UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Campus Araraquara Departamento de Ciências Biológicas JÉSSICA SACCHI CASTILHO Caracterização biológica e morfológica de duas cepas de Trypanosoma cruzi isoladas de espécimes de Triatoma sherlocki coletadas em Santo Inácio, BA. ARARAQUARA – SP 2017 JÉSSICA SACCHI CASTILHO CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MORFOLÓGICA DE DUAS CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI ISOLADAS DE ESPÉCIMES DE TRIATOMA SHERLOCKI COLETADAS EM SANTO INÁCIO, BA. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista como parte dos requisitos exigidos para obter o grau de Farmacêutica-Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. João Aristeu da Rosa Coorientadora: Dra. Aline Rimoldi Ribeiro ARARAQUARA - SP 2017 AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer aos meus pais, Sergio e Denise, sem eles nada disso seria possível. Obrigada pelo apoio psicológico, financeiro e pelo amor incondicional. Mesmo estando longe, vocês estiveram presentes em todos os momentos nesses meus seis anos em Araraquara. Essa conquista é nossa! A Fernanda, que mesmo com a minha ausência, quando nos encontrávamos parecia que nada mudou. A Vó Ana, Tia Regina, obrigada por todo o carinho e preocupação, pelos finais de semana em São Paulo regados a mimo. Agradeço ter vocês na minha vida, amo muito vocês! A minha república Só Caqui, que foi a família que a vida me deu, vocês estiveram e ainda estão do meu lado em qualquer situação, e tornaram minha vida em Araraquara mais divertida, leve e com certeza, nos melhores anos da minha vida. Ao Farra Farma, responsáveis por grande parte dos meus “5 bolas”, sem vocês eu não teria chegado aqui, obrigada pela companhia diária, pelas risadas e pela amizade. Ao Iago, que viveu de perto essa reta final comigo, me proporcionou muitos momentos felizes, sem você meu último ano em Araraquara não teria sido a mesma coisa. As Panteras, que sempre entenderam a distância e continuaram sendo as melhores amigas que alguém pode ter. Ao meu orientador João Aristeu, sempre paciente e inspirador, tanto como profissional, quanto como pessoa. Foi uma honra ser sua aluna. A minha coorientadora e amiga Aline, que sempre se mostrou disposta a me ajudar e passar todo seu conhecimento da melhor maneira. Saibam que eu aprendi, muito, nesses anos com vocês. SUMÁRIO 1. Introdução...................................................................................................................... 10 1.1. Histórico ..................................................................................................................... 10 1.2. Trypanosoma cruzi .................................................................................................... 11 1.3. Triatomíneo ................................................................................................................ 14 1.3.1. Triatoma sherlocki .............................................................................................. 15 1.4. Transmissão ............................................................................................................... 16 1.5. Patologia da doença ................................................................................................... 17 1.6. Controle da doença e tratamento................................................................................ 19 1.7. Epidemiologia ............................................................................................................ 21 2. Objetivos ....................................................................................................................... 22 2.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 22 2.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 22 3. Metodologia .................................................................................................................. 22 3.1. Cepas estudadas ......................................................................................................... 22 3.2. Meio de cultura .......................................................................................................... 24 3.2.1. Manutenção em meio LIT .................................................................................. 25 3.2.2. Manutenção em estufa B.O.D............................................................................. 25 3.3. Manutenção das cepas “in vivo” ................................................................................ 26 3.4. Fixação, coloração e mensuração de formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi28 3.5. Cinética de crescimento ............................................................................................. 31 3.6. Curva parasitêmica .................................................................................................... 32 4. Resultados ..................................................................................................................... 33 4.1. Cinética de crescimento ............................................................................................. 33 4.2. Curva parasitêmica .................................................................................................... 34 4.3. Mensuração de formas tripomastigotas de T. cruzi ................................................... 37 5. Discussão ....................................................................................................................... 43 6. Conclusão ...................................................................................................................... 46 7. Bibliografia.................................................................................................................... 47 8. Anexos ........................................................................................................................... 59 RESUMO A América Latina é a área onde se encontra o maior número de pessoas com doença de Chagas. As estimativas referem que existem entre 6-8 milhões de infectados no mundo. Mas, nas últimas décadas, com o aumento da mobilidade populacional entre a América Latina e os demais países, podem ser encontrados chagásicos nos Estados Unidos, Canadá, países Europeus e do Pacifico Oriental. Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, apresenta alta variabilidade que pode ser diferenciada por marcadores biológicos, bioquímicos, imunológicos e genéticos. Duas cepas de Trypanosoma cruzi (Tsh1 e Tsh7) estudadas foram isoladas no laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP/Araraquara, a partir de dois exemplares de Triatoma sherlocki coletados em Santo Inácio, Bahia. As cepas foram mantidas em meio de cultura LIT (Liver Infusion Tryptose) onde se avaliou a cinética de crescimento, e a partir das formas obtidas em cultura foi desenvolvida curva parasitêmica em camundongos Swiss determinando-se período pré-patente, pico parasitêmico, taxa de mortalidade e desaparecimento das formas circulantes no sangue periférico dos camundongos, a fim de estabelecer o padrão de infecção. Essas mesmas formas tripomastigotas sanguíneas, foram avaliadas microscopicamente, onde foram determinadas as características morfológicas das cepas. Desta forma, as cepas de T. cruzi isoladas de exemplares coletados em Santo Inácio mostraram baixa virulência e baixa parasitemia quando comparadas à cepa de referência, Y. Estudos moleculares e biológicos estão em desenvolvimento, de modo a ampliar o conhecimento a respeito das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. Ressalta-se que não foram localizados artigos sobre isolamento e caracterização de cepas de T. cruzi a partir de Triatoma sherlocki, sendo esse o primeiro trabalho. PALAVRAS-CHAVE: Trypanosoma cruzi, Triatoma sherlocki, doença de Chagas. ABSTRACT Latin America is the area where the largest number of people with Chagas' disease is found. Estimates indicate that are between 6-8 million infected people in the world. But in recent decades, with the increasing of population mobility between Latin America and other countries, chagasic patients can be found in the United States, Canada, European and Eastern Pacific countries. Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas' disease, presents high variability it can be differentiated by biological, biochemical, immunological and genetic markers. Two strains of T. cruzi (Tsh1 and Tsh7) studied were isolated from the laboratory of Parasitology of the Faculty of Pharmaceutical Sciences/UNESP/Araraquara, from two specimens of Triatoma sherlocki collected in Santo Inácio, Bahia. The strains were maintained in LIT (Liver Infusion Tryptose) culture medium, where the growth kinetics were evaluated, and from the forms obtained in culture a parasitemic curve was developed in Swiss mice, determining a pre-patent period, parasitemic peak, mortality and disappearance of circulating forms in the peripheral blood of the mice in order to establish the pattern of infection. These same blood trypomastigote forms were evaluated microscopically, where the morphological characteristics of the strains were determined. Thus, T. cruzi strains isolated from specimens collected in Santo Inácio showed low virulence and low parasitemia when compared to the reference strain, Y. Molecular and biological studies are under development, in order to increase the knowledge about the strains Tsh1 and Tsh7 from T. cruzi. No articles has been found on isolation and characterization of T. cruzi strains of Triatoma sherlocki, this is the first work. KEYWORDS: Trypanosoma cruzi, Triatoma sherlocki, Chagas disease. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Fórmula meio de cultura LIT. ................................................................................. 24 Tabela 2 – Modo de preparo do corante Giemsa. ..................................................................... 29 Tabela 3 - Parâmetros morfométricos para formas tripomastigotas de T. cruzi. ...................... 31 Tabela 4 - Média de crescimento das cepas de T. cruzi (x106) em meio LIT. ......................... 34 Tabela 5 - Características biológicas da cepa Tsh1 de T. cruzi após infecção intraperitonial em camundongos. ........................................................................................................................... 36 Tabela 6 - Características biológicas da cepa Tsh7 de T. cruzi após infecção intraperitonial em camundongos. ........................................................................................................................... 37 Tabela 7 - Parâmetros morfométricos da cepa Tsh1 de T. cruzi. ............................................. 38 Tabela 8 - Parâmetros morfométricos da cepa Tsh7 de T. cruzi. ............................................. 40 Tabela 9 – Resultados das mensurações de formas tripomastigotas da cepa Tsh1 de T. cruzi.41 Tabela 10 –Resultados das mensurações de formas tripomastigotas da cepa Tsh7 de T. cruzi. .................................................................................................................................................. 42 Tabela 11 - Características morfométricas e biológicas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. ... 42 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Representação das formas de Trypanosoma cruzi. .............................................. 13 Figura 2 – Mapa do local onde o espécime foi encontrado e foto de Triatoma sherlocki. .. 23 Figura 3 - Diagrama de uma forma tripomastigota de T. cruzi. ........................................... 30 Figura 4 - Perfil da cinética de crescimento das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi em meio de cultura LIT. ........................................................................................................................... 34 Figura 5 - Curva parasitêmica da cepa Tsh1 de T. cruzi. ..................................................... 35 Figura 6 - Curva parasitêmica da cepa Tsh7 de T. cruzi. ..................................................... 35 Figura 7 - Comparação das curvas parasitêmicas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. ......... 36 Figura 8 - Fotomicrografias de formas tripomastigotas de cepa Tsh1 de T. cruzi (x100).... 39 Figura 9 - Fotomicrografias de formas tripomastigotas da cepa Tsh7 de T. cruzi (x100).... 41 Figura 10 - Comparação dos parâmetros avaliados na mensuração de formas tripomastigotas de T. cruzi. .................................................................................................. 42 file:///E:/TCC%20JESSICA/TCC%20-%20Versão%20Final%20-%20Jéssica%20Castilho%20-%20Araraquara%202017.docx%23_Toc486290779 10 1. Introdução 1.1. Histórico O primeiro relato sobre os aspectos e hábitos dos triatomíneos, que data do ano de 1590, foi feito pelo Padre Reginaldo de Lizárraga em uma viagem de inspeção a conventos no Peru e Chile. Nesse relato são descritos os hábitos noturnos do inseto e sua proximidade dos humanos (GALVÃO, 2003). Darwin em uma viagem à América do Sul, também observou o inseto, e relatou como era curioso observar seu corpo durante o ato de sugar, visto que em menos de 10 minutos sua forma mudava de uma bolacha, para uma forma globular, além da sua voracidade por sangue (GALVÃO, 2014). O primeiro triatomíneo descrito foi Cimex rubrofasciatus, por De Geer em 1773. Posteriormente, quando a espécie passou para o gênero Triatoma, o seu nome passou a ser Triatoma rubrofasciata (LENT; WYGODZINSKY, 1979). Inicialmente os triatomíneos foram estudados sob um ponto de vista entomológico, no entanto após a descrição da nova tripanossomíase americana por Carlos Chagas, em 1909, foi despertado o interesse epidemiológico e sanitário por esses vetores (NEIVA; LENT, 1936; ABALOS; WYGODZINSKY, 1951). Em uma viagem a trabalho para o norte de Minas Gerais, a pedido do sanitarista Oswaldo Cruz, a fim de controlar um surto de malária, Carlos Chagas foi alertado pelo chefe da comissão de engenheiros da presença de insetos, vulgarmente chamados de barbeiros ("barbeiro" seria uma referência a pratica da sangria, realizada por esses profissionais no passado) (REZENDE; RASSI, 2008). Chagas resolveu investigar, para averiguar a possibilidade de o inseto transmitir algum parasito ao ser humano, pois diversos 11 casos de arritmia, insuficiência cardíaca e morte súbita haviam sido relatados no local, além da malária (GALVÃO, 2014). Ao examinar os insetos coletados no local, foram encontrados parasitos flagelados no seu intestino, acreditando se tratar de Trypanosoma minasense, que infectava saguis na região. Ao serem encaminhados para o Instituto Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro, foi identificado um novo Trypanosoma, inicialmente chamado de Schizotrypanum cruzi - em homenagem ao seu mestre Oswaldo Cruz - posteriormente renomeado para Trypanosoma cruzi. Após 30 dias, Chagas retornou ao local onde o inseto havia sido coletado e encontrou uma menina febril na qual haviam formas circulantes de T. cruzi (COUTINHO; DIAS, 1999). 1.2. Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae – esta família também engloba os gêneros Leishmania, Phytomonas, Endotrypanum, Leptomonas, Herpetomonas, Crithidia e Blastocrithidia, os quais são filogeneticamente separados. A ordem dos kinetoplastídeos é constituída de organismos eucariotos, que possuem uma organela típica denominada cinetoplasto. O cinetoplasto é constituído por DNA (kDNA) e situa-se no interior da mitocôndria. Membros da família Trypanosomatidae são todos parasitos de vertebrados, invertebrados ou plantas e são conhecidos por possuir um único flagelo (STEVENS et al., 2001). Segundo Silva e Nussenzweig (1953), foram encontradas diferenças antigênicas nas cepas de T. cruzi isoladas de humanos, morcegos, triatomíneos e roedores, nesse momento foram classificados pelo menos três tipos imunológicos. Nesse mesmo período, a análise de 12 sete exemplares de T. cruzi de diferentes origens, permitiu que Brener e Chiari (1963) os agrupassem em três padrões morfológicos distintos, de acordo com a largura das formas – formas delgadas, largas e muito largas ou “robustas” – já descritas por Chagas como dimorfismo sexual, em 1909. As diferentes formas encontradas estão diretamente relacionadas com a infectividade das cepas, quando mais delgada a forma, com mais facilidade ela migra da corrente sanguínea para os órgãos, ou seja, mais virulenta (ANDRADE et al., 1970). Outra forma de classificação do parasito é de acordo com a posição do cinetoplasto (Figura 1). As formas tripomastigotas são finas e alongadas, apresentam núcleo fusiforme, flagelo longo que se estende por toda a célula, cinetoplasto em forma esférica posicionado posterior ao núcleo, e membrana que emerge da sua extremidade posterior. As formas epimastigotas são caracterizadas por serem células grandes de formato alongado, núcleo esférico, flagelo livre na porção anterior ao núcleo, cinetoplasto em formato de bastão, justaposto ao núcleo e presença de cistóstoma. As formas amastigotas têm formato arredondado ou ovóide, cinetoplasto em forma de bastão, anterior ao núcleo, flagelo curto e visível apenas à microscopia eletrônica e a presença de citóstoma, esta consiste na forma replicativa no hospedeiro vertebrado (ARAÚJO et al., 2000). 13 Figura 1 - Representação das formas de Trypanosoma cruzi. Fonte: Adaptado de Parasitologia Médica, 2014. Formas classificadas de acordo com a posição do cinetoplasto. Onde A= forma amastigota; B= forma epimastigota e C= forma tripomastigota. Trypanosoma cruzi sob a forma tripomastigota pode ser encontrado somente no sangue de mamíferos, em aves, répteis ou anfíbios não há ocorrência, pois esses animais possuem lisinas que destroem T. cruzi (GALVÃO, 2014; COURA; DIAS, 2009). Trypanosoma cruzi possui dois hospedeiros durante seu ciclo, um vertebrado e outro invertebrado, os mamíferos e o triatomíneo respectivamente (TYLER; ENGMAN, 2001). Ao se alimentar de um mamífero infectado, o triatomíneo ingere uma população de T. cruzi presente no sangue do hospedeiro vertebrado, a maioria tripomastigota e cerca de 10% das formas ingeridas são amastigotas, as quais possuem geralmente de 3 a 5 mm de diâmetro (LEY et al., 1988; TYLER; ENGMAN, 2001). Em seguida os parasitas passam para o intestino médio do triatomíneo originando as esferomastigotas, que sofrem diferenciação para epimastigotas, que também são replicativas. As formas epimastigotas 14 aderem à superfície do intestino médio e posterior, onde se multiplicam intensamente assumindo a forma de tripomastigotas metacíclicas, as quais migram para o reto e são eliminadas pelas fezes e urina dos triatomíneos (TYLER; ENGMAN, 2001). Em mamíferos, inclusive humanos, as formas tripomastigotas infectantes penetram por meio das mucosas ou da pele lesada. Após a penetração, estes atingem a corrente sanguínea, invadindo as células, onde perdem o flagelo e se diferenciam em amastigotas. No interior da célula as formas amastigotas multiplicam-se por divisão binária, em ciclos de 12 horas aproximadamente, ocupando toda a célula. Após esse período se diferenciam novamente em tripomastigotas e ocorre lise celular, liberando os tripomastigotas para a corrente sanguínea. Estas então atingem uma nova célula-alvo de diferentes órgãos e músculo, tais como coração e baço, ou podem ainda ser ingeridas novamente pelo vetor, iniciando um novo ciclo. (ANDRADE, 2000; TYLER; ENGMAN, 2001). 1.3. Triatomíneo Existem mais de 100 animais considerados reservatórios silvestres de T. cruzi – como marsupiais, morcegos, roedores – além dos animais domésticos - como cachorros, gatos, roedores domésticos, porcos e caprinos (HAMILTON et al., 2012). Assim, ainda hoje, o triatomíneo é a meio principal de transmissão da doença de Chagas para o humano, transmitindo o protozoário para a corrente sanguínea por meio de suas fezes e urina depositadas próximo à lesão da picada (SILVEIRA, 2000). Em ambientes domésticos, os triatomíneos podem ser encontrados em frestas nas paredes de pau a pique ou inacabadas, em construções rurais e suburbanas, estes são fotofóbicos, ou seja, evitam locais iluminados, por esse motivo possuem hábitos noturnos, 15 alimentando-se durante a noite (REISENMAN et al., 1998). Em momentos em que o alimento torna-se escasso, buscam um novo habitat, a maior parte da sua locomoção entre os ninhos e a habitação humana é pelo solo. Somente os triatomíneos adultos têm asas, algumas espécies são capazes de se deslocar pequenas distâncias, no caso, Triatoma sherlocki não é capaz de voar (LEHANE; SCHOFIELD, 1981; REISENMAN et al., 1998). A picada do triatomíneo é indolor, ferindo levemente a pele, pois suas peças bucais são extremamente finas, no entanto possuem uma forte bomba capaz de sugar o sangue rapidamente (PEREIRA et al., 1996). Segundo Ferreira (2007) e Lehane (2005), o triatomíneo tem a percepção de sentir pequenas diferenças de temperatura na superfície da pele, identificando local com vênulas. Sua saliva possui, anestésicos e anticoagulantes, que inibem qualquer reação cutânea que revelaria a presença do mesmo (FERREIRA et al., 2007; LEHANE, 2005). 1.3.1. Triatoma sherlocki Atualmente são descritos 18 gêneros e 153 espécies na subfamília Triatominae, dessas 68 são encontradas no Brasil (GALVÃO, 2014; SOUZA et al., 2016). Triatoma sherlocki é uma espécie silvestre, coletada pela primeira vez em 1982 por Cerqueira. Este foi originalmente considerado uma subespécie do T. brasiliensis: T. brasiliensis santinacensis. Triatoma brasiliensis foi considerada como portadora de três variedades: T. brasiliensis (NEIVA, 1911); T. brasiliensis melanica (NEIVA; LENT, 1936; COSTA et al., 2006) e T. brasiliensis macromelasoma (GALVÃO, 2003); dessa forma T. brasiliensis santinacensis seria a quarta variedade de T. brasiliensis. Mas em 2002, Papa e colaboradores descreveram uma nova espécie silvestre e altamente endêmica - Triatoma 16 sherlocki, a qual foi coletada em Santo Inácio, Bahia. Até hoje, a Bahia é o único local do Nordeste onde a espécie foi encontrada, apresentando como habitat natural ambientes rochosos (PAPA et al., 2002). Os espécimes machos de T. sherlocki medem de 19 a 23mm de comprimento e as fêmeas de 19 a 26mm. Com características específicas como, pronoto de coloração castanho escura a preto, abdômen com urotergitos dorsais expostos, hemiélitros reduzidos, estrutura dianteira curta e anéis de cor laranja avermelhado ao longo dos fêmures. A genitália externa masculina mostra um processo mediano do pigóforo com ápice aguçado de ponta romba e base arqueada, o processo do endosoma é bastante estriado e região apical arredondada com muitos dentes (PAPA et al., 2002). 1.4. Transmissão Após a picada, a estrutura do triatomíneo perde a rigidez, devido ao aumento da pressão interna gerada pela bomba de ingestão. Dessa forma, seu volume aumenta, podendo ter em quantidade de sangue, seu peso em jejum multiplicado (MADDRELL, 1966; ORCHARD et al., 1988; IANOWSKI et al., 1998). Com sua forma volumosa e pesada, o barbeiro perde mobilidade e defeca logo após a sucção do sangue e eliminando formas tripomastigotas infectantes ao lado da picada. Normalmente a picada ocorre em áreas expostas durante a noite, como por exemplo, o rosto que fica desprotegido, e como reflexo, ao coçar os parasitas presentes nas fezes entram em qualquer abertura da pele – o orifício causado pela picada ou mucosas (olhos, nariz e boca) ou pequenas feridas e arranhaduras na pele (GALVÃO, 2014). 17 Alimentos contaminados com fezes e urina de triatomíneo, transfusões de sangue, transplantes de órgãos, transmissão congênita (gravidez ou parto) e acidentes laboratoriais, também podem transmitir T. cruzi (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017). 1.5. Patologia da doença De acordo com a conformação da forma tripomastigota, T. cruzi se apresenta sob três formas, descritas como dimorfismo sexual por Chagas: formas delgadas, largas e muito largas ou “robustas”. As formas delgadas se movem mais rapidamente e irregularmente por todos os campos do microscópio, apresentam um tropismo mais susceptível para macrófagos e com isso seriam mais virulentas. Já as formas largas e muito largas, tendem a permanecer por mais tempo no mesmo campo do microscópio, se movendo mais lentamente, assim também se observa menor virulência e maior tropismo para as células musculares (PINTO, 1942; BRENER; CHIARI, 1963; ANDRADE, 1974). Em cerca de 20 a 50% dos casos, ao penetrar na corrente sanguínea o parasita desencadeia sinais de porta de entrada característicos da transmissão vetorial, como lesão na pele, dores de cabeça, febre, gânglios aumentados, palidez, dor muscular abdominal e torácica e dificuldade de respirar. Outro sinal importante é o edema bipalpebral unilateral, que se trata de uma reação inflamatória à difusão do parasito na conjuntiva e adjacências, levando ao inchaço completo do olho (TATTO et al., 2007). A doença de Chagas é dividida em três fases: aguda, crônica indeterminada e crônica determinada. A aguda inicia-se após um período de incubação de cerca de sete a dez dias, permanecendo por até dois meses após o primeiro contato com o parasita, ou de acordo com o tempo de infecção e resposta do hospedeiro. Nesse momento, as formas se 18 encontram somente na corrente sanguínea e os sintomas são muito suaves ou inexistentes, podendo passar despercebida para a fase mais severa, que para pessoas imunocomprometidas, crianças e idosos pode ser fatal. Segundo Ribeiro e Rocha 1998, em crianças menores que dois anos com a ausência de tratamento a letalidade pode chegar a 10% (RIBEIRO; ROCHA, 1998). A segunda é a fase crônica indeterminada, esta começa entre quatro a dez semanas após o contado inicial. Esta fase é definida pela presença de infecção por T. cruzi, mas com ausência de manifestações clínicas, radiológicas e eletrocardiográficas de acometimento cardíaco ou digestivo, mas com anormalidades cardiovasculares significativas. Neste momento os parasitas deixam a corrente sanguínea e se estabilizam nos órgãos, principalmente músculos, coração e sistema digestório, o hospedeiro fica com baixa parasitemia e alta quantidade de anticorpos circulantes. A validade do conceito de forma indeterminada tem sido reafirmada, pela simplicidade diagnóstica e benignidade do prognóstico, os fatores considerados são: positividade sorológica e/ou parasitológica para doença de Chagas; ausência de sintomas e/ou sinais da moléstia; eletrocardiograma convencional normal; estudos radiológicos do coração, esôfago e cólon normais (RIBEIRO; ROCHA, 1998). A última fase é a crônica determinada, caracterizada pelo comprometimento cardíaco, digestivo e/ou neurológico. No coração há destruição progressiva de músculos e sistema nervoso, levando a paradas cardíacas ou morte súbita e no trato digestivo produz visceromegalias, principalmente o megaesôfago e megacólon. Das pessoas que já atingiram o estado crônico da doença, 30% desenvolvem problemas cardíacos e 10% problemas no trato gastrointestinal e neurológico (WHO, 2017; ARAÚJO et al., 2000). 19 1.6. Controle da doença e tratamento Até hoje, a principal forma para o controle da doença, envolve diretamente o controle do vetor. Desde 1990, no Brasil, uma das formas de controle são inseticidas em spray como o Dicloro-Difenil-Tricloroetano (DTT), até então usado somente para malária, foi uma das diversas alternativas usadas para o controle do vetor. A partir de 1947 novos testes foram realizados usando inseticidas clorados, como o Gamexanne P 530 ou hexaclorociclohexano (BHC), os quais apresentaram resultados mais promissores como triatominicida (BUSVINE; BARNES, 1947). O emprego do hexaclorobenzeno foi feito até 1982, quando foram introduzidos piretróides de síntese, que aumentavam sua eficácia e diminuíam a toxicidade para seres humanos e animais domésticos (DIAS; PELLEGRINO, 1948). Essa forma de prevenção mostrou resultados positivos, como a quase erradicação de transmissão de T. cruzi por Triatoma infestans. Por outro lado, as espécies silvestres permaneceram com sua dispersão inicial não atingidas pela eliminação de T. infestans, quando muito ocorreu apenas uma diminuição da população. Dessa forma T. brasiliensis se tornou a principal ameaça no semiárido do nordeste brasileiro (MENDONÇA et al., 2009). Outras medidas de profilaxia envolvem questões pessoais, como: uso de mosquiteiros, repelentes e inseticidas na residência e perímetro, telas em janelas e portas, fechamento de frestas, seja nas paredes ou no piso, impedindo a entrada do triatomíneo. Além disso, boa higiene no preparo, transporte, armazenamento e consumo de alimentos; triagem adequada em transplantes de sangue e órgãos; diagnósticos precoces e cuidados especiais em mulheres grávidas, evitando transmissão congênita (WHO, 2017). A doença de Chagas ainda não tem cura, mas o tratamento deve ser feito no início da infecção, inclusive em transmissões congênitas, garantindo que a doença ainda se encontre 20 na fase aguda, quanto maior a demora para o início do tratamento, menor a eficácia do medicamento. Os dois únicos medicamentos disponíveis são o Benzonidazol e o Nifurtimox, o tratamento apresenta duração de dois meses, quando este é feito corretamente, ou seja, na fase aguda apresentam eficácia próxima de 100%. Grande parte dos pacientes apresenta efeitos adversos, como intolerância digestiva, polineurite, psicose e tremores, gerando o abandono do tratamento, por isso o acompanhamento é essencial (TATTO, 2007; RASSI, 1971). Ainda hoje os medicamentos são considerados potencialmente tóxicos, sendo contraindicados para mulheres grávidas ou pessoas com problemas renais e no fígado. O Nifurtimox não deve ser usado por pessoas com histórico de desordens psiquiátricas e neurológicas, pois pode desencadear sintomas mais intensos (COURA et al., 1997). Quando a doença atinge a fase crônica, o tratamento é específico para as manifestações clínicas apresentadas, principalmente a cardíaca e digestiva, pois segundo estudo feito em pacientes por Coura (1997), o tratamento inicial, quando feito no estágio crônico, não apresentou nenhuma melhora significativa no quadro. Além disso, em relação aos efeitos colaterais, 17% dos pacientes avaliados interromperam o tratamento antecipadamente. O Nifurtimox, principalmente, apresentou mais efeitos colaterais que o Benzonidazol, foram eles: intolerância digestiva, parestesias e manifestações neuropsíquicas. O Benznidazole apresentou manifestações de erupção cutânea, neuropatia periférica e distúrbios gastrointestinais, porém, discretos ou moderados (COURA et al., 1997). 21 1.7. Epidemiologia Segundo Schmunis e Yadon (2010), na América Latina, a doença de Chagas representa o quarto maior impacto social entre todas as doenças infecciosas e parasitárias, atrás somente da AIDS, diarreia e doenças respiratórias. Estima-se que mundialmente, entre 6 e 7 milhões de pessoas se encontram infectadas pela doença (SCHMUNIS; YADON, 2010; WHO, 2017). Atualmente todos os países da América Latina, com exceção das ilhas caribenhas, possuem ocorrência da doença e devido à motilidade populacional, países que antes não possuíam histórico da doença, hoje apresentam número elevado de pessoas infectadas, como é o caso dos Estados Unidos, Canadá, alguns países da Europa e do Pacífico (WHO, 2017). Mas como cenário geral, os casos que predominam são os crônicos, decorrentes de transmissão vetorial no passado. Uma vez que atualmente, o desenvolvimento sócio econômico e mudanças estruturais nos países, favorecem a melhoria das condições habitacionais, da urbanização e migração de populações rurais para o meio urbano, diminuindo o número de casos. Além das atividades de controle, como inseticidas em residências, que reduziram os vetores (COUTINHO; DIAS, 1999). A doença de Chagas é uma doença de notificação compulsória, e qualquer caso deve ser comunicado ao Programa Nacional de Controle da Doença de Chagas do Ministério da Saúde, para assim haver um controle das áreas de risco e de pessoas infectadas (TATTO et al., 2007). Esse trabalho é a primeira caracterização biológica e morfológica de cepas de T. cruzi, isoladas de Triatoma sherlocki na Bahia, mostrando a importância de estudos que, no 22 futuro auxiliarão no controle efetivo dos vetores e na possível erradicação da doença de Chagas. 2. Objetivos 2.1. Objetivo geral Realizar a caracterização biológica de duas cepas de T. cruzi isoladas de Triatoma sherlocki, denominadas Tsh1 e Tsh7. 2.2. Objetivos específicos - Avaliar o comportamento biológico de duas cepas de T. cruzi, comparando a cinética de crescimento em meio de cultura LIT (Liver Infusion Tryptose); - Realizar a curva parasitêmica das duas cepas de T. cruzi; - Realizar estudo morfológico de formas tripomastigotas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi por microscopia óptica 3. Metodologia 3.1. Cepas estudadas Foram estudadas duas cepas de T. cruzi isoladas de Triatoma sherlocki, provenientes de uma colônia coletada na cidade de Santo Inácio, distrito de Gentio do Ouro, Bahia, no 23 período de 14-18 de outubro de 2014. O isolamento das cepas de T. cruzi foi realizado por meio de compressão abdominal dos triatomíneos, onde as fezes obtidas foram diluídas em solução salina 0,9% e observadas em microscópico óptico, em busca de formas flageladas do parasito (RIBEIRO et al., 2014). As amostras positivas, que apresentaram formas de Trypanosomatidae, foram mantidas por meio de sucessivos repiques. As culturas foram mantidas no Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP/Araraquara, onde após o obter ótimo crescimento em meio LIT e livre de contaminantes, foi realizado o inóculo intraperitoneal das cepas (5x103 – padronizado para 0,3mL) em camundongos Swiss. Manteve-se a infecção a partir do sangue do animal previamente infectado, coletado por meio de punção cardíaca, e inoculado em outros camundongos com idade de 21 dias. Desse modo, as cepas estudadas foram mantidas “in vitro” em meio de cultura LIT Fonte: Eco Enigma Fonte: Andre Teco (a) Município de Santo Inácio – Bahia e (b) exemplar de Triatoma sherlocki. (a) (b) Figura 2 – Mapa do local onde o espécime foi encontrado e foto de Triatoma sherlocki. 24 e “in vivo” em camundongos Swiss. 3.2. Meio de cultura O meio de cultura utilizado foi o meio LIT, abreviação para Liver Infusion Tryptose, desenvolvido por Camargo (1964) e modificado por Martinez (2004) (Tabela 1). Tabela 1 – Fórmula meio de cultura LIT. Solução Quantidade NaCl 4,0g KCl 0,4g Na2HPO4 8,0g Glucose 2,0g Triptose 5,0g Caldo de infusão de fígado 5,0g Haemin (Sigma) 25,0mg Soro Fetal Bovino 100mL H20 MiliQ qsq. 1000,0mL Fonte: CAMARGO, 1964; MARTINEZ, 2004. Para o preparo em um erlenmeyer foi dissolvido o NaCl, KCl, Na2HPO4, Glucose, Triptose e caldo de infusão de fígado em água. Em um béquer pequeno, foi solubilizado o Haemin em 0,5mL de trietanolamina, acrescentou-se água e homogeneizou-se com um bastão de vidro e misturou-se à solução previamente preparada no erlenmeyer. Foi medido o pH com indicador Merck e, caso necessário, o pH foi ajustado para 7,2 com HCl. O meio foi filtrado em membrana 0,22µm, a este foi acrescentado assepticamente o soro fetal bovino previamente inativado em banho maria a 56°C/1 hora. O meio foi então distribuído em frascos estéreis e mantido na geladeira até o momento do uso. Para o uso deve ser mantido na temperatura de 28°C. 25 3.2.1. Manutenção em meio LIT Visto que os parasitos são isolados das fezes de triatomíneos, que é um local com muitas bactérias, o contato com um meio de cultura rico em nutrientes, pode favorecer contaminação com crescimento indesejado e ainda impedir o crescimento de T. cruzi. Portanto foi feito o isolamento e a limpeza correta do meio, para que não entrem em estado de declínio e estejam sempre em crescimento ótimo para uso em experimentos. Como cada cepa de T. cruzi apresenta uma cinética de crescimento diferenciada, o repique foi realizado de 20-30 dias, para evitar o declínio da cultura. Segundo Araújo (2000) e Ribeiro (2014), o inóculo inicial em meio LIT foi de 7,5x106 parasitos/mL em erlenmeyer contendo 50mL de meio. Nos quatro dias iniciais ocorreu à fase logarítmica da multiplicação ou crescimento celular, onde predominaram formas epimastigotas, com raras formas tripomastigotas de T. cruzi. Posteriormente, a cultura apresentou a fase estacionária, período em que a população de parasitos alcançou 1,5x108 parasitas/mL. As culturas foram mantidas de 26-28°C, sob essas circunstâncias não é necessária agitação durante o cultivo (ARAÚJO et al., 2000; RIBEIRO et al., 2014). 3.2.2. Manutenção em estufa B.O.D. Para esse tipo de manutenção foi utilizado o meio LIT, o qual foi aliquotado em tubos de vidro com tampa de rosca e estocado a 4°C até o momento do uso ou em garrafas de cultura contendo o meio de cultura. Para cada amostra estudada pelo menos seis tubos de cultura foram utilizados. Todo o processo foi realizado dentro de uma capela de fluxo 26 laminar ou sala asséptica com bico de Bunsen. Os tubos ou garrafas semeados foram transferidos para uma estufa incubadora B.O.D (Biochemical Oxygen Demand) a 28°C. 3.3. Manutenção das cepas “in vivo” Segundo Chagas (1909) e Dias e Filho (1943) existem diferenças no curso da infecção – cinética, intensidade, mortalidade – dependendo da espécie hospedeira utilizada e origem dos parasitas. Desde a década de 60, por influência do uso do camundongo em estudos de imunologia geral, facilidade e baixo custo de manutenção desses animais, os trabalhos com infecção experimental por T. cruzi se tornaram cada vez mais frequentes usando como modelo o camundongo (CHAGAS, 1909; DIAS; FILHO, 1943). Para esse modelo animal, tanto as formas tripomastigotas metacíclicas, como as sanguíneas, são infectantes, desencadeando a fase aguda. Estas ao atingirem a fase crônica, apresentam características histopatológicas similares da doença humana, assim como a infecção congênita, que já foi reproduzida e apresentou similaridade à congênita humana (ARAÚJO et al., 2000). As vias intraperitoneal e subcutânea são as mais utilizadas para inoculação de T. cruzi em camundongos jovens, a via conjuntival foi a menos explorada até hoje, já a via oral, apresentou algumas peculiaridades. Pela via oral só há infecção com o uso de tripomastigotas metacíclicas, com formas sanguíneas não houve resposta, além disso, a infecção ocorre somente pela mucosa gástrica, em qualquer outra mucosa do tubo digestivo não ocorre, porém esta via se demostra eficaz apenas em camundongos de até vinte dias de idade, enquanto a intraperitoneal promove infecção em qualquer faixa etária (ARAÚJO et al., 2000). 27 Demonstrou-se, segundo Araújo et al. (2000), que o hamster reproduz, do ponto de vista histopatológico, características importantes da doença de Chagas crônica, são elas: miocardite com despopulação neuronal acompanhada de transtornos eletrocardiográficos, miosite, ganglionite e dilatação ou alongamento do cecum com distúrbios de motilidade, por outro lado, a forma indeterminada se mostrou mais frequente em coelho (ARAÚJO et al., 2000). Ainda de acordo com Araújo et al. (2000), em Manual de Experimentação Animal, o modelo utilizado nesse trabalho é o Mus musculus, camundongo albino Swiss, macho, não isogênico. Estes são animais altamente sensíveis às diversas cepas do parasita e não apresentam diferença na resistência relacionada ao sexo. Este camundongo possui idade de acasalamento de 50-60 dias; período de gestação de 18-21 dias; filhotes por parto de 3-10; idade de desmame de 18-21 dias; peso ao nascimento de 1,5g; peso de desmame de 10g; peso ao acasalamento de 25g e peso aproximado para o inóculo, é de 22 a 24g (ARAÚJO et al., 2000). Uma das desvantagens encontradas com o uso de camundongos foi a alta taxa de mortalidade na fase aguda, com lesões que são incomuns na mesma fase humana aguda, mas pode ser contornada com uma combinação de linhagens mais resistentes e um menor inóculo (Araújo et al., 2000). Após inóculo inicial em camundongos Mus musculus, linhagem Swiss, com formas tripomastigotas isoladas do triatomíneo, coletou-se aproximadamente 5 µL de sangue da cauda do camundongo para o esfregaço sanguíneo. Este foi analisado em microscópio ótico, confirmando se havia presença de formas tripomastigotas no sangue periférico, que é a prova definitiva da infecção. No dia que a parasitemia máxima de T. cruzi foi encontrada nos camundongos infectados, os animais foram eutanasiados e sangria foi feita por punção 28 cardíaca, onde a seringa foi ambientada com heparina, evitando coagulação (ARAÚJO et al., 2000). Posteriormente colheu-se o sangue da cauda do animal, uma forma não invasiva, sem necessidade de anestesia ou preparo. Quando positivo, com a presença de formas circulantes, foi realizado o repique, por meio da punção cardíaca no camundongo previamente infectado. O repique foi feito a cada 40 dias, por meio de inóculo intraperitonial em camundongos de aproximadamente 21 dias de vida, pois segundo Chagas (1909), animais jovens apresentam maior susceptibilidade à infecção do que animais adultos (ARAÚJO et al., 2000). As condições ambientais estáveis do biotério estavam diretamente ligadas à reprodutibilidade e qualidade dos resultados obtidos nessa experimentação animal. Portando, o ambiente era calmo e sem barulho; isolado; com temperatura e umidade constantes (18 a 22°C e 45 a 55% respectivamente); ventilação de 10 a 15 vezes/hora; ciclo regular de luz (claro/escuro) de 12/12 horas; não haviam janelas na sala de experimentação - pois os camundongos têm hábitos noturnos, como alimentação e acasalamento e ficam em estado de sono, letargia e pouca atividade nos períodos de luz. Além disso, o biotério de experimentação possuía salas separadas por espécie hospedeira (ratos, camundongos, hamsters, etc) e por agente patogênico (T. cruzi, Leishmania, etc) (ARAÚJO et al., 2000). 3.4. Fixação, coloração e mensuração de formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi Segundo Rimoldi et al. (2012), para avaliação das características morfológicas de formas tripomastigotas circulantes de T. cruzi foram realizados esfregaços de sangue dos 29 animais inoculados. Em uma lâmina desengordurada foi aplicado 5µL de sangue do animal infectado, com o auxílio de outra lâmina esse sangue foi arrastado, até se espalhar de maneira perfeitamente uniforme por toda a extensão da mesma (RIMOLDI et al., 2012). Depois de seca, realizou-se a fixação química usando álcool metílico, de 2-3 gotas por dois minutos, seguido de coloração por método de Giemsa, segundo Rosenfeld (1974). Tabela 2 – Modo de preparo do corante Giemsa. Corante Giemsa segundo Rosenfeld Giemsa (pó) 0,97g May-Grunwald 0,53g Metanol P.A 1000mL Acondicionar em frasco âmbar. Validade: 5 anos. Fonte: ROSENFELD, 1974. O corante Giemsa pode apresentar-se muito concentrado, por esse motivo, três gotas foram diluídas em 2mL de água destilada autoclavada pH 7,2. A lâmina foi colocada em um suporte de coloração, e então cobriu-se toda a extensão com 1mL do corante Giemsa, que permaneceu por 10 minutos. Em seguida lavou-se com água corrente três vezes, o verso da lâmina foi limpo com uma gaze, permanecendo em posição vertical esperando a secagem completa. A observação no microscópio foi feita após 24 horas. Sua finalidade foi corar células em esfregaços de sangue periférico. Em casos de material ácido, houve predominância de tons azuis na coloração e em materiais básicos, tons vermelhos (LORENZI et al., 2003). A leitura da lâmina e a captura de imagens foram feita no microscópio Leica Leitz DMRXE acoplado a câmara filmadora Leica DC100 e as formas mensuradas no programa Motic Advanced 3.2 plus. 30 Levando-se em conta a qualidade das imagens e das organelas estudadas, foram capturadas 30 imagens provenientes do sangue do animal infectado, contendo formas tripomastigotas de T. cruzi. Os parâmetros morfológicos seguiram a pesquisa feita por Silva (1959) e Ferrioli et al. (1968), onde os parâmetros mensurados foram: comprimento total da célula (CT), largura total da célula (LT), distância anterior ao núcleo (DAN), distância posterior ao núcleo (DPN), área do cinetoplasto (AC), área do núcleo (AN) e índice nuclear (IN=DPN/DAN) (SILVA, 1959; FERRIOLI, 1968). Segundo Dias e Filho (1943), somente as medidas do comprimento total, não eram satisfatórias para caracterizar as formas tripomastigotas de diferentes cepas de T. cruzi. Utilizou-se então a relação DPN/DAN, que indica a posição do núcleo de cada tripanosoma relativo às extremidades da célula, não considerando o flagelo (DIAS; FILHO, 1943). Figura 3 - Diagrama de uma forma tripomastigota de T. cruzi. Fonte: DIAS; FREITAS, 1943. Onde PN = Extremidade posterior-meio do núcleo; NA= meio do núcleo-extremidade anterior; FL= flagelo livre; T= comprimento total. 31 Segundo Martins (2008), outra forma de classificação seria pela razão C/L, onde valores menores ou iguais a 7,06 µm definem formas pequenas; entre 7,06 µm e 8,12 µm, formas médias; e maiores ou iguais a 8,12 µm, formas grandes. Para definir formas tripomastigotas foram utilizados os parâmetros definidos por Araújo e Chiari (1988), como mostrado na tabela 3 abaixo: Tabela 3 - Parâmetros morfométricos para formas tripomastigotas de T. cruzi. Parâmetros Morfométricos - Valores (µm) Largura Fina Intermediária Larga 0,6 - 1,3 1,4 - 2,1 2,2 - 5,5 Comprimento Curto Intermediário Longo 13,5 - 19,5 19,6 - 24,8 24,9 - 43,8 Fonte: ARAÚJO;CHIARI, 1988. 3.5. Cinética de crescimento O estudo da dinâmica de crescimento das formas epimastigotas, das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi foi realizado inoculando-se 5x106 parasitos/mL em meio LIT, modificado de Chiari (1974). A concentração de parasitas e os volumes foram previamente ajustados, para atingir a concentração inicial desejada. Contagens foram realizadas em triplicata, durante 10 dias consecutivos em câmara de Neubauer, analisadas em microscópio óptico (RIMOLDI et al., 2012). Esse experimento foi realizado para definir a fase logarítimica de crescimento de cada cepa de T. cruzi, para assim saber o melhor dia para se realizar inóculo em animais laboratoriais e para extrair DNA genômico, no caso de estudos moleculares. 32 3.6. Curva parasitêmica A curva parasitêmica foi realizada de acordo com o método de Brener e Chiari (1963) com correção de intercampos, por meio da contagem de formas tripomastigotas presentes no sangue periférico de camundongos infectados até atingirem a forma crônica e a contagem zerar. O inóculo inicial de T. cruzi nos camundongo Swiss foi de 5x103 parasitos/mL, com 21 dias de idade e peso aproximado de 30 gramas, foram mantidos em condições controladas de alimentação, temperatura e luminosidade. Todos os experimentos com animais passaram pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEUA/FCF/CAr nº13/2012) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP/Araraquara. O camundongo infectado foi inserido na caixa de retenção, com a cauda para fora. Com uma das mãos massageou-se a cauda no sentido da base ponta, e com a outra mão, realizou-se a incisão de aproximadamente 1 mm da cauda. Depositou-se o material biológico em uma lâmina de vidro (26x76 mm) recobrindo-a com uma lamínula (dimensões 22x22 mm), de modo a se obter uma camada delgada de sangue, ocupando toda a superfície da lamínula. A fim de evitar que o sangue seque e as formas percam mobilidade, a lâmina foi examinada rapidamente em microscópio ótico com objetiva de 40x. Contou-se ao todo 100 campos microscópicos, sendo 20 campos nas 4 extremidades da lamínula e mais 20 na parte central. A coleta foi feita por 60 dias intercalados, em todos os animais do estudo. O cálculo foi realizado para a correção dos intercampos no aumento utilizado, que ao todo foram cerca de 1550 campos microscópicos. Logo, o valor encontrado de parasitos no exame de 100 campos foi multiplicado pelo fator 15,55, obtendo assim o número de formas contidos em 5 μL. Para avaliar o número de formas tripomastigotas do inóculo de 0,1mL, 33 basta multiplicar esse número por 20. 4. Resultados 4.1. Cinética de crescimento No ano de 1963, Brener e Chiari mostraram diferenças no comportamento em meio LIT de cepas isoladas de casos humanos e de T. infestans (BRENER; CHIARI, 1963). Em 1990, Barr analisando amostras isoladas de cão, gambá e tatu silvestre, também demonstrou diferenças na curva de crescimento (BARR, 1990). Mais recente, no ano de 2012, Rimoldi e colaboradores demostraram diferenças ao estudarem quatro cepas de T. cruzi. Duas cepas isoladas de Triatoma sordida, uma cepa de um gato e uma de um caso humano (RIMOLDI et al., 2012). Observou-se a cinética de crescimento das cepas Tsh1 e Tsh7. Os resultados da triplicata se mostraram similares, indicando variabilidade biológica entre as cepas durante a multiplicação em meio LIT (Tabela e Figura 4). 34 Tabela 4 - Média de crescimento das cepas de T. cruzi (x106) em meio LIT. Leitura Tsh1 Tsh7 1° dia 5,0 5,0 2° dia 7,5 8,6 3° dia 12,6 9,6 4° dia 16,9 20,4 5° dia 18,6 16,6 6° dia 25,3 26,2 7° dia 21,2 19,8 8° dia 19,5 24,2 9° dia 16,9 18,5 10° dia 13,8 17,4 Figura 4 - Perfil da cinética de crescimento das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi em meio de cultura LIT. 4.2.Curva parasitêmica A curva parasitêmica foi realizada por meio de valores obtidos na contagem de formas tripomastigotas presentes no sangue periférico de camundongos durante 60 dias. A curva parasitêmica e as características biológicas das cepas Tsh 1 e Tsh7, são apresentadas abaixo (Figuras 5 – 7 e Tabelas 5 e 6). 35 Figura 5 - Curva parasitêmica da cepa Tsh1 de T. cruzi. Onde C1; C2; C3; C4; C5 são exemplares de camundongos Swiss. Figura 6 - Curva parasitêmica da cepa Tsh7 de T. cruzi. Onde C1; C2; C3; C4; C5 são exemplares de camundongo Swiss. Nos camundongos C1 e C5 não foram observadas formas tripomastigotas sanguíneas. 36 Analisando a curva parasitêmica das cepas Tsh1 e Tsh7 temos a Figura 7. Figura 7 - Comparação das curvas parasitêmicas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. Onde C1; C2; C3; C4; C5 são exemplares de camundongo Swiss. Tabela 5 - Características biológicas da cepa Tsh1 de T. cruzi após infecção intraperitonial em camundongos. Animal (formas/0,3mL) Período Pré-patente (dias) Parasitemia máxima Fase Aguda (dias) Observações Inóculo 5x103 n°/mL dia C1 22 0,46x103 37° 14 Cronicidade C2 24 0,46x103 25° 27 Cronicidade C3 24 0,15 x103 25° 01 Cronicidade C4 20 0,77 x103 28° 31 Cronicidade C5 29 2,17 x103 43° 29 Cronicidade 37 Tabela 6 - Características biológicas da cepa Tsh7 de T. cruzi após infecção intraperitonial em camundongos. Animal (formas/0,3mL) Período Pré-patente (dias) Parasitemia máxima Fase Aguda (dias) Observações Inóculo 5x103 n°/mL dia C1 * * * * * C2 36 0,77 x103 37° 22 Cronicidade C3 15 2,02 x103 18° 14 Cronicidade C4 13 4,66 x103 23° 31 Cronicidade C5 * * * * * ∗ Não foram observadas formas tripomastigotas sanguíneas. 4.3. Mensuração de formas tripomastigotas de T. cruzi A observação das lâminas coradas por Giemsa para mensuração das formas tripomastigotas nas amostras Tsh1 e Tsh7 mostraram variabilidade de posição do cinetoplasto, comprimento total e largura da célula, área do cinetoplasto, área do núcleo, distância da extremidade anterior ao núcleo, extremidade posterior ao núcleo e índice nuclear. E permitiu obter imagens das formas intermediárias para largura total, com aspecto de C ou S itálicos conforme figuras 8 e 9 e de formas curtas para comprimento total. A mensuração de cada parâmetro foi feita em triplicata, encontrando uma média para cada uma, com um total de 30 formas tripomastigotas sanguíneas, empregando o analisador de imagem e baseando-se nos parâmetros descritos por Barreto (1965), conforme Tabelas 7 e 8 abaixo. 38 Tabela 7 - Parâmetros morfométricos da cepa Tsh1 de T. cruzi. Imagem Comprimento (µm) Largura (µm) Núcleo (µm2) Cinetoplasto (µm2) Índice Nuclear (µm) Média±DP Tsh1 - 1 9,73 ± 0,40 1,57 ± 0,25 2,07 ± 0,06 0,97 ± 0,06 1,16 ± 0,03 Tsh1 - 2 10,43 ± 0,12 1,50 ± 0,10 1,67 ± 0,06 1,00 ± 0,20 1,43 ± 0,03 Tsh1 - 3 11,17 ± 0,15 1,63 ± 0,12 1,67 ± 0,15 1,37 ± 0,15 0,94 ± - Tsh1 - 4 10,63 ± 0,06 1,20 ± 0,10 1,83 ± 0,21 0,60 ± 0,00 1,15 ± 0,01 Tsh1 - 5 12,03 ± 0,06 1,87 ± 0,06 1,57 ± 0,21 0,97 ± 0,12 0,97 ± 0,04 Tsh1 - 6 8,67 ± 0,15 1,23 ± 0,12 1,07 ± 0,15 0,93 ± 0,06 1,16 ± 0,04 Tsh1 - 7 13,33 ± 0,25 1,67 ± 0,12 2,10 ± 0,10 1,07 ± 0,06 1,07 ± 0,02 Tsh1 - 8 11,57 ± 0,12 1,43 ± 0,12 1,77 ± 0,15 1,30 ± 0,10 1,04 ± 0,02 Tsh1 - 9 11,50 ± 0,26 1,10 ± 0,10 1,37 ± 0,12 1,00 ± 0,10 0,99 ± 0,06 Tsh1 - 10 9,90 ± 0,20 1,53 ± 0,06 1,43 ± 0,12 1,13 ± 0,12 1,05 ± 0,07 Tsh1 - 11 10,13 ± 0,15 0,97 ± 0,06 1,47 ± 0,06 1,03 ± 0,06 1,40 ± 0,04 Tsh1 - 12 11,87 ± 0,15 1,50 ± 0,00 2,30 ± 0,26 1,37 ± 0,06 0,82 ± 0,01 Tsh1 - 13 12,93 ± 0,15 1,50 ± 0,00 1,93 ± 0,15 1,27 ± 0,06 0,78 ± 0,03 Tsh1 - 14 11,33 ± 0,15 1,53 ± 0,06 2,10 ± 0,10 0,93 ± 0,06 0,92 ± 0,03 Tsh1 - 15 9,07 ± 0,06 1,23 ± 0,06 1,17 ± 0,06 1,07 ± 0,06 0,86 ± 0,03 Tsh1 - 16 10,07 ± 0,15 1,97 ± 0,06 1,13 ± 0,06 0,83 ± 0,06 0,84 ± 0,02 Tsh1 - 17 11,03 ± 0,15 1,30 ± 0,00 1,40 ± 0,10 1,03 ± 0,06 0,82 ± 0,02 Tsh1 - 18 8,73 ± 0,15 1,43 ± 0,06 1,07 ± 0,06 0,90 ± 0,10 1,01 ± 0,01 Tsh1 - 19 10,00 ± 0,10 1,23 ± 0,06 1,43 ± 0,06 0,53 ± 0,12 1,15 ± 0,04 Tsh1 - 20 11,93 ± 0,06 1,33 ± 0,06 0,83 ± 0,06 0,83 ± 0,06 0,94 ± 0,04 Tsh1 - 21 11,43 ± 0,21 1,40 ± 0,10 1,23 ± 0,06 0,80 ± 0,00 0,86 ± 0,03 Tsh1 - 22 10,30 ± 0,17 1,27 ± 0,06 1,37 ± 0,15 0,83 ± 0,06 1,25 ± 0,04 Tsh1 - 23 10,90 ± 0,17 1,37 ± 0,06 1,80 ± 0,10 0,97 ± 0,12 0,90 ± 0,01 Tsh1 - 24 11,17 ± 0,15 1,37 ± 0,06 1,63 ± 0,12 1,10 ± 0,10 1,05 ± 0,03 Tsh1 - 25 11,17 ± 0,15 1,23 ± 0,06 2,10 ± 0,00 0,93 ± 0,06 0,80 ± 0,04 Tsh1 - 26 12,13 ± 0,06 1,37 ± 0,06 2,47 ± 0,21 0,83 ± 0,06 1,00 ± 0,02 Tsh1 - 27 10,00 ± 0,10 1,47 ± 0,06 1,40 ± 0,10 1,03 ± 0,06 1,04 ± 0,02 Tsh1 - 28 12,27 ± 0,12 1,53 ± 0,06 1,87 ± 0,06 1,07 ± 0,06 1,31 ± 0,06 Tsh1 - 29 11,73 ± 0,12 1,27 ± 0,06 1,33 ± 0,06 1,07 ± 0,06 1,19 ± 0,02 Tsh1 - 30 9,63 ± 0,06 1,43 ± 0,06 1,77 ± 0,06 0,93 ± 0,06 1,26 ± 0,01 39 Figura 8 - Fotomicrografias de formas tripomastigotas de cepa Tsh1 de T. cruzi (x100). Nas imagens (a)(c)(d)(g) foram observadas formas tripomastigotas em forma de C e nas imagens (b)(e)(f)(h)(i) foram observadas formas tripomastigotas em forma em S itálico. 40 Tabela 8 - Parâmetros morfométricos da cepa Tsh7 de T. cruzi. Imagem Comprimento (µm) Largura (µm) Núcleo (µm2) Cinetoplasto (µm2) Índice Nuclear (µm) Média±DP Tsh7 - 1 11,80 ± 0,17 1,77 ± 0,06 2,20 ± 0,17 1,13 ± 0,12 1,10 ± 0,01 Tsh7 - 2 9,83 ± 0,15 1,67 ± 0,06 1,87 ± 0,12 1,23 ± 0,06 0,75 ± 0,02 Tsh7 - 3 11,70 ± 0,10 1,73 ± 0,06 2,00 ± 0,10 1,30 ± 0,10 0,89 ± 0,00 Tsh7 - 4 12,67 ± 0,06 1,53 ± 0,12 1,60 ± 0,00 0,87 ± 0,12 1,02 ± 0,03 Tsh7 - 5 12,30 ± 0,00 1,97 ± 0,12 2,07 ± 0,12 0,87 ± 0,06 1,09 ± 0,01 Tsh7 - 6 11,57 ± 0,06 1,70 ± 0,10 2,23 ± 0,06 1,83 ± 0,15 1,04 ± 0,02 Tsh7 - 7 10,53 ± 0,15 1,57 ± 0,06 2,17 ± 0,06 1,03 ± 0,06 0,91 ± 0,03 Tsh7 - 8 10,40 ± 0,17 1,37 ± 0,06 2,37 ± 0,12 1,70 ± 0,10 0,99 ± 0,05 Tsh7 - 9 11,47 ± 0,31 1,17 ± 0,06 2,47 ± 0,12 1,40 ± 0,10 1,30 ± 0,06 Tsh7 - 10 11,00 ± 0,10 1,63 ± 0,06 2,40 ± 0,10 1,00 ± - 0,88 ± 0,02 Tsh7 - 11 8,17 ± 0,06 1,37 ± 0,06 2,03 ± 0,06 1,03 ± 0,06 0,92 ± 0,04 Tsh7 - 12 11,60 ± 0,10 1,63 ± 0,06 1,93 ± 0,06 0,97 ± 0,06 0,88 ± 0,03 Tsh7 - 13 12,13 ± 0,06 1,13 ± 0,06 1,63 ± 0,06 1,30 ± 0,10 0,93 ± 0,01 Tsh7 - 14 11,60 ± 0,10 1,83 ± 0,06 2,47 ± 0,12 1,07 ± 0,12 0,99 ± 0,01 Tsh7 - 15 12,77 ± 0,15 1,63 ± 0,06 2,17 ± 0,06 1,57 ± 0,12 0,92 ± 0,02 Tsh7 - 16 11,23 ± 0,15 1,33 ± 0,06 2,43 ± 0,06 1,50 ± 0,10 1,10 ± 0,01 Tsh7 - 17 12,73 ± 0,12 1,50 ± 0,10 2,10 ± 0,10 1,13 ± 0,06 0,91 ± 0,02 Tsh7 - 18 11,03 ± 0,06 1,77 ± 0,06 2,63 ± 0,06 1,30 ± 0,10 0,70 ± 0,01 Tsh7 - 19 14,60 ± 0,20 1,43 ± 0,06 2,23 ± 0,06 1,47 ± 0,15 1,25 ± 0,04 Tsh7 - 20 10,63 ± 0,12 1,07 ± 0,06 1,60 ± 0,10 1,40 ± 0,10 1,10 ± 0,04 Tsh7 - 21 12,57 ± 0,12 1,73 ± 0,06 2,90 ± 0,10 1,27 ± 0,12 1,05 ± 0,02 Tsh7 - 22 11,83 ± 0,06 1,33 ± 0,06 1,47 ± 0,06 1,33 ± 0,06 0,97 ± 0,02 Tsh7 - 23 12,00 ± 0,10 1,63 ± 0,12 2,07 ± 0,06 1,03 ± 0,06 0,79 ± 0,03 Tsh7 - 24 13,93 ± 0,06 1,50 ± - 1,67 ± 0,06 1,23 ± 0,06 1,06 ± 0,04 Tsh7 - 25 12,67 ± 0,06 1,53 ± 0,06 2,17 ± 0,12 0,90 ± - 1,15 ± 0,01 Tsh7 - 26 11,37 ± 0,12 1,33 ± 0,06 2,37 ± 0,12 1,80 ± 0,17 0,79 ± 0,01 Tsh7 - 27 10,77 ± 0,06 1,43 ± 0,06 3,17 ± 0,06 1,50 ± 0,10 1,08 ± 0,04 Tsh7 - 28 12,27 ± 0,15 1,43 ± 0,06 2,43 ± 0,06 0,83 ± 0,06 1,02 ± 0,08 Tsh7 - 29 14,00 ± 0,10 1,47 ± 0,15 2,53 ± 0,15 1,20 ± 0,10 0,70 ± 0,02 Tsh7 - 30 11,60 ± 0,10 1,67 ± 0,06 2,40 ± 0,10 1,47 ± 0,15 1,35 ± 0,05 41 Figura 9 - Fotomicrografias de formas tripomastigotas da cepa Tsh7 de T. cruzi (x100). Nas imagens (a)(b)(e)(f)(h) foram observadas formas tripomastigotas em forma de C e nas imagens (c)(d)(g)(i) foram observadas formas tripomastigotas em forma de S itálico. Tabela 9 – Resultados das mensurações de formas tripomastigotas da cepa Tsh1 de T. cruzi. Parâmetros morfométricos Valores (µm) Mínimo Máximo Média±DP Comprimento total 8,66 12,93 10,89±1,167 Largura total 0,96 1,96 1,41±0,208 Área núcleo* 0,83 2,41 1,61±0,397 Área cinetoplasto* 0,60 1,36 0,99±0,189 Índice Nuclear 0,77 1,30 1,03±0,176 *(µm2) 42 Tabela 10 –Resultados das mensurações de formas tripomastigotas da cepa Tsh7 de T. cruzi. Parâmetros morfométricos Valores (µm) Mínimo Máximo Média±DP Comprimento total 8,16 14,60 11,76±1,270 Largura total 1,06 1,96 1,52±0,211 Área núcleo* 1,60 3,16 2,19±0,383 Área cinetoplasto* 0,83 1,80 1,25±0,273 Índice Nuclear 0,69 1,29 0,98±0,161 *(µm2) Tabela 11 - Características morfométricas e biológicas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. Cepas de T. cruzi Médias (µm) Índice de Infecção (%) Período Pré-Patente (dias) C L IN Tsh1 10,89 1,41 1,03 100 20 Tsh7 11,79 1,52 0,98 60 13 Onde: C = comprimento total do corpo; L = largura; IN = índice nuclear. Figura 10 - Comparação dos parâmetros avaliados na mensuração de formas tripomastigotas de T. cruzi. 43 5. Discussão Segundo os estudos de cinética de crescimento realizados por Rimoldi et al. (2012), Silva e Nussenzweig (1953) e Almeida (2015) as cepas de T. cruzi apresentaram pico de crescimento entre o 6° e 8° dia (RIMOLDI et al., 2012; SILVA; NUSSENZWEIG, 1953; ALMEIDA, 2015). No estudo de Andrade et al. (1970) e Araújo et al. (2000), a cepa Y apresentou máxima parasitemia entre o 7° e 8° dia (ANDRADE et al., 1970). Os dados obtidos neste estudo vão de encontro aos resultados encontrados nos estudos citados acima, as cepas Tsh1 e Tsh7 apresentaram pico de crescimento no 6° dia, com 2,53x107 parasitos/mL e 2,62x107 parasitos/mL, respectivamente (Tabela 4). Os dados obtidos mostram paridade de crescimento entre as cepas isoladas de T. sherlocki, mas uma diferença quando comparada a outras cepas de T. cruzi. Por meio do perfil parasitêmico observou-se que as cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi isoladas de T. sherlocki em Santo Inácio apresentaram entre si diferenças no período pré- patente, pico parasitêmico e cronicidade. Além de apresentarem diferença no perfil da curva parasitêmica. Pode ser notado que, mesmo com a padronização do inóculo inicial (5x103), há uma variação da parasitemia nos animais estudados, tanto em relação ao número de tripomastigotas sanguíneos, quanto ao índice de infecção. Nesse estudo o período pré-patente, no geral, foi longo, não estando de acordo com outros estudos realizados previamente, como Ribeiro et al. (2014), que apresentou período pré-patente de 11 dias (RIBEIRO et al., 2014). O período descrito por Martins (2008) foi de 5 a 7 dias (MARTINS, 2008) concordando com Schlemper (1986) o qual descreveu como período curto (SCHLEMPER, 1986). As cepas Tsh1 e Tsh7 apresentaram, uma média de 44 período pré-patente de 23 e 22 dias, respectivamente. Já a duração da fase aguda não apresentou uma uniformidade, variando na cepa Tsh1 de 3 a 31 dias e na Tsh7 de 14 a 31 dias. A parasitemia máxima para a cepa Tsh1 foi atingida no 43° dia (2,17x103) e para a cepa Tsh7 no 23° dia (4,66x103) (Tabelas 5 e 6). O índice de infecção foi de 100% para a cepa Tsh1 e de 60% para a cepa Tsh7, já o grau de agressividade mostrou-se variável, entre os animais infectados, uma vez que alguns se mostraram mais debilitados que outros, porém o índice de letalidade nesse estudo foi nulo para ambas as cepas. Os camundongos foram eutanasiados após o término do estudo, e já se encontravam na fase crônica da doença, sem nenhuma forma circulante tripomastigotas. Segundo Miles et al. (1980), inóculos de cepas com baixa virulência, tendem a gerar cronicidade, sem mortalidade elevada, estando de acordo com esse trabalho e classificando as cepas Tsh1 e Tsh7 como pouco virulentas (MILES et al., 1980). A captura das imagens de formas tripomastigotas, permitiu avaliar os aspectos morfológicos das formas tripomastigotas sanguíneas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi. Nesse estudo os resultados se apresentaram semelhantes à de outras cepas de T. cruzi, como o flagelo livre relativamente curto – com forma de C ou S, núcleo central ou subterminal, cinetoplasto arredondado ou ovoide. As cepas Tsh1 e Tsh7 apresentaram formas curtas para o comprimento, de 10,89 µm e 11,79µm, respectivamente; e formas intermediárias para a largura, de 1,41 µm e 1,52µm, respectivamente (Tabelas 9 e 10). Estes resultados estão de acordo com a literatura, pois os tripomastigotas intermediários ou largos predominam a maioria dos estudos feitos por Brener e Chiari (1963); Andrade (1974) e Pinto (2000). Este estudo confirma a hipótese de Zeledon e Vieto (1958), o qual preconiza que quanto maior o índice nuclear maior a infectividade (ZELEDON; VIETO, 1958). Pois a 45 cepa Tsh1 apresentou índice nuclear de 1,03 e 100% de infectividade, enquanto a Tsh7 com índice nuclear de 0,98 apresentou 60% de infectividade (Tabela 11). Segundo o trabalho de Andrade et al. (1970), há uma predominância inicial de formas delgadas, gerando uma fase aguda mais curta, logo as formas mais largas permanecem mais tempo na corrente (ANDRADE et al., 1970). Nesse estudo a cepa Tsh7 apresentou uma largura superior, assim como uma fase aguda mais longa até atingir a cronicidade, suportando essa teoria. Diante dos dados apresentados, pode-se concluir que as cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi apresentam baixa virulência e parasitemia, quando comparadas com outras cepas do parasito, como a cepa Y. Para complementar os resultados, estudos moleculares estão em desenvolvimento no Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de Araraquara. No entanto, diante da heterogeneidade das populações de T. cruzi, os dados obtidos contribuem para ampliar os conhecimentos sobre o agente etiológico da doença de Chagas, nosologia até hoje negligenciada. Deste modo, sua continuidade se faz necessária para entendermos o perfil, das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi, colaborando para o entendimento da relação parasito-hospedeiro. 46 6. Conclusão  A cinética de crescimento demonstrou que ambas as cepas possuem perfil de crescimento semelhante em meio de cultura LIT, atingindo a fase exponencial no 6° dia.  A curva parasitêmica mostrou maior patogenicidade da cepa Tsh1, que apresentou 100% de infectividade, enquanto que a cepa Tsh7 apresentou 60% de infectividade, o que pode ser confirmado pelo valor do índice nuclear maior para Tsh1.  A cepa Tsh1 apresentou maior período pré-patente, menor fase aguda, parasitemia máxima menor em número de parasitos no sangue, quando comparada a Tsh7.  As formas tripomastigotas das cepas Tsh1 e Tsh7 de T. cruzi apresentaram comprimento curto, largura intermediária e índice nuclear baixo, quando comparadas à outras cepas de T. cruzi já caracterizadas. 47 7. Bibliografia ABALOS J.W.; WYGODZINSKY P. Las Triatominae Argentinas (Reduviidae, Hemiptera). Publicação Instituto Médico Regional, monografia 2, 179pp. Acot P (1990) História da Ecologia. Rio de Janeiro: Campus. 212pp, 1951. ALMEIDA, L.A. Estudo biológico, morfológico e molecular de duas cepas de Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) isoladas de exemplares de Triatoma sordida e Triatoma rubrovaria (Hemiptera, Reduviidae). Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Farmácia Bioquímica) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, 2015. ANDRADE, S. G.; CARVALHO, M.L.; FIGUEIRA, R.M. et al. Caracterização morfo- biológica e histopatológica de diferentes cepas do Trypanosoma cruzi. Gazeta Médica da Bahia, v. 70, n. 1, p. 32-42, 1970. ANDRADE, S. G. Caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas do Recôncavo Baiano: contribuição ao estudo da patologia geral de doença de Chagas em nosso meio. Revista Patologia Tropical, v. 3, p.65-121, 1974. ANDRADE, Z. A. Patologia da Doença de Chagas. In: BRENER, Z.; ANDRADE, Z. A.; BARRAL-NETTO, 2000. M. Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Rio de Janeiro, v. 2, p. 177, 2000. 48 ARAUJO, T.C.; CASTRO, J.; CASTRO, S.L. Doença de Chagas. Manual para experimentação animal. Fiocruz, Instituto Oswaldo Cruz, 2000. ARAÚJO, S. M.; CHIARI, E. Caracterização biológica de clones de cepas Y, CL e MR de Trypanosoma cruzi em camundongos C3H isogênicos. Memória Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 83, p. 175-181, 1988. BARR, S. C.; DENNIS, V. A.; KLEI, T. R. Growth characterestic in axenic and cell cultures, protein profiles, and zymodeme typing of three Trypanosoma cruzi isolates from Louisiana mammals. The Journal of Parasitology, v. 76, p. 631-638, 1990. BARRETO, M. P. Tripanossomos semelhantes ao Trypanosoma cruzi em animais silvestres e sua identificação com o agente etiológico da doença de Chagas. Revista do Instituto de Medicina Tropical, São Paulo, v.7, n. 5, p. 305 - 315, 1965. BRENER, Z.; CHIARI, E. Variações morfológicas observadas em diferentes amostras de Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical, São Paulo v. 5, p. 220- 224, 1963. BRENER, Z. Comparative studies of Trypanosoma cruzi. Annals of Tropical Medicine & Parasitology, Liverpool, v.59, n.1, p. 19-25, 1965. 49 BRENER, Z. et al. Observations on Trypanosoma cruzi strains maintained over an 8-year period in experimentally inoculated mice. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 16, n. 1, p. 39-46, 1974. BUSVINE J.R.; BARNES S. Observations on mortality among insects exposed to dry insecticidal fims. Bulletin of Entomological Research, Res 38: p. 80-81, 1947. CHAGAS, C. Nova tripanossomíase humana. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 1, p. 159-218, 1909. CAMARGO, E. P. Growth and differention in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes in liquid media. Instituto de Medicina Tropical, v. 4, p. 93-100, 1964. COSTA, J.; ARGOLO, A.; FELIX, M. Redescription of Triatoma melanica Neiva & Lent, 1941, new status (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Zootaxa. v. 1385, p. 47-58, 2006. COURA J.R.; ABREU L.L.; WILLCOX H.P.F.; PETANA W. Estudo comparativo controlado com emprego de benzonidazole, nifurtimox e placebo, na forma crônica da doença de Chagas, em uma área de campo com transmissão interrompida. I. Avaliação preliminar. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, p. 139 – 144, 1997. 50 COURA, J. R.; DIAS, J. C. P. Epidemiology, control and surveillance of Chagas disease - 100 years after its discovery. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.104, p.31 - 40, 2009. COURA, J. R.; VIÑAS, P. A. Chagas disease: a new worldwide challenge. Nature, v. 465, p. S6 - S7. 2010. COUTINHO M.; DIAS J.C.P. A descoberta da doença de Chagas. Caderno de Ciência, v.16, p. 11-51, 1999. DIAS, J. C. P. The Treatment of Chagas Disease (South American Trypanosomiasis). Annals of Internal Medicine, v.144, n. 10, p. 772-774, 2006. DIAS, E.; FREITAS FILHO, L. Introdução ao estudo biométrico dos hemoflagelados do gênero Schizotrypanum. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 38, n. 3, 1943. DIAS E.; PELLEGRINO J. Alguns ensaios com o “Gamexanne” no combate aos transmissores da doença de Chagas. Brazil Medico, v. 62, p. 185-190, 1948. FERREIRA R.A.; LAZZARI C.R.; LORENZO M.G.; PEREIRA M.H. Do haematophagous bugs assess skin surface temperature to detect blood vessels. PLoS ONE v. 2, p. 923, 2007. 51 FERRIOLLI FILHO, F.; BARRETO, M.P.; CARVALHEIRO, J.R. Estudos sobre reservatórios e vectores silvestres do Trypanosoma cruzi XXIV. Variação dos dados biométricos obtidos em amostras do T. cruzi isoladas de casos humanos de Doença de Chagas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.2, p.1-8, 1968. GALVÃO, C. A sistemática dos Triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae), de De Geer ao DNA. Entomologia y Vectores, v.10, p.511-530, 2003. GALVÃO, C. Vetores da doença de chagas no Brasil. 20º edição, Curitiba. Sociedade Brasileira de Zoologia, 2014. HAMILTON, P. B.; TEIXEIRA, M. M. G.; STEVENS, J. R. The evolution of Trypanosoma cruzi: the ‘bat seeding’ hypothesis. Trends in Parasitology, v.28, p.136 - 141, 2012. IANOWSKI J.P.; MANRIQUE G.; NÚÑEZ J.A.; LAZZARI C.R. Feeding is not necessary for triggering plasticization of the abdominal cuticle in haematophagous bugs. Journal of Insect Physiology, v. 44, p.379-384, 1998. LEHANE M.J.; SCHOFIELD C.J. Field experiments of dispersive flight by Triatoma infestans. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 75, p. 399-400, 1981. 52 LEHANE M.J. The biology of blood-sucking in insects. New York, Cambridge University Press, 2005. LENT H.; WYGODZINSKY P. Revision of Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) and their significance as vectors of Chagas disease. Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 163, p. 123-529, 1979. LEY V.; ANDREWS N.W.; ROBBINS E.S.; NUSSENZWEIG V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. The Journal of Experimental Medicine, v. 168, p. 649- 659, 1988. LORENZI T.F.; D’AMICO E.; DANIEL M.M., SILVEIRA P.A.A.; BUCCHERI V. Manual de Hematologia - Propedêutica e Clínica, v.3, 2003. MADDRELL S.H. Nervous control of the mechanical properties of the abdominal wall at feeding in Rhodnius. Journal of Experimental Biolology, v. 44, p. 59-68, 1966. MANDACARU, S. C. Análise de proteínas nucleares reguladas na amastigogênese e de complexos proteicos de Trypanosoma cruzi. Dissertação de mestrado (Pós – Graduação em Biologia Molecular) - Universidade de Brasília, Brasília, 2013. MARTINEZ, I. Caracterização de duas cepas de Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909 (KINETOPLASTIDAE) isoladas de exemplares de Triatoma rubrovaria (BLANCHARD, 1843) (HEMIPTERA, REDUVIIDAE) coletadas em ambiente silvestre. 2004. 85f. Tese de 53 Doutorado em Análises Clínicas. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2004. MARTINS, L. P. A. et al. Rural Triatoma rubrovaria from Southern Brazil Harbors Trypanosoma cruzi of Lineage IIc. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 79, n.3, p. 427 - 434, 2008. MENDONÇA, V.J.; SILVA, M. T. A.; ARAÚJO, R.F.; JÚNIOR, MARTINS, J.; BACCI, M.; ALMEIDA, C. E.; COSTA, J.; GRAMINHA, M. A. S.; CICARELLI, R. M. B.; ROSA, J. A. Phylogeny of Triatoma sherlocki (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) Inferred from Two Mitochondrial Genes Suggests Its Location Within the Triatoma brasiliensis Complex. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene, p. 858– 864, 2009. MILES, M. A.; LANHAN, S. M.; DE SOUZA, A. A.; POVOA, D. G. Further enzymic characters of Trypanosoma cruzi and their evaluation for strain identification. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.74, p.221 - 242, 1980. NEIVA A.; LENT H. Notas e comentários sobre triatomideos. Lista de espécies e sua distribuição geographica. Annual Review of Entomology, v. 6, p. 153-190, 1936. NETO, S.R. Estudo epidemiológico da Doença de Chagas em dadores de sangue. Dissertação de Mestrado - Universidade de Aveiro, Portugal, 2009. 54 ORCHARD I.; LANGE A.B.; BARRETT F.M. Serotonergic supply to the epidermis of Rhodnius prolixus - Evidence for serotonin as the plasticizing factor. Journal of Insect Physiology, v.34, p. 873-879, 1988. PAPA A. R.; JURBERG J.; CARCAVALLO R. U.; CERQUEIRA R. L.; BARATA J. M. S. Triatoma sherlocki sp. n. coletada na Bahia, Brasil (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae). Entomologia y Vectores, v. 9, p. 133–146, 2002. FLORES, M.A.B. Parasitologia Médica, 2014, 4º edição, México, Editora Mc Graw Hill, p. 452. PEREIRA M.H.; SOUZA M.E.; VARGAS A.P.; MARTINS M.S., PENIDO C.M.; DIOTAIUTI L. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica, v. 61, p. 255-261, 1996. PINTO, C. Tripanosomiasis Cruzi (Doença de Carlos Chagas) no Rio Grande do Sul, Brasil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.37, n.4, p.443-537, 1942. PINTO, P.L.S. Circulação e caracterização de Trypanosoma cruzi isolados de mamíferos silvestres capturados no Estado de São Paulo – Brasil. 2000. 139 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, 2000. 55 Ministério da Saúde. Portal da Saúde. Disponível em: . Acesso em: Acesso em: 20 de abril de 2017. RASSI, A.; FERREIRA, H. O. Tentativas de tratamento específico da fase aguda da doença de Chagas com Nitrofuranos em esquemas de duração prolongada. Revista Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.5, p.23-262, 1971. REISENMAN C.E.; LAZZARI C.R.; GIURFA M. Circadian control of photonegative sensitivity in the haematophagous bug Triatoma infestans. Journal of Comparative Physiology, v. 183, p. 533-541, 1998. REZENDE J.M.; RASSI A. Por que os triatomíneos são chamados de “barbeiros”? Revista de Patologia Tropical, v. 37, p. 75-83, 2008. RIBEIRO, R. A.; MENDONÇA, V. J.; ALVES, R. T.; MARTINEZ, I.; ARAÚJO. R. F.; MELLO, F.; ROSA, J. A. Trypanosoma cruzi strains from triatomine collected in Bahia and Rio Grande do Sul, Brazil. Revista de Saúde Pública, v. 48, p. 295-302, 2014. RIBEIRO, L. P.; ROCHA, M. O. C. Forma indeterminada da doença de Chagas: considerações acerca do diagnóstico e do prognóstico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 31, n. 3, p. 301-314, 1998. http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/secretarias/svs/doenca-de-chagas http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/o-ministerio/principal/secretarias/svs/doenca-de-chagas 56 RIMOLDI, A.; TOMÉ, A. R.; AMBRÓSIO, D. L.; FERNANDEZ, M. Z. T.; MARTINEZ, I.; DE ARAÚJO, R. F.; CICARELLI, R. M. B.; ROSA, J. A. Morphological, biological and molecular characterization of three strains of Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) isolated from Triatoma sordida (Stal) 1859 (Hemiptera, Reduviidae) and a domestic cat. Parasitology, v.139, p. 37 - 44, 2012. ROSENFELD, G. Corante pancrômico para hematologia e citologia clínica. Nova combinação dos componentes do May-Grunwald e do Giemsa num só corante de emprego rápido. Memórias do Instituto Butantan, v. 20, p. 329-334, 1974. SCHLEMPER JR., B. R. et al. Tripomastigota muito largo como padrão morfológico de cepas de Trypanosoma cruzi do extremo sul do Brasil? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 81, n. 2, p. 191-198, 1986. SCHMUNIS, G. A.; YADON, Z. E. Chagas disease: A Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica, v.115, p.14 – 21, 2010. SILVA, L. H. P. da; NUSSEINZWEIG, V. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o camundongo branco. Folia Clínica et Biológica, v. 20, n. 3, p. 191-208, 1953. SILVA, L. H. P. da. Observações sobre o ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical, v. 1, p. 99-118, 1959. 57 SILVA, L.H.P. da; NUSSENZWEIG, V. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o camundongo branco. Folia Clínica et Biológica, v.20, n.3, p. 191 - 208, 1953. SILVEIRA, C. A. Situação do controle da transmissão vetorial da doença de Chagas nas Américas. Caderno de Saúde Pública, v.16, p. 35-42, 2000. STEVENS, J. R.; NOYES, H. A.; SCHOFIELD, C. J.; GIBSON, W. The molecular evolution of Tryoanosomatidae. Advances in Parasitology, v. 48, p. 1-56, 2001. TATTO E.; PADILHA E.M.; FERNANDES S.B. Doença de Chagas Aguda. Aspectos epidemiológicos, diagnóstico e tratamento – Guia de consulta rápida para profissionais de saúde. Revista de Patologia Tropical, v. 36, p. 1-32, 2007. TYLER, K. M.; ENGMAN, D. M. The life cycle of Trypanosoma cruzi revisited. International Journal Parasitology, v.1, p. 472-481, 2001. World Health Organization. Chagas disease (American trypanosomiasis). Disponível em: . Acesso em: 20 de abril de 2017. ZELEDÓN, R.; VIETO, P.L. Comparative studies of Schizotrypanum cruzi Chagas, 1909 and S. verpertilionis Battaglia, 1904 from Costa Rica, Journal of Parasitology, v.44, p. 499 - 502, 1958. http://www.who.int/chagas/en/ 58 ZINGALES, B.; SOUTO, R. P.; MANGIA, R. H.; LISBOA C. V.; CAMPBELL, D. A.; COURA, J. R.; JANSEN, A.; FERNANDES, O. Molecular epidemiology of American trypanosomiasis in Brazil based dimorphisms of rRNA and miniexon gene sequences. International Journal for Parasitology, v.28, p.105 - 112, 1998. ZINGALEZ, B.; MILES, M. A.; CAMPBELL, D. A.; TIBAYRENC, M.; MACEDO, A. M.; TEIXEIRA, M. M. G.; SCHIJMAN, A. G.; LLEWELLYN, M. S.; LAGES-SILVA, E.; MACHADO, C. R.; ANDRADE, S. G.; STURM, N. R. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological, relevance and research applications. Infection, Genetics and Evolution, v.12, p.240 - 253, 2012. 59 8. Anexos ANEXO 1. Dados brutos dos parâmetros morfométricos da cepa Tsh1 de T. cruzi (valores em µm). IMAGEM CT LT AN* AC* DPN DAN IC Tsh1 -1 9,80 1,30 2,10 1,00 5,10 4,50 1,13 9,30 1,80 2,10 0,90 5,10 4,40 1,16 10,10 1,60 2,00 1,00 5,10 4,30 1,19 9,73 1,57 2,07 0,97 5,10 4,40 1,16 Tsh1 -2 10,50 1,50 1,70 1,00 5,90 4,10 1,44 10,50 1,40 1,70 1,20 6,10 4,20 1,45 10,30 1,60 1,60 0,80 6,00 4,30 1,40 10,43 1,50 1,67 1,00 6,00 4,20 1,43 Tsh1 -3 11,00 1,70 1,50 1,40 5,00 5,30 0,94 11,30 1,50 1,80 1,50 5,20 5,50 0,95 11,20 1,70 1,70 1,20 5,00 5,30 0,94 11,17 1,63 1,67 1,37 5,07 5,37 0,94 Tsh1 -4 10,60 1,10 1,90 0,60 5,50 4,80 1,15 10,70 1,30 1,60 0,60 5,70 5,00 1,14 10,60 1,20 2,00 0,60 5,90 5,10 1,16 10,63 1,20 1,83 0,60 5,70 4,97 1,15 Tsh1 -5 12,10 1,80 1,80 0,90 6,00 6,10 0,98 12,00 1,90 1,40 1,10 5,70 6,20 0,92 12,00 1,90 1,50 0,90 5,90 5,90 1,00 12,03 1,87 1,57 0,97 5,87 6,07 0,97 Tsh1 -6 8,80 1,30 0,90 0,90 4,90 4,10 1,20 8,70 1,30 1,20 0,90 5,00 4,50 1,11 8,50 1,10 1,10 1,00 5,10 4,40 1,16 8,67 1,23 1,07 0,93 5,00 4,33 1,16 Tsh1 -7 13,30 1,60 2,20 1,10 6,90 6,40 1,08 13,60 1,80 2,10 1,00 6,90 6,40 1,08 13,10 1,60 2,00 1,10 6,80 6,50 1,05 13,33 1,67 2,10 1,07 6,87 6,43 1,07 Tsh1 -8 11,70 1,50 1,90 1,40 5,90 5,60 1,05 11,50 1,30 1,60 1,30 5,80 5,70 1,02 11,50 1,50 1,80 1,20 5,90 5,70 1,04 11,57 1,43 1,77 1,30 5,87 5,67 1,04 Tsh1 -9 11,70 1,10 1,30 1,10 5,60 6,00 0,93 60 11,60 1,20 1,30 0,90 5,60 5,70 0,98 11,20 1,00 1,50 1,00 6,00 5,70 1,05 11,50 1,10 1,37 1,00 5,73 5,80 0,99 Tsh1 -10 10,10 1,50 1,50 1,00 5,00 5,00 1,00 9,70 1,50 1,50 1,20 5,00 4,90 1,02 9,90 1,60 1,30 1,20 5,30 4,70 1,13 9,90 1,53 1,43 1,13 5,10 4,87 1,05 Tsh1 -11 10,00 0,90 1,50 1,10 5,60 4,10 1,37 10,30 1,00 1,50 1,00 6,00 4,30 1,40 10,10 1,00 1,40 1,00 5,90 4,10 1,44 10,13 0,97 1,47 1,03 5,83 4,17 1,40 Tsh1 -12 11,90 1,50 2,00 1,40 5,10 6,20 0,82 11,70 1,50 2,40 1,40 5,10 6,30 0,81 12,00 1,50 2,50 1,30 5,00 6,00 0,83 11,87 1,50 2,30 1,37 5,07 6,17 0,82 Tsh1 -13 13,10 1,50 1,90 1,20 5,70 7,20 0,79 12,90 1,50 2,10 1,30 5,60 7,00 0,80 12,80 1,50 1,80 1,30 5,50 7,40 0,74 12,93 1,50 1,93 1,27 5,60 7,20 0,78 Tsh1 -14 11,20 1,50 2,10 0,90 5,80 6,30 0,92 11,30 1,60 2,00 1,00 5,80 6,10 0,95 11,50 1,50 2,20 0,90 5,70 6,40 0,89 11,33 1,53 2,10 0,93 5,77 6,27 0,92 Tsh1 -15 9,10 1,30 1,20 1,10 4,30 4,90 0,88 9,10 1,20 1,10 1,10 4,10 4,70 0,87 9,00 1,20 1,20 1,00 4,00 4,90 0,82 9,07 1,23 1,17 1,07 4,13 4,83 0,86 Tsh1 -16 10,20 2,00 1,10 0,80 4,40 5,30 0,83 10,10 1,90 1,20 0,90 4,50 5,20 0,87 9,90 2,00 1,10 0,80 4,50 5,40 0,83 10,07 1,97 1,13 0,83 4,47 5,30 0,84 Tsh1 -17 11,00 1,30 1,50 1,10 5,00 5,90 0,85 10,90 1,30 1,40 1,00 4,90 6,00 0,82 11,20 1,30 1,30 1,00 4,80 6,00 0,80 11,03 1,30 1,40 1,03 4,90 5,97 0,82 Tsh1 -18 8,70 1,50 1,00 0,80 4,50 4,50 1,00 8,90 1,40 1,10 1,00 4,40 4,40 1,00 8,60 1,40 1,10 0,90 4,40 4,30 1,02 8,73 1,43 1,07 0,90 4,43 4,40 1,01 Tsh1 -19 10,00 1,20 1,40 0,60 5,20 4,40 1,18 9,90 1,30 1,40 0,40 5,00 4,50 1,11 10,10 1,20 1,50 0,60 5,40 4,70 1,15 61 10,00 1,23 1,43 0,53 5,20 4,53 1,15 Tsh1 -20 11,90 1,40 0,90 0,80 5,70 6,30 0,90 11,90 1,30 0,80 0,80 5,70 6,20 0,92 12,00 1,30 0,80 0,90 6,00 6,10 0,98 11,93 1,33 0,83 0,83 5,80 6,20 0,94 Tsh1 -21 11,50 1,50 1,30 0,80 5,50 6,20 0,89 11,60 1,30 1,20 0,80 5,20 5,90 0,88 11,20 1,40 1,20 0,80 5,20 6,30 0,83 11,43 1,40 1,23 0,80 5,30 6,13 0,86 Tsh1 -22 10,10 1,30 1,40 0,80 6,00 5,00 1,20 10,40 1,30 1,20 0,80 6,10 4,80 1,27 10,40 1,20 1,50 0,90 6,00 4,70 1,28 10,30 1,27 1,37 0,83 6,03 4,83 1,25 Tsh1 -23 10,80 1,30 1,80 0,90 5,00 5,50 0,91 11,10 1,40 1,70 1,10 5,10 5,70 0,89 10,80 1,40 1,90 0,90 5,10 5,60 0,91 10,90 1,37 1,80 0,97 5,07 5,60 0,90 Tsh1 -24 11,20 1,40 1,70 1,20 6,00 5,90 1,02 11,00 1,30 1,70 1,10 6,20 5,90 1,05 11,30 1,40 1,50 1,00 5,90 5,50 1,07 11,17 1,37 1,63 1,10 6,03 5,77 1,05 Tsh1 -25 11,20 1,20 2,10 0,90 5,10 6,10 0,84 11,30 1,20 2,10 1,00 5,00 6,20 0,81 11,00 1,30 2,10 0,90 4,90 6,40 0,77 11,17 1,23 2,10 0,93 5,00 6,23 0,80 Tsh1 -26 12,10 1,40 2,30 0,80 6,00 6,00 1,00 12,20 1,30 2,40 0,90 6,30 6,20 1,02 12,10 1,40 2,70 0,80 6,00 6,10 0,98 12,13 1,37 2,47 0,83 6,10 6,10 1,00 Tsh1 -27 9,90 1,50 1,40 1,00 5,30 5,00 1,06 10,00 1,40 1,30 1,00 5,30 5,10 1,04 10,10 1,50 1,50 1,10 5,30 5,20 1,02 10,00 1,47 1,40 1,03 5,30 5,10 1,04 Tsh1 -28 12,20 1,50 1,90 1,00 7,40 5,40 1,37 12,20 1,50 1,90 1,10 7,20 5,70 1,26 12,40 1,60 1,80 1,10 7,20 5,60 1,29 12,27 1,53 1,87 1,07 7,27 5,57 1,31 Tsh1 -29 11,80 1,30 1,30 1,00 5,90 4,90 1,20 11,80 1,20 1,30 1,10 5,90 5,00 1,18 11,60 1,30 1,40 1,10 6,00 5,10 1,18 11,73 1,27 1,33 1,07 5,93 5,00 1,19 62 Tsh1 -30 9,60 1,40 1,80 0,90 5,10 4,00 1,28 9,70 1,40 1,70 0,90 5,20 4,10 1,27 9,60 1,50 1,80 1,00 5,00 4,00 1,25 9,63 1,43 1,77 0,93 5,10 4,03 1,26 * (µm2) Onde: CT: Comprimento total da célula; LT: Largura total da célula; AC: Área do cinetoplasto; AN: Área do núcleo; DNA: Distância anterior ao núcleo; DNP: Distância posterior ao núcleo; IN: Índice nuclear (IN=DPN/DAN). Os valores em negrito representam as medias dos resultados. 63 ANEXO 2. Dados brutos dos parâmetros morfométricos da cepa Tsh7 de T. cruzi (valores em µm). IMAGEM CT LT AN* AC* DPN DAN IC Tsh7 - 1 11,70 1,80 2,30 1,00 6,00 5,50 1,09 12,00 1,80 2,30 1,20 6,00 5,50 1,09 11,70 1,70 2,00 1,20 6,00 5,40 1,11 11,80 1,77 2,20 1,13 6,00 5,47 1,10 Tsh7 - 2 10,00 1,70 1,80 1,20 4,30 5,60 0,77 9,80 1,60 1,80 1,20 4,00 5,40 0,74 9,70 1,70 2,000 1,30 4,00 5,50 0,73 9,83 1,67 1,87 1,23 4,10 5,50 0,75 Tsh7 - 3 11,70 1,70 2,00 1,20 5,40 6,10 0,89 11,80 1,80 2,10 1,30 5,40 6,10 0,89 11,60 1,70 1,90 1,40 5,60 6,30 0,89 11,70 1,73 2,00 1,30 5,47 6,17 0,89 Tsh7 - 4 12,60 1,60 1,60 0,80 6,20 6,10 1,02 12,70 1,60 1,60 0,80 6,20 6,20 1,00 12,70 1,40 1,60 1,00 6,30 6,00 1,05 12,67 1,53 1,60 0,87 6,23 6,10 1,02 Tsh7 - 5 12,30 1,90 2,00 0,80 6,10 5,60 1,09 12,30 1,90 2,20 0,90 6,30 5,80 1,09 12,30 2,10 2,00 0,90 6,20 5,60 1,11 12,30 1,97 2,07 0,87 6,20 5,67 1,09 Tsh7 - 6 11,50 1,80 2,20 2,00 5,70 5,50 1,04 11,60 1,70 2,30 1,80 5,80 5,70 1,02 11,60 1,60 2,20 1,70 5,80 5,50 1,05 11,57 1,70 2,23 1,83 5,77 5,57 1,04 Tsh7 - 7 10,50 1,60 2,20 1,00 5,30 5,70 0,93 10,40 1,50 2,10 1,00 5,20 5,60 0,93 10,70 1,60 2,20 1,10 5,10 5,80 0,88 10,53 1,57 2,17 1,03 5,20 5,70 0,91 Tsh7 - 8 10,30 1,30 2,30 1,70 5,30 5,40 0,98 10,30 1,40 2,30 1,60 5,10 5,40 0,94 10,60 1,40 2,50 1,80 5,30 5,10 1,04 10,40 1,37 2,37 1,70 5,23 5,30 0,99 Tsh7 - 9 11,20 1,1 2,4 1,3 5,8 4,3 1,35 11,80 1,2 2,4 1,4 5,4 4,1 1,32 11,40 1,2 2,6 1,5 5,4 4,4 1,23 11,47 1,17 2,47 1,40 5,53 4,27 1,30 64 Tsh7 - 10 11,00 1,60 2,40 1,00 5,30 6,00 0,88 10,90 1,60 2,50 1,00 5,40 6,00 0,90 11,10 1,70 2,30 1,00 5,30 6,20 0,85 11,00 1,63 2,40 1,00 5,33 6,07 0,88 Tsh7 - 11 8,20 1,40 2,00 1,00 4,40 4,60 0,96 8,20 1,30 2,10 1,00 4,20 4,80 0,88 8,10 1,40 2,00 1,10 4,30 4,60 0,93 8,17 1,37 2,03 1,03 4,30 4,67 0,92 Tsh7 - 12 11,60 1,60 1,90 1,00 6,00 6,60 0,91 11,50 1,60 1,90 0,90 5,90 6,90 0,86 11,70 1,70 2,00 1,00 5,90 6,70 0,88 11,60 1,63 1,93 0,97 5,93 6,73 0,88 Tsh7 - 13 12,10 1,10 1,60 1,20 5,40 5,90 0,92 12,20 1,20 1,60 1,30 5,60 6,00 0,93 12,10 1,10 1,70 1,40 5,70 6,10 0,93 12,13 1,13 1,63 1,30 5,57 6,00 0,93 Tsh7 - 14 11,60 1,90 2,40 1,00 5,80 5,90 0,98 11,50 1,80 2,60 1,20 5,80 5,80 1,00 11,70 1,80 2,40 1,00 5,90 5,90 1,00 11,60 1,83 2,47 1,07 5,83 5,87 0,99 Tsh7 - 15 12,90 1,60 2,20 1,50 6,00 6,60 0,91 12,80 1,70 2,10 1,50 5,90 6,50 0,91 12,60 1,60 2,20 1,70 6,10 6,50 0,94 12,77 1,63 2,17 1,57 6,00 6,53 0,92 Tsh7 – 16 11,20 1,30 2,40 1,60 5,90 5,40 1,09 11,10 1,40 2,50 1,50 6,00 5,50 1,09 11,40 1,30 2,40 1,40 6,00 5,40 1,11 11,23 1,33 2,43 1,50 5,97 5,43 1,10 Tsh7 - 17 12,80 1,40 2,10 1,10 6,10 6,60 0,92 12,60 1,50 2,20 1,10 5,90 6,60 0,89 12,80 1,60 2,00 1,20 6,00 6,50 0,92 12,73 1,50 2,10 1,13 6,00 6,57 0,91 Tsh7 - 18 11,00 1,80 2,70 1,30 4,90 7,10 0,69 11,10 1,70 2,60 1,20 4,90 7,00 0,70 11,00 1,80 2,60 1,40 5,00 7,10 0,70 11,03 1,77 2,63 1,30 4,93 7,07 0,70 Tsh7 - 19 14,60 1,40 2,20 1,50 7,60 5,90 1,29 14,80 1,50 2,20 1,30 7,50 6,00 1,25 14,40 1,40 2,30 1,60 7,40 6,10 1,21 14,60 1,43 2,23 1,47 7,50 6,00 1,25 Tsh 7 - 20 10,70 1,10 1,50 1,50 5,60 5,30 1,06 10,50 1,10 1,60 1,40 5,70 5,10 1,12 65 10,70 1,00 1,70 1,30 5,70 5,10 1,12 10,63 1,07 1,60 1,40 5,67 5,17 1,10 Tsh7 - 21 12,70 1,70 3,00 1,20 6,30 6,00 1,05 12,50 1,70 2,90 1,40 6,20 6,00 1,03 12,50 1,80 2,80 1,20 6,30 5,90 1,07 12,57 1,73 2,90 1,27 6,27 5,97 1,05 Tsh7 - 22 11,90 1,30 1,50 1,30 6,10 6,40 0,95 11,80 1,30 1,40 1,30 6,20 6,30 0,98 11,80 1,40 1,50 1,40 6,10 6,20 0,98 11,83 1,33 1,47 1,33 6,13 6,30 0,97 Tsh7 - 23 11,90 1,70 2,10 1,00 5,40 6,60 0,82 12,10 1,70 2,10 1,00 5,10 6,70 0,76 12,00 1,50 2,00 1,10 5,30 6,60 0,80 12,00 1,63 2,07 1,03 5,27 6,63 0,79 Tsh7 - 24 13,90 1,50 1,70 1,20 6,90 6,80 1,01 13,90 1,50 1,60 1,20 7,00 6,40 1,09 14,00 1,50 1,70 1,30 6,90 6,50 1,06 13,93 1,50 1,67 1,23 6,93 6,57 1,06 Tsh7 - 25 12,70 1,60 2,10 0,90 7,30 6,30 1,16 12,70 1,50 2,10 0,90 7,40 6,40 1,16 12,60 1,50 2,30 0,90 7,20 6,30 1,14 12,67 1,53 2,17 0,90 7,30 6,33 1,15 Tsh7 - 26 11,50 1,40 2,30 1,60 5,30 6,70 0,79 11,30 1,30 2,30 1,90 5,30 6,80 0,78 11,30 1,30 2,50 1,90 5,40 6,70 0,81 11,37 1,33 2,37 1,80 5,33 6,73 0,79 Tsh7 - 27 10,70 1,40 3,10 1,50 5,20 5,00 1,04 10,80 1,40 3,20 1,40 5,40 5,00 1,08 10,80 1,50 3,20 1,60 5,40 4,80 1,13 10,77 1,43 3,17 1,50 5,33 4,93 1,08 Tsh7 - 28 12,10 1,50 2,40 0,80 6,00 5,90 1,02 12,30 1,40 2,40 0,90 5,70 6,00 0,95 12,40 1,40 2,50 0,80 6,30 5,70 1,11 12,27 1,43 2,43 0,83 6,00 5,87 1,02 Tsh7 - 29 14,10 1,60 2,70 1,10 5,90 8,40 0,70 13,90 1,30 2,50 1,20 5,80 8,60 0,67 14,00 1,50 2,40 1,30 6,00 8,30 0,72 14,00 1,47 2,53 1,20 5,90 8,43 0,70 Tsh7 - 30 11,60 1,70 2,40 1,50 5,70 4,30 1,33 11,50 1,60 2,50 1,30 5,80 4,10 1,41 11,70 1,70 2,30 1,60 5,80 4,40 1,32 11,60 1,67 2,40 1,47 5,77 4,27 1,35 * (µm2) 66 Onde: CT: Comprimento total da célula; LT: Largura total da célula; AC: Área do cinetoplasto; AN: Área do núcleo; DNA: Distância anterior ao núcleo; DNP: Distância posterior ao núcleo; IN: Índice nuclear (IN=DPN/DAN). Os valores em negrito representam as medias dos resultados.