GUSTAVO TADEU VOLPATO REPERCUSSÕES MATERNAS, REPRODUTIVAS E PERINATAIS DO TRATAMENTO COM EXTRATO AQUOSO DE FOLHAS DE Bauhinia forficata (PATA-DE-VACA) NA PRENHEZ DE RATAS NÃO-DIABÉTICAS E DIABÉTICAS Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, Curso de Pós-Graduação em Ginecologia e Obstetrícia, Área de Concentração em Obstetrícia, para obtenção do título de Mestre. ORIENTADORA: Profa. Dra IRACEMA DE MATTOS PARANHOS CALDERON BOTUCATU 2001 1 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SULAMITA SELMA CLEMENTE COLNAGO Volpato, Gustavo Tadeu Repercussões maternas, reprodutivas e perinatais do tratamento com extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata (Pata-de-vaca) na prenhez de ratas não- diabéticas e diabéticas / Gustavo Tadeu Volpato. – 2001. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2001. Orientador:Iracema de Mattos Paranhos Calderon 1.Diabetes na gravidez – Estudos experimentais CDD 618.3 Palavras-chave: Bauhinia forficata; Diabete; Plantas medicinais; Gravidez; Malformações 2 SUMÁRIO Capítulo I ................................................................................................. 3 Referências Bibliográficas .............................................................. 16 Capítulo II ................................................................................................ 27 Resumo .......................................................................................... 28 Abstract .......................................................................................... 30 Introdução ....................................................................................... 32 Objetivos ......................................................................................... 36 Material e Método ........................................................................... 37 Animais ................................................................................. 37 Grupos Experimentais ........................................................... 37 Planta e Preparo do Extrato ................................................ 38 Seqüência Experimental ....................................................... 38 Métodos de Avaliação ........................................................... 40 Análise Estatística ................................................................. 45 Resultados ...................................................................................... 46 Discussão ....................................................................................... 57 Do Método ............................................................................ 57 Dos Resultados .................................................................... 59 Conclusões ..................................................................................... 65 Referências Bibliográficas .............................................................. 66 3 CCaappííttuuooll 11 UUssoo PPooppuullaarr ddee PPllaannttaass ccoommoo OOppççããoo TTeerraappêêuuttiiccaa nnoo CCoonnttrroollee ddoo DDiiaabbeetteess MMeelllliittuuss 4 Os vegetais fazem parte da vida do homem desde seus primórdios, sendo utilizados como fonte de alimentos, de materiais para o vestuário, habitação e utilidades domésticas, de confecções de armas de defesa e ataque, na produção de meios de transporte e também na cura de doenças1. O homem primitivo, interessado em sua sobrevivência, foi descobrindo plantas com ação tóxica e medicinal, tendo início a sistematização empírica de seu uso2. Até o século XIX, os recursos terapêuticos eram constituídos predominantemente por plantas e extratos vegetais, ou seja, as plantas medicinais e seus extratos constituíam a maioria dos medicamentos que, naquela época, pouco se diferenciavam dos remédios utilizados na medicina popular1. O uso de princípios naturais como terapia alternativa é muito difundido em países onde grande porcentagem da população não tem acesso à assistência médica. No Brasil, este fato é enriquecido pela tradição cultural dos índios3. Outra justificativa seria o alto custo dos medicamentos, tornando estes produtos inacessíveis para a população dos países do terceiro mundo e, em decorrência, o recurso da medicina não alopata como opção terapêutica4. É comum o pensamento de que as plantas medicinais de uso tradicional já foram testadas e homologadas pelo uso prolongado na espécie humana. Por isso, são considerados remédios eficazes e que não apresentam efeitos colaterais, não necessitando, portanto, de avaliação. A automedicação milagrosa com plantas medicinais chega ao extremo de substituir terapias em doenças graves como, por exemplo, as de efeito hipoglicemiantes ou antidiabéticas5. Diabetes mellitus é uma síndrome ocasionada pela falta de produção de insulina pelas células beta (β) das ilhotas de Langerhans (diabete tipo 1 ou insulino-dependente) ou pelo defeito nos receptores para insulina nas células-alvo (diabete tipo 2 ou não insulino-dependente). É caracterizada como desordem crônica, que altera o metabolismo de carboidratos, gordura e proteínas, tendo como sinais cardinais polifagia (fome insaciável), polidipsia (sede constante) e poliúria (micção excessiva)6, 7, 8. O diabete é síndrome de enorme importância, pois afeta cerca de 7% da população mundial. Nos Estados Unidos, o Diabetes Mellitus constitui a quarta razão mais comum pela qual os pacientes procuram assistência médica, tornando-se causa destacada de incapacidade e morte. No Brasil, existem mais 5 de cinco milhões de portadores de diabete, dos quais metade desconhece o diagnóstico. A doença acomete igualmente homens e mulheres, aumentando de modo considerável em relação à idade, com prevalência de 7,6%, semelhante a dos países desenvolvidos9. Para o tratamento dessa patologia, são indicados exercícios físicos regulares e dieta adequada, independentemente do tipo de diabete. No diabete tipo 1, o uso de insulina é obrigatório. No diabete tipo 2, caso a dieta não consiga controlar a hiperglicemia, recorre-se aos hipoglicemiantes orais e, em alguns casos, à insulina10, 11. Outro recurso para o controle do diabete é o uso de plantas com atividade supostamente hipoglicemiante12. O uso de plantas é o tratamento mais antigo para Diabetes mellitus e data do “Papirus de Ebers”, de 1550 a.C., o qual recomendava dieta com grande quantidade de fibras dos grãos de algodão e ocre. Após a introdução da terapia convencional com insulina, o uso do tratamento tradicional declinou acentuadamente nas sociedades ocidentais. Não obstante, algumas práticas tradicionais continuaram como propostas profiláticas ou como complemento para a terapia convencional13. Em regiões sub-desenvolvidas, nas quais a medicina convencional não está totalmente disponível, o tratamento tradicional ainda permanece como a principal forma de terapia para o diabete4. Poucos dos tratamentos tradicionais com plantas, utilizados no controle do diabete, têm recebido atenção médica ou científica. Os especialistas da OMS (Organização Mundial de Saúde) recomendam que os métodos tradicionais devam ser melhor investigados14. O uso popular não é suficiente para validar eticamente as plantas medicinais como drogas eficazes e seguras. Neste sentido, as plantas medicinais não diferem de qualquer xenobiótico sintético, e sua preconização ou autorização devem ser fundamentadas em evidências experimentais, comprovando que os riscos são suplantados pelos benefícios15. Vários métodos como a pancreatectomia parcial ou total16, o uso de hormônios antiinsulínicos, a exposição à hidrocortisona ou ACTH, lesões no sistema nervoso central17 e o uso de agentes químicos β-citotóxicos, como a aloxana e o streptozotocin18, 19, foram desenvolvidos para indução do diabete. Atualmente, o mais utilizado é a indução com streptozotocin (STZ), droga dose dependente com toxicidade seletiva para as células β7. Os efeitos de substâncias 6 ativas, presentes em plantas, responsáveis pelo efeito hipoglicemiante ou antidiabético foram avaliados em diversos trabalhos, a partir desses modelos experimentais. A primeira etapa do estudo de um fitoterápico é a seleção do material vegetal a ser testado20. Existem três tipos distintos de abordagem para a seleção de espécies medicinais na investigação farmacológica: 1) randômica (ao acaso): quando não é utilizado qualquer critério para seleção das plantas, ou seja, elas são investigadas aleatoriamente, sempre que houver disponibilidade de espécies; 2) quimiotaxonômica: quando são selecionadas espécies de acordo com a ocorrência de uma dada classe química de substâncias de um gênero ou família; 3) etnofarmacológica: quando se seleciona plantas de acordo com o uso terapêutico alegado por um determinado grupo étnico21. Apesar de representarem obstáculos na validação de um determinado fitoterápico, outras etapas importantes devem ser cumpridas. É essencial garantir a uniformidade e a estabilidade do produto a ser utilizado. Nesse sentido, a planta medicinal oferece dificuldades já na fase preliminar. A confusão botânica entre espécies afins é comum; os exemplares de uma mesma espécie, colhidos em épocas ou lugares diferentes, não possuem necessariamente a mesma atividade biológica; torna-se difícil o controle químico de um extrato vegetal, em virtude do grande número de substâncias presentes20. Deve-se também levar em consideração fatores que alteram a extração do princípio ativo, tais como as características do material vegetal, o meio extrator (solvente) e a metodologia empregada22. Por essa razão, os efeitos biológicos produzidos por uma mesma espécie vegetal podem ser diferentes, mostrando que apenas a identificação botânica não é suficiente para garantir a atividade medicinal de uma planta5. Quando diferentes partes de Eugenia jambolana (Jambolão) foram testadas em animais diabéticos, observaram-se resultados diversos. Sementes e frutos de E. jambolana, administrados na dieta de ratos com diabete induzido por streptozotocin, tiveram efeito hipoglicemiante23. Entretanto, o uso do extrato das folhas dessa mesma planta não confirmou o efeito hipoglicemiante, quando administrado por via oral a ratos diabéticos24. A diferença de sensibilidade entre as espécies é outro aspecto a ser considerado. O efeito hipoglicemiante do extrato das folhas de Aloe barbadensis 7 (Babosa), administrado por via oral, foi confirmado em camundongos com diabete induzido por aloxana25. O extrato das folhas da mesma planta não apresentou efeito hipoglicemiante quando administrado por via oral em coelhos diabéticos26. Embora os dois trabalhos tivessem utilizado metodologia semelhante quanto à forma de extração, à via de administração e à parte da planta utilizada (folhas), houve diferença nos resultados quanto ao efeito hipoglicemiante, relacionada à eventual diferença de sensibilidade entre as espécies de animais. Por fim, tem relevância a dose necessária para o efeito desejado. Existe uma dose limite para cada substância, onde abaixo desta não se observa nenhum efeito27. Por outro lado, com uma dose mais elevada corre-se o risco de toxicidade, pois a planta medicinal pode originar produtos metabólicos potencialmente tóxicos5. Kedar & Chakrabarti28 verificaram que coelhos com diabete induzido por streptozotocin, alimentados com várias doses do pó de sementes de Momordica charantia (Melão de São Caetano), durante 21 dias, apresentaram diferentes resultados de acordo com a dose empregada no controle glicêmico. Os animais que receberam 1 e 2 g/kg de peso não apresentaram efeito hipoglicemiante, mas os que receberam 3 g/kg de peso tiveram redução nos níveis de glicose sangüínea. Alguns trabalhos vêm sendo realizados para se compreender os possíveis mecanismos de ação pelos quais os princípios ativos de plantas exercem efeito hipoglicemiante. Dentre esses mecanismos, salientam-se12, 29: ♦ diminuição da absorção de glicose no intestino, ♦ atuação sobre as células β do pâncreas e estimulação sobre a secreção de insulina, ♦ inibição da síntese de glicose-6-fostato ou qualquer enzima que degrade o glicogênio, ♦ estimulação do efeito da insulina e da adrenalina, ♦ proteção do pâncreas contra o efeito de drogas. Nissin30 e Hart & McColl31 mostraram que certas substâncias são capazes de inibir a absorção intestinal de glicose, como alguns laxantes e fibras. A diminuição de glicose no intestino foi observada pela técnica de perfusão intestinal de glicose com extrato aquoso das folhas de Chrysobalanus icaco (Cajuru), administrado por via oral em ratos com diabete induzido por aloxana32. 8 Munari et al.33 relataram que a administração de cápsulas de Opuntia fícus-indica (Figueira da Índia) resultou em manutenção dos níveis glicêmicos em indivíduos diabéticos. Os que receberam placebo tiveram aumento nos níveis de glicemia. Concluíram que a grande quantidade de fibras desta planta pode ter retardado a absorção de glicose no intestino. Sharma et al.34 constataram efeito hipoglicemiante do extrato aquoso e etanólico de sementes Caesalpinia boducella (Olho-de-gato), em ratos com diabete induzido por STZ, possivelmente devido a estímulo das células β sobreviventes na liberação de insulina. Ratos diabéticos submetidos ao tratamento com extrato aquoso das folhas de Aegle marmelos (Bilva) apresentaram diminuição nos níveis de glicose sangüínea, cujo efeito foi relacionado à ação da planta em aumentar a secreção de insulina35. Através de análise bioquímica, Shibib et al.36 constataram que a atividade hipoglicemiante do extrato alcoólico de Momordica charantia (Melão de São Caetano), em ratos diabéticos, foi devida à diminuição da glicogenólise hepática, pela elevação dos níveis da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e conseqüente depressão dos efeitos da glicose-6-fosfato. Também, atribuído à redução significativa da atividade da glicose-6-fosfatase hepática, Glombitza et al.37 observaram efeito hipoglicemiante do extrato de Zizyphus spina-christi (Coroa-de-cristo), administrado por via oral, a ratos com diabete induzido por STZ. Chattopadhyay38 sugeriu que o extrato alcoólico das folhas de Ocimum sanctum (Manjericão), administrado a ratos com diabete induzido por STZ, promove efeito hipoglicemiante pela potencialização da insulina exógena. Estudando os efeitos pancreáticos e extra-pancreáticos produzidos pelas folhas de Medicago sativa (Alfafa), em camundongos diabéticos, Gray & Flatt39 também admitiram que a planta reduz a hiperglicemia através da potencialização da ação e da secreção de insulina. Kamtchouing et al.40, pesquisando os efeitos hipoglicemiantes do extrato aquoso de folhas de Anacardium occidentale (Cajueiro), aventaram o efeito protetor da planta sobre as células β contra a toxicidade produzida pelo streptozotocin. Muitas plantas utilizadas popularmente para o controle da hiperglicemia, apesar de comprovado efeito em animais, não foram testadas ou não tiveram seu 9 efeito confirmado em pesquisas envolvendo seres humanos (Tabela 1). Dentre as mais comuns estão a Eugenia jambolana (Jambolão), o Aegle marmelos (Bilva), a Bauhinia candicans (Pata-de-vaca), o Allium cepa (Cebola) e a Polymnia sonchifolia (Yacon). Tabela 1. Plantas medicinais de uso popular com comprovado efeito hipoglicemiante em animais. Nome da espécie Nome popular Parte utilizada Tipo do extrato Dose Via Animal Nº Ref. Acacia arabica ou A. nilodica Árvore da goma arábica Semente Semente Tritura Aquoso 2-4 mg/kg 15 ml/kg v.o. v.o. Coelho Rato 41 42 Aegle marmelos Bilva Folha Folha Folha Aquoso Aquoso Aquoso 1 g/kg 100 mg/kg 0,1 g/ml v.o. v.o. v.o. Rato Rato Rato 43 35 44 Agaricus campestris Champgnon Tudo Aquoso 0,25-1 mg/kg v.o. Cdgo. 45 Agrimonia eupatoria Agrimônia Folha Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 62,5 g/kg v.o. Cdgo. 46 Allium cepa Cebola Bulbo Bulbo Éter Alcoólic o 100 mg/kg 250 mg/kg v.o. v.o. Coelho Coelho 47 48 Allium sativum Alho Bulbo Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 62,5 g/kg v.o. Cdgo. 49 Aloe barbadensis Babosa Folha Macera do 500 mg/kg v.o. Cdgo. 25 Aloe vera Babosa Semente Aquoso 1 g/kg v.o. Rato 50 Ambrosia maritima Losna do campo −⎯ Aquoso 15 ml/kg v.o. Rato 42 Anacardium occidentale Cajueiro Folha Aquoso 175 mg/kg v.o. Rato 40 Artemisia arborescens Losna de Portugal −⎯ Aquoso 15 ml/kg v.o. Rato 42 Atriplex hamilus Salgadeira Folha Aquoso 50 ml/kg v.o. Rato 51 10 Coninuação… Bauhinia candicans Pata-de-vaca Folha Aquoso 0,2 g/ml v.o. Rato 52 Beta vulgaris Acelga Folha Aquoso 2-8 g/kg v.o. Coelho 53 Biophytum sensitivum Azedinha sensitiva Folha Aquoso −⎯ v.o. Coelho 54 Bumelia sartorum Quixabeira Caule Caula Alcoólic o Alcoólic o 100 mg/kg −⎯ v.o. v.o. Rato Rato 55 56, 57 Caesalpia ferrea Pau-ferro Caule Alcoólic o 100 mg/kg v.o. Rato 55 Caesalpina bonducella Olho-de-gato Semente Semente Aquoso e alcoólic o 100, 250 e 500 mg/kg v.o. v.o. Rato Rato 58 34 Cajanus cajan Feijão Guandu Folha Semente Aquoso Aquoso 1 g/kg 60 e 80 % i.p v.o. Rato Cdgo. 59 60 Camellia sinensis Chá-da-índia Folha Aquoso 20 ml/kg v.o. Rato 61 Cassia alata Maria-preta Folha Aquoso −⎯ v.o. Rato 62 Cassia fistula Cannafistula verdadeira Folha Aquoso 1 g/kg i.p. Rato 59 Cecropia obtusifolia Embaúba Folha Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Chrysobalanus icaco Cajuru Folha Aquoso 5 % v.o. Cdgo. 32 Coriandrum sativum Coentro Semente Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 62,5 mg/kg v.o. Cdgo. 63 Costus speciosus Canna do brejo Raiz Aquoso −⎯ v.o. Rato 64 Croton cajuraca Cajucára Casca Fração 25 e 50 mg/kg v.o. Rato 65 11 Continuação... Cucurbita ficifolia Abóbora chila Fruto Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26, 66 Cuminum cyminum Cominho Semente Dieta 1,25 % v.o. Rato 67 Eriobotrya japonica Ameixa amarela Folha Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Eucaliptus globulus Eucalipto Folha Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 6,25 % v.o. Cdgo. 68 Eugenia jambolana Jambolão Semente Semente Fruto Aquoso/ dieta 1 g/kg 170-510 mg/kg −⎯ v.o. v.o. v.o. Coelho Rato Rato 69 70 23 Euphorbia prostrata Quebra-pedra Tudo Aquoso 18 mg/kg v.o. Coelho 71 Geranum robertianum Bico de cegonha −⎯ Aquoso 15 ml/kg v.o. Rato 42 Guazuma ulmifolia Camacan Folha Aquoso 11 mg/kg v.o. Coelho 71 Juniperus communis Cedro, Zimbro Semente Semente Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 6,25 % 250 mg/kg v.o. v.o. Cdgo. Rato 49 72 Lactuca virosa Alface −⎯ Aquoso 15 ml/kg v.o. Rato 42 Lagerstroemia speciosa Escumilha Folha Aquoso 5 % v.o. Cdgo. 73 Luffa aegyptiaca Buxa dos paulistas Semente Alcoólic o 2 g/kg v.o. Rato 74 Lupinus termis Tremoço branco Semente Aquoso 1 g/kg v.o. Rato 50 Manihot esculeta Mandioca Raiz Aquoso 50 mg/ml v.o. Rato 75 Medicago sativa Alfafa Folha Aquoso/ dieta 2,5 g/l e 6,25 % v.o. Cdgo. 39, 49 12 Coninuação… Momordica charantia Melão de São Caetano Fruto Semente Fruto Semente Semente Fruto Alcoólic o Tritura Aquoso Tritura −⎯ Acetílico 500 mg/kg 1-3 g −⎯ 0,5 % 200 mg/kg −⎯ v.o. v.o. v.o. v.o. v.o. v.o. Rato Coelho Rato Rato Rato Rato 76 28 77 78 36 79 Morus alba Amoreira branca Folha Raiz Aquoso Alcoólic o 0,2 g/ml −⎯ v.o. v.o. Rato Cdgo. 52 80 Musa sapientum Bananeira Flor Aquoso 65 mg/kg v.o. Coelho 71 Nelumbo nucifera Lotus do Egito Raiz Alcoólic o 400 mg/kg v.o. Rato 81 Nephrolepsis tuberosa Samambaia Caule Aquoso −⎯ v.o. Rato 64 Ocimum sanctum Manjericão Folha Folha Folha Alcoólic o Aquoso Tritura 200 mg/kg 10 g% −⎯ v.o. v.o. v.o. Rato Rato Rato 38 82 83 Phaseolus vulgaris Feijão Vagem Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Phyllanthus amarus Quebra-pedra Folha Aquoso 0,1 e 1 g/kg v.o. Coelho 84 Polygonatum officinale Selo-de- salomão Raiz Alcoólic o 800 mg/kg i.p.. Cdgo. 85 Polymnia sonchifolia Yacon Folha Aquoso 32,4 mg/kg v.o. Rato 86 Portulaca oleracea Beldroega pequena −⎯ Aquoso 15 ml/kg v.o. Rato 42 Psidium guajava Goiabeira Fruto Aquoso 1 g/kg i.p. Cdgo. 87 Punica granatum Romã Fruto Alcoólic o 100 mg/kg i.p. Cdgo. 29 13 Coninuação… Solanum verbascifolium Fruta do lobo Folha Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Tecoma stans Guará-guará Folha e caule Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Teucrium cubense Teucrio Folha Aquoso 4 ml/kg v.o. Coelho 26 Tournefortia hirsutissima Herva de lagarto Caule Aquoso 11 mg/kg v.o. Coelho 71 Trigonella foenum graceum Feno-grego Folha Semente Folha Semente Semente Semente Aquoso Aquoso Aquoso Fração Alcoólic o Alcoólic o 0,06-8 g/kg 1 g/kg 27 mg/kg 1,86 g/kg 200 mg/kg 200 mg/kg v.o./ i.p. v.o. v.o. v.o. v.o. v.o.. Rato Rato Coelho Cão Rato Cdgo. 88 50 71 89 90 91 Turnera diffusa Damiana Folha Aquoso 65 mg/kg v.o. Coelho 71 Vinca rosea Boas noites Folha Aquoso −⎯ v.o. Rato 92 Zizyphus jujuba Jujuba Folha Aquoso 3 ou 6 % v.o. Rato 93 Zizyphus sativa Jujuba Folha Alcoólic o 100-400 mg/kg v.o. Rato 94 Zizyphus spina-christi Coroa de cristo Folha Aquoso 100 mg/kg v.o. Rato 37 Apesar do efeito hipoglicemiante ou antidiabético confirmado experimentalmente, muitas plantas medicinais não foram validadas como fitoterápicos de acordo com protocolos científicos modernos, com relação à eventual toxicidade e ao controle de qualidade apropriado. Outro fator de importância é a dose padronizada em animais e sua equivalência à dose mínima necessária para obtenção do mesmo efeito no homem. A maioria dessas plantas não pode, portanto, ser aceita como medicamento ético de prescrição livre5. Outro grupo de plantas já foi testado e seu efeito hipoglicemiante comprovado no homem, destacando-se a Ficus carica (Figueira), a Momordica 14 charantia (Melão de São Caetano), o Ocimum album (Remédio de vaqueiro), o Ocimum sanctum (Manjericão), a Opuntia ficus-indicaceum (Figueira-da-índia), o Phyllanthus amarus (Quebra-pedra) e a Trigonella foenum-graceum (Feno-grego) (Tabela 2). Tabela 2. Plantas medicinais de uso popular com comprovado efeito hipoglicemiante no homem. Nome da espécie Nome popular Parte utilizada Tipo do extrato Dose Via Refe- rênci a Ficus carica Figueira Folha Aquoso −⎯ v.o. 95 Momordica charantia Melão de São Caetano Fruto Aquoso −⎯ v.o. 96 Ocimum album Remédio de vaqueiro Folha Aquoso 25 mg/kg v.o. 97 Ocimum sanctum Manjericão Folha Folha Aquoso Tritura 25 mg/kg −⎯ v.o. v.o. 97 98 Opuntia fícus- indica Figueira da india Caule Cápsula 3,35 mg/caps v.o. 33 Phyllanthus amarus Quebra-pedra Folha Aquoso −⎯ v.o. 99 Trigonella foenum-graceum Feno-grego Semente Semente Na dieta Na dieta 100 g 12,5 g v.o. v.o. 100 101 Uma vez estabelecido o grau de confiança do ponto de vista toxicológico, e comprovada sua segurança, é possível que essas plantas possam ser usadas como terapêutica complementar da terapia convencional do diabete. Embora seja improvável que um substituto botânico, oralmente ativo, venha mimetizar a ação da insulina, os extratos ou princípios ativos de plantas, com ação estimulante na biossíntese e secreção de insulina endógena (e conseqüente promoção de sua ação), são possibilidades reais13. A idéia primordial na indicação de fitoterápicos não é substituir medicamentos registrados e já comercializados, mas sim aumentar a opção 15 terapêutica dos profissionais de saúde, considerando-se a redução dos custos5 e os benefícios de uma ação coadjuvante, potencializadora da terapia convencional. 16 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Schenkel EP; Gosman G, Petrovick PR. Produtos de origem vegetal e o desenvolvimento de medicamentos. In: Simões CMO, Schenkel EP; Gosman G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR (editores). Farmacognosia: da planta ao medicamento (1ed). Porto Alegre (RS): UFRGS; 1999: 489-516. 2. Poser GL, Mentz LA. Diversidade biológica e sistemas de classificação. 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Objetivo Geral: Avaliar os efeitos do extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata (Pata-de-vaca) sobre o metabolismo materno, a performance reprodutiva, o desenvolvimento fetal e a teratogênese na prenhez de ratas diabéticas e não- diabéticas. Objetivos Específicos: Comparar os níveis glicêmicos e o ganho de peso em ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar as taxas de prenhez a termo e de perda pré e pós-implantação em ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar o peso médio dos recém-nascidos e das placentas, o índice placentário e o percentual de recém-nascidos pequenos (PIP), adequados (AIP) e grandes (GIP) para a idade de prenhez em ninhadas de ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar a freqüência de anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas de ratas prenhes, diabéticas e não- diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. 29 Material e Método: Ratas Wistar prenhes constituíram quatro grupos experimentais, de acordo com a presença ou não de diabete e em função do tratamento com Bauhinia forficata. O diabete foi induzido antes da prenhez pela injeção intravenosa de streptozotocin (40 mg/kg de peso). O extrato de folhas de Bauhinia forficata foi administrado por via oral (gavage) em três doses crescentes: 500 mg/kg do 0 ao 4° dia de prenhez, 600 mg/kg do 5° ao 14° e 1000 mg/kg do 15° ao 20°, sendo dois terços da dose administrados pela manhã e um terço à tarde. O grupo controle foi tratado com água destilada. As doses foram ajustadas diariamente de acordo com o peso do animal. No 21º dia da prenhez, as ratas foram submetidas à cesárea para retirada dos recém-nascidos e avaliação da performance reprodutiva e das anomalias e malformações. Resultados e Conclusões: O extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata, administrado a ratas prenhes não-diabéticas: 1. não interferiu com os níveis glicêmicos e com o ganho de peso materno; 2. não influenciou na performance reprodutiva e no desenvolvimento fetal e placentário; 3. não foi teratogênico, não aumentando a freqüência de malformações e anomalias fetais, esqueléticas ou viscerais, observadas nos recém- nascidos de ratas não-diabéticas e não tratadas. O extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata, administrado a ratas prenhes diabéticas: 1. não controlou os níveis glicêmicos e não favoreceu o ganho de peso materno; 2. não melhorou a performance reprodutiva e o desenvolvimento fetal e placentário; 3. influenciou a teratogênese de forma positiva, diminuindo a freqüência de algumas anomalias esqueléticas (vértebra bipartida) e malformações viscerais (hidronefrose) e mostrando tendência à queda na freqüência de outras malformações esqueléticas (esternébrio ausente e palatosquese) e viscerais (microftalmia), em relação à observada nos recém-nascidos de ratas diabéticas não tratadas. 30 ABSTRACT Justificative: It is well known that diabetic pregnant women often use plants that are popularly used as hypoglycemic, regardless its action is not established yet. In this set, Bauhinia forficate (“Pata-de-vaca”) is one of the most mentioned. The risk using this plant lies in the fact that maternal and fetal effects, as well as its side effects, are not known. Thus, it is plausible to access whether the aqueous extract of B. forficata, administered to diabetic and non-diabetic pregnant rats, can interfere in maternal glycemia, especially in reproductive performance and fetal malformations. General goal: To investigate the effects of aqueous extract of leaves of Bauhinia forficata (“Pata-de-vaca”) on maternal metabolism, reproductive performance, fetal development and teratogenicity in pregnant diabetic and non-diabetic female rats. Specific goals: • To compare glycemia levels and body weight gain in diabetic and non- diabetic pregnant female rats, treated or not with aqueous extract of Bauhinia forficata leaves. • To compare birth rates and pre-implantation and post-implantation losses in diabetic and non-diabetic pregnant rats, treated or not with aqueous extract of Bauhinia forficata leaves. • To compare the mean age of newborn rats and its placentas, placental index and small newborn percentage (PIP), normal newborn percentage (AIP) and big newborn percentage (GIP) concerning pregnancy age in offspring of diabetic and non-diabetic pregnant rats, treated or not with aqueous extract of Bauhinia forficata leaves. • To evaluate the frequency of internal (skeletal and visceral) and external malformations in offspring of diabetic and non-diabetic pregnant rats, treated or not with aqueous extract of Bauhinia forficata leaves. Material and Method: Pregnant Wistar rats were divided into four experimental groups considering diabetes status and B. forficata treatment. Diabetes was 31 produced before pregnancy with intravenous injection of streptozotocin (40mg/kg body weight). B. forficata leaves aqueous extract was administered through gavage as follows: 500mg/kg from 0 to 4th day of pregnancy, 600 mg/kg from 5th to 14th day, and 1000 mg/kg from 15th to 20th day of pregnancy, whereas 2/3 of the dose were provided in the morning and the 1/3 left during afternoon. The control group was treated with distilled water and doses were adjusted daily according body weight. In the 21th day of pregnancy rats were submeted to surgery in order to get the offspring and evaluate reproductive performance, malformations and organic disturbs. Results and Conclusions: The intake of Bauhinia forficata leaves aqueous extract by pregnant diabetic rats: 1. Did not interfere with glucose blood levels nor maternal body weight gain; 2. Did not reflect on reproductive perfomance nor fetal/placental development; 3. Was not teratogenic, since there was no increase on fetal abnormalities observed. The intake of Bauhinia forficata leaves aqueous extract by pregnant diabetic rats: 1. Did not control glucose blood levels and did not change maternal body weight gain; 2. Did not improve reproductive perfomance nor fetal/placental development; 3. Influenced teratogenesis in a positive way, decreasing the frequency of skeletal (bipartite vertebra) and visceral malformations (showing a tendency towards other skeletal and visceral malformations, e.g., palatosquesis and microftalmy, respectively), compared to those features observed in progeny of diabetic non-treated rats. 32 INTRODUÇÃO Na gestação, o pâncreas materno passa por uma série de adaptações – desenvolve hiperatividade, aumenta a síntese e liberação de insulina e mantém o nível de glicose materna circulante abaixo do normal, garantindo aporte energético ao feto. Na falta de reserva funcional pancreática, ocorrerá hipoinsulinismo na segunda metade da gestação com conseqüente hiperglicemia materna, caracterizando o Diabete Gestacional1,2. No diabete pré-existente, é grande o risco de descompensação metabólica e cetoacidose diabética nessa fase da gestação. As primeiras descrições sobre a associação entre diabete e gravidez foram feitas por volta de 1830. No início do século XX, os índices de concepção entre diabéticas não ultrapassavam 5% e a mortalidade materna atingia cifras de 40 a 50%, sendo marcante o abortamento terapêutico. Os óbitos intra-uterinos e a mortalidade neonatal eram freqüentes. Em vista disso, a solução era contra- indicar o casamento e a gravidez e, quando inevitáveis, optava-se pela interrupção prematura da gestação. Entretanto, após a descoberta da insulina, melhorou-se o prognóstico, com redução da morbidade e da mortalidade, tanto para a mãe como para o feto e recém-nascido3. Os modelos animais estão sendo cada vez mais utilizados no esclarecimento dos múltiplos fatores envolvidos nas repercussões materno-fetais do binômio diabete e gravidez. Em ratas não-diabéticas observa-se aumento no número e no tamanho das ilhotas pancreáticas, com conseqüente elevação na produção de insulina no final da prenhez. No diabete de grave intensidade, há falência funcional do órgão, com diminuição progressiva das células produtoras de insulina após o 18º dia da prenhez4. O estado diabético materno afeta o crescimento e o desenvolvimento fetal em decorrência de alterações no metabolismo do embrião5. Resultados experimentais demonstram distúrbios no crescimento e desenvolvimento de órgãos, além da presença de malformações em embriões e fetos expostos a ambiente de hiperglicemia6. As malformações mais freqüentes são as cardiovasculares, as que acometem o sistema nervoso central e abdome, incluindo a síndrome da regressão caudal – as mesmas descritas nos bebês de 33 mulheres diabéticas. A alta freqüência de reabsorções (morte embrionária) em ratas diabéticas também simula a elevada taxa de abortos descrito em gestantes portadoras de diabete7. Apesar de diversos pesquisadores demonstrarem que a hiperglicemia e outros estímulos metabólicos causam malformações congênitas na prole, os mecanismos pelos quais estas anomalias são induzidas ainda não estão claros8,9. Os fetos de ratas diabéticas, além do maior risco de desenvolver a Síndrome do Desconforto Respiratório por retardo na maturação pulmonar, macrossomia e hiperagregabilidade plaquetária10, podem apresentar catarata congênita e um conjunto de malformações, incluindo micrognatia, hipoplasia de timo, tireóide e paratireóide e anomalias do coração e grandes vasos. Associam-se também, reabsorções e morte fetal em fase mais tardia da prenhez11. Apesar do progresso da medicina, possibilitando melhor acompanhamento e tratamento clínico das gestantes diabéticas, a incidência das malformações congênitas tem se mantidao elevada durante as últimas décadas. É quase três vezes maior quando comparada à população em geral, sendo apontada como a maior causa de mortalidade perinatal entre os recém-nascidos de mães diabéticas12. Além das características genéticas, a hiperglicemia deve estar associada a outras alterações metabólicas, responsáveis pela etiologia multifatorial dessas malformações13. É atrativa a idéia de que um sinal metabólico perturbado, enviado da mãe para o concepto no início da gestação, possa ser um mensageiro. Porém, a natureza exata do sinal, bem como o período gestacional, são ainda obscuros14. De concreto mesmo está demonstrada a relação entre o rígido controle glicêmico materno e o melhor prognóstico perinatal15,16. Embora diversas drogas sejam utilizadas para controlar o Diabetes mellitus, a normoglicemia é raramente atingida. Novas alternativas têm sido investigadas e, dentre elas, o uso de plantas medicinais. A Bauhinia forficata é uma das várias plantas utilizadas empiricamente pela população, por se acreditar numa possível ação hipoglicemiante ou antidiabética. Muitas espécies do gênero Bauhinia L., pertencentes à família Leguminosae, têm merecido atenção de pesquisadores nos últimos anos. As folhas de Bauhinia forficata Link, vegetal comumente denominado de pata-de-vaca ou de unha-de-vaca, são empregadas como diurético e, especialmente, no tratamento do diabete17. Mas, até o presente 34 momento, não se tem idéia do tipo de substância ativa responsável pela ação farmacológica das espécies de Bauhinia. A ação hipoglicemiante de Bauhinia forficata foi evidenciada em 192918. Os primeiros trabalhos, realizados em cachorros, não demonstraram resultados satisfatórios. Mesmo assim, experiências clínicas passaram a ser desenvolvidas em seres humanos. Estudo clínico com pacientes diabéticos e não-diabéticos, comparando o efeito hipoglicemiante dos extratos das folhas de Myrcia uniflora e Bauhinia forficata, não evidenciou efeito, agudo ou crônico, nos níveis de glicose plasmática ou de hemoglobina glicosilada. Não se observou também diferença em quaisquer outros parâmetros clínicos, tendo sido concluído que as infusões preparadas das folhas de M. uniflora e B. forficata não tiveram ação hipoglicemiante em indivíduos normais ou portadores de diabete tipo 219. Outras plantas, entretanto, já tiveram efeito hipoglicemiante comprovado no homem. A Ficus carica (Figueira)20, a Momordica charantia (Melão de São Caetano)21, o Ocimum album (Remédio de vaqueiro)22, o Ocimum sanctum (Manjericão)23, a Opuntia ficus-indicaceum (Figueira-da-índia)24, o Phyllanthus amarus (Quebra-pedra)25 e a Trigonella foenum-graceum (Feno-grego)26, dentre outras, são algumas com estabelecida ação hipoglicemiante no homem. A composição química de Bauhinia forficata foi pouco investigada, admitindo-se a presença genérica de alcalóides, flavonóides, mucilagem, óleo essencial e taninos27. Pelo uso popular entre os portadores de diabete, esta planta continua sendo estudada em modelos experimentais. Almeida & Agra28 verificaram que o extrato etanólico de Bauhinia forficata, administrado por via oral a ratos não-diabéticos, não alterou significativamente a glicemia destes animais. Volpato et al.29, administrando extrato das folhas de Bauhinia forficata a ratas prenhes diabéticas, apesar de não comprovarem diminuição da glicemia materna, observaram melhora na performance reprodutiva dessas fêmeas. De grande interesse, alguns trabalhos destacam a ação de vitaminas na prevenção de malformações fetais, comuns na associação diabete e gravidez. As vitaminas E e C, administradas a ratas prenhes diabéticas mostraram influencia na diminuição de reabsorções tardias e de malformações fetais30,31. A suplementação com ácidos linoleicos, derivados de plantas, evidenciou ação indireta na glicemia materna, influenciando na freqüência de malformações 35 esqueléticas e viscerais de fetos de ratas diabéticas32. Em trabalho recente, Damasceno33 relacionou o uso do extrato aquoso das folhas de B. forficata ao efeito antioxidante na prevenção de malformações viscerais em prenhez de ratas com diabete induzido por streptozotocin (STZ). A despeito da ação, comprovada ou não, é comum a constatação de que gestantes diabéticas fazem uso de plantas popularmente conhecidas como antidiabéticas. O risco está em não se conhecer seus efeitos e possíveis repercussões materno-fetais. As mais citadas são a Eugenia jambolana (Jambolão), a Maitenus uniflora (Sete-sangrias) e a Bauhinia forficata (Pata-de- vaca)34. Nesse aspecto, justifica-se o interesse em verificar se do extrato aquoso de folhas de B. forficata, administrado a ratas prenhes não-diabéticas e diabéticas, interfere na glicemia materna, na performance reprodutiva e, em especial, na freqüência de malformações fetais. 36 OBJETIVO GERAL Avaliar os efeitos do extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata (Pata- de-vaca) sobre o metabolismo materno, a performance reprodutiva, o desenvolvimento fetal e a teratogênese na prenhez de ratas diabéticas e não- diabéticas. Objetivos Específicos Comparar os níveis glicêmicos e o ganho de peso em ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar as taxas de prenhez a termo e de perda pré e pós-implantação em ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar o peso médio dos recém-nascidos e das placentas, o índice placentário e o percentual de recém-nascidos pequenos (PIP), adequados (AIP) e grandes (GIP) para a idade de prenhez em ninhadas de ratas prenhes, diabéticas e não-diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. Comparar a freqüência de anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas de ratas prenhes, diabéticas e não- diabéticas, tratadas ou não com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata. 37 MATERIAL E MÉTODO 1) Animais Foram utilizados ratos Wistar, pesando em torno de 250g, e ratas Wistar virgens, em idade reprodutiva (três meses), pesando aproximadamente 220g, fornecidos pelo Biotério Central do Campus de Botucatu, Unesp. 2) Grupos Experimentais As ratas foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos experimentais, assim constituídos: - Grupo Não-Diabético e Não-Tratado (NDNT): Ratas prenhes não-diabéticas, que receberam diariamente, por gavage, água destilada em volume equivalente ao do grupo tratado com extrato de Bauhinia forficata (pata- de-vaca), durante toda a prenhez (n=13). - Grupo Não-Diabético e Tratado (NDT): Ratas prenhes não-diabéticas, que receberam diariamente, por gavage, extrato de Bauhinia forficata (pata- de-vaca), durante toda a prenhez (n=13). - Grupo Diabético e Não-Tratado (DNT): Ratas prenhes diabéticas, que receberam diariamente, por gavage, água destilada em volume equivalente ao do grupo tratado com o extrato de Bauhinia forficata (pata- de-vaca), durante toda a prenhez (n=18). - Grupo Diabético e Tratado (DT): Ratas prenhes diabéticas, que receberam diariamente, por gavage, extrato de Bauhinia forficata (pata-de-vaca), durante toda a prenhez (n=16). 38 3) Planta e Preparo do Extrato A planta Bauhinia forficata L., conhecida popularmente como pata-de-vaca, foi coletada no município de Botucatu, no mês de junho de 1998, com identificação confirmada no Departamento de Botânica do Instituto de Biociências – UNESP (exsicata BOTU 22306). As folhas foram dessecadas em estufa aerada à temperatura de 50ºC, por um período de 24 horas. Em seguida, o material seco foi triturado em liquidificador e realizada a extração por processo de decocção (cerca de 5 minutos), na proporção de 50 gramas de pó das folhas da planta para cada litro de água. O extrato foi resfriado sob agitação, filtrado e determinada a concentração em mg/ml. Alíquotas do extrato foram mantidas em freezer até o momento do consumo. 4) Seqüência Experimental Foi dividida em quatro períodos: de adaptação, diabetogênico, de acasalamento e de prenhez, adaptados do delineamento padronizado para montagem de modelo experimental de diabete e prenhez em ratas35. 4.1. Período de adaptação As ratas foram adaptadas no biotério do Laboratório Experimental do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia durante sete dias. Permaneceram em gaiolas coletivas com capacidade máxima de cinco animais, sob temperatura ambiente mantida entre 21º e 25ºC e fotoperíodo de 12 horas. Após o período de adaptação, as ratas foram sorteadas para comporem os grupos controle e com diabete a ser induzido. 4.2. Período diabetogênico 39 O streptozotocin (STZ) foi a droga escolhida para indução do diabete, e o período para avaliação do efeito diabetogênico nos animais se estendeu por 15 dias. As ratas normoglicêmicas sorteadas para indução do diabete receberam streptozotocin (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO) na dose de 40 mg/kg de peso. As sorteadas para o grupo controle receberam, também por via intravenosa, solução fisiológica a 0,9% em volume equivalente à droga diabetogênica calculado para uma rata do mesmo peso36. A observação de ingestão excessiva de água (polidipsia) e alimentos (polifagia) associada à perda ou manutenção do peso, alterações no comportamento e aspecto dos animais – irritabilidade, dor à manipulação, turgor diminuído da pele e pêlos eriçados – foram interpretados como indícios de hiperglicemia, desde o primeiro até o 15º dia após a injeção da droga. Também foi parâmetro indicativo de hiperglicemia, o aumento no grau de umidade da forração da gaiola acompanhado de odor característico, traduzindo excesso na diurese dos animais (poliúria). Na presença dos dados clínicos acima descritos, foi determinada a glicemia, considerando-se 120 mg/dl como limite superior de normalidade35. Entretanto, para inclusão no estudo, foi adotado o limite mínimo de glicemia de 200 mg/dl, caracterizando o diabete grave4, 35. 4.3. Período de acasalamento Após o período diabetogênico, iniciou-se a fase de acasalamento com duração máxima de 15 dias. Para o acasalamento, as ratas foram distribuídas quatro a quatro em gaiolas de polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho ao final da tarde. Na manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais coletados pela introdução de cotonete embebido em solução fisiológica a 0,9%. Considerou-se indicativo de prenhez a presença de espermatozóides associado ao diagnóstico da fase de estro do ciclo estral. Esta fase é caracterizada como a fase estrogênica máxima, onde são encontradas apenas células queratinizadas. Confirmada a prenhez, convencionou-se esse dia como o dia zero4, 35. 40 4.4. Período de prenhez As ratas prenhes normoglicêmicas e portadoras de diabete grave receberam extrato de pata-de-vaca, na dose de 500 mg/kg até o 4º dia, 600 mg/kg do 5º até o 14º e 1000 mg/kg do 15º ao 20º dia da prenhez. A dose foi administrada duas vezes ao dia, por via oral (gavage), sendo dois terços pela manhã e um terço à tarde, ajustadas diariamente, de acordo com o peso das ratas. Na prenhez, as fêmeas foram mantidas em gaiolas individuais por 21 dias, pesadas diariamente e observadas quanto ao comportamento e a ingestão hídrica e alimentar. No 21º dia, foram anestesiadas por inalação de éter etílico e realizada laparotomia com exposição dos cornos uterinos para observação dos nódulos de reabsorção. Fetos e placentas foram imediatamente retirados, analisados e, posteriormente, pesados. As mães, após esse procedimento, foram mortas por esgotamento da volemia 4, 35. 5) Métodos de Avaliação 5.1. Peso materno Para a avaliação diária do peso foi utilizada balança Gehaka BG4000 com capacidade de 4200g e precisão de 0,1g. O ganho de peso foi calculado pela diferença entre os pesos corpóreos observados nos dias zero, 5º, 14º e 21º da prenhez. 5.2. Glicemia materna Os níveis de glicemia foram monitorados por leitura de glicofita (Blood Glucose Monitoring Teste Strips Ultra +, HDI Home Diagnostics, Inc., Flórida) contendo sangue obtido por punção da parte distal da cauda da rata. Esta fita foi então introduzida em glicosímetro específico (Blood Glucose Monitoring Meter Ultra +), expressando os valores da glicemia em miligramas por decilitro (mg/dl). Tais dosagens foram realizadas nos dias zero, 5º, 14º e 21º da prenhez. 41 5.3. Performance reprodutiva materna Foram observados e contados pontos de implantação, nódulos de reabsorção, números de fetos vivos e mortos. Os ovários também foram observados e realizada contagem de corpos lúteos, com auxílio de lupa (16/12.5 x 1.25). A taxa de perda de embriões no período que antecede a implantação foi denominada de porcentagem de perda pré-implantação e foi calculada por37: No. de Corpos Lúteos – No. de Implantações x100 No. de Corpos Lúteos A morte dos embriões após seu processo de implantação (porcentagem de perda pós-implantação) foi calculada por28: No. de Implantações – No. de Fetos Vivos x100 No. de Implantações 5.4. Teste para confirmação dos sítios de implantações e de reabsorções No caso de ausência de desenvolvimento fetal ou de pontos de implantações visíveis, o útero foi então colocado em reativo de Salewsky38 para coloração dos pontos de implantação. 5.5. Peso e classificação dos recém-nascidos Após a laparotomia, os recém-nascidos foram pesados utilizando-se balança Marte com capacidade de 500g e precisão de 0,001g. Os pesos corpóreos foram classificados em35: 42 AIP - recém-nascidos de peso adequado para idade gestacional: peso corpóreo compreendido entre a média de peso do grupo controle mais ou menos um desvio-padrão; PIP - recém-nascidos pequenos para idade gestacional: peso corpóreo inferior à média de peso do grupo controle menos um desvio-padrão; GIP - recém-nascidos grandes para idade gestacional: peso corpóreo superior à média do peso de grupo controle mais um desvio-padrão. 5.6. Peso das placentas e Índice placentário As placentas, livres de membrana e cordão umbilical, foram pesadas em balança Marte com capacidade de 500 g e precisão de 0,001g. O índice placentário (IP) foi determinado pela relação entre o peso placentário (PP) e o peso fetal (PF)35. PP IP = PF 5.7. Análise das malformações externas Após a pesagem, os recém-nascidos foram examinados externamente, com análise minuciosa de olhos, boca, implantação das orelhas, conformação craniana, membros anteriores e posteriores, perfuração anal e cauda39. 5.8. Análise das anomalias e malformações viscerais Imediatamente após o exame externo, metade dos recém-nascidos de cada ninhada foi colocada em solução de Bouin para fixação das estruturas viscerais e decalcificação dos ossos. Completada a fixação, utilizou-se o método de secção seriada de Wilson39, para observação de anomalias e/ou malformações viscerais, ilustradas no Quadro 1. 43 Quadro 1. Anomalias e malformações investigadas no exame visceral39. Estruturas Malformações AAnnoommaalliiaass Boca Palatosquese Língua bífida Nariz Alterações do septo nasal Olho Retinocele Microfitalmia mono ou bilateral Macrofitalmia mono ou bilateral Anoftalmia Catarata Degeneração do cristalino Cérebro Hidrocefalia Anencefalia Hemorragia cerebral Dilatação do ventrículo cerebral Coração co aórtico duplo ou voltado para o lado direito Cardiomegalia Comunicação intra-atrial Comunicação intra-ventricular Destrocardia Sinistrocardia Ausência de septos esença de 4 vasos ou a sub- clávia pode estar girando em trono do esofago Rins Agenesia renal Ectopia renal Hibronefrose Fusão renal Fusão suprarenal Hiper ou hipoplasia renal Rim supranumerário tação da pelve renal mono ou bilateral Hemorragia renal Ureteres Agenesia de ureter Fusão do ureter Duplicação do ureter Dilatação mono ou bilateral Ureter sinuoso mono ou bilateral Bexiga Hiper ou hipoplasia vesical 5.9. Análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas e contagem dos pontos de ossificação Para análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas utilizou-se o método de Staples e Schnell40. A metade restante dos recém-nascidos de cada ninhada foi colocada em acetona e, após 24 horas, eviscerados, diafanizados e 44 corados com Alizarina. As anomalias e/ou malformações estão ilustradas no Quadro 2. Quadro 2. Anomalias e malformações investigadas no exame esquelético40. Estruturas Malformações Anomalias Crânio Fusão frontal Ossificação reduzida Esterno Esterno bífido Esternébrio atrofiado Esternébrio bipartido Esternébrio supranumerário Esternébrio rudimentar Esternébrio assimétrico: em shaped em borboleta Vértebras Agenesia vertebral Fusão de vértebras Corpo vertebral sem ossificação alias semelhantes as dos esternébrios Costelas Agenesia de costelas Duplicação de costelas Hipoplasia de costelas Fusão de vértebras Costela ondulada Costela extra uni ou bilateral 13a. costela reduzida Bacia poplasia de bacia Ossificação reduzida (ílio, ísquio e púbis) Clávicula Agenesia de clávicula Dilatação da pelve renal mono ou bilateral Hemorragia renal Falanges Agenesia de falanges Fusão de falanges Hiperfalangia Metacarpo Fusão de metacarpo Metatarso Fusão de metatarso Os pontos de ossificação foram observados e contados na metade da ninhada processada para a análise das malformações esqueléticas, segundo método proposto por Aliverti41. Foram avaliados os pontos de ossificação nos seguintes locais: esternébrios, falanges anteriores e posteriores, metacarpos, metatarsos e vértebras caudais. 45 6) Análise Estatística Para comparação dos valores de glicemia e peso corpóreo foi realizada ANOVA seguida do teste de Tukey42. Para comparação dos valores médios dos parâmetros de performance reprodutiva, pesos fetal e placentário e índice placentário dos grupos experimentais foi utilizado o teste estatístico não- paramétrico de Kruskal-Wallis43. Para a comparação das porcentagens de PIP, AIP e GIP foi utilizado o teste do Qui-quadrado42. Para avaliação da incidência de malformações ou de anomalias fetais, dentro dos grupos não-diabéticos e diabéticos, foi utilizado o teste de Goodman44,45. Considerou-se, como nível de significância estatística, o limite de 5% (p<0,05). 46 Nos grupos não-diabéticos a glicemia materna manteve-se em níveis inferiores a 120 mg/dl e, nos grupos com diabete induzido, superiores a 200 mg/dl. Não se observou diferença significativa nos níveis glicêmicos maternos, tanto no grupo não-diabético como diabético, após o tratamento com extrato aquoso de Bauhinia forficata, em qualquer período da prenhez (Tabela 1). Tabela 1. Médias e respectivos desvios-padrão da glicemia (mg/dl) de ratas não- diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabéticos Diabéticos Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Dia 0 65,0 ± 14,7 a0 98,1 ± 19,2 a0 332,4 ± 86,3 b0 309,5 ± 45,1 b0 Dia 5 80,6 ± 21,8 a1 98,5 ± 34,0 a1 288,2 ± 53,1 b1 295,4 ± 53,3 b1 Dia 14 93,5 ± 15,1 a2 103,5 ± 29,2 a2 327,4 ± 53,9 b2 325,9 ± 68,5 b2 Dia 21 92,8 ± 29,5 a3 85,5 ± 23,9 a3 325,9 ± 76,2 b3 312,9 ± 75,2 b3 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada momento, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – ANOVA seguida do teste de Tukey. 47 A evolução da glicemia materna não se diferenciou nos diferentes períodos da prenhez ou em relação ao tratamento instituído. Esta observação foi válida tanto para as ratas não-diabéticas como para as portadoras de diabete (Figura 1). Figura 1. Evolução da glicemia materna de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. 0 50 100 150 200 250 300 350 0 5 14 21 Dias da prenhes G lic em ia (m g/ dl ) NDNT NDT DNT DT a3 a2 a1 a0 a1 a1 a1 a3 a2 a3 a2 a3 a2 a0 a0 a0 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada grupo, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – ANOVA seguida do teste de Tukey. 48 O peso médio das ratas não-diabéticas tratadas com extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata foi inferior ao observado no grupo não-tratado, desde o dia zero até o 21º dia da prenhez. Nos grupos diabéticos, o tratamento não interferiu com o peso materno em qualquer período da prenhez (Tabela 2). Tabela 2. Médias e respectivos desvios-padrão dos pesos (g) de ratas não- diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabéticos Diabéticos Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Dia 0 246,2 ± 40,4 a0 214,4 ± 15,6 b0 241,8 ± 20,0 c0 237,4 ± 26,6 c0 Dia 5 264,2 ± 39,7 a1 225,3 ± 25,7 b1 249,7 ± 17,1 c1 244,5 ± 23,5 c1 Dia 14 295,1 ± 39,0 a2 265,7 ± 16,7 b2 265,6 ± 28,3 c2 259,7 ± 25,5 c2 Dia 21 374,6 ± 53,3 a3 338,5 ± 26,8 b3 305,4 ± 53,2 c3 302,7 ± 50,3 c3 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada momento, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – ANOVA seguida do teste de Tukey. 49 A evolução do peso materno foi progressiva durante a prenhez, em qualquer grupo estudado. As ratas não-diabéticas atingiram ganho de peso superior a 70g no período final da prenhez. Nos grupos diabéticos esse aumento foi menor, em torno de 40 g, independentemente do tratamento com extrato aquoso de Bauhinia forficata (Figura 2). Figura 2. Evolução do ganho de peso materno de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. 0 15 30 45 60 75 90 5 14 21 Dias da prenhes G an ho d e pe so (G ) NDNT NDT DNT DT a2 a3 a2 a0 c1 b1 a1 a3 b0 c0 b2 b3 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada grupo, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – ANOVA seguida do teste de Tukey. 50 As 13 ratas não-diabéticas, tanto do grupo tratado como do não tratado com extrato aquoso de Bauhinia forficata, levaram a prenhez a termo. Não foram observados nódulos de reabsorção (Salewsky +) nestes grupos, a despeito do tratamento com a planta. Ainda, as porcentagens de perdas pré e pós- implantação, observadas nos grupos não-diabéticos, não dependeram do uso de Bauhinia forficata (Tabela 3). Das 18 ratas do grupo diabético não-tratado, somente 14 levaram a prenhez a termo, sendo observados nódulos de reabsorção nas quatro ratas restantes. A perda pré-implantação foi de 7,99% e a pós-implantação atingiu 38,55%. O tratamento com o extrato aquoso de Bauhinia forficata não melhorou esse prognóstico, não se observando diferença significativa na performance reprodutiva entre as ratas diabéticas (Tabela 3). TABELA 3. Número de ratas acasaladas, prenhez a termo, nódulos de reabsorção e taxa de perdas pré e pós-implantação de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso das folhas de B. forficata. Não-diabéticos Diabéticos Grupos Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Ratas acasaladas 13 a0 13 a0 18 a1 16 a1 Prenhez a termo 13 b0 13 b0 14 b1 11 b1 Reabsorção (Salewski+) 0 c0 0 c0 4 c1 5 c1 Perda pré (%) 4,84 d0 9,27 d0 7,99 d1 12,68 d1 Perda pós (%) 6,72 e0 1,77 e0 38,55 e1 38,61 e1 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste de Kruskal-Wallis. 51 No grupo não-diabético e não-tratado, o peso fetal médio foi de 5,3g e o placentário ficou em torno de 0,5g, determinando índice placentário médio de 0,1. Nos recém-nascidos de ratas diabéticas, o peso médio da ninhada foi de 4,3g, com peso e índice placentário, respectivamente, de 0,8 g e 0,2. Não se observou diferença significativa nesses parâmetros em relação ao tratamento com o extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata (Tabela 4). Tabela 4. Médias e respectivos desvio-padrão dos pesos fetais, pesos das placentas e índice placentário de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabético Diabético Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Pesos fetais (g) 5,3 ± 0,3 a0 5,4 ± 0,3 a0 4,3 ± 0,6 a1 4,7 ± 0,4 a1 Pesos placentários (g) 0,5 ± 0,1 b0 0,5 ± 0,1 b0 0,8 ± 0,2 b1 0,7 ± 0,1 b1 Índice placentário 0,1 ± 0,0 c0 0,1 ± 0,0 c0 0,2 ± 0,1 c1 0,1 ± 0,0 c1 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste de Kruskal-Wallis. 52 A maioria dos recém-nascidos de ratas não-diabéticas e não-tratadas apresentou peso adequado para a idade de prenhez (AIP – 58,4%). Os recém- nascidos restantes distribuíram-se, de modo equivalente, entre as classes de peso pequeno (PIP – 20,4%) e grande (GIP – 21,2%). No grupo diabético não- tratado houve predomínio de recém-nascidos PIP (86,8%), 10,4% de AIP e 2,5% de GIP. O tratamento com o extrato de Bauhinia forficata não mostrou diferença significativa na porcentagem dos recém-nascidos nas diferentes classes, tanto no grupo não-diabético como no diabético (Tabela 5). Tabela 5. Porcentagem (%) de recém-nascidos com peso pequeno (PIP), adequado (AIP) e grande (GIP) para a idade da prenhez em ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabético Diabético Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado PIP (%) 20,4 a0 21,2 a0 86,8 a1 70,4 a1 AIP (%) 58,4 b0 50,1 b0 10,4 b1 29,6 b1 GIP (%) 21,2 c0 28,7 c0 2,5 c1 0,0 c1 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste do Qui-quadrado. 53 O predomínio de recém-nascidos AIP, com igual proporção de GIP e PIP não foi diferente quando se introduziu o tratamento com extrato Bauhinia forficata em ratas prenhes não-diabéticas. Nos grupo diabético não tratado houve predomínio de recém-nascidos PIP (86,8%) e igual proporção de AIP e GIP. Com o tratamento, cerca de 70,0% dos recém-nascidos de ratas diabéticas foram classificados como PIP, próximo de 30% como AIP e nenhum recém-nascido teve peso grande para a idade de prenhez (Figura 3). Figura 3. Porcentagem (%) de fetos com peso pequeno (PIP), adequado (AIP) e grande (GIP) para a idade da prenhez em ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 NDNT NDT DNT DT Grupos Po rc en ta ge m (% ) PIP AIP GIP a0 a0 b0 a1 a1 b1 b2 b2 a2 c3 b3 a3 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada grupo, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste do Qui-quadrado. 54 A contagem total dos pontos de ossificação foi, em média, 39,2 no grupo não-diabético e não-tratado e 31,9 no grupo diabético e não-tratado. O extrato aquoso das folhas de Bauhinia forficata não evidenciou diferença significativa na contagem total ou diferencial desses pontos de ossificação nos grupos de ratas não-diabéticas e diabéticas tratadas (Tabela 6). Tabela 6. Média e desvio-padrão dos pontos de ossificação de recém-nascidos de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabéticos Diabéticos Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Falanges anteriores 7,1 ± 1,0 a0 7,4 ± 1,1 a0 5,4 ± 1,9 a1 6,5 ± 1,2 a1 Metacarpos 7,9 ± 0,3 b0 8,0 ± 0,0 b0 7,7 ± 0,6 b1 8,0 ± 0,1 b1 Falanges posteriores 3,8 ± 2,1 c0 4,0 ± 3,0 c0 0,5 ± 1,0 c1 1,8 ± 1,9 c1 Metatarsos 9,6 ± 0,7 d0 9,9 ± 0,3 d0 8,3 ± 1,0 d1 8,6 ± 0,8 d1 Vértebras caudais 4,8 ± 0,9 e0 5,5 ± 0,7 e0 4,2 ± 1,2 e1 4,9 ± 1,0 e1 Esternébrios 6,0 ± 0,1 f0 6,0 ± 0,0 f0 5,8 ± 0,4 f1 5,8 ± 0,4 f1 Total 39,2 ± 3,3 g0 40,8 ± 4,4 g0 31,9 ± 4,6 g1 34,5 ± 2,3 g1 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste de Kruskal-Wallis. 55 Nos grupos não-diabéticos não foram diagnosticadas malformações ou anomalias externas e malformações viscerais, independentemente do tratamento com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Nos grupos diabéticos as anomalias externas também não foram observadas. O tratamento com a planta não diminuiu a freqüência das malformações e anomalias esqueléticas no grupo diabético, mas reduziu as malformações viscerais (Tabela 7). Tabela 7. Freqüência das anomalias e malformações externas, esqueléticas e viscerais em ninhadas e recém-nascidos de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabético Diabético Grupos Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Malformações externas Recém-nascidos afetados 0/138 0/133 4/118 2/100 Ninhadas afetadas 0/13 0/13 2/13 2/11 Anomalias externas Recém-nascidos afetados 0/138 0/133 0/118 0/100 Ninhadas afetadas 0/13 0/13 0/13 0/11 Malform. esqueléticas Recém-nascidos afetados 11/64 11/68 29/60 14/52 Ninhadas afetadas 5/11 6/13 9/13 6/11 Anomalias esqueléticas Recém-nascidos afetados 18/64 29/68 49/60 45/52 Ninhadas afetadas 9/11 12/13 12/13 11/11 Malformações viscerais Recém-nascidos afetados 0/74 0/65 29/56 a0 5/48 b0 Ninhadas afetadas 0/13 0/13 10/13 a1 4/11 b1 Anomalias viscerais Recém-nascidos afetados 19/74 24/65 22/56 17/48 Ninhadas afetadas 7/13 12/13 11/13 8/11 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste de Goodman. 56 Na análise diferencial das malformações e anomalias comprovou-se diferença significativa no efeito do tratamento com extrato aquoso de Bauhinia forficata em ratas diabéticas. Houve diminuição significativa na porcentagem de vértebra bipartida (21,7 para 13,5%) e de hidronefrose (35,7 para 8,3%) em filhotes de ratas diabéticas tratadas. Além desses efeitos, o tratamento instituído no grupo portador do diabete evidenciou tendência a diminuir o percentual das malformações esqueléticas observadas e de microftalmia. Tabela 8. Percentual de malformações e anomalias externas, esqueléticas e viscerais de recém-nascidos de ratas não-diabéticas e diabéticas, tratadas ou não com extrato aquoso de folhas de B. forficata. Não-diabético Diabético Não-tratado Tratado Não-tratado Tratado Malformações externas (%) Macroglossia 0,0 0,0 3,4 1,0 Malform. esqueléticas (%) Esternébrio ausente 1,6 0,0 11,7 1,9* Palatosquese 14,1 16,2 43,3 25,0* Anomalias Esqueléticas (%) Vértebra em borboleta 0,0 0,0 0,0 15,4 Vértebra bipartida 10,9 0,0 21,7 a0 13,5 b0 14a costela 10,9 1,5 61,7 61,6 Esternébrio atrofiado 6,2 7,4 31,7 28,9 Esternébrio in shaped 9,4 5,9 26,7 28,9 Malformações Viscerais (%) Hidronefrose 0,0 0,0 35,7 a1 8,3 b1 Microftalmia 0,0 0,0 16,1 4,2* Anomalias Viscerais (%) Uretér alargado 25,7 36,9 39,3 33,3 Valores seguidos de mesma letra e índice, dentro de cada avaliação, não diferem entre si ao nível de 5% (p≥0,05) – Teste de Goodman. * tendência (p=0,05) 57 DISCUSSÃO DO MÉTODO Foram utilizados ratos da linhagem Wistar pela disponibilidade no biotério e também pela comprovada suscetibilidade ao efeito da droga indutora do diabete. O diabete foi induzido pelo streptozotocin na dose de 40 mg/kg de peso. É droga dose dependente, de conhecido efeito hiperglicemiante e tem toxicidade seletiva para as células beta (β) pancreáticas, causando necrose celular entre 48 a 72 horas. Na dose utilizada, a maioria das ratas desenvolveu diabete grave, com níveis glicêmicos superiores a 200 mg/dl46, 47, 48. Para mimetizar as condições em que a planta é utilizada popularmente por gestantes diabéticas (chá de folhas de pata-de-vaca), utilizou-se a administração oral, a extração aquosa e as folhas de B. forficata. A modificação em relação ao modelo experimental desenvolvido por Calderon35 foi a não utilização de insulina no período diabetogênico. Isto ocorreu porque a insulina altera a ovulação e o desenvolvimento inicial do embrião, e seu uso neste período poderia influenciar na análise da performance reprodutiva das ratas diabéticas. Além disso, a insulina reduziria a glicemia materna que, atingindo níveis normais no momento da concepção, poderia prevenir a incidência das malformações fetais decorrentes do diabete49,50,51. A indução do diabete antes da prenhez simula as condições metabólicas observadas em seres humanos portadores de diabete clínico, favorecendo análises comparativas, além de evitar a interferência da droga diabetogênica no período de implantação e de embriogênese32. Tanto a indução do diabete por via intravenosa, quanto a administração do extrato da planta por via oral, por sonda orogástrica (gavage), envolvem manipulação com estresse para o animal. Para se evitar a influência destes fatores, o grupo controle foi submetido a procedimento semelhante, com uso de tampão citrato para indução do diabete e administração de água destilada por gavage. As doses de referência utilizadas no tratamento com extrato aquoso de folhas de Bauhinia forficata foram progressivas durante a na prenhez, passando 58 de 500 para 600 e 1000 mg/kg de peso/dia, para mimetizar as necessidades aumentadas de insulina das gestações complicadas pelo diabete materno 2, 15, 52. A evolução do ganho de peso materno foi utilizada como avaliação indireta do controle metabólico durante a prenhez35. Da mesma maneira, a contagem dos pontos de ossificação nos recém-nascidos foi realizada como avaliação indireta do desenvolvimento fetal, dependente do controle metabólico materno e do ambiente intra-uterino41. Considerou-se malformações as alterações externas, esqueléticas ou viscerais incompatíveis com a sobrevivência ou capazes de influenciar no desenvolvimento pós-natal, na fertilidade e longevidade dos recém-nascidos das ratas em estudo. Foram denominadas anomalias, as alterações que não representassem prejuízo na função, geral ou específica, de determinado órgão ou sistema ou no desenvolvimento pós-natal53. O número total de recém-nascidos submetidos à análise esquelética foi menor que os avaliados macroscopicamente. Isto ocorreu por falha técnica, onde os esqueletos de alguns recém-nascidos foram completamente dissolvidos pela solução de KOH e tiveram que ser desprezados. Os grupos de ratas não-diabéticas, não-tratadas e tratadas com o extrato aquoso de folhas de B. forficata, foram incluídos no estudo para se avaliar possíveis efeitos indesejáveis do tratamento em prenhez de ratas livres de patologias, simulando a gestação normal. Não foi objetivo deste trabalho a comparação entre a gestação normal e a complicada pelo diabete. Nesse sentido, a literatura está bastante suprida de resultados clínicos e experimentais2,4,6,7,29,32,35,50. Os grupos de ratas, não- diabéticas e diabéticas, não submetidos ao tratamento serviram de controle para os respectivos grupos tratados com extrato aquoso de folhas de B. forficata. 59 DOS RESULTADOS Nas gestações complicadas pelo diabete materno as repercussões iniciam- se na pré-concepção, estendem-se por todo o período gravídico e culminam com afecções perinatais, incluindo risco de morte intra-útero e neonatal. Entre as repercussões maternas e perinatais, destacam-se a descompensação metabólica na segunda metade da gestação, o elevado número de abortos, a macrossomia fetal, as malformações, a hipoglicemia neonatal e o retardo no desenvolvimento pulmonar, com risco aumentado de Síndrome do Desconforto Respiratório ao nascimento15, 16. A chave para prevenção desta cascata de eventos deletérios ao feto e ao recém-nascido é o controle glicêmico materno, com redução da hiperglicemia-hiperinsulinemia fetal54. A normoglicemia materna também é responsável pelo bloqueio de alguns agentes envolvidos no estresse oxidativo ou no metabolismo do ácido araquidônico, reconhecidamente indutores de malformações fetais. Além da hiperglicemia, os radicais livres de oxigênio estão sendo identificados como importantes agentes teratogênicos33,55,56 e o tratamento com ácido linoléico parece prevenir tais complicações32. Da mesma maneira, tratamento com plantas, de comprovado efeito hipoglicemiante em animais e seres humanos57,58,59,60,61,62 começam a ser investigados na prevenção destas complicações decorrentes do diabete. A hipótese fundamental desse trabalho foi que a utilização do extrato aquoso de folhas de B. forficata, agindo no controle da hiperglicemia materna, preveniria as repercussões perinatais do diabete, em especial as malformações fetais. O tratamento com extrato aquoso de folhas de B. forficata não interferiu no controle glicêmico das ratas diabéticas e não causou hipoglicemia em ratas não- diabéticas (Tabela 1). Isto foi observado também por Russo et al19. Em pacientes com diabete tipo 2. Talvez não seja a folha desta planta a estrutura que contenha o princípio ativo capaz de controlar a hiperglicemia33. Talvez, as doses não tivessem sido adequadas para a ação desejada, apesar de progressivamente reajustadas. Ou ainda, a extração aquosa não fosse o método mais eficiente. Novas perspectivas acabam surgindo, entre elas, pesquisar o princípio ativo 60 responsável pela ação hipoglicemiante e testar outras doses ou outros meios de extração, diferentes daquele utilizado neste trabalho. Os níveis glicêmicos maternos mantiveram-se constantes, independentemente da fase (início ou final) da prenhez e do tratamento instituído. As ratas não-diabéticas apresentaram evolução da glicemia na faixa de normalidade e aquelas portadoras de diabete, nos limites de hiperglicemia grave (Figura 1). Nas gestações complicadas pelo diabete é comum a descompensação no final da prenhez, exigindo ajustes constantes da dose de insulina para prevenir, entre outros efeitos, a cetoacidose diabética 15,16,52. Estes resultados foram confirmados em trabalhos experimentais com ratas prenhes diabéticas4,35,63. Entretanto, neste estudo, não se observou a elevação progressiva da glicemia materna na fase final (14º ao 21º dia) da prenhez associada ao diabete, tanto em ratas não-tratadas como tratadas. A explicação deve estar no fato de que o ganho de peso materno foi melhor e progressivo (Tabela 2 e Figura 2) comparado com resultados prévios, indicando menor comprometimento metabólico ou menor efeito da droga diabetogênica35. A evolução no ganho de peso materno, apesar de progressivo, independeu do tratamento com o extrato aquoso de Bauhinia forficata. O grupo de ratas não- diabéticas submetido ao tratamento iniciou a prenhez com menor peso corporal, fator responsável pela diferenciação entre os ganhos observados nos grupos livres do diabete. Os grupos de ratas diabéticas tiveram o mesmo peso inicial e apresentaram índices ponderais semelhantes durante toda a prenhez, independentemente se submetidos ou não ao tratamento instituído (Tabela 2 e Figura 2). A avaliação ponderal da gestante é parâmetro indireto do grau de comprometimento materno e fetal. O ganho de peso insuficiente pode acarretar restrição do crescimento intra-uterino64. Ao contrário, nas gestações complicadas pelo diabete, o peso materno costuma ser exagerado, associado à macrossomia e ao polidrâmnio2,6. Em ratas com diabete induzido por drogas, a macrossomia e o ganho excessivo de peso materno não são facilmente reprodutíveis. A diferença na duração do período fetal entre as duas espécies e as lesões severas observadas em placentas de ratas poderiam explicar tais diferenças35. 61 Estudos experimentais sugerem que a hiperglicemia materna constante e severa representa sobrecarga renal, com eliminação de grandes quantidades de água e eletrólitos, culminado com desidratação e conseqüente perda ou dificuldade no ganho de peso65,66,67. O estado hiperglicêmico grave, persistindo no meio intra-uterino, leva à falência do pâncreas fetal não permitindo o aproveitamento adequado do aporte energético de glicose, instalando-se a restrição no desenvolvimento do concepto, entre o 18º e o 21º dias da penhez4. Estes mecanismos foram comprovados neste trabalho e o tratamento com extrato de B. forficata não conseguiu revertê-los (Tabela 2 e Figura 2; Tabelas 4 e 5 e Figura 3). A média de peso dos recém-nascidos foi inferior e a placenta mostrou-se aumentada e insuficiente na presença do diabete35, sendo que o tratamento não interferiu nessas complicações fetais e placentárias. Por outro lado, o uso de B. forficata não se revelou prejudicial aos grupos não-diabéticos, uma vez que não influenciou nos índices dos pesos fetais e placentários observados (Tabela 4). Alterações placentárias têm sido evidenciadas em mulheres diabéticas, entre elas, o predomínio de endarterite, espessamento das membranas e restrição do espaço interviloso (EIV)68,69, com conseqüente redução na circulação e nas trocas materno-fetais. As alterações no fluxo sangüíneo total da placenta de ratas diabéticas estão diminuídas em 50% nos últimos dias da prenhez70, restringindo a oxigenação e a nutrição do feto. O aumento da placenta seria um mecanismo de compensação, na tentativa de aumentar a superfície de trocas materno-fetais. No entanto, foi demonstrado que este aumento placentário é insuficiente, dificultando a nutrição fetal35. O elevado valor do índice placentário nos grupos diabéticos confirma esta disfunção placentária (Tabela 4). A classificação do peso dos recém-nascidos em adequado (AIP), pequeno (PIP) e grande (GIP) para a idade de prenhez, mais uma vez confirmou resultados atribuídos à intensidade da hiperglicemia no meio intra-uterino (Tabela 5, Figura 3)4,35,71. O tratamento com o extrato aquoso de B. forficata também não reverteu as complicações decorrentes do diabete e não interferiu na distribuição dos recém-nascidos dos grupos não-diabéticos (Tabela 5 e Figura 3). Vale ressaltar que, no grupo diabético tratado, nenhum recém-nascido foi classificado como GIP e que a incidência de PIP foi reduzida de 86,8% (diabético não-tratado) para 62 70,4% (diabético tratado). O resultado final foi o aumento, próximo de 20,0%, na proporção de recém-nascidos AIP. Isto pode ser indício de um efeito favorável do tratamento no controle metabólico materno, predispondo ao adequado desenvolvimento fetal. Apesar da diferença não-significativa, tanto em avaliações diferenciais quanto totais, os pontos de ossificação aumentaram em torno de 80% após tratamento nos grupos diabéticos, comparado ao padrão de 40% observado no grupo não-diabético tratado (Tabela 6). Seguindo o mesmo raciocínio acima exposto, estas observações poderiam indicar, de modo indireto, a ação benéfica do tratamento com a planta. Na era pré-insulina, as mulheres diabéticas não-controladas tinham dificuldade para engravidar e os abortamentos eram complicações constantes72,73,74. Em ratas, o panorama reprodutivo não é diferente35 e, neste trabalho, maior número de ratas diabéticas foram acasaladas para equiparar as proles não-diabéticas de termo. As reabsorções embrionárias foram observadas somente em presença de hiperglicemia e as perdas pós-implantação foram cerca de seis vezes mais comuns na prenhez associada ao diabete materno. O tratamento com B. forficata, insuficiente para atingir a normoglicemia materna, não conseguiu prevenir tais complicações (Tabela 3), classicamente descritas em relatos clínicos75,76 e experimentais32,50,77,78,79. O grupo de ratas não-diabéticas foi caracterizado por malformações esqueléticas fetais – esternébrio ausente e palatosquese; anomalias esqueléticas – vértebra bipartida, 14a costela e esternébrio atrofiado ou in shaped. Não foram observadas malformações externas ou viscerais, anomalias externas e, apenas uretér alargado foi identificado dentre as anomalias viscerais (Tabelas 7 e 8). O uso do extrato aquoso de B. forficata não evidenciou qualquer efeito teratogênico, uma vez que, no grupo não-diabético tratado, as anomalias ou malformações não se diferenciaram do observado no respectivo controle. No grupo com diabete induzido, as malformações e anomalias fetais, de todos os tipos, foram mais freqüentemente observadas, não existindo alterações compatíveis apenas com anomalias externas (Tabelas 7 e 8). Chama a atenção que o tratamento com extrato aquoso de B. forficata preveniu a incidência de malformações viscerais, confirmado por menor porcentagem de hidr