Universidade Estadual Paulista Instituto de Biociências – Departamento de Farmacologia Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Tese de Doutorado “Estudo farmacológico e neuroquímico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e Citrus aurantium L.” Celso Acácio Rodrigues de Almeida Costa Tese apresentada ao Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp de Botucatu como requisito para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas (AC: Farmacologia). Orientadora: Profª. Drª. Mirtes Costa Botucatu 2011 Universidade Estadual Paulista Instituto de Biociências – Departamento de Farmacologia Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Tese de Doutorado “Estudo farmacológico e neuroquímico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e Citrus aurantium L.” Celso Acácio Rodrigues de Almeida Costa Tese apresentada ao Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp de Botucatu como requisito para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas (AC: Farmacologia). Orientadora: Profª. Drª. Mirtes Costa Botucatu 2011 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Divisão Técnica de Biblioteca e Documentação - Campus de Botucatu - UNESP Bibliotecária responsável: Sulamita Selma Clemente Colnago – CRB 8/4716 Costa, Celso Acácio Rodrigues de Almeida. Estudo farmacológico e neuroquímico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e Citrus aurantium L. / Celso Acácio Rodrigues de Almeida Costa. – Botucatu, 2011 Tese (doutorado) - Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2011 Orientadora: Mirtes Costa Capes: 21003009 1. Neuropsicofarmacologia. 2. Etnofarmacologia. 3. Essências e óleos essenciais - Uso terapêutico. Palavras-chave: Ansiedade; Camundongo; Citrus aurantium; Cymbopogon citratus; Depressão; Neuroquímica; Óleo essencial Celso Acácio Rodrigues de Almeida Costa “Estudo farmacológico e neuroquímico dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e Citrus aurantium L.” Tese apresentada ao Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp de Botucatu como requisito para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas (AC: Farmacologia). Comissão Examinadora: 1º Titular/Presidente: Profª. Drª. Mirtes Costa (UNESP/Botucatu) 2º Titular: Profª. Drª. Thereza Christina Monteiro de Lima (UFSC/Florianópolis) 3º Titular: Profº. Drº. Ricardo Luiz Nunes de Souza (UNESP/Araraquara) 4º Titular: Profª. Drª. Silvia Mitiko Nishida (UNESP/Botucatu) 5º Titular: Profº. Drº. Luiz Claudio Di Stasi (UNESP/Botucatu) Suplentes: 1º: Profº. Drº. Reinaldo Nóbrega Almeida (UFPB/João Pessoa) 2º: Profª. Drª. Cleopatra da Silva Planeta (UNESP/Araraquara) 3º: Profª. Drª. Clélia Akiko Hiruma-Lima (UNESP/Botucatu) Botucatu 2011 Auxílio Financeiro: FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) Processo nº 2006/07195-8 “Que riqueza não é, até entre os pobres, ser filho de bons pais." (Juan Luis Vives) Aos meus pais “E a pergunta que me vem, em tom de agradecimento, é: por que será que você aconteceu na minha vida? Não espero respostas, mas deixo-me aos seus cuidados.” (Fernanda Young) À Flávia – “Kalose” “Nenhum indício melhor se pode ter a respeito de um homem do que a companhia que freqüenta: o que tem companheiros decentes e honestos adquire, merecidamente, bom nome, porque é impossível que não tenha alguma semelhança com eles.” (Adam Parfrey) À Deus! Aos pequenos e nobres animais pela imprescindível contribuição dada a este trabalho. Antes de qualquer agradecimento, meu respeito! Aos grandes amigos que tive o prazer de conviver junto: Adriano e Érica, Fábio (Raridade), Gustavo (Babito), Lucas (K rrompido), Thiago (Mingo) e Uilian (Prumo). À moçada que está longe e ao mesmo tempo sempre perto: Fernando, Gabriel, Júlio, Manu.... À galerinha da Comissão do Workshop da Pós-Graduação!!! À moçada do “Lab. Clélia”, agregados e afins!!! Valeu Ariane (Sponja) pela companhia nos vários almoços e pelas boas risadas!!! Aos amigos que fiz no laboratório: Carlos (Rosquinha), Filipe (Carninha), Valéria, Thaís (Miss), Leandro (Flamb´s), Bruna (Tuba) e Vinícius. Obrigado por contribuírem no meu crescimento e por mostrarem como é bom (e porque não dizer difícil!) conviver com as diferenças. Muuuito obrigado pelos ótimos momentos que pudemos rir juntos! E claro, Valéria... valeu pelos muitos sábados e domingos passados no laboratório!!! Aos meus tios de São Paulo e, em especial, ao meu primo Alê que sempre abriu as portas de sua casa quando eu precisava ir pra São Paulo. À todos do Depto. de Farmacologia: Professores, Funcionários – Paulão, Luis/Purga, Cris e Flávia -, Estagiários, Pós-graduandos, que fizeram parte dessa caminhada. À moçado do “Lab. André” pelo empréstimo de material quando necessário! Juliana (Pupua), Ricardo (Nulo), Vanessa (Busilis), Enio e Fernanda. Ao pessoal do LaFit-Botu (“Lab. Di Stasi”) também pelo empréstimo de material e mão-de-obra sempre que preciso (certo, Léo?). Obrigado Aline, Ana, Léo e todos os outros alunos. À sessão de Pós-graduação: Luciene, Herivaldo, Davi e Luciana. E o cara das antigas: Serginho! Aos Professores de Música: Daniel (batera) e Hélião (baixo) – pelos momentos de descontração! “Music is food for the soul.” ♫ Aos bons amigos que fiz na pós: Léo, Walter, Rafael, Eduardo, Hélio (Ponpon) e família!!! Ao Profº Luis Fernando Barbisan (Depto. de Morfologia) e seu aluno (e grande amigo!) Lucas T. Bidinotto pelos belos trabalhos em parceria! À Profª Regina Takahira (Laboratório Clínico Veterinário da FMVZ/UNESP) pela disponibilidade e pelos trabalhos realizados em conjunto! Às moças que cuidam do Depto. de Farmacologia, em especial a “Janjan” - Valeu Janete!!! Ao pessoal do CIE (Centro de Isótopos Estáveis) pela colaboração, em especial ao Evandro, à Juliana Denadai e ao Prof. Ducatti (Tatão!). À Profª Drª Silvia M. Nishida pela amizade e pelos bons ‘papos de corredor’. Ao Prof. Dr. Jorge Camilo Flório do Depto. de Patologia da FMVZ/USP por estar sempre disposto a adaptar-se, de alguma forma, aos “imprevistos” de minhas visitas à USP. Grato pela dedicação e paciência! Aos professores da Banca, pelo aceite e disponibilidade: Profª. Thereza, Profº. Ricardo, Profª. Silvia, Profº. Di Stasi, Profº. Reinaldo, Profª Cleopatra e Profª. Clélia. À FAPESP pelo incentivo científico e suporte financeiro. À todos aqueles que, por um lapso, não foram aqui citados!!! Não tenham dúvida: este trabalho leva um pouco de todos vocês! “O professor medíocre expõe. O bom professor explica. O professor superior demonstra. O grande professor inspira!” (William Arthur Ward) Agradeço, primeira e especialmente, à minha Professora e Orientadora Drª Mirtes Costa, por pouco mais de 8 anos de um contínuo acompanhamento, pela amizade, compreensão e sabedoria. Meus mais sinceros agradecimentos! "Até hoje os cientistas discutem como a vida começou. Até hoje não se tem certeza de onde viemos. Os filósofos ainda querem entender quem somos. E existem umas duzentas teorias para onde vamos. Se a orientação sexual é definida pela genética. Porque você boceja quando alguém boceja. Os biólogos querem entender como os pássaros migram. E os nutricionistas se o ovo faz mal à saúde. Os economistas querem explicar a crise. E os cientistas como o cérebro funciona. Como você pode ver, não são as respostas que movem o mundo. São as perguntas!" (Criação da F/Nazca Saatchi & Saatchi para o Canal Futura) “...é coisa de primeiro mundo! Eu paro pra pensar e falo: - Que primeiro mundo é esse? De onde vem isso? Ou então quando alguém fala de alguma coisa negativa que acontece na nossa vida cotidiana: - Isso só acontece no Brasil! Eu tenho uma boa e uma má notícia! Praqueles que usam essa expressão e gostam do primeiro mundo: o primeiro mundo faliu!!! Em todos os sentidos. Faliu financeiramente! Faliu moralmente! Faliu eticamente! E agora vem a boa notícia: o primeiro mundo agora é aqui!!! ” (Miguel Nicolelis) Resumo Resumo: A depressão e a ansiedade representam algumas das mais comuns e proliferativas desordens mentais no mundo. Tradicionalmente se postula que ansiedade e depressão são desordens separadas e distintas. Entretanto, muitos estudos clínicos têm demonstrado uma grande sobreposição entre esses dois estados. Atualmente, a maioria dos transtornos de ansiedade é tratada com drogas que interferem, de modo mais ou menos seletivo, com a neurotransmissão gabaérgica, serotonérgica e/ou noradrenérgica. A depressão, por sua vez, tem seu tratamento fundamentado no aumento da disponibilidade de serotonina e/ou noradrenalina. As drogas disponíveis na clínica não são capazes de controlar estas desordens em boa parte dos pacientes e possuem efeitos colaterais importantes. Dessa forma, os múltiplos efeitos adversos das drogas disponíveis, e a sua eficácia limitada em uma considerável proporção de pacientes, justificam os esforços no sentido de se encontrar novas substâncias com potencial atividade no tratamento destas desordens. As espécies vegetais Cymbopogon citratus e Citrus aurantium apresentam este potencial, pois são utilizadas na medicina popular como calmante e sedativa. Resultados prévios demonstraram a presença de atividade ansiolítica no óleo essencial (OE) obtido de ambas as espécies. No presente trabalho o OE de C. citratus apresentou atividade ansiolítica resultante da interação com o complexo receptor GABA-benzodiazepínico na dose de 10 mg/kg após tratamento agudo (v.o.). Além disso, o tratamento concomitante com doses não efetivas de diazepam e OE demonstrou efeito sinérgico entre as duas preparações. Por sua vez, o OE de C. aurantium apresentou atividade ansiolítica na dose de 5 mg/kg (v.o.) mediada pelos receptores serotonérgicos do tipo 5-HT1A e, depois de 14 dias de tratamento, o OE apresentou efeito ansiolítico na dose de 1 mg/kg/dia. Não foram detectadas alterações neuroquímicas no córtex, estriado, hipotálamo e ponte após tratamento agudo, bem como não foram verificadas modificações histopatológicas e bioquímicas, exceto a redução nos níveis de colesterol dos animais tratados repetidamente com as espécies em estudo. O tratamento agudo ou repetido, para todas as doses testadas dos OE, não provocou prejuízo da atividade locomotora. Os resultados obtidos corroboram o uso popular e garantem consideravelmente o uso seguro das espécies estudadas. Palavras-chave: Ansiedade; Camundongo; Citrus aurantium; Cymbopogon citratus; Depressão; Neuroquímica; Óleo essencial. Abstract Abstract: Depression and anxiety represent two of the most common and proliferating mental disorders in the world. Traditionally, anxiety and depression disorders have been considered separate and distinct. However, many clinical studies have shown a significant comorbidity between these two states. Currently, most anxiety disorders are treated with drugs that interfere, more or less selectively, with GABAergic, serotonergic and/or noradrenergic neurotransmission. The treatment of depression, on the other hand, has been based on the increased availability of serotonin and/or norepinephrine. The drugs available in a clinic are not able to control these disorders in many patients and also have significant side effects. Thus, based on the multiple adverse effects of available drugs and their limited efficacy in a considerable proportion of patients, significant efforts are justified for finding new substances that could potentially treat these disorders, particularly, the plant species Cymbopogon citratus and Citrus aurantium because they are used in folk medicine as tranquilizers and sedatives. Previous results demonstrated the presence of anxiolytic-like activity in the essential oil (EO) obtained from both species. In this work, the C. citratus EO showed anxiolytic-like activity resulting from interaction with the GABA-benzodiazepine receptor complex at a dose of 10 mg/kg after acute oral treatment. Moreover, concomitant treatment with ineffective doses of diazepam and EO showed a synergistic effect between the two preparations. In turn, the C. aurantium EO showed anxiolytic-like activity at a dose of 5 mg/kg (p.o.) mediated by serotonin receptors of 5-HT1A type, and, after 14 days of treatment, the EO showed anxiolytic-like effects at a dose of 1 mg/kg/day. Neurochemical changes were not detected in the cortex, striatum, hypothalamus, and pons after acute oral treatment, and there were no histopathological or biochemical changes, except for the reduction in cholesterol levels in animals treated repeatedly with these species. At each dose of EO neither the acute nor the repeated treatment caused locomotor impairment. The results corroborate the popular use and help ensure the safe use of the species. Keywords: Anxiety; Citrus aurantium; Cymbopogon citratus; Depression; Essential oil; Mice; Neurochemistry. SUMÁRIO Dedicatória Agradecimentos Resumo Abstract Sumário Prólogo I.) Introdução ................................................................................................. 01 II.) Capítulo 1 The GABAergic system contributes to the anxiolytic-like effect of essential oil from Cymbopogon citratus (lemongrass) .............................. 15 III.) Capítulo 2 Safety evaluation of lemongrass (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) essential oil in male Swiss mice ….......................................................... 43 IV.) Capítulo 3 Behavioral, neurochemical and biochemical evaluation of Citrus aurantium L. essential oil …………………………………………..……………… 63 V.) Conclusão ................................................................................................ 98 VI.) Referências Bibliográficas ........................................................................ 101 VII.) Apêndice A – Padronização do mecanismo de ação de drogas no Teste do Nado Forçado (TNF) ........................................................................................ 109 VIII.) Anexos .................................................................................................. 112 Prólogo Prólogo: Durante todo o período do curso de Doutorado no Programa de Pós- graduação em Ciências Biológicas - Área de Farmacologia houve a possibilidade de participação em diferentes atividades extracurriculares além de outros trabalhos de pesquisa desenvolvidos no laboratório. Estes trabalhos possibilitaram a divulgação de resultados em Congressos Nacionais e Internacionais e envio de artigos para publicações em periódicos científicos internacionais. No mais, o desenvolvimento das atividades de Professor-bolsista possibilitaram o exercício da relação professor-aluno em todos os níveis: regência de aulas teóricas e teórico-práticas, preparação e correção de provas, além do contato com os aspectos administrativos da docência. * Elaboração de artigos científicos: Artigos publicados: 1. BLANCO, M. M.; COSTA, C. A. R. A.; FREIRE, A. O.; SANTOS Jr., J. G.; COSTA, M. Neurobehavioral effect of essential oil of Cymbopogon citratus in mice. Phytomedicine (Stuttgart), v. 16, p. 265-270, 2009. 2. GARGANO, A. C.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Essential Oils from Citrus latifolia and Citrus reticulata reduce anxiety and prolong ether sleeping time in mice. Tree and Forestry Science and Biotechnology, v. 2, p. 121-124, 2008. Artigo aceito para publicação: 1. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; SALVADORI, D. M. F.; COSTA, M.; RODRIGUES, M. A. M.; BARBISAN, L. F. Protective effects of lemongrass (Cymbopogon citratus STAPF) essential oil on DNA damage and carcinogenesis in female Balb/C mice. Journal of Applied Toxicology, 2010. doi:10.1002/jat.1593. Prólogo Artigos submetidos: 1. COSTA, C. A. R. A.; KÖHN, D. O.; LIMA, V. M.; GARGANO, A. C.; FLÓRIO, J. C.; COSTA, M. Gabaergic system contributes to the anxiolytic-like effect of essential oil from Cymbopogon citratus (lemongrass). Journal of Ethnopharmacology. 2. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M.; RODRIGUES, M. A. M.; BARBISAN, L. F. Modifying effects of lemongrass essential oil on tissue response to carcinogen N-methyl-N-nitrosurea (MNU) in female Balb/C mice. Journal of Medicinal Food. 3. COSTA, C.A.R.A.; BIDINOTTO, L.T.; TAKAHIRA, R. K.; SALVADORI, D.M.F.; BARBISAN, L.F.; COSTA, M. Safety evaluation of lemongrass (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) essential oil in male Swiss mice. Food and Chemical Toxicology. 4. RIBEIRO, C. A. S.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Sequential procedures battery to assess the anxiolytic- and antidepressant-like activity in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 5. COSTA, C. A. R. A.; CURY, T. C.; CASSETTARI, B. O.; FLÓRIO, J. C.; COSTA, M. Behavioral, neurochemical and biochemical evaluation of Citrus aurantium L. essential oil. European Neuropsychopharmacology. * Prêmios e títulos: ⇒ Menção Honrosa pela apresentação do painel “Envolvimento do complexo receptor GABA-benzodiazepínico na atividade ansiolítica do óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf”, durante a XXIV Reunião Anual da FeSBE, 2009. Prólogo * Experiência Didática: 1. Professor Bolsista vinculado ao Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp/Botucatu nas disciplinas de Farmacologia nos cursos de Ciências Biológicas (Modalidade Licenciatura), Ciências Biomédicas, Enfermagem e Medicina durante o ano de 2010. (60 horas) 2. Métodos de Pesquisa em Psicofarmacologia, na disciplina de Farmacologia do Curso de Ciências Biológicas – Licenciatura, Unesp/Botucatu, 2010. (4 horas). 3. Métodos Experimentais em Psicofarmacologia, na disciplina optativa de Farmacologia “Metodologia Experimental Farmacológica”, Unesp/Botucatu, 2009. (4 horas). 4. Professor-Palestrante da Disciplina de Microbiologia e Imunologia Clínica da FAIT-ACITA (Associação Cultural e Educacional de Itapeva), 2009. (20 horas). 5. Métodos de Pesquisa em Psicofarmacologia, na disciplina optativa de Farmacologia “Metodologia Experimental Farmacológica”, Unesp/Botucatu, 2008. (4 horas). 6. Neuropsicofarmacologia de Produtos Naturais, nas disciplinas de Farmacologia dos Cursos de Ciências Biológicas (Bacharelado e Licenciatura) e Ciências Biomédicas, Unesp/Botucatu, 2008 (12 horas). * Co-orientações: 1. Camila Maschieto. Serjania erecta: estudo da potencialidade antihipertensiva, 2010. Co-orientação. Curso: Nutrição - UNESP. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. Orientador: Profª. Drª. Juliana I. F. de Gobby. 2. Leandro Jorge Coelho. Avaliação da atividade antidepressiva do óleo essencial de Cananga odorata (Lam.) Hook. f. & Thomson em camundongos, por via oral, 2010. Co-orientação. Curso: Ciências Biológicas - Bach./Licenc. - UNESP. Orientadora: Profª. Drª. Mirtes Costa. Prólogo 3. Thaís Canto Cury. Estudo da atividade ansiolítica e antidepressiva do óleo essencial de Citrus aurantium L. administrado por via inalatória em camundongos, 2010. Co-orientação. Curso: Ciências Biomédicas - UNESP. Orientador: Profª. Drª. Mirtes Costa. * Participação em bancas de comissões julgadoras e pareceres: 1. Parecer de relatório final de estágio curricular (Iniciação Científica) de aluno do Curso de Ciências Biomédicas do Instituto de Biociências de Botucatu, 2010. 2. Membro da Comissão Científica para seleção dos painéis apresentados durante o VIII Workshop da Pós-Graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, 2009. Unesp/Botucatu. 3. Avaliador de painéis durante o XX Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2008. Unesp/São José dos Campos. * Estágios/Visitas Técnicas: 1. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ/USP). Treinamento técnico realizado junto ao Departamento de Patologia Animal – Laboratório de Farmacologia e Toxicologia - da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, perfazendo um total de 120 horas, 2008-2011. 2. Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LFT). Visita técnica realizada no LTF da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) na cidade de João Pessoa/PB, 2010. 3. Departamento de Ciências Experimentais e da Saúde. Visita técnica realizada na Universidade Pompeu Fabra (UPF) na cidade de Barcelona/Espanha, 2010. 4. Instituto de Medicina Molecular de Lisboa (IMM). Visita técnica realizada na unidade de Neurociência do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina de Lisboa/Portugal, 2009. Prólogo 5. Centro de Bioactivos Marinos (CEBIMAR). Visita técnica realizada no Centro de Bioactivos Marinos (CEBIMAR) na cidade de La Habana/Cuba, 2009. 6. Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Visita e Treinamento Técnico realizados durante a Disciplina da Pós-Graduação: "Biossíntese, métodos de extração e identificação de metabólitos secundários em plantas medicinais e aromáticas", 2008. * Participação em eventos científicos: 1. XXV Reunião Anual da FeSBE, 2010. Águas de Lindóia/SP. 2. 11th International Society for Ethnopharmacology Congress and I Encuentro Hispano Portugués de Etnobiología, 2010. Albacete/Espanha. 3. XXI Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2010. João Pessoa/PB. 4. IX Workshop da Pós-Graduação & X Workshop de Genética, 2010. Botucatu/SP. 5. XXIV Reunião Anual da FeSBE, 2009. Águas de Lindóia/SP. 6. XVIII Congreso Italo-latinoamericano de Etnomedicina, 2009. La Habana/Cuba. 7. 2º Congresso Iberoamericano de Fitoterapia, 2009. Lisboa/Portugal. 8. VIII Workshop da Pós-Graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, 2009. Botucatu/SP. 9. I Ciclo de Palestras sobre Ética na Experimentação Animal: Cuidados e Atenção na Experimentação Animal, 2009. Botucatu/SP. 10. XX Simpósio Brasileiro de Plantas Medicinais e X Congresso Internacional de Etnofarmacologia, 2008. São Paulo/SP. 11. I Congresso de Neurociências da América Latina, Caribe e Península Ibérica, 2008. Búzios/RJ. 12. V Simpósio de Ciências Aplicadas da FAIT, 2008. Itapeva/SP. 13. VIII Workshop de Plantas Medicinais de Botucatu, 2008. Botucatu/SP. 14. VII São Paulo Research Conferences, 2007. São Paulo/SP. Prólogo * Trabalhos apresentados em eventos científicos nacionais: 1. COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Investigação do mecanismo de ação ansiolítica do óleo essencial de Citrus aurantium L.. In: XXV Reunião Anual da FeSBE, 2010, Águas de Lindóia. 2. LIMA, V. M.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Investigação da atividade antidepressiva e ansiolítica do óleo essencial de Rosmarinus officinalis L. (Alecrim). In: XXI Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2010, João Pessoa/PB. 3. FERREIRA, F. G.; RIBEIRO, C. A. S.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Avaliação das atividades ansiolítica e antidepressiva dos óleos essenciais de Mentha piperita e Cananga odorata em camundongos por via inalatória. In: XXI Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2010, João Pessoa/PB. 4. MASCHIETO, C.; COSTA, C. A. R. A.; COELHO, R. G.; COSTA, M.; GOBBI, J. I. F. Administração crônica do decocto da raiz de Serjania erecta não modifica parâmetros de ansiedade em ratos SHR. In: IX Workshop da Pós- graduação e X Workshop de Genética, 2010, Botucatu/SP 5. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M.; BARBISAN, L. F. Efeitos do óleo essencial de Capim-limão sobre alterações na cinética celular do epitélio mamário de fêmeas BALB/c, induzidas pela N-Metil-N-Nitrosuréia. In: VIII Workshop da Pós-Graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, 2009, Botucatu/SP. 6. KÖHN, D. O.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Estudo da atividade anticonvulsivante do extrato hidroalcoólico de Ruta graveolens L.. In: VIII Workshop da Pós-Graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, 2009, Botucatu/SP. 7. COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Envolvimento do complexo receptor GABA-benzodiazepínico na atividade ansiolítica do óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC) Stapf. In: XXIV Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2009, Águas de Lindóia. 8. KÖHN, D. O.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Pharmacological activity of Ruta graveolens L.: disagreement between ethnopharmacological information and experimental data. In: 41º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 2009, Ribeirão Preto. Prólogo 9. COSTA, C. A. R. A.; FERREIRA, F. G.; COSTA, M. Avaliação do Óleo Essencial (OE) de Cymbopogon citratus em Modelos de Transtorno Obsessivo Compulsivo (TOC) e Depressivo (TD). In: XX Simpósio Brasileiro de Plantas Medicinais e X Congresso Internacional de Etnofarmacologia, 2008, São Paulo. 10. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M; BARBISAN, L. F. Lack of protective effects of lemongrass essential oil against aberrant crypt foci development in females Balb/C mice. In: XX Simpósio Brasileiro de Plantas Medicinais e X Congresso Internacional de Etnofarmacologia, 2008, São Paulo. 11. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M.; BARBISAN, L. F. Efeitos do capim-limão sobre as taxas de proliferação celular e apoptose em criptas intestinais do cólon de fêmeas Balb/C expostas à N-metil-N-nitrosuréia. In: 11º Encontro Regional de Biomedicina, 2008, Botucatu. 12. BIDINOTTO, L. T.; COSTA, C. A. R. A.; SALVADORI, D. M. F.; BARBISAN, L. F. Efeitos de capim-limão (Cymbopogon citratus STAPF) sobre danos de DNA causados por N-Metil-N-Nitrosuréia em fêmeas Balb/C. In: XXIII Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2008, Águas de Lindóia. * Trabalhos apresentados em eventos científicos internacionais: 1. COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Evaluation of the action mechanism of anxiolytic-like effect of essential oil from Citrus aurantium L. In: 11th ISE Congress and I EHPE, 2010, Albacete/Espanha. Revista de Fitoterapia - Book of Abstracts, 2010. v. 10. p. 140-140. 2. COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Neuropharmacological profile of essential oil and major compounds from Cymbopogon citratus (Lemongrass). In: XVIII Congreso Italo-latinoamericano de Etnomedicina, 2009, Ciudade de La Habana. XVIII Congreso Italo-latinoamericano de Etnomedicina "Juan Tomáz Roig", 2009. Prólogo 3. COSTA, C. A. R. A.; KÖHN, D. O.; LIMA, V. M.; COSTA, M. Tratamento agudo, mas não subcrônico, com óleo essencial de Cymbopogon citratus promove efeito ansiolítico por meio de receptores benzodiazepínicos. In: 2º Congresso Iberoamericano de Fitoterapia, 2009, Lisboa. Revista de Fitoterapia - Livro de Resumos Fito 2009. Valencia/España, 2009. v. 9. p. 153-153. 4. COSTA, C. A. R. A.; GARGANO, A. C.; COSTA, M. Influência do Ciclo Estral na Resposta Ansiolítica de Diazepam e Imipramina em Camundongos. In: I Congresso de Neurociências da América Latina, Caribe e Península Ibérica, 2008, Búzios/RJ. 5. KÖHN, D. O.; RIBEIRO, C. A. S.; COSTA, C. A. R. A.; COSTA, M. Avaliação da interferência do ciclo circadiano sobre os comportamentos de camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. In: I Congresso de Neurociências da América Latina, Caribe e Península Ibérica, 2008, Búzios/RJ. * Formação complementar: 1. Farmacodinâmica Molecular, 3 horas. FeSBE, 2010. 2. Extensão universitária em Detecção de Danos no DNA pelo Ensaio Cometa, 32 horas. Multigene, 2009. 3. Extensão universitária em Animais de Laboratório - Uma especialidade, 40 horas. Instituto Butantan, 2009. 4. Problemas éticos e científicos relacionados com a invalidez e a ineficiência de trabalhos com animais de laboratório, 3 horas. FeSBE, 2009. 5. Fitoquímica, Farmacologia e Fitoterapia, 6 horas. Instituto de Biociências/Unesp, 2008. 6. Efeitos Farmacológicos de Plantas em Modelos Animais, 3 horas. XX Simpósio Brasileiro de Plantas Medicinais, 2008. 7. Modelos animais em neurociências, 3 horas. Congresso de Neurociências da América Latina, Caribe e Península Ibérica, 2008. 8. Plasticidade e Degeneração no Sistema Nervoso, 8 horas. SBNeC, 2007. 9. Introdução à Neurobiologia, 24 horas. São Paulo Research Conferences, 2007. Prólogo * Disciplinas cursadas na Pós-graduação: 1. Bioinformática (2007/2 créditos/ Conceito: A) 2. Classificação de Receptores Farmacológicos (2007/3 créditos/ Conceito: A) 3. Tópicos de Atualização em Ciências (2007/1 crédito/ Conceito: A) 4. Teoria e Prática de Técnicas Espectroscópicas de UV-VIS, Fluorescência e Quimiluminescência: Aplicações em Ciências Biomédicas (2008/2 créditos/ Conceito: A) 5. Tópicos de Atualização em Ciências (2008a/1 crédito/ Conceito: A) 6. Empreendedorismo (2008/4 créditos/ Conceito: A) 7. Tópicos de Atualização em Ciências (2008b/1 crédito/ Conceito: A) 8. Neurofarmacologia e Comportamento (2009/2 créditos/ Conceito: A) 9. Tópicos de Atualização em Ciências (2009a/1 crédito/ Conceito: A) 10. Tópicos de Atualização em Ciências (2009b/1 crédito/ Conceito: A) * Organização de evento: 1. IX Workshop da Pós-Graduação & X Workshop de Genética, 2010. 2. VIII Workshop da Pós-Graduação do IB de Botucatu, 2009. 3. VII Workshop da Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2008. 4. VI Workshop da Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2007. * Trabalhos técnicos: 1. Desenvolvimento dos Anais do VIII Workshop da Pós-Graduação do IB de Botucatu, 2009. 2. Desenvolvimento dos Anais do VII Workshop da Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2008. Introdução 1 I. Introdução: A comorbidade entre depressão e ansiedade é assunto ainda bastante controverso. Historicamente se postula que ansiedade e depressão são desordens separadas e distintas, entretanto, muitos estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado uma grande sobreposição entre esses dois estados (Andreatini e Bacellar, 1999; Cryan e Holmes, 2005; Kessler et al., 2005; Lamers et al., 2011), inclusive pela classificação, sujeita a questionamentos na prática clínica e na pesquisa, na categoria de diagnóstico chamado “transtorno misto ansioso depressivo” - mixed anxiety- depressive disorder - MADD (Spijker et al., 2010). A depressão e as desordens de ansiedade representam algumas das mais comuns e proliferativas doenças de saúde no mundo (Cryan e Holmes, 2005). De acordo com levantamento feito pela OMS por meio do Consórcio Internacional em Epidemiologia Psiquiátrica (ICPE), a ansiedade generalizada atinge, ao longo da vida, de 3 à 9% da população a qual o estudo se refere: Brasil, Canadá, Holanda e Estados Unidos da América (Andrade et al., 2003). Por sua vez, a depressão tem sua prevalência estimada entre 3 à 17% na população estudada de 10 países: Canadá, Estados Unidos, Brasil, Chile, México, República Tcheca, Alemanha, Holanda, Turquia e Japão (Kessler et al., 2002, 2003). No Brasil, um estudo multicêntrico de morbidade psiquiátrica em adultos demonstrou as seguintes estimativas de prevalência para os transtornos ansiosos: 12,1% para Brasília, 6,9% para São Paulo e 5,4% para Porto Alegre (Almeida Filho et al., 1992). Introdução 2 Conceitualmente a ansiedade é caracterizada por sintomas psicológicos e físicos. Os sintomas psicológicos predominantes são a sensação persistente e antecipatória de medo, cuja fonte é incerta ou desconhecida, pensamentos preocupantes repetitivos, inquietação, irritabilidade e falta de concentração. Os sintomas físicos estão associados à tensão muscular (que pode causar dores e tremores musculares e dores de cabeça tensionais) e à hiper atividade autonômica que causa vários sintomas somáticos tais como sensação de aperto e dor no peito, hiperventilação e taquicardia e aumento da pressão arterial (Rickels et al., 2002). Já a depressão caracteriza-se por alterações do humor, geralmente acompanhadas de sintomas cognitivos, comportamentais e somáticos. Queixas de ansiedade, irritabilidade, preocupação, desinteresse ou perda da capacidade de sentir prazer nas atividades habituais, bem como sentimentos de culpa e baixa auto-estima estão entre os principais sintomas dos transtornos depressivos (Nestler et al., 2002). Não são recentes as tentativas de desenvolvimento de teorias psicológicas e biológicas para se entender o substrato neuroquímico na etiologia da depressão e da ansiedade (Jesberger e Richardson, 1985). Como em outros distúrbios psiquiátricos a etiologia da depressão e da ansiedade patológica, parece depender de uma interação entre predisposição e fatores ambientais. Estudos fornecem indícios de que estes quadros possuam origens genéticas comuns, porém a predisposição pode também ser resultado de diferentes causas ambientais, como por exemplo: problemas familiares, eventos estressantes da vida (morte de um parente, exposição a um evento traumático), circunstâncias econômicas, além de outros (Cerdá et al., 2010; Hettema, 2008). Além disso, as associações destes transtornos Introdução 3 costumam ser mais graves do que os transtornos isolados em termos de sintomas, evolução, resposta ao tratamento, risco de suicídio e prevalência de transtornos psiquiátricos entre os familiares (Lamers et al., 2011). É bastante improvável que os transtornos de depressão e ansiedade sejam decorrentes de alterações em um único sistema de neurotransmissão, uma vez que diversos neurotransmissores participam, em maior ou menor grau, da modulação dos comportamentos defensivos, além de interagirem entre si (Charnay e Léger, 2010; Graeff e Hetem, 2004; Neumann et al., 2011). O conhecimento atual da participação de neurotransmissores nos processos de depressão e ansiedade advém, principalmente, do estudo do mecanismo de ação de drogas que atenuam ou agravam estes processos. Estes estudos neurobiológicos investigam principalmente duas características da comorbidade ansiedade-depressão: por um lado buscam semelhanças nas alterações neurofisiológicas que embasam os dois tipos de adoecimento e; por outro lado investem na especificidade dos transtornos e comparam o funcionamento do sistema nervoso central em cada patologia e na sua associação (Kalueff e Tuohimaa, 2004). Um mecanismo fisiopatológico comum para a ansiedade e a depressão, consistiria de modificações nos sistemas de neurotransmissão relacionados às monoaminas, por meio da desregulação dos sistemas serotonérgico, noradrenérgico e, em menor grau do sistema dopaminérgico (Neumann et al., 2011), além da desregulação do eixo Hipotálamo-Pituitária- Adrenal (Baldwin et al., 2002; Nutt e Stein, 2006; Wardenaar et al., 2011). Atualmente, a maioria dos transtornos de ansiedade é tratada com drogas que interferem, de modo mais ou menos seletivo, com a neurotransmissão Introdução 4 gabaérgica, serotonérgica e noradrenérgica. A depressão, por sua vez, tem seu tratamento fundamentado no aumento da disponibilidade de serotonina ou noradrenalina, mecanismo comum às principais drogas disponíveis para a terapêutica, como os inibidores da monoamina-oxidase e os antidepressivos tricíclicos. Disponibilizados a partir do final da década de 1970, os inibidores seletivos da recaptação de serotonina atuam com menos intensidade sobre as outras monoaminas, inclusive a noradrenalina (Taylor et al., 2005). Sem dúvida a serotonina foi o neurotransmissor mais extensivamente estudado nas últimas décadas e a sua importância na fisiopatologia destas desordens é reforçada pela eficácia dos inibidores da recaptação de serotonina tanto no tratamento da ansiedade quanto no da depressão (Blier e Ward, 2003; Taylor et al., 2005). Parece que as duas vias serotoninérgicas originárias dos Núcleos da Rafe estariam distintamente relacionadas com estes dois transtornos. A primeira, representada por neurônios que se originam no Núcleo Mediano da Rafe e que se projetam para o lobo temporal e hipocampo, estaria relacionada com a depressão, enquanto a segunda, que faz a conexão entre a rafe dorsal e a amígdala contribuiria para a regulação dos quadros ansiosos (Graeff e Hetem, 2004). A neurotransmissão mediada por noradrenalina guarda semelhança com a mediada por serotonina, já que várias estruturas cerebrais recebem aferências de ambos os sistemas. A partir do locus coeruleus os neurônios que formam o feixe noradrenérgico dorsal atingem várias regiões telencefálicas, entre elas a amígdala, área septal, formação hipocampal e todo o neocórtex, por meio de fibras que compõem o feixe prosencefálico medial, o mesmo que também contém as fibras serotonérgicas Introdução 5 (Graeff e Hetem, 2004). O estudo das interconexões entre estes sistemas tem mostrado que a interação é recíproca, sendo ambos fortemente influenciados pelo sistema gabaérgico (Fink e Göthert, 2008). Esta relação com o GABA é particularmente interessante, desde que este é o principal aminoácido inibitório do sistema nervoso central, e o alvo da ação dos benzodiazepínicos. A ação ansiolítica destes compostos é devida a sua atividade sobre a porção basolateral da amígdala, onde a concentração de receptores benzodiazepínicos é máxima, assim como à redução do funcionamento do sistema septo-hipocampal, por diminuírem a atividade da aferência serotonérgica e noradrenérgica (Graeff e Hetem, 2004; McGaugh et al., 2002; Truitt et al., 2009). Desde a década de 1960 os benzodiazepínicos têm sido extensivamente usados para tratar formas severas de ansiedade mostrando clara eficácia e sendo atualmente a classe de fármacos mais prescrita no mundo (López-Muñoz et al., 2011). Os benzodiazepínicos não são capazes de controlar os quadros ansiosos em aproximadamente 25% dos pacientes e possuem efeitos colaterais importantes, incluindo: sedação, relaxamento muscular, potencialização do efeito depressor do etanol, amnésia anterógrada e dependência (Uzun et al., 2010). Outras drogas, posteriormente introduzidas na terapêutica como a buspirona e seus correlatos, que atuam sobre o sistema serotonérgico, apresentam latência de cerca de duas semanas para o início dos efeitos ansiolíticos, e falham no controle dos sintomas de ansiedade em uma parcela importante dos pacientes (Lowry et al., 2005). Introdução 6 Se, por um lado a atividade ansiolítica de drogas que atuam sobre o sistema gabaérgico é muito bem estabelecida, por outro, a atividade deste sistema sobre a depressão não é tão evidente. No entanto, estudos recentes têm associado o receptor tipo GABAB com os quadros depressivos, sugerindo que antagonistas destes receptores podem ter efeitos antidepressivos por meio de mudanças na função e na expressão de tais receptores (Ghose et al., 2011). Desta forma, considerando os altos índices de comorbidade entre os quadros de ansiedade e depressão, em torno de 60 a 70 % da população geral (Kalueff et al., 2007; Lamers et al., 2011) e a eficácia do tratamento com antidepressivos, tanto para quadros ansiosos (como é o caso do Transtorno de Pânico, da Fobia Social, do Transtorno Obsessivo-compulsivo e mesmo da Ansiedade Generalizada), quanto para os casos de Depressão com ou sem componente ansioso importante (Argyropoulos, 2000; Ravindran e Stein, 2010), é possível supor que uma mesma substância exógena possa exercer atividade terapêutica em ambos os quadros. No mais, os múltiplos efeitos adversos das drogas disponíveis, e a sua eficácia limitada em uma considerável proporção de pacientes, justificam os esforços no sentido de encontrar novas substâncias com potencial atividade sobre a ansiedade e/ou a depressão (Cryan e Holmes, 2005; Olivier, 2003; Pilc e Nowak, 2005). Assim, é neste amplo contexto que surgem as plantas medicinais. Os metabólitos secundários da grande diversidade de espécies vegetais representam uma rica fonte de novas moléculas que podem servir como protótipo de substâncias úteis em diversos transtornos do sistema nervoso central (Elisabetsky e Souza, 2004). Introdução 7 Recorrer à natureza como forma de amenizar sintomas ou curar doenças é uma prática comum e bastante antiga. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2000) aproximadamente 80% da população mundial dependem de práticas tradicionais, sendo que 85% dessa parcela utilizam plantas ou preparações à base de vegetais. Além disso, o mercado mundial de fitoterápicos movimenta cerca de US$ 22 bilhões por ano. No Brasil, por exemplo, estima-se que o comércio de fitoterápicos seja da ordem de 5% do mercado total de medicamentos, avaliados em mais de US$ 400 milhões (Pinto et al., 2002). Durante as últimas décadas, o interesse nas terapias naturais e o uso de medicamentos fitoterápicos pela população têm aumentado (WHO, 2004). O desenvolvimento de medicamentos pela indústria farmacêutica a partir de produtos naturais vem ressurgindo e as plantas continuam a ser a maior fonte de busca de novos medicamentos (Pitchai et al., 2010). Além disso, de acordo com Calixto (2005), de 25-30% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual são derivados diretos ou indiretos de produtos naturais. Estima-se que 43% da população que sofre com desordens de ansiedade e a grande maioria dos acometidos com depressão usam alguma forma de terapia complementar, sendo os medicamentos naturais os tratamentos mais populares, como apontado nos trabalhos feitos por Ernst (2006, 2007). As espécies Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf e Citrus aurantium L. foram selecionada com base em dados etnofarmacológicos, que as indicam como detentoras de ação sobre o sistema nervoso central. Essa é uma estratégia eficiente para escolha de plantas para pesquisa, visto que seu uso Introdução 8 tradicional pode ser considerado como uma pré-triagem quanto a sua utilidade terapêutica (Elisabetsky e Souza, 2004) e possibilita o desenvolvimento de grupos de drogas inteiramente novos, com mecanismos de ação diferentes das drogas já disponíveis (Andreatini et al., 2001). No Brasil, de acordo com levantamento feito por Nogueira (1983), o C. citratus foi indicado como medicamento para os transtornos do sistema nervoso ou “males psiconeurológicos” por 201 entre 479 (41,96%) mulheres que freqüentaram centros de Saúde de São Paulo. O chá das folhas é largamente utilizado na medicina popular como antiespasmódico, sedativo, calmante, analgésico suave, carminativo, antipirético, emenagogo, diurético, sudorífico, hipotensor e anti-reumático (Di Stasi et al., 1989). Seguramente o emprego como sedativo do sistema nervoso ou calmante é o uso mais comum (Carlini, 1985). Também há registro de uso caseiro para combater diversas afecções das vias respiratórias e digestivas e também inflamação da bexiga. A planta foi incluída na lista da extinta Ceme (Central de Medicamentos) como espécie de estudo prioritária (Akisue, 1996). Já a espécie C. aurantium é popularmente empregada para curar ou aliviar insônia, tratar nervosismo, ansiedade e histeria, e as flores são utilizadas com fins sedativos (Santos et al., 1988; Lehrner et al., 2000). Um destes estudos foi realizado com homens e mulheres expostos a gotas de óleo essencial de Citrus sinensis dispersas na ante-sala de um consultório odontológico. Esta exposição provocou efeito relaxante nos pacientes, especificamente nos casos das mulheres, que apresentaram menor nível de ansiedade, melhora no humor e maior estado de tranquilidade (Lehrner et al., 2000). Introdução 9 Resultados prévios obtidos em nosso laboratório demonstraram a presença de atividade ansiolítica tanto para o óleo essencial obtido de C. citratus (Blanco et al., 2009) quanto para o obtido de C. aurantium (Carvalho- Freitas, 2002; Pultrini et al., 2006). Estas espécies vegetais, a despeito da grande utilização empírica, foram objetos de poucos estudos controlados no sentido de se caracterizar suas atividades terapêuticas ou tóxicas sobre o sistema nervoso central. A triagem de novas drogas no campo da psicofarmacologia está intimamente relacionada às ferramentas experimentais (modelos animais adequados) que permitam a correta avaliação/identificação de tais substâncias, o delineamento dos mecanismos de ação e o estudo da neurobiologia dos transtornos mentais (Andreatini et al., 2006; Lapiz-Bluhm et al., 2008). Se, de um lado os avanços nos métodos da neurobiologia aumentam nosso conhecimento básico, por outro eles também são insuficientes para elucidar a etiologia e a fisiopatologia dos transtornos afetivos bem como não são suficientes para o desenvolvimento de novos tratamentos (Neumann et al., 2011). Assim, independentemente da abordagem utilizada, os critérios básicos para serem cumpridos por um modelo satisfatório são: as validades de face, preditiva e de construto. A validade de face indica que o fenótipo do modelo é semelhante ao da síndrome humana a qual se supõe imitar; A validade preditiva estipula que uma manipulação que influencia a patologia humana vai ter efeitos semelhantes no modelo animal sendo a abordagem mais utilizada da validade preditiva o isomorfismo farmacológico (capacidade do modelo de detectar drogas potencialmente úteis na clínica) e finalmente; a validade de Introdução 10 construto, na qual a validade de face e a validade preditiva contribuem, pressupõe que uma doença humana e o modelo animal possuem substratos patológicos comuns, que podem explicar a patologia em ambos, permitindo assim a geração de uma teoria mecanicista comum e testes experimentais dos aspectos clínicos mais salientes de uma dada doença (Neumann et al., 2011; Andreatini et al., 2006). Teoricamente um procedimento experimental deveria cumprir todos os três critérios para ser um bom modelo, entretanto esta situação não é vista com muita freqüência. Por exemplo, os modelos tradicionais de depressão falham na validade de face e de construto, porém são muito bons na validade preditiva (Kalueff e Tuohimaa, 2004), tal como acontece com os principais modelos de ansiedade (Cryan e Holmes, 2005). O fato é que os modelos animais servem para a triagem dos possíveis efeitos ansiolíticos e/ou antidepressivos de novos medicamentos e, quanto mais próximo um modelo se aproximar dos sintomas clínicos significativos da patologia, mais robusto ele será na geração de bons dados (Miczek e de Wit, 2008). Dentre os diferentes procedimentos experimentais para o estudo da ansiedade, o da Caixa Claro/Escuro - CCE (figura 1) parece ser adequado para detecção de substâncias ativas no tratamento dos Transtornos de Ansiedade Generalizada – TAG (File, 1990), enquanto o Teste de Esconder Esferas – TEE (figura 2) parece ser mais sensível a substâncias utilizadas para o tratamento do Transtorno Obsessivo Compulsivo - TOC (Witkin, 2008). O procedimento da CCE tem a vantagem de ser rápido e fácil de usar, sem a necessidade de treinamento prévio dos animais e sem submetê- los a estímulos nocivos, como choques elétricos, privação de água ou Introdução 11 alimentos, que geram estados motivacionais (dor, sede, fome) que podem interferir no comportamento do animal e assim obscurecer as análises de ansiedade (Bourin e Hascoët, 2003). Um conflito natural ocorre quando os animais são expostos a um ambiente não familiar ou a um novo objeto. O conflito ocorre entre a tendência de explorar e a tendência inicial de evitar o desconhecido – neofobia. A atividade exploratória reflete o resultado combinado destas tendências na nova situação. Assim, na CCE, as drogas ansiolíticas induzem um aumento nos comportamentos executados na parte clara. Um aumento na transição entre os ambientes claro e escuro, sem um aumento na locomoção espontânea, é considerado reflexo da atividade ansiolítica (Bourin e Hascoët, 2003). Por sua vez, o TEE explora o comportamento de roedores de ocultar objetos e drogas que apresentam atividade ansiolítica diminuem o número de objetos escondidos pelos animais (Treit et al., 1981). O modelo está relacionado ao transtorno obsessivo-compulsivo caracterizado por obsessões e/ou compulsões, tendo em vista que a principal classe de droga ativa no modelo são os inibidores seletivos de recaptação de serotonina (ISRS) e os animais previamente expostos às esferas continuam a atividade de enterrar, mesmo na ausência das esferas, o que caracterizaria o comportamento compulsivo (Gyertyan, 1995). As substâncias ativas nestes procedimentos experimentais também são distintas. Assim, na CCE, os derivados benzodiazepínicos são capazes de aumentar o tempo de permanência no compartimento claro e no TEE, drogas antidepressivas são capazes de reduzir o número de esferas escondidas. Similarmente, estas são as drogas mais ativas nestas desordens Introdução 12 na clínica, ou seja, os benzodiazepínicos são as drogas mais ativas no TAG e os antidepressivos – em especial os ISRS – as drogas mais ativas no TOC (Davidson et al., 2010; Witkin, 2008). Já no que diz respeito aos procedimentos relacionados à depressão, dois são os principais modelos utilizados na avaliação de drogas com potencial efeito antidepressivo (Cryan et al., 2002; Pollak et al., 2010): Teste do Nado Forçado (TNF) e Teste da Suspensão pela Cauda (TSC). Baseado no teste originalmente descrito por Porsolt e colaboradores em 1977, o TNF (figura 3) é composto por duas sessões de natação: uma chamada treino, e uma segunda, realizada 24 horas após, chamada teste. Durante a sessão de teste cada animal permanece na água durante 5 minutos e tem seu comportamento registrado para análise posterior, resultando na classificação do comportamento exercido: natação, escalada ou imobilidade. O comportamento de natação é caracterizado por movimentos, usualmente horizontais, através do recipiente; o comportamento de escalada é caracterizado por movimentos ascendentes das patas dianteiras, geralmente, ao longo das paredes do recipiente; a imobilidade é definida quando nenhuma atividade adicional é realizada, com os animais executando movimentos mínimos para manter suas cabeças acima da água (Cryan et al., 2002). O comportamento de imobilidade reflete o estado de baixo humor relacionado com a impossibilidade de escape durante a situação experimental (Porsolt et al., 1977). O antidepressivo tricíclico imipramina, um inibidor não seletivo de recaptação de noradrenalina e serotonina interfere, em ratos, de acordo com Cryan e colaboradores (2002), nos comportamentos ativos executados no TNF (escalar e nadar). Introdução 13 O TSC (figura 4) descrito por Steru e colaboradores (1985), baseia-se na observação que camundongos quando suspensos pela cauda, sem possibilidade de fuga, adotam um comportamento característico no qual ocorre um período de alta atividade inicial, seguido de períodos de imobilidade, sendo esta imobilidade relacionada com o estado de desistência, semelhante à síndrome depressiva humana. Fármacos antidepressivos diminuem este tempo de imobilidade e muitas vezes aumentam a latência até a imobilidade ocorrer, constituindo um procedimento adequado de triagem para novas drogas antidepressivas (Steru et al., 1985). Com o intuito de se descartar possíveis resultados falso-positivo, as avaliações foram complementadas com o teste da Barra Giratória (figura 5). Descrita por Dunham e Miya (1957), esta técnica pode detectar prejuízos neurológicos como ataxia, sedação e hiperexcitabilidade ou alterações motoras caracterizadas pela inabilidade do animal em se manter sobre a barra giratória. Deste modo, o presente trabalho avaliou o efeito dos óleos essenciais de C. citratus e C. aurantium sobre modelos experimentais de depressão, além de investigar o mecanismo de ação ansiolítica dos óleos essenciais por meio da identificação de alterações nos sistemas de neurotransmissão, utilizando técnicas comportamentais e neuroquímicas, bem como a caracterização de possíveis ações inespecíficas dos óleos essenciais, que poderiam refletir efeitos tóxicos, por meio de análises bioquímicas, genotóxicas e histopatológicas de órgãos-alvo. Introdução 14 Figura 3 – Teste do Nado Forçado Adaptado de Cryan et al., 2002 TRENDS in Pharmacological Sciences Figura 2 – Teste de Esconder Esferas A – Antes do início do teste B – Depois do teste Figura 1 – Caixa Claro/Escuro Figura 5 – Barra-giratória A B Figura 4 – Teste da Suspensão pela Cauda Imobilidade Nado Escalada 15 THE GABAERGIC SYSTEM CONTRIBUTES TO THE ANXIOLYTIC-LIKE EFFECT OF ESSENTIAL OIL 1 FROM Cymbopogon citratus (LEMONGRASS). 2 3 4 5 6 Celso A. Rodrigues de Almeida Costa1, Daniele Oliveira Kohn1, Valéria Martins de Lima1, André Costa Gargano1, 7 Jorge Camilo Flório2, and Mirtes Costa1,* 8 9 1 Department of Pharmacology, Institute of Biosciences, Unesp - Univ Estadual Paulista, P.O. Box 510, 18618-970 – 10 Botucatu, São Paulo, Brazil 11 2 Department of Pathology, School of Veterinary Medicine, USP - University of São Paulo, Av. Orlando Marques de 12 Paiva, 87 – São Paulo, SP, Brazil 13 14 15 16 17 18 19 * Corresponding author. Tel.: +55 14 3811 6253; fax: +55 14 3815 3744 20 E-mail address: mcosta@ibb.unesp.br (Mirtes Costa) 21 22 23 24 25 26 Artigo submetido ao periódico científico: Journal of Ethnopharmacology 27 28 16 Abstract 1 2 Ethnopharmacological relevance 3 The essential oil (EO) from Cymbopogon citratus (DC) Stapf is reported to have a wide range of biological activities 4 and is widely used in traditional medicine as an infusion or decoction. However, despite this widely use, there are 5 few controlled studies confirming its biological activity in central nervous system.6 Material and Methods 7 The anxiolytic-like activity of the EO was investigated in light/dark box (LDB) and marble-burying test (MBT) and 8 the antidepressant activity was investigated in forced-swimming test (FST) in mice. Flumazenil, a competitive 9 antagonist of benzodiazepine binding and the selective 5-HT1A receptor antagonist WAY100635 was used in 10 experimental procedures to determine the action mechanism of EO. To exclude any false positive results in 11 experimental procedures, mice were submitted to the rota-rod test. We also quantified some neurotransmitters at 12 specific brain regions after EO oral acute treatment. 13 Results 14 The present work found anxiolytic-like activity of the EO at the dose of 10 mg/kg in a LDB. Flumazenil, but not 15 WAY100635, was able to reverse the effect of the EO in the LDB, indicating that the EO activity occurs via the 16 GABAA receptor-benzodiazepine complex. Only at higher doses did the EO potentiate diethyl-ether-induced 17 sleeping time in mice. In the FST and MBT, EO showed no effect. Finally, the increase in time spent in the light 18 chamber, demonstrated by concomitant treatment with ineffective doses of diazepam (DZP) and the EO, revealed a 19 synergistic effect of the two compounds. The lack of activity after long-term treatment in the LDB test might be 20 related to tolerance induction, even in the DZP-treated group. Furthermore, there were no significant differences 21 between groups after either acute or repeated treatments with the EO in the rota-rod test. Neurochemical evaluation 22 showed no amendments in neurotransmitters levels evaluated in cortex, striatum, pons, and hypothalamus. 23 Conclusions 24 The results corroborate the use of C. citratus in folk medicine and suggest that the anxiolytic-like effect of its EO is 25 mediated by the GABAA receptor-benzodiazepine complex. 26 27 28 Keywords: Anxiolytic; Cymbopogon citratus; Essential oil; GABAergic system; Lemongrass; Sedative. 29 30 17 1. Introduction 1 2 Anxiety and depressive disorders are the most common mental illnesses in the world and a prominent health 3 care problem (Herrera-Ruiz et al., 2006; Yu et al., 2007). The World Health Organization (WHO) estimates that the 4 prevalence of these diseases ranges from 0.1 to 16.9% (Demyttenaere et al., 2004). Benzodiazepines are the major 5 class of compounds used to treat generalized anxiety disorder and acute anxiety states (Rickels and Schweizer, 1997; 6 Rupprecht et al., 2006). However, these compounds have a number of undesirable effects such as sedation, muscle 7 relaxation, amnesia, dependence and tolerance (Rickels and Schweizer, 1997; Reynolds, 2008). Therefore, the search 8 for new therapeutic agents continues, and medicinal plants have emerged as a crucial source for the development of 9 drugs to treat neurological disorders and play an important role for patients who respond poorly to conventional 10 treatments (Carlini, 2003; Herrera-Ruiz et al., 2006). 11 Cymbopogon citratus (DC) Stapf (Poaceae), commonly known as lemongrass, is widely used in traditional 12 medicine as an infusion or decoction for treating nervous disturbances (Carlini, 1986). In Mexico, C. citratus is used 13 as a sedative (Tortoriello and Romero, 1992), and in Brazil, an infusion or the cold juice of the leaves has been 14 employed as a sedative and analgesic (Hiruma-Lima et al., 2002). An antinociceptive effect of C. citratus has been 15 detected in the rodent hot plate test, an experimental procedure related to central activity (Viana et al., 2000). In 16 previous work (Blanco et al., 2009; Costa et al., 2006), we have demonstrated that acute treatment with the essential 17 oil (EO) from C. citratus is effective against generalized anxiety disorder and epilepsy in experimental procedures in 18 mice. 19 In the current study, we investigated the effect of the EO after long-term treatment and the putative 20 synergistic effect of the EO and diazepam (DZP), a classic anxiolytic drug. We administered repeated dosages, 21 instead of a single dosage, to mimic human drug regimens and to allow for reductions in individual dosages. To 22 better characterize its central nervous system activity, the EO was also evaluated in different experimental 23 procedures related to depressive and obsessive-compulsive disorders, thus complementing the anxiolytic and 24 sedative/hypnotic protocols. Finally, the mechanism of action of the EO was investigated through blockade of the 25 GABAergic or serotonergic neurotransmission systems. In this manner, we sought to elucidate the pharmacological 26 activity of the EO from C. citratus in order to validate its popular use as an anxiolytic or adjuvant drug in 27 combination with classic drugs such as benzodiazepines; such a combination could represent a novel approach for 28 the treatment of anxiety. 29 30 18 2. Material and methods 1 2 2.1. Plant material 3 4 Plant seedlings of specimens from the garden of medicinal plants (Lageado Farm, UNESP) were cultivated 5 at the Institute of Biosciences. The plant was identified in the BOTU Herbarium, Department of Botany, UNESP, 6 where a voucher specimen (# 23031) had been deposited. Leaves of C. citratus were collected between May and 7 June of 2008 and immediately processed to obtain the EO. 8 9 2.2. Essential oil extraction and phytochemical analysis 10 11 Fresh leaves were processed with a Clevenger apparatus, and the EO was obtained by hydrodistillation, 12 protected against light and heat, and stored until behavioral assays. Previously, the EO was analyzed by gas 13 chromatography coupled with mass spectrometry as described (Blanco et al., 2009). 14 15 2.3. Animals 16 17 All experiments were conducted in accordance with the Ethical Principles in Animal Research adopted by 18 the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA) and were approved by the Biosciences Institute – Ethics 19 Committee for Animal Research (CEEA). Adult Swiss male mice (30 days old) from the colony at the UNESP 20 Central Animal House facility were used in all experiments after a one-week adaptation period at the Animal House 21 of the Department of Pharmacology. Thus, the animals used were approximately 40 to 45 days old. The animals were 22 maintained under controlled environmental conditions of temperature (21+2 oC) and light (12/12 light/dark cycle) 23 with food and water ad libitum until 2 h prior to the experimental procedures. 24 25 2.4. Drugs 26 27 Diazepam (DZP, Germed - EMS, Brazil) was used as the standard anxiolytic and hypnotic drug and 28 imipramine hydrochloride (IM, Sigma-Aldrich, USA) as the standard antidepressant drug. Flumazenil (FLU, 29 Flumazil® - Cristália, Brazil) was utilized as a competitive antagonist of benzodiazepine binding, and WAY100635 30 19 (WAY, Sigma-Aldrich) was used as a highly selective 5-HT1A antagonist. For intraperitoneal injections (i.p.), DZP 1 and IM were dissolved in isotonic saline (SAL - 0.9% NaCl). For oral administration (p.o.), the EO was dissolved in 2 0.01 % (v/v) polyoxyethylene sorbitan monooleate (TW - Tween 80®, Sigma-Aldrich) in saline, which was used to 3 treat control groups. All samples were freshly prepared on the test day and administered at 10 ml/kg of body weight, 4 except FLU, which was administered at 20 ml/kg due to the concentration (0.1 mg/ml) of its commercial form. 5 6 2.5. Treatments 7 8 In a preliminary experiment, the behavioral data did not differ among the animals that received the three 9 vehicle solutions – Tween (TW), saline and water – (data not shown), which justified our choice to include only the 10 TW control group data for comparison. For the single treatment, mice were treated 30 min before experimental 11 procedures, whereas for long-term treatment (WHO, 1993), animals were treated with the EO for 21 days and 12 exposed to the experimental procedure 30 min after the last treatment. For evaluation of antidepressant activity, mice 13 were treated three times within the 24 h before the experimental procedure. To address a possible contribution from14 the GABAergic system, mice were co-administered DZP (1 mg/kg, i.p.) or the EO (10 mg/kg, p.o.) 30 min before the 15 test and then were given FLU (2 mg/kg, i.p.) 15 min before testing. To evaluate possible interference from the 16 serotonergic system, animals were pretreated with WAY (0.1 mg/kg, i.p.) and 15 minutes afterwards, received the 17 EO (10 mg/kg) or the standard drug DZP (1 mg/kg); the experimental procedure was carried out 30 min after the last 18 drug treatment. To evaluate a putative synergism between treatments, groups of animals were simultaneously treated 19 with non-effective doses of DZP (0.25 mg/kg, i.p.) and the EO (2.5 mg/kg, p.o.). 20 21 2.6. Neurochemical evaluation 22 23 Animals treated with TW or EO (10 mg/kg) were euthanatized, and their brains were rapidly dissected (not 24 more than 3 min after extraction) on ice. Briefly, the striatum, hypothalamus, pons, and frontal cortices were 25 dissected, weighed, and stored in liquid nitrogen until the neurochemical analyses. 26 Following sample collections, tissues were homogenized in 0.1M perchloric acid by manual sonication, and 27 centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes to remove supernatant, and stored at – 80 ºC until the determination of 28 monoamine levels. 29 20 Neurotransmitters and its metabolites - dopamine (DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and 1 homovanillic acid (HVA), and serotonin (5HT) and 5-hydroxyindoleacetic acid (5HIAA) - were measured by2 reverse-phase using an high performance liquid chromatography (HPLC) system (model 6A, Shimadzu, Kyoto, 3 Japan) with an electrochemical detector as described in detail elsewhere (Felício et al. 1996). Briefly, 20 μ l samples 4 were loaded into a sample injector and the mobile phase was delivered at a constant rate of 1.2 ml/min. The runtime 5 for each sample was 15 min, and concentrations of all neurotransmitters and its metabolites were expressed as 6 nanograms per gram of tissue (ng/g). 7 8 2.6. Behavioral procedures 9 10 Mouse behavior in the forced-swimming test and light/dark box test were videotaped under white light 11 illumination using a video camera and a computer. Digital video was subsequently played, and behaviors were 12 scored by a highly trained observer who was blind to treatment condition. In other procedures, the behaviors were 13 registered in real time. All experimental procedures occurred between 9:00am and 5:00pm. 14 15 2.6.1. Marble-Burying Test (MBT) 16 17 The marble-burying procedure is based on a defensive burying behavior that can be elicited in rodents in 18 response to aversive stimuli such as a shock prod, noxious food or an effective unconditioned stimulus such as glass 19 marbles (Broekkamp et al., 1986; Poling et al., 1981). The mice used in the marble-burying procedure were 20 previously selected to represent those that exhibit a stable burying score (at least 13 out of 25 marbles) for three 21 consecutive days before the test (Pultrini et al., 2006). Thirty minutes after treatments with EO (5, 10 or 50 mg/kg), 22 the animals were placed individually in cages (27 long x 16 wide x 13 cm high) with 25 glass marbles uniformly 23 distributed on a 5-cm layer of sawdust. Each cage was covered with a smooth, acrylic, transparent plate with small 24 punctures for ventilation. The mice were left in the cages with the marbles for 30 minutes, after which they were 25 removed to count the number of marbles that were totally hidden by sawdust. 26 27 28 29 30 21 2.6.2. Forced-Swimming Test (FST) 1 2 This test is the most widely used and recognized pharmacological model for assessing antidepressant 3 activity (Petit-Demouliere et al., 2005). This procedure was carried out following a modified version (Cryan et al., 4 2002) of the conditions proposed by Porsolt et al. (1977, 1978). The apparatus consisted of a clear Plexiglas cylinder 5 (21 cm high x 20.5 cm diameter) filled with water (23 + 2 ºC) to a depth of 13 cm. Each animal underwent a pre-test 6 swimming session for 15 min; the pre-tests were carried out 24 h prior to the 5-min swimming tests. At the end of the 7 swimming sessions, the animals were removed from the water and gently dried. Mice were treated with EO at 5, 10 8 or 50 mg/kg according to the following schedule: the first treatment (T1) was administered 1 h after finishing the 9 pre-test session and subsequently 5 h (T2) and 30 min (T3) before the test session. The digital video recording of 10 each mouse in the water was evaluated using a time-sampling technique (Detke et al. 1995) to classify in 10-s bins 11 the behavioral response into one of these three possible categories: climbing behavior, defined as upward-directed 12 movements of the forepaws along the side of the swimming chamber; swimming behavior, defined as movements 13 throughout the swimming chamber; and immobility time, defined as time during which the mouse remained floating 14 in the water and made only the movements necessary to maintain its head above the water (Cryan et al., 2002). 15 16 2.6.3. Sleep induced by diethyl-ether (SID) 17 18 The effectiveness of the EO was measured by its capacity to reduce the latency to sleep and/or to increase 19 the duration of sleep without interfering with hepatic metabolism (Tsuji et al., 1996). Thirty minutes after the 20 treatments with EO (500, 1000 or 1500 mg/kg), animals were induced to sleep by inhalation of diethyl-ether in a 3-L 21 flask. Each mouse was placed individually in a cylindrical glass chamber saturated for 20 min with vapor delivered 22 from 5 ml of diethyl-ether absorbed on a piece of cotton bound in the coiled cap of the flask. Each mouse was left 23 there for 60 sec after loss of its postural reflex – sleep latency was defined as time until loss of the postural reflex – 24 and then was withdrawn and placed in an individual cage to record the time to recover the postural reflex (sleep 25 duration) (Héllion-Ibarrola et al., 2006). 26 27 28 29 30 22 2.6.4. Light/Dark Box Test (LDB) 1 2 The light/dark box (46 long x 27 wide x 30 cm high) was divided into the typical dimensions of one-third 3 for the dark compartment with black walls, floor and roof and two-thirds for the light compartment with white walls 4 and floor and illuminated by a 20-W fluorescent lamp. The light and dark compartments were connected by an 5 opening (7.5 x 7.5 cm) located at floor-level in the center of the partition (Crawley and Goodwin, 1980). Thirty 6 minutes after treatment with EO (5, 10, 50 or 100 mg/kg), each animal was individually placed in the center of the 7 light compartment, facing the dark one, and observed for 5 minutes after the first entry into the dark compartment. 8 During this period, we recorded the number of shuttle crossings (an activity-exploration index), number of rearings 9 and the time spent in the light compartment, which is the most consistent and useful measure for assessing 10 anxiolytic-like activity. This parameter provides consistent dose-effect results for anxiolytic drugs including 11 benzodiazepines, 5-HT1A receptor agonists or 5-HT3 receptor antagonists (Bourin and Hascoët, 2003; Young and 12 Johnson, 1991). 13 14 2.6.5. Rota-rod Test (RRT) 15 16 The rota-rod procedure was described by Duhan and Miya (1957) and is suitable for detecting motor 17 impairment due to pharmacological agents such as skeletal muscle relaxants or central nervous system depressants. 18 The apparatus consisted of a non-slippery plastic rod, 3.0 cm in diameter and 50 cm in length, rotating at 5 rpm at a 19 height of 25 cm. Immediately after the LDB, each mouse was placed on the apparatus to register the total time it 20 performed on the rotating bar in three successive trials totaling 1 min. To avoid a bias on account of inability not 21 related to drug treatment, one day prior to testing animals were evaluated, using the same conditions as those in the 22 test, to select those that had the ability to walk on the bar. 23 24 2.7. Statistical analysis 25 26 Quantitative data from behavioral tests were subjected to Kruskal-Wallis non-parametric variance analysis, 27 followed by the Mann-Whitney test when appropriate. Proportions in the RRT were compared by Fisher’s exact test. 28 Neurochemical data were analysed by unpaired t-test. All statistical analysis was made using the GraphPad InStat® 29 23 version 3.02. Contrasts were made between treated and TW (vehicle) group, and differences were considered 1 statistically significant when p≤0.05. 2 3 3. Results 4 5 3.1. Essential oil composition 6 7 The main EO compounds were identified by the retention time and retention index as monoterpene citral 8 (71.29%), a mixture of the stereoisomers geranial and neral, or beta-myrcene (16.5%). Other compounds detected in 9 the EO include geraniol (1.28%), 6-methyl-5-hepten-2-ona (0.64%), and undecan-2-one (0.29%), as detailed in 10 Bidinotto et al. (2010). 11 12 3.2. Neurochemical evaluation 13 14 The acute treatment with lemongrass EO did not result in neurotransmitters or their metabolites producing 15 changes (DA, DOPAC, HVA, 5HT, and 5HIAA) as evaluated in cortex, striatum, pons, and hypothalamus (Table 1). 16 17 3.3. Effect of the EO on the Forced-swimming test (FST) and Marble-burying test (MBT) 18 19 The EO administered at 5, 10 or 50 mg/kg was unable to modify parameters evaluated in the FST or MBT, 20 as shown in Table 1. Imipramine, the standard drug in both experimental procedures, significantly decreased the 21 number of immobility events and concomitantly augmented the number of climbing and swimming events during the 22 FST while also reducing the number of marbles buried in the MBT.23 24 3.4. Effect of the EO on diethyl ether-induced sleep 25 26 The EO significantly decreased sleep latency after treatment at 1000 or 1500 mg/kg and increased sleep 27 duration at the same doses, as did the standard drug DZP (5 mg/kg). Data are presented in Table 2. 28 29 24 3.5. Anxiolytic-like effect of the EO in the LDB 1 2 The results obtained in the LDB test after acute treatment with the EO (Fig. 1, left panel) reveal a significant 3 increase in time spent in the LDB light chamber after acute administration of the EO at 10 mg/kg when compared to 4 the TW group. A discrete increase in exploratory parameters (number of transitions between compartments and, 5 especially, rearing) could be observed after treatment with either DZP or the EO. However, neither DZP nor the EO, 6 administered for 21 days, was able to modify the time spent on the illuminated side of the LDB. 7 Additionally, the group that was repeatedly treated with saline and that received one treatment with DZP 30 minutes 8 before the experimental procedure showed an anxiolytic-like effect analogous to acute DZP treatment (Fig. 1, right 9 panel). This result validates the experimental conditions used in the LDB session and confirms the absence of an 10 anxiolytic-like effect in mice repeatedly treated with DZP. Reductions in the number of rearings and transitions 11 between compartments were observed after long-term treatment with 100 mg/kg of the EO, which was the same 12 trend observed after long-term treatment with DZP (Fig. 1 B and C). 13 14 3.6. The role of GABA or 5-HT neurotransmission on the anxiolytic-like effect of the EO in the LDB 15 16 Experimental sessions to evaluate the interference of flumazenil (FLU) or WAY100635 (WAY) in the acute17 effect of the EO (10 mg/kg) or DZP (1 mg/kg) were carried out independently; the results are presented in Fig. 3. 18 Results from FLU or WAY alone did not differ from those obtained from the TW group, showing no per se effect of 19 these blockers on evaluated parameters. Mice treated with DZP or the EO spent more time in the light chamber, 20 when compared with the TW group – an effect not observed in mice treated concomitantly with FLU, a 21 benzodiazepine antagonist (Fig. 2A, left panel). However, concomitant treatment with WAY not only was unable to 22 block the effect of DZP, as expected, but also could not block the effect of the EO (Fig. 2A, right panel). Neither 23 FLU nor WAY could reverse the effect of DZP or the EO on the exploratory or motivational parameters such as the 24 numbers of rearings and transitions between chambers (Fig. 2 B and C). 25 26 3.7. Effect of combined administration of DZP and the EO in the LDB 27 28 The upper left corner of Fig. 3 displays the observed effect of DZP treatment at 1.0 mg/kg, the effective 29 dose in the LDB. Thus, mice treated with 0.25 mg/kg of DZP or with 2.5 mg/kg of the EO did not spend more time 30 25 than the TW group on the illuminated side of the apparatus, the main anxiety parameter in the LDB. The EO at 5.0 1 mg/kg showed a significant but discrete augmentation in this parameter. Furthermore, when mice were treated with a 2 combination of DZP and the EO, at these non-effective doses, the anxiolytic-like effect was evident, showing the 3 mutual potentiation of action between the EO and DZP (Fig. 3). 4 5 3.8. Effect of the EO and DZP on the RRT 6 7 The rota-rod test was carried out to measure locomotor impairment in mice treated acutely or repeatedly 8 with DZP or the EO. The results, presented in Table 3, include the number of disabled mice in relation to the total 9 number of treated animals in each experimental group. The disabled mice, defined as those that could not stay on the 10 rotating bar in a maximum of three attempts at 5 rpm for 1 min, did not differ statistically from the TW group, 11 suggesting an absence of treatment-induced motor impairment. 12 13 4. Discussion 14 15 The already considerable attention directed at the use of natural essential oils from plants is continuing to 16 increase. The widespread uses of these medicinal oils for bactericidal, antiparasitic, insecticidal and medicinal 17 applications are examples of their pharmaceutical use (Bakkali et al., 2008; Fandohan et al., 2008). 18 Despite the frequent use of C. citratus (lemongrass) in traditional medicine, there are few controlled studies 19 confirming its biological activity. According to a review of herbal remedies for anxiety (Ernst, 2006), there has been 20 only one placebo-controlled study on Brazilian lemongrass tea, conducted by Leite et al. (1986). Recently, our 21 laboratory demonstrated the anxiolytic-like activity of the EO from C. citratus in experimental models of generalized 22 anxiety disorder and epilepsy (Costa et al., 2006; Blanco et al., 2009) at 500 and 1000 mg/kg. 23 The observation in mice of antinociceptive activity of the EO from C. citratus at the dose of 25 mg/kg 24 (Viana et al., 2000) and an anticonvulsant effect of the EO from C. winterianus (Quintans-Júnior et al., 2008) at 25 doses below 400 mg/kg encouraged us to evaluate the anxiolytic activity of lower doses of the EO from C. citratus. 26 Thus, we decided to study essential oil effects in a dose range lower than previously tested (Blanco et al., 2009). This 27 approach showed positive results in anxiety-related parameters in the LDB, in which EO was active at 10 mg/kg. 28 The anxiolytic effect of benzodiazepines is due to their binding to GABAA receptor at a site distinct from 29 the GABA binding site (Whiting, 2003). To determine whether the anxiolytic-like effect of the EO in the LDB 30 26 occurs through the GABAergic system, mice treated with the EO or DZP were co-administered FLU, a 1 benzodiazepine GABAA site antagonist. This procedure reversed the anxiolytic-like activity of not only the standard 2 drug DZP but also the EO (Fig. 2). The ability of FLU, a specific GABAA receptor antagonist, to antagonize the 3 anxiolytic-like activity of the EO strongly suggests, for the first time, a role of this receptor complex in mediating EO 4 activity. Furthermore, according to Silva et al. (2010) the EO from C. citratus administered i.p. had anticonvulsant 5 effect, by intraperitoneal route, which was blocked by the pretreatment with flumazenil, suggesting and enhancing a 6 possible effect on the GABAergic neurotransmission system. The authors did not exclude a possible interference of 7 other systems (e.g., glycinergic) in such activity.8 The neurochemical assessment revealed no alterations in neurotransmission mediated by dopamine and 9 serotonin after acute oral treatment with EO. It has been suggested that serotonin could be a central neurotransmitter 10 involved in the modulation of anxiety and anti-anxiety effects of benzodiazepines, however neurochemical studies on 11 the effects of that class of drugs on brain serotonin metabolism/or turnover are not very consistent (Batool and 12 Haleem, 1997). On the other hand, the diazepam seems to alter levels of dopamine in the nigrostriatum of rats only at 13 doses greater than those with anxiolytic and anticonvulsant effects (Invernizzi et al., 1991). Further, the role of 14 mesolimbic DA projections in the effects of benzodiazepine-site ligands is still unclear (Heikkinen et al., 2009). 15 Even over a large range of doses, the EO produced no effect in the experimental models of obsessive-16 compulsive disorder (MBT) and depression (FST). These experimental models are not sensitive to treatment with 17 benzodiazepines but are sensitive to drugs like imipramine, which is clinically useful for treating obsessive-18 compulsive disorder and depression. Therefore, it was not surprising that the EO activity was not disrupted by 19 previous exposure to the selective 5-HT1A antagonist WAY100635. In our experience, WAY at 0.1 mg/kg is able to 20 block the activity of imipramine (30 mg/kg) in the FST (data not shown). In this manner, the WAY and EO results 21 corroborate the hypothesis that the anxiolytic-like activity of the EO is mediated by the GABAergic system. 22 When doses of DZP (0.25 mg/kg) and the EO (2.5 mg/kg) that were ineffective per se were co-23 administered, they had a synergistic effect on each other. In other words, mice treated with DZP and the EO at their 24 respective ineffective doses showed a significant increase in time spent in the LDB light chamber. In addition, mice 25 treated with effective doses of the EO (5.0 mg/kg) and DZP showed a significantly elevated light-chamber duration, 26 when compared to the EO 5.0 mg/kg alone or with DZP (Fig. 3). 27 After a single treatment with the EO, mice showed a significant increase in LDB parameters, in contrast to 28 long-term treatment, either with the EO or DZP, which produced no such increases (Fig. 1). In this procedure, only 29 the animals repeatedly treated with saline that received DZP 30 minutes before the experimental procedure showed 30 27 significant differences on the LDB anxiety parameters. Long-term treatment with the EO at 100 mg/kg produced a 1 behavioral profile similar to that observed with DZP in the same conditions, with statistical significance in reducing 2 the number of rearings and transitions between black and white compartments, without observable effects on motor 3 coordination in the rota-rod test (Table 3). The reduction in efficacy after long-term treatment with DZP, and perhaps 4 with the EO, could be due to the development of tolerance (Reynolds, 2008), as already described in mice after two 5 weeks of continuous DZP use (Flaishon et al., 2003) and which is an EO hypothesis also assessed in other species 6 (Pultrini et al., 2006). 7 The EO was effective over a wide dose range. Its sedative effects reflected in the sleep induction studies 8 were achieved at doses that are 100-fold higher than those found effective in the LDB. In the experimental procedure 9 involving ether-induced sleeping time, only at 1500 mg/kg did the EO decrease the latency to sleep and increase the 10 sleeping time, which proved to be a specific central nervous system effect. According to Tsuji et al. (1996), this 11 effect is not related to a pharmacokinetic interaction with hepatic enzymes, a recognized limitation of barbiturate-12 induced sleeping time. The decrease in spontaneous motor activity (after long-term treatment) and potentiation of 13 ether-induced sleeping time (after acute treatment at higher doses) strongly suggest central depressant activity of the 14 EO. 15 To exclude any false positive results in experimental procedures related to anxiety disorders, mice 16 underwent the rota-rod test. All animals treated with different EO doses after acute or long-term treatment showed no 17 impairment of the locomotor system (Table 3), thus confirming that the EO from C. citratus is anxiolytic in rodents 18 without any motor impairment. 19 The absence of toxicity signals or symptoms in mice, whether treated acutely or repeatedly, at the doses 20 used in the present study shows the relative safety of the EO. The absence of a deleterious effect on the 21 morphological structure of the stomach or liver in rats treated sub-acutely with doses up to 1500 mg/kg has been 22 described previously (Fandohan et al., 2008). However, the major compound in the EO from C. citratus induced 23 maternal toxicity in pregnant rats at doses higher than 125 mg/kg (Nogueira et al., 1995). This observation confirms 24 that acute toxicity data limit the pre-clinical applications of the EO because a cumulative toxic effect does occur even 25 at very low doses (Mabeku et al., 2007), reinforcing the importance of complementary toxicological studies to 26 evaluate the safety of the EO as a therapeutic alternative in folk medicine. 27 Finally, essential oils are complex mixtures of numerous molecules. The major compounds of the EO from 28 C. citratus were identified by GC/MS as follows: citral (a mixture of the cis and trans isomers – neral and geranial; 29 followed by myrcene and geraniol. According to Vale et al. (2002), citral and myrcene were not able to modify 30 28 parameters of anxiolytic activity in mice, as evaluated by the elevated plus maze. These data reinforce the idea that 1 the major compounds are not always responsible for biological activity and that such activity cannot always be 2 attributed to only one constituent from the herbal preparation, according to the concept of a multitargeted approach 3 as a therapeutic strategy (Wagner and Ulrich-Merzenich, 2009). Moreover, for biological purposes, it is more 4 informative to study whole oil rather than some of its components because the concept of synergism appears to be 5 more meaningful (Bakkali et al., 2008). 6 7 Acknowledgements 8 9 We are grateful to MSc. Filipe Galvão Ferreira, MSc. Flávia Bonamin and Dr. Leonardo Noboru Seito for technical 10 assistance. This work was part of the Ph.D. dissertation and was supported by grants from FAPESP – Fundação de 11 Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Celso A R A Costa – Proc. nº. 2006/07195-8) and CAPES – 12 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (André C Gargano). 13 14 References 15 16 Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M., 2008. Biological effects of essential oils – A review. Food 17 Chemical Toxicology 46, 446-475. 18 Batool, F., Haleem, D. J., 1997. Neurochemical and behavioural effects of diazepam: evidences from animal models. 19 Pakistan Journal Pharmaceutical Sciences 10(1), 1-8. 20 Bidinotto, L. T. Costa, C. A. R. A., Salvadori, D. M. F., Costa, M., Rodrigues, M. A. M., Barbisan, L. F., 2010. 21 Protective effects of lemongrass (Cymbopogon citratus STAPF) essential oil on DNA damage and 22 carcinogenesis in female Balb/C mice. Journal of Applied Toxicology DOI: 10.1002/jat.1593. 23 Blanco, M. M., Costa, C. A. R. A., Freire, A. 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