DANIARA CRISTINA FERNANDES Estudo químico e atividade biológica de Garcinia xanthochymus (Clusiaceae) Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química Orientadora: Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva Araraquara 2010 SÚMULA CURRICULAR DANIARA CRISTINA FERNANDES DADOS PESSOAIS � Nascimento: 16/11/1981 � Nacionalidade: Brasileira � Naturalidade: Jáu/SP � Estado civil: Solteira � Filiação: Wilson Fernandes Marilda Aparecida Marquesan Fernandes � Profissão: Química � Endereço: Av. Sorocaba n° 2128, Vila Quitandinha, Araraquara-SP � Telefone: (16) 9186 5788 � E-mail: daniaraf@gmail.com FORMAÇÃO ACADÊMICA � Licenciatura em Química Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Período: 2003-2007 � Mestrado em Química Área de Concentração: Química Orgânica Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” ESTÁGIOS REALIZADOS � Iniciação à Pesquisa Científica Título do projeto: Estudo químico e atividade antioxidante de Pterogyne nitens (Leguminosae) Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Orientação: Dulce Helena Siqueira Silva Período: 2006-2007 Bolsa: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP PARTICIPAÇÕES EM CONGRESSOS E COMISSÕES � Perfil químico e atividade biológica das folhas de Garcinia xanthochymus (clusiaceae). 2009. 17° Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química, Araraquara-SP. � Obtenção e estudo do potencial de híbridos orgânico-inorgânicos para aplicações como filtros em protetores solares. 2009. 17° Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química, Araraquara-SP. � The leaves chemical profile and biological activity of Garcinia xanthochymus. 2009. 2º Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro-SP. � Perfil químico e atividade biológica das folhas de Garcinia xanthochymus (Clusiaceae). 2009. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Fortaleza-CE. � Perfil cromatográfico por HPLC-DAD e atividade biológica dos extratos dos frutos de Eugenia jambolana (Myrtaceae). 2009. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Fortaleza-CE. � Identificação de triterpenos e esteróides de Pterogyne nitens (Fabaceae- Caesalpinioideae) utilizando cromatografia gasosa de alta resolução. 2008. XII Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas e III Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afins, Florianópolis-SC. � Atividade sequestradora de radicais livres de extratos obtidos de Pterogyne nitens (Fabaceae). 2007. Simpósio Paulista de Farmacognosia, Araraquara-SP. � Myeloperoxidase inhibitory flavonoids from fruits and leaves of Pterogyne nitens (Fabaceae). 2007. 48th Annual Meeting of the American Society of Pharmacognosy, Portland-OR, EUA. � Avaliação eletroquímica de flavonóides isolados de Pterogyne nitens (Fabaceae) empregando voltametria cíclica. 2007. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP. � Interaction of potential antimalarial guanidine alkaloids from Pterogyne nitens (Leguminosae) with heme using spectrophotometry. 2007. 6th International Congress of Pharmaceutical Sciences, Ribeirão Preto-SP. � Mieloperoxidase inhibitory flavonoids from fruits and leaves of Pterogyne nitens (Fabaceae). 2007. 1st Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro-SP. � Study of interaction of potential antimalarial guanidine alkaloids and flavonoids from Pterogyne nitens (Leguminosae) with heme using spectrophotometry. 2007. 1st Brazilian Conference on Natural Products, São Pedro-SP. � Alternativas às barreiras encontradas na aplicação de teorias pedagógicas no ensino de química. 2007. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP. � Pterogyne nitens (FABACEAE) como fonte de produtos naturais bioativos. 2007. XV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades Grupo Montevideo, Assunción, Paraguai. � Ação antioxidante e constituintes químicos de Pterogyne nitens (Leguminosae). 2006. XVIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Bauru-SP. � Atividade antiinflamatória e constituintes químicos das folhas de Pterogyne nitens (Leguminosae). 2006. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP. � Busca de substâncias antioxidantes em Pterogyne nitens (Leguminosae) empregando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica. 2006. II Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afins, São Pedro-SP. � O desenvolvimento de uma concepção científica através de metodologias alternativas. 2006. XIII Encontro Nacional do Ensino de Química, Campinas-SP. � Três diferentes concepções geradas a partir de uma parceria Universidade-Escola Pública diferenciada. 2006. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP. � Atividade antiinflamatória e constituintes químicos das folhas de Pterogyne nitens (Leguminosae). 2006. I Escola de Inverno da USP-RP. � Estudo dos constituintes químicos de baixa polaridade de Pterogyne nitens (Leguminosae). 2005. XII Congresso de Iniciação científica da UNESP, Araraquara-SP. � Espaços não-formais: motivação para a aprendizagem do ensino de física promovendo a educação científica. 2005. V Encontro Nacional de Pesquisa em Educação em Ciências, Bauru-SP. � Centro de Ciências de Araraquara: Plantão de Dúvidas. 2004. II Evento de Educação em Química, Araraquara-SP. � Educação científica em espaços não-formais promovendo o ensino de química. 2004. XII Encontro Nacional do Ensino de Química, Goiânia-GO. � Plantão de dúvidas como agente facilitador no processo ensino-aprendizagem em Química. 2004. XII Encontro Nacional do Ensino de Química, Goiânia-GO. � Comissão organizadora do VI Simpósio e VI Reunião de Avaliação do Programa Biota-Fapesp, 2008, Araraquara-SP. � Organização do III e IV Workshop do NuBBE, 2008 e 2009, Araraquara-SP. TRABALHOS CIENTÍFICOS PUBLICADOS � Regasini, L. O.; Vieira-Júnior, G. M.; Fernandes, D. C.; Bolzani, V. S.; Cavalheiro, A. J.; Silva, D. H. S. Identification of triterpenes and sterols from Pterogyne nitens (Fabaceae-Caesalpinioideae) using high-resolution gas chromatography. Journal of the Chilean Chemical Society. v. 54, n. 3, p. 218-221, 2009. � Regasini L. O.; Fernandes D. C.; Silva D. H. S.; Furlan M.; Barreiro E. J.L.; Young M. C. M.; Bolzani V. Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens (Caesalpinioideae). Química Nova. v. 31, p. 802-806, 2008. � Fernandes D. C.; Regasini L. O.; Vellosa J.C. R.; Oliveira O. M.; Bolzani V.; Castro- Gamboa I.; Silva D. H. S. Myeloperoxidase inhibitory and radical scavenging activities of flavones from Pterogyne Nitens. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 56, n. 5, p. 723-726, 2008. INFORMAÇÕES ADICIONAIS � Premiações: - Auxílio-mérito pelo trabalho intitulado “Avaliação eletroquímica de flavonóides isolados de Pterogyne nitens (Fabaceae) empregando voltametria cíclica” apresentado na 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. - Resumo completo selecionado pela PROEX entre os 40 melhores da UNESP. O trabalho intitulado como “Pterogyne nitens (FABACEAE) como fonte de produtos naturais Bioativos” foi selecionado para apresentação oral e premiado como melhor trabalho na categoria de Produtos naturais bioativos e suas aplicações, Reunião da AUGM, Assunción, Paraguai, 2007. - Seleção entre os alunos do Instituto de Química/Araraquara/UNESP para cursar a disciplina intersemestral “Métodos Modernos de Caracterização Estrutural e Dinâmica de proteínas” oferecida pelo Instituto de Química da UNICAMP em janeiro de 2007. Aos meus pais Wilson Fernandes e Marilda Ap. M. Fernandes que me auxiliaram a continuar com dedicação esta pesquisa, por toda compreensão, por terem lutado para eu chegar à universidade e por estarem sempre comigo... As minhas irmãs e verdadeiras amigas Daniele G. Fernandes e Daniane M. Fernandes, por compartilharem solidariamente a alegria das vitórias e o dissabor dos insucessos... Ao meu noivo Marco Aurélio Cebim, minha maior conquista e credor do meu amor, carinho e respeito... DEDICO ESTE TRABALHO AGRADECIMENTOS Foram longos momentos de desafios e provações, porém momentos de intenso aprendizado e prazer. Muitas pessoas se notabilizaram por suas relevantes e despretensiosas cooperações, por isso terão seus nomes merecidamente mencionados, como forma de perpetuar suas valiosas participações. Meu grato reconhecimento: À Deus por estar ao meu lado mesmo quando eu estava longe e perdida... À doce profª Dra. Dulce Helena Siqueira Silva que me proporcionou grandes oportunidades de aprendizado, me mostrando sempre as opções e me apoiando nas minhas decisões. Agradeço pela confiança em mim depositada durante a realização deste trabalho e ainda, pelos ensinamentos, que com sua seriedade, tranquilidade e conhecimento, me guiaram para caminhos corretos e compensadores. Agradeço por ter despertado em mim o interesse pelo estudo das plantas. Muito obrigada... Ao meu mestre Dr. Ian Castro-Gamboa, pesquisador obstinado e perfeccionista, o qual instigou minha paixão pela Química Orgânica e mesmo que distante, sua ousadia, motivação, alegria e capacidade intelectual me contagiam... À profª Dra. Márcia Nasser e à profª Dra. Ângela R. Araújo, por sempre estarem dispostas a transmitir seus valiosos ensinamentos e por me incentivarem nesta longa caminhada. Meu estimado apreço pelo exemplo de docente, pesquisador e principalmente ao exemplo relacionado ao valor da vida... Aos professores Dra. Vanderlan da Silva Bolzani, Dr. Alberto Cavalheiro, Dr. Lúcia Xavier, Dr. Maysa Furlan, Dra. Isabele Rodrigues Nascimento e Dra. Lourdes C. dos Santos, pela convivência e pelo aprendizado durante meus seis anos no laboratório... Aos professores, membros da banca, que gentilmente aceitaram o convite de ler este manuscrito... Ao Dr. Nivaldo Boralle, pela realização dos espectros de RMN, por seus valiosos conhecimentos e ensinamentos, pelos bons momentos de descontração, pela sua seriedade e disponibilidade em resolver meus “pepinos” e claro, por cuidar muito bem do Nerinho. Um cão é a única coisa na terra que nos ama mais do que ama a sí mesmo... Ao Dr. Alberto C. Alécio, pela amizade, compreensão, por seus ensinamentos, por estar sempre solícito quando é necessário, e principalmente pela humildade em lidar com as pessoas. Admiro pessoas como vc... Aos professores Dr. Norberto Peporine (USP- Ribeirão Preto) e ao especialista em Laboratório Dr. José Carlos Tomaz, pela realização dos espectros de massas, imprescindíveis para a elucidação estrutural das substâncias isoladas neste trabalho... Ao professor Antonio Gilberto Ferreira da Universidade Federal de São Carlos pelas medidas dinâmicas de RMN... Ao prof° Dr. Wagner Vilegas e em especial as doutorandas Juliana Severi e Juliana Rodrigues pela presteza na realização das medidas ópticas... À profª Dra. Mary Rosa R. de Marchi e seu orientado Flavio Soares Silva pela disponibilidade do equipamento de CG-EM... Aos Professores integrantes do Projeto Temático Biota/Bioprospecta-Fapesp e seus orientados pela realização dos ensaios farmacológicos. Em especial as alunas Tarsia, pelo ensaio quimiopreventivo; Mariana, pelo ensaio tripanocida e Luciana pelos ensaios antifúngicos... Ao meu amigo, irmão e mestre Dr. Luis Octávio Regasini pelo seu esmero e dedicação na pesquisa e transmissão de conhecimentos científicos agregados a valores éticos (elementos fundamentais para uma boa qualificação profissional) e pelas oportunidades concedidas para meu aperfeiçoamento acadêmico, as quais têm me permitido acessar novos campos de estudo. “Espero corresponder às suas expectativas.” Aos amigos Amanda, Marcos, Marília, Vanessa, Sheila, Carol, Welington, Aline, Néia, Mike, Ana, Juliana, Thais, Luciene, Andréinha, João Marcos, Sílvia, Lidiane, Marcos Marçal, Sara, Otávio, Luciana, Magela, Vânia, Vivi, Cristiano e Fernando, por terem me ensinado muito sobre suas experiências em Química de Produtos Naturais, durante o período de Graduação e Pós-Graduação, cujo aprendizado acelerou o amadurecimento da minha formação científica. “Sou grata pelas informações que produziram atalhos, e pelo apoio emocional que me fortaleceu durante a caminhada.” À minha amiga Alessandra Cr. Dametto, minha parceira no estudo fitoquímico, nos grupos de sala de aula, nas confraternizações, nos congressos e como não se lembrar, das incansáveis organizações. Muito obrigada por fazer parte da minha história... As minhas amigas inseparáveis Adriana, Sheila, Patrícia e Rosilene “O quarteto fantástico”, ou melhor, “As agregadas” e à Thayz, por me ajudarem sempre, me acolherem e me ouvirem. Por tudo que vivemos juntas desde a graduação até hoje, amigas verdadeiras que quero sempre em minha vida, mesmo longe... Aos colegas da gradução Aroldo, Flavia, João Medeiros, Leandro, Mônica, Éderson, Fabrícia, Renata, Jeane, Paulo, Ademar e Jorge, por fazerem parte da minha vida até hoje... À FAPESP pela bolsa concedida e apoio financeiro ao projeto. “Primeiro aprenda a ser um artesão. Isso não impedirá você de ser um gênio”. Eugène Delacroix Resumo RESUMO A espécie Garcinia xanthochymus, comumente conhecida como Gamboja, é uma árvore nativa da Índia com aproximadamente 8-10 metros, utilizada extensamente na medicina popular como antidiarréica. Este trabalho descreve o estudo químico e biológico das folhas e frutos de G. xanthochymus. Dentre as substâncias isoladas, podemos destacar 3 triterpenos obtidos do extrato hexânico das folhas: friedelina (1), lanosta-8,24-dien-3-ol (2) e lanosta- 7,24-dien-3-ol (3), sendo as substâncias 2 e 3 relatadas pela primeira vez na literatura da espécie. A prospecção química da fase acetato de etila das folhas revelou uma abundante presença de biflavonóides, sendo as substâncias saharanflavona (4), I3, II8-biapigenina (5), GB1a (6), (+)-morelloflavona (8), GB2a (11), volkensiflavona (12), GB2 (14), xantochimusídeo (15) e fukugisídeo (16), caracterizadas pela ligação interflavonoídica do tipo 3�8’’, e as substâncias podocarpusflavona (7) e amentoflavona (9), pela ligação do tipo 3’�8’’. Merece destaque a substância 4, isolada pela primeira vez de fontes naturais. A composição química de G. xanthochymus constituiu-se ainda das substâncias diidrokaempferol (10), ácido vanílico (13), cinco derivados de ácidos fenilpropanoídicos: ácido 3-O-cafeoilquínico (17), ácido 5-O-cafeoilquínico (18), ácido 3-p-coumaroilquínico (21), ácido 4-O-cafeoilquínico (22) e ácido 4-p-coumaroilquínico (23); e ainda a mistura binária das benzofenonas xantochimol (19) e cicloxantochimol (20). Todas as substâncias foram relatadas pela primeira vez nas folhas de G. xanthochymus, com exceção da substância 7 e as substâncias 10, 13, 17, 18, 21, 22 e 23 ainda não haviam sido identificadas na espécie. Através da técnica CG-DIC foram identificados 15 triterpenos e/ou esteróides nos extratos de baixa polaridade e através das técnicas hifenadas, como CLAE-UV e CLAE-EM, foi possível localizar substâncias já isoladas e/ou isoladas em trabalhos anteriores. Os resultados observados para os ensaios antioxidantes utilizando-se o radical DPPH evidenciaram a importância dos grupos catecólicos como essenciais para uma excelente ação antioxidante. Em relação à atividade antifúngica os extratos etanólico e hexânico dos frutos de G. xanthochymus apresentaram resultados muito atrativos, com CIM de 1,95 µg/mL, oito vezes menor que o apresentado pelo padrão comercial fluconazol (CIM=16,0 µg/mL). A (+)-morelloflavona (8) mostrou elevada capacidade de indução da atividade da enzima quinona redutase, comparável ao da 4’-bromoflavona (padrão comercial), evidenciando o potencial quimiopreventivo de G. xanthochymus. Palavras-chave: Garcinia xanthochymus. Biflavonóide. Bioprospecção. Abstract ABSTRACT The species Garcinia xanthochymus, known as Gamboja is a native Indian tree ca. 8-10 m high, which is extensively used as folk medicine for treating diarrhea and dysentery. This work describes the study of the chemical profile of G. xanthochymus leaves and fruits. Among the isolated substances three triterpenes were obtained from the hexane extract of the leaves: friedelin (1), lanosta-8,24-dien-3-ol (2) e lanosta-7,24-dien-3-ol (3), with compounds (2) and (3) described for the first time in the literature of this species. The chemical prospection of the ethyl acetate extract of the leaves revealed an abundant amount of biflavonoids, with compounds saharanflavone (4), I3,II8-biapigenin (5), GB1a (6), (+)- morelloflavone (8), GB2a (11), volkensiflavone (12), GB2 (14), xanthochymuside (15) and fukugiside (16) characterized by the interflavonoid 3�8” bond, and compounds podocarpusflavone (7) and amentoflavone (9), by the interflavonoid 3’�8’’ bond. Substance 4 was isolated for the first time from a natural source. The chemical composition of G. xanthochymus included additionally dihydrokaempferol (10), vanillic acid (13), and five phenylpropanoid acid derivatives: 3-O-caffeoylquinic acid (17), 5-O-caffeoylquinic acid (18), 3-p-coumaroylquinic acid (21), 4-O-caffeoylquinic acid (22) and 4-p- coumaroylquinic acid (23); as well a binary mixture of xanthochymol (19) and cycle- xanthochymol (20) benzophenones. All the compounds were reported for the first time in the leaves of G. xanthochymus, with the exception of compound 7, and compounds 10, 13, 17, 18, 21, 22 e 23, which had not yet been identified in this species. By CG-FID technique fifteen triterpenes and/or steroids were identified in the low polarity extracts. Hyphenated techniques such as HPLC-UV and HPLC-MS were used to locate previously isolated compounds from different fractions and/or isolated substances from other works. The bioactivity evaluation of extracts, semipurified fracions and pure compounds from G. xanthochymus displayed attractive results. The free radical scavenging assay with DPPH radical confirmed the importance of the cathecol group as essential for optimum antioxidant action. The ethanol and hexane extracts from the fruits of G. xanthochymus showed potent antifungal activity (MIC= 1.95 µg/mL), ca. eight times lower than the commercial standard fluconazole (MIC=16,0 µg/mL). Additionally, (+)-morelloflavone (8) showed strong induction of quinone reductase enzyme activity, comparable to the positive control 4’- bromoflavone, evidencing the chemopreventive potential of G. xanthochymus. Keywords: Garcinia xanthochymus. Biflavonoid. Bioprospection. Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Foto de diferentes partes de Garcinia xanthochymus. 33 Figura 2 - Algumas classes de substâncias isoladas da espécie de Garcinia xanthochymus. 33 Figura 3 - Esquema geral da rota biossintética de flavonóides (ACC-acetil CoA- carboxilase, CS-chalcona sintetase e CI-chalcona isomerase). 37 Figura 4 - Estrutura de biflavonóides tipo flavona-flavona. 37 Figura 5 - Experimento de RMN 1H para a (±)-morelloflavona (Li et al., 2002) em temperaturas variáveis. O sinal 1a representa o confôrmero principal e 1b o confôrmero minoritário. 40 Figura 6 - Representação do equilíbrio entre as EROs e as defesas antioxidantes do nosso organismo (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). 42 Figura 7 - Fracionamento cromatográfico dos frutos de Garcinia xanthochymus. 52 Figura 8 - Fracionamento cromatográfico das folhas de Garcinia xanthochymus. 53 Figura 9 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia xanthochymus em coluna de permeação em gel (LH-20, Sephadex®). 53 Figura 10 - Fracionamento cromatográfico da fração AcOEt-FOL de Garcinia xanthochymus em coluna de fase normal (sílica-gel 60-230 µ). 54 Figura 11 - Fracionamento cromatográfico da fração BuOH-FOL de Garcinia xanthochymus. 54 Figura 12 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-FOL-14, eluída com MeOH:H2O: HOAc (57:42,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 57 Figura 13 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt- FOL-15 e (b) AcOEt-FOL-16, eluídas com MeOH:H2O: HOAc (75:24,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 58 Figura 14 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt- SIL-3 e (b) AcOEt-SIL-9, eluídas com MeOH:H2O: HOAc (45:54,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 58 Figura 15 - Cromatogramas analíticos obtidos via CLAE-UV das subfrações (a) AcOEt- SIL-4, eluída com MeOH:H2O: HOAc (60:39,5:0,5) e (b) AcOEt-SIL-5, eluídas com MeOH:H2O: HOAc (50:49,5:0,5). 59 Figura 16 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração AcOEt-SIL-11, eluída com MeOH:H2O: HOAc (35:64,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 60 Lista de Figuras Figura 17 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV da subfração BuOH-FOL-6, eluída com MeOH:H2O: HOAc (20:79,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 61 Figura 18 - Cromatoplaca da subfração AcOEt-FRU-7 com (a) revelação física em �=254 nm e (b) revelação química com anisaldeído sulfúrico (c) Cromatograma analítico da subfração AcOEt-FRU-7, obtido em coluna ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m) eluída com fase móvel de MeOH:H2O: HOAc (75:24,5:0,5) e detecção em λ=254 nm. 61 Figura 19 - Cromatograma analítico obtido via CLAE-UV do extrato ETOH (a) e das frações AcOEt (b), BuOH (c) e HA (d) dos frutos (acima) e das folhas (abaixo) de Garcinia xanthochymus no modo gradiente em H2O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 68 Figura 20 - Espectro no UV de algumas substâncias isoladas da fração AcOEt-FOL de Garcinia xanthochymus. 68 Figura 21 - Espectro de massas da substância 1 obtido por CG-EM (IE=+70 eV). 70 Figura 22 - Espectro vibracional na região do IV da substância 1. 71 Figura 23 - Proposta de fragmentação da substância 1. 71 Figura 24 - Espectro vibracional na região do IV da substância 2. 73 Figura 25 - Espectro de massas da substância 2 obtido por CG-EM (IE= + 70 eV). 73 Figura 26 - Proposta de fragmentação da substância 2. 73 Figura 27 - Estrutura da substância 4. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 4 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 76 Figura 28 - Espectro vibracional na região do IV da substância 4. 76 Figura 29 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 4 obtido no modo negativo (ESI). 78 Figura 30 - Estrutura da substância 5. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 5 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m) 79 Figura 31 - Espectro vibracional na região do IV da substância 5. 80 Figura 32 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 5 obtido no modo negativo (ESI). 80 Lista de Figuras Figura 33 - Estrutura da substância 8. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 8 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 82 Figura 34 - Espectro vibracional na região do IV da substância 8. 83 Figura 35 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 8, obtido em modo negativo com energia de colisão de 5% para EM2 (ESI). 83 Figura 36 - Proposta de fragmentação da substância 8. 83 Figura 37 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 8. 85 Figura 38 - Estruturas do confôrmero principal (8a) e minoritário (8b) da morelloflavona. 85 Figura 39 - Estrutura da substância 9. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 9 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 87 Figura 40 - Espectro vibracional na região do IV da substância 9. 88 Figura 41 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 9 obtido no modo negativo (ESI). 88 Figura 42 - Estrutura da substância 10. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 10 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 90 Figura 43 - Espectro vibracional na região do IV da substância 10. 91 Figura 44 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 10, obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 91 Figura 45 - Proposta de fragmentação da substância 10. 92 Figura 46 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 10. 93 Figura 47 - Estrutura da substância 11. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 11 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 94 Figura 48 - Espectro vibracional na região do IV da substância 11. 94 Figura 49 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 11, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 95 Figura 50 - Proposta de fragmentação da substância 11. 95 Lista de Figuras Figura 51 - Experimento de RMN 1H com temperatura variável da substância 11. 98 Figura 52 - Estrutura da substância 12. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 12 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 99 Figura 53 - Espectro vibracional na região do IV da substância 12. 100 Figura 54 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 12, obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 101 Figura 55 - Proposta de fragmentação da substância 12. 101 Figura 56 - Curva de dicroísmo circular (DC) da substância 12. 101 Figura 57 - Estrutura da substância 13. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 13 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 102 Figura 58 - Espectro vibracional na região do IV da substância 13. 103 Figura 59 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 13, obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 105 Figura 60 - Proposta de fragmentação da substância 13. 105 Figura 61 - Estrutura da substância 14. (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 14 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 106 Figura 62 - Curva de dicroísmo circular (DC) das substâncias (a) 11 e (b) 14. 108 Figura 63 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 14, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 108 Figura 64 - Proposta de fragmentação da substância 14. 109 Figura 65 - Estruturas das substâncias 17 e 18. (a) Cromatogramas analíticos e (b) espectros de absorção das substâncias 17 e 18 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 35:75 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 110 Figura 66 - Espectro vibracional na região do IV da substância 17. 110 Figura 67 - Estrutura do ácido quínico. (a) conformação de maior estabilidade. (b) conformação de menor estabilidade evidenciando interação 1,3-diaxial entre a carboxila e a hidroxila em C5. 112 Lista de Figuras Figura 68 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 17, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 114 Figura 69 - Proposta de fragmentação da substância 17. 114 Figura 70 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 18, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 115 Figura 71 - Proposta de fragmentação da substância 18. 115 Figura 72 - Cromatograma analítico de alguns constituintes majoritários obtido via CLAE- UV-DAD das subfrações (a) AcOEt-FRU-13 (b) e AcOEt-FRU-17, no modo gradiente em H2O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 117 Figura 73 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 24, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 117 Figura 74 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 25 obtido no modo negativo (ESI). 117 Figura 75 - Proposta de fragmentação da substância 24. 118 Figura 76 - Proposta de fragmentação da substância 25. 118 Figura 77 - Estruturas das xantonas padrão utilizadas no processo de desreplicação das substâncias 24 e 25. 119 Figura 78 - (a) Espectro de absorção da substância 24, da xantona 1 e cromatograma analítico da xantona 1 (b) Espectro de absorção da substância 25, xantona 2 e cromatograma analítico da xantona 2. Modo gradiente em H2O: MeOH (95:5) até MeOH (100) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 120 Figura 79 - Espectro de absorção no UV comparativo (a) da substância 11 e o pico 2 da fração AcOEt-FRU-17 e (b) da substância 14 e o pico 1 da fração AcOEt-FRU- 17. 120 Figura 80 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem dos picos 1 (esquerda) e 2 (direita) da subfração AcOEt-FRU-17, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 121 Figura 81 - (a) Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da substância 6 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático 1:1 (MeOH:H2O) e suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m). 121 Figura 82 - Espectro de RMN de 1H (500 MHz) da substância 6 (DMSO-d6). 122 Figura 83 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 6, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 123 Figura 84 - Proposta de fragmentação da substância 6. 123 Lista de Figuras Figura 85 – Espectro de RMN de 1H (500 MHz) da substância 7 (DMSO-d6). 124 Figura 86 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 7 obtido no modo negativo (ESI). 124 Figura 87 - Espectro de RMN de 1H (500 MHz) da substância 15 (DMSO-d6). 124 Figura 88 - Espectro de RMN de 1H (500 MHz) da substância 16 (DMSO-d6). 125 Figura 89 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 15, obtido em modo negativo com energia de colisão de 10% para EM2 (ESI). 125 Figura 90 - Espectro de massas de primeira-ordem da substância 16 obtido no modo negativo (ESI). 126 Figura 91 - Cromatograma analítico e (b) espectro de absorção da subfração AcOEt-FRU-7 obtido via CLAE-UV-DAD no modo isocrático MeOH:H2O:HOAc (75:24,5:0,5), suporte cromatográfico: ODS (Phenomenex, 25,0 cm x 4,6 mm x 5�m) e detecção em λ=254 nm. 128 Figura 92 - Espectro de RMN de 1H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d6). 128 Figura 93 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da subfração AcOEt- FRU-7, obtido em modo negativo com energia de colisão de 30% para EM2 (ESI). 129 Figura 94 - Espectro de massas (a) de primeira e (b) segunda-ordem da substância 22, obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI). 130 Figura 95 - Espectro de massas de primeira e segunda-ordem obtido em modo negativo com energia de colisão de 15% para EM2 (ESI) da (a) substância 21 e da (b) substância 23. 130 Figura 96 - Estruturas dos triterpenos e esteróides identificados nos extratos e frações de baixa polaridade de Garcinia xanthochymus. 131 Figura 97 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-5 (a) do HEX-FRU [38 tr=22,05; 39 tr=23,38; 35 tr=23,82; 27 tr=24,43 e 32 tr=26,84] (b) da FR. HEX-FOL [39 tr=23,38; 35 tr=23,75; 27 tr=24,33 e 32 tr=26,75] (c) e do EXT-FOL [37 tr=20,41 e 34 tr=24,82], em presença de colesterol (padrão interno). 133 Figura 98 - Perfil cromatográfico (CG-DIC) em SPB-50 (a) do HEX-FRU [38 tr=17,29; 39 tr=19,24; 35 tr=22,97; 27 tr=24,06 e 32 tr=25,46] (b) da FR. HEX-FOL [39 tr=19,11; 35 tr=22,80; 27 tr=23,31 e 32 tr=25,35] (c) e do EXT-FOL [37 tr=15,86 e 34 tr=25,64], em presença de colesterol (padrão interno). 133 Figura 99 - Gráfico da curva de concentração dos extratos e frações (a) das folhas e dos (b) frutos de G. xanthochymus versus a % de seqüestro de DPPH. 135 Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Substâncias isoladas de Garcinia xanthochymus e bioatividades relatadas nas referências citadas. 34 Tabela 2 - Intervalos de absorção no UV para diferentes tipos de flavonóides. 69 Tabela 3 - Dados de RMN de 13C (125 MHz) das substâncias 1, 2 e 3 em CDCl3. 75 Tabela 4 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 4 (DMSO-d6). 78 Tabela 5 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 5 (DMSO-d6). 81 Tabela 6 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 8 (DMSO-d6). 86 Tabela 7 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 9 (DMSO-d6). 89 Tabela 8 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 10 (DMSO-d6). 93 Tabela 9 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 11 (DMSO-d6). 96 Tabela 10 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 12 (DMSO-d6). 102 Tabela 11 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 13 (DMSO-d6). 105 Tabela 12 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 14 (DMSO-d6). 107 Tabela 13 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e RMN de 13C (125 MHz) da substância 17 (DMSO-d6). 110 Tabela 14 - Fragmentos obtidos dos analitos isolados de G. xanthochymus a partir da análise por EM e EM2 obtido em modo negativo com energia de colisão de 15%. 113 Tabela 15 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) das substâncias 19 e 20 (DMSO-d6). 127 Tabela 16 - Fragmentos obtidos de benzofenonas isoladas de G. xanthochymus através de EM e EM2. 129 Tabela 17 - Valores da retenção relativa das amostras com o colesterol. 132 Lista de Tabelas Tabela 18 - Atividade antioxidante dos extratos e frações de Garcinia xanthochymus frente ao radical DPPH. 134 Tabela 19 - Atividade inibitória in vitro no ensaio de formação de β-Hematina para os extratos e frações de Garcinia xanthochymus. 136 Tabela 20 - Atividade antifúngica in vitro dos extratos e frações de G. xanthochymus frente a fungos patogênicos humanos. 137 Tabela 21 - Atividade biológica dos constituintes isolados das folhas e frutos de Garcinia xanthochymus. 138 Tabela 22 - Atividade tripanocida dos extratos e frações de G. xanthochymus. 139 Tabela 23 - Avaliação da taxa de indução (IR) da atividade de QR em linhagem Hepa1c1c7 para 8. 140 Lista de Anexos LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Espectro de RMN de 1H da substância 1. ......................................................... 156 Anexo 2. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 1. ................................... 156 Anexo 3. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 1. ................................... 157 Anexo 4. Espectro de RMN de 13C da substância 1. ........................................................ 157 Anexo 5. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 1. .................................. 158 Anexo 6. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 1. .................................. 158 Anexo 7. Espectro de DEPT 135° da substância 1. .......................................................... 159 Anexo 8. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 1. .................................... 159 Anexo 9. Espectro de DEPT 90° da substância 1. ............................................................ 160 Anexo 10. Espectro de RMN de 1H da substância 2......................................................... 160 Anexo 11. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 1................................... 161 Anexo 12. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 2................................... 161 Anexo 13. Espectro de RMN de 13C da substância 2 ....................................................... 162 Anexo 14. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 2. ................................ 162 Anexo 15. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 2. ................................ 163 Anexo 16. Espectro de DEPT 135° da substância 2. ........................................................ 163 Anexo 17. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2. .................................. 164 Anexo 18. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 2. .................................. 164 Anexo 19. Espectro de DEPT 90° da substância 2. .......................................................... 165 Anexo 20. Espectro de RMN de 1H da mistura 2 e 3........................................................ 165 Anexo 21. Espectro de RMN de 13C da mistura 2 e 3. ..................................................... 166 Anexo 22. Ampliação do espectro de RMN de 13C da mistura 2 e 3. ............................... 166 Anexo 23. Ampliação do espectro de RMN de 13C da mistura 2 e 3. ............................... 167 Anexo 24. Ampliação do espectro de RMN de 13C da mistura 2 e 3. ............................... 167 Anexo 25. Espectro de RMN de 1H da substância 4. ........................................................ 168 Anexo 26. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 4................................... 168 Anexo 27. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 4. ......................................... 169 Anexo 28. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 4. ................... 169 Anexo 29. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 4. ....................................... 170 Anexo 30. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 4 .................. 170 Anexo 31. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 4. ....................................... 171 Anexo 32. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 4. ................. 171 Lista de Anexos Anexo 33. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 4. ................. 172 Anexo 34. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 4. ................. 172 Anexo 35. Espectro de HOMODEC da substância 4 ....................................................... 173 Anexo 36. Espectro de NOESY 1D (irradiação em �H 6,25) da substância 4.................... 173 Anexo 37. Espectro de RMN de 1H da substância 5......................................................... 174 Anexo 38. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 5................................... 174 Anexo 39. Espectro de RMN de 13C da substância 5........................................................ 175 Anexo 40. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 5. ................................ 175 Anexo 41. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 5. ................................ 176 Anexo 42. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 5. ......................................... 176 Anexo 43. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 5. ................... 177 Anexo 44. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 5. ....................................... 177 Anexo 45. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 5. ................. 178 Anexo 46. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 5. ................. 178 Anexo 47. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 5. ................. 179 Anexo 48. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ....................................... 179 Anexo 49. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ................. 180 Anexo 50. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ................. 180 Anexo 51. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ................. 181 Anexo 52. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ................. 181 Anexo 53. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 5. ................. 182 Anexo 54. Espectro de RMN de 1H da substância 8. ........................................................ 182 Anexo 55. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 8................................... 183 Anexo 56. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 8. ......................................... 183 Anexo 57. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 8. ................... 184 Anexo 58. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 8. ....................................... 184 Anexo 59. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 8. ................. 185 Anexo 60. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 8. ................. 185 Anexo 61. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 8. ................. 186 Anexo 62. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8 ........................................ 186 Anexo 63. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 187 Anexo 64. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 187 Anexo 65. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 188 Anexo 66. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 188 Lista de Anexos Anexo 67. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 189 Anexo 68. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 189 Anexo 69. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 190 Anexo 70. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 8. ................. 190 Anexo 71. Espectro de RMN de 1H da substância 9. ........................................................ 191 Anexo 72. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 9................................... 191 Anexo 73. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 9................................... 192 Anexo 74. Espectro de RMN de 13C da substância 9........................................................ 192 Anexo 75. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 9. ................................ 193 Anexo 76. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 9. ................................ 193 Anexo 77. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 9. ......................................... 194 Anexo 78. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 9. ................... 194 Anexo 79. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 9. ....................................... 195 Anexo 80. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 9. ................. 195 Anexo 81. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 9. ................. 196 Anexo 82. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 9. ....................................... 196 Anexo 83. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 9. ................. 197 Anexo 84. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 9. ................. 197 Anexo 85. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 9. ................. 198 Anexo 86. Espectro de RMN de 1H da substância 10. ...................................................... 198 Anexo 87. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 10. ................................ 199 Anexo 88. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 10......................................... 199 Anexo 89. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 10. ................. 200 Anexo 90. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 10. ................. 200 Anexo 91. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 10. ..................................... 201 Anexo 92. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 10. ............... 201 Anexo 93. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 10. ..................................... 202 Anexo 94. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 10. ............... 202 Anexo 95. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 10. ............... 203 Anexo 96. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 10. ............... 203 Anexo 97. Espectro de RMN de 1H da substância 11....................................................... 204 Anexo 98. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 11................................. 204 Anexo 99. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 11................................. 205 Anexo 100. Espectro de RMN de 13C da substância 11. ................................................... 205 Lista de Anexos Anexo 101. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 11.............................. 206 Anexo 102. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 11.............................. 206 Anexo 103. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 11.............................. 207 Anexo 104. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 11.............................. 207 Anexo 105. Espectro de DEPT 135° da substância 11. .................................................... 208 Anexo 106. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11. .............................. 208 Anexo 107. Ampliação do espectro de DEPT 135° da substância 11. .............................. 209 Anexo 108. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 11....................................... 209 Anexo 109. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 11. ............... 210 Anexo 110. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 11. ............... 210 Anexo 111. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 11. ............... 211 Anexo 112. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 11. ................................... 211 Anexo 113. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 11 .............. 212 Anexo 114. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 11. ............. 212 Anexo 115. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 11. ............. 213 Anexo 116. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ................................... 213 Anexo 117. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 214 Anexo 118. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 214 Anexo 119. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 215 Anexo 120. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 215 Anexo 121. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 216 Anexo 122. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 216 Anexo 123. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 217 Anexo 124. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 217 Anexo 125. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 11. ............. 218 Anexo 126. Espectro de RMN de 1H da substância 12. .................................................... 218 Anexo 127. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 12. .............................. 219 Anexo 128. Espectro de RMN de 13C da substância 12. ................................................... 219 Anexo 129. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 12.............................. 220 Anexo 130. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 12.............................. 220 Anexo 131. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 12.............................. 221 Anexo 132. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 12....................................... 221 Anexo 133. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 12. ............... 222 Anexo 134. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 12. ............... 222 Lista de Anexos Anexo 135. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ................................... 223 Anexo 136. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ............. 223 Anexo 137. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ............. 224 Anexo 138. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ............. 224 Anexo 139. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ............. 225 Anexo 140. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 12. ............. 225 Anexo 141. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ................................... 226 Anexo 142. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ............. 226 Anexo 143. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ............. 227 Anexo 144. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ............. 227 Anexo 145. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ............. 228 Anexo 146. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 12. ............. 228 Anexo 147. Espectro de RMN de 1H da substância 13..................................................... 229 Anexo 148. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 13............................... 229 Anexo 149. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 13....................................... 230 Anexo 150. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 13. ............... 230 Anexo 151. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 13. ................................... 231 Anexo 152. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 13. ............. 231 Anexo 153. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 13. ................................... 232 Anexo 154. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 13. ............. 232 Anexo 155. Espectro de RMN de 1H da substância 14..................................................... 233 Anexo 156. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 14............................... 233 Anexo 157. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 14............................... 234 Anexo 158. Espectro de RMN de 13C da substância 14. ................................................... 234 Anexo 159. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 14.............................. 235 Anexo 160. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 14.............................. 235 Anexo 161. Ampliação do espectro de RMN de 13C da substância 14.............................. 236 Anexo 162. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 14....................................... 236 Anexo 163. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 14. ............... 237 Anexo 164. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 14. ............... 237 Anexo 165. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 14. ................................... 238 Anexo 166. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 14. ............. 238 Anexo 167. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 14. ............. 239 Anexo 168. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 14. ................................... 239 Lista de Anexos Anexo 169. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 14. ............. 240 Anexo 170. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 14. ............. 240 Anexo 171. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 14 .............. 241 Anexo 172. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 14 .............. 241 Anexo 173. Espectro de RMN de 1H da substância 17. .................................................... 242 Anexo 174. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 17. .............................. 242 Anexo 175. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 17. .............................. 243 Anexo 176. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 17. .............................. 243 Anexo 177. Espectro de RMN de 13C da substância 17. ................................................... 244 Anexo 178. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 17....................................... 244 Anexo 179. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 17. ............... 245 Anexo 180. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 17. ............... 245 Anexo 181. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 17. ................................... 246 Anexo 182. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 17 .............. 246 Anexo 183. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 17. ............. 247 Anexo 184. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 17. ............. 247 Anexo 185. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ................................... 248 Anexo 186. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ............. 248 Anexo 187. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ............. 249 Anexo 188. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ............. 249 Anexo 189. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ............. 250 Anexo 190. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 17. ............. 250 Anexo 191. Espectro de RMN de 1H da substância 18..................................................... 251 Anexo 192. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 18............................... 251 Anexo 193. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 18............................... 252 Anexo 194. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância 18............................... 252 Anexo 195. Espectro de RMN de 13C da substância 18. ................................................... 253 Anexo 196. Mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 18....................................... 253 Anexo 197. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 18. ............... 254 Anexo 198. Ampliação do mapa de contorno 1H-1H gCOSY da substância 18. ............... 254 Anexo 199. Mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 18. ................................... 255 Anexo 200. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 18. ............. 255 Anexo 201. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 18. ............. 256 Anexo 202. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMQC da substância 18. ............. 256 Lista de Anexos Anexo 203. Mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ................................... 257 Anexo 204. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 257 Anexo 205. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 258 Anexo 206. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 258 Anexo 207. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 259 Anexo 208. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 259 Anexo 209. Ampliação do mapa de contorno 1H-13C gHMBC da substância 18. ............. 260 Abreviaturas e símbolos ABREVIATURAS E SÍMBOLOS � �TD� rotação óptica � comprimento de onda �H deslocamento químico de hidrogênio �C deslocamento químico de carbono ACC enzima acetil CoA-carboxilase ACQ ácido cafeoilquínico AcOEt acetato de etila AcOEt-FOL fração acetato de etila das folhas AcOEt-FRU fração acetato de etila dos frutos AcOEt-SIL fração acetato de etila submetida a CC-FN ApCoQ ácido p- coumaroilquínico BuOH-FOL fração n-butanólica das folhas BuOH-FRU fração n-butanólica dos frutos CC cromatografia em coluna CCDC cromatografia em camada delgada comparativa CC-FN cromatografia em coluna de fase normal CDCl3 clorofórmio deuterado CLAE cromatografia líquida de alta eficiência CLAE-prep cromatografia líquida de alta eficiência preparativa CI chalcona isomerase CI50 concentração inibitória mínima CG cromatografia gasosa CPG cromatografia de permeação em gel CS chalcona sintetase d dubleto dd duplo dubleto DAD detector com arranjo de diodos DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DIC detector de ionização de chama DMSO-d6 dimetilsulfóxido deuterado DPPH radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila Abreviaturas e símbolos DNA Ácido desoxiribonucleíco ELL extração líquido-líquido EM espectrometria de massa EM2 espectrometria de massa de segunda-ordem EROs espécies reativas de oxigênio ESI electrospray FR. HEX-FOL fração hexânica das folhas ETOH-FOL extrato etanólico das folhas ETOH-FRU extrato etanólico dos frutos gCOSY gradient Correlated Spectroscopy gHMBC gradient Heteronuclear Multiple Bond Correlation gHMQC gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence GSH enzima glutationa peroxidase GSSG enzima glutationa redutase GST enzima glutationa s-transferase J constante de acoplamento HA-FOL fração hidroalcoólica das folhas HA-FRU fração hidroalcoólica dos frutos HEX hexano HEX-FOL extrato hexânico das folhas HEX-FRU extrato hexânico dos frutos HOAc ácido acético HOMODEC homonuclear decoupling IV infravermelho IE impacto eletrônico m multipleto m massa m/z relação massa/carga MeOH metanol MTT 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difenil Brometo de Tetrazólio n-BuOH n-butanol NaOH hidróxido de sódio NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy NuBBE Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais Abreviaturas e símbolos RMN de 1H ressonância magnética nuclear de hidrogênio RMN de 13C ressonância magnética nuclear de carbono s singleto SPB-5 coluna capilar (5% fenil-metil-siloxano) SPB-50 coluna capilar (50% fenil-metil-siloxano) SNC Sistema Nervoso Central SOD enzima superóxido dismutase RR retenção relativa ODS octadecilsilano OMS Organização Mundial da Saúde QR quinona redutase tr tempo de retenção t tripleto TMS tetrametilsilano UV ultravioleta UV-vis ultravioleta e visível v volume Sumário SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 30 1.1 O ESTADO DA ARTE 30 1.2 A FAMÍLIA CLUSIACEAE 31 1.3 A ESPÉCIE GARCINIA XANTHOCHYMUS 32 1.4 BIFLAVONÓIDES 36 1.4.1 Atropoisomerismo 38 1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 39 1.6 BIFLAVONÓIDES COMO AGENTES ANTIOXIDANTES 41 1.7 AGENTES QUIMIOPREVENTIVOS 43 2 JUSTIFICATIVA 45 3 OBJETIVOS 47 4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 48 4.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 48 4.1.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) 48 4.1.2 Cromatografia em coluna de fase normal (CC-FN) 48 4.1.3 Extração líquido-líquido (ELL) 49 4.1.4 Cromatografia de permeação em gel (CPG) 49 4.1.5 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE- DAD) 49 4.1.6 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (CLAE-UV) 49 4.1.7 Cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (CLAE-UV-prep) 50 4.1.8 Cromatografia gasosa (CG) 50 4.2 ESPECTROMETRIA 50 4.3 SOLVENTES 51 5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 52 5.1 COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS E FRAÇÕES 52 5.2 PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA PARA CLAE-DAD E UV 55 5.3 ESTUDO QUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO DAS FOLHAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (HEX-FOL) 55 Sumário 5.4 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DA FRAÇÃO ACOET DAS FOLHAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (ACOET-FOL) 56 5.5 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÃO ACOET-FOL-14 56 5.6 ESTUDO QUÍMICO DAS SUBFRAÇÕES ACOET-FOL-15 E 16 57 5.7 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÕES ACOET-SIL-3 E 9 58 5.8 ESTUDO QUÍMICO DAS SUBFRAÇÕES ACOET-SIL-4 E 5 59 5.9 ESTUDO QUÍMICO DA SUBFRAÇÃO ACOET-SIL-11 59 5.10 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO E ESTUDO QUÍMICO DA FRAÇÃO BUOH DAS FOLHAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (BUOH-FOL) 60 5.11 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO E ESTUDO QUÍMICO DA FRAÇÃO ACOET DOS FRUTOS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS (ACOET -FRU) 61 5.12 IDENTIFICAÇÃO POR CLAE-DAD-EM DOS CONSTITUINTES DE FRAÇÕES SELECIONADAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS-ANÁLISE POR DESREPLICAÇÃO 62 5.13 IDENTIFICAÇÃO DE TRITERPENOS E ESTERÓIDES PRESENTES NOS EXTRATOS DE BAIXA POLARIDADE DE GARCINIA XANTHOCHYMUS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) 62 5.14 ENSAIOS ANTIOXIDANTES 63 5.14.1 Descoloração de β-caroteno 63 5.14.2 Atividade seqüestradora de radicais livres: DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila) 63 5.15 ENSAIO IN VITRO DA POLIMERIZAÇÃO DE HEME 63 5.16 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA 64 5.17 ATIVIDADE TRIPANOCIDA 65 5.18 ATIVIDADE QUIMIOPREVENTIVA 66 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 67 6.1 ANÁLISE DOS CROMATOGRAMAS E ESPECTROS DE ABSORÇÃO 67 6.2 ESTUDO QUÍMICO DAS FOLHAS 69 6.2.1 Caracterização espectrométrica da substância 1 69 6.2.3 Caracterização espectrométrica da substância 3 74 6.2.4 Caracterização espectrométrica da substância 4 75 6.2.5 Caracterização espectrométrica da substância 5 79 6.2.6 Caracterização espectrométrica da substância 8 81 6.2.7 Caracterização espectrométrica da substância 9 87 6.2.8 Caracterização espectrométrica da substância 10 90 Sumário 6.2.9 Caracterização espectrométrica da substância 11 93 6.2.10 Caracterização espectrométrica da substância 12 98 6.2.11 Caracterização espectrométrica da substância 13 102 6.2.12 Caracterização espectrométrica da substância 14 106 6.2.13 Caracterização espectrométrica das substâncias 17 e 18 109 6.3 A DESREPLICAÇÃO EM ESTUDOS DE BIOPROSPECÇÃO 115 6.3.1 Identificação por CLAE-UV-DAD-EM dos constituintes de Garcinia xanthochymus 116 6.4 IDENTIFICAÇÃO DE TRITERPENOS E ESTERÓIDES PRESENTES NOS EXTRATOS DE BAIXA POLARIDADE DE GARCINIA XANTHOCHYMUS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) 131 6.5 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS EXTRATOS, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE GARCINIA XANTHOCHYMUS 134 6.5.1 Atividade antioxidante 134 6.5.2 Ensaio in vitro da polimerização de heme 135 6.5.3 Atividade antifúngica 137 6.5.4 Atividade tripanocida 138 6.5.5 Atividade quimiopreventiva 139 7 CONCLUSÕES 141 REFERÊNCIAS 144 ANEXOS 155 Introdução 30 1 INTRODUÇÃO 1.1 O estado da arte A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas conhecidas. Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PINTO et al., 2002). Os trabalhos de isolamento das primeiras substâncias puras do reino vegetal tiveram início entre os séculos XVIII e XIX. Com o aparecimento da química combinatória na década de 80 e as triagens em alta escala, que são os paradigmas tecnológicos de desenvolvimento da química medicinal moderna ou atual, os departamentos de produtos naturais das grandes empresas farmacêuticas foram eliminados ou transferidos para empresas menores (YOUNES; VARELLA; SUFFREDINI, 2007). No entanto, nestes últimos 10 anos, mudanças importantes vêm sendo observadas no rumo da pesquisa por fármacos novos devido aos avanços da biologia molecular, mapeamento genético, bioensaios automatizados e quimiogenômica. Esses eventos têm levado a indústria farmacêutica a repensar sua maneira de investimento na busca por fármacos de origem natural (NEWMAN; CRAGG, 2007). A descoberta dos alcalóides morfina, cocaína e quinina, entre tantas substâncias isoladas de plantas e utilizadas como medicamentos até os dias atuais, não deixam dúvidas quanto à importância das plantas, principalmente, de uso tradicional (PINTO et al., 2002). Com a descoberta dos antibióticos e anticolesterolêmicos a partir de microrganismos, dos benefícios divulgados pela Organização Mundial de Saúde na década de 70 sobre a eficácia da medicina chinesa e da descoberta de quimioterápicos eficazes como vimblastina (Velban ), vincristina (Oncovin ), podofilotoxina e análogos (VP-16-213; Vepeside ), Teniposídeo (VM-26; Vulmon ) e taxol (plaxitaxel; taxol ) a procura pelos produtos naturais como modelos para agentes terapêuticos voltou a ser um tema recorrente da indústria farmacêutica (KIRBY, 1996). Um terço dos medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo foi desenvolvido a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003). No caso dos agentes antitumorais e antibióticos, por exemplo, esse percentual atingiu aproximadamente 60% e 75%, respectivamente (NEWMAN; CRAGG, 2007). As estatinas foram responsáveis por um Introdução 31 mercado de US$ 19 bilhões em 2002 e a OMS estima que as vendas totais de ervas medicinais alcançaram um lucro de US$ 400 milhões no Brasil em 2001 (SOYAMA, 2007), mostrando o forte impacto desses medicamentos no mercado mundial. Diante destes dados, países como o Brasil, que detém grande parte da biodiversidade mundial, poderão usufruir deste patrimônio se esforços forem dirigidos para a pesquisa colaborativa na descoberta por fármacos potenciais desta biodiversidade (GREENWOOD; MUTABINGWA, 2002). Nos últimos anos, o NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais do IQ-UNESP, Araraquara) vem concentrando esforços na busca por substâncias com atividades antitumoral, antifúngica, antimalárica e antioxidante, caracterizando uma pesquisa de bioprospecção multifocal. Várias espécies coletadas nos biomas do Estado de São Paulo foram selecionadas devido a alguma bioatividade apresentada na triagem preliminar, agregando valor à extratoteca, já bastante representativa com mais de 1800 extratos. Dentre as espécies selecionadas, Garcinia xanthochymus demonstrou especial interesse por conter substâncias fenólicas com potencial antitumoral e antioxidante. Além disso, ocorrem neste gênero substâncias da classe das xantonas, conhecidas por sua atividade antimalárica (CHANMAHASATHIEN et al., 2003a). 1.2 A família Clusiaceae A família Clusiaceae compreende cerca de 50 gêneros e 1200 espécies de ocorrência exclusiva nas regiões tropicais. A maioria dos representantes desta família são árvores, arbustos ou ervas sendo raramente epífitas (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002). Alguns gêneros e espécies são endêmicos de certas áreas, por exemplo, o gênero Symphonia L. e Pentadesma sabine são encontradas unicamente na África (SULTANBAWA, 1980). No Brasil, há 21 gêneros e 183 espécies distribuídas na Amazônia, Cerrado e Mata Atlântica (CRUZ et al., 1998). Os gêneros são distribuídos em três subfamílias, destacando-se inúmeros com importância medicinal no Brasil, como Hypericum e Vismia (Hypericoideae), Clusia, Calophyllum e Garcinia (Calophylloideae) e Kielmeyera (Bonnetioideae). Destacam-se nesses gêneros importantes espécies econômicas para a produção de madeiras, gomas, pigmentos, óleos essenciais e resinas (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002). Introdução 32 O estudo da constituição química dos troncos de várias espécies de Clusiaceae brasileiras mostrou, além dos triterpenóides comuns, xantonas como constituintes predominantes (GOTTLIEB; RAMAIAH; LAVIE, 1985). A família Clusiaceae apresenta um número de xantonas comparáveis com as da família Gentianaceae e se destaca por apresentar mais da metade dessas xantonas substituídas por isoprenóides (SIMÕES et al., 2002; PANTHONG, et al., 2006; ZHONG; CHEN; YANG, 2008). 1.3 A espécie Garcinia xanthochymus O gênero Garcinia pertence à família Clusiaceae, sinonímia de Guttiferae, e contêm cerca de 200 espécies confinadas nos trópicos como árvores ou arbustos, raramente epífitas, das quais 21 espécies encontram-se na China (ZHONG; CHEN; YANG, 2008). No Brasil é nativa a espécie Garcinia brasiliensis conhecida como Bacupari, encontrada na Mata Atlântica e Amazônia, porém ocorrem outras espécies como Garcinia gardneriana e Garcinia xanthochymus. A espécie Garcinia xanthochymus (Figura 1) comumente conhecida como Gamboja, é uma árvore nativa da Índia com aproximadamente 8-10 metros. As árvores possuem folhas verdes escuras e sua fruta é amarela com polpa suculenta ácida, possui diâmetro de 6-7 cm, duas sementes e é utilizada extensamente na medicina popular como antidiarréica. A Gamboja é usada como pigmento para aquarela e como corante amarelo de tecidos. O fruto acidificado é utilizado em geléias, conservas e vinagres (BAGGETT et al., 2005). Revisão bibliográfica sobre o estudo fitoquímico das folhas, frutos, cascas e caules de Garcinia xanthochymus (Tabela 1) revelou a presença principalmente de benzofenonas, flavonóides, biflavonóides, triterpenos e xantonas (Figura 2), as quais possuem atividade analgésica, antibacteriana, antioxidante, antiviral e antitumoral. Introdução 33 O O OH OH OH OH O O OH OCH 3 OCH 3 OH OH O HH HO OH OH O OOH Figura 1 - Foto de diferentes partes de Garcinia xanthochymus. O OH OH O OH O Figura 2 - Algumas classes de substâncias isoladas da espécie de Garcinia xanthochymus. O OOH OH OH O OH OOH OH Benzofenonas Derivados do floroglucinolTriterpenos FlavonoidesBiflavonoides Xantonas Introdução 34 Tabela 1 - Substâncias isoladas de Garcinia xanthochymus e bioatividades relatadas nas referências citadas. Classe Substância bioatividade órgão Referência benzofenona aristofenona A - frutos BAGGETT et al., 2005 cicloxantochimol - frutos BAGGETT et al., 2005 isoxantochimol - frutos BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981; BAGGETT et al., 2005; KARANJGOAKAR, et al., 1973 gambogenona antitumoral, antioxidante frutos BAGGETT et al., 2005 gutiferona E - frutos BAGGETT et al., 2005 gutiferona H antitumoral, antioxidante frutos BAGGETT et al., 2005 maclurina - frutos BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981; TANDON et al., 1980; BAGGETT et al., 2005 xantochimol antimicrobial frutos KARANJGOAKAR et al., 1973; RAMA RAO; VENKATSWAMY; YEMUL, 1980 biflavonóide agatisflavona - folhas PARVEEN et al., 1994 amentoflavona - frutos BAGGETT et al., 2005 I3,II8-biapigenina - frutos BAGGETT et al., 2005 (±)-fukugisídeo - frutos KONOSHIMA et al., 1970; BAGGETT et al., 2005 (±)-fukugetina - frutos KONOSHIMA et al., 1970; BAGGETT et al., 2005 7-O-metilamentoflavona - folhas PARVEEN et al., 1994 volkensiflavona - frutos KONOSHIMA et al., 1970; BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981; BAGGETT et al., 2005 xantochimusídeo - caules KONOSHIMA et al., 1970 GB1 - frutos BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981 GB1a - frutos KONOSHIMA et al., 1970; BASLAS; KUMAR, 1979 GB2 - caules KONOSHIMA et al., 1970 GB2a - caules KONOSHIMA et al., 1970 bis-xantona bigarcinenona A antioxidante cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 éster tereftalato de dimetila - folhas SINGH et al., 1991 flavonóide 6-prenilapigenina antitumoral cascas HAN et al., 2007 vitexina - folhas PARVEEN et al., 1994 Derivado do floroglucinol garcinenona F antioxidante cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 Terpeno betulina - folhas SINGH et al., 1991 canofilol - folhas SINGH et al., 1991 friedelina - folhas SINGH et al., 1991 -sitosterol - folhas SINGH et al., 1991 Introdução 35 xantona alloathyriol - frutos BAGGETT et al., 2005 1,3,5,6-tetrahidroxi-4,7,8- triprenilxantona Regenerativa de nervos caule CHANMAHASATHIEN et al., 2003a garcinexantona A - cascas CHEN et al., 2008 garcinexantona B - cascas CHEN et al., 2008 garcinexantona C - cascas CHEN et al., 2008 garcinexantona D - cascas CHEN et al., 2008 garcinexantona E - cascas CHEN et al., 2008 garciniaxantona E Regenerativa de nervos, antitumoral caule CHANMAHASATHIEN et al., 2003a; HAN et al., 2007 12b-hidroxi-des-d-garcigerrina Regenerativa de nervos caule CHANMAHASATHIEN et al., 2003b 5-hidroxi-1,2-dimetoxixantona - cascas ZHONG et al., 2008 5-hidroxi-1,3-dimetoxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,5-dihidroxixantona - frutos BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981 1,4,5,6-tetrahidroxi-7- prenilxantona antitumoral cascas HAN et al., 2007 1,4,5,6-tetrahidroxi-7,8- diprenilxantona antitumoral cascas HAN et al., 2007 1,3,5,6-tetrahidroxy-4,7,8- triprenilxantona antitumoral cascas HAN et al., 2007 1,7-dihidroxixantona - frutos BASLAS; KUMAR, 1979 e 1981 1,5-dihidroxi-3-metoxixantona antioxidante cascas CHENG et al., 2008 1,2-dihidroxi-5,6- dimetoxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,6-dihidroxi-4,5- dimetoxixantona - cascas ZHONG et al., 2007 2,5-dihidroxi-1-metoxixantona antioxidante cascas CHENG et al., 2008 1,2,5-trihidroxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,3,7-trihidroxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,4,5-trihidroxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,2,7-trihidroxi-4-(1,1- dimetilalil)xantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,5,6-trihidroxi-7,8-di(3-metil- 2-butenil)-6’,6’- dimetilpirano(2`,3`:3,4)xantona - cascas ZHONG et al., 2007 1,4,6-trihidroxi-5- metoxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,3,7-trihidroxi-5- metoxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,2,5-trihidroxi-6- metoxixantona - cascas ZHONG; CHEN; YANG, 2008 1,2,6-trihidroxi-5-metoxi-7-(3- metil-2-butenil)xantona Regenerativa de nervos caule CHANMAHASATHIEN et al., 2003b Introdução 36 1,4,6-trihidroxi-5-metoxi-7- prenilxantona antitumoral cascas HAN et al., 2007 1,2,5,6-tetrahidroxi-7- geranilxantona antitumoral cascas HAN et al., 2007 1,4,5,6-tetrahidroxi-7,8-di(3- metil-2-butenil)xantona Regenerativa de nervos caule CHANMAHASATHIEN et al., 2003b 1.4 Biflavonóides Os flavonóides figuram entre as classes de substâncias químicas de maior ocorrência botânica, sendo contabilizados em números superiores a seis mil exemplares (HARBORNE e WILLIAMS, 2000). São derivados de benzo-�-pirona com a maioria de seus representantes formados por 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental. A biossíntese dos flavonóides (Figura 3) apresenta a singularidade de seus anéis aromáticos serem formados por rotas metabólicas distintas. Sua porção fenil-propanoídica (anel B + C2,C3,C4) é derivada do ácido p-cumárico formado pela via do chiquimato. Por outro lado, o anel A é formado basicamente pela condensação de unidades de acetato, pela via dos policetídeos, que se inicia com a formação de malonil CoA a partir de acetil CoA mediante a enzima acetil CoA-carboxilase (ACC). A biossíntese geral dos flavonóides tem como intermediário central o tio-éster p-cumaril-CoA, que será alongado pela condensação de três unidades de malonil-CoA, catalisado pela enzima chalcona sintetase (CS). A ciclização resulta na formação do anel A e produz a chalcona, que em condições fisiológicas, tende espontaneamente à flavona racêmica. É relatado também que a ciclização da chalcona é catalisada pela enzima chalcona isomerase (CI), que induz o fechamento estereoespecífico do anel (adição syn sobre a dupla ligação E) formando exclusivamente a 2-(S)-flavanona. Os outros tipos de flavonóides são formados por subseqüentes etapas de óxi-redução deste intermediário comum (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000; XIE e DIXON, 2005). Os biflavonóides se caracterizam pela união covalente das unidades monoméricas dos flavonóides (Figura 4). Essas unidades podem ser semelhantes ou possuírem diferentes tipos estruturais e se diferenciam de outros oligômeros como as proantocianidinas, devido à origem biogenética das unidades constituintes (SUZART et al., 2007). As ligações entre as unidades flavonoídicas podem ser C-C ou C-O-C envolvendo os anéis A, B ou C dos monômeros. Raramente ocorre alteração no padrão de oxigenação dos precursores, sendo garantida a oxigenação em 5, 7 e 4'. Adicionalmente, podem ocorrer Introdução 37 oxidações nas posições 6, 8 ou 3' e quando isso acontece é, normalmente proveniente da outra unidade ligada nessa posição via ligação C-O-C (SUZART et al., 2007). Rota Chiquimato Fenilalanina Ácido cinâmico Ácido cumárico Ácido cafeico Ácido clorogênico Ácido quínico p-cumaril-CoA Malonil CoA Acetil CoA lig na na s ACC chalcona flavona isoflavonaflavanona dihidroflavonolflavonol catequina antocianidina antocianina epicatequina leucoancianidina Taninos condensados Rota acetato malonato CS CI Rota Chiquimato Fenilalanina Ácido cinâmico Ácido cumárico Ácido cafeico Ácido clorogênico Ácido quínico p-cumaril-CoA Malonil CoA Acetil CoA lig na na s ACC chalcona flavona isoflavonaflavanona dihidroflavonolflavonol catequina antocianidina antocianina epicatequina leucoancianidina Taninos condensados Rota acetato malonato CS CI Figura 3 - Esquema geral da rota biossintética de flavonóides (ACC-acetil CoA-carboxilase, CS- chalcona sintetase e CI-chalcona isomerase). Figura 4 - Estrutura de biflavonóides tipo flavona-flavona. O OH OH O OH OH OH O O OH 6’ 9 4 5’ 3’ 2’ 8 4’ 10 7 5 6 6’’’ 5’’’ 4’’’ 3’’’ 2’’’ 10’’ 9’’ 8’’ 7’’ 6’’ 5’’ 4’’ 3’’ 2’’ 3 2 O OH OH O OH OH OH O O OH 6’ 9 4 5’ 3’ 2’ 8 4’ 10 7 5 6 6’’’ 5’’’ 4’’’ 3’’’ 2’’’ 10’’ 9’’ 8’’ 7’’ 6’’ 5’’ 4’’ 3’’ 2’’ 3 2 Introdução 38 Estima-se que a quantidade de biflavonóides seja superior a duzentas substâncias, dispersas principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas, das quais se destacam as famílias Clusiaceae, Ochnaceae e Anacardiaceae. Os biflavonóides, quando comparados aos seus monômeros, frequentemente apresentam maior atividade, como por exemplo, em doenças espamódicas (HARBONE e WILLIAMS, 2000). A biflavanona 7,7’’-di-O-metiltetraidroamentoflavona isolada das folhas de Rhus retinorrhoea apresentou moderada atividade frente às cepas W2 e D6 de P. falciparum com valores de CI50 de 0,98 e 2,80 �g.mL-1, respectivamente (AHMED et al., 2001). O fracionamento do extrato n-BuOH da raiz de Wikstroemia indica permitiu o isolamento de sikokianina B e sikokianina C com valores de CI50 de 0,54 e 0,56 �g.mL-1, respectivamente, frente à cepa cloroquina-resistente K1 de P. falciparum (NUNOME et al., 2004). Alguns biflavonóides apresentaram atividade antifúngica, como a amentoflavona, 6,6’’-bigenquanina e 7,7’’-dimetoxiagastisflavona que inibiu a produção de aflatoxina em Aspergillus flavus (GONCALEZ; FELICIO; PINTO, 2001). Atividades antivirais foram determinadas para os compostos amentoflavona, agatisflavona, rhusflavanona e robustaflavona, em ensaios frente aos vírus Myxovirus influenzae (gripe), Herpes simplex (LIN et al., 1999) e HIV (LIN et al., 1997). O potencial antineoplásico de alguns biflavonóides e análogos já foi avaliado com sucesso, em testes de citotoxicidade frente a linhagens de células tumorais (CHEN; DUH; CHEN, 2005), (LIN; KUO; CHOU, 2000), (SILVA et al., 1995), (LIN; CHEN; LEE, 1989) e mediante ensaios de inibição da enzima DNA topoisomerase (GRYNBERG et al., 2002). As biflavonas 6→6′′-begenquanina e 7,7′′-O-dimetilagatisflavona isoladas de Ouratea spectabilis apresentaram atividade inibitória sobre a enzima aldose redutase de cristalino bovino. O aumento da atividade dessa enzima está relacionado com a patogênese da maioria das complicações da diabetes, como cataratas, retinopatia, neuropatia (FELÍCIO et al., 1995). 1.4.1 Atropoisomerismo O fenômeno conhecido como atropoisomerismo, denominação oriunda da palavra grega atropos (sem rotação), é atribuído a um tipo de estereoisomerismo característico de sistemas onde a rotação livre em torno de uma ligação simples é impedida, produzindo uma barreira energética suficientemente elevada, de modo a permitir o isolamento ou simplesmente a detecção dos diferentes rotâmeros, chamados atropoisômeros (FRAGA, et Introdução 39 al., 2007). O atropoisomerismo ocorre quando os isômeros são separáveis com meia-vida de pelo menos 1000 s (16,7 min), não depende do valor da barreira energética de interconversão e é variável com a temperatura (CANUTO, 2007). A complexidade dos espectros de um biflavonóide, em que se observa duplicação e pareamento de sinais, é explicada pela atropoisomeria e ocorre frequentemente em estruturas cujas unidades estão interligadas através dos carbonos C-3→C-8’’. Li et al. (2002) mostrou que um experimento de RMN 1H com os biflavonóides (±)- morelloflavona, (±)-morelloflavona-7-sulfato e (±)-volkensiflavona-7-sulfato, isolados de Rheedia acuminata, realizado sob aquecimento de 80°C simplifica o espectro devido a alta energia da rotação, resultando assim, no desaparecimento das linhas espectrais duplicadas. À temperatura ambiente (25°C) foram observados sinais pareados referente à mistura de rotâmeros (1a e 1b) em razão da lenta interconversão causada pela elevada barreira energética. Entretanto, em temperaturas superiores (80 °C) observa-se que os sinais duplos tendem a aproximar-se (alargamento dos picos), coalescem (pico único alargado) e por último obtem-se um sinal simples cuja absorção corresponde a uma freqüência central às duas existentes anteriormente. Isto acontece porque o aquecimento acelera a velocidade de interconversão, fazendo com que seja superada mais facilmente a barreira energética, favorecendo a formação exclusiva de um dos confôrmeros (Figura 5). 1.5 Atividade antioxidante Doenças degenerativas do Sistema Nervoso Central (SNC) como Mal de Alzheimer e Mal de Parkinson estão associadas em parte com os efeitos deletérios que o desequilíbrio entre fatores pró e antioxidantes, decorrente da produção descontrolada de radicais livres, pode provocar nos sistemas biológicos. A geração de radicais livres ocorre normalmente durante o metabolismo. Em condições fisiológicas, de todo o oxigênio molecular captado nas mitocôndrias e processado na cadeia respiratória, só 1 a 5% escapam e formam oxirradicais. Porém, esta mínima porcentagem é suficiente para dar origem a diversas espécies reativas, seja por absorção de energia ou por transferência de elétrons. Vale notar que nem todas as espécies reativas de oxigênio (EROs) são radicais, o peróxido de hidrogênio e o oxigênio singlete não possuem elétrons desemparelhados, e sua reatividade é atribuída ao fato de seus elétrons de valência estarem situados em órbitais mais distantes do núcleo, o que leva o Introdução 40 átomo a um estado químico altamente reativo, com características diradicalares (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997). Figura 5 - Experimento de RMN 1H para a (±)-morelloflavona (Li et al., 2002) em temperaturas variáveis. O sinal 1a representa o confôrmero principal e 1b o confôrmero minoritário. A produção dessas espécies de maneira desordenada provoca danos oxidativos em macromoléculas biológicas como lipídeos, proteínas, DNA, alterando suas propriedades, estruturas e as funções das membranas celulares e do material genético (POTTERAT, 1997). O2 O2 -. H2O2 HO-. H2O Na tentativa de minimizar os efeitos danosos dos radicais livres, organismos aeróbicos desenvolveram mecanismos de proteção antioxidante (Figura 6) que envolvem sistemas enzimáticos como a superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase (GSH) e sistemas antioxidantes compostos por micromoléculas como o ácido Introdução 41 ascórbico (vitamina C), tocoferóis (vitamina E), carotenóides e flavonóides, entre outros (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). Embora o organismo tenha capacidade de prevenir reações indesejáveis e reparar moléculas e tecidos danificados, estes mecanismos de defesa não são suficientemente abrangentes para reparar todos os danos causados por tais reações, ocorrendo o acúmulo de substâncias prejudiciais ao nosso corpo. Esta situação de desequilíbrio entre a formação de espécie com poder oxidante e a sua destruição denomina-se estresse oxidativo e pode conduzir a um metabolismo anormal, disfunção celular, à perda de funções fisiológicas, a doenças e à morte. Trabalhos sobre medicina preventiva mostram que as substâncias fenólicas são os antioxidantes naturais mais eficientes e enfatizam a importância da descoberta de novas substâncias que possam ser incluídas na dieta alimentar, visando à manutenção do equilíbrio pró-oxidante/antioxidante corporal, evitando assim o estresse oxidativo (RICE- EVANS; MILEER; PAGANGA, 1996). 1.6 Biflavonóides como agentes antioxidantes Os flavonóides/biflavonóides têm sido objeto de considerável interesse científico principalmente pela sua potencial ação antioxidante. De um modo geral, estes possuem estrutura ideal para o seqüestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E em determinadas situações. A atividade antioxidante dos flavonóides depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: estabilidade do radical flavonoil formado, reatividade como agente doador de H. e elétrons, capacidade de quelar metais de transição e solubilidade e interação com as membranas (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). A atividade de seqüestro está diretamente ligada ao potencial de oxidação dos flavonóides e das espécies a serem seqüestradas. Quanto menor o potencial de oxidação do flavonóide, maior é a sua atividade como seqüestrador de radicais livres. Introdução 42 O2 Mitocôndria NADPH oxidase O2 - H2O2 OH- H2O Fe2+ Fe3+Reação de Fenton H2O O2 catalase Peroxidação lipídica Lesão protéica Lesão do DNA Glutationa- peroxidase Glutationa- redutase 2GSH GSSG Defesas antioxidantesERO H2O2 O2 - OH- catalase GSH SOD SOD vitamina C tocoferóis HOO O2 Mitocôndria NADPH oxidase O2 - H2O2 OH- H2O Fe2+ Fe3+Reação de Fenton H2O O2 catalase Peroxidação lipídica Lesão protéica Lesão do DNA Glutationa- peroxidase Glutationa- redutase 2GSH GSSG Defesas antioxidantesERO H2O2 O2 -O2 - OH-OH- catalase GSH SOD SOD vitamina C tocoferóis HOOHOO Figura 6 - Representação do equilíbrio entre as EROs e as defesas antioxidantes do nosso organismo (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). Quanto maior o número de hidroxilas, maior atividade como agente doador de H radicalar e de elétrons (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997; YANG et al., 2001). Flavonóides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por exemplo, a 5-hidroxi-flavona tem atividade abaixo dos limites de detecção. Entre os flavonóides diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem o grupo catecol (3’, 4’ -diidroxi) no anel B. Os flavonóides com múltiplas hidroxilas como a miricetina, quercetina, luteolina, e taxifolina possuem forte atividade antioxidante quando comparados ao α-tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno, glutationa, ácido úrico e bilirrubina (YANGet al., 2001). A estabilidade do radical livre flavonoil formado depende da habilidade em deslocalizar o elétron desemparelhado. A presença de hidroxilas em orto e a insaturação em C2-C3 são os principais fatores que auxiliam nessa deslocalização. Os flavonóides, devido ao seu caráter fracamente ácido e à extensa conjugação, encontram-se, em geral, parcialmente ionizados, o que aumenta a estabilidade do radical formado na posição C-4 e favorece a deslocalização do elétron desemparelhado do radical formado entre os anéis A, B e C. A remoção de metais de transição livres no meio biológico é fundamental para a proteção antioxidante do organismo, visto que esses catalisam as reações de Fenton (1) e de Haber-Weiss (2), produtoras de EROs. Para a atividade de quelação de metais é fundamental a presença de grupos orto-dioxigenados, onde o mais comum é o sistema 3’, 4’-diidroxi, unidade catecol em B e/ou estruturas cetol com 4-ceto-3-hidroxi e 4-ceto-5- Introdução 43 hidroxi. A substituição de qualquer uma das hidroxilas envolvidas na quelação de metais reduz essa atividade devida ao impedimento estérico provocado. Outro fator importante que influencia a atividade antioxidante é a sua interação com as biomembranas. A lipofilicidade do flavonóide indica a incorporação deste pela membrana, que é alvo da grande parte dos radicais livres. Assim deve haver uma concentração mínima do flavonóide por ácido graxo, de modo a assegurar a presença de suas moléculas próximas aos sítios preferências de ataque do radical (VAN ACKEL et al., 1996). Flavonóides que possuem uma cadeia de açucares ligada em sua estrutura são muito polares, não sendo assimilados pela membrana, porém nesta forma eles podem ser armazenados em vesículas, possuindo um tempo maior de permanência no organismo. Os flavonóides que são assimilados pelas membranas exercem a função de moduladores de fluidez. Restringindo essa fluidez os flavonóides geram um impedimento físico pra a difusão dos radicais livres, de modo que decresce a cinética das reações responsáveis pelo estresse oxidativo. Os biflavonóides apresentam significativa atividade antioxidante como a amentoflavona que é capaz de proteger membranas lipossômicas contra a degradação peroxidativa causada pelos raios UV (YAMAGUCHI et al., 2005). Recentemente, o biflavonóide morelloflavona mostrou-se ativo frente à inibição da oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (HUTADILOCK-TOWATANA; KONGKACHUAY; MAHABUSARAKAM, 2007) e alguns biflavonóides como amentoflavona e hinokiflavona mostraram efeitos de proteção em estudos de morte celular induzida por estresse oxidativo com H2O2 (KANG et al., 2005). 1.7 Agentes quimiopreventivos A quimioprevenção pode ser entendida como o uso de substâncias químicas a fim de prevenir, retardar ou reverter o processo de carcinogênese (WATTENBERG, 1985). Muitas substâncias quimiopreventivas potenciais estão presentes na dieta como polifenóis, isoflavonas, curcumina, fenetil isoiocianato, sulforafano, licopeno, ácidos salicílicos, cafeína entre outras. Tais substâncias tem-se mostrado grande aliadas no tratamento dos Introdução 44 linfomas, dos tumores da infância e das neoplasias de células germinativas (KELLOFF et al., 2000; CHUANG et al., 2000). Os elementos quimiopreventivos podem ser classificados em dois grupos de acordo com a etapa da carcinogênese química sobre a qual são eficazes. O primeiro grupo é composto por agentes bloqueadores, representados por compostos capazes de modular os processos de absorção intestinal, biotransformação e bioativação microssomal, excreção renal e interação com o material genético de substâncias cancerígenas. O segundo grupo de quimiopreventivos é composto por agentes supressores que interferem em alguns eventos celulares críticos à promoção e progressão da carcinogênese, prevenindo a evolução da malignização celular (WATTENBERG, 1985). Algumas das estratégias para a proteção de células dos eventos iniciais da formação de tumores incluem a inibição de enzimas metabólicas responsáveis pela geração de espécies reativas (enzimas de fase I), ao passo que enzimas da fase II são estimuladas, promovendo a desativação de radicais e eletrófilos envolvidos nos processos celulares normais. Os agentes responsáveis por este acontecimento são denominados “indutores bifuncionais”, onde os carcinógenos poderiam induzir a uma proteção contra seu próprio efeito tóxico. Além destes, existem os “indutores monofuncionais”, que somente induzem enzimas de fase II seletivamente e ativam elementos de resposta antioxidante (CUENDET et al., 2006). A redução de quinonas eletrofílicas pela quinona redutase se constitui numa via importante de detoxificação e o seu grau de atividade pode ser inferido através da indução em células da linhagem de hepatocarcinoma murino-Hepa 1c1c7. A indução de enzimas da fase II pode proteger os sistemas biológicos contra espécies químicas tóxicas e reativas, e estudos recentes demonstram que a elevação dessas enzimas, como a NADPH: quinona- redutase e GST (Glutationa s-transferase) estão correlacionadas com a proteção celular nos estágios iniciais e intermediários contra a carcinogênese induzida por agentes químicos em modelos animais (WATTENBERG, 1985; SONG et al., 1999; CUENDET et al., 2006). Justificativa 45 2 JUSTIFICATIVA A obtenção de substâncias bioativas a partir de fontes naturais sofreu interesse renovado nos últimos anos, apesar do avanço acentuado de tecnologias competitivas como a química combinatória, análise de proteoma e metaboloma e a engenharia molecular (ROUHI, 2003; NEWMAN; CRAGG, 2007). A obtenção de moléculas de esqueleto inédito ou com atividades biológicas marcantes e/ou novos mecanismos de ação age como força matriz para esforços intensos e contínuos em atividades de bioprospecção e justificam os grandes investimentos realizados em escala mundial na busca por protótipos moleculares para o desenvolvimento de fármacos (CORDELL, 2000; YOUNES; VARELLA; SUFFREDINI, 2007). O Brasil, com sua enorme biodiversidade apresenta motivos adicionais para intensificar essas atividades já que o conhecimento científico dos remanescentes da nossa flora podem despertar a consciência sobre as consequências da degradação dos nossos ecossistemas, com a perda de espécies desconhecidas ou não investigadas e consequentemente, de substâncias potencialmente úteis. Os projetos em andamento no NuBBE visando à conservação e uso sustentável da diversidade vegetal no Estado de São Paulo através de estudos sobre diversidade química e busca de drogas potenciais, incluem as atividades de bioprospecção e fazem parte da estratégia de exploração racional de nossa biodiversidade. As substâncias presentes nos extratos vegetais pertencem a variadas classes de produtos naturais e podem apresentar atividades biológicas marcantes. A vasta gama de patologias decorrentes do estresse oxidativo permite uma abordagem que usa a detecção e avaliação das propriedades antioxidantes de extratos vegetais como etapa preliminar e indicativa de outros tipos de bioatividades. Assim, a detecção de atividade citotóxica seletiva para determinadas linhagens de células tumorais, por exemplo, através de mecanismos de apoptose e, no caso de plantas usadas por suas propriedades antiinflamatórias, os antioxidantes podem agir como redutores de estresse oxidativo que ocorre nas células sob ação dos mediadores químicos pró-inflamatórios. Outras patologias associadas ao estresse oxidativo, como o câncer, podem ser evitados com o uso de agentes quiomiopreventivos, ou seja, extratos vegetais, frações semipurificadas ou substâncias isoladas que associam as propriedades antioxidantes com efeitos biológicos de indução sobre enzimas destoxificantes do organismo, por exemplo, a Justificativa 46 quinona redutase. Fica evidente, portanto, a complementariedade das informações obtidas na busca por substâncias naturais com atividade antioxidante, citotóxica e indutora de quinona redutase, justificando esta abordagem. Objetivos 47 3 OBJETIVOS (A) Isolamento e determinação estrutural de substâncias dos frutos e folhas de Garcinia xanthochymus; (B) Avaliação do potencial de bioatividade dos extratos brutos, frações semipurificadas e substâncias isoladas empregando ensaios para atividade antioxidante, indutora de quinona redutase, antifúngica, antimalárica e tripanocida. Materiais e Equipamentos 48 4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 4.1 Métodos cromatográficos 4.1.1 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) As cromatoplacas foram preparadas aplicando-se uma suspensão de sílica gel 60 PF254, com indicador de fluorescência em água destilada, na proporção de 1:2 (m:v) sobre placas de vidro, obtendo-se 25 mm de espessura de adsorvente através da utilização de espalhador Quickfitt®. Após a preparação das cromatoplacas, estas foram ativadas em estufa por 30 minutos. Revelação das cromatoplacas: cada cromatoplaca foi revelada por meio de um ou mais dos métodos físicos e químicos descritos abaixo: (A) Inspeção em luz ultravioleta: as cromatoplacas foram expostas a luz ultravioleta, nos comprimentos de onda de 254 e 365 nm. (B) Solução de anisaldeído: aproximadamente 5,0 ml de solução de anisaldeído (0,5 ml de anisaldeído + 10,0 mL de ácido sulfúrico concentrado + 85,0 ml de MeOH) foi preparada com a adição dos reagentes em banho de gelo. Tal solução foi acondicionada em vidro âmbar e armazenada a 8°C. Para a revelação de cromatoplacas, borrifaram-se pequenas alíquotas e então, estas foram colocadas em estufas a 120°C. (C) Solução de β-caroteno: Preparou-se uma solução de 0,02% de β-caroteno (Aldrich®) em metanol. Após a nebulização das cromatoplacas, essas foram expostas ao ar e luz natural, por cerca de 6 horas, a fim de catalisar a oxidação do β-caroteno. 4.1.2 Cromatografia em coluna de fase normal (CC-FN) Para cromatografia em coluna de fase normal foi utilizado como fase estacionária sílica-gel 60-230 µ (Merck). O empacotamento da coluna se deu 24 horas antes do início da eluição. Materiais e Equipamentos 49 4.1.3 Extração líquid