são encontradas 

11 espécies, sendo que o representante mais abundante desta espécie na natureza é o fungo 

Collectotrichum gloesporioides, que é conhecido como um fungo saprofítico e patogênico e 

causa sérios prejuízos à agricultura. 

As espécies hospedeiras destes microrganismos estão sujeitas a esta patologia em todas as 

fases do seu crescimento, podendo contaminar a semente e realizar a disseminação do fungo 

para outras áreas (MENEZES, 2006). 

No NuBBe (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais) este 

fungo já foi estudado pelo grupo da Prof. Maysa Furlan e da Prof. Angela Araújo, e, foi 

constatada a produção de (-) cis-4-hidróxi-6-deóxiscitalona, (4R)-4,8-dihidróxi-α-tetralona e 2-

feniletil 1H-indol-3-il-acetato que apresentaram atividade antifúngica frente a Cladosporium 

cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (INÁCIO et al., 2006; CHAPLA et al., 

2014). 

Apesar deste fungo se apresentar como um fitopatógeno, já foram relatados metabólitos 

secundários como compostos nitrogenados, esteróis, terpenos, pironas, fenólicos e ácidos 

graxos com diversas bioatividades (KIM; SHIM, 2019). Como exemplo disso a pirona n-butil 

β-D-glicopiranosideo produzido por C. aotearoa apresentou baixa citotoxicidade in vitro frente 

a macrófagos de camundongo (RAW 264.7) (HSIAO et al., 2016). 

Em uma pesquisa desenvolvida por Choi et al. (2016), demonstrou a presença de outro 

metabólito de interesse farmacológico produzido pelos fungos do gênero Collectotrichum sp., 



36 

 

conhecido como taxadienos. Neste trabalho, das 12 espécies analisadas, 8 continham a estrutura 

única do esqueleto do paclitaxel sendo reconhecidos como acumuladores de taxol. 

No trabalho desenvolvido por Chapla e colaboradores (2014) no Instituto de Química da 

Unesp de Araraquara demonstrou que o endófito C. gloesporioides produziu, uracila, ciclo(S-

Pro-S-Tir), ciclo(S-Pro-S-Val), ácido 2-(2-aminofenil) acético, 4-hidróxibenzamida, ácido 2-

(2-hidróxifenil) acético e acetato de 2-feniletil-1H-indol-3-il que apresentou forte atividade 

antifúngica frente a C. cldosporioides e C. spherospermum quando comparado a nistatina. 

Na literatura existem muitos relatos dos malefícios que este fungo causa aos agricultores, 

porém esta carece de trabalhos que demonstram o potencial biológico desta espécie. Neste 

sentido, foi estudado o fungo Collectotrichum sp. no combate a outros microrganismos que 

causam infecções fúngicas, e, além desta também foi estudado o seu potencial efeito inibitório 

em células cancerígenas. 

Outro fungo que também é foco de estudo do presente trabalho é o Alternaria sp. (Figura 

6) (Família: Pleosporaceae; Ordem: Pleosporales; Classe: Dothideomycetes; Divisão: 

Ascomycota) é um importante fitopatógeno que causam doenças conhecidas como antracnoses 

que ocorrem em diversas espécies de plantas (MENEZES, 2006). 

Figura 6. Foto de trás e da frente da placa de Petri com Alternaria sp. 

 

Fonte: O autor. 

Este microrganismo endofítico foi classificado como anafórmico e se apresenta na 

coloração palha ou clara, sendo que a cor dos conídeos se difere da cor do micélio (TOFOLI, 

DOMINGUES & FERRARI, 2015). 

Alternaria sp. é um fitopatógeno que infecta culturas como tomate, batata, cenoura, cebola 

e alho e causa a mancha púrpura, círculos concêntricos e a pinta preta, e, podem sobreviver em 

equipamentos de manejo agrícola e em estacas de madeira por até um ano em condições de 

baixa umidade (TOFOLI, DOMINGUES & FERRARI, 2015). Este ser vivo pode ser 

frequentemente isolado de plantas tanto como endófito, tanto quanto patógeno (DEMERS, 

2022). 



37 

 

Para proteger as plantações algumas ações podem de controle podem ser tomadas como a 

escolha da área, época de plantio, utilização de sementes tratadas com fungicidas e rotação de 

culturas (PEREIRA, CARVALHO & PINHEIRO, 2013). Neste sentido, estes dados 

influenciaram o interesse para o estudo deste microrganismo endofítico na busca de novos 

agentes terapêuticos bioativos. 

Na espécie Alternaria atrans foi constatada a produção de um derivado de ácido fusárico 

conhecido como atransfusarina e de (3R,6R)-3-benzil-6-isopropil-4-metilmorfolina-2,5 diona, 

os quais apresentaram atividade antifúngica frente aos patógenos Alternaria solani, 

Collectotrichum gloesporioides, Phyricularia grisea e Botrytis cinerea (YANG et al., 2019).  

Em um estudo bioguiado realizado por Gu (2009) na espécie Alternaria brassicola foi 

identificado um composto conhecido como herbarina que apresentou potencial antimicrobiano 

contra B. subtilis, E. coli, P. fluorescens e antifúngica em C. albicans. Neste trabalho ainda foi 

identificado um marcador químico deste gênero denominado alternariol que demonstrou ação 

inibitória frente a xantina oxidase impedindo a formação de radicais livres na formação do ácido 

úrico. 

Visando a produção de novos metabólitos no endófito Alternaria sp. foi empregada a 

abordagem OSMAC (One Strain Many Compound) (ORFALI, EBRAHIM & EL-SHAFAE, 

2017). Esta técnica consiste na alteração sistemática dos parâmetros de cultivo estimulando a 

diversidade química de uma ou mais cepas (PARANAGAMA, WIJERATNE & 

GUNATILAKA, 2007). Esta metodologia pode ativar ou silenciar vias metabólicas devido a 

utilização de parâmetros como agitação, temperatura, pH, adição de inibidores de enzima na 

intenção de produzir novos compostos (ROMANO et al., 2018). 

Neste sentido, o fungo Alternaria sp. produziu um composto inédito conhecido como ácido 

7-metóxiftalídeo-3-acético quando submetido a dois diferentes cultivos, um em meio sólido de 

arroz e outro em meio líquido de malte. Além deste, foram produzidos outros 20 policetídeos 

denominados alternariol, alternariol-5-O-metil éter, altenusina, ácido tenuazônico, stemfitriol 

altertoxina II, altenueno, 4’-epialtenueno, ácido isoocracinico, talaroflavona, ácido altérico, 

alterlactona, 2,5-dimetil-7-hidroxicromona, altecromona B, ácido ferúlico, cítreoisocumarinol, 

6-metilcítreoisocumarina, cítreoisocumarina, ortosporina, diaportinol. Estes metabólitos 

exibiram atividade anticâncer frente a células de linfoma de camundongo in vitro (ORFALI, 

EBRAHIM & EL-SHAFAE, 2017).  

 Em outro trabalho realizado por Sempere e Santamarina (2010), foi estudada a interação 

entre os endófitos Alternaria alternata e Pennicilium oxalicum sob diferentes condições de 



38 

 

temperatura, stress hídrico e meio de cultivo. Foi possível observar uma interação antagônica 

por contato entre estes microorganismos provavelmente devido a produção de agentes de 

controle biológico tóxicos. 

 Sendo assim, no presente trabalho foi utilizada a técnica OSMAC variando os meios de 

cultivo de malte, arroz parbolizado e Czapeck, de forma estática sob a presença de luz e 

temperatura controlada de 25°C. Também foi investigada a produção metabólica destes 

microorganismos isolados e em co-cultivo, bem como a interação por contato entre Alternaria 

sp. e Collectotrichum sp. Será realizada um estudo bioguiado destes extratos fúngicos frente as 

atividades larvicida, citotóxica, antifúngica e antimicrobiana. Através destes resultados, serão 

utilizadas as técnicas espectrométricas de espectroscópicas como GC/MS (Cromatografia 

gasosa acoplada a espectrometria de massas) e LC/MS (Cromatografia líquida acoplada a 

espectrometria de massas) simultaneamente com o uso do UNIFI (Sistema de informação 

científica/Waters) que é uma ferramenta do estado da arte utilizada na anotação de metabólitos. 

 

1.6 Utilização de ferramentas do estado da arte na caracterização de metabólitos 

secundários 

  

Os produtos naturais de fungos desempenham um papel importante na terapia e na 

descoberta de novos medicamentos (HUFENDNDIEK et al., 2016). Metabólitos secundários 

de cepas fúngicas podem ser rastreados através de duas abordagens diferentes: estudo bioguiado 

utilizando bioensaios para a confirmação de atividades biológicas e abordagens baseadas em 

desreplicação usando cromatografia líquida com arranjo de diodos e detecção por 

espectrometria de massas de alta resolução (KILDGAARD et al., 2017). 

A desreplicação é uma etapa essencial na descoberta de produtos naturais para evitar o 

reisolamento e a recaracterização de compostos bioativos conhecidos. É especialmente 

importante a triagem de bioatividades onde o alvo microbiológico muitas vezes é não seletivo 

havendo uma grande chance de se redescobrir compostos citotóxicos, anticancerígenos (EL-

ELIMAT et al., 2013) e antifúngicos (YANG, et al., 2019). 

Estes metabólitos podem ser identificados através da cromatografia líquida de alta 

performance com arranjo de diodos acoplado a espectrometria de massas (UPLC-PDA-MS) 

utilizando os modos de ionização positivo e negativo (EL-ELIMAT, et al., 2013), cromatografia 

gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC/MS), e ressonância magnética nuclear uni 

(1D) e bidimensional (2D) (SHAABAN, SHAABAN & ABDEL-AZIZ, 2012). O uso destas 



39 

 

técnicas levou a descoberta de várias famílias de compostos bioativos com diferentes origens 

biossintéticas (KILDGAARD et al., 2017). 

A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas é um dos métodos de 

rotina mais difundidos aplicados a triagem em larga escala e utilizados na descoberta de novos 

biomarcadores (HUMMEL, et al., 2010). 

. Estudos de perfis de GC/MS visando a identificação de compostos de misturas 

biológicas complexas dependem da comparação dos espectros de massas e dos tempos de 

retenção com bibliotecas de referência como o GMD (Golm Metabolome Database) que 

compreendem dados de substâncias de referência puras e de marcadores espectrais de 

metabólitos ainda não identificados (HUMMEL, et al., 2010). Além desta, existem outras bases 

de dados exclusivas para compostos voláteis como The Adams Library (Adams, 2007), 

Terpenoids Library (http://massfinder.com/wiki/Terpenoids_Library) (SKOGERSON et al., 

2009). 

 O acoplamento de espectrometria de massas com cromatografia líquida foi aprimorado 

na década de 1980 por Fenn com o desenvolvimento do eletrospray. Os fabricantes 

desenvolveram rapidamente instrumentos equipados com essa fonte de ionização que possuíam 

grande impacto na bioquímica de proteínas e peptídeos (FENN et al., 1989). 

 A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC/MS) é agora uma 

técnica de rotina com o desenvolvimento da ionização por eletrospray (ESI) que fornece uma 

interface simples e robusta. Ela pode ser aplicada a uma ampla gama de moléculas biológicas 

e uso de tandem MS e padrões internos de isótopos estáveis que permitem o desenvolvimento 

de ensaios altamente sensíveis e precisos. As velocidades de varredura rápidas permitem um 

alto grau de complexação e muitos compostos podem ser caracterizados em uma única corrida 

analítica (PITT, 2009). 

 A espectrometria de massas de tempo de vôo quadrupolo (UPLC/qTOF-MS) ganhou 

atenção considerável na última década como uma técnica analítica que possui alta sensibilidade 

na detecção de metabólitos. Ela fornece soluções de triagem rápidas e abrangentes que estão 

ganhando popularidade nos ambientes laboratoriais (ALLEN & MCWHINNEY, 2019). 

 Os princípios operacionais do TOF-MS envolvem a medição do tempo necessário para 

um analito viajar da fonte de íons para o detector através da aplicação de um campo elétrico 

que os acelera. Se todas as partículas possuem a mesma carga, as energias cinéticas serão 

idênticas e suas velocidades dependerão apenas de suas massas. À medida que os íons 

atravessam a região “livre de campo” entre a fonte de íons e o detector, eles se separam em 

http://massfinder.com/wiki/Terpenoids_Library


40 

 

grupos ou pacotes gerando uma função m/z, ou seja, íons mais leves atingirão o detector 

primeiro (KANG, 2012). 

 Outra metodologia que está sendo bastante empregada na detecção e anotação de 

metabólitos secundários é o UNIFI (Sistema de Informação Científica/Waters). Neste software 

é inserida uma biblioteca dos compostos produzidos pelos fungos endfíticos em formato de 

aquisição .mol (Figura 7), que fornecem espectros de fragmentação a partir dos dados obtidos 

da análise de cromatografia líquida de alta performance acoplada ao detector de espectrometria 

de massas de tempo de vôo quadrupolo (VIEIRA, CORTELO & CASTRO-GAMBOA, 2020). 

Figura 7. Obtenção dos dados e desenvolvimento da metodologia no UNIFI. 

 

Fonte: O autor. 

 O sistema de informação UNIFI pode calcular a composição elementar dos compostos 

presentes em uma amostra complexa fornecendo sugestões sobre uma possível fórmula 

molecular. O fluxo de trabalho começa com uma análise untarget, ou seja, uma análise de dados 

independente denominada MSE, onde “E” representa a energia de colisão (CABOVSKA, 2020). 

Esta técnica fornece duas funções de varredura em uma única corrida cromatográfica, 

onde a primeira aquisição de dados MS utiliza uma energia de colisão baixa e coleta 

informações dos íons precursores na amostra. Em uma segunda varredura é utilizada uma 

energia mais alta que a primeira que permite a coleta dos fragmentos em uma ampla faixa m/z 

(CABOVSKA, 2020).  

A integração da aquisição e processamento de dados juntamente com a biblioteca 

inserida no equipamento UPLC/qTOF-MS fornece um processo simples e eficiente para 



41 

 

facilitar a identificação de metabólitos em extratos de produtos naturais complexos (DENG et 

al., 2016). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



42 

 

2.0 OBJETIVOS 

2.1 Objetivos gerais 

 

Este projeto teve como objetivo descrever o estudo químico e biológico dos fungos 

endofíticos isolados das raízes e folhas da espécie Tagetes patula e realizar a caracterização dos 

metabólitos secundários produzidas por estes seres, e avaliar suas bioatividade. 

 

2.2 Objetivos específicos 

 

 Cultivar os fungos endofíticos isolados das raízes e folhas de Tagetes patula em meios 

de malte para obtenção de seus extratos; 

 Avaliar as atividades nematicida e nematostática, antifúngica, larvicida, e citotóxica dos 

extratos obtidos através de bioensaios in vitro;  

 Utilizar a abordagem OSMAC (One Strain Many Compound) através da realização do 

cultivo e do co-cultivo destes microrganismos em malte, Czapek e arroz parbolizado; 

 Testar os extratos dos cultivos e co-cultivos nas linhagens de Candida, Trycophyton e 

Cryptococcus; 

 Selecionar os extratos que apresentaram bioatividade significativa para a realização da 

atividade citotóxica frente a células hepáticas (Hep-G2), de cólon (HCT-116 e HT-29) 

e antibacteriana (Enterobacter e Citrobacter); 

 Obter perfis químicos por HPLC-DAD e GC/MSs; 

 Fracionar os extratos bioativos selecionados em MPLC-DAD; 

 Realizar isolamento, identificação e determinação estrutural das frações, através do 

RMN; 

 Realizar a anotação de substâncias no UNIFI (Plataforma Científica da Waters) dos 

extratos bioativos. 

 

 

 

 

 

 



43 

 

3.0 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 

 

3.1 Seleção e coleta da espécie vegetal 

Em de abril de 2019 foram coletadas plantas jovens da espécie Tagetes patula no viveiro 

A Botânica Paisagismo (21º48’04’’S, 48º22’10’’W) em Araraquara-SP. Logo em seguida, 

acondicionou-se este material em caixas térmicas, onde foi transportado ao Instituto de Química 

- UNESP/Araraquara. O material coletado foi identificado pelo Prof. Dr. Jimi Nakajima em 

Uberlândia-MG, e, foi gerada uma exsicata de número HUFU 78381, a qual foi armazenada no 

Herbário Uberlandense.  

3.2 Obtenção e cultivo do endófito 

Para a retirada dos fungos endofíticos foram selecionadas folhas e raízes jovens de 

Tagetes patula que foram seladas com parafina utilizando-se uma vela (Figura 8) para não 

permitir a entrada de outros microrganismos. Inicialmente foram preparadas placas de BDA 

(batata dextrose ágar) com o antibiótico sulfato de gentamicina (66,7 µg.mL-1). O antibiótico 

gentamicina foi colocado em contato para evitar o crescimento bacteriano. Outros materiais 

como béqueres, erlenmeyers e bisturi foram previamente autoclavados a fim de serem utilizados 

no respectivo experimento.  

Figura 8. Parte da planta selada com parafina. 

 

Fonte: O autor. 

Para a assepsia do material vegetal, em capela de fluxo laminar, foi feita uma solução 

de hipoclorito de sódio 1% (5 minutos), de álcool 70% (1 minuto) (Figura 9), e também duas 

águas de lavagem (5 minutos em cada) (Figura 10). 

 

 

 



44 

 

Figura 9. Imersão em NaClO 1% e etanol. 

 
Fonte: O autor. 

 

Figura 10. Imersão nas águas de lavagem 

 

Fonte: O autor. 

Com o auxílio de uma espátula e de um bisturi com lâmina estéril, foram feitos cortes 

na parte jovem da planta e colocadas nas placas de Petri (Figura 11). A segunda água de 

lavagem também foi inoculada em uma placa para realizar um controle desta análise. Uma folha 

jovem foi selecionada e realizou-se pequenos cortes que foram dispostos nas placas de petri 

(Figura 12).  

Figura 11. Parte de interesse da planta cortada em placa de Petri. 

 

Fonte: O autor. 

 

 



45 

 

Figura 12. Parte de interesse da planta disposta em placa de Petri. 

 

Fonte: O autor. 

 Após 3 dias de crescimento fúngico (Figura 13) foi realizado o repique (Figura 14) dos 

mesmos com o objetivo de obter uma maior separação dos fungos que já estavam saindo da 

parte de interesse da planta.  

 

Figura 13. Crescimento dos endófitos em placa de Petri. 

 

Fonte: O autor. 

 

Figura 14. Repique dos endófitos. 

 

Fonte: O autor. 

Em seguida, foram feitas as estrias (Figura 15) das placas do repique, visando a 

separação dos mesmos para o isolamento das linhagens puras. 



46 

 

Figura 15. Estrias realizadas nos endófitos. 

 

Fonte: O autor. 

As linhagens puras foram isoladas em frascos de penicilina contendo água ultrapura e o 

fungo em PDA. Estes frascos foram lacrados, mantidos em temperatura ambiente e depositados 

na micoteca do NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos 

Naturais) localizada no Departamento de Bioquímica e Química Orgânica (DBQO), do IQ-

UNESP. 

3.3 Cultivo dos fungos em escala analítica no meio líquido de malte 

Inicialmente o fungo ao ser retirado do slant (local de preservação) é colocado em placa 

de petri para seu crescimento. Após 8 dias de crescimento, parte do micélio deste 

microrganismo serão inoculados em meio líquido de malte (KASVI) previamente autoclavado 

(121ºC por 20 minutos) com água ultrapura (Milipore). Este experimento foi realizado em 10 

erlenmeyers de boca larga durante 28 dias em modo estático, a temperatura ambiente (25 ºC) 

na presença de luz.  

Após o período de incubação, o caldo foi separado do micélio por filtração a vácuo, e o 

filtrado foram submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila (3x300 mL) (CHAPLA, 

BIASSETO, ARAÚJO, 2012). Além deste, o micélio fresco foi colocado em uma mistura de 

hexano/isopropanol (6:4) (O’BRIEN.; SENSKE, 1994). Feito isso, ambas as frações do caldo 

em acetato de etila e do micélio foram concentradas em rota evaporador, onde foram obtidos 

11 extratos do caldo fúngico e 11 extratos dos micélios destes microrganismos, referentes às 

folhas e raízes, respectivamente (Esquema 1). 



47 

 

Esquema 1. Esquema para a obtenção dos extratos dos fungos cultivados em pequena escala. 

Fonte: O autor. 

Neste trabalho foram propostas algumas atividades biológicas visando realizar um 

estudo bioguiado para estes 22 extratos, sendo elas: atividade nematicida e nematostática 

(Meloidogyne incognita), antifúngica (Candida albicans) e larvicida (Aedes aegypti) realizadas 

em triplicata. 

A partir destes resultados, os extratos dos fungos endofíticos (denominados 9M e 13M), 

apresentaram bioatividade foram enviados ao Sequenciamento Sanger, e, então identificados 

(Esquema 2). Neste Esquema é possível verificar que apenas os fungos que foram identificados 

foram testados em outros meios de cultivo. Inicialmente os fungos 9M e 13M foram cultivados 

em escala ampliada com enfoque no isolamento de metabólitos através de HPLC-DAD e 

HPLC-MS. Posteriormente estes microrganismos foram cultivados isoladamente e em co-

cultivo em pequena escala meio de arroz parbolizado e Czapek para a realização de uma 

comparação entre os meios sólido (rico em nutrientes), líquido (rico em nutrientes para o malte 

e pobre em nutrientes para o Czapek). 

 

 

 

 

 

 

 



48 

 

Esquema 2. Sequenciamento Sanger dos endófitos selecionados. 

 

Fonte: O autor. 

Após a identificação destes microrganismos foi utilizada a abordagem OSMAC (One 

Strain Many Compound), onde estes endófitos foram cultivados nos meios de arroz parbolizado 

(21 dias) (Esquema 3) e Czapek (28 dias), em modo estático, a temperatura ambiente na 

presença de luz. Para o meio líquido de Czapek altera-se apenas a concentração do meio de 

cultivo para 39 g/L, e, desta maneira segue-se igualmente no meio de malte, referente ao 

Esquema 1. 

Esquema 3. Cultivo no meio de Arroz parbolizado 

 



49 

 

Fonte: O autor 

 Desta forma, estes extratos cultivados no meio de Czapek e arroz parbolizado foram 

testados frente a C. albicans para a verificação da bioatividade, e, a partir destes resultados 

foram feitas também outras atividades como antibacteriana (Enterobateer ATCC 29004 e 

Citrobacter freundii), citotóxica em hepatocarcinoma humano (Hep-G2), adenocarcinoma de 

cólon humana (HT-29) e antitumoral em células de adenocarcinoma de colon (HCT-116). 

Sendo assim, para os endófitos que foram previamente selecionados (9M, 13M, CCM e 

CCCZ) frente a estas atividades biológicas foram obtidos os perfis espectroscópicos e 

espectrométricos fazendo uso de técnicas cromatográficas acopladas conhecidas (CG/MS, 

HPLC-DAD, LC-MS/qTOF). As siglas utilizadas neste trabalho, como “CC” e “M”, referem-

se a co-cultivo e malte, respectivamente. O termo “9M” está relacionado com o fungo 9 

(Collectotrichum sp.) no meio de malte, e o termo “13M” ao fungo 13 no mesmo meio 

(Alternaria sp). Já os termos “CCM” e “CCCZ” são o co-cultivo no meio de malte e o co-

cultivo no meio de Czapek. 

 

3.4 Identificação dos fungos endofíticos enviados ao Sequencimento Sanger 

A identificação foi realizada através do sequenciamento Sanger de regiões específicas 

do DNA (ITS) do micro-organismo. Inicialmente foi feita a extração do material genético 

(DNA), seguida da amplificação com o auxílio de primers e do sequenciamento das amostras. 

3.4.1 Extração do DNA 

O DNA da amostra foi extraído através do Kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™ 

(D6005) de acordo com protocolo do fabricante. O DNA extraído foi mantido à temperatura de 

-20ºC até o momento do uso. 

3.4.2 Amplificação do DNA  

As reações de PCR foram feitas em um volume final de 20µL, contendo 10µL de 

GoTaq® Colorless Master Mix 2x (Promega, USL), 0.6μM de oligonucleotideo foward e 

0.6μM de oligonucleotideo reverse, 40ng de DNA genômico e água ultrapura estéril suficiente 

para 20uL. Para a amplificação da região ITS foram utilizados os primers ITS4 e ITS5. O 

programa de amplificação consistiu na desnaturação da dupla hélice do DNA  a 95ºC por 5 min 

(nesta etapa ocorre o rompimento das ligações de hidrogênio das bases nitrogenadas formando 

um molde que será combinado com o respectivo primer), seguida por 30 ciclos de desnaturação 

a 95ºC (neste processo ocorre a quebra da dupla hélice da fita de DNA que rompe as ligações 

de hidrogênio das bases nitrogenadas) por 30 segundos, anelamento a 56ºC por 40seg; extensão 



50 

 

a 72ºC por 1 min e uma extensão final a 72ºC por 5 min. As reações de amplificação foram 

conduzidas em termociclador Veriti™ Thermal Cycler (Applied Biosystems). 

3.4.3 Reações de Sequenciamento 

As amostras de PCR foram avaliadas e gel de agarose 2% corados com UniSafe Dye, 

visualizado sob luz UV e após purificadas com Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, 

Inc.). A quantificação dos produtos purificados realizada por fluorescência em aparelho Qubit 

(ThermoFhischer), reação de sequenciamento BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 

(Apllied) e a reação de precipitação por Etanol/EDTA/Acetato de Sódio, seguida do 

sequenciamento automático por eletroforese capilar no equipamento ABI3730xl DNA 

Analyzer (Applied Biosystems). 

3.4.4 - Análise dos resultados  

Após o sequenciamento (Esquema 2), foi realizado a análise dos cromatogramas através 

da técnica de eletroforese capilar utilizando os programas Chromas Lite e Geneious 4.8.3 para 

obtenção da sequência consenso. Após a edição, a sequência obtida foi utilizada na busca de 

sequências de referência similares depositadas no GenBank, através da ferramenta BLAST. 

 

3.5 Ensaio nematicida/nematostático 

3.5.1 Multiplicação e extração de Meloidogyne incognita 

Plantas de tomate (Solanum lycopersicum, L cv. Santa cruz), cultivadas em casa de 

vegetação, foram utilizadas como hospedeiro para multiplicação do inóculo de M. incognita, 

raça 3, em ambiente com fotoperíodo de 16 horas. Após 3 meses do primeiro inóculo, raízes de 

tomateiros infestadas com o nematoide foram lavadas em água corrente, cortadas em pequenos 

fragmentos de 2 a 3 cm e trituradas em liquidificador industrial com 60 mL de solução de 

hipoclorito de sódio (NaOCl) a 0,5%, durante 30 segundos. Após este período o material 

triturado foi transferido e aplicado no topo do sistema de peneiras de 48, 100 e 500 mesh, 

lavadas individualmente com água corrente durante 30 segundos e a suspensão de ovos retida 

na última peneira (500 mesh) foi coletada e submetida à técnica do funil de Baermann 

modificada (Coolen & D’Herde 1972; Hussey & Barker, 1973) para eclosão dos ovos. Este 

aparato foi mantido sob temperatura ambiente, mantendo o funil em contato com água destilada 

para coleta de juvenis pré-parasíticos de segundo estádio. Após 48 h, os J2 eclodidos foram 

contabilizados em uma lâmina de contagem (câmara de Peters) contendo 1 mL da suspensão, 

utilizando o microscópio ótico Zeiss Axiolab (Alemanha). 

 



51 

 

3.5.2 Ensaio de mortalidade de J2 

Juvenis de segundo estádio foram coletados e colocados em placas de 24 poços 

KASVI®. Em média, 100 nematoides por 1 mL foram colocados em cada poço da placa. Os 

tratamentos foram conduzidos em testes aquosos para avaliar a eficácia dos extratos nas 

seguintes concentrações: 100, 50, 25 12,5, 6,25 e 3,125 µg.mL-1. Foi utilizada água destilada 

como controle negativo e uma solução de abamectina (1 mg.mL-1) como controle positivo. O 

volume final por poço foi de 1,5 mL, sendo que cada tratamento continha três repetições 

(distribuído por coluna). As placas de 24 poços foram acondicionadas em uma estufa a 28º C, 

no escuro. 

Após 24 h, a quantidade de J2 vivos e mortos foram contabilizadas por observação sob 

luz branca na lente objetiva 10x, utilizando um microscópio ótico Zeiss Axiolab (Alemanha). 

Para confirmar a morte dos nematoides devido a algum dos tratamentos, foi utilizada uma 

solução de 20 µl de hidróxido de sódio 1 M (NaOH), observando se os mesmos permaneciam 

imóveis e esticados, assim, confirmando sua morte. Cada contagem foi realizada em triplicata. 

Foram realizados os testes in vitro para a verificação da atividade 

nematicida/nematostática frente a Meloydogine incognita que foi realizado pela Dra. Maria 

Eugênia Lisei de Sá sob a supervisão da Dra. Fátima Grossi de Sá, no Laboratório de Interação 

Molecular Planta-Praga – Embrapa Cenargen/Brasília (DF). 

Neste experimento foi testada apenas a concentração mais alta, a de 100 µg.mL-1, em 

triplicata, para a verificação positiva ou negativa da respectiva atividade. As análises foram 

realizadas em água destilada e com DMSO 2% como controle negativo e Invermectina como 

controle positivo (RUPCIC et al., 2018). 

 

3.6 Avaliação da atividade larvicida 

O teste larvicida frente a cepa Rockfeller (Aedes aegypti) para determinação da CL50 

foram realizados no Laboratório de Farmacognosia da Universidade de Brasília (UNB), em 

Brasília (DF), sob a supervisão da Profa. Dra. Laila Salmen Espindola. 

Foram feitas soluções da concentração mais alta 100 µg.mL-1, em placas de 12 poços 

com 10 larvas de Aedes aegypti em cada poço, em um volume final de 2 mL. Também foram 

utilizadas como soluções controle DMSO 2% e Bt-HorusSC (larvicida natural). 

 

 

 



52 

 

3.7 Cepas e condições de cultivo para espécies do gênero Candida 

Para a prospecção a atividade antifúngica de todos os fracionamentos foi utilizada a cepa 

de Candida albicans SC 5314. Foi feita a avaliação à susceptibilidade em outros fungos de 

frações que apresentaram atividade < 125 µg/ml. Para os testes de susceptibilidade foram 

usadas cepas de C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, C. tropicalis ATCC 750 

e Cryptococcus neoformans H99.  Todas as espécies de ambos os gêneros foram subcultivadas 

em ágar Sabouraud Dextrose (BD Difco™) e incubadas a 35ºC por 24 e 48 horas 

respectivamente. 

Foram também utilizadas cepas de Trichophyton rubrum ATCC 28189 e T. 

mentagrophytes ATCC 11481, subcultivadas em ágar de extrato de malte [extrato de malte 

(Kasvi): 2%, peptona de tecido animal (Sigma-Aldrich): 2%, glicose (Synth): 2% e ágar 

(Kasvi): 2%], pH 5,7, incubado a 28 ° C por 7 dias ou até a esporulação (GARCIA et al., 2020, 

BILA et al., 2021). 

3.7.1 Ensaio de susceptibilidade para as leveduras 

O ensaio de susceptibilidade das espécies de Candida e Cryptococcus foi feito de acordo 

com o documento M27-A3, proposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 

2008). As diluições dos fármacos utilizados no controle de qualidade do teste, bem como a 

preparação do inóculo, foram realizados como padronizado no documento, com algumas 

modificações, através da adição de resazurina (SILVA et al., 2013). As frações de extratos 

foram solubilizadas em DMSO numa concentração estoque de 30.000 µg.ml-1. As soluções 

trabalho das frações e dos fármacos controle foram diluídos assepticamente no meio RPMI 

1640, com L-glutamina, sem bicarbonato e com vermelho de fenol como indicador de pH 

(Gibco®) e tamponado com MOPS - [ácido 3-(N-morfolina) propanossulfônico] (Sigma-

Aldrich), pH=7. Foram realizados cálculos para que a concentração inicial na placa de 

microdiluição das fracões fosse de 1000 µg.ml-1. Em seguida, foram realizadas diluições 

seriadas até que a concentração final na placa fosse de 1,95 µg.ml-1. Para os fármacos 

itraconazol (ITZ) e fluconazol (FLZ), foram preparadas soluções-estoque considerando suas 

purezas. Em seguida, as soluções-trabalho foram preparadas através da diluição das soluções-

estoque em meio RPMI-1640, nas proporções de 1:100 (ITZ) ou 1:10 (FLZ) e colocadas nas 

placas de 96 poços. FLZ e ITZ foram testados nos seguintes intervalos de concentração, 

respectivamente: 64 a 0,125 µg.ml-1 e 4 a 0,008 µg.ml-1. 

 Para o preparo do inóculo, foram preparadas suspensões fúngicas por meio da adição 

das colônias em 5 mL de solução salina estéril a 0,85%. As suspensões foram agitadas em 

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=6&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiVksPvqpHXAhUSlpAKHU_OAxcQFghFMAU&url=https%3A%2F%2Fwww.fishersci.com%2Fshop%2Fproducts%2Fbd-difco-dehydrated-culture-media-sabouraud-maltose-agar-sabouraud-maltose-agar-500g%2Fdf0110178&usg=AOvVaw1IkDWslXfgmzjYagdeLAaL


53 

 

vórtex e os inóculos foram ajustados com a contagem das células leveduriformes no 

hematocitômetro, de modo a atingir uma concentração final entre 106 a 5 x 106 células .ml-1. 

Em seguida essas suspensões foram diluídas 1:50 em solução salina estéril e 1:20 em meio 

RPMI, de modo que a concentração final nas placas de microdiluição fossem entre 0.5 a 2,5 x 

103 cels/mL. Cem microlitros das suspensões foram colocados em contato com os fármacos e 

as frações dos estratos nas placas de 96 poços, juntamente com seus respectivos controles e 

incubadas a 35ºC sem agitação, por 24 horas para as espécies do gênero de Candida e 48 horas 

para Cryptococcus neoformans. Após esse período, foram adicionados 30 µL de solução de 

resazurina a 0.02% e as placas foram novamente incubadas nas mesmas condições por 24 horas 

adicionais, totalizando 48 e 72 horas de incubação final. Foi realizada leitura visual, na qual a 

concentração inibitória mínima foi determinada pela menor concentração do fármaco ou 

composto que não houve mudança na cor original azul do reagente, indicando ausência de 

atividade metabólica. Os testes foram realizados em triplicata e em três experimentos 

independentes. 

 

3.7.2 Ensaio de susceptibilidade para os fungos filamentosos 

Para o ensaio de susceptibilidade em espécies de dermatófitos (T. rubrum e T. 

mentagrophytes) foram conduzidos de acordo com o documento M38-A2, proposto pelo 

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). O inóculo foi preparado da mesma 

forma que a seção anterior, de modo a atingir uma concentração final entre 1 - 2,5 x 103 

células/mL em meio RPMI. Após a padronização do inóculo, foram acrescentados 100 µL 

juntamente com 100 µL de diferentes diluições (soluções trabalho) das frações dos estratos, 

preparadas como descrito na secção anterior em placas de 96 poços. Foram feitos controle de 

esterilidade do meio e controle de crescimento do fungo sem tratamento. As placas foram a 

35ºC a 150 rpm por 94 h. Após esse período, 30 µL de solução de resazurina 0.02% foram 

adicionados em cada placa e incubadas nas mesmas condições por 24 horas adicionais, 

totalizando 120 de incubação (CLSI, 2008; COSTA-ORLANDI et al., 2020, BILA et al., 2021). 

Todas a cepas são pertencentes à coleção do Laboratório de Micologia da Faculdade de 

Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista de Araraquara, Estado de São Paulo, 

Brasil. Avaliou-se a atividade antifúngica por sensibilidade frente a Candida albicans sob a 

supervisão da Profª. Drª. Maria Jose S. M. Giannini e Ana Marisa F Almeida, do Núcleo de 

Proteômica – Laboratório de Micologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - 

UNESP/Araraquara. 



54 

 

3.8 Atividade citotóxica frente as células HepG2, HT-29 e HCT-116 

A linhagem de hepatocarcionoma HepG2 (ATCC HB 8065) foi obtida do banco de 

células do Rio de Janeiro e cultivadas em garrafas próprias com meio DMEM enriquecido com 

10% de soro fetal bovino. As garrafas foram incubadas à 37 OC com 5% de CO2 até atingir a 

confluência celular. Posteriormente, as células foram retiradas com o auxílio de PBS+EDTA, 

centrifugadas e ressuspendidas no meio de cultura e contadas na câmara de Neubauer, de forma 

a obter uma concentração de 1 x 104 células por poço da placa de microdiluição. Duzentos 

microlitros das suspensões de células foram semeados em cada poço de uma placa de 96 poços, 

a qual foi incubada por 24 h à 37 ºC com 5% de CO2 para permitir a adesão celular, obtendo 

pelo menos 80% de confluência. Foi feita a diluição seriada dos compostos em tubos cônicos, 

o meio anterior dos poços foi retirado e adicionadas aos poços os compostos em concentrações 

que variaram de 1000 – 3,9 µg/mL. As células foram expostas aos compostos por 48 h e com 

24 h adicionou-se 10 µL de resazurina 0,02% (Sigma). Após a incubação, a absorbância foi lida 

em leitor de microplacas (Biotek) em 570 e 600 nm e a concentração inibitória 50% (IC50) foi 

determinada (XIÃO et al., 2010). 

Esta análise também foi realizada no Laboratório de Micologia da Faculdade de 

Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara. 

Os extratos 9M, 13M e CCM foram avaliados quanto a capacidade de alterar a 

viabilidade de diferentes linhagens celulares, microscopicamente por alteração da morfologia 

celular e mensurada através do método colorimétrico MTT (tetrazolium3-[4,5-dimetiltiazol-2-

il]-2,5-difeniltetrazolium brometo) (Sigma®).   

Neste trabalho, foi utilizada célula de adenocarcinoma de cólon humana (HT29, 

cultivadas a 37 °C em atmosfera umedecida e 5% de CO2.  Para o crescimento e manutenção 

das células foi utilizado o DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Sigma®) contendo 

penicilina (1,60 mg.mL-1), estreptomicina (0,40 mg.mL-1) e suplementado com 10% de soro 

fetal bovino (SBF).  

Neste ensaio, 100 µL de meio DMEM e células na concentração de 1,0x104 células/poço 

foram distribuídas em microplacas de 96 poços e incubadas a 37 °C durante 24 horas em estufa 

com atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade. Após esse período, as células foram tratadas 

com soluções de diferentes concentrações (400,00 a 3,12 µg.mL-1) dos extratos e incubadas 

novamente em estufa por 48 horas. Os controles deste ensaio foram feitos adicionando apenas 

o meio de cultura nos poços (100% de células viáveis). As microplacas foram monitoradas por 

microscopia óptica diariamente.  



55 

 

Após as 48 horas, o meio foi removido e em cada poço foi adicionado 50 μL de solução 

de MTT (0,1 mg.mL-1). As placas foram novamente incubadas a 37 °C e atmosfera 5% de CO2 

por 4 h. Posteriormente, a solução de MTT foi removida e adicionado 100 μL de 

dimetilsulfóxido (DMSO) em cada poço. As absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro 

com comprimento de onda de 570 nm. 

A viabilidade celular foi calculada para cada concentração testada, conforme a seguinte 

equação:  

% células viáveis = média densidade óptica (células tratadas) x 100/média densidade óptica do 

controle (sem tratamento) 

Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas 

pelo teste de Tukey (P ≤ 0.05). Os testes foram realizados em triplicata. 

As células HCT-116 (adenocarcinoma do cólon) foram cultivadas em Roswell Park Memorial 

Institute (RPMI) médio (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, EUA). O foi suplementado 

com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Thermo Fisher Scientific) e estreptomicina penicilina a 

1% (Thermo Fisher Scientific). As células foram mantidas em uma incubadora (Panasonic, 

Osaka, Japão) com 5% de CO2 a 37°C. Para metiltiazol tetrazólio (MTT) (Thermo Fisher 

Scientific), as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 104  por 

poço com 200 μL de meio de cultura. Após 24 horas, as amostras foram testadas em diferentes 

concentrações, 5μg.mL-1 e 50μg.mL-1 para a triagem. Após o tratamento, o as placas foram 

incubadas por 72 horas. Dimetil sulfóxido (DMSO; 0,05%) (Sintetizador, Diadema, SP, Brasil) 

foi utilizado como controle negativo, e o composto antineoplásico doxorrubicina (0,00064–10 

μM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi usada como positiva ao controle. Três horas 

antes do término do experimento, os meios de cultura foram substituídos por meio fresco 

contendo solução de MTT (0,5 mg.mL-1). Ao final das 72 horas, o MTT A solução foi removida 

e o produto formazan foi solubilizado em 150 μL de DMSO. O a absorvância foi obtida a 540 

nm. Os valores IC50 e seu intervalo de confiança de 95% foram calculados por regressão não 

linear sigmoidal usando o software GraphPad Prism 6. 

 

3.9 Atividade antibacteriana frente a Enterobcater ATCC 29004 e Citrobacter freundii 

As cepas bacterianas Enterobacter ATCC 29004 e Citrobacter freundii ATCC 8090 

foram utilizadas no teste de concentração inibitória mínima (CIM). Neste ensaio, foi empregada 

a metodologia padronizada de microdiluição em caldo, em microplacas de 96 cavidades (CLSI, 

2012). Primeiramente, foi realizada uma diluição seriada dos extratos fúngicos 9M, 13M e 



56 

 

CCM, onde 100 µL do meio de cultura Mueller Hinton (MH; Himedia®) foram adicionados e 

100 µL de amostra; desta solução, 100 µL foram retirados e homogeneizados com 100 µL de 

meio de cultura na cavidade seguinte, e assim sucessivamente, obtendo-se uma série de 

concentrações dos extratos (inicialmente a 5 mg.mL-1) diluída em razão 2 (2,50 mg.mL-1 na 

segunda cavidade e assim sucessivamente). Posteriormente, foram adicionados em cada poço 

100 µL de suspensão bacteriana ajustada para concentração final de 106 UFC/mL. Como 

controle negativo foi utilizado o solvente dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich®) 5% e 

como controle positivo foram adicionados 10 µL de cefoperazone (CEFAMIX; SWISSBRAS 

CHEMICAL LTDA).  

As microplacas foram mantidas em estufa de crescimento a 37 °C por 24 h. Após 

incubação, foram adicionados 20 µL de resazurina (Sigma-Aldrich®) (0,5 mg.mL-1). As 

microplacas foram incubadas por mais 2 horas. 

A determinação da CIM foi qualitativa e visual. Considera-se o valor do CIM, a 

concentraçã