Campus de São José do Rio Preto Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudo da Interação da Piplartina com Albumina do Soro Humano por Técnicas Espectroscópicas Departamento de Física Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE) Universidade Estadual Paulista (UNESP) São José do Rio Preto – SP Março – 2017 Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudo da Interação da Piplartina com Albumina do Soro Humano por Técnicas Espectroscópicas Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq - Proc. 130449/2015-6 Orientador: Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio São José do Rio Preto - SP Março - 2017 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Campus de São José do Rio Preto Contessoto, Nayara Sousa de Alcântara. Estudo da interação da Piplartina com Albumina do Soro Humano por técnicas Espectroscópicas / Nayara Sousa de Alcântara Contessoto. -- São José do Rio Preto, 2017 51 f. : il., tabs. Orientador: Marinônio Lopes Cornélio Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Biologia molecular. 2. Biofísica. 3. Albumina. 4. Espectroscopia de fluorescencia. 5. Piplartina. 6. Piperlongumine I. Cornélio, Marinônio Lopes. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU – 577.3 Nayara Sousa de Alcântara Contessoto Estudo da Interação da Piplartina com Albumina do Soro Humano por Técnicas Espectroscópicas Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq - Proc. 130449/2015-6 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio UNESP – São José do Rio Preto - SP Orientador Prof. Dr. Marcelo Andrés Fossey UNESP – São José do Rio Preto - SP Prof. Dr. Valdecir Farias Ximenes UNESP – Bauru - SP São José do Rio Preto - SP 24 de Março de 2017 Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus. Ao Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio pela orientação, paciência, dedicação e ensinamentos. Aos integrantes da banca Profs. Drs. Valdecir Farias Ximenes e Marcelo Andrés Fossey pela presença e sugestões. Aos amigos de laboratório, Cíntia e Ícaro, pelas ajudas e conhecimentos transmitidos. À Unesp pelo acolhimento e infra-estrutura fornecida; ao programa de pós-graduação em Biofísica Molecular e Faperp pelos auxílios fornecidos. Aos pesquisadores colaboradores Drs. Daniel Pereira Bezerra e José Maria Barbosa Filho. Aos servidores e docentes do Departamento de Física pela transmissão de conhecimento e postura, em excelência, de profissionais, professores e pesquisadores. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro. Aos companheiros de pós-graduação e amigos da Unesp. À minha família, especialmente aos meus pais, Rosali e Amaurício, e aos meus queridos irmãos, Felipe e Rafael, pela dedicação, paciência, incentivo e carinho. Ao meu esposo Vinícius pelo amor, amizade, carinho, compreensão e paciência. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram com a realização desse trabalho. Sumário Lista de Abreviaturas i Lista de Símbolos ii Lista de Figuras iv Lista de Tabelas v Resumo vi Abstract vii 1 Organização da Dissertação 1 2 Introdução 2 2.1 Piplartina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.2 Albumina do Soro Humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 Motivação e Objetivos 6 4 Princípios Espectroscópicos de Fluorescência 7 4.1 Características Gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4.2 Absorção de Luz e Lei de Beer-Lambert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4.3 Filtragem Interna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 4.4 Supressão de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 4.4.1 Dinâmica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 4.4.2 Estática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 4.5 Termodinâmica da Interação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.6 Método Função Densidade de Ligação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 4.6.1 Estados Físicos da Macromolécula . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.6.2 Scatchard . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.7 Deslocamento do Marcador de Sítio Específico . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.8 Comparação dos Métodos de Análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 5 Materiais e Métodos 23 5.1 Compostos e Soluções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 5.2 Espectroscopia de Absorção Molecular UV-Visível . . . . . . . . . . . . . . 23 5.3 Espectroscopia de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 5.3.1 Estudos da Supressão de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . 24 5.3.2 Estudos do Deslocamento de Marcadores de Sítio . . . . . . . . . . 24 6 Resultados e Discussões 26 6.1 Mecanismo de Supressão de Fluorescência . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 6.2 Determinação da Constante de Ligação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 6.3 Análises Termodinâmicas e Forças de Ligação . . . . . . . . . . . . . . . . 29 6.4 Método Função Densidade de Ligação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 6.5 Deslocamento do Marcador de Sítio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 7 Conclusões 35 Referências 36 Anexo I - Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão) Anexo II - Material Suplementar do Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão) Lista de Abreviaturas BDF Função densidade de ligação (Binding Density Function) CAS number Número do registro no banco de dados do Chemical Abstracts Service HSA Albumina do soro humano (Human Serum Albumin) MM Massa molecular PDB Banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) Phe Fenilalanina PPTN Piplartina Trp Triptofano Tyr Tirosina UV Ultravioleta Vis Visível i Lista de Símbolos ∆G0 Variação da energia livre de Gibbs ∆H0 Variação da entalpia ∆S0 Variação da entropia T Temperatura ε Coeficiente de extinção molar (absortividade molar) λex Comprimento de onda de excitação λmax Comprimento de onda máximo K′ Constante de supressão de Stern-Volmer KSV Constante de supressão de Stern-Volmer (mecanismo estático) KD Constante de supressão de Stern-Volmer (mecanismo dinâmico) Kq Constante de supressão bimolecular Kb Constante de ligação Ka Constante de afinidade n Número de sítios de ligação (coeficiente estequiométrico) R Constante universal dos gases ideais I Intensidade de luz transmitida I0 Intensidade de luz incidente dc.o. Comprimento do caminho óptico [C] Concentração Itransmitancia Transmitância β Constante de proporcionalidade Fcorr Intensidade de fluorescência corrigida Fobs Intensidade de fluorescência observada Abs Absorbância Aex Absorbância no comprimento de onda de excitação Aem Absorbância no comprimento de onda de emissão IF Intensidade de fluorescência nFE Número de fótons emitidos nFA Número de fótons absorvidos ii EF Energia do fóton ΦF Rendimento quântico de fluorescência τ Tempo de vida de fluorescência τo Tempo de vida do fluoróforo na ausência do supressor F Intensidade de fluorescência da HSA na presença de piplartina F0 Intensidade de fluorescência da HSA na ausência de piplartina [PPTN ] Concentração de piplartina [Q] Concentração do supressor (piplartina) LF Concentração do ligante livre LT Concentração total do ligante LXµMT Concentração total do ligante quando a concentração de proteína é XµM PT Concentração total da macromolécula (proteína) PXµMT Concentração total da proteína (igual a XµM) PF Concentração da proteína livre PB Concentração da proteína ligada LnP Concentração do complexo não fluorescente ∑ νi Distribuição densidade de ligação do ligante sobre a proteína Sobs Sinal da intensidade de fluorescência da HSA na presença de piplartina (observada) SFPT Sinal da intensidade de fluorescência da HSA na ausência de piplartina ∆Sobs Porcentagem da supressão da intensidade de fluorescência observada ∆F Porcentagem da supressão da intensidade de fluorescência SF Sinal da fluorescência molar da proteína livre SB Sinal da fluorescência molar da proteína ligada Si Sinal da fluorescência molar do complexo com i ligantes ligados Pi Concentração da proteína complexada com i ligantes ligados ∆Si i Grau médio de supressão por ligante ligado no complexo contendo i ligantes iii Lista de Figuras 1 Porcentagem da distribuição dos compostos isolados de diferentes espécies de Piper organizados por categoria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 Estrutura química da piplartina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 A - Estrutura cristalográfica da albumina do soro humano (HSA). B - Representação da estrutura da HSA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 Diagrama de Jablonski. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 Absorção da luz monocromática ao atravessar uma amostra. . . . . . . . . 8 6 Variação da transmitância com relação ao comprimento de caminho óptico. 9 7 Comparação dos mecanismos de supressão dinâmico e estático. . . . . . . . 13 8 Representação qualitativa da realização dos experimentos de deslocamento do marcador de sítio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 9 Espectro de emissão da HSA na ausência e presença de piplartina. . . . . . 26 10 Análise de Stern-Volmer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 11 Gráfico duplo logarítmico da interação entre piplartina e HSA. . . . . . . . 28 12 Análise de van’t Hoff. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 13 Porcentagem de supressão da intensidade de fluorescência para duas concen- trações diferentes de HSA na presença de piplartina. . . . . . . . . . . . . . 31 14 Análise de Scatchard. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 15 Análise do deslocamento do marcador de sítio pela piplartina. . . . . . . . 33 16 Representação qualitativa dos experimentos de deslocamento do marcador de sítio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 iv Lista de Tabelas 1 Comparação dos métodos de análise do número de sítios e da constante de associação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2 Constantes de supressão de Stern-Volmer da interação PPTN-HSA. . . . . 27 3 Constantes de ligação e número de sítios ligados da interação entre HSA e PPTN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4 Parâmetros termodinâmicos da interação HSA-PPTN. . . . . . . . . . . . . 30 v Resumo Piplartina é um alcalóide amida presente em raízes e caules de diferentes espécies de pimentas do gênero Piper. Este composto apresenta várias propriedades farmacológicas promissoras, tais como: antidepressiva, ansiolítica, genotóxica, citotóxica, antiangiogê- nico, antimetastático, entre outras; destaca-se sua propriedade anti-cancerígena, pois este composto demonstra efeito anti-proliferativo maior em células alteradas do que em cé- lulas normais. Estudos têm determinado os parâmetros farmacocinéticos da piplartina em plasma de rato, através de administração via intraperitoneal, porém, sem detalhar qualquer alvo molecular ou descrever as forças físico-químicas da interação. Este estudo foi realizado para compreender a interação entre piplartina (PPTN) e albumina do soro humano (HSA), que é a proteína predominante no plasma sanguíneo e carreadora de vários fármacos. Essa interação foi investigada através de espectroscopia de fluorescência de estado fundamental, monitorando a emissão de fluorescência do único resíduo de triptofano da HSA (Trp214). Observou-se a formação do complexo HSA-piplartina. A análise do pa- râmetro termodinâmico indicou que o processo ocorre espontaneamente e é entalpicamente dirigido; a constante de afinidade sugere que essa interação é reversível. As análises de deslocamento do marcador de sítio e do método função densidade de ligação indicaram que a piplartina liga sobre um único sítio da HSA, o qual foi sugerido como o subdomínio IIA. Palavras-chave: Piplartina, Piperlongumine, Albumina do Soro Humano, Espectroscopia de Fluorescência. vi Abstract Piplartine is an alkaloid amide present in roots and stems of different peppers species of the genus Piper. This compound has several promising pharmacological properties, such as: an- tidepressant, anxiolytic, genotoxic, cytotoxic, antiangiogenic, antimetastatic, among others; Its anticancer property is highlighted, because this compound does demonstrate greater anti-proliferative effect in altered cells than in normal cells. Studies have determined the pharmacokinetic parameters of piplartine in rat plasma by intraperitoneal administration, however, without pointing any molecular target or describing the physicochemical forces of the interaction. This study was conducted to understand the interaction between piplartine (PPTN) and human serum albumin (HSA), which is the predominant protein in blood plasma and carrier of various drugs. This interaction was investigated through steady-state fluorescence spectroscopy, monitoring the fluorescence emission of the single tryptophan residue of HSA (Trp214). It was observed the complex HSA-piplartine formation. The thermodynamic parameter analysis indicates that the process occurs spontaneously and it is enthalpically driven; the affinity constant suggests that this interaction is reversible. It was indicated by the binding density function method and by the site marker displacement analysis that the piplartine binds on HSA at single site, which was determined like the IIA sub-domain. Keywords: Piplartine, Piperlongumine, Human Serum Albumin, Fluorescence Spectros- copy. vii 1 Organização da Dissertação Nesta dissertação procura-se entender e discutir a interação entre a piplartina e a proteína Albumina do Soro Humano (HSA) através de análises físico-químicas. A parte introdutória aborda as principais características dos compostos em estudo; detalhes das técnicas experimentais espectroscópicas estão descritas na seção 4 juntamente com a teoria dos métodos de análises utilizados. Na seção 5 encontra-se a descrição dos materiais e métodos para os experimentos realizados. Os resultados obtidos e as respectivas discussões estão apresentados na seção 6. Em anexo encontra-se os manuscritos do artigo (Anexo I - Artigo Piplartina) e do ma- terial suplementar (Anexo II - Material Suplementar do Artigo Piplartina) à ser submetido para publicação, referentes ao trabalho desenvolvido no mestrado. A contribuição dos demais autores ainda serão inseridas. 1 2 Introdução 2.1 Piplartina As espécies do gênero Piper destacam-se dentre às outras espécies também pertencentes à família Piperaceae devido à sua grande importância comercial, econômica e medicinal. Encontram-se amplamente distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Economicamente destacam-se nos mercados mundiais de especiarias através das pimentas; e devido às suas propriedades medicinais estão descritas em várias farmacopeias, são famosas na medicina Ayurveda Indiana, popular da América Latina e das Índias Ocidentais. [1, 2]. Das mais de 1000 espécies pertencentes ao gênero Piper somente cerca de 10% (112 espécies) tem sua fitoquímica investigada. Dessas 112 espécies foram isolados 667 diferentes compostos e classificados nas seguintes categorias (Figura 1): alcalóides/amidas, kavapi- ronas, chalconas/di-hidrochalconas, terpenos, flavonas, neolignanas, esteróides, lignanas, flavanonas, propenilfenóis, piperolídeos, entre outros (alcanos, álcoois, ácidos, ésteres, etc.) [2, 3]. Figura 1: Porcentagem da distribuição dos compostos isolados de diferentes espécies de Piper organizados por categoria [2, 3]. (*)Compostos diversos que não se enquadram nos grandes grupos comuns de metabólitos secundários. Gerada pela autora, dados de Dyer [3]. 2 Neste trabalho um dos principais compostos alcalóide/amidas pertencentes ao gênero Piper foi selecionado: a piplartina (Figura 2), que também é conhecida por piperlongumine, 5,6-dihidro-1- [(2E)-1-oxo-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-propen-1-il]-2(1H)-piridinona, e possui 317.3g/mol. Foi isolada pela primeira vez em 1963 do caule de Piper longum, comercialmente conhecida como ‘piplamool’. Atualmente a Piplartina (PPTN) é isolada a partir de cascas do caule e raízes de diferentes espécies de pimenta, como Piper tuberculatum L. (pimenta- d’arda), Piper longum L. (pimenta longa), entre outras [1, 2, 4–7]. Figura 2: Estrutura química da piplartina (C17H19O5N). Extraída de Bezerra [5]. Estudos in vivo e in vitro demonstram que a piplartina possui várias propriedades farmacológicas promissoras como: antidepressiva, ansiolítica, genotóxica, citotóxica, an- tiangiogênica, antimetastática, anti-diabética, anti-bacteriana, antifúngica, antitumoral, entre outras; tornando esta molécula potencialmente útil e com destaque para sua ati- vidade anti-cancerígena pois este composto demonstra efeito anti-proliferativo maior em células alteradas do que em células normais [5, 6, 8–10]. Devido às propriedades benéficas deste composto para saúde encontram-se na literatura trabalhos que abordam desde a sua obtenção à ensaios celulares. Porém, neste contexto, quase nenhum trabalho descreve a interação deste composto com macromoléculas biológicas. 3 2.2 Albumina do Soro Humano A proteína escolhida neste estudo foi a Albumina do Soro Humano (HSA), a qual predomina no plasma sanguíneo, cuja principal função é carrear vários compostos endógenos (por exemplo: ácidos graxos de cadeia longa, hormônios, metabólitos tóxicos e metais) e exógenos (por exemplo: moléculas de fármacos) [11, 12]. Sua sequência de aminoácidos foi publicada em 1975, simultaneamente, pelos laboratórios de Brown e Meloun; possui 585 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 66,5kDa [11,13]. A estrutura terciária dessa proteína globular monomérica (Figura 3 - A ) é estabilizada por dezessete pontes dissulfeto, formando alças que se agrupam em três domínios homólogos (I, II e III), cada domínio possui dois subdomínios (A e B) e predominam as α-hélices (Figura 3 - B) [11]. Conforme descrito na figura 3 - B, os índices Ia-h(1 a 6), Ib-h(1 a 4), IIa-h(1 a 6), IIb-h(1 a 4), IIIa-h(1 a 6) e IIIb-h(1 a 4) referem-se aos seus subdomínios e suas respectivas α-hélices [13]. Vários compostos ligam-se reversivelmente na HSA, e isso afeta a distribuição desses compostos no organismo e suas taxas de metabolismo e excreção. Consequentemente, esses fatores implicam na disponibilidade e na intensidade dos efeitos do fármaco, portanto, interações HSA-fármaco são de interesse farmacológico e de modelagem biofísica [14,15]. Por possuir um único resíduo de triptofano (Trp214), no subdomínio IIA (Figura 3 - A), a HSA é uma excelente candidata em estudos através de técnicas de espectroscopia de fluorescência, que é a técnica utilizada neste trabalho. As principais regiões da interação HSA-ligante são bem determinadas na literatura, e estão localizadas nas cavidades hidrofóbicas nos subdomínios IIA, IIIA e IB que são nomeados como sítio I, II e III, respectivamente, da HSA (Figura 3 - B) [11,14,16]. 4 Figura 3: A - Estrutura cristalográfica da albumina do soro humano (HSA) com seus sub- domínios indicados, em destaque o resíduo de triptofano (Trp214) localizado no subdomínio IIA (código do PDB: 1AO6) [17]. B - Representação da estrutura da HSA. Os retângulos, as linhas finas e as linhas grossas indicam, respectivamente, as alfa-hélices, as voltas e as pontes dissulfeto (descritas ao lado dos seus respectivos domínios) [11, 13]. Extraída de Peters e adaptada pela autora. Os subdomínios das figuras (A e B) estão coloridos igualmente. 5 3 Motivação e Objetivos A motivação e os objetivos deste trabalho é caracterizar físico-quimicamente a interação entre a piplartina e a albumina do soro humano. A piplartina é um fitofármaco natural, abundante e com vários potenciais farmacológicos promissores, destacando-se a inibição de crescimento de tumores [2,8]. A HSA é a proteína predominante no plasma sanguíneo e carreadora de várias substâncias. Através da técnica de espectroscopia de fluorescência a interação HSA-PPTN foi investigada monitorando a emissão do único resíduo de triptofano na HSA (Trp 214). Caracterizar a interação fármaco-proteína é de grande interesse farmacológico, pois a ligação do ligante na HSA resulta em um aumento da solubilidade no plasma, diminuição da toxicidade e/ou proteção contra a oxidação; ou seja, facilita exercer seu efeito terapêutico no alvo molecular, portanto essas análises complementam os estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos do fármaco [18,19]. 6 4 Princípios Espectroscópicos de Fluorescência 4.1 Características Gerais A emissão de fluorescência é caracterizada como um processo espontâneo, e ocorre através da desexcitação de fluoróforos que estão em um estado quântico eletronicamente excitado devido à absorção de fótons, outros fenômenos também estão envolvidos na desexcitação, conforme ilustra o diagrama de Jablonski (Figura 4). Nas proteínas, os fluoróforos intrínsecos são os resíduos de aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe) [20–22]. Figura 4: Diagrama de Jablonski. Figura extraída de Lakowicz e adaptada pela autora [20]. O fenômeno da fluorescência é caracterizado por parâmetros como: rendimento quântico, tempo de vida e intensidade [21]. Neste trabalho será analisado a intensidade de emissão de fluorescência (IF ) a um dado comprimento de onda de excitação, tem-se então: IF = nFE · EF (1) Nesta equação, nFE é o número de fótons emitidos por fluorescência e EF é a energia do fóton. O rendimento quântico de fluorescência (ΦF ) é a razão do número de fótons emitidos por fluorescência pelo número de fótons absorvidos (ΦF=nFE/nFA), portanto, IF e ΦF são proporcionais. Já o tempo de vida da fluorescência (τ) é o tempo médio do fluoróforo no estado excitado antes do decaimento para o estado fundamental [21]. 7 4.2 Absorção de Luz e Lei de Beer-Lambert A absorção de fótons pela molécula induz sua excitação, neste fenômeno a energia absorvida pela molécula é igual a soma das energias absorvidas pelos níveis de energia eletrônica, vibracional e rotacional. Estes três níveis são responsáveis pela liberação de energia no fenômeno de fluorescência, portanto compreender a absorção da luz por uma amostra é necessário no estudo de espectroscopia de fluorescência [21]. O espectro de absorção é caracterizado por dois parâmetros: o comprimento de onda máximo (λmax) e a absortividade molar (ε) calculada geralmente no λmax, onde as moléculas absorvem mais [20, 21] . O coeficiente de extinção molar (ou absortividade molar) é assim denominado devido a luz ao atravessar uma solução ser parcialmente absorvida, ou seja, sua intensidade é suprimida [21]. A concentração de uma amostra pode ser calculada através da análise de sua absorbância. Um feixe de luz monocromática incide sobre uma solução em uma cubeta de quartzo, cujo comprimento do caminho óptico é determinado pela dimensão da cubeta, a luz ao atravessá-la será parcialmente absorvida e o espectrofotômetro registrará a intensidade da luz transmitida (Figura 5) [21]. Figura 5: Absorção da luz monocromática ao atravessar uma amostra. Io, I e dc.o. são as intensidade de luz incidente e transmitida e o comprimento do caminho óptico, respectivamente. Figura extraída de Lakowicz e adaptada pela autora [20]. A transmitância (ITransmitancia) é descrita pela razão entre a intensidade de luz trans- mitida (I) pela intensidade de luz incidente (Io). O gráfico da transmitância versus o comprimento do caminho óptico (dc.o.), para três amostras com concentrações diferentes 8 ([C]), indica que a transmitância é proporcional ao exponencial de [C]dc.o. (Figura 6) [21]. Ou seja, ITransmitancia = I Io (2) ITransmitancia ∝ e−[C]dc.o. (3) Figura 6: Variação da transmitância (ITransmitancia) com relação ao comprimento de caminho óptico (dc.o.) para três concentrações de amostras (1, 2 e 10 M). Figura extraída de Albani e adaptada pela autora [21]. Substituindo a equação 2 na equação 3, tem-se: I Io ∝ e−[C]dc.o. (4) Aplicando a função logarítmica neperiana: ln ( I Io ) ∝ ln ( e−[C]dc.o. ) (5) ln ( I Io ) ∝ −[C]dc.o. (6) Igualando através da constante de proporcionalidade (β): ln ( I Io ) = −β[C]dc.o. (7) 9 Multiplicando por (-1): −ln ( I Io ) = β[C]dc.o. (8) ln ( Io I ) = β[C]dc.o. (9) Transformando em logaritmo decimal: ln ( Io I ) = loge ( Io I ) = log10 ( Io I ) log10 (e) = log ( Io I ) log (e) = β[C]dc.o. (10) Rearranjando: log ( Io I ) = β[C]dc.o.log (e) = β[C]dc.o.0.4343 = β[C]dc.o. 2.302 (11) Substituindo β 2.302 por ε: log ( Io I ) = ε[C]dc.o. (12) Portanto, −log (ITransmitancia) = log ( Io I ) = ε[C]dc.o. = Abs (13) Nesta equação Abs é a absorbância, e é uma grandeza adimensional. A concentração ([C]) é dada em molar (M), o comprimento do caminho óptico (dc.o.) em centímetro (cm) e o coeficiente de extinção molar (ε) em M−1cm−1 [21]. Portanto, a relação entre o coeficiente de extinção molar, a concentração da amostra, e a espessura do caminho óptico é caracterizada pela lei de Beer-Lambert (Equação 14) [20,21]. Abs = log ( Io I ) = ε[C]dc.o. (14) Ou seja, a Lei de Beer-Lambert indica que a absorbância é diretamente proporcional à concentração da amostra. 4.3 Filtragem Interna O efeito de filtragem interna foi identificado por Stokes ao observar que a luz UV ao atravessar uma solução de quinina era ’enfraquecida’ após a emersão, ou seja, sua intensidade diminui, não mais causando o brilho azulado. Esse fenômeno ocorre devido 10 à dissipação da energia absorvida através de energia térmica, energia de colisão com as moléculas de solvente, e também a transferência de energia para outras moléculas na solução [20,21]. No espectrofluorímetro usual o feixe de emissão é registrado perpendicularmente ao feixe de excitação. Considerando que a emissão é detectada no centro da cubeta, tem-se que o feixe incidente vai passar por metade do comprimento do caminho da cubeta (caminho óptico) antes da emissão ser gerada e o feixe de emissão deve também atravessar a metade do comprimento do caminho da cubeta antes de ser detectado [21]. Devido o sistema, a intensidade da emissão observada (Fobs) será subestimada, portanto deve-se fazer uma correção desta auto-absorção pela solução, ou seja, para este efeito de filtragem interna [21]. A correção da intensidade de fluorescência, devido ao efeito de filtragem interna, é realizada utilizando a equação 15: Fcorr = Fobs · 10(Aex+Aem)/2 (15) Nesta equação, Fcorr e Fobs são as intensidades de fluorescência corrigida e observada, respectivamente. Aex e Aem são as absorbâncias no comprimento de onda de excitação e no comprimento de onda de emissão, respectivamente [21]. 4.4 Supressão de Fluorescência A diminuição da intensidade de fluorescência de uma amostra é denominada supressão de fluorescência. A supressão pode ocorrer por inúmeros processos, mas os mecanismos de supressão são geralmente classificados por estático ou colisional (dinâmico), onde ambos requerem contato molecular entre o fluoróforo e o supressor. Na supressão dinâmica o fluoróforo no estado excitado é desexcitado, retornando ao estado fundamental sem emissão de fótons, após o contato com alguma molécula supressora, porém, sem a formação de complexos. Já na supressão estática, o supressor entra em contato com o fluoróforo no estado fundamental e forma um complexo não fluorescente. Portanto, informações sobre sistemas bioquímicos podem ser obtidas com auxílio da análise das supressões, pois os mecanismos indicam o processo pelo qual a supressão ocorre [20,21]. A diminuição da intensidade de fluorescência conforme o aumento da concentração de 11 supressor é descrita pela equação de Stern-Volmer (Equação 16) [20,21]: Fo F = 1 + τoKq[Q] = 1 +K ′[Q] (16) Nesta equação F e Fo são as intensidades de fluorescência na presença e na ausência de supressor, respectivamente. τo é o tempo de vida do fluoróforo na ausência de supressor (para o triptofano τo é aproximadamente 6ns). Kq é a constante de supressão bimolecular, K ′ é a constante de supressão de Stern-Volmer; e [Q] é a concentração do supressor [20,22]. Pela análise de Stern-Volmer (Equação 16), apresentada pela fração Fo F versus [Q], espera- se um comportamento linear; entretanto este comportamento não determina o mecanismo de supressão, pois em ambos mecanismos a supressão é proporcional à concentração. Para distingui-los a condição ideal de medida seria a fluorescência com resolução temporal, mas variações como viscosidade e temperatura podem elucidar tal mecanismo de supressão [20,21]. Na supressão estática o tempo de vida médio de fluorescência analisado na presença (τ) e ausência de supressor (τo) serão iguais, porque apenas as moléculas fluorescentes são observadas, ou seja, os fluoróforos livres tem o tempo de vida inalterado. Portanto, neste caso, a intensidade da fluorescência e o rendimento quântico diminuem, mas o tempo de vida da fluorescência não muda ( τo τ = 1) [20, 21]. Na supressão dinâmica o tempo de vida médio de fluorescência na presença de supressor será menor do que na ausência, porque neste caso há uma perda parcial de energia das moléculas de fluoróforo ao colidirem com as moléculas do supressor. Portanto, a intensidade de fluorescência, o rendimento quântico e o tempo de vida diminuem (Fo F = τo τ ) [20, 21]. Conforme o aumento da temperatura, a difusão será mais rápida e a supressão de inten- sidade de fluorescência por colisão será maior (supressão dinâmica) (Figura 7). Entretanto a supressão da intensidade de fluorescência no caso estático será menor conforme o aumento da temperatura porque os complexos fracamente ligados são dissociados, ou seja, alguns dos fluoróforos que não estavam fluorescendo (devido a formação do complexo) passam a fluorescer (Figura 7) [20,21]. Neste trabalho a supressão da intensidade de fluorescência de emissão foi analisada em relação à temperatura. 12 Figura 7: Comparação dos mecanismos de supressão dinâmico (colisional) e estático. Figura extraída de Lakowicz e adaptada pela autora [20]. 4.4.1 Dinâmica A supressão colisional ocorrerá quando o fluoróforo for desexcitado, voltando ao estado fundamental, através de um encontro difuso com alguma outra molécula em solução durante o tempo de vida do estado excitado, ou seja, este é um processo dependente do tempo. Na equação 16, a constante K ′ indica a sensibilidade do fluoróforo a uma molécula supressora. Um fluoróforo no interior de uma biomolécula é geralmente inacessível a supressores solúveis em água, portanto o valor de K ′ é baixo. Entretanto valores maiores de K ′ são encontrados quando o fluoróforo está livre em solução ou próximo à superfície de uma biomolécula [20]. Diferenciando as constante K ′ (Equação 16) para o mecanismo de supressão dinâmica e estática utiliza-se KD e KSV , respectivamente. Portanto, no caso dinâmico tem-se: Fo F = 1 +KD[Q] (17) Nesta equação KD é a constante de supressão de Stern-Volmer para o mecanismo dinâmico. 4.4.2 Estática A supressão estática ocorre quando os fluoróforos formam complexos (no estado funda- mental) com supressores, e o complexo ao absorver luz retorna, imediatamente, ao estado fundamental sem emissão de fótons, ou seja, não fluorescendo [21]. 13 Portanto, substituindo a constante K ′ por KSV na equação 16, para o caso estático tem-se: Fo F = 1 +KSV [Q] (18) Nesta equação KSV é a constante de supressão de Stern-Volmer para o mecanismo estático. Utiliza-se esta equação na análise da dependência de KSV com relação à temperatura (T) e, consequentemente, para determinar o tipo de mecanismo de supressão [20,21]. Pressupondo que exista n locais de ligação do ligante na proteína, a equação da reação para o mecanismo estático pode ser descrita como [21,23]: nLF + PF → LnP (19) Portanto, tem-se a constante de ligação (Kb) para a formação do complexo: Kb = [LnP ] [LF ]n [PF ] (20) Nesta equação, [LF ] e [PF ] são as concentrações do supressor e da proteína livres, respecti- vamente. [LnP ] é a concentração do complexo proteína-ligante não fluorescente [20, 21]. A concentração total de proteína ([PT ]) pode ser descrita como: [PT ] = [LnP ] + [PF ] (21) Isolando [LnP ]: [LnP ] = [PT ]− [PF ] (22) Substituindo na equação 20: Kb = [PT ]− [PF ] [LF ]n [PF ] (23) A intensidade de fluorescência (F ) é diretamente proporcional à concentração de proteína livre [PF ] na supressão estática, já que o complexo formado não fluoresce. Portanto, a intensidade de fluorescência na ausência do supressor (Fo) é proporcional à concentração de proteína total [PT ]. Ou seja: Fo F = [PT ] [PF ] (24) Rearranjando a equação 23: Kb = [PT ] [LF ]n [PF ] − [PF ] [LF ]n [PF ] (25) 14 Kb = [PT ] [LF ]n [PF ] − 1 [LF ]n (26) Kb [LF ]n = [PT ] [PF ] − 1 (27) Substituindo a equação 24: Fo F − 1 = Kb [LF ]n (28) Fo − F F = Kb [LF ]n (29) Considerando a concentração de supressor ligado como sendo muito pequena em comparação com a concentração de supressor adicionada, então a concentração de supressor livre será quase igual à concentração total adicionada [21]. Portanto, a equação 29 pode ser escrita como: Fo − F F = Kb [LT ]n (30) Aplicando a função logarítmica: log ( Fo − F F ) = log (Kb [LT ]n) (31) Rearranjando: log ( Fo − F F ) = log (Kb) + log ([LT ]n) (32) log ( Fo − F F ) = log (Kb) + n (log ([LT ])) (33) Com esta relação duplo-logarítmica, log ( Fo−F F ) versus log ([LT ]), determina-se a constante de ligação (Kb) e o número de sítios na proteína (n). 4.5 Termodinâmica da Interação As forças moleculares que contribuem na estabilidade de interações são geralmente: ligações de hidrogênio, interações de van der Waals, eletrostáticas e hidrofóbicas. Os modos de interação podem ser indicados através das análises dos parâmetros termodinâmicos da 15 ligação (variações da energia livre de Gibbs (∆Go), entalpia (∆Ho) e entropia (∆So)) [24]. Para determinar a energia livre de Gibbs utiliza-se a equação: ∆Go = −RT lnKb (34) Nesta equação, T e R são a temperatura e a constante universal dos gases (8.31Jmol−1K−1), respectivamente. Kb é a constante de ligação, obtida utilizando-se a equação 33, em cada temperatura (T). Igualando a equação 34 a seguinte relação da energia livre de Gibbs: ∆Go = ∆Ho − T∆So (35) Obtém-se: −RT lnKb = ∆Ho − T∆So (36) Rearranjando: lnKb = −∆Ho RT + ∆So R (37) Portanto, para estimar os parâmetros termodinâmicos da interação utiliza-se a relação de van’t Hoff (Equação 37), plotando lnKb versus o inverso da temperatura ( 1 T ). Em seguida, para determinar os valores de T∆S, os valores de ∆G e ∆H, obtidos acima, são substituídos na equação 35. 4.6 Método Função Densidade de Ligação Este método foi descrito por Lhoman e Bujalowski no artigo de 1991 "Thermodynamic Mehods for Model-Independent Determination of Equilibrium Binding Isotherms for Protein-DNA Interactions: Spectroscopic Approaches to Monitor Binding". Nesta aborda- gem utiliza-se um sinal espectroscópico (por exemplo, absorbância, fluorescência, dicroísmo circular, entre outros) para monitorar uma ligação proteína-ligante. Este sinal observado pode ser da proteína, neste caso ocorre a titulação do ligante e é denominada como titulação normal; ou o sinal pode ser do ligante e ocorre a titulação da proteína, denominada titulação reversa [25]. Neste trabalho foi analisado o sinal da proteína (HSA) através da espectroscopia de fluorescência. O método função densidade de ligação (Binding Density Function - BDF) 16 depende somente da distribuição densidade de ligação do ligante sobre a proteína, conforme descrito (abaixo) matematicamente. Em equilíbrio, o número médio de ligantes ligados por proteína ( ∑ νi) é determinado por uma dada concentração de ligante livre (LF ), ou seja, se a concentração de ligante livre é a mesma para duas (ou mais) soluções em diferentes concentrações de proteína total (PT ), então a distribuição média da densidade de ligação do ligante ( ∑ νi) também será a mesma em cada solução. Portanto, a equação da conservação de massa pode ser descrita como: LT = LF + (∑ νi ) PT (38) Nesta equação LT , LF e PT são as concentrações do ligante total, ligante livre e proteína total, respectivamente. Os valores de LF e ∑ νi são constantes para diferentes conjuntos de pares de concentração do ligante total e da proteína total (LXµMT , PXµMT ). Para melhor visualização, os colchetes indicando as concentrações não foram inseridos. Para um dado LF , a intensidade de fluorescência observada, Sobs, é a soma algébrica das concentrações de todos os estados macromoleculares, Pi, ponderada pelo valor da intensidade de fluorescência correspondente desse estado, Si. A equação da conservação de sinal de uma amostra contendo ligante e proteína em dadas concentrações totais LT e PT , respectivamente, é dada por: Sobs = SFPF + ∑ SiPi (39) Nesta equação SF é o sinal da fluorescência molar da proteína livre, Si é o sinal da fluorescência molar do complexo, Pi é a concentração da proteína complexada com i ligantes ligados, e PF é a concentração da proteína livre. No caso da ligação de somente um ligante por proteína, esta equação geral se reduz à equação: Sobs = SFPF + SBPB (40) Os índices F e B, nesta equação, referem-se aos estados livres e ligados, respectivamente. A equação da conservação da massa para proteína pode ser descrita como: PT = PF + ∑ Pi (41) Isolando PF , obtém-se: PF = PT − ∑ Pi (42) 17 Pela definição da densidade de ligação νi (i moles de ligantes ligados por mol de macromolécula) [25]: νi = i Pi PT (43) Isolando Pi, obtém-se: Pi = νi i PT (44) Substituindo as equações 42 e 44 na equação 39, obtém-se: Sobs = SF ( PT − ∑(νi i PT )) + ∑ Si (νi i PT ) (45) Rearranjando: Sobs = SFPT − ∑ SF (νi i PT ) + ∑ Si (νi i PT ) (46) Sobs = SFPT + ∑[ (Si − SF ) (νi i )] PT (47) A porcentagem da supressão da intensidade de fluorescência (∆F ) pode ser descrita como: ∆F = ( Fo − F Fo ) ∗ 100% (48) Nesta equação Fo é a intensidade de fluorescência na ausência do supressor e F é a intensidade de fluorescência na presença do supressor (intensidade observada). Então, na notação utilizada nesta seção podemos reescrever a porcentagem da supressão da intensidade de fluorescência observada (∆Sobs) da seguinte forma: ∆Sobs ≡ ( SFPT − Sobs SFPT ) ∗ 100% ≡ SFPT − Sobs SFPT (49) Nesta equação SFPT e Sobs são as intensidades de fluorescência na ausência e presença do supressor, respectivamente. Substituindo a equação 47 na equação 49 obtém-se: ∆Sobs ≡ SFPT − ( SFPT + ∑[ (Si − SF ) ( νi i )] PT ) SFPT (50) Simplificando: ∆Sobs ≡ −∑ [ (Si − SF ) ( νi i )] PT SFPT (51) 18 ∆Sobs ≡ −∑ [ (Si − SF ) ( νi i )] SF (52) ∆Sobs ≡ ∑ (SF − Si) ( νi i ) SF (53) Portanto, ∆Sobs ≡ ∑ (∆Si) (νi i ) ≡ ∑( ∆Si i ) (νi) (54) Nesta equação ∆Si i é o grau médio de supressão por ligante ligado no complexo contendo i ligantes. Pode-se observar desta equação que ∆Sobs é função somente da distribuição densidade de ligação ( ∑ νi), desde que ∆Si i seja uma propriedade molecular intrínseca do sistema, ou seja, a função densidade de ligação (BDF) depende somente da distribuição densidade de ligação do ligante sobre a macromolécula ( ∑ νi). Portanto, ∑ νi deve ser a mesma para qualquer par de concentrações totais (LXµMT , PXµM T ) para as quais a porcentagem de supressão (∆Sobs) é constante. Desde que ∑ νi seja função única de LF , então o valor da concentração de ligante livre (LF ) no mesmo grau de saturação (∆Sobs) deve também ser constante [25]. Os pares das concentrações (LXµMT , PXµM T ) são determinados conforme descrito na seção 6.4 4.6.1 Estados Físicos da Macromolécula Para determinar os estados físicos (LF e ∑ νi) no caso de duas concentrações de macromolécula (por exemplo: 2µM e 4µM) utiliza-se a equação 38 e obtém: L2µM T = LF + (∑ νi ) P 2µM T (55) L4µM T = LF + (∑ νi ) P 4µM T (56) Subtraindo a equação 56 pela equação 55 obtém-se: L4µM T − L2µM T = (∑ νi ) P 4µM T − (∑ νi ) P 2µM T (57) Rearranjando: L4µM T − L2µM T = (∑ νi )( P 4µM T − P 2µM T ) (58) 19 Isolando ∑ νi: ∑ νi = L4µM T − L2µM T P 4µM T − P 2µM T (59) Isolando LF na equação 56 obtém-se: LF = L4µM T − (∑ νi ) P 4µM T (60) E substituindo a equação 59: LF = L4µM T − ( L4µM T − L2µM T P 4µM T − P 2µM T ) P 4µM T (61) Rearranjando: LF = L4µM T ( P 4µM T − P 2µM T P 4µM T − P 2µM T ) − ( L4µM T − L2µM T P 4µM T − P 2µM T ) P 4µM T (62) LF = ( P 4µM T L4µM T − P 2µM T L4µM T P 4µM T − P 2µM T ) − ( P 4µM T L4µM T − P 4µM T L2µM T P 4µM T − P 2µM T ) (63) LF = P 4µM T L4µM T − P 2µM T L4µM T − ( P 4µM T L4µM T − P 4µM T L2µM T ) P 4µM T − P 2µM T (64) LF = P 4µM T L2µM T − P 2µM T L4µM T P 4µM T − P 2µM T (65) Portanto, para uma dada porcentagem de supressão (∆Sobs) com dois conjuntos de pares de concentrações ((L2µM T , P 2µM T ) e (L4µM T , P 4µM T )), determinados pelo método BDF conforme descrito na seção 6.4 (Figura 13), obtém-se as constantes ∑ νi e LF com o auxílio das equações 59 e 65. 4.6.2 Scatchard A interação entre proteína e pequenas moléculas são geralmente expressas pelo modelo descrito por Scatchard [26]. Portanto, para determinar o número de sítios ligados (n) e a constante de afinidade (Ka) da interação por esse modelo utiliza-se os valores do ligante livre e da distribuição densidade de ligação (LF e ∑ νi) calculados pelo método BDF, conforme descrito anteriormente (Seção 4.6.1). 20 Após plotar o gráfico da ∑ νi LF versus ∑ νi, sem utilizar qualquer modelo a priori, e observar um comportamento linear (como no caso deste trabalho) utiliza-se a seguinte relação de Scatchard para o melhor ajuste [26]: ∑ νi = nKaLF 1 +KaLF (66) Rearranjando: 1∑ νi = 1 +KaLF nKaLF (67) 1∑ νi = 1 nKaLF + 1 n (68) 1 nKaLF = 1∑ νi − 1 n = n−∑ νi n ∑ νi (69) n ∑ νi nKaLF = n− ∑ νi (70) ∑ νi LF = Ka ( n− ∑ νi ) (71) ∑ νi LF = nKa −Ka (∑ νi ) (72) Portanto após este ajuste (Equação 72) pode-se determinar o número de sítios ligados e a constante de afinidade entre a proteína e o ligante. 4.7 Deslocamento do Marcador de Sítio Específico A análise do deslocamento do marcador de sítio é utilizada para identificar sob qual sítio da proteína é mais favorável o fármaco de interesse interagir. Neste estudo foram selecionadas três moléculas (Seção 5.3.2), as quais ligam-se em sítios específicos da proteína analisada (HSA). A supressão da intensidade de fluorescência da proteína na presença de cada molécula marcadora de sítio específico foi monitorada conforme o aumento da concentração do fármaco de interesse, como descrito na seção 5.3.2. 21 Estas análises qualitativas são comparadas com a medida controle, ou seja, com a supressão da intensidade de fluorescência da proteína na ausência de molécula marcadora de sítio. Portanto, somente, com aumento da concentração do fármaco de interesse [27]. 4.8 Comparação dos Métodos de Análise O coeficiente estequiométrico (n), ou número de sítios de ligação, pode ser determinado por dois métodos descritos acima, a partir da equação de reação de primeira ordem (Seção 4.4.2) e através da aplicação do método função densidade de ligação (BDF) (Seção 4.6) na relação de Scatchard. O valor da constante de associação também pode ser determinado por esses métodos, no primeiro foi denominada como constante de ligação (Kb) e no segundo método como constante de afinidade (Ka). A tabela a seguir (Tabela 1) compara, a priori, as duas equações da conservação da massa da proteína e do ligante nestes dois métodos analisados. E a última expressão é em realação à intensidade de fluorescência observada. Tabela 1: Comparação dos métodos de análise do número de sítios e da constante de associação (Seções 4.4.2 e 4.6). Equação de Reação (Primeira Ordem) Método BDF [PT ] = [LnP] + [PF ] [PT ] = ∑ [Pi] + [PF ] [LT ] = [LF ] [LT ] = [LF ] + ∑ νi[PT ] F ∝ [PF ] Sobs = SF [PF ] + ∑ Si[Pi] Portanto, desta análise comparativa, o método BDF é mais preciso em relação ao método utilizando a equação de reação de primeira ordem. 22 5 Materiais e Métodos 5.1 Compostos e Soluções As amostras de Piplartina C17H19NO5 (CAS number: 20069-09-4) foram cedidas pelos colaboradores da Universidade Federal do Paraíba (UFPB) e da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). A Albumina do Soro Humano de fração V (CAS number: 70024-90-7), Varfarina C19H16O4 (CAS number: 81-81-2), Ibuprofeno C13H18O2 (CAS number: 15687-27-1), Alaranjado de Metila C14H14N3O3SNa (CAS number: 547-58-0), fosfato de sódio dibásico (CAS Number: 7558-79-4), ácido cítrico anidro (CAS Number: 77-92-9) e cloreto de sódio (CAS Number: 7647-14-5) foram comprados da Sigma-Aldrich Chemical Co. e álcool metílico foi comprado da Dinâmica Química Contemporânea LTDA. Todos compostos utilizados foram de grau de reagente analítico. Água ultrapura foi preparada por um sistema de purificação de água (Direct-Q UV-3) da Millipore. A Albumina do Soro Humano (MM = 66.5kDa) foi diluída em solução aquosa de tampão fosfato (MM = 141.96g/mol) de 50mM, contendo 150mM de cloreto de sódio dibásico (MM = 58.44g/mol) e o pH 7.0 foi ajustado com ácido cítrico anidro (MM = 192.12g/mol). As soluções estoques de piplartina (MM = 317.3g/mol), varfarina (MM = 308.33g/mol), ibuprofeno (MM = 206.28g/mol) e alaranjado de metila (MM = 327.33g/mol) foram preparados em álcool metílico. 5.2 Espectroscopia de Absorção Molecular UV-Visível O espectro de absorção UV-Vis foi coletado no espectrofotômetro Cary-3E (Varian, Palo Alto, CA) à temperatura ambiente (298K), controlado por ar condicionado e monitorado por termômetro, equipado com lâmpadas de tungstênio e deutério. Duas cubetas de quartzo, cada uma com caminho óptico igual a 10 mm, foram utilizadas nos experimentos. Os espectros foram coletados varrendo os comprimentos de onda entre 200 e 500 nm, com tempo de integração de 0.333 s. O software Cary foi utilizado para coletar os dados medidos. Com esta técnica pode-se determinar as concentrações das soluções estoques dos compostos citados acima. 23 5.3 Espectroscopia de Fluorescência Todas medidas foram realizadas no espectrofluorímetro de estado estacionário ISS PC1 (Champaign, IL, USA) equipado com banho térmico Neslab RTE-221 e lâmpada de xenônio. Uma cubeta de quartzo de 3 ml e com caminho óptico de 10 mm foi utilizada nos experimentos. A largura das fendas de excitação e de emissão foram ajustadas para o comprimento de 8.0 nm. Os aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina) são capazes de absorver luz na faixa do UV, mas com o comprimento de onda em 295 nm evita-se a excitação dos resíduos de tirosina e de fenilalanina e proporciona a excitação do único resíduo de triptofano da HSA (Trp214, no subdomínio IIA) [11,20]. Portanto o comprimento de onda de excitação utilizado foi 295 nm e os espectros de emissão obtidos foram na faixa de 305 à 500 nm, com resolução de 1.0 nm, e cada ponto de emissão coletado é a média de 10 acumulações. O software Vinci foi utilizado para coletar os dados medidos. 5.3.1 Estudos da Supressão de Fluorescência Na análise do mecanismo de supressão de fluorescência e determinação das constantes de ligação, pequenas alíquotas de piplartina foram adicionadas na solução de HSA (3.0 mL) a 4.0 µM . A concentração de piplartina variou de 0 a 6.0 µM com incrementos de 0.4 µM . As medidas foram realizadas a temperaturas de 288, 298 e 308K. Na análise da função de densidade de ligação (BDF), pequenas alíquotas de piplartina foram adicionadas nas soluções de HSA (3.0 ml) a 2.0 e 4.0 µM , as concentrações de piplartina variaram de 0 a 3.6 µM e de 0 a 5.6 µM , respectivamente, com incrementos de 0.4 µM . As medidas foram realizadas a temperatura fixa (298K). Em todas os experimentos, o volume final de álcool metílico no tampão foi ≤ 0.5%, a correção da fluorescência de fundo foi obtida pela subtração do espectro de emissão do tampão fosfato de cada espectro medido. As correções dos efeitos de filtragem interna também foram realizadas, conforme descrito na seção 4.3. 5.3.2 Estudos do Deslocamento de Marcadores de Sítio Na análise de deslocamento de sítio marcado, a molécula marcadora (4.0 µM) foi titulada em solução de HSA (4.0 µM) e mantido durante 1 hora com agitador magnético. Pequenas 24 alíquotas de piplartina foram adicionadas nesta solução de 3.0 ml, as concentrações de piplartina variaram de 0 a 7.5 µM com incrementos de 0.84 µM . Os marcadores de sítio específico da HSA utilizados neste estudo foram: varfarina, ibuprofeno e alaranjado de metila que são os marcadores dos subdomínios IIA (site 1), IIIA (site 2) e IB (site 3), respectivamente (Figura 8) [16]. As medidas foram realizadas a uma única temperatura (298 K), as proporções das concentrações de proteína por molécula marcadora foram 1:0 e 1:1, na ausência e na presença de cada marcador, respectivamente. Nos experimentos, o volume final de álcool metílico no tampão foi ≤ 0.6% e a correção de fluorescência de fundo foi realizada. Figura 8: Representação qualitativa da realização dos experimentos de deslocamento do marcador de sítio (varfarina - IIA, ibuprofeno - IIIA e alaranjado de metila - IB) na albumina do soro humano (HSA) pela adição de piplartina (PPTN). 25 6 Resultados e Discussões 6.1 Mecanismo de Supressão de Fluorescência A interação entre piplartina e HSA foi investigada através da supressão da intensidade de fluorescência da HSA pela adição de diferentes concentrações de piplartina (Figura 9), conforme descrito na seção 5.3.1. Os mecanismos de supressão são geralmente classificados como dinâmicos (desativação do estado excitado por colisão) ou estáticos (formação do complexo de estado fundamental), para distingui-los através da fluorescência de estado estacionário é analisada sua dependência com a temperatura utilizando a equação de Stern-Volmer (Equação 16) descrita na seção 4.4 [20, 21]. Figura 9: Espectro de emissão da HSA (4µM) na ausência (a) e presença de piplartina (b-p: 0.4-6.0µM) (pH 7.0, T = 298K e λex=295nm), a seta indica o progresso da titulação, com incrementos de 0.4µM. A linha tracejada é o espectro de emissão do tampão fosfato. Inserção: estrutura química da piplartina. Pela análise de Stern-Volmer, apresentada pela fração Fo F versus [PPTN ] (Figura 10), obtém-se a constante de Stern-Volmer para cada temperatura estudada, as quais estão indicadas a seguir, na tabela 2. 26 Figura 10: Análise de Stern-Volmer para a supressão da intensidade de fluorescência da HSA pela titulação de PPTN em 288, 298 e 308K. R é o coeficiente de correlação. Na tabela 2 pode-se observar que ao aumentar a temperatura há uma diminuição das constantes de Stern-Volmer (KSV ), ou seja, as temperaturas (T ) e as constantes de Stern-Volmer são inversamente proporcionais, o que indica o mecanismo de supressão como estático, portanto a formação do complexo PPTN-HSA ocorre [20]. Tabela 2: Constante de supressão de Stern-Volmer (KSV ) da interação PPTN-HSA em pH 7.0 para as temperaturas (T ): 288, 298 e 308K. T(K) KSV (x104 M−1) 288 8.9 298 6.6 308 4.7 Os coeficientes de correlação são ≥ 0.997. 6.2 Determinação da Constante de Ligação A seção anterior (Seção 6.1) indicou o mecanismo de supressão estático, assim, para determinar as constantes de ligação, em condições de equilíbrio entre moléculas livres e 27 ligadas, aplicou-se a equação 33 (Seção 4.4.2) aos dados de supressão, obtidos conforme descrito na seção 5.3.1. Desta forma, com gráfico duplo-logarítmico apresentado na figura 11 determinou-se o número de sítio de ligação (n) e a constante de ligação (Kb), esses valores são indicados na tabela 3 para cada temperatura estudada (288, 298 e 308K). Figura 11: Gráfico duplo logarítmico em diferentes temperaturas (288, 298 e 308K) para interação entre piplartina e HSA de acordo com a equação 33 ([HSA]=4µM, [PPTN]=0.8 à 6.0µM com incrementos de 0.4µM em pH 7.0). R é o coeficiente de correlação. Tabela 3: Constante de ligação (Kb) e número de sítios ligados (n) da interação entre HSA e PPTN em pH 7.0 e 288, 298 e 308K. T(K) Kb (x105 M−1) n 288 3.93 1.12 298 1.81 1.08 308 0.47 1.00 Os coeficientes de correlação são ≥ 0.992. 28 6.3 Análises Termodinâmicas e Forças de Ligação Para determinar as forças moleculares que contribuem na estabilização das interações, analisa-se os parâmetros termodinâmicos da ligação [24]. A energia livre de Gibbs (∆Go) foi determinada utilizando a equação 34 (Seção 4.5), juntamente com as constantes de ligação (Kb), obtidas na seção anterior (Seção 6.2), a cada temperatura (T), conforme apresentada na tabela 4. A relação de van’t Hoff (Equação 37 - Figura 12) foi utilizada para estimar o valor da entalpia (∆Ho), apresentado a seguir (Tabela 4). Figura 12: Análise de van’t Hoff (Equação 37) em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K). R é o coeficiente de correlação. Utilizando a equação 35 (Seção 4.5) e os valores ∆Go e ∆Ho obtidos, determinou-se os valores T∆S (Tabela 4). Portanto, destes resultados, tem-se que a energia livre de Gibbs negativa (∆Go < 0) indica que a interação PPTN-HSA ocorre espontaneamente. A principal contribuição para energia livre de Gibbs foi devido a uma parte entálpica maior, juntamente com uma parte entrópica menor, portanto, a formação do complexo é denominada entalpicamente dirigida. 29 Tabela 4: Parâmetros termodinâmicos (variação na energia livre de Gibbs (∆Go), entalpia (∆Ho) e entropia (∆So)) da interação HSA-PPTN em pH 7.0 e 288, 298 e 308K. T(K) ∆Ho(kJ mol−1) ∆Go(kJ mol−1) T∆So(kJ mol−1) 288 -78.1 -30.8 -47.3 298 -29.9 -48.2 308 -27.5 -50.6 O coeficiente de correlação é 0.940. Conforme descrito por Ross e Subramanian no artigo de 1981 "Thermodynamics of Protein Association Reactions: Forces Contributing to Stability"as variações entálpica e entrópica negativas (∆Ho < 0 e ∆So < 0) indicam que as forças dominantes na interação são ligações de hidrogênio e interações de van der Waals, portanto no complexo PPTN-HSA essas forças são as responsáveis por estabilizar a interação [24]. 6.4 Método Função Densidade de Ligação Para obter informações mais precisas sobre a afinidade da piplartina pela HSA e a estequiometria da ligação utilizou-se o método BDF (Seção 4.6). As medidas foram realizadas conforme descrito na seção 5.3.1. Na seção 4.6 foi determinado que a porcentagem de supressão observada (∆Sobs) é função somente da distribuição densidade de ligação ( ∑ νi) (Equação 54). Portanto, para um mesmo valor de ∆Sobs em diferentes concentrações de proteína total (PT ), tem-se que os valores da distribuição densidade de ligação ( ∑ νi) e da concentração de ligante livre (LF ) são constantes para diferentes conjuntos de pares de concentração do ligante total e da proteína total (LXµMT , PXµMT ) [27]. Para determinar estes conjuntos de pares de concentrações analisou-se a porcentagem de supressão da intensidade de fluorescência da HSA (∆Sobs), equação 49, conforme o aumento da concentração da piplartina ([PPTN]) (Figura 13). Nesta figura, a linha horizontal que intersepta as duas curvas indica o valor da porcentagem de supressão. A interseção dessa linha horizontal com cada curva de titulação indica os dois conjuntos de valores: 30 (L2µM T , P 2µM T ) e (L4µM T , P 4µM T ), quando LF e ∑ νi são constantes. Portanto, duas equações de conservação de massa (Equações 55 e 56) podem ser escritas para cada porcentagem de supressão observada, e essas soluções determinam os valores constantes: LF e ∑ νi, conforme descrito na seção 4.6.1 (Equações 59 e 65) [27]. Figura 13: Porcentagem de supressão da intensidade de fluorescência para duas concen- trações diferentes de HSA (2.0 e 4.0µM) na presença de piplartina (pH 7.0, T = 298K e λex=295nm); L2µM T e L4µM T representam as concentrações de ligante total. Após determinar os valores de LF e ∑ νi (Equações 59 e 65) pode-se construir o gráfico de Scatchard (Figura 14), o qual não utilizou qualquer modelo de ligação a priori. Desta análise obteve-se uma isoterma de forma linear (Figura 14) que, consequentemente, foi ajustada utilizando a equação da relação clássica de Scatchard (Equação 72), conforme descrito na seção 4.6.2 [26]. 31 Figura 14: Análise de Scatchard para determinar a constante de afinidade (Ka) e o coeficiente estequiométrico (n) de acordo com a equação 72; os valores encontrados foram 4.5 x 106M−1 e 1.03, respectivamente. ∑ νi é a distribuição média da densidade de ligação do ligante e R é o coeficiente de correlação. Pela análise de Scatchard obteve-se os valores para a constante de afinidade piplartina- HSA (Ka) e o coeficiente estequiométrico da ligação (n) como: 4.5 x 106M−1 e 1.03, respectivamente, em 298K. As constantes de associação (afinidade ou ligação) das interações reversíveis entre drogas e proteínas variam de 104 a 106M−1 [28]. Portanto, isto sugere que a interação HSA-PPTN é reversível. 6.5 Deslocamento do Marcador de Sítio A HSA possui três sítios específicos de ligação de drogas, denominados sítio I, II e III. Esses sítios são bem definidos na literatura e nos ajuda a determinar sobre qual sítio da HSA a piplartina prefere se ligar. As medidas foram realizadas conforme descrito na seção 5.3.2. Varfarina, ibuprofeno e alaranjado de metila foram utilizados para marcar os sítios do subdomínio IIA (sítio 1), IIIA (sítio 2) e IB (sítio 3) na HSA, respectivamente [11,16]. A taxa da supressão de fluorescência do complexo HSA-marcador na ausência (Fo) e na presença (F ) de piplartina foi comparada qualitativamente na presença de cada marcador 32 de sítio específico. Esta taxa de supressão de fluorescência varia na presença de varfarina e permanece a mesma na presença dos marcadores ibuprofeno e alaranjado de metila, quando comparada na ausência de marcador (Figura 15), a representação esquemática da realização dos experimentos está apresentada na figura 16. O deslocamento da taxa de supressão do complexo varfarina-HSA depois da adição de piplartina indica que a piplartina altera o microambiente da interação varfarina-HSA. Portanto, piplartina se liga na HSA sobre o sítio 1 (subdomínio IIA), preferencialmente. Este sítio de ligação único corrobora com os resultados obtidos pelo método BDF na seção anterior (Seção 6.4) Figura 15: Análise do deslocamento do marcador de sítio pela piplartina. Monitorando a emissão de fluorescência da HSA ([HSA]=4.0µM, T = 298K e λex=295nm) na ausência (�) e na presença de (•) ibuprofeno, (H) alaranjado de metila, (N) varfarina ([marcador]=4.0µM) conforme titulações de piplartina ([PPTN]=0.0-7.5µM). 33 Figura 16: Representação qualitativa dos experimentos de deslocamento do marcador de sítio (varfarina - IIA, ibuprofeno - IIIA e alaranjado de metila - IB) na albumina do soro humano (HSA) pela adição de piplartina (PPTN). . 34 7 Conclusões Este estudo descreve a interação entre a piplartina e a albumina do soro humano através da técnica de espectroscopia de fluorescência de estado fundamental. Pelas análises dos dados de fluorescência determinou-se o mecanismo de supressão como estático, ou seja, o complexo HSA-PPTN foi formado. As análises da contribuição energética são as principais evidências para descrever o modo de ligação; portanto, os parâmetros termodinâmicos foram determinados e o resultado sugere que o processo de ligação é espontâneo (∆Go < 0) e que a estabilidade do complexo HSA-PPTN ocorre devido a ligações de hidrogênio e interações de van der Waals (∆Ho < 0 and ∆So < 0) [24]. No método função densidade de ligação (BDF) o ajuste da isoterma de ligação propõe que para cada molécula de HSA deve haver uma única molécula de PPTN ligada; esse resultado foi também confirmado pela análise do deslocamento de sítio marcado que indicou o local de ligação da PPTN na HSA como o sítio I (subdomínio IIA). A afinidade entre a piplartina e a HSA sugere uma condição adequada para a distribuição eficiente de PPTN no sistema circulatório do sangue para atingir os órgãos alvo [28]. Deste modo, este conjunto de dados experimentais que descrevem a interacção entre PPTN e HSA complementa a informação obtida em estudos farmacocinéticos de PPTN [29]. 35 Referências [1] C. K. Atal and J. N. Ojha. Studies on the genus Piper. Part IV. Long peppers of Indian commerce. Economic Botany, 19(2):157–164, April 1965. [2] Virinder S. Parmar, Subhash C. Jain, Kirpal S. Bisht, Rajni Jain, Poonam Taneja, Amitabh Jha, Om D. Tyagi, Ashok K. Prasad, Jesper Wengel, C. E. Olsen, and Per M. Boll. Phytochemistry of the genus Piper. Phytochemistry, 46(4):597–673, October 1997. [3] Lee A. Dyer, Joe Richards, and Craig D. Dodson. Isolation, synthesis, and evolutionary ecology of piper amides. In Piper: A Model Genus for Studies of Phytochemistry, Ecology, and Evolution. Springer US, 2004. [4] Per M. Boll, Jesper Hansen, Ole Simonsen, and Niels Thorup. Synthesis and molecular structure of piplartine (=piperlongumine). Tetrahedron, 40(1):171–175, 1984. [5] Daniel P. Bezerra, Marne C. 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Química Nova, 35(3):460–465, 2012. 39 Interaction of Piplartine with Human Serum Albumin by Spectroscopic Techniques Nayara Sousa de Alcântaraa, Marinônio Lopes Cornélioa aDepartamento de F́ısica, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), UNESP, São José do Rio Preto, SP, Brazil Abstract Piplartines are alkaloid amides present in roots and stems of different pep- per species which have promising pharmacological properties like anticancer. Some recent studies had determined pharmacokinetic parameters of piplar- tine in rat blood plasma but without pointing any molecular target or describ- ing the physicochemical forces of the interaction. Here, it was investigated the interaction between piplartine and human serum albumin (HSA) which is the predominant protein in blood plasma. It was employed the fluores- cence spectroscopy to observe the complex HSA-piplartine formation. The thermodynamic parameter analysis indicates that the process occurs sponta- neously and it is enthalpically driven; the affinity constant suggests that this interaction is reversible. It was indicated by the binding density function method and by the displacement analysis that the piplartine binds on HSA at single site, which was determined like the IIA sub-domain. Keywords: Piplartine, Piperlongumine, Human Serum Albumin, Fluorescence Spectroscopy 1. Introduction1 Piplartines, also known as piperlongumine, 5,6-dihydro-1- [(2E) -1-oxo-3-2 (3,4,5-trimethoxyphenyl) -2-propen-1-yl] -2 (1H) -pyridinone, are biologically3 active compounds classified as alkaloid amides which are presents in roots and4 stem barks of different peppers species, of the Piperaceae family, genus Piper,5 as Long pepper (Piper longum L.), Pimenta-d’arda (Piper tuberculatum J. (de6 Jacq.)), among others [1, 2, 3]. In vivo and In vitro studies demonstrate that7 these compounds have various promising pharmacological properties as an-8 tidepressant, anxiolytic, genotoxic, cytotoxic, antiangiogenic, antimetastatic,9 Preprint submitted to Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis March 7, 2017 Anexo I - Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão) antitumoral, among others [1, 3, 4, 5]. Due the piplartine (PPTN) be an im-10 portant biological agent, the number of the publications about its beneficial11 health properties are increasing, along with studies in vivo about techniques12 to determine pharmacokinetic parameters of this compound in rat plasma13 [6]; but so far almost no paper describes the interaction between piplartine14 and molecular targets.15 The molecular target chosen in this study was the human serum albu-16 min (HSA), which predominates in blood plasma, it is the carrier of several17 endogenous (e.g. fatty acids, hormones, toxic metabolites, metals) and ex-18 ogenous compounds (e.g. drug molecules) [7], it is a monomeric globular19 protein and consists of three homologous α-helical domains (I, II and III)20 which are further divided into two subdomains (A and B); of 585 amino acid21 residues has only one tryptophan at position 214 (Trp 214) on the IIA sub-22 domain [8]. Studies suggest that the major specific drugs binding sites on23 HSA are located in the hydrophobic cavities in subdomains IIA and IIIA,24 namely, site I and II, respectively [9, 8]. But an additional drug binding area25 is found in subdomain IB, named as site III, the third major site of HSA26 [10].27 In this study was performed the characterization of interaction of this28 compound with the main protein in blood plasma, human serum albumin29 (HSA), by fluorescence spectroscopy of emission. Physicochemistry informa-30 tion about complex formed could be obtained, like the thermodynamic prop-31 erties, site numbers and affinity constant through of the monitoring nearby32 of microenvironment of the intrinsic fluorophore (Trp 214). The binding33 region of the piplartine on HSA was found with the studies of the drug dis-34 placement in presence of three markers, like warfarin, ibuprofen and methyl35 orange [8, 10].36 Therefore, describe the HSA-PPTN interaction is of pharmaceutical in-37 terest, because the binding parameters between macromolecule and ligand38 (e.g. drug’s affinity for the protein, number of drug binding sites on the pro-39 tein, location of the effect site) are important factors in pharmacodynamic40 and pharmacokinetic, i.e., under pharmacological effect of drug. Studies41 about drug-HSA interaction has helped also for therapeutic and diagnostic42 purposes [7, 11].43 2 2. Materials and Methods44 2.1. Materials and Solutions45 Human serum Albumin fraction V (CAS number: 70024-90-7), war-46 farin C19H16O4 (CAS number: 81-81-2), ibuprofen C13H18O2 (CAS num-47 ber: 15687-27-1), methyl orange C14H14N3O3SNa (CAS number: 547-58-48 0), dibasic sodium phosphate, citric acid and sodium chloride were pur-49 chased from Sigma-Aldrich Chemical Co. and methyl alcohol was purchased50 from Dinâmica Qúımica Contemporânea LTDA. Piplartine C17H19NO5 (CAS51 number: 20069-09-4) was provided by collaborators (Daniel P. Bezerra and52 José M. Barbosa Filho). In the experiments all chemicals were of analytical53 reagent grade, and ultrapure water was prepared by a Direct-Q UV-3 water54 purification system from Millipore. HSA was dissolved in aqueous phosphate55 buffer solution of 50mM, containing 0.15M of sodium chloride and the pH 7.056 was adjusted with citric acid. The stock solutions of the piplartine, warfarin,57 ibuprofen and methyl orange were prepared in absolute methyl alcohol and58 the concentrations were determined spectrophotometrically.59 2.2. UV-Vis Absorbance Spectroscopy60 Uv-Vis absorption spectrum was carried out in a Cary-3E spectropho-61 tometer (Varian, Palo Alto, CA) at room temperature (298 K), controlled62 by air conditioning and monitored by thermometer, equipped with tung-63 sten and deuterium lamps. Two quartz cuvettes, each with 10 mm optical64 path length, were used in the experiments. UV-Vis absorption spectra were65 recorded in the wavelength range of 200-500 nm, with an integration time of66 0.333 s. The Cary software was used to collected the measured data.67 2.3. Fluorescence Spectroscopy68 All the fluorescence measurements were performed in an ISS PC1 steady-69 state spectrofluorimeter (Champaign, IL, USA) equipped with a Neslab RTE-70 221 thermostat bath and xenon lamp. A 3 ml quartz cuvette with 10 mm71 optical path length was used in the experiments. The widths of both ex-72 citation and emission slits were set to 8.0 nm. The aromatic amino acids73 (tryptophan, tyrosine and phenylalanine) are able of absorb light in range74 UV, but with the excitation wavelength at 295 nm it is avoided the excitation75 of phenylalanine and tyrosine residues and provides the excitation of the sin-76 gle tryptophan residue of HSA (Trp214, in subdomain IIA) [8, 12]. Thus the77 excitation wavelength was 295nm and the emission spectra were obtained78 3 in the wavelength range of 305-500 nm, with 1.0 nm resolution step, and79 each collected emission point is the average of 10 accumulations. The Vinci80 software was used to collected the measured data.81 2.3.1. Fluorescence Quenching Studies82 In fluorescence quenching mechanism analysis and determination of bind-83 ing constants, small aliquots of piplartine were added in the HSA solution84 (3.0ml) at 4.0 µM. Piplartine concentration varied from 0 to 6.0 µM with85 increments of 0.4 µM. The measurements were performed at temperatures86 of 288, 298 and 308K. In binding density function (BDF) analysis, small87 aliquots of piplartine were added in the HSA solutions (3.0ml) at 2.0 and88 4.0 µM, the piplartine concentrations varied from 0 to 3.6 µM and form 089 to 5.6 µM, respectively, with increments of 0.4 µM. The measurements were90 performed at fixed temperature (298K). In all experiments, the final volume91 of methyl alcohol in the buffer was ≤ 0.5%, the background fluorescence92 correction was obtained by the subtraction of spectrum of emission of the93 phosphate buffer from each measured spectra and the corrections of the inner94 filter effects also were realized [13].95 2.3.2. Site Marker Displacement Studies96 In displacement analysis, the marker (4.0µM) was titrated on HSA so-97 lution (4.0µM) and kept for 1 hour with magnetic stirrer. Small aliquots98 of piplartine were added in this solution of 3.0ml, piplartine concentrations99 varied from 0 to 7.5µM with increments of 0.84µM. The site-specific markers100 of HSA used in this study were: warfarin, ibuprofen and methyl orange that101 are the markers of the subdomains IIA (site 1), IIIA (site 2) and IB (site102 3), respectively [10]. The measurements were performed at a single temper-103 ature (298K), the ratios of protein per marker molecule were 1:0 and 1:1, in104 the absence and presence of each marker, respectively. In experiments, the105 final volume of methyl alcohol in the buffer was ≤ 0.6% and the fluorescence106 background correction was realized.107 3. Results and Discussions108 3.1. Fluorescence Quenching Mechanism109 The interaction between piplartine and HSA was investigated trough flu-110 orescence quenching of HSA by add of different concentration of piplartine111 4 (Figure 1 - A). This phenomena of fluorescence intensity decrease is associ-112 ated with various process of molecular interactions, but the quenching mech-113 anisms are generally classified either as dynamic (deactivation of excited-114 state by collision) or static (formation of ground-state complex). In both115 cases the fluorescence intensity quenching is proportional to concentration of116 quencher, thus to distinguish the mechanism using the steady-state fluores-117 cence is necessary analyze its dependence with the temperature [12, 13]. The118 PPTN-HSA quenching mechanism was found with aid of the Stern-Volmer119 equation (Equation 1) [12]:120 F0 F = 1 +KSV [Q] (1) In this equation, F0 and F are the steady-state fluorescence intensities of121 HSA in the absence and presence of the piplartine (quencher), respectively.122 KSV is the Stern-Volmer constant and [Q] is the concentration of piplartine.123 From the results in figure S1 of Supporting Information and table 1 was124 observed that when the temperature increases there is a decrease of the125 Stern-Volmer constants, i.e., the temperatures and Stern-Volmer constants126 are inversely proportional, which indicate the quenching mechanism as static,127 therefore the formation of the complex PPTN-HSA occurs [12].128 3.2. Determination of Binding Constants129 The previous section (Section 3.1) indicated the static quenching mecha-130 nism, thus for determine the binding constants, at conditions of equilibrium131 between free and bound molecules, was used the equation (Equation 2) [14]:132 log F0 − F F = logKb + n log [PPTN ] (2) In this equation, F0 and F are the steady-state fluorescence intensities of133 HSA in the absence and presence of the piplartine, respectively. [PPTN ],134 n and Kb are the piplartine concentration, binding site number and binding135 constant, respectively. The equation 2 was applied to the quenching data136 described in section 2.3.1. Thus, the double-logarithmic plots showed in137 figure 1 - B determines the binding site number (n) and binding constant138 (Kb), this values are indicated in table 1 for each temperature studied (288,139 298 and 308K).140 5 Table 1: Stern-Volmer quenching constant (KSV ), binding constant (Kb) and binding site numbers (n) of the interaction between HSA and PPTN at pH 7.0 and 288, 298 and 308K. T(K) KSV (x104 M−1) Kb (x105 M−1) n 288 8.9 3.93 1.12 298 6.6 1.81 1.08 308 4.7 0.47 1.00 The correlation of coefficients are ≥ 0.992. 3.3. Thermodynamic Analyses and Binding Forces141 The molecular forces that contribute to stabilize the interactions are gen-142 erally hydrogen bonds, van der Waals, hydrophobic and electrostatic interac-143 tions. The interaction mode may be indicated through of the thermodynamic144 parameters analyses of the binding (Gibbs free energy (∆Go), enthalpy (∆Ho)145 and entropy (∆So) changes) [15]. To determine the Gibbs free energy used146 the equation:147 ∆Go = −RT lnKb (3) In this equation, T and R are the temperature and universal constant of148 gases, respectively. Kb is the binding constant, obtained in previous section149 (Section 3.2), at each temperature (T). The van’t Hoff relationship (Equa-150 tion 4, Figure 1 - B (insert)) were analyzed to estimate the thermodynamic151 parameters:152 lnKb = −∆Ho RT + ∆So R (4) Using the equations 3 and 4, and the ∆G and ∆H values, obtained above,153 were determined the T∆S values.154 The thermodynamic parameters were showed in table 2. The negative155 free energy (∆Go < 0) indicated that the interaction PPTN-HSA is a spon-156 taneous process. The main source of the free energy value was derived a157 larger enthalpic part together with a smaller entropic part, therefore, the158 formation of complex is enthalpically driven. The analyses of the energetic159 contributions, negative enthalpy (∆Ho < 0) and negative entropy (∆So < 0)160 changes, indicated that the dominate forces in the binding between piplartine161 and HSA are hydrogen bonds and van der Waals interactions [15].162 6 Figure 1: A - Emission spectra of HSA (4µM) in absence (a) and presence of the piplartine (b-p: 0.4-6.0µM) (pH 7.0, T = 298K and λex=295nm), the arrow indicates the progress of titration, with increments of 0.4µM. The dashed line is the emission spectrum of phosphate buffer. Insert: chemical structure of piplartine. B - Double-logarithm plots at different temperatures (288, 298 and 308K) for interaction between piplartine and HSA according to equation 2 ([HSA]=4µM, [PPTN]=0.8 to 6.0µM with increments of 0.4µM at pH 7.0). Insert: van’t Hoff plot at three temperatures (288, 298 and 308K). 7 Table 2: Thermodynamic parameters (Gibbs free energy (∆Go), enthalpy (∆Ho) and entropy (∆So) changes) of the HSA-PPTN interaction at pH 7.0 and 288, 298 and 308K. T(K) ∆Ho(kJ mol−1) ∆Go(kJ mol−1) T∆So(kJ mol−1) 288 -78.1 -30.8 -47.3 298 -29.9 -48.2 308 -27.5 -50.6 The correlation coefficient is 0.940. 3.4. Binding Density Function Method163 The BDF method was used to obtain more accurate information about164 the affinity of the piplartine for the HSA and the stoichiometry of binding.165 This method depends of the binding density distribution of drug on the pro-166 tein. The measurements were performed according to section 2.3.1 at single167 temperature (298K). In equilibrium, the average number of ligands bound168 per protein ( ∑ νi) is determined by the free ligand concentration (LF ), i.e.,169 if the free ligand concentration (LF ) is the same for two (or more) solutions170 at different total protein concentration (PT ), then the average ligand binding171 density distributions ( ∑ νi) also will be the same in each solution. Thus, the172 mass conservation equation (Equation 5) was describe as [16]:173 LT = LF + (∑ νi ) PT (5) In this equation, LT , LF and PT are the total ligand, free ligand and total174 protein concentrations, respectively. The values of LF and ∑ νi will be con-175 stant for different set of concentration pairs of total ligand and total protein176 (LXµMT , PXµM T ) at each percent quenching observed [16]. To determine this177 set of concentration pairs, the percent quenching of fluorescence intensity178 from HSA (∆Sobs) was analyzed as the increase of piplartine concentration179 ([PPTN ]) (Figure 2 - A).180 ∆Sobs ≡ SFPT − Sobs SFPT (6) In this equation, SFPT and Sobs are the signal form fluorescence intensi-181 ties of HSA in the absence and presence of the piplartine, respectively. In182 figure 2 - A, the horizontal line intersecting both curves indicate the value183 of the percent quenching (∆Sobs). The intersection of this horizontal line184 with each titration curve indicate the two sets of values: (L2µM T , P 2µM T ) and185 8 (L4µM T , P 4µM T ), when LF and ∑ νi are constants. Thus, two mass conser-186 vation equations (Equation 5) can be written for each percent quenching187 observed, and these solutions determine the constant values: LF and ∑ νi188 [16, 17].189 The Scatchard plot (( ∑ νi)/LF x ( ∑ νi)) was built using the values190 founded previous (LF and ∑ νi), without the use of any binding model a191 priori (Figure 2 - B). A linear shape isotherm was obtained and consequently192 was fitted using the follow equation of the classical Scatchard relationship193 (Equation 7) [18]:194 ∑ νi LF = nKa −Ka (∑ νi ) (7) Where, the obtained values for affinity constant between piplartine-HSA195 (Ka) and stoichiometry number of the binding (n) were 4.5 x 106M−1 and196 1.03, respectively. The discrepancy between the results obtained to Ka and197 Kb may be due to approaches in the models used. The association constants198 of the reversible interactions between drugs and proteins range of 104 to199 106M−1 [19]. Therefore, this suggest that the interaction HSA-PPTN is200 reversible.201 3.5. Analysis of Site Maker Displacement202 The HSA have three specific sites of drugs linkage, denominated site I, II203 and III. These sites are well defined in the literature and helped to determine204 under which site of the HSA the piplartine prefers bind. The measurements205 were performed according to section 2.3.2. Warfarin, ibuprofen and methyl206 orange were used to marker the sites of the subdomains IIA (site 1), IIIA207 (site 2) and IB (site 3) on the HSA, respectively [8, 10]. The fluorescence208 quenching rate of HSA-marker complex in the absence (F0) and presence209 (F) of piplartine was compared qualitatively in presence of each specific site210 marker [17]. This fluorescence quenching rate varied in the presence of war-211 farin and remained the same in the presence of the markers ibuprofen and212 methyl orange, when compared at absence of the marker (Figure 3). The213 quenching rate displacement of the warfarin-HSA complex after addition pi-214 plartine indicates that piplartine change the microenvironment of the in-215 teraction warfarin-HSA. Therefore, piplartine does bind at HSA on site 1216 (subdomain IIA), preferentially. This single binding site corroborates to the217 obtained result by BDF method in previous section Section 3.4.218 9 Figure 2: A - Percent quenching of fluorescence intensity of the HSA (2.0 and 4.0µM) in the presence of the piplartine (pH 7.0, T = 298K and λex=295nm); L2µM T and L4µM T represent the total ligand concentrations. B - Scatchard plot for determinate the affinity constant (Ka) and the stoichiometric number (n) according to equation 7; the found values were 4.5 x 106M−1 and 1.03, respectively. ∑ νi is the average ligand binding density distribution and R is the correlation coefficient. 10 Figure 3: Analysis of piplartine site displacement. Monitoring fluorescence emission of HSA ([HSA]=4.0µM, T = 298K and λex=295nm) in the absence (�) and presence of (•) ibuprofen, (H) methyl orange, (N) warfarin ([marker]=4.0µM) at titrations of piplartine ([PPTN]=0.0-7.5µM). 4. Conclusion219 The interaction of piplartine (PPTN) with human serum albumin (HSA)220 was describe trough spectroscopic techniques, such as steady-state fluores-221 cence spectroscopic. By analyses of fluorescence data was determinate the222 quenching mechanism as static, i.e., the complex HSA-PPTN was formed.223 The analyses of the energetic contribution are the main evidences for de-224 scribe binding modes; the thermodynamic parameters were determined and225 suggested that the binding process is spontaneous (∆Go < 0) and that the226 stability of complex HSA-PPTN occur due to hydrogen bonds and van der227 Waals interactions (∆Ho < 0 and ∆So < 0) [15]. The fit of the binding228 isotherm (BDF method) propose that for each molecule of HSA there should229 be a single molecule of bound PPTN; this was confirmed by study of site230 marker displacement which indicated the binding site of the PPTN on HSA231 as the site I (subdomain IIA). The affinity between piplartine and HSA sug-232 gest an appropriate condition for efficient distribution of PPTN in the blood233 11 circulatory system to reach target organs [19]. Therefore, this experimental234 data set describing the interaction between PPTN and HSA complements235 the information obtained in pharmacokinetic studies of PPTN [6].236 5. Acknowledgments237 NSA was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient́ıfico238 e Tecnológico (CNPq), Brazil.239 240 241 REFERENCES242 [1] D. P. Bezerra, M. C. Vasconcellos, M. S. Machado, I. V. Villela, R. M.243 Rosa, D. J. Moura, C. Pessoa, M. O. Moraes, E. R. Silveira, M. A. S.244 Lima, N. C. Aquino, J. A. P. Henriques, J. Saffi, L. V. 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Otagiri, A Molecular Functional Study on the Interactions of Drugs308 with Plasma Proteins, Drug Metabolism and Pharmacokinetics 20309 (2005) 309–323.310 14 Supporting Information - Interaction of Piplartine with Human Serum Albumin by Spectroscopic Techniques Nayara Sousa de Alcântara and Marinônio Lopes Cornélio∗ Departamento de Física, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE) UNESP - Universidade Estadual Paulista São José do Rio Preto, SP, Brazil E-mail: mario@ibilce.unesp.br 1 Anexo II - Material Suplementar do Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão) Stern-Volmer Analysis The Stern-Volmer plot (Figure S1) at three different temperatures (288, 298 and 308K) showed that when the temperature increases there is a decrease of the Stern-Volmer con- stants, according to the equation 1 at appendix I. Where, F0 and F are the fluorescence intensities of HSA in the absence and presence of the piplartine, respectively, and [PPTN ] is the concentration of piplartine in figure S1. This results indicate that the quenching mechanism is static, i.e., occurs the formation of the complex PPTN-HSA. Figure S1: Stern-Volmer plot for the fluorescence intensity quenching of the HSA by titration of PPTN at 288, 298 and 308K. 2 Capa Sumário Lista de Abreviaturas Lista de Símbolos Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract Organização da Dissertação Introdução Piplartina Albumina do Soro Humano Motivação e Objetivos Princípios Espectroscópicos de Fluorescência Características Gerais Absorção de Luz e Lei de Beer-Lambert Filtragem Interna Supressão de Fluorescência Dinâmica Estática Termodinâmica da Interação Método Função Densidade de Ligação Estados Físicos da Macromolécula Scatchard Deslocamento do Marcador de Sítio Específico Comparação dos Métodos de Análise Materiais e Métodos Compostos e Soluções Espectroscopia de Absorção Molecular UV-Visível Espectroscopia de Fluorescência Estudos da Supressão de Fluorescência Estudos do Deslocamento de Marcadores de Sítio Resultados e Discussões Mecanismo de Supressão de Fluorescência Determinação da Constante de Ligação Análises Termodinâmicas e Forças de Ligação Método Função Densidade de Ligação Deslocamento do Marcador de Sítio Conclusões Referências Anexo I - Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão) Anexo II - Material Suplementar do Artigo Piplartina (Em Fase de Submissão)