RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta Tese será disponibilizado somente a partir de 01/03/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA ISABELA MANCINI MARTINS Caracterização genômica, transcriptômica e infecção em diferentes modelos de Salmonella Typhimurium invasiva não-tifoidal (iNTS) Orientador: Prof. Dr. Cristiano Gallina Moreira Araraquara 2023 ISABELA MANCINI MARTINS Caracterização genômica, transcriptômica e infecção em diferentes modelos de Salmonella Typhimurium invasiva não-tifoidal (iNTS) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” como requisito para obtenção do título de Doutora em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Cristiano Gallina Moreira Araraquara 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Caracterização genômica, transcriptômica e infecção em diferentes modelos de Salmonella Typhimurium invasiva não-tifoidal (iNTS) TÍTULO DA TESE: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: ISABELA MANCINI MARTINS ORIENTADOR: CRISTIANO GALLINA MOREIRA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, área: Análises Clínicas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. CRISTIANO GALLINA MOREIRA (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Biologicas / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas do Campus de Araraquara da Unesp Profa. Dra. JULIANA PFRIMER FALCÃO (Participaçao Virtual) Análises Clínicas Toxicológicas e Bromatológicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da USP Prof. Dr. RODRIGO TAVANELLI HERNANDES (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Quimicas e Biologicas / Instituto de Biociencias de Botucatu - Unesp Profa. Dra. CARLA RAQUEL FONTANA MENDONÇA (Participaçao Virtual) Departamento de Analises Clinicas / Faculdade de Ciencias Farmaceuticas do Campus de Araraquara da Unesp Araraquara, 29 de agosto de 2023 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por me dar a vida, saúde e me proporcionar viver este momento. Sabedoria, por não me deixar desistir nas etapas mais difíceis dessa caminhada. Junto com ele, a Nossa Senhora do Perpétuo Socorro que sempre esteve no meu coração e intercedendo por mim em todos os momentos. A minha mãe Renata, que sempre foi um exemplo de mulher. Mesmo não tendo a oportunidade de estudar quando jovem, e muitas vezes dificuldades financeiras, sempre trabalhou arduamente para minha formação. Sempre fiz de tudo para que tivesse orgulho de mim, e creio que consegui. Obrigada mamãe! Agradeço ao irmão Raul, pelo amor incondicional e por ter me dado suporte em todos os momentos do doutorado. Agradeço ao meu orientador, Cristiano Gallina Moreira por ter acreditado em mim e me orientado por todos esses anos. Agradeço a toda equipe do Laboratório de Pesquisa em Patogenicidade e Sinalização Química Bacteriana (PASIQUIBAC), pela cooperação durante toda a minha trajetória. Em especial, agradeço a minhas amigas Tamara Renata Machado e Bruna Cardinali Lustri Morgado pela paciência, ensinamentos e pela companhia em todos os momentos. Agradeço as Técnicas Débora Pizzaia e Mariana Biasioli pelo suporte Agradeço a minha amiga Amanda Aparecida Seribelli pelos ensinamentos e amizade. Aos professores Dra. Juliana Pfrimer Falcão, Dr.Rodrigo Hernandes e Dra. Carla Fontana pela contribuição ao meu trabalho. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP de Araraquara, por todas as experiências adquiridas, pelo conhecimento propagado e parcerias. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. À FAPESP (processo nº 2019/03049-7) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). tel:+12019030497 5 RESUMO A compreensão dos mecanismos pelos quais as bactérias intestinais se relacionam em comunidades complexas e com o hospedeiro são essenciais para o desenvolvimento de novas terapias. Estudos anteriores do grupo revelaram mecanismos de sinalização química relacionados à patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium que causam predominantemente gastroenterite em humanos no mundo todo. Porém, estudos recentes têm demonstrado que linhagens ST313 de S. Typhimurium são capazes de evadir do Trato Gastrointestinal (TGI) e atingir a corrente sanguínea de humanos com comorbidades por via de mecanismos ainda desconhecidos. Tais linhagens são denominadas invasive non- typhoidal Salmonella (iNTS) e são descritas principalmente na África-subsaariana e no Brasil. O objetivo do presente trabalho foi auxiliar na compreensão da sobrevivência e colonização extra intestinal de linhagens de S. Typhimurium ST313. Foram utilizadas 13 linhagens de S. Typhimurium ST313 isoladas de hemoculturas humanas do Hospital Universitário da UNESP de Botucatu – SP entre os anos 1998-2011. O sequenciamento do genoma completo foi realizado para todas as linhagens pelo HiSeq e genes plasmidiais de virulência (pSLT) importantes para sobrevivência e multiplicação no hospedeiro e de resistência relacionados à produção de bombas de efluxo foram detectados na maioria das linhagens estudadas. Fenotipicamente foram observadas resistência apenas aos antimicrobianos estreptomocina, ampicilina e canamicina. A análise transcriptômica (RNA- seq) de uma linhagem de S. Typhimurium ST313 cultivada em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com sangue de carneiro a 37ºC evidenciou o aumento na expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico (oxidação de lipídeos) na linhagem invasiva, desempenhando um papel importante durante a infecção crônica e colonização tecidual. O gene fadA é necessário para oxidação do ácido graxo e o gene citX no metabolismo e transporte lipídico, ambos apresentaram aumento de expressão e até o dado momento essa via ainda não foi explorada em ST313. Foram realizados nocautes gênicos via Lambda Red para caracterização fenotípica e ensaios in vitro e in vivo para avaliar a patogênese de S. Typhimurium ST313. A interrupção dos genes alvos fadA e citX resultaram na diminuição da invasão em células HeLa e diminuição da replicação/sobrevivências em macrófagos J774. No ensaio in vivo no modelo alternativo de Galleria mellonella a porcentagem de larvas sobreviventes é superior as larvas inoculadas com linhagens mutantes durante o período de 72 horas, evidenciando a atenuação da virulência de S. Typhimurium ST313 em genes correlacionados ao metabolismo lipídico, também foi visualizado na análise histopatológica atenuação das lesões no tecido intestinal dos mutantes em comparação a linhagem selvagem. Portanto, os resultados obtidos até o momento contribuem para uma melhor caracterização da virulência deste tipo clonal e entendimento deste importante patógeno em nosso meio. Palavras-chave: S. Typhimurium ST313, testes fenotípicos relacionados à virulência, transcriptoma, Galleria mellonella. 6 ABSTRACT Understanding the mechanisms by which intestinal bacteria interact in complex communities and with the host is essential for the development of new therapies. Previous studies by the group revealed chemical signaling mechanisms related to the pathogenicity of Salmonella enterica serovar Typhimurium that predominantly cause gastroenteritis in humans worldwide. However, recent studies have demonstrated that ST313 strains of S. Typhimurium are able to evade the Gastrointestinal Tract (GT) and reach the bloodstream of humans with comorbidities through mechanisms still unknown. These strains are known as invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) and are mainly described in sub-Saharan Africa and Brazil. The aim of the study was to help in understanding the survival and extra intestinal colonization of S. Typhimurium ST313 strains. We used 13 strains of S. Typhimurium ST313 isolated from human blood cultures at the University Hospital of UNESP in Botucatu – SP between the years 1998-2011. Whole genome sequencing was performed for all strains by HiSeq and plasmid virulence (pSLT) important for survival and multiplication in the host and resistance genes related to efflux pump production were detected in most of the strains studied. Phenotypically, resistance was observed only to the antimicrobials streptomocin, ampicillin and kanamycin. Transcriptomic analysis (RNA-seq) of a strain of S. Typhimurium ST313 grown in Luria-Bertani (LB) medium supplemented with sheep blood at 37ºC showed an increase in the expression of genes related to lipid metabolism (lipid oxidation) in the invasive strain, playing an important role during chronic infection and tissue colonization. The fadA gene is necessary for fatty acid oxidation and the citX gene for lipid metabolism and transport, both showed increased expression and so far this pathway has not been explored in ST313. Gene knockouts were generated via Lambda Red, and it was used to perform phenotypic characterization and in vivo and in vitro assays to evaluate the pathogenesis of S. Typhimurium ST313. Disruption of fadA and citX target genes resulted in decreased invasion in HeLa cells and decreased replication/survival in J774 macrophages. In the in vivo assay in the alternative model of Galleria mellonella, the percentage of surviving larvae is higher in larvae inoculated with mutant strains during the 72 hours period, evidencing the attenuation of virulence of S. Typhimurium ST313 in genes correlated to lipid metabolism, was also visualized in the histopathological analysis attenuation of the lesions in the intestinal tissue of the mutants in comparison to the wild lineage. Therefore, the results obtained so far contribute to a better characterization of the virulence of this clonal type and understanding of this important pathogen in our environment. Key words: S. Typhimurium ST313, phenotypic tests related to virulence, transcriptomic analysis, Galleria mellonella. 7 Lista de Figuras Figura 1. Esquema de vias de metabolismo lipídico em Salmonella Typhimurium ............ 16 Figura 2. Estratégia de nocaute via Lambda Red ................................................................. 25 Figura 3. Volcano plot da expressão relativa entre S. Typhimurium ST313 em comparação ao LB suplementado com sangue e LB. Distribuição dos genes de ST313 de acordo com o logFC e p-value. Pontos em azul representam os genes que não tiveram sua expressão alterada; pontos em vermelho representam genes com expressão diferencial. ..................... 32 Figura 4. Análise Transcriptômica das principais vias de S. Typhimurium ST313 após o crescimento em LB suplementado com 5% de sangue de carneiro em comparação ao LB a 37ºC ........................................................................ ...............................................................33 Figura 5. qRT-PCR dos alvos fadA e citX ............................................................................ 34 Figura 6. Checagem da mutagênese via PCR dos alvos fadA e citX ....................................35 Figura 7. Curva de crescimento em meio Luria-Bertani.......................................................36 Figura 8. Curva de crescimento em meio M9 ..... .................................................................36 Figura 9. Curva de crescimento em M9 suplementado com glicose .................................... 37 Figura 10. Curva de crescimento em M9 suplementado com ácido oleico...........................37 Figura 11. Ensaio de invasão em células HeLa . ...................................................................38 Figura 12. Ensaio de replicação em macrófagos J774 em meio DMEM..............................39 Figura 13. Ensaio de replicação em macrófagos J774 em meio DMEM com glicose..........39 Figura 14. Ensaio de replicação em macrófagos J774 em meio DMEM com ácido oleico..40 Figura 15. Galleria mellonella..............................................................................................41 Figura 16. Análise histopatológica do intestino de G. mellonella infectada por S. Typhimurium SL1344 (ST19)................................................................................................42 Figura 17. Análise histopatológica do intestino de G. mellonella infectada por S. Typhimurium ST313 selvagem..............................................................................................43 Figura 18. Análise histopatológica do intestino de G. mellonella infectada por S. Typhimurium ST313 mutante fadA........................................................................................43 Figura 19. Análise histopatológica do intestino de G. mellonella infectada por S. Typhimurium ST313 mutante citX.........................................................................................44 8 Lista de Tabelas Tabela 1. Identificação e ano de isolamento das 13 linhagens de S. Typhimurium ST313 provenientes de hemoculturas humanas utilizadas no estudo.................................................20 Tabela 2. Primers utilizados na técnica de qRT-PCR............................................................23 Tabela 3. Primers utilizados na mutagênese..........................................................................25 Tabela 4. Primers utilizados na checagem da mutagênese....................................................25 Tabela 5. Perfis de resistência genotípica e fenotípica das 13 linhagens de S. Typhimurium ST313 estudadas.........................................................................……………........................29 Tabela 6. Características de genes plasmidiais das 13 S. Typhimurium ST313 provenientes de sangue humano através do Virulence Factors Database (VFDB) ..... ..............................30 9 Lista de Abreviaturas e Siglas CARD ............................................................ Comprehensive Antibiotic Resistance Database CDC .................................................................... Centers for Disease Control and Prevention CLSI ....................................................................... Clinical and Laboratory Standard Institute D.O.600 ............................................................................. Densidade Óptica a 600 nanômetros GO ................................................................................................................... Gene Onthology H&E ....................................................................................................... Hematoxilina e Eosina iNTS ................................................................................... invasive non-typhoidal Salmonella LB ........................................................................................................................ Luria-Bertani MOI ..................................................................................................... Multiplicity of infection NARMS ............................................... National Antimicrobial Resistance Monitoring System PBS ..................................................................................................... Phosphate Buffer Saline qRT-PCR ................................................ Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction SPI ................................................................................. Ilha de Patogenicidade de Salmonella ST.......................................................................................................................Sequence Type TCA............................................................................................Ciclo do Ácido Tricarboxílico TGI...........................................................................................................Trato Gastrointestinal T3SS ......................................................................................... Sistema de Secreção do Tipo 3 VFDB ........................................................................................... Virulence Factors Database ΔΔCt ....................................................................................... Comparative Critical Threshold WT ............................................................................................................................. Wild Type ZEO .......................................................................................................................... Zeomicina 10 SUMÁRIO RESUMO..................................................................................................................................5 ABSTRACT.............................................................................................................................6 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 12 1.1 Patogênese de Salmonella: SPI-1 e SPI-2 ........................................................................... 14 1.2 Metabolismo ....................................................................................................................... 15 1.3 Modelo alternativo para estudos de patogenicidade ........................................................... 17 2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ........................................................................................... 18 3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 18 4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 19 4.1. Sequenciamento de genoma completo ................................................................................. 20 4.2. Plasmídeo de virulência e genes de resistência .................................................................... 21 4.3. Perfil de susceptibilidade antimicrobiana de linhagens ST313 ........................................... 21 4.4. Extração de RNA para análise da expressão gênica ............................................................ 22 4.5. Mapeamento de bibliotecas de RNAseq e análise da expressão diferencial de genes ......... 22 4.6. Análise de ontologia gênica ................................................................................................. 23 4.7. Análise de expressão por qRT-PCR ..................................................................................... 23 4.8. Construção de mutantes isogênicos ..................................................................................... 23 4.9. Curva de crescimento ........................................................................................................... 25 4.10. Ensaio de invasão em células HeLa ................................................................................... 26 4.11. Ensaio de replicação em macrófagos ................................................................................. 26 4.12. Virulência no modelo alternativo Galleria mellonella ...................................................... 27 4.13. Análise histopatológica do modelo alternativo Galleria mellonella infectadas com S. Typhimurium ...................................................................................................................... 27 4.14. Análise Estatística .............................................................................................................. 28 5. RESULTADOS .................................................................................................................. 29 5.1. Análise de genes resistência ................................................................................................. 29 5.2. Perfil de susceptibilidade antimicrobiana ............................................................................ 30 5.3. Pesquisa de genes do plasmídeo de virulência pSLT .......................................................... 30 5.4. Análise Transcriptômica ...................................................................................................... 31 5.4.1. Análise transcriptômica de S. Typhimurium ST313 após o crescimento em LB suplementado com sangue versus LB ..................................................................................... 31 5.5. Análise da expressão gênica via qRT-PCR .......................................................................... 33 11 5.6. Checagem da mutagênese via PCR ...................................................................................... 34 5.7. Curva de crescimento em meios diferenciais ....................................................................... 35 5.8. Ensaio de invasão de células HeLa ...................................................................................... 38 5.9. Ensaio de replicação em macrófagos ................................................................................... 38 5.10. Mutantes de S. Typhimurium ST313 possuem atenuação da virulência em modelo de Galleria mellonella ............................................................................................................. 40 5.11. Análises histopatológicas de G. mellonella apresentam diferenças na preservação do tecido intestinal entre linhagem selvagem e mutantes de Salmonella Typhimurium ST313..................................................................................................................................41 7 CONCLUSÕES ................................................................................................................... 53 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 54 APÊNDICE 1 ........................................................................................................................ 68 APÊNDICE 2 ........................................................................................................................ 69 APÊNDICE 3 ........................................................................................................................ 71 12 1 INTRODUÇÃO Bactérias necessitam de mecanismos específicos para a comunicação intercelular, desta forma a sinalização química em bactérias é um dos mais intrigantes aspectos da relação entre estes microrganismos (HUGHES et al., 2010; MOREIRA et al., 2010). Assim como, a relação patógeno-hospedeiro e sua respectiva microbiota que empregam diversos mecanismos para se comunicar com o meio e regular seus mecanismos de sobrevivência (HUGHES et al., 2010; MOREIRA et al., 2010). Especificamente, Salmonella enterica subespécie enterica tem sido considerada um dos principais patógenos intestinais de origem alimentar no planeta, sendo subdivididas em dois grupos de acordo com as doenças associadas: Salmonella tifoidais e não tifoidais. As febres tifoide e paratifoide são causadas pelos sorovares S. Typhi e S. Paratyphi, respectivamente e a infecção se desenvolve inicialmente na mucosa intestinal e evolui para uma doença sistêmica (FERREIRA; CAMPOS, 2008; HARAGA et al., 2008). Salmonella não tifoidal ou do inglês non-typhoidal Salmonella (NTS) tem sido uma importante causa de gastroenterite autolimitante no mundo, sendo que apenas uma minoria dos casos (~5%) desenvolve a doença invasiva, frequentemente devido a imunossupressão, por exemplo, na infecção avançada pelo HIV (ASHTON et al., 2017). É importante mencionar que muitos sorovares de NTS descritos como hospedeiros generalistas, incluindo S. Typhimurium e S. Enteritidis são capazes de infectar animais e humanos (HARAGA et al., 2008). Segundo o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2021), estima-se que aproximadamente 1,2 milhões de pessoas são acometidas por gastroenterites ocasionadas por Salmonella resultando em 450 óbitos anualmente nos Estados Unidos (CDC, 2021). O Sequence Type (ST) 19 é o mais prevalente e estudado ST entre as linhagens de S. Typhimurium seguidas por ST34 e ST313 (ACHTMAN et al., 2012; ALMEIDA et al., 2017). O ST é obtido pela técnica de Multilocus sequence typing (MLST) que consiste em uma abordagem molecular de anotação de microrganismos e utiliza a variação alélica de genes altamente conservados em Salmonella (ACHTMAN et al., 2012). Dados clínicos e epidemiológicos indicaram que S. Typhimurium ST313 tem sido intimamente ligada à doença invasiva sistêmica como bacteremia, septicemia e meningite. As altas taxas de resistência antimicrobiana e uma mortalidade superior a 25% são frequentemente observadas no continente Africano (FEASEY et al., 2014; LEY et al., 2014; RAMACHANDRAN et al., 2015). 13 Casos de gastroenterite têm sido causados predominantemente por S. Typhimurium ST19 no mundo todo, principalmente no Malawi, Mali, Quênia, Nigéria entre outros (RAMACHANDRAN et al., 2015). No intestino delgado, S. Typhimurium atravessa a mucosa intestinal a fim de escapar das enzimas digestivas, sais biliares, peptídeos antimicrobianos, IgA secretada e defesa imunológica inata do hospedeiro. A interação com as células do hospedeiro culmina em reorganização dos filamentos de actina e facilita a internalização via macropinocitose (HARAGA et al., 2008; NEEDHAM; TRENT, 2013). Sabe-se que invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) tem sido um grave problema de saúde pública, principalmente porque causa uma alta taxa de mortalidade em pacientes com comorbidades como HIV, malária, desnutrição, caquexia e anemia falciforme na África. Além disso, muitas dessas linhagens são multidroga resistentes (resistente a três ou mais classes de antimicrobianos diferentes) gerando um cenário preocupante no continente (SINGLETARY et al., 2016; HASELBECK et al., 2017). Plasmídeos são conhecidos por serem essenciais para a virulência e resistência a antimicrobianos em diferentes bactérias, o grupo de incompatibilidade de plasmídeos IncF é heterogêneo e constantemente descrito em enterobactérias (VILLA et al., 2010; SERIBELLI et al., 2020). O plasmídeo de virulência de S. Typhimurium (pSLT) pertence ao grupo de incompatibilidade de plasmídeo IncFIIs e carreia genes importantes para a patogenicidade desse sorovar. Especificamente, neste plasmídeo há uma região altamente conservada denominada spv (Salmonella plasmid virulence) que codifica quatro genes estruturais spvA, spvB, spvC e spvD e o gene regulatório spvR (GUINEY et al., 1995; GILCHRIST; MACLENNAN, 2019). Ademais, os genes spvB e spvC são efetores da Ilha de Patogenicidade de Salmonella 2 participando no processo de apoptose de macrófagos e diminuindo a resposta inflamatória do hospedeiro, respectivamente (IBARRA; STEELE- MORTIMER, 2009; HEIJDEN; FINLAY, 2012). S. Typhimurium ST313 são normalmente isoladas do sangue humano e consideradas mais invasivas por sua capacidade de evadir do Trato Gastrointestinal (TGI) e atingir a corrente sanguínea por mecanismos ainda desconhecidos (SINGLETARY et al., 2016). No Malawi verificou-se a alta prevalência de S. Typhimurium ST313 em uma coleção de isolados datada de 1997 a 2006, todas as 31 amostras foram positivas para ST313, sendo 87% provenientes do sangue e 13% do líquido cefalorraquidiano, no Quênia 13/20 amostras foram positivas para ST313 sendo 84,7% isolados do sangue (KINGSLEY et al., 2009). Porém, existe ainda muitas dúvidas em como esta iNTS consegue alcançar e sobreviver na corrente sanguínea. 14 Estudos baseados no sequenciamento do genoma, confirmaram linhagens filogenéticas distintas de ST313, linhagem 1 (L1) foi identificada por volta de 1960 no sudoeste da África e a L2 (D23580) no Malawi em 1977 (OKORO et al., 2012). Análise da sequência completa do genoma de S. Typhimurium D23580 sugere que o ST313 pode ter sofrido degradação seletiva parcial do genoma propiciando algumas semelhanças com os sorovares de Salmonella adaptados ao hospedeiro que causam doenças invasivas, como S. Typhi, S. Paratyphi A e S. Gallinarum (KINGSLEY et al., 2009). A linhagem D23580 apresenta resistência ao cloranfenicol, no qual era o tratamento de primeira linha para infecções sépticas no Malawi em 2001 (OKORO et al., 2012; TSAI; COOMBES, 2021) Posteriormente, adquiriu-se resistência a ampicilina, canamicina, estreptomicina, sulfonamidas e trimetropim (KINGSLEY et al., 2009; SINGLETARY et al., 2016). Recentemente denominaram-se em L3 as variantes susceptíveis a antimicrobianos e clonalmente relacionadas às ST313 isoladas predominantemente em casos de gastroenterite encontrados no Reino Unido e Brasil (ASHTON et al., 2017; PULFORD et al., 2020; PEREZ-SEPULVEDA et al., 2021). No Brasil isolou-se S. Typhimurium ST313 de várias fontes como alimentos, fezes e sangue humano (ALMEIDA et al., 2017; SERIBELLI et al., 2021a). Um estudo recente demonstrou que S. Typhimurium ST313 isolada de fezes humana estabeleceu melhor colonização e invasão no cólon murino e maior expressão de genes relacionados à patogênese em comparação com a linhagem S. Typhimurium SL1344 (SERIBELLI et al., 2021b). 1.1 Patogênese de Salmonella: SPI-1 e SPI-2 A patogênese de S. Typhimurium é um mecanismo complexo e orquestrado (HARAGA et al., 2008). Diversas ilhas de patogenicidade têm sido descritas na literatura e as mais bem elucidadas a partir do sequenciamento das linhagens S. Typhimurium LT2 e ST19 (SL1344) são as ilhas que classicamente estão associadas a processos infecciosos denominadas Ilhas de Patogenicidade de Salmonella 1 e 2 (SPI-1 e SPI-2) (GALAN; CURTISS, 1989; OCHMAN et al., 1996; MARCUS et al., 2000; KRÖGER et al., 2012). As ilhas SPI-1 e SPI-2 codificam distintos Sistemas de Secreção do Tipo 3 (T3SS), estruturas em forma de agulha molecular responsáveis por injetar proteínas efetoras essenciais durante dois momentos distintos, extra e intracelular (GROISMAN; OCHMAN, 1993; SHEA et al., 1996; HENSEL et al., 1998). A SPI-1 está associada à invasão celular e contém genes que codificam proteínas efetoras, como reguladores do SPI1-T3SS. Entre tais proteínas, estão três importantes efetores (SopE, SopE2 e SopB) para o patógeno e outros três como as RhoGTPases, Cdc42, 15 Rac1 e RhoG para o hospedeiro. Estas proteínas são requeridas para a coordenação e eficiência do processo de invasão, de modo que alteram a reorganização dos filamentos de actina, facilitando o processo de internalização bacteriana por macropinocitose (GALAN & CURTISS, 1989; GROISMAN; OCHMAN, 1993; GALAN, 1996; MCGHIE et al., 2001). Após a secreção de efetores e a internalização de Salmonella, ocorre a formação do vacúolo (Salmonella-containing vacuole – SCV). Uma vez dentro da célula hospedeira, Salmonella consegue evitar a ação de células imunológicas no lúmen intestinal, protegendo-se de citocinas secretadas durante a inflamação (HERRERO-FRESNO; OLSEN, 2017). Os genes de virulência localizados em SPI-2 estão relacionados à replicação intracelular, sobrevivência em macrófagos e infecção sistêmica em camundongos (SRIKANTH et al., 2011). A proteína SsrB liga-se a todos os promotores da SPI-2 de agrupamentos de genes essenciais para a expressão estrutural, reguladora e de componentes efetores deste locus (SRIKANTH et al., 2011). Apesar de ser codificada fora de SPI-2, a proteína efetora SifA é secretada via o aparato T3SS codificado por SPI-2, sendo que esta é crucial na indução da tubulação do fagossomo de S. Typhimurium (GROISMAN; OCHMAN, 1993; SHEA et al., 1999). 1.2 Metabolismo Bactérias podem causar doenças em diversos hospedeiros e quanto mais nos aprofundamos na dinâmica do funcionamento destes microrganismos observamos que algo distinto ocorre em cada situação, podendo isso ser devido a fatores externos ao microrganismo ou a sua capacidade de adaptação aos diferentes hospedeiros (LUSTRI et al., 2017). Salmonella Typhimurium possui um metabolismo energético diversificado para colonizar novos nichos infecciosos, ativando rotas metabólicas, a fim de sobreviver a ambientes diferenciados (TAYLOR; WINTER, 2020). Há habilidade de utilizar ácidos graxos e o desvio de glioxilato parece desempenhar um papel crítico em Salmonella durante a infecção crônica em hospedeiros mamíferos (FANG et al., 2005; HERRERO-FRESNO; OLSEN, 2017). A degradação do ácido graxo por S. Typhimurium envolve múltiplos passos (Figura 1), alguns dos quais podem ser executados por produtos genéticos codificados por uma via de metabolismo lipídico canônico ou secundário (CLARK; CRONAN, 2005; IRAM; CRONAN, 2006). Os ácidos graxos de cadeia média e longa são transportados através da membrana externa por FadL e FadD e ativados pela adição de coenzima A (CoA) para produzir acil-CoA (REENS et al., 2020). 16 Na segunda etapa do metabolismo lipídico, o acil-CoA é oxidado por uma série de enzimas para produzir acetil-CoA, participando no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (IRAM; CRONAN, 2006; REEN S et al., 2019) (Figura 1). Figura 1. Esquema de vias de metabolismo lipídico em Salmonella Typhimurium Salmonella Typhimurium é capaz de utilizar tanto os caminhos canônicos (YafH, FadB e FadA) ou secundário (YdiO, YfcX e YfcY) da β-oxidação (oxidação de ácidos graxos). Em condições anaeróbias S. Typhimurium utiliza o caminho secundário e em condições aeróbias depende em grande parte da via canônica (REENS et al., 2020). Quando os lipídeos são a única fonte de carbono para S. Typhimurium o desvio do glioxilato se faz necessário para preservá-lo e incorporar em vias biosintéticas. No terceiro passo do metabolismo lipídico do TCA, o acetil-CoA é convertido em citrato e posteriormente em isocitrato. Nessa etapa as enzimas AceA (isocitrato liase) e AceB (malato sintase) fazem o desvio e convertem isocitrato em glioxilato, preservando o carbono e cofatores durante o crescimento na ausência de fontes de energia glicolíticas (FANG et al., 2005; YIMGA et al., 2006; REENS et al., 2020; TAYLOR; WINTER, 2020). Fonte: Adaptado de Reens (REENS et al., 2020). Figura 1. Esquema de vias de metabolismo lipídico em S. Typhimurium. (A) Os ácidos graxos livres de cadeia longa e média são importados via FadL e ativados por FadD ou YdiD (sínteses de acil-CoA). As proteínas de importação canônica são negras; a importação secundária é laranja. (B) Os acil-tioesters resultantes são serialmente β-oxidados via YafH ou YdiO, FadB ou YfcX e FadA ou YfcY. O produto é metabolizado através do ciclo TCA. A β-oxidação canônicos são azuis e a β-oxidação secundária em vermelho. (C) O desvio do glioxilato (verde) consiste em AceA (isocitrato liase) e AceB (malato sintase), que fazem a ponte do ciclo TCA. 17 1.3 Modelo alternativo para estudos de patogenicidade Nos últimos anos, sabe-se que a prática científica tem buscado a utilização de modelos alternativos de infecção, como uma ferramenta para minimizar o uso de animais em pesquisa. Galleria mellonella é a maior mariposa da cera de abelhas e tem sido amplamente utilizada como hospedeiro modelo, devido a presença de uma resposta imune inata com alto grau de homologia com o sistema mamífero, os hemócitos presente na hemolinfa comportam-se de forma similar às células fagocíticas apresentando robusta explosão oxidativa em resposta a alvos microbianos (MARMARAS; LAMPROPOULOU, 2009; BENDER et al., 2013; VIEGAS et al., 2013). Além disso, em contraste com outros modelos invertebrados, experimentos com larvas de G. mellonella podem ser realizados a 37ºC, temperatura ideal para a grande maioria dos patógenos humanos (BENDER et al., 2013). Estudos demonstraram a correlação positiva em dados obtidos nos ensaios de virulência no modelo de camundongos infectados por Candida albicans e Aspergillus fumigatus em comparação aos achados em larvas de G. mellonella (BRENNAN et al., 2002; SLATER et al., 2011). Ademais, o modelo alternativo de G. mellonella também foi empregado para avaliar a virulência de Paracoccidioides spp. (SCORZONI et al., 2015) e patógenos bacterianos, incluindo Staphylococcus aureus (GROUNTA et al., 2016), Serratia marcescens (CHADWICK et al., 1990), Pseudomonas aeruginosa (JANDER et al., 2000), Listeria monocytogenes (MUKHERJEE et al., 2010), Enterococcus faecalis (LEBRETON et al., 2011) e S. Typhimurium (BENDER et al., 2013; SERIBELLI et al., 2020). Outras vantagens de utilizar G. mellonella como modelo de infecção é a capacidade de aplicar doses bacterianas definidas através da hemocele e são facilmente cultivadas em grande número a baixo custo (BENDER et al., 2013). 53 7 CONCLUSÕES Este estudo analisou características fenotípicas, genotípicas e transcriptômicas de linhagens de S. Typhimurium ST313 provenientes de hemoculturas humanas no Estado de São Paulo. As linhagens desse ST brasileiro não demonstram a resistência encontrada na África por outro lado observou-se a resistência ao antimicrobiano comumente utilizado na prática veterinária. Visivelmente, demostramos aqui que mutantes do metabolismo lipídico são importantes para a patogênese da linhagem de S. Typhimurium ST313 evidenciado nos testes realizados, incluindo a invasão em células HeLa, sobrevivência em macrófagos J774 e infecção no modelo alternativo de G. mellonella. De maneira geral, os resultados do presente trabalho contribuíram para um melhor entendimento dessas linhagens invasivas, as quais apresentam um grave problema de saúde pública no continente Africano. 54 REFERÊNCIAS ACHTMAN, M.; WAIN, J.; WEILL, F.X.; NAIR, S. et al. Multi locus sequence typing as a replacement for serotyping in Salmonella enterica. PLoS Pathog, v.8, p1-19, 2012. ALMEIDA, F.; SERIBELLI, A.A.; SILVA, P.; MEDEIROS, M.I.C.et al. 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