UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Fernanda Coelho Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial reparador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-bmp-2 Araraquara 2018 UNESP - Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Araraquara Fernanda Coelho Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial reparador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-bmp-2 Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara para obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Biociências, Biomateriais e Ciências Forenses Orientador: Profa. Dra. Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote Araraquara 2018 Coelho, Fernanda Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial reparador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-BMP-2 / Fernanda Coelho. -- Araraquara: [s.n.], 2018 99 f. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote 1. Regeneração óssea 2. Anticorpos monoclonais 3. Toxicidade 4. Expressão gênica I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ana Cristina Jorge, CRB-8/5036 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Fernanda Coelho Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial reparador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-bmp-2 Comissão julgadora Dissertação para obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Biociências, Biomateriais e Ciências Forenses Presidente e orientador: Prof. Dr. Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote 2º Examinador: Prof. Dr. Raquel Mantuanelli Scarel Caminaga 3º Examinador: Prof. Dr. Chaine Pavone Araraquara, 23 de fevereiro de 2018 DADOS CURRICULARES Fernanda Coelho NASCIMENTO: 14/08/1992 - São Carlos- São Paulo FILIAÇÃO: Augustinho Coelho e Marinês Cavallaro Coelho FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2016- 2018 Mestrado em Odontologia. Área de concentração: Biociências, Biomateriais e Ciências Foresens. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Sao Paulo, Brasil Título: Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial regenerador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-BMP-2 Orientador: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2011 – 2016 Graduação em Farmácia-Bioquímica. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Avaliação do potencial tóxico de lentes de contato à base de Celulose bacteriana com adição de complexos fármaco-ciclodextrinas revestidas por composto híbrido orgânico-inorgânico Orientador: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Dedico este trabalho à Deus, por me permitir viver e por me capacitar para realizar meus sonhos; Aos meus pais, Augusto e Marinês, que são minha base, pelo incentivo e esforços que fizeram para eu alcançar meus objetivos; E ao homem, que Deus não poderia ter escolhido melhor para estar ao meu lado, Paulo, pela paciência, pelo apoio, pelas inúmeras vezes que não me deixou desanimar e me fez encontrar forças para continuar acreditando nos nossos sonhos. AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Prof. Dr. Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote, por ter acredito no potencial dessa pesquisa, pelo apoio e pela confiança depositada em mim para realizá-lo. Por ter se adaptado ao meu modo de ser e trabalhar, por transmitir seus inúmeros conhecimentos e nunca ter me negado um pedido de ajuda. Obrigada pela sua amizade, a qual nunca eu irei esquecer. Você é uma das pessoas responsáveis por eu concluir mais uma etapa da minha vida. Muito obrigada! Aos colaboradores desse trabalho, Prof. Dr. Sidney José de Lima Ribeiro, Profa. Dra. Alexandra Ivo Medeiros, Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga, Dr. Mauricio Cavicchioli, e a Dra. Sybele Saska Specian, pelo apoio desde a elaboração do projeto de pesquisa e a execução dos ensaios. À Profa. Dra. Raquel Mantuanelli Scarel Scaminaga, pelos ensinamentos desde os primeiros anos de graduação até o presente, pela oportunidade de poder aprender um pouco mais nesses últimos meses sobre outros ensaios, e principalmente, pela paciência que teve ao trabalhar com o meu jeito acelerado. Meu sincero muito obrigado por todos esses anos de convívio. Agradeço em especial ao Mauricio Cavicchioli, que sempre esteve disponível para a confecção das amostras e sempre me transmitiu todo seu conhecimento, me auxiliando em tudo que era possível. À Profa. Dra. Alexandra Ivo Medeiros que aceitou participar desse projeto e sempre esteve disponível para nos auxiliar nas inúmeras dúvidas que surgiram. Agradeço as suas alunas, Leticia e Ana que sempre muito educadas me auxiliaram e contribuíram para a realização de alguns ensaios. Agradeço a ajuda da Andreia na realização dos testes de resistência da membrana e pelo conhecimento transmitido. Agradeço a minha amiga Larissa Mendes, que apesar da distância, nunca me negou uma ajuda e tentou me auxiliar sempre da melhor maneira possível. À Prof. Dr. Estela Sasso Cerri pelo auxílio durante a utilização do microscópio de florescência. Às minhas amigas de laboratório Sâmia Corbi e Suzane Pigossi, que me transmitiram os seus conhecimentos para a realização do ensaio de expressão gênica e sempre que possível me auxiliaram. Às integrantes e ex-integrantes do grupo LCCM: Maria, Joissi e Karine, meninas que nunca terei do que reclamar e só terei motivos para agradecer sempre por toda a ajuda concedida. A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização e conclusão deste trabalho. À FAPESP, pelo auxílio concedido (processo: 2016/25926-1) e à CAPES pela bolsa de Mestrado. “Prefiram a minha instrução à prata, e o conhecimento ao ouro puro, pois a sabedoria é mais preciosa do que rubis; nada do que vocês possam desejar compara-se a ela.” Provérbios 8:10-1 Coelho F. Desenvolvimento, avaliação da toxicidade e do potencial reparador ósseo de materiais à base de fibroína ou celulose bacteriana associados à hidroxiapatita e anticorpos anti-bmp-2. [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. RESUMO A engenharia tecidual voltada ao tecido ósseo tem como objetivo proporcionar uma reparação que apresente propriedades físicas e biológicas similares ao osso natural com restabelecimento adequado das suas funções. Neste contexto, materiais aloplásticos baseados em biopolímeros como a fibroína da seda (FS) e celulose bacteriana (CB) têm proporcionado a síntese de excelentes biomateriais para reparação óssea. Esses biopolímeros são biocompatíveis, possuem características mecânicas interessantes, apresentam uma lenta taxa de degradação in vivo, além da capacidade de serem modificados quimicamente. Para conferir a estes biopolímeros uma melhor bioatividade com intuito de potencializar a eficácia local da reparação óssea, o objetivo do presente estudo consistiu em sintetizar uma membrana à base de FS e outra à base de CB, sendo cada uma associada à hidroxiapatita e anticorpo anti-proteína morfogenética óssea (anti- BMP-2). Para tanto, estas membranas foram caracterizadas físico-quimicamente e, para análise do potencial destas membranas na reparação óssea, foram realizados ensaios in vitro para investigação de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade, além de expressão gênica desses materiais. As membranas à base de CB obtiveram resultados da caracterização físico-quimicamente mais satisfatórios em relação à FS e os testes seguintes foram realizados apenas com a membrana de CB. A membrana de CB associada à hidroxiapatita não demonstrou citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade para as linhagens CHO-K1 e MC3T3-E1. Estudos de cinética de liberação de anticorpos in vitro foram realizados para confirmar a ligação de anti-BMP- 2 nas membranas e o perfil de liberação dos anticorpos quando associados a anticorpos secundários conjugados com FITC. Os resultados demonstraram níveis de anticorpos detectados por até 14 dias e uma redução gradativa com o passar dos dias, reduzindo aproximadamente 70% em 7 dias e 90% em 14 dias. Referente à análise de expressão gênica dos 6 genes candidatos investigados, todos apresentaram aumento de expressão gênica, sendo os genes ALPL, RUNX2 e TNFRS11B nos primeiros dias de contato com a membrana e os genes SPP1, BGLAP e VEGF após um período de contato maior comparado ao grupo de interesse. Estudos de mineralização óssea e a atividade de fosfatase alcalina demonstraram que os grupos que apresentavam a proteína BMP-2 obtiveram uma maior resposta quando comparada ao grupo controle. Em conclusão, a membrana CB-HA-antiBMP-2 obteve resistência mecânica necessária para agir como material de preenchimento ósseo; é hidrofílica, permitindo a adesão e proliferação celular e não apresentou potencial tóxico. A adsorção dos anticorpos nas membranas foi confirmada; houve um aumento da expressão dos genes envolvidos na reparação óssea in vitro em células MC3T3-E1; houve aumento da formação de nódulos minerais e da atividade de ALP. Palavras-chave: Regeneração óssea. Anticorpos monoclonais. Toxicidade. Expressão gênica. Coelho F. Development, evaluation of toxicity and bone repair potential of materials made of fibroin or bacterial cellulose associated with hydroxyapatite and anti-bmp-2 antibodies.[dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. ABSTRACT Tissue engineering related to the bone tissue aims to provide a repair that presents similar physical and biological properties to the natural bone with adequate restoration of its functions. In this context, alloplastic materials based on biopolymers such as silk fibroin (SF) and bacterial cellulose (BC) have provided the synthesis of excellent biomaterials for bone repair. These biopolymers are biocompatible, have interesting mechanical characteristics, have a slow rate of degradation in vivo, and the ability to be chemically modified. In order to give these biopolymers better bioactivity to potentiate the local effectiveness for bone repair, the aim of the present study was to synthesize a SF-based and BC-based membrane, each of them was associated with hydroxyapatite and antibody anti-bone morphogenetic protein (anti-BMP-2). The membranes with immobilized anti-BMP-2 are expected to be effective in capturing endogenous BMP-2, conferring a different therapeutic approach and potential use for bone tissue engineering. For this purpose, these membranes were physico-chemically characterized and, in order to analyze the potential of these membranes in bone repair, in vitro assays were performed to investigate cytotoxicity, genotoxicity, mutagenicity and gene expression of these materials. The BC-based membranes obtained physically- chemically characteristics more satisfactory than the SF, and the next tests were performed only on the BC membrane. The BC membrane associated with hydroxyapatite did not demonstrate cytotoxicity genotoxicity and mutagenicity for CHO-K1 and MC3T3-E1. In vitro antibody kinetics studies were performed to confirm the binding of anti-BMP-2 to membranes and the antibody release profile when associated with FITC-conjugated secondary antibodies. The results demonstrated antibody levels detected for up to 14 days, and a gradual reduction over the course of days, reducing approximately 70% at 7 days and 90% at 14 days. Regarding the gene expression analysis of the 6 candidate genes investigated, all presented increased gene expression, with the ALPL, RUNX2 and TNFRS11B genes in the first days of contact with the membrane, and the SPP1, BGLAP and VEGF genes after a superior contact period compared to the interest group. Studies of bone mineralization and alkaline phosphatase activity demonstrated that the groups that presented the BMP-2 protein obtained a greater response when compared to the control group. In conclusion, the BC- HA-anti-BMP-2 membrane presented the necessary mechanical resistance to act as bone filling materials; is hydrophilic, allowing adhesion and cell proliferation; and did not present toxic potential. The adsorption of the antibodies on the membranes was confirmed; there was an increase of the expression of genes involved in bone repair in vitro in MC3T3-E1 cells; there was increase of the mineral nodule formation and of the ALP activity. Key words: Bone regeneration. Monoclonal antibodies. Toxicity. Gene expression. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Cascata de sinalização de BMP-2 na expressão de marcadores osteogênicos. Figura 2: Esquema de imobilização de anti- BMP-2 em membranas. Demonstração da captura de BMP-2 endógeno e de células células-tronco osteoprogenitoras. 1) O mAb anti-BMP-2 é imobilizado em uma membrana de CB. (2) O mAb captura BMP-2 endógeno do microambiente. (3) O BMP-2 capturado por mAb atrai e liga em seu receptor celular específico células osteoprogenitoras, promovendo sua diferenciação osteogênica. Figura 3: Produção da membrana de celulose bacteriana. A- Inoculação do meio de cultura. B- Manta de CB produzida. Figura 4: Produção da FS de acordo com o protocolo de Rockwood et al. (2011). Figura 5: Representação dos níveis de interação gota-superfície de acordo com o ângulo de contato. Figura 6: Citotoxicidade (viabilidade celular) avaliada pelo método XTT. Colunas indicam o valor médio da viabilidade celular. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 7: CLAE da solução restante da extração do casulo com NaCO3. Figura 8: CLAE da solução viscosa final obtida a partir da solução de LiBr. Figura 9: CLAE solução viscosa final obtida a partir da solução de CaCl2. Figura 10: Espectro vibracional na região do infravermelho obtido das amostras CB e CB-HA. Figura 11: Espectro vibracional na região do infravermelho obtido das amostras FS e FS-HA. Figura 12: Micrografia de MEV das membranas de CB e CB-HA: A. Superfície da CB, aumento 10x; B. Superfície da CB, aumento 50x; C. Superfície da CB-HA, aumento 10x; D, superfície da CB-HA, aumento 50x. Figura 13: Micrografia de MEV das membranas de FS e FS-HA. A. Superfície da FS, aumento 10x; B. Superfície da FS, aumento 50x; C. Superfície da FS-HA, aumento 10x; D. Superfície da FS-HA, aumento 50x. Figura 14: Espectro de EDS para as amostras CB-HA (A) e FS-HA (B). Figura 15 Citotoxicidade (viabilidade celular) avaliada pelo método XTT. Colunas indicam o valor médio da viabilidade celular. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 16: Citotoxicidade avaliada pela Sobrevivência Clonogênica. Colunas indicam o valor médio da Fração de Sobrevivência (%). CN representa 100% de fração de sobrevivência. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 17: Genotoxicidade avaliada pelo Ensaio Cometa. Colunas indicam o valor médio da porcentagem de DNA encontrado na cauda dos nucleóides. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 18: Genotoxicidade avaliada pelo Ensaio Cometa. Colunas indicam o valor médio de Tail Moment. Barras indicam o erro padrão. *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,001). Teste de Dunnett. Figura 19: Citotoxicidade (viabilidade celular) avaliada pelo método XTT. Colunas indicam o valor médio da viabilidade celular. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 20: Citotoxicidade avaliada pela Sobrevivência Clonogênica. Colunas indicam o valor médio da Fração de Sobrevivência (%). CN representa 100% de fração de sobrevivência. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (*** = p<0,0001) (** = p< 0,001). Teste de Dunnett. Figura 21: Genotoxicidade avaliada pelo Ensaio Cometa. Colunas indicam o valor médio da porcentagem de DNA encontrado na cauda dos nucleóides. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 22: Genotoxicidade avaliada pelo Ensaio Cometa. Colunas indicam o valor médio de Tail Moment. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Figura 23: Caracterização do perfil de adsorção in vitro de anticorpos monoclonais anti- BMP-2 nas membranas de CB. (A) Análise microscópica de fluorescência demonstrando a ligação do mAb anti-BMP-2 na membrana CB-HA detectado por anticorpo secundário anti-humano de camundongo conjugado com FITC em diferentes intervalos de tempo (1, 3, 7 e 14 dias). A primeira linha mostra as membranas CB-HA com anticorpos primários e secundários. A segunda linha mostra as membranas CB-HA apenas com anticorpos secundários. A última coluna mostra o Controle (CB-HA) sem nenhum tipo de anticorpo ligado. (B) Análise microscópica de fluorescência na membrana CB-HA inoculadas apenas por anticorpo secundário anti-humano de camundongo conjugado com FITC em diferentes intervalos de tempo (1, 3, 7 e 14 dias). O dia 1 representa a detecção de ligação de anti-BMP-2mAb imediatamente após a imobilização do mAb na membrana CB-HA, confirmando que o mAb de camundongo é mantido em todos por até duas semanas in vitro. Figura 24: Caracterização do perfil de adsorção in vitro de anticorpos monoclonais anti-BMP-2 nas membranas de CB-HA. Análise quantitativa de imunofluorescência de membranas com mAb anti-BMP-2 imobilizado do dia 1 ao dia 14 após a adsorção. Figura 25: Análise quantitativa de RT-qPCR dos grupos G1, G2, G3, G4 e G5 nos períodos de 7, 14 e 21 após cultivo celular dos genes SPP1 (A), ALPL (B), TNFRSF11B (C), RUNX2 (D), BGLAP (E), e VEGF (F). Barras indicam o nível médio de expressão gênica (2 -ΔCt ) +/- erro padrão. ANOVA two-way seguido do Teste de Bonferroni. *** = p <0,001; ** = p<0,1, * = p<0,05, quando comparado ao grupo controle de cada período. Figura 26: Análise macroscópica e microscópica dos nódulos minerais por Vermelho de Alizarina dos grupos G1, G2 e G4 nos períodos de 7, 10 e 14 dias após cultivo celular. Figura 27: Análise quantitativa dos nódulos minerais por Vermelho de Alizarina dos grupos G1, G2, G3, G4 e G5 nos períodos de 7, 10 e 14 dias, por leitura de absorbância a 405 nm. Barras indicam o maior potencial osteogênico de culturas de acordo com o material investigado +/- erro padrão. ANOVA one-way seguido do Teste de Tukey. *** = p <0,001 quando comparado ao grupo controle. Figura 28: Análise quantitativa da atividade de ALP dos grupos G1, G2, G3, G4 e G5 nos períodos de 7, 10 e 14 dias após cultivo celular em 595 nm. Barras indicam a atividade de ALP de acordo com o material investigado +/- erro padrão. ANOVA one- way seguido do Teste de Tukey. *** = p<0,001 quando comparado ao grupo controle. Figura 29: Análise quantitativa da produção de IL-6 dos grupos G1, G2 e G4 nos períodos de 7, 14 e 21 dias. Barras indicam a quantidade detectada de IL-6 de acordo com o material investigado +/- erro padrão. ANOVA one-way seguido do Teste de Tukey. *** = p<0,001 quando comparado ao grupo controle. Figura 30: Análise quantitativa da produção de TGF-ß dos grupos G1, G2 e G4 nos períodos de 7, 14 e 21 dias. Barras indicam a quantidade detectada de TGF-ß de acordo com o material investigado +/- erro padrão. ANOVA one-way seguido do Teste de Tukey. *** = p<0,001 quando comparado ao grupo controle. LISTA DE TABELAS Tabela 1: Materiais desenvolvidos à base de FS ou CB, associados à HA e anticorpo anti-BMP-2. Tabela 2: Materiais testados durante extração da fibroína. Tabela 3: Ângulos de contato e condições de hidrofilicidade. Tabela 4: Fosfatos de cálcio em sistemas biológicos. Fase da apatita, fórmula química e razão molar Ca/P. Tabela 5: Espessura das membranas (média ± desvio padrão; n=5). Tabela 6: Propriedades mecânicas das membranas. Tabela 7: Valores mensurados para o ângulo de contato para as amostras CB, CB+HA, FS, FS+HA, CB+AC, CB+HA+AC, FS+AC, FS+HA+AC. Tabela 8: Índice de Divisão Nuclear (IDN), Frequência de Células Binucleadas com Micronúcleo (FBMN), Frequência de Micronúcleos (FMN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Brotos obtidos de cada tratamento com os materiais e controles. Valores apresentados da média e erro padrão (EP). ** = p<0,001, *** = p< 0,0001, em relação à CN. Dunnett. Tabela 9: Índice de Divisão Nuclear (IDN), Frequência de Células Binucleadas com Micronúcleo (FBMN), Frequência de Micronúcleos (FMN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Brotos obtidos de cada tratamento com os materiais e controles. Valores apresentados da média e erro padrão (EP). A letra a indica diferença estatisticamente significante em relação ao CN (p<0,0001), Dunnett. b = p<0,0001, Tukey. Tabela 10. Materiais avaliados no ensaio de Expressão Gênica LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS ALP- Alkaline Phoasphatase (Fosfatase Alcalina) AMOR- Antibody Mediated Osseous Regeneration Ap- Alongamento Durante a Perfuração BGLAP- Osteocalcina BMPs- Proteínas Morfogenéticas Ósseas CB- antiBMP-2- Celulose Bacteriana + anticorpo anti- BMP-2 CB- Celulose bacteriana CB-HA- Celulose Bacteriana + Hidroxiapatita CB-HA-antiBMP-2- Celulose Bacteriana + Hidroxiapatita + anticorpo anti- BMP-2 CLAE- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CN- Controle negativo CP- Controle Positivo EDS- Espectroscopia por Dispersão de Energia e Raio X ELISA- Ensaio Imunoenzimático Ep- Energia na Perfuração por Unidade de Volume FBMN- Frequência de Células Binucleadas com Micronúcleos FDA- Food and Drug Administration FITC- Isotiocianata de fluoresceína FMN- Frequência total deMmicronúcleos FS- Fibroína da seda FS-antiBMP-2- Fibroína + anticorpo anti- BMP-2 FS-HÁ- Fibroína + Hidroxiapatita FS-HA-antiBMP-2- Fibroína + Hidroxiapatita + anticorpo anti- BMP-2 FTIR- Fourier-Transform Infrared Spectroscopy HA- Hidroxiapatita IDN- Índice de Divisão Nuclear IL-6- Interleucina -6 MAPK- Mitogen Activated Protein Kinases MEV- Microscopia Eletrônica de Varredura PCR- Reação em cadeia da Polimerase PN- Pontes Nucleoplasmáticas Rp- Resistência à Rerfuração RT-qPCR- Reação de transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real. SBF- Simulated Body Fluid SFB- Soro Fetal Bovino SPP1- Osteopontina TA- Temperatura Ambiente TGF-β- Ttransformation Growth Factor – β TNFRSF11B -Osteoprotegerina VEGF- Fator de Crescimento Endotelial SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 21 1.1 Biopolímeros Fibroína da Seda (FS) e Celulose Bacteriana (CB) 22 1.2 Hidroxiapatita 23 1.3 Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs) 24 1.4 Antibody Mediated Osseous Regeneration (AMOR) 27 1.5 Investigação de Citotoxicidade, Cenotoxicidade e Mutagenicidade 28 1.6 Investigação da Expressão Gênica 30 2 OBJETIVOS 32 2.1 Objetivos Gerais 32 2.2 Objetivos Específicos 32 3 MATERIAIS E MÉTODOS 33 3.1 Preparação e Caracterização das Membranas de CB e de FS 33 3.2 Ensaios in Vitro para Investigação de Citotoxicidade, Genotoxicidade e Mutagenicidade das Membranas 41 3.3 Imobilização do Anticorpo Monoclonal anti-bmp-2 nas Membranas de Celulose Bacteriana e Verificação da Cinética de Adsorção do Anticorpo in Vitro 47 3.4 Expressão Gênica 47 3.5 Detecção da Formação de Nódulos Minerais por Coloração com Vermelho de Alizarina 48 3.6 Atividade da ALP 49 3.7 Quantificação da Produção de IL-6 e TGF-ß por Ensaio Imunoenzimático (ELISA) 49 4 RESULTADOS 50 4.1 Avaliação da Toxicidade da Fibroína: Ensaio de Citotoxicidade e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para Confirmação da Separação e Eliminação da Proteína Serecina 50 4.2 Caracterização das Membranas 52 4.3 Ensaios in Vitro para Investigação de Citotoxicidade, Genotoxicidade e Mutagenicidade 60 4.4 Estudos de Adsorção de Anticorpos in Vitro 69 4.5 Expressão Gênica 71 4.6 Detecção da Formação de Nódulos Minerais por Coloração com Vermelho de Alizarina 76 4.7 Atividade da Proteína Fosfatase Alcalina (ALP) 79 4.8 Quantificação da Produção de IL-6 e TGF-ß por Ensaio Imunoenzimático (ELISA) 80 5 DISCUSSÃO 82 6 CONCLUSÃO 92 REFERÊNCIAS 93 21 1 INTRODUÇÃO O tecido ósseo é uma forma especializada de tecido conjuntivo que possui uma matriz extracelular mineralizada com determinado grau de rigidez e elasticidade, conferindo ao corpo a função de suporte 1 . A produção, manutenção e reabsorção deste tecido resultam da interação de três tipos celulares: os osteoblastos, osteócitos e osteoclastos. A matriz óssea tem dois componentes: uma parte mineral constituída por hidroxiapatita que contribui com 65- 70%, e uma parte orgânica, composta de glicoproteínas, proteoglicanos, sialoproteínas, proteínas ósseas, que compõem entre 25-30% da matriz total 2 . A regeneração óssea é um processo altamente eficiente e fortemente regulado que envolve todos os componentes do tecido ósseo 3 . Esse processo envolve múltiplos eventos que incluem a reabsorção do tecido ósseo necrosado e do coágulo subsequente ao trauma. Concomitante a esses eventos, há o desenvolvimento de processo inflamatório que propicia a liberação de fatores de crescimento que auxiliam na diferenciação celular e, consequentemente, na formação do tecido ósseo 4 . O processo de regeneração óssea transcorre sem complicações na maioria dos casos (90 a 95%) 5 . No entanto, defeitos ósseos prolongados após trauma ou ressecção de câncer ou fraturas não unidas podem exigir tratamento mais sofisticado. Nestes casos, procedimentos de enxerto ósseo, transporte ósseo, distração osteogênica ou biomateriais são aplicados para reconstrução óssea 3 . O enxerto ósseo é um procedimento cirúrgico comumente realizado para aumentar a regeneração óssea em uma variedade de procedimentos ortopédicos e maxilofaciais 6 , sendo o osso autólogo considerado o material "padrão-ouro" de enxerto ósseo 4,2,7,6,8 . Isso ocorre porque combina todas as propriedades necessárias para uma regeneração óssea eficiente em um material: osteointegração (proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) e outros fatores de crescimento), osteogênese (células osteoprogenitoras) e osteocondução 6 . Contudo, o enxerto autólogo apresenta algumas desvantagens, como a necessidade de remoção do tecido ósseo de outra região do paciente (sítio doador), o que demanda outra cirurgia, com suas respectivas morbidade e possíveis complicações pós-operatórias (hemorragia, hematoma, infecção e dor crônica) que são comuns da remoção do tecido ósseo para enxerto 3 , as quais aumentam com a quantidade de osso colhido 2 . O aloenxerto, osso retirado do corpo de outra pessoa, poderia ser uma alternativa. No entanto, a taxa de incorporação do aloenxerto é menor do que com o auto-enxerto, além de apresentar possibilidade de transmissão de patógenos 2 . 22 Em certos contextos clínicos e indicações apropriadas, uma combinação de materiais substitutos ósseos (biomateriais) com células/tecidos vivos, ou uso desses biomateriais sozinhos pode ser adequada 8 . Sendo assim, um biomaterial ideal para reconstrução óssea deveria possuir as qualidades de um osso autógeno, sem as desvantagens decorrentes da obtenção de tecido ósseo de um sítio doador. É necessário que permita uma boa adesão celular à sua superfície, tenha uma resistência mecânica suficiente para ser usado em locais onde há incidência de carga, não tenha características oncogênicas, seja hemostático, esterilizável, biocompatível, biorreabsorvível, osteocondutor, osteoindutor, estruturalmente semelhante ao osso, fácil de usar e econômico 3,8 . O número crescente de materiais para enxerto ósseo com origens completamente diferentes está comercialmente disponível para muitas aplicações no corpo humano. São variáveis em sua composição, seu mecanismo de ação e, portanto, suas indicações. Biomateriais são geralmente considerados como uma alternativa altamente relevante para enxerto ósseo em cirurgia dentária, implantodontia e periodontia. Desta forma, uma grande variedade de defeitos ósseos pode ser reparada usando biomateriais 8 . 1.1 Biopolímeros Fibroína da Seda (FS) e Celulose Bacteriana (CB) Entre os polímeros naturais, a celulose bacteriana (CB) e a fibroína da seda (FS) oferecem inúmeras oportunidades para funcionalização, processamento e integração biológica 9 . A seda é amplamente conhecida na indústria têxtil por seu brilho e propriedades mecânicas. Sedas são proteínas fibrosas sintetizadas por células epiteliais de glândulas do bicho-da-seda. As fibras de fibroína possuem aproximadamente 10-25 μm e consistem em duas cadeias proteicas: uma cadeia leve (26 kDa) e outra pesada (390 kDa), ligadas por uma simples ligação dissulfeto 10 . Essas cadeias são revestidas por uma proteína hidrofílica chamada sericina que representa 25-30% do casulo total do bicho-da-seda 11 . A FS é purificada pelo aquecimento dos casulos em uma solução alcalina. A cadeia primária da fibroína consiste praticamente em glicina (43%), alanina (30%) e serina (12%) 12 . Esses aminoácidos mediam interações importantes entre células de mamíferos e a matriz extracelular, facilitando a adesão e o crescimento celular 10 . A FS possui várias propriedades desejáveis, incluindo a sua biocompatibilidade, facilidade com que pode ser quimicamente modificada, lenta taxa de degradação in vivo e a 23 sua capacidade de ser processada em múltiplos formatos a partir de qualquer solução aquosa ou solvente orgânico 11 e apresenta atividade antimicrobiana 10 . Devido ao cultivo em grande escala de bichos-da-seda para a indústria têxtil, existem fontes de custo abundantes e razoáveis para este polímero natural. Contudo, para aplicações médicas, é necessária uma extração e preparação adequadas. A partir dos casulos crus, a sericina deve ser removida das fibras de fibroína para assegurar a biocompatibilidade. A sericina é um grupo de glicoproteínas solúveis que cobre a superfície da fibroína. Uma vez que esta proteína adesiva é removida, as fibras de fibroína são dissolvidas numa solução aquosa que pode ser posteriormente processada em diferentes materiais 11 . A celulose é o biopolímero mais abundante na Terra e está presente em uma ampla variedade de espécies vivas, sendo obtidas principalmente de árvores e algodão. Também pode ser obtida a partir da bactéria Gluconacetobacter xylinus, a qual produz celulose nanobacteriana isenta de lignina e hemicelulose em uma rede hierárquica tridimensional composta por feixes de microfibrilas muito mais finas de tamanho nanométrico de 3,0 a 3,5 μm 10 . A celulose sintetizada pelas bactérias é microcristalina, apresenta capacidade de absorção de água superior à celulose vegetal e apresenta maior resistência mecânica quando hidratada 13 . Ao contrário de outros tipos de membranas sintéticas, a membrana de celulose bacteriana (CB) exibe uma alta resistência à corrosão química, é biocompatível, porosa e ainda possui boa resistência mecânica 14 . A CB pode ser produzida em quase qualquer forma devido à sua elevada moldabilidade durante a formação 10 . Propriedades únicas que a fazem ser um biopolímero com grande potencial a ser explorado pela biotecnologia, e outras áreas da ciência biomédica 15 . Membranas de CB não foram citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas em células CHO- K1 16 , assim como membranas de FS não apresentaram citotoxicidade e proporcionaram o crescimento de células fibroblásticas, bem como mantiveram as funções celulares 17 . 1.2 Hidroxiapatita A hidroxiapatita (HA) é um sal de fosfato de cálcio hidroxilado com um elevado grau de dureza, que constitui o componente principal de substância inorgânica dos ossos e dentes, onde é parcialmente substituído por fluorapatita. É solúvel somente em um ambiente fortemente ácido. Os osteoblastos formam HA a partir de íons fosfato e cálcio, incorporados nos ossos humanos, os quais são compostos por aproximadamente 70% de matrizes minerais. A cerâmica HA é quimicamente quase idêntica à HA natural 8 . 24 A HA apresenta propriedades biológicas como biocompatibilidade e osteocondução 18 . Devido às suas características de bioatividade e reabsorção, promove ligação direta com os tecidos vivos e promove degradação lenta e gradual do material com a finalidade de substituição dos tecidos em que são implantados 19 . As biocerâmicas à base de fosfato de cálcio (hidroxiapatita sintética e fosfato tricálcico) se assemelham aos componentes inorgânicos do tecido ósseo. Estas similaridades as tornam propícias à adesão celular e à neoformação do tecido ósseo 20 , o que as tornam excelentes materiais para proporcionar uma melhor bioatividade aos materiais para reparação/regeneração óssea. Entretanto, as biocerâmicas possuem baixa resistência mecânica quando comparado a materiais poliméricos e metálicos 21 , exemplificado pela HA que tem boa bioatividade e osteocondutividade, porém é muito frágil e apresenta baixa resistência à tração 22 . Apesar disto, a associação destas cerâmicas com materiais polímeros tem se tornado uma opção atrativa para o desenvolvimento de compósitos para reconstrução óssea, pois desta forma, obtêm-se materiais com resistência mecânica adequada e ainda com bioatividade favorecida pela cerâmica 23, 24 . Partículas de HA nanométricas estão associadas a um nível menor de citotoxicidade in vitro com boas ligações celulares e crescimento de osteoblastos humanos 25,8 . Biomateriais estão sendo desenvolvidos utilizando a FS como a parte orgânica de compósitos, com adição de compostos inorgânicos como a HA, a fim de melhorar as propriedades dos materiais, tornando-os mais similares ao tecido ósseo 26 mostrando resultados promissores para a regeneração óssea 27, 26, 28 . Os compósitos HA/BC apresentam aplicações potenciais na engenharia de tecidos ósseos com características marcantes como propriedades mecânicas elevadas, porosidade suficiente, moldabilidade, excelente biocompatibilidade e boa capacidade de ligação óssea 29 . 1.3 Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs) Proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs do termo em inglês – bone morphogenetic proteins) pertencem à família TGF-β (transformation growth factor – β) 3 identificadas como o fator osteoindutivo mais relevante na matriz óssea desmineralizada. Embora exista uma vasta gama de BMPs descritas na literatura, as BMPs 2, 4, 6 e 7 (também chamadas OP-1) são geralmente consideradas as mais osteoindutoras 2 . O principal papel das BMPs é o recrutamento de células mesenquimais para o local de cicatrização e, em seguida, diferenciá-las em linhagem osteogênica, resultando em nova 25 formação óssea 2,8 . A BMP-2 desempenha um papel importante na expressão de marcadores osteogênicos como Fosfatase Alcalina, do inglês- alkaline phoasphatase (ALPL), a osteocalcina e a proteína quinase Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK). Ao mesmo tempo, provavelmente está também envolvida na expressão dos fatores de transcrição nuclear RUNX2. As BMPs já foram utilizadas em estudos pré-clínicos e clínicos. Apesar de bons resultados terem sido obtidos, houve um problema com relação à definição da dose terapêutica, a qual variou bastante, dificultando a definição de uma concentração ideal para aplicações em humanos 2 . BMPs desempenham um papel essencial na regulação da osteogênese, bem como na remodelação óssea pela proliferação e diferenciação de osteoblastos. Tradicionalmente, acredita-se que estes caminhos sejam ativados pela ligação de BMPs em um receptor ligante- específico de membrana, receptores BMP tipo 1 (BMPR1) e receptores BMP tipo 2 (BMPR2). A ligação do receptor inicia a transdução de sinal através da fosforilação de várias proteínas SMAD e sua translocação nuclear. Os SMADs também funcionam como fatores de transcrição, controlando a expressão de genes osteogênicos essenciais envolvidos na proliferação de osteoblastos (Msx2), síntese da matriz (RUNX2, osteopontina-SPP1, fofatase alcalina-ALPL) e inibição de diferenciação dos osteoclastos (TNFRSF11B- osteoprotegerina) 30 . Além da sinalização BMP/SMAD, as cascatas MAPK representam uma via alternativa, não-canônica para a transdução de sinal de BMP-2. BMP-2 ativa as vias de sinalização p38, ERK1/2 e JNK1/2 para promover a expressão e ativação de um fator de transcrição específico relacionado ao RUNX2. RUNX2 tem um papel essencial na diferenciação osteoblástica de células-tronco e diretamente estimula a transcrição de importantes genes alvo à jusante, incluindo aqueles que codificam osteocalcina (BGLAP), colágeno tipo 1 (COL1A1) e osteopontina (SPP1) 25 . O mecanismo de ação do BMP-2 na expressão de marcadores osteogênicos pode ser verificada através da cascata de sinalização na Figura 1. 26 Figura 1 -Cascata de sinalização de BMP-2 na expressão de marcadores osteogênicos. Fonte: Elaborado pela autora. Segundo Kneser et al. 3 foi provado que sistemas de liberação inteligente apresentam importância crucial para a formação óssea confiável e aplicação econômica de BMPs. Com a ausência dos sistemas de liberação controlada, os fatores de crescimento rapidamente se difundem para longe dos dispositivos 3 . A ossificação heterotópica, a cinética de liberação não ideal e, por último, mas não menos importante, o preço elevado representam um desafio para aplicação mais ampla destas substâncias 3 . Proteínas recombinantes produzidas a partir da clonagem de BMPs humanas (rhBMPs - proteínas morfogenéticas recombinantes humanas) demonstraram capacidade para induzir a formação óssea 31 . Estas foram aprovadas pela FDA (Food and Drug Administration), resultando em uma rápida aceitação para reparação de fraturas ósseas 32 . BMP/INFUSE (rhBMP-2) (Medtronic, Memphis, TN e EUA) foi aprovado pela FDA em 2002 como uma alternativa ao enxerto ósseo autógeno para fusões de vértebras lombares. Foi observado que efeitos adversos graves podem ocorrer após o uso de rhBMP-2 nas cirurgias de coluna vertebral. Complicações in vivo e in vitro em modelos animais atribuídas às BMPs (BMP-2, BMP-7) datam de meados de 2000. Essas complicações, particularmente 27 devido ao uso de doses mais altas, incluem processos inflamatórios, vascularização aumentada, proliferação fibroblástica e catabolismo 33 . De acordo com Epstien 33 , a literatura especializada recente reconhece que a utilização de BMP/INFUSE para realizar fusões espinhais contribui para a maior morbidade perioperatória e pós-operatória. Além disso, a produção de rhBMPs tem alto custo para o uso clínico, o que gera preocupação em relação ao custo-benefício 34 . Uma parte do elevado custo de rhBMPs está relacionada ao fato de doses supra-fisiológicas (1,5 mg/ml) das proteínas serem necessárias para se obter o resultado esperado, além da incapacidade de manter a concentração do fator de crescimento por longos períodos de tempo e a menor atividade biológica de rhBMPs em relação ao BMP endógeno 35 . 1.4 Antibody Mediated Osseous Regeneration (AMOR) A maioria dos processos biológicos é guiada por mediadores celulares específicos. A administração de apenas um fator de crescimento exógeno não apresentaria uma condição ideal para a cicatrização de feridas 35 . Como uma alternativa para a administração exógena de rhBMP-2, foi estudado o uso de anticorpos anti-BMP-2 imobilizados em scaffolds para a captura de BMP-2 endógena. O BMP-2 endógeno capturado seria capaz de induzir a diferenciação osteogênica de células-tronco osteoprogenitoras. Esta abordagem ficou denominada como (Antibody Mediated Osseous Regeneration - AMOR) 35 . O esquema de ligação dos anticorpos anti-BMP-2 em membranas para a captura de BMP-2 endógeno pode ser visualizado na Figura 2. Figura 2 -Esquema de imobilização de anti- BMP-2 em membranas. Demonstração da captura de BMP-2 endógeno e de células células-tronco osteoprogenitoras. 1) O mAb anti- BMP-2 é imobilizado em uma membrana de CB. (2) O mAb captura BMP-2 endógeno do microambiente. (3) O BMP-2 capturado por mAb atrai e liga em seu receptor celular específico células osteoprogenitoras, promovendo sua diferenciação osteogênica. Fonte: Elaborado pela autora 28 Freire et al. 35 investigaram o potencial regenerativo de BMP-2, visando a captura de BMP-2 endógena com a utilização de clones de anticorpos imobilizados em scaffolds de esponja de colágeno absorvível em defeito de calvária de ratos. Análises de micro-CTs (microtomografias computadorizadas) demonstraram que logo após duas semanas pós- cirúrgicas ocorreu um preenchimento ósseo estatisticamente significante com o tratamento dos clones de anticorpos anti-BMP-2: 4B12 e 3G7. A presença da molécula de anticorpo nos estágios iniciais da cicatrização alterou o comportamento celular pelo aumento da infiltração celular, bem como, pela ativação da expressão gênica de BMP-2, BMP-4 e BMP-7. O anticorpo monoclonal reagiu com BMP-2, BMP-4 e BMP-7 in vitro e in vivo, levando a concentrações significativamente maiores dessas moléculas no local durante a cicatrização precoce. A eficácia de anti-BMP-2 3G7 na regeneração de osso novo foi quantitativamente comparável ao de rhBMP-2 e qualitativamente equivalente ao osso endógeno. Ansari et al. 36 utilizando do conhecimento osteogênico in vivo da abordagem AMOR, investigaram a ação deste em diferentes matrizes: micro-esferas de titânio, hidrogel de alginato e esponja de colágeno absorvível. Os estudos in vivo utilizaram a análise de micro- CTs em defeitos em calvária de ratos. Foi observada e quantificada a formação óssea nos 3 tipos de scaffolds após 8 semanas de implantação, tendo sido diferente do controle negativo. O scaffold de titânio apresentou maior formação óssea devido às microesferas contribuírem para um maior volume de material nas calvárias de ratos, possuírem radiopacidade e não serem biodegradáveis. Em ambos os estudos, a utilização de anticorpos anti-BMP-2 foi capaz de capturar múltiplos mediadores osteogênicos devido ao alto grau de homologia entre o gene humano BMP-2 em relação a outras espécies, incluindo chimpanzé (99,3%), vaca (94,3%), camundongo (92,5%) e rato (92,2%). Esta pode ser a razão que os anticorpos gerados contra o antígeno humano BMP-2 possam mediar a regeneração óssea em calvária de ratos. 1.5 Investigação de Citotoxicidade, Genotoxicidade e Mutagenicidade Para um composto ser classificado como biomaterial este deve ser biocompatível e quimicamente inerte ou estável 37 . Logo, a utilização de um biomaterial compatível não deve desenvolver reações tóxicas, alérgicas ou carcinogênicas. No intuito de verificar se os materiais propostos neste projeto apresentam essas propriedades, foram realizados ensaios in vitro para investigação de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade. Citotoxicidade é estabelecida como o potencial de um material em produzir efeitos letais ou sub-letais 38 . Um dos mais utilizados e eficientes métodos de avaliar a citotoxicidade 29 é por meio do kit XTT, que quantifica a capacidade da enzima desidrogenase presente nas mitocôndrias viáveis de converter o sal tetrazólio hidrossolúvel XTT (cor amarela) em compostos de formazana por meio de espectrofotômetro 39 . O ensaio de Sobrevivência Clonogênica é capaz de avaliar quantitativamente o efeito sub-letal da citotoxicidade. O método consiste em avaliar se um determinado tratamento pode ou não prejudicar a capacidade proliferativa das células; ou seja, se as células mantém sua capacidade de formarem colônias após tratamento com determinada substância 38 . A genotoxicidade é definida como o potencial que uma substância tem de reagir com o DNA da célula. Esse contato pode resultar tanto em um efeito genotóxico, caso as enzimas endógenas de reparo do DNA possam reparar as quebras de fita simples e/ou dupla do DNA; como em um efeito mutagênico, caso tais alterações no DNA de uma célula não sejam passíveis de reparação, sendo transmitidas de modo estável às células filhas no processo de divisão celular 40 . Descrito por Singh et al. 41 o Ensaio Cometa ou single cell gel assay é um excelente método para investigar se um material pode apresentar atividade genotóxica em um tecido. Os fragmentos decorrentes da quebra de fitas simples e duplas de DNA migram do núcleo, de acordo com o dano ocorrido na molécula 41 . Segundo Darroudi e Natarajan 42 , os danos causados ao DNA e que podem ser detectados por meio do ensaio Cometa, podem estar sujeitos aos processos de reparo celular. Somente uma pequena parcela dos danos provocados no DNA é que serão fixados gerando as mutações, isso ocorre por causa da capacidade de reparo das células, devido ao estágio do ciclo celular que a célula se encontra e ao tipo de agente mutagênico 43 . De acordo com Poersch et al. 44 o estudo do dano genético ao nível cromossômico é essencial para a genética toxicológica, pois as mutações cromossômicas são um importante evento da carcinogênese. Entre os métodos mais utilizados para avaliar danos cromossômicos, destaca-se o teste do micronúcleo, que é definido como uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo principal que se forma durante a telófase da mitose ou meiose, quando o envoltório nuclear é reconstituído ao redor dos cromossomos das células filhas. Desse modo, são resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que se perderam do núcleo principal, representando perda de cromatina em conseqüência de dano cromossômico estrutural ou distúrbio no aparato mitótico 45 . 30 1.6 Investigação da Expressão Gênica Uma importante estratégia para verificar in vitro e/ou in vivo se um determinado material ou substância tem papel na modulação da expressão de genes e proteínas importantes para reparação/regeneração óssea é por meio da investigação da expressão gênica e protéica. Foi verificada em uma linhagem mioblástica (C2C12) que a utilização da abordagem AMOR (utilizando anti-BMP-2) resultou em efetiva diferenciação óssea, inclusive promoveu o fechamento de um defeito ósseo crítico em calvária de ratos 46 . Geralmente, quando se deseja investigar a expressão de genes mediada pela presença de substâncias ou materiais, costuma- se cultivar células de uma linhagem relacionadas ao tecido que estará em contato com o material. No que se refere à reparação/regeneração óssea, costuma-se cultivar as células MC3T3-E1 (pré-osteoblastos de calvária de camundongo) sobre o material objeto de investigação 47 . Como já descrito por Huang et al. 25 e por Rath et al. 30 , as proteínas BMPs possuem um papel especial na via de expressão de diversos genes osteogênicos envolvidos na proliferação de osteoblastos, síntese da matriz, inibição de diferenciação dos osteoclastos e também na transcrição de importantes genes alvo à jusante. Podem ser destacados alguns genes osteogênicos como os genes da osteopontina (SPP1), fosfatase alcalina (ALPL), osteoprotegerina (TNFRS11B), RUNX2, osteocalcina (BGLAP) e do fator de crescimento endotelial (VEGF). O gene SPP1, localizado no cromossomo 5, é responsável por codificar a proteína envolvida na ligação de osteoclastos à matriz óssea mineralizada. A proteína codificada é secretada e se liga à hidroxiapatita com alta afinidade. O receptor de vibronectina de osteoclastos é encontrado na membrana celular e pode estar envolvido na ligação a esta proteína 48 . O produto do gene ALPL, localizado no cromossomo 4, é uma enzima glicosilada, a qual pode desempenhar um papel na mineralização óssea. As mutações neste gene têm sido associadas à hipofosfatasia, uma desordem caracterizada por hipercalcemia e defeitos esqueléticos 49 . Também conhecido por OGP, o gene TNFRS11B está localizado no cromossomo 8 e codifica uma proteína a qual pertence a uma superfamília do receptor de TNF. Esta proteína é um receptor de osteoblastos que funciona como um regulador negativo da reabsorção óssea. Esta proteína se liga especificamente ao seu ligante de osteoprotegerina, os quais são reguladores extracelulares chave do desenvolvimento de osteoclastos 50 . Membro da família RUNX de fatores de transcrição, o gene RUNX2 localiza-se no cromossomo 17 e codifica uma proteína nuclear com um domínio Runt de ligação ao DNA. 31 Esta proteína é essencial para a diferenciação osteoblástica e morfogênese esquelética e atua como um arcabouço para ácidos nucleicos e fatores reguladores envolvidos na expressão do genes importantes para o desenvolvimento ósseo 51 . O gene BGLAP, localizado no cromossomo 3, codifica uma proteína óssea altamente abundante segregada por osteoblastos que regula a remodelação óssea e o metabolismo energético. A proteína codificada contém um domínio Gla (carboxilglutamato gama), que funciona na ligação ao cálcio e à hidroxiapatita 52 . Membro da família de fatores de crescimento de PDGF/VEGF, o gene VEGF está localizado no cromossomo 17 e induz a proliferação e migração de células endoteliais vasculares e é essencial tanto para angiogênese fisiológica quanto patológica 53 . Apesar do que já se conhece de biomaterias para a promoção do reparo ósseo, o presente estudo revela uma estratégia para buscar atender as necessidades da indústria quanto a confecção de um biomaterial com uma formação óssea confiável e aplicação econômica. 32 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos Gerais O objetivo deste estudo foi sintetizar e caracterizar dois tipos de compósitos manufaturados como membranas: um à base de FS e outro à base de CB (membranas), associados à HA e anticorpos anti-BMP-2, além de avaliar sua toxicidade e eficácia na modulação da expressão de genes importantes para reparação/regeneração óssea. 2.2 Objetivos Específicos 2.2.1. Sintetizar dois tipos de compósitos: um à base de FS e outro à base de CB (membranas), associados à HA e anticorpos anti-BMP-2; 2.2.2. Caracterizar físico-quimicamente os compósitos por meio dos ensaios: microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia por dispersão de energia e raio X (EDS), espectroscopia de infravermelho (Fourier-transform infrared spectroscopy - FTIR), análise das propriedades mecânicas e análise da hidrofilicidade pelo ensaio do ângulo de contato; 2.2.3. Avaliação da toxicidade in vitro nas linhagens CHO-K1e MC3T3-E1 pelos ensaios de citotoxicidade (Ensaio do XTT e Sobrevivência Clonogênica), genotoxicidade (Ensaio Cometa) e mutagenicidade (Teste do Micronúcleo); 2.2.4. Estudos de cinética de adsorção de anticorpos in vitro detectados por anticorpos secundários anti-IgG conjugados com FITC por meio de microscopia de imunofluorescência; 2.2.5. Avaliação da expressão de genes importantes para reparação óssea através da realização de PCR em tempo real (RT-qPCR); 2.2.6. Avaliação da formação de nódulos minerais por vermelho de alizarina e da atividade de ALP. 2.2.7. Quantificação da Produção de IL-6 e TGF-ß por Ensaio Imunoenzimático (ELISA) 33 3 MATERIAIS E MÉTODOS Foram desenvolvidos dois tipos de compósitos, um à base de FS e HA e outro à base de CB e HA, ambos associados ao anticorpo anti-BMP-2 (Tabela 1). Tabela 1 -Materiais desenvolvidos à base de FS ou CB, associados à HA e anticorpo anti- BMP-2. Fonte: Elaborada pela autora 3.1 Preparação e Caracterização das Membranas de CB e de FS Produção da celulose bacteriana A produção de CB, sintetizada pela bactéria Acetobacter xylinum, ocorreu em meio de cultura apresentando a seguinte composição básica: glicose 50 g/L (m/v), extrato de levedura 4 g/L, fosfato de potássio monobásico anidro (KH2PO4) 2 g/L, sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,73 g/L e etanol 20 g/L a 30°C. Preparo do meio: Foram pesados 4 g de extrato de levedura, 0,73 g de MgSO4.7H2O e 2 g de KH2PO4 em um erlenmeyer (1L) e adicionados 680 mL de água para que fossem dissolvidos. Em outro erlenmeyer (500 mL) foi adicionado 50 g de glicose e 300 mL de água para que também fosse dissolvida. Os conteúdos de ambos os erlenmeyers foram autoclavados separadamente, pois a glicose é muito reativa e pode reagir com os outros componentes. Após ser autoclavado, o etanol foi adicionado ao meio em fluxo laminar. O meio preparado foi então adicionado em erlenmeyer de 250 mL, respeitando a proporção de 5:1, adicionado 45 mL de meio. Pré-inóculo: 10% de Acetobacter xylinum e 90% do meio (5 mL de pré-inoculo e 45 mL de meio) foram inoculados, sempre flambando os frascos e incubados a 30°C por 24 horas. Materiais: Celulose Bacteriana (CB) Celulose Bacteriana+ anti-BMP-2 (CB- antiBMP-2) Celulose Bacteriana + hidroxiapatita (CB-HA) Celulose Bacteriana + hidroxiapatita + anti-BMP-2 (CB-HA-antiBMP-2) Fibroína (FS) Fibroína + anti-BMP-2 (FS-antiBMP-2) Fibroína + hidroxiapatita (FS-HA-antiBMP-2) Fibroína + hidroxiapatita + anti-BMP-2 (FS-HA-antiBMP-2) 34 Inoculação: O pré-inóculo foi utilizado na inoculação dos meios (50 mL de inóculo e 450 mL de meio) e 100 mL foram adicionados em placas petri de 13 cm de diâmetro e incubados por 5 dias a 30°C para a produção da celulose. Após esse período, as membranas de CB produzidas foram lavadas inicialmente com água corrente (3 dias), tratadas com 300 mL de NaOH 0,1 mol.L-1 a 80°C por 30 min. A solução de NaOH foi trocada e deixada por mais 30 minutos. Na sequência, as membranas foram lavadas com água destilada por 3 dias até verificação de pH neutro, como pode ser visualizada na Figura 3. Figura 3 -Produção da membrana de celulose bacteriana. A- Inoculação do meio de cultura. B- Manta de CB produzida. Fonte: Elaborado pela autora Produção da fibroína Extração da fibroína: A produção da fibroína ocorre pela extração dos casulos de Bombyx mori de acordo com o protocolo de Rockwood et al. 11 . Em um recipiente, foi adicionado 4 L de água deionizada para 5 g de casulos e 4,24 g de carbonato de cálcio, os quais foram mantidos em aquecimento por até 30 minutos após a fervura. Ocasionalmente, deve-se agitar com uma espátula para promover a boa dispersão de fibroína. A fibroína extraída foi removida com a ajuda de uma espátula e lavada em água ultra pura. Em seguida, foi adicionado 2 L de água deionizada e lavada em água durante 20 min enquanto se agitava suavemente sobre uma placa de agitação. Esse procedimento foi repetido por duas vezes, obtendo um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, a fibroína foi espalhada sobre um papel de alumínio e deixada em estufa para secagem por 24 horas. 35 Para a dissolução da fibroína, foram testadas as soluções LiBr e CaCl2 quanto à viabilidade celular e pela cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Como não houve diferença entre elas, a dissolução da fibroína foi realizada em solução de CaCl2. Dissolução da fibroína em CaCl2: A cada 10 gramas de fibroína foram adicionados 100 mL da solução de CaCl2. EtOH. H2O (1:2:8 molar) e a suspensão mantida em 85ºC em banho termostatizado até a dissolução completa. Diálise da fibroína: Diálise contra 1 L de água ultrapura para 12 mL de solução de fibroína em uma fita de diálise. Para assegurar a mistura, uma grande barra de agitação foi usada e colocada uma barra magnética pata agitar a placa. A água foi trocada após 1h, 4h, naquela noite, na manhã seguinte e na noite seguinte, bem como na parte da manhã do dia seguinte (ou seja, seis trocas dentro de 48 h). Foi realizada uma centrifugação para remover impurezas a 20.000 rpm a 4°C durante 20 min e a centrifugação foi repetida por mais uma vez. O esquema de produção pode ser verificado na Figura 4. Figura 4 -Produção da FS de acordo com o protocolo de Rockwood et al. (2011) 11 Fonte: Elaborado pela autora. 5) Secagem da fibroína em estufa por 24 horas 6) Dissolução da fibroína em LiBr e em CaCl 2 7)Diálise da fibroína 1) Corte dos casulos 2) Fervura em água deionizada com NaCO 3 (5g de casulo/ 4,24g NaCO 3 ) 3)Agitação constante por 30 minutos após fervura 4) Lavagem em água ultra pura corrente e em seguida, lavagem com agitação com 2 L de água deionizada (2 trocas) 36 Avaliação da toxicidade da fibroína: Ensaio de Citotoxicidade e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para confirmação da separação e eliminação da proteína Serecina As fibras de fibroína possuem aproximadamente 10-25 μm e consistem em duas cadeias proteicas: uma cadeia leve (26KDa) e a pesada (390 kDa) ligadas por uma simples ligação de dissulfeto. As cadeias leve e pesada da fibroína são revestidas pela proteína sericina, a qual apresenta uma relativa toxicidade para a fibroína, caso não seja removida por completo. Para verificar a toxicidade da fibroína e a total remoção da serecina, foram realizados os ensaios in vitro de citotoxicidade (teste do XTT) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Eluato A avaliação do material foi feita recolhendo substâncias referentes a cada etapa do processo de extração da fibroína (Tabela 2). As soluções extraídas foram obtidas a partir do preparo de eluato, confeccionado de acordo com a ISO 10993-12 54 . O material foi imerso em meio de cultura HAMF10: D-MEN (1:1) com ausência de soro fetal bovino, a 37ºC por 24 horas, sob agitação a 133 rpm em incubadora (New Brunswick Scientific – Excella E24 Incubator Shaker Series). Tabela 2 -Materiais testados durante extração da fibroína. Fonte: Elaborado pela autora Cultura Celular e Tratamentos Para realização dos experimentos foram utilizadas células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), com ciclo de divisão de aproximadamente 14 horas, crescidas em meio de cultura HAM-F10:D-MEM (1:1), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e kanamicina (1%) mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2. As células foram cultivadas e repicadas até atingirem a terceira passagem. Materiais: Casulo (A) Algodão obtido após a extração da serecina com NaCO3 (B) Solução restante da extração do casulo com NaCO3 (C) Solução viscosa final obtida a partir da solução de LiBr (D) Solução viscosa final obtida a partir da solução de CaCl2 (E) 37 Teste de Citotoxicidade – Viabilidade celular (XTT) Foram semeadas 2x10 4 células em placas de 24 poços num volume de 1 mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB e incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos colocando-se eluatos na concentração de 100% por 24 horas, além do controle negativo (CN = poços contendo apenas células com meio de cultura sem SFS e sem material). Para o CP, foi utilizado cloridrato de doxorrubicina (3,0 µg/mL por 24 horas). Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Após o tempo de tratamento, os eluatos foram removidos de cada poço, as culturas foram lavadas com 250 μL de PBS 1x e receberam 1,0 mL de meio de cultura suplementado com 10% de SFB. Após 24 horas, as culturas foram lavadas com 250 μL de PBS 1x e, com a câmara de fluxo com a luz apagada, foram inseridos em cada poço 500 μL de meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) sem fenol vermelho, seguido da adição de 60μl da solução XTT/eléctron (50:1) (Cell Proliferation Kit II – Roche Applied Science). Após 3 horas em estufa, 200 μL do meio de cada poço foi transferido para placa de 96 poços para leitura colorimétrica em espectrofotômetro (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 492 nm normalizada a 690 nm. A absorbância é considerada diretamente proporcional ao número de células metabolicamente ativas (células viáveis). Foram feitas três repetições independentes. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) A cromatografia foi realizada para verificação dos picos presentes na solução restante da extração do casulo com NaCO3, ou seja, que deveria conter a proteína serecina e nas soluções viscosas finais obtidas a partir da solução de LiBr e a partir da solução de CaCl2, as quais deveriam conter apenas a proteína fibroína. A análise foi realizada com a colaboração de pesquisadores do Instituto de Química de Araraquara – UNESP e, assim, foi possível verificar se a extração foi efetiva. Preparação da solução de hidroxiapatita A hidroxiapatita foi incorporada à CB e à FS segundo a metodologia de Hutchens 55 e Saska 56 . As membranas de CB ou de fibroína foram imersas em solução de etanol 20%, a temperatura ambiente (TA) por 24 h. Para precipitação da HA, cada uma das amostras previamente desidratadas foram imersas primeiramente em 20 mL de solução de CaCl2 0,05 38 mol.L -1 por 24 h a temperatura ambiente e, posteriormente, cada amostra foi imersa em 20 mL de solução de Na2HPO4 0,1 mol.L -1 por 24 h a TA. Para obtenção das membranas CB-HA ou FS-HA, as amostras foram secas em molde prensado. Após a secagem, as membranas foram acondicionadas em envelopes apropriados e foram esterilizadas com radiação gama a 20 kGy. Caracterização das membranas Os compósitos CB-HA e FS-HA foram caracterizados para elucidar a síntese dos respectivos compósitos e a interação dos anticorpos aos materiais. Desta forma, foram analisados: 3.1.1 Morfologia e estrutura dos compósitos bem como a análise dos cristais de apatita incorporados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia por dispersão de energia e raio X (EDS) As micrografias foram realizadas para verificar a estrutura fina da morfologia da superfície das amostras e a microanálise semi-quantitativa por EDS para verificar a razão molar Ca/P dos compósitos CB-HA, FS-HA. Cada amostra foi colocada em suporte de cobre para a realização das microanálises semi-quantitativas com tensão de 5 Kv. Posteriormente, as amostras foram recobertas com uma camada de carbono com espessura de 10 nm durante 80 segundos, tensão de 3 Kv e corrente de 15 μA. As micrografias foram realizadas sob tensão de 10-25 Kv. As micrografias e o EDS foram obtidos em microscópio eletrônico modelo FEG-MEV; JEOL modelo 7500F realizadas no Laboratório de Caracterização (Instituto de Química- Universidade Estadual Paulista – UNESP). O software ImageJ foi utilizado para analisar o tamanho das fibras da membrana de CB e a calibração foi feita utilizando a escala em barras da respectiva micrografia. 3.1.2 Análise dos grupos funcionais relacionados às fases de apatita nas membranas por FTIR Os espectros de FTIR foram obtidos usando um espectrômetro de absorção na região do infravermelho médio com transformada de Fourier – (Vertex 70, Bruker). Os espectros foram realizados sob as seguintes condições: porcentagem de absorbância (%A) com acúmulo de 32 varreduras, com uma resolução de 4 cm −1 , na faixa de absorção de 400-4000 cm -1 . 39 3.1.3 Análise das propriedades mecânicas A espessura das membranas foi determinada utilizando um micrômetro Digital MDC- Lite (Mitutoyo®), sendo as medidas obtidas em 5 pontos aleatórios de cada filme (n = 5). Os parâmetros de resistência à perfuração (Rp), alongamento durante a perfuração (Ap) e energia na perfuração por unidade de volume (Ep) foram determinadas em analisador universal de textura TA-XT2 Texture Analyser (Stable Micro Systems) equipado com sonda em aço inoxidável com ponteira esférica (D = 2,5cm). Secções das membranas (n=8) foram fixadas sobre um suporte metálico com um orifício circular (D = 5cm) a uma distância de 25 mm da sonda. A sonda metálica desceu perpendicularmente à superfície da membrana com velocidade constante de 1mm s -1 , em direção ao centro do orifício circular, sendo que durante a perfuração da membrana a velocidade foi de 0,10mm s -1 . A força de gatilho foi de 0,005 kg. Curvas de força versus deslocamento foram registradas até o momento da ruptura da membrana e utilizadas para determinar suas propriedades mecânicas, como resistência à perfuração (Rp), alongamento durante a perfuração (Ap) e energia na perfuração por unidade de volume (Ep), de acordo com as equações 1, 2 e 3, respectivamente 57 .Foram verificadas essas propriedades em amostras secas e úmidas, as quais foram imersas em solução de fluido corporal simulado (Simulated body fluid - SBF), pH 7,4, que possui concentração iônica semelhante ao do plasma sanguíneo, preparado de acordo com Kokubo et al. 59 por 24h. Rp= F A Equação 1 em que F é a força requerida para a ruptura do membrana e A é a área da seção transversal da membrana (A = 2rd, onde r é o raio do orifício e d a espessura da membrana). 𝐴p% = √r2+ d2 − 𝑟∙ 100% r Equação 2 em que r é o raio da membrana exposto no orifício da placa e d o deslocamento do dispositivo do ponto de contato até a ruptura da membrana. 𝐸p = 𝐴𝑈𝐶 𝑉 Equação 3 em que AUC é a área sob a curva força versus deslocamento e V o volume da membrana (V = πr2h) localizado no orifício da placa. 3.1.4 Análise de ângulo de contato para determinar as propriedades hidrofílicas dos compósitos antes e após a imobilização dos anti-BMP-2 40 O ângulo de contato foi medido pelo equipamento Dataphysics modelo OCA-15 equipado com uma câmera CCD. O método utilizado para realizar as medidas foi o de gotejamento utilizando água deionizada (tensão superficial: 72.30 mN/m); a gota foi dispensada por uma seringa com uma agulha de 0,5 mm de diâmetro, com um volume de 10 μL, numa velocidade de gotejamento de 1 μL.s -1 sobre as superfícies das membranas. As imagens das gotas capturadas foram analisadas empregando o software SCA20. Desta forma, o ângulo de contato formado pela gota na superfície da amostra foi mensurado. As medidas para ângulo de contato foram realizadas para todas as amostras em triplicata (n=3), a temperatura ambiente. As medidas foram realizadas após 10 s (T = 10s) e a média ± desvio padrão destes valores foram calculados. A medida do ângulo de contato entre a gota a superfície do material caracteriza a hidrofilicidade desta superfície conforme apresentado na Tabela 3. Esta propriedade influencia diretamente na resposta biológica de um material implantado podendo alterar adsorção de proteínas, coagulação sanguínea e, principalmente, afetar a adesão celular. Tabela 3 -Ângulos de contato e condições de hidrofilicidade. θ= 0 Hidrofilicidade 0<θ< 90º Hidrofilicidade parcial θ > 90° Hidrofobicidade Fonte: Elaborado pela autora Os diferentes ângulos de contatos formados no limite da interceptação do líquido com o sólido estão apresentados na Figura 5. Quando ocorre o espalhamento da gota do líquido, a força de adesão entre as moléculas das duas fases supera a força de coesão; por outro lado, quando a força de atração entre as moléculas é superior a força de coesão entre as fases, não há molhabilidade ou espalhamento da gota. 41 Figura 5 -Representação dos níveis de interação gota-superfície de acordo com o ângulo de contato. Fonte: Thomazini et al. 58 . Figura adaptada. 3.2 Ensaios in Vitro para Investigação de Citotoxicidade, Genotoxicidade e Mutagenicidade das Membranas Para realização dos experimentos foram utilizadas células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) e células de calvária (pré-osteoblastos) de camundongos (MC3T3-E1), crescidas em meio de cultura DEMEM e α-MEM, respectivamente, suplementados com 10% de SFB e mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2. As células foram cultivadas e repicadas até atingirem a 3ª passagem. Como referência, cada ensaio contou com duplicatas de cada tratamento. Para cada ensaio foram feitas três repetições independentes. Para esses ensaios não foram utilizados os materiais contendo anticorpos, uma vez que é sabido da não toxicididade desses anticorpos, e devido ao alto custo desses componentes, sendo avaliados somente nos ensaios em que demonstrariam seu potencial de atividade. 3.2.1 Ensaios de citotoxicidade Ensaio XTT Linhagem CHO-K1 Foram semeadas 2x10 4 células em placas de 24 poços num volume de 1 mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB, e incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB, CB+HA, FS, FS+HA por 24 horas, além do controle negativo (CN = poços contendo apenas células com meio de cultura sem SFB e sem material). Cada poço recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFB com exceção do Controle Positivo (CP). 42 Para o CP, foi utilizado cloridrato de doxorrubicina (3,0 µg/mL por 24 horas). Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Após o tempo de incubação, as membranas foram removidos de cada poço, as culturas foram lavadas com 250 µL de PBS 1x e receberam 1,0 mL de meio de cultura suplementado com 10% de SFB. Após 24 horas, as culturas foram lavadas com 250 μL de PBS 1x e, com a câmara de fluxo com a luz apagada foi colocado em cada poço 500 µL de meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) sem fenol vermelho (Cultlab) com 60 μl da solução (Cell Proliferation Kit II – Roche Applied Science). Após 3 horas em estufa, 200 μL do meio de cada poço foi transferido para placa de 96 poços para leitura colorimétrica em espectrofotômetro (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 492 nm normalizada a 690 nm. A absorbância é considerada diretamente proporcional ao número de células metabolicamente ativas (células viáveis). Linhagem MC3T3-E1 Foram semeadas 5x10 3 células em placas de 48 poços num volume de 1 mL de meio α- MEM (1:1) suplementado com 10% de SFS e incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB+HA por 7,14 e 21 dias, além do controle negativo (CN = poços contendo apenas células com meio de cultura sem SFB e sem material). Cada poço recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFB com exceção do CP. Para o CP, foi utilizado cloridrato de doxorrubicina (3,0 µg/mL por 24 horas). Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Após o tempo de incubação, seguiu-se o mesmo protocolo da linhagem CHO- K1. Ensaio de Sobrevivência Clonogênica (ou Eficiência de Clonagem) Linhagem CHO-K1 Para o ensaio de sobrevivência clonogênica, foram semeadas 4x10 4 células em 1 mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB, incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB, CB+HA, FS, FS+HA por 24 horas, além do controle negativo (CN = poços contendo apenas células com meio de cultura sem SFB e sem material). Cada poço recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFB, com exceção do CP. O cloridrato de doxorrubicina (0,3 μg/mL por 4 horas) foi utilizado como CP. 43 Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Ao final do tratamento, as membranas e o meio de cultura foram removidos de cada poço e foram lavados com 250 μL de PBS 1x e receberam 1,0 mL de meio de cultura suplementado com 10% de SFB. Após 24 h, os poços foram lavados com 250 μL de PBS 1x, as células foram desprendidas por tripsinização e transferidas para um microtubo, num volume de 1 mL de meio de cultura para contagem em Câmara de Neubauer. Assim, para o ensaio de sobrevivência clonogênica, 150 células foram semeadas em cada frasco de cultivo (25 cm 2 ) com 5 mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFS, em duplicada, além dos CN e CP. Após 7 dias de cultivo, as células foram lavadas com 5 mL de PBS 1x a 37°C. Foi descartado o PBS e as células foram fixadas com metanol:ácido acético:água destilada (1:1:8) a 37°C, por 30 minutos. As colônias foram coradas com 5 mL do corante Giemsa diluído em tampão fosfato a 37°C, na proporção de 1:20, por 20 minutos. Depois de coradas, as células foram lavadas com água destilada, para remover o excesso de corante. O número de colônias contadas no CN foi considerado como 100%. A partir disso, foram realizados os cálculos das frações de sobrevivência (FS): FS = nº de colônias contadas em cada tratamento x 100 nº de colônias observadas no CN Linhagem MC3T3-E1 Foram semeadas 6x10 4 células em placas de 24 poços num volume de 1 mL de meio α- MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB e incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB+HA por 24 horas, além do controle negativo (CN = poços contendo apenas células com meio de cultura sem SFB e sem material). Cada poço recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFB com exceção do CP. Para o CP, foi utilizado cloridrato de doxorrubicina (0,3 µg/mL por 4 horas). Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Após o tempo de incubação, seguiu-se o mesmo protocolo da linhagem CHO- K1, alterando-se apenas a quantidade de células semeadas de 150 para 300 células em frasco de cultivo (25 cm 2 ) com 5 mL de meio meio α-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB. 44 3.2.2 Teste de genotoxicidade Linhagem CHO-K1 Para o teste de genotoxicidade foi utilizada a metodologia descrita por Singh 41 para a versão alcalina do Ensaio Cometa. Foram semeadas 40x10 3 células em 1mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB em placas de 24 poços, que foram incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2. No segundo dia, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB, CB+HA, FS, FS+HA por 24 horas em cada poço em duplicata, além do CN (sem membrana). Para o Controle Positivo foi utilizada a solução de Peróxido de Hidrogênio (80 µM por 5 minutos). Ao final do tratamento, as membranas foram removidas com uma pinça. As células foram lavadas com 250 µL de PBS 1x e receberam 1,0 mL de meio de cultura suplementado com 10% de SFB. Após 24 h, os poços foram lavados com 250 μL de PBS 1x, as células foram desprendidas por tripsinização e transferidas para microtubos, os quais foram centrifugados por 3 minutos a 2000 rpm. O pellet de células foi homogeneizado com 0,5% de agarose de baixo ponto de fusão em volume suficiente para 200 µL. Esta solução de agarose com as células foi igualmente dividida e aplicada em 2 lâminas histológicas pré-gelificadas com 1,5% de agarose com ponto de fusão normal. Em seguida, foram cobertas com lamínulas e deixadas em geladeira por 10 minutos, quando após cuidadosa retirada da lamínula, as lâminas foram imersas em uma solução de lise (1% Triton X-100, 10% DMSO, 2,5 mmol.L-1 NaCl, 100 mmol.L-1 Na2EDTA, 100 mmol.L-1 Tris, pH 10) por 12 horas protegidas da luz em geladeira. Posteriormente, as lâminas ficaram imersas em tampão de eletroforese alcalino (1 mmol.L-1 Na2EDTA, 300 mmol.L-1 NaOH, pH 13) por 20 min para desnaturação do DNA. Em seguida, foi realizada corrida em eletroforese a 43 V e 308 mA por 25 min. Ao final, as lâminas foram transferidas para um recipiente contendo tampão de neutralização (Tris-HCl, pH 7,5) por 15 min, protegidas da luz em geladeira. Após secagem das lâminas a temperatura ambiente, as mesmas foram fixadas em etanol absoluto por 3 min. A análise foi feita em microscópio de fluorescência após coloração da lâmina com de 80 μL de solução de brometo de etídeo (0,2 M). O dano ao DNA foi avaliado por um sistema de análise de imagem (TriTek CometScore®1.5, 2006, Sumerduck, VA, EUA). A porcentagem de DNA na cauda e Tail Moment foram obtidos para cada tratamento, sendo analisados 100 nucleóides para cada repetição. A análise do Tail Moment permite relacionar a quantidade de DNA fragmentado com a distância que os fragmentos migraram durante a eletroforese 60 . 45 Linhagem MC3T3-E1 Foram semeadas 50x10 3 células em 1mL de meio α-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB em placas de 24 poços, que foram incubadas a 37ºC em estufa com 5% de CO2. No segundo dia, foram realizados os tratamentos colocando-se as membranas CB+HA em cada poço em duplicata por 24 horas, além do CN (sem membrana). Para o Controle Positivo foi utilizada a solução de Peróxido de Hidrogênio (80 µM por 5 minutos). Após o tratamento, seguiu-se o mesmo protocolo da CHO-K1, alterando-se novamente apenas no período de contato da solução de lise (1% Triton X-100, 10% DMSO, 2,5 mmol.L-1 NaCl, 100 mmol.L- 1 Na2EDTA, 100 mmol.L-1 Tris, pH 10) por apenas 2 horas protegidas da luz em geladeira. 3.2.3 Teste de mutagenicidade Linhagem CHO-K1 O protocolo adotado para o teste de mutagenicidade foi o descrito por Fenech et al. 45 com algumas adaptações. Foram semeados 37x10 4 células em garrafas de 25 cm², contendo 5 mL de meio HAM-F10:D-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos por 24 horas, colocando-se as membranas CB, CB+HA, FS, FS+HA em cada garrafa, além do controle negativo (CN = garrafas contendo apenas células sem meio de cultura com SFB e sem material). Cada garrafa recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFB com exceção do CP. O CP constou de cloridrato de doxorrubicina (0,15 μg/mL) por 4 horas. Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Foram adicionados 25μl de citocalasina B (1mg/ml) em cada garrafa de 25 cm² por 24 h para interromper a citocinese. Após o término dos tratamentos, as células foram lavadas, tripsinizadas, o conteúdo das garrafas foi transferido para um tubo tipo Falcon de 15 mL e centrifugados por 7 minutos a 1000 rpm. O pellet de células foi ressuspendido em solução hipotônica gelada (KCl 0,3%) por 5 min. Essa suspensão celular foi centrifugada novamente e ressuspensa em 3 mL de fixador metanol:ácido acético (3:1) juntamente com quatro gotas de formol 1% e cuidadosamente homogeneizado com pipeta Pasteur. Após nova centrifugação, foi desprezado o sobrenadante e a suspensão gotejada em 2 lâminas previamente limpas em metanol e mantidas em água destilada gelada. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa 3% diluído em tampão fosfato (Na2HPO4 0,06 M e KH2PO4 0,06 M – pH 6,8) por 7 minutos, lavadas com água destilada e seca a temperatura ambiente. 46 Para a determinação do Índice de Divisão Nuclear (IDN), 500 células viáveis com citoplasma bem preservado foram contadas por lâmina codificada, usando um microscópio Leica DM500 e anotando-se as células que contiverem de 1 a 4 núcleos. O IDN foi calculado de acordo com Eastmond e Tucker 61 utilizando a fórmula: IDN = [ M1 + 2(M2) + 3(M3) + 4(M4) ]/N, onde M1 a M4 é o número de células com 1, 2, 3 e 4 núcleos, respectivamente; e N é o número total de células viáveis. Além disso, pela contagem de 1000 células binucleadas, foram analisadas a frequência de células binucleadas com micronúcleos (FBMN) e a frequência total de micronúcleos (FMN). Os critérios utilizados para identificação de micronúcleos foram baseados em Fenech et al 45 . Linhagem MC3T3-E1 Foram semeados 40x10 4 células em garrafas de 25 cm², contendo 5 mL de meio α-MEM (1:1) suplementado com 10% de SFB. No dia seguinte, foram realizados os tratamentos por 24 horas, colocando-se as membranas CB+HA em cada garrafa, além do controle negativo (CN = garrafas contendo apenas células com meio de cultura sem SFB e sem eluato). Cada garrafa recebeu posteriormente uma suplementação de 10% de SFS com exceção do CP. O CP constou de cloridrato de doxorrubicina (0,15 μg/mL) por 4 horas. Todos os tratamentos e os CN e CP foram realizados em duplicata. Foram adicionados 25 μl de citocalasina B (1 mg/ml) em cada garrafa de 25 cm² por 48 h, para interromper a citocinese. Após o tratamento, seguiu-se o mesmo protocolo da CHO-K1. Análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando o Programa GraphPad Prism 5.01 e todos os testes estatísticos foram considerados ao nível de significância de 5%. Os dados variaram entre paramétricos (apresentando aderência à curva normal) e não-paramétricos. Assim, para os paramétricos foram aplicadas a análise de variância (ANOVA) one-way, seguido do teste de Tukey. Também foi aplicado o teste de Dunnet, que compara os valores obtidos de cada um dos tratamentos com o de uma referência (no caso, o Controle Negativo). Para dados não- paramétricos foi aplicado o teste de Kruskall-Wallis, seguido do teste de Dunn. 47 3.3 Imobilização do Anticorpo Monoclonal Anti-BMP-2 nas Membranas de Celulose Bacteriana e Verificação da Cinética de Adsorção do Anticorpo inVitro O anticorpo anti-BMP-2 foi comprado comercialmente e imobilizado nas membranas de acordo com Freire et al. 35 . O anticorpo foi diluído em solução salina (PBS) numa concentração de 25 μg/mL e incorporado por adsorção nas membranas de 25 mm de diâmetro por 24 horas. 3.3.1 Estudos de adsorção e quantificação de anticorpos in vitro Para avaliar a adsorção dos anticorpos anti-BMP-2 nas membranas, os materiais contendo os anticorpos foram suspensos em 5 mL de PBS (pH = 7,4). Em vários períodos de tempo (1, 3, 7 e 14 dias), a quantidade de anticorpo liberada foi detectada por anticorpos secundários anti-IgG de rato conjugados com FITC por meio de microscopia de imunofluorescência 62 . A análise de quantificação foi realizada por meio das fotografias capturadas pelo microscópio de fluorescência dos respectivos períodos e pelo uso do programa Image J. 3.4 Expressão Gênica Foram cultivadas 5x10 3 células de calvária (pré-osteoblastos) de camundongos (MC3T3-E1) sobre cada material objeto de investigação em placas de 48 poços, além do Controle Negativo (sem material) e Controle Positivo (200ng/ml proteína BMP-2). As células foram cultivadas com 1 mL de meio osteogênico composto de: meio modificado de Dulbecco (DMEM) contendo SFB a 10% , penicilina–streptomicina (PS) a 1%, ß-glicerofosfato 2M e ácido ascórbico 50ug/ml durante 7, 14 e 21 dias de contato do material. O meio de cultura foi mudado uma vez a cada três dias 65 . Após o tratamento, as células MC3T3-E1 foram submetidas à extração do RNA total por meio de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) segundo o protocolo recomendado pelo fabricante. A concentração do RNA extraído de cada amostra foi medida por densidade óptica por meio do Nanodrop (ThermoScientific). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado por transcrição reversa utilizando o OligodT(20) com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Invitrogen™) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foram realizadas pelo sistema TaqMan (Applied Biosystems, Foster City), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. O gene para controle endógeno da reação foi o Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase (GAPDH, cat. nº Mm99999915_g1), cujo nível de 48 expressão foi usado para normalizar a expressão dos genes de interesse: SPP1 (Osteopontina; cat. nº Mm00436767_m1), ALPL (Fosfatase Alcalina; cat. nº Mm00475834_m1), TNFRSF11B (Osteoprotegerina; cat. nº Mm01205928_m), RUNX2 (RUNX; cat. nº Mm00501584_m1), BGLAP (Osteocalcina; cat. nº Mm00649782_gH) e VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular; cat. nº Mm01281449_m1). Foi realizada a validação do sistema gene de interesse/controle endógeno, a fim de verificar se as eficiências de amplificação de ambos os genes eram semelhantes e próximas a 100%. Para a quantificação relativa do gene selecionado, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em duplicata a partir de: 6,25μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 0,625 μL da solução de primers e sonda (ensaio TaqMan), 1,625 μL de água e 4,0 μL de cDNA (50 ng), sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 μL de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos e 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa dos genes de interesse foram analisados utilizando o software Expression Suite (Applied Biosystems®). O software utiliza o método comparativo Cτ (ΔCτ) para quantificar com precisão a expressão gênica relativa dos genes analisados. Após normalização pela expressão do gene controle endógeno, os valores de expressão para cada gene alvo foram obtidos, sendo apresentados em gráficos os resultados do fold change (2 -ΔCt ). A análise estatística foi realizada utilizando o Programa GraphPad Prism 5.01 e todos os testes estatísticos foram considerados ao nível de significância de 5%. Foram aplicadas a análise de variância (ANOVA) two-way, seguido do teste de Bonferroni. 3.5 Detecções da Formação de Nódulos Minerais por Coloração com Vermelho de Alizarina Para a avaliação da formação de nódulos de mineralização foram utilizadas 5x10 3 células de calvária (pré-osteoblastos) de camundongos (MC3T3-E1) crescidas em 1 ml de meio osteogênico. As células foram semeadas em placas de petri de 90 mm x 15mm em contato com a membrana CB-HA-anti-BMP-2 durante o período de 7, 10 e 14 dias. As células MC3T3-E1 cultivadas sobre as placas de cultura celular foram lavadas com solução de PBS, fixadas em formaldeído 4% por 30 min, e lavadas na sequência com PBS. Em seguida, foram coradas com vermelho de Alizarina a 40 mM pH 4,2, a temperatura ambiente por 30 min. Para a avaliação quantitativa da formação de nódulos minerais, o corante foi diluído com solução de ácido acético 10% e hidróxido de amônia 10%. Posteriormente, 150 µl desta 49 solução foram transferidos para uma placa de 96 poços e a leitura da absorbância das amostras foi realizada por um espectrofotômetro (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com comprimento de onda de 405 nm . 3.6 Atividade da ALP A atividade de ALP foi avaliada utilizando 5x10 3 células de calvária (pré-osteoblastos) de camundongos (MC3T3-E1) crescidas em placas de 48 poços com 1 ml de meio osteogênico em contato com a membrana CB-HA-anti-BMP-2 durante o período de 7, 10 e 14 dias de incubação, por meio da liberação de timolftaleína por hidrólise do substrato de timolftaleína monofosfato, utilizando kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (Labtest Diagnóstica, Belo Horizonte, MG, Brasil). A absorbância da reação foi avaliada em espectrofotômetro (VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), utilizando comprimento de onda de 590 nm e a atividade de fosfatase alcalina, medida a partir da curva padrão usando a timolftaleína. Os dados foram normalizados pelo conteúdo de proteína total, que foi determinado pelo método de Lowry. As proteínas foram extraídas inicialmente de cada poço adicionando-se 1 mL/poço de lauril sulfato de sódio a 0,1% (Sigma®) por 40 min em temperatura ambiente (TA). Uma quantidade de 100 µL da solução de Lowry (Sigma) foram adicionados a 150 µL das amostras e incubadas por 20 min, em temperatura ambiente. Após a incubação, foram adicionados 50 µL da solução de Folin & Ciocalteu’s (Sigma) e incubadas por 30 min em temperatura ambiente. A absorbância foi avaliada a 595 nm utilizando espectrofotômetro (ELx 800, Bio-Tec). O conteúdo de proteína total foi então calculado através de curva padrão determinada a partir de albumina bovina e expresso em µg.mL -1 . 3.7 Quantificação da Produção de IL-6 e TGF-ß por Ensaio Imunoenzimático (ELISA) A produção de IL-6 e TGF-ß foi quantificada nos sobrenadantes de culturas de células de linhagem MC3T3-E1 crescidas em contato com a membrana CB-HA-anti-BMP-2 durante o período de 7, 14 e 21 dias, coletados durante o ensaio de expressão gênica. Os limites de detecção mínimos foram 31,25 pg/mL para IL-6 e 15,625 pg/mL para TGF-ß (R&D System – DuoSet ELISA). Os procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. 50 4 RESULTADOS 4.1 Avaliações da Toxicidade da Fibroína: Ensaio de Citotoxicidade e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para Confirmação da Separação e Eliminação da Proteína Serecina Considerando a viabilidade celular obtida no CN como valor referência, foi observada diferença significativa somente em relação à solução restante da extração do casulo com NaCO3 (solução C) (p<0,0001; Dunnett), pois continha serecina, demonstrando o potencial citotóxico da mesma (Figura 6). Figura 6 -Citotoxicidade (viabilidade celular) avaliada pelo método XTT. Colunas indicam o valor médio da viabilidade celular. Barras indicam o erro padrão. O símbolo *** indica diferença estatisticamente significante em relação à CN (p<0,0001). Teste de Dunnett. Fonte: Elaborado pela autora 4.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Por meio do estudo do CLAE, foi possível identificar dois picos na solução restante da extração do casulo com NaCO3 (Figura 7). O primeiro pico aparente em torno de 0,04 volts (eliminado em torno de 10 minutos de análise) é correspondente à proteína serecina, e o segundo pico menor em torno de 0,01 volts (eliminado em torno de 20 minutos de análise) é correspondente à proteína fibroína. 0 20 40 60 80 100 120 140 CN CP A B C D E V ia b il id a d e C el u la r (% ) *** *** (A) Casulo (B) Algodão (C) Sol. restante da extração com NaCO3 (D) Sol. final obtida pela sol. LiBr (E) Sol. final obtida pela sol. CaCl2 51 Figura 7 -CLAE da solução restante da extração do casulo com NaCO3. Fonte: Elaborado pela autora A análise de CLAE realizada nas soluções viscosas finais obtidas a partir das soluções de LiBr e de CaCl2 permite identificarmos a redução do primeiro pico de 0,04 para 0,01 volts e o aumento significativo do segundo pico de 0,01 para 0,1 volts, ou seja, a proteína serecina é praticamente eliminada da amostra e a proteína fibroína passa ser relativamente expressa, como pode ser visto nas Figuras 8 e 9, pelas soluções de LiBr e de CaCl2, respectivamente. Figura 8 -CLAE da solução viscosa final obtida a partir da solução de LiBr. Fonte: Elaborado pela autora 52 Figura 9 -CLAE solução viscosa final obtida a partir da solução de CaCl2. Fonte: Elaborado pela autora Esses estudos preliminares demonstraram que a extração da serecina foi realizada de forma efetiva, proporcionando a eficácia do processo de extração da proteína fibroína e o caráter não citotóxico da mesma pelo ensaio XTT. 4.2 Caracterização das Membranas 4.2.1 Análise dos grupos funcionais relacionados às fases de apatita precipitada nas membranas por FTIR A Figura 10 apresenta espectros de infravermelho para as amostras CB e CB-HA. 53 Figura 10 -Espectro vibracional na região do infravermelho obtido das amostras CB e CB- HA. Fonte: Elaborado pela autora As principais atribuições que caracterizam a celulose são: ~3450cm -1 - estiramento OH; ~2900 cm -1 - estiramento CH de alcanos e estiramento assimétrico CH2; 2700 cm -1 - estiramento simétrico CH2; 1645 cm -1 - deformação OH; 1432 cm -1 - deformação CH2; ~1370 cm -1 - deformação CH3; ~1332 cm -1 - deformação OH e na região de 1320 -1030 cm -1 deformação CO 56 . As membranas de CB-HA apresentaram um espectro com bandas de fosfato típicas com estrutura de apatita. Bandas intensas foram observadas em 1093, 1020, 962, 570-600 cm -1 correspondentes ao estiramento dos íons (PO4 3− ) 55, 63,64 . As bandas com intensidade baixa localizadas ao redor de 1428 e 838 cm -1 correspondem ao estiramento de íons (CO3 2− ) 55. A banda de baixa intensidade em torno de 3500–3200 cm −1 (estiramento OH) observado no espectro da CB sofreu um leve decréscimo na intensidade no espectro do compósito CB- HA, sugerindo possível interação dos cristais de HA com os grupos hidroxilas da celulose. A Figura 11 apresenta espectros de infravermelho para as amostras FS e FS-HA. 54 Figura 11 -Espectro vibracional na região do infravermelho obtido das amostras FS e FS-HA. Fonte: Elaborado pela autora As principais atribuições que caracterizam a fibroína são: bandas de absorção em: 1643, 1598, e 1243, são característicos de bandas de amida I, amida II, amida III. A absorção das bandas em 1634 e 650 cm -1 é característica das bandas de amida I e amida V. As bandas em 631 e 3470 cm -1 pertencem à vibração da hidroxila. As bandas 1045 e 1091 cm -1 são característicos das bandas de vibração de alongamento do fosfato, enquanto as bandas em 603 e 570 cm -1 são devido à vibração de flexão de fosfato 66 . A intensidade de vibração em 1072 cm -1 diminuiu devido ao aumento de HA e, praticamente desapareceu devido à vibração do fosfato em 1045 cm -1 . No espectro de FS, a absorção da carbonila da amida em 1634 cm -1 foi atribuída à estrutura folha α-hélice, enquanto no espectro de FS-HA essa banda diminuiu, o que sugere que a hidroxiapatita tenha revestido o filme de fibroína, impedindo a detecção dessa proteína pelo FTIR. 4.2.2 Morfologia e estrutura dos respectivos compósitos bem como a análise dos cristais de apatita incorporado aos compósitos por MEV/EDS A micrografia das superfícies das membranas CB-HA revelaram cristais de HA de ordem nanométrica recobrindo as fibras da CB de forma homogênea e se observou também poros distribuídos regularmente na superfície da membrana (Figura 12). 55 Figura 12 -Micrografia de MEV das membranas de CB e CB-HA: A. Superfície da CB, aumento 10x; B. Superfície da CB, aumento 50x; C. Superfície da CB-HA, aumento 10x; D, superfície da CB-HA, aumento 50x. Fonte: Elaborado pela autora A micrografia das superfícies das membranas FS-HA revelaram cristais de HA de ordem nanométrica recobrindo a superfície da FS de forma homogênea e se observou também que algumas regiões ocorreram uma deposição aumentada dos cristais (Figura 13). A B C D 56 Figura 13 -Micrografia de MEV das membranas de FS e FS-HA. A. Superfície da FS, aumento 10x; B. Superfície da FS, aumento 50x; C. Superfície da FS-HA, aumento 10x; D. Superfície da FS-HA, aumento 50x. Fonte: Elaborado pela autora Os dados do EDS mostraram que as razões molares Ca/P qualitativamente mensuradas estão de acordo com a morfologia dos cristais de HA observados para as amostras CB-HA. De acordo com a Tabela 4, que mostra a ocorrência dos fosfatos de cálcio em sistemas biológicos, podemos concluir que o compósito CB-HA obteve uma razão molar Ca/P entre 1,49-1,54 com uma média de 1,52, dados estes referentes à hidroxiapatita deficiente em cálcio (CDHA) (Figura 14A). Nos compósitos FS-HA (Figura 14B) foi obtido uma razão molar Ca/P entre 1,28-1,32 com uma média de 1,30, podendo esta razão molar Ca/P ser referente a um fosfato octacálcio 74 . A B C D 57 Tabela 4 -Fosfatos de cálcio em sistemas biológicos. Fase da apatita, fórmula química e razão molar Ca/P. Fase da apatita Fórmula razão molar Ca/P fosfato dicálcio (monetita) - DCP CaHPO4 1,0 fosfato dicálcio dihidratado (brushita) - DCPD CaHPO4.2H2O 1,0 pirofosfato de cálcio - CPP Ca2P2O7 1,0 fosfato octacálcio - (OCP) Ca8H2(PO4)6.5H2O 1,33 fosfato de cálcio amorfo - (ACP) ------------ 1,40 - 1,50 α e β-fosfato tricálcio - (α e β-TCP) (Ca)9(PO4)6 1,48 hidroxiapatita deficiente em cálcio - (CDHA) Ca9(HPO4)(PO4)5(OH) 1,52