UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E MOLECULAR DE AGENTES TRANSMITIDOS POR ARTRÓPODES EM AVES CARNÍVORAS Ana Beatriz Vieira Sacchi Médica veterinária 2015 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E MOLECULAR DE AGENTES TRANSMITIDOS POR ARTRÓPODES EM AVES CARNÍVORAS Ana Beatriz Vieira Sacchi Orientadora: Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária, Área: Medicina Veterinária Preventiva 2015 Sacchi, Ana Beatriz Vieira S119d Diagnóstico sorológico e molecular de agentes transmitidos por artrópodes em aves carnívoras / Ana Beatriz Vieira Sacchi. – – Jaboticabal, 2015 ix, 75 p. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientadora: Rosangela Zacarias Machado Banca examinadora: Cristiane Divan Baldani, Carlos Termignoni, Marcos Rogério André e Cristina Harumi Adania Bibliografia 1. Agentes Anaplasmataceae. 2. Bartonellaceae. 3. Haemosporida. 4. Aves carnívoras. 5. Diagnóstico sorológico. 6. Diagnóstico molecular. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.159:636.5 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DA AUTORA ANA BEATRIZ VIEIRA SACCHI - nascida na cidade de Mirassol, São Paulo, em 03 de abril de 1981. Cursou o Ensino Fundamental na Escola Estadual de Primeiro Grau Professor Edmur Neves e o Ensino Médio na Escola Estadual de Primeiro e Segundo Grau Anísio José Moreira, na cidade de Mirassol. É Médica Veterinária formada pela Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, em 2006. Durante o curso de graduação foi bolsista de Iniciação Científica da FAPESP, trabalhando na área de Parasitologia Veterinária, com Helmintologia em Animais Silvestres. Ingressou no Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração Patologia Animal, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Jaboticabal– SP, em agosto de 2007, sob orientação da Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado, obtendo o título de Mestre na referida área. Em agosto de 2011, ingressou no Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração Medicina Veterinária Preventiva, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Jaboticabal– SP, novamente sob orientação da Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado. Atualmente ocupa o cargo de Assistente Agropecuário II, na Coordenadoria de Assistência Técnica Integral (CATI), da Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo. DEDICATÓRIA À amizade... Não há sonhos que se realizem sem esta manifestação do amor... AGRADECIMENTOS Ao Senhor da Vida, pela paciência em nos ensinar a viver; À minha família, que se tornou maior... Ao meu amor, Guilherme Furquim Bernardes...Obrigada, queridos, pelo amor, apoio, paciência e compreensão. Eu amo vocês... À Professora Rosangela Zacarias Machado, minha orientadora, pelo exemplo de força e dedicação profissional, e pela paciência e amizade constantes; muito obrigada pela preciosa oportunidade de crescimento profissional e pessoal, em nossa convivência; Aos professores membros da Banca de Qualificação e Defesa: Profa. Dra. Rosangela Zacarias Machado, Prof. Dr. Marcos Rogério André, Profa. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, Profa. Dra Karin Werther, Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara, Prof. Dr. Carlos Termignoni, Dra. Cristina Harumi Adania, Profa Dra. Cristiane Divan Baldani... Obrigada pelo auxílio na correção deste trabalho e sugestões pertinentes ao contexto da discussão; Aos colaboradores desta pesquisa, Dra. Cristina Harumi Adania, Profa Dra. Cristiane Divan Baldani, Profa. Dra Karin Werther, Prof. Dr. Ricardo José Garcia Pereira, além dos amigos Artur Gouveia Rocha e Itair Bessi (e família), pelo auxílio na captura das aves e colheita das amostras; Aos amigos presentes e aqueles que já passaram pelo Departamento de Patologia Veterinária (funcionários, professores, estagiários e pós-graduandos): obrigada pela boa convivência e pela contribuição, cada um a seu modo, para a realização de nosso trabalho; agradecimento especial aos queridos amigos Márcia Jusi, Rafaela Beraldo, Carla Freschi, Keyla Sousa, Luiz Ricardo Gonçalves, Marcos Rogério André, Juliana, Aline e Pedro (Ambulatório de Animais Selvagens da FCAV – UNESP - Jaboticabal): obrigada pelos ensinamentos, pela paciência, bondade, dedicação e amizade, de sempre; não há palavras no mundo que possam expressar minha gratidão a vocês; Aos amigos de jornada, pelo apoio e amizade constantes; muita obrigada, minha querida Scheilla Bolonhezi Verdade e sua família, André e Ana Lúcia, Michele e Marcelo, D. Regina e S. Osvaldo, eu amo vocês; Aos demais professores e funcionários deste campus, pela boa convivência e pela enorme contribuição em minha formação profissional; À Fapesp, pelo suporte financeiro ao projeto (Processo nº 2012 11870-3). i SUMÁRIO Página LISTA DE TABELAS...............................................................................................iii LISTA DE QUADROS.............................................................................................iv LISTA DE FIGURAS................................................................................................v RESUMO...............................................................................................................xiii ABSTRACT.............................................................................................................ix 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................01 2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................03 2.1. Infecções por agentes da Ordem Rickettsiales.............................................03 2.1.1. Agentes etiológicos e transmissão........................................................03 2.1.2. Agentes Anaplasmataceae e as Aves...................................................06 2.1.3 Agentes Anaplasmataceae e infecções humanas..................................09 2.2. Infecções por agentes da Ordem Rhizobiales: Bartonella spp......................10 2.2.1. Agentes etiológicos e transmissão........................................................10 2.2.2. Bartonella spp. e Infecções Animais......................................................11 2.2.3. Bartonella spp. e Infecções Humanas...................................................11 2.3. Infecções por agentes da Ordem Haemosporida..........................................12 2.3.1 Agentes etiológicos e transmissão.........................................................12 2.3.2. Aves e Infecções por Plasmodium spp, Haemoproteus spp. e Leucocytozoon spp.......................................................13 2.3.3. Ordem Haemosporida e infecções humanas.........................................15 3. OBJETIVOS.........................................................................................................15 3.1. Objetivo geral.................................................................................................15 3.2. Objetivos específicos.....................................................................................15 4. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................16 4.1. Espécies amostradas e áreas de estudo.......................................................16 4.2. Métodos de Captura.......................................................................................16 ii 4.3. Colheita das amostras....................................................................................21 4.4. Pesquisa de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos...............................22 4.5. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)...............................................22 4.6. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)......................................................23 4.6.1. Extração de DNA....................................................................................23 4.6.2. PCR em Tempo Real (qPCR)................................................................24 4.6.3. PCR Convencional.................................................................................25 4.6.3.1. Reações de Amplificação....................................................................25 4.6.3.2. Eletroforese de DNA em gel de agarose.............................................28 4.6.3.3. Extração e Purificação das amostras..................................................28 4.6.4. Sequenciamento....................................................................................29 4.6.5. Análise das sequências e construção das árvores filogenéticas...........29 5. RESULTADOS.....................................................................................................30 5.1. Presença de Ectoparasitas............................................................................30 5.2. Avaliação dos esfregaços sanguíneos...........................................................31 5.3. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)...............................................31 5.4. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR).........................33 5.5. Reação em Cadeia da Polimerase Convencional (cPCR).............................39 5.6. Análise das sequências..................................................................................43 5.7. Árvores Filogenéticas.....................................................................................44 6. DISCUSSÃO........................................................................................................47 7. CONCLUSÕES....................................................................................................56 8. REFERÊNCIAS....................................................................................................57 iii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise (probe TaqMan) utilizados na qPCR multiplex para os gêneros Ehrlichia spp., Anaplasma spp. e Bartonella spp. (ANDRÉ, 2012)..............................................25 Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores, genes alvo e sondas de hidrólise (probe TaqMan) utilizados nas qPCRs para E. chaffeensis e A. phagocytophilum (RELLER et al., 2010)…………………………………………25 Tabela 3. Espécies e origem das aves positivas na qPCR para Anaplasma spp. (gene groE)........................................................................35 iv LISTA DE QUADROS Quadro 1. Espécies e número de aves amostradas, incluindo local da captura e período de amostragem, assim como presença ou ausência de ectoparasitas, nos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Brasil..........................................19 Quadro 2. Descrição dos oligonucleotídeos Iniciadores para as reações de PCR e nested PCR, tamanho do amplímero (pb), sequência térmica e referências utilizadas, relacionados a cada agente pesquisado (agentes Anaplasmataceae gene alvo 16SrRNA; hemosporídeos , gene alvo citocromo B)..........................................................27 Quadro 3. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho do amplímero (pb), sequência térmica e referências, utilizados nas reações de PCR e nested PCR realizadas apenas para amostras previamente positivas na qPCR para o gene groESL e PCR convencional para o gene 16SrRNA (Ehrlichia spp. Anaplasma spp.)........................................................................28 Quadro 4. Resumo dos resultados positivos, indicando a espécie da ave, local de colheita da amostra e a positividade negatividade para os vários testes realizados................................................................................42 Quadro 5. Identidade pelo Blast dos amplímeros sequenciados.....................43 v LISTA DE FIGURAS Figura 1. Captura de exemplar macho da espécie Falco sparverius em Jaboticabal - SP...............................................................18 Figura 2. Gavião Carijó (Rupornis magnirostris) jovem, capturado com auxílio da bal-chatri, em Descalvado – SP...............................18 Figura 3. Armadilha improvisada em antiga pocilga em propriedade rural no município de Santa Ernestina - SP, para captura de urubus (Coragyps atratus) – A. Vista lateral; B. Vista Interna......................................20 Figura 4. Contenção de Tyto alba para colheita de sangue, na Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP...........................................22 Figura 5. Gavião Carijó (R. magnirostris) recém capturado em Descalvado – SP, evidenciando a presença de uma ninfa ingurgitada de Amblyomma spp. na proximidade da abertura nasal esquerda........................31 Figura 6. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de cervo-do-Pantanal) para A. phagocytophilum. Em A, são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B, não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 400X e 1000X, respectivamente.......................................................................32 Figura 7. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de cervo-do-Pantanal) para Ehrlichia chaffeensis. Em A são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 1000X..........................33 Figura 8. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de felino) para Ehrlichia canis. Em A são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 1000X..................................................33 vi Figura 9. Resultados da qPCR para Ehrlichia spp. e Anaplasma spp. (gene alvo groE; linhas azul e violeta, respectivamente). Em A, são evidenciadas amostras positivas para Anaplasma spp. do lado direito e inferior do quadro. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação.................34 Figura 10. Resultados da qPCR realizada para E. chaffeensis (gene alvo vlpt) (linha azul). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação..................36 Figura 11. Resultados da qPCR realizada para A. phagocytophilum (gene alvo msp-2) (linha violeta). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação...................................37 Figura 12. Resultados da qPCR realizada para Bartonella spp. (gene alvo nuoG) (linha vermelha). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação.......................................................................................38 Figura 13. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 410 pb, na PCR para E. chaffeensis (gene 16SrRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Technologies®); Canaleta 1: controle positivo (410 pb); Canaleta 29: branco; Canaletas 2, 3, 11, 18 e 23: amostras PCR positivas........................................................39 Figura 14. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 358 pb, na PCR para E. canis (gene 16SrRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Techonologies®); Canaleta 1: controle positivo (358 pb); Canaleta 7: branco; Canaletas 4 e 5: amostras PCR positivas.........40 vii Figura 15. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 480 pb, na PCR para Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. (gene citocromo B). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Techonologies®); Canaleta 2: controle positivo; Canaleta 16: branco; Canaletas 2, 3, 9 e 14: amostras PCR positivas................................................................40 Figura 16. Posição filogenética de sequências de Ehrlichia spp. detectadas em aves carnívoras do Brasil, com base em sequências de DNA do gene 16SrRNA. A árvore foi construída utilizando o método de máxima verossimilhança e modelo GTRGAMMA+I. Os números na árvore indicam valores de bootstrap acima de 50 para os pontos de ramificação. Números de acesso estão em indicados ao lado das sequências.....................................................................................45 Figura 17. Posição filogenética de sequências de Haemoproteus spp. detectadas em aves carnívoras do Brasil, com base em sequências de DNA do gene mitocondrial citocromo b. A árvore foi construída utilizando o método de máxima verossimilhança e modelo GTRGAMMA+I. Os números na árvore indicam valores de bootstrap acima de 50 para os pontos de ramificação. Números de acesso estão em indicados ao lado das sequências.....................................................................................46 Figura 18. Posição filogenética de sequências de Plasmodium spp. detectadas em aves carnívoras do Brasil, com base em sequências de DNA do gene mitocondrial citocromo b. A árvore foi construída utilizando o método de máxima verossimilhança e modelo GTRGAMMA+I. Os números na árvore indicam valores de bootstrap acima de 45 para os pontos de ramificação. Números de acesso estão em indicados ao lado das sequências.....................................................47 viii DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E MOLECULAR DE AGENTES TRANSMITIDOS POR ARTRÓPODES EM AVES CARNÍVORAS RESUMO - Agentes das Ordens Rickettsiales, Haemosporida e Rhizobiales são causadores de enfermidades que acometem várias espécies animais, podendo representar um risco à saúde dos mesmos, inclusive de seres humanos. Aves carnívoras podem infestar-se e infectar-se com muitas espécies de parasitas, incluindo- se carrapatos e hemoparasitas, sendo os hábitos de predação fatores de favorecimento à transmissão e translocação de diversos agentes etiológicos. O objetivo deste estudo foi pesquisar, por meio de métodos indiretos (Reação de Imunofluorescência Indireta – RIFI) e diretos (esfregaços sanguíneos, PCR em Tempo Real e PCR Convencional) os agentes das Famílias Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) e Ordem Haemosporida (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em ectoparasitas e amostras de sangue de aves carnívoras, realizando-se um estudo filogenético dos agentes encontrados. Para tanto, procedeu-se à colheita de 121 amostras de sangue total e 88 amostras de soro de aves pertencentes às Ordens Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes e Cathartiformes, capturadas nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro. Em relação aos ectoparasitas, foram recolhidas três larvas e uma ninfa ingurgitada de carrapatos do gênero Amblyomma de um gavião carijó (Rupornis magnirostris) no Estado de São Paulo. Na RIFI para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, 03 (3,41%) e 05 (5,68%) amostras apresentaram sororreatividade, respectivamente. Todas as amostras testadas na RIFI para E. canis mostraram-se negativas. Na avaliação de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, não foram encontradas estruturas compatíveis com hemoparasitas. Em relação a PCR em Tempo Real (qPCR), não foram encontrados animais PCR positivos para Ehrlichia chaffeensis (gene vlpt) e Anaplasma phagocytophilum (gene msp-2). Na qPCR Multiplex para Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (gene groE) e Bartonella spp. (gene nuoG) observamos 12 amostras positivas para Anaplasma spp. (9,91%). Na PCR convencional baseada no gene 16SrRNA de Anaplasmataceae e no gene citocromo B para hemosporídeos, oito aves foram PCR positivas para Ehrlichia spp (6,61%, sendo cinco na PCR para E. chaffeensis e três na PCR para E. canis), três para Haemoproteus spp (2,48%) e uma para Plasmodium spp (0,83%). Na análise filogenética, quatro amostras de Ehrlichia spp. posicionaram-se no mesmo ramo de Ehrlichia identificadas em animais selvagens no Brasil e de um isolado humano nos EUA. Para os agentes estudados, a diversidade genética entre as linhagens dos hemoparasitas em estudo interferem enormemente no diagnóstico específico, sobretudo quando apenas é utilizado o diagnóstico molecular. Apesar da baixa frequência de aves infectadas pelos referidos patógenos e infestadas por carrapatos, as aves carnívoras estão expostas à infecção por agentes da Família Anaplasmataceae e Ordem Haemosporida, podendo carreá-los em seu habitat. Palavras-chave: Agentes Anaplasmataceae, Haemosporida, Bartonelllaceae, aves carnívoras, diagnóstico sorológico e molecular. ix SEROLOGICAL AND MOLECULAR DIAGNOSIS OF AGENTS TRANSMITTED BY ARTHROPODS IN CARNIVOROUS BIRDS ABSTRACT - Rickettsiales, Haemosporida and Rhizobiales agents cause diseases that affect various animal species, including humans. Carnivorous birds become infested and infected with many species of parasites, including ticks and hemoparasites, and the predation habits favoring transmission and translocation of various etiological agents. The aim of this study was to investigate, using indirect methods (Immunofluorescence - IFAT) and direct methods (blood smears, Real-Time PCR and Conventional PCR) agents of Families Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) and Haemosporida Order (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in ectoparasites and blood samples carnivorous birds, performing a phylogenetic study of these agents. Therefore, we collected 121 blood samples and 88 serum samples from birds belonging to the Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes and Cathartiformes Orders, captured in the states of São Paulo and Rio de Janeiro. Regarding the ectoparasites, we collected three larvae and one engorged nymphal Amblyomma ticks of a Rupornis magnirostris in São Paulo. At IFAT for E. chaffeensis and A. phagocytophilum, 03 (3.41%) and 05 (5.68%) samples showed seroreactivity, respectively. Blood smears stained by Giemsa were analyzed and hemoparasites were not found. Regarding the Real-Time PCR (qPCR), in multiplex qPCR for Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (groE gene) and Bartonella spp. (nuoG gene) observed 12 samples positive for Anaplasma spp. (9.91%). In conventional PCR-based 16SrRNA gene for Anaplasmataceae and cytochrome B gene for hemosporidia, eight birds were PCR positive for Ehrlichia spp (6.61%, five in PCR for E. chaffeensis and three in PCR for E. canis), three for Haemoproteus spp (2.48%) and Plasmodium spp (0.83%). In phylogenetic analysis, four samples of Ehrlichia spp. positioned on the same branch Ehrlichia identified in wild animals in Brazil and the US human isolate. The genetic diversity between strains of hemoparasites in these study interfere greatly in the specific diagnosis. Despite the low frequency of birds infected by these pathogens and infested with ticks, carnivorous birds are exposed to infection by agents of Anaplasmataceae Family and Haemosporida Order, and may carrea them in their habitat. Keywords: Anaplasmataceae agents, Haemosporida, Bartonelllaceae, carnivorous birds, serological and molecular diagnosis. 1 1. INTRODUÇÃO Nos últimos séculos, o ambiente terrestre tem sofrido uma série de transformações, evidenciadas no avanço das fronteiras agrícolas e monoculturas, alterações climáticas, modificações nas relações parasita-hospedeiro e reemergência ou introdução de patógenos. Indubitavelmente, os efeitos dessas alterações são maiores sobre animais que competem diretamente com o homem por habitat, afetando drasticamente a ecologia das doenças nos ecossistemas bem como a saúde global das populações humana e animal. Nesse contexto, as aves apresentam grande potencial na dispersão de patógenos, uma vez que muitas espécies apresentam hábitos migratórios, grande facilidade de locomoção e amplo território, o que permite que entrem em contato com animais e vetores infectados, fazendo translocação de agentes etiológicos. Para algumas espécies de aves carnívoras, o hábito de predação favorece a infestação por ectoparasitas e a infecção por endoparasitas, devido ao contato com solo e vegetação local, além de contato íntimo e ingestão de vísceras das presas. No Brasil, estudos têm sido conduzidos com o objetivo de investigar o papel dos animais selvagens na epidemiologia das doenças causadas por agentes das Ordens Rickettsiales, Rhizobiales e Haemosporida. Para alguns agentes Rickettsiales, como Ehrlichia spp. e Anaplasma spp. (Rickettsiales: Anaplasmataceae), foi realizada a detecção do DNA dos patógenos em várias espécies animais, incluindo aves carnívoras. Análises filogenéticas apontaram tratar-se de agentes filogeneticamente próximos a Ehrlichia chaffeensis e Anaplasma phagocytophilum, respectivamente. Bartonella spp. (Rhizobiales: Batonellaceae) também é considerado um patógeno negligenciado e reemergente, sendo que hoje são descritas mais de 40 espécies e subespécies responsáveis por um grande número de doenças infecciosas em humanos e animais. No Brasil, há relatos da infecção em cães, gatos, felinos selvagens e humanos, sendo que os artrópodes vetores das enfermidades são representados por mosquitos, pulgas, e também carrapatos. Recentemente, o DNA de Bartonella henselae e B. koehlerae foi identificado em amostras de sangue de aves no 2 Estado da Carolina do Norte, Estados Unidos. Ainda, DNA de B. grahamii foi identificado em carrapato recolhido de uma ave, na Coréia. Além do aspecto zoonótico considerado, doenças infecciosas emergentes que afetam aves selvagens parecem aumentar em número e têm levado a reduções localizadas de populações, e até mesmo extinções de espécies. Considerando os fatores previamente mencionados, como os impactos ambientais das atividades humanas, mudanças climáticas e, portanto, alterações nas populações de vetores e translocação de patógenos, a conservação de espécies ameaçadas torna-se mais difícil de ser realizada, pois a reprodução é prejudicada. Nesse contexto, descobriu-se recentemente que a infecção crônica causada pelos hemosporídeos (Haemosporida: Plasmodiidae, Haemoproteidae) representados pelos agentes Plasmodium spp. e Haemoproteus spp., promove o encurtamento dos telômeros, e então as células morrem, acumulando danos nos tecidos e provocando disfunções nos órgãos. Esses fatores reduzem o tempo de vida das aves, interferindo no sucesso reprodutivo e na propagação da espécie. Assim, com o advento da biologia molecular, em particular o uso da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), tornou-se possível realizar uma investigação mais aprofundada a respeito das enfermidades transmitidas por artrópodes e seus reservatórios selvagens e domésticos, bem como os efeitos que essas doenças causam em seu hospedeiro. Estudos que determinam a prevalência desses patógenos auxiliam no entendimento da epidemiologia das enfermidades, e contribuem enormemente à proteção à saúde pública e à saúde de animais domésticos e selvagens. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Infecções por agentes da Ordem Rickettsiales 2.1.1. Agentes etiológicos e transmissão Uma reclassificação da Ordem Rickettsiales dividiu a mesma em duas famílias: Rickettsiaceae (gêneros Rickettsia e Orientia) e Anaplasmataceae (gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia e Wolbachia). Assim, as espécies antes denominadas Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi, Ehrlichia platys e Ehrlichia bovis foram agrupadas no gênero Anaplasma; E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e Cowdria ruminantium no gênero Ehrlichia; E. sennetsu e E. risticii no gênero Neorickettsia; e Wolbachia pipientis no gênero Wolbachia (DUMLER et al., 2001). Agentes Anaplasmataceae são bactérias gram-negativas, intracelulares obrigatórias, de formato cocóide ou elipsoidal, que causam doenças nos animais e no homem. Compreendem espécies filogeneticamente relacionadas, porém genética e antigenicamente diferentes (YU et al., 2006), cujos ciclos biológicos são compostos por interações entre vetores invertebrados (principalmente carrapatos) e hospedeiros vertebrados (WALKER e DUMLER, 1996; DUMLER et al., 2001; PADDOCK e CHILDS, 2003). Nos EUA, Ehrlichia chaffeensis (agente etiológico da erliquiose monocítica humana) tem como seus principais vetores os carrapatos das espécies Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis e Ixodes pacificus. É encontrada parasitando veados-de-cauda-branca (Odocoileus virginianus), o mais importante hospedeiro das formas adulta e imaturas de Amblyomma americanum (LOCKHART et al., 1997), além de cães, coiotes e cabras neste mesmo país (WALKER et al., 2008). Além disso, raposas vermelhas (Vulpes vulpes), guaxinins (Procyon lotor), gambás (Didelphis sp.) e roedores (Neotoma fuscipes, Sciurus griseus, Peromyscus spp.) podem também servir como hospedeiros para todos os estágios de Amblyomma americanum (PADDOCK & CHILDS, 2003), o que sugere que eles possam estar envolvidos na manutenção natural de E. chaffeensis. No Brasil, Ehrlichia spp. filogeneticamente próxima a E. chaffeensis foi detectada em cervos-do-pantanal (Blastocerus dichotomus) (MACHADO et al., 2006; 4 SACCHI et al., 2012) e aves carnívoras (MACHADO et al., 2012). Suspeita-se que a transmissão desta bactéria entre os cervos, no Brasil, seja realizada pelo carrapato Amblyomma triste (SACCHI et al., 2012). Além de E. chaffeensis, Ehrlichia ewingii também é transmitida pela picada do carrapato A. americanum, sendo encontrada parasitando veados-de-cauda-branca e cães nos EUA (WALKER et al., 2008). No continente asiático, E. chaffeensis, E. ewingii, E. canis e A. phagocytophilum são descritos infectando roedores na China e na Coréia, sendo que Ixodes persulcatus, Dermacentor silvarum e Haemaphysalis spp. são apontados como transmissores desses agentes (CAO et al., 2006; WEN et al., 2003; KIM et al., 2006). Em relação a E. canis, o principal mecanismo de transmissão natural no cão é pela picada do carrapato Rhipicephalus sanguineus que, no repasto sanguíneo, inocula a bactéria nos animais (EWING, 1969). O carrapato se infecta ingerindo sangue contendo a bactéria, a qual é capaz de se multiplicar nos hemócitos, nas células das glândulas salivares e do intestino (SMITH et al., 1976). A transmissão ocorre de forma transestadial e não transovariana (GROVES et al., 1975; SMITH et al., 1976). As erlíquias infectam leucócitos mononucleares, formando um agrupado de estruturas de formato cocóide ou elipsoidal. Estas inclusões citoplasmáticas em agrupamento são denominadas mórulas (RISTIC e HUXSOLL, 1984). O ciclo de desenvolvimento de Ehrlichia spp. na célula hospedeira inicia-se com a adesão de pequenas células densamente coradas (CD), as quais acabam por penetrar na célula hospedeira. Dentro de um vacúolo nesta última, as células-densas se transformam em células reticuladas (CR), as quais se multiplicam por divisão binária em cerca de 48 horas e, então, após 72 horas de infecção, maturam e se transformam em células- densas novamente. Estas, por sua vez, são liberadas da célula hospedeira e recomeçam um novo ciclo de infecção (ZHANG et al., 2006). Anaplasma platys, descrito pela primeira vez nos Estados Unidos em 1978 (HARVEY et al., 1978), infecta especificamente plaquetas de cães e causa uma doença denominada trombocitopenia infecciosa cíclica canina. Sacchi et al (2012) relata que a análise filogenética de Anaplasma spp identificados em cervos-do-pantanal aponta que 5 este agente está mais relacionado a Anaplasma platys do que a outras espécies de Anaplasma, podendo indicar a ocorrência de variedades genéticas do agente no meio selvagem. Não é conhecida a patogenicidade do agente para os cervídeos, nem mesmo os vetores envolvidos, o que motiva maiores investigações sobre a ocorrência deste agente no meio selvagem. Já Anaplasma phagocytophilum (agente etiológico da anaplasmose granulocítica animal e humana) é transmitido pelos carrapatos Ixodes scapularis e e Ixodes pacificus nos EUA, tendo como principais hospedeiros o veado-de-cauda-branca, cães, equinos, esquilos, alces e roedores. Na Europa, Ixodes ricinus é considerado o principal vetor de A. phagocytophilum (RYMASZEWSKA & ADAMSKA, 2004; FERQUEL et al., 2006), sendo descritos como hospedeiros desse agente o cabrito montês (Capreolus capreolus), alce (Alces alces), cervo vermelho (Cervus elaphus) e os roedores Apodemus flavicollis e Clethrionomys glareolus (RIZZOLI et al., 2004; SKARPHÉDINSSON et al., 2005; STUEN et al., 2006), além de equinos, bovinos, gatos e ovelhas (WALKER et al., 2008). No Brasil, Anaplasma spp. filogeneticamente próximo a A. phagocytophilum foi detectado recentemente em cães no estado do Rio de Janeiro (SANTOS et al., 2011), aves carnívoras (MACHADO et al., 2012), gatos domésticos e carnívoros selvagens em cativeiro (ANDRÉ et al., 2014; ANDRÉ et al., 2012) e cervídeos (SILVEIRA et al., 2014). Neorickettsia helminthoeca, agente etiológico da doença do envenenamento pelo salmão, ocorre na região noroeste dos EUA e sul do Brasil (HEADLEY et al., 2011). Nos EUA, a doença é transmitida pela ingestão de salmão contendo metacercárias do trematódeo Nanophytes salmincola infectadas com N. helminthoeca. O caramujo Oxytrema silicula é o primeiro hospedeiro intermediário do trematódeo (HEADLEY et al., 2011). Em relação à febre de Potomac, sabe-se que é uma doença infecciosa não contagiosa causada pela Neorickettsia risticii, sendo que pouco é conhecido sobre sua prevalência e transmissão natural. É sugerido que, pela proximidade filogenética com N. helminthoeca e N. sennetsu, N. risticii também apresente padrão de transmissão envolvendo a ingestão de trematódeos aquáticos e caramujos (PUSTERLA et al., 2000; 6 DUMLER et al., 2001). Nos EUA, existem relatos de detecção do DNA de N. risticii em morcegos e pássaros insetívoros, parasitados por trematódeos (PUSTERLA et al., 2003; GIBSON et al., 2005). No sul do Brasil, foram descritas infecções por N. helminthoteca e N. risticii, em cães e cavalos, respectivamente (HEADLEY et al., 2004; HEADLEY et al., 2006; COIMBRA et al., 2006), detectando-se, inclusive, o DNA dos agentes. No Estado do Rio Grande do Sul, Coimbra et al (2005) identificaram caramujos do gênero Heleobia albergando cercárias PCR positivas para N. risticii. 2.1.2. Agentes Anaplasmataceae e as Aves Pouco é relatado a respeito da ocorrência de agentes Anaplasmataceae em aves selvagens bem como qual papel desempenham estes animais no ciclo das enfermidades causadas pelos referidos patógenos. Estudos de patogenicidade dos agentes e tratamento das enfermidades têm sido explorados intensivamente, mas vários aspectos epidemiológicos das doenças se mantêm, em muitas regiões, especulativo. Assim, os possíveis hospedeiros para os patógenos e os ciclos naturais de transmissão ainda não foram totalmente estabelecidos. A investigação de potenciais hospedeiros para agentes Anaplasmataceae é de significativa importância, dado seu potencial zoonótico e os relatos de ocorrência destes agentes em várias espécies animais, como no caso de anfíbios (DAVIS et al., 2009), répteis (VÁCLAV et al., 2011) e aves (BJÖERSDORFF et al., 2001; DANIELS et al., 2002; OGDEN et al., 2008). Durante uma migração, várias espécies de aves se estabelecem em determinadas localidades para efetuar mudas de penas, para se alimentar ou nidificar, permanecendo nesses locais por períodos variáveis de tempo. Tal comportamento favorece o contato com ectoparasitas do local, especialmente ácaros e carrapatos, os quais, por sua vez, podem ser transportados por longas distâncias, e assim, novos focos de doenças relacionadas a este parasitismo podem ser estabelecidos ao longo das rotas migratórias (BJÖERSDORFF et al., 2001). Em relação às aves carnívoras, o hábito de predação de algumas espécies favorece a infestação por ectoparasitas e a 7 infecção por endoparasitas, devido ao contato íntimo com a presa e ingestão de vísceras da mesma. Segundo Daniels et al. (2002), torna-se necessário identificar as espécies de aves que poderiam atuar como reservatórios do agente da anaplasmose granulocítica humana (HGE) e de outros agentes potencialmente causadores de zoonoses, tais como Rickettsia spp., assim como os padrões de movimento destas aves nas migrações sazonais, tanto de curta distância quanto as que abrangem grandes extensões territoriais. Estes autores ainda sugerem que, pelo menos duas espécies de aves americanas o Turdus migratorius e o Catharus fuscescens possam atuar como reservatórios de A. phagocytophilum e Borrelia burgdorferi, sendo fonte de infecção para Ixodes scapularis. Na Suécia, estudo envolvendo 3.054 aves migratórias de 56 espécies diferentes, relatou uma frequência de 2,4% de aves parasitadas com I. ricinus, sendo que 5,4% mostraram positivos na PCR para Ehrlichia spp., detectada pela PCR (BJÖERSDORFF et al., 2001). Os autores afirmam que o papel reservatório das aves para Ehrlichia spp. ainda não está totalmente esclarecido e sugerem que as aves poderiam atuar tanto como reservatório dos agentes, como transportadoras de vetores de uma região para outra, o que ressalta a importância destes animais na epidemiologia das erliquioses. Em Nova York, EUA, 20% dos “pools” de larvas de I. scapularis coletados de aves mostraram-se positivos para A. phagocytophilum, 12 % para Borrelia burgdorferi e 4% para ambos os agentes, o que segundo os autores demonstra coinfecção. Os autores, no entanto, não descartam a possibilidade da ocorrência de cofeeding (coalimentação), em que as ninfas antes presentes nas aves poderiam ter transmitido os patógenos às larvas, num mesmo sítio de alimentação (DANIELS et al., 2002). Na Itália, o DNA de A. phagocytophilum, Borrelia garinii e Borrelia valaisiana foi detectado em exemplares de I. ricinus coletados em uma área de reprodução de aves. Os autores sugerem importante papel das aves como reservatórios destes agentes (MANNELLI et al., 2003). Neste mesmo país, Toma et al. (2014) identificaram, por meio da PCR, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia africae, Ehrlichia spp., Coxiella burnetii, Borrelia burgdorferi e Babesia microti em carrapatos recolhidos de aves migratórias. No 8 Canadá, foi detectado DNA de A. phagocytophilum e Borrelia sp. em carrapatos (I. scapularis) de aves migratórias pertencentes a 17 espécies diferentes, que migravam a partir do norte dos EUA, evidenciando a dispersão dos agentes e podendo representar um risco à Saúde Pública (OGDEN et al. 2008). Já na Alemanha, foram detectados também molecularmente, Babesia spp., A. phagocytophilum e Rickettsia spp. em 4,7%, 2,6% e 7,3%, respectivamente, nos 191 exemplares de I. ricinus provenientes de 99 pássaros (pertencentes a 11 espécies diferentes) presentes numa ilha de conservação no mar Báltico (HILDEBRANDT et al., 2010). Johnston et al. (2013), em um estudo de infecção experimental, relataram que Turdus migratorius e Dumetella carolinensis podem se infectar com e, em seguida, transmitir A. phagocytophilum aos carrapatos. Observaram que um exemplar de Turdus infectou duas de 13 larvas de carrapatos em repasto sanguíneo no dia sete pós- infecção. As aves, porém, não desenvolvem bacteremia, anticorpos específicos ou doença grave, mas os camundongos controle se tornaram bacterêmicos e apresentaram soroconversão. Estes resultados sugerem que estas duas espécies de aves não desempenham um papel significativo na manutenção do agente da HGE e que pesquisas envolvendo sorologia em aves podem não representar um indicador confiável de exposição ao A. phagocytophilum. Por outro lado, Lommano et al. (2014), na Suíça, relataram que aves do gênero Turdus foram as mais parasitadas por carrapatos, e também aquelas que carreavam maior número de carrapatos PCR positivos aos agentes estudados (A. phagocytophilum, Borrelia spp., Rickettsia spp). Os autores também afirmam que de acordo com a infecção detectada em larvas de carrapatos sobre as aves, Turdus merula e Anthus trivialis podem ser considerados reservatórios para Borrelia spp., Rickettsia spp. e A. phagocytophilum. Nesse estudo, apesar de a taxa de infecção das larvas que se alimentaram juntamente com as ninfas (16,3%) ser muito semelhante a taxa de infecção das larvas que se alimentaram sem a presença de ninfas (17,9%) no hospedeiro, não foi descartada a possibilidade da ocorrência de co-feeding (coalimentação). Os autores levantaram a possibilidade de que as ninfas deixaram o hospedeiro antes da captura do mesmo, mas efetuaram a infecção de larvas previamente. 9 Ainda, o DNA de Anaplasma spp. foi detectado em amostras de sangue de aves silvestres no Chipre, Grécia (IOANNOU et al., 2009). No Brasil, Machado et al. (2012) relataram a identificação de Ehrlichia spp. filogeneticamente próxima a E. chaffeensis e E. canis e Anaplasma spp. filogeneticamente próximo a A. phagocytophilum em Polyborus plancus, Coragyps atratus e Falco sparverius. 2.1.3. Agentes Anaplasmataceae e infecções humanas Infecções humanas por organismos da família Anaplasmataceae foram primeiramente reconhecidas em 1953, inicialmente com Neorickettsia sennetsu. Em 1986, 1990 e 1998 foram reconhecidas as infecções causadas por Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma phagocytophilum e Ehrlichia ewingii em seres humanos (DUMLER et al., 2007). Evidências sorológicas da exposição humana à E. chaffeensis, E. canis e A. phagocytophilum foram relatadas no Brasil e na Venezuela (ARRAGA-ALVARADO et al., 1996; GALVÃO et al., 2002; CALIC et al., 2004). No Brasil, anticorpos para E. chaffeensis (GALVÃO et al., 2002) e DNA de E. ewingii (OLIVEIRA et al., 2008) foram detectados em cães no Estado de Minas Gerais, onde casos suspeitos de erliquiose monocítica humana foram relatados (CALICI et al., 2004; COSTA et al. 2005; COSTA et al., 2006). Na Venezuela, PEREZ et al. (2006), utilizando PCR para o gene 16SrRNA, relataram a ocorrência de infecção humana por Ehrlichia spp. filogeneticamente próxima E. canis, em pacientes com sintomatologia clínica compatível com erliquiose. A infecção em humanos, no entanto, pode cursar assintomática, e mesmo assim, o DNA de agentes Anaplasmataceae pode ser identificado no sangue (BREITSCHWERDT et al., 2014). Vale ressaltar que as técnicas de detecção de anticorpos anti-agentes Anaplasmataceae não são específicas e, apenas por técnicas moleculares, principalmente pela amplificação de fragmentos de vários genes e sequenciamento das amostras, a detecção específica de cada agente pode ser alcançada. Desde o primeiro reconhecimento e implementação de métodos de diagnóstico para a infecção humana por E. chaffeensis, E. ewingii e A. phagocytophilum, o número 10 de casos reportados tem aumentado linearmente. No entanto, testes diagnósticos e epidemiológicos indicam que as infecções causadas por membros da referida família estão distribuídas globalmente e sugerem que outros agentes serão identificados. Com o aumento do diagnóstico das enfermidades, constatou-se que as mesmas podem se manifestar de forma severa, com aproximadamente metade dos pacientes requerendo hospitalização por complicações incluindo dificuldade respiratória, miocardite, acometimento neurológico, hepatite, choque séptico ou tóxico, infecções oportunistas, e morte em 0,5 a 3,0%. Por esse motivo, principalmente, o estudo mais aprofundado dessas doenças, incluindo a identificação de vetores, reservatórios e fatores de risco, torna-se imprescindível (DUMLER, 2005). 2.2. Infecções por agentes da Ordem Rhizobiales: Bartonella spp. 2.2.1. Agentes etiológicos e transmissão A bartonelose, uma enfermidade zoonótica reemergente, é causada por uma bactéria hemotrópica, gram-negativa, aeróbica, e intracelular facultativa, sendo transmitida por artrópodes hematófagos ou mordedura e arranhadura de animais, principalmente gatos. As Bartonella spp. são bactérias classificadas no subgrupo alfa-2 da classe Proteobacteria e pertencentes à ordem Rhizobiales. Fazem parte da família Bartonellaceae e mantêm uma relação filogenética remota com os membros da Ordem Rickettsiales (CHOMEL et al., 2003; DEHIO, 2004). Das 31 espécies de Bartonella spp. descritas, pelo menos 17 têm sido associadas com infecções humanas, sendo que várias espécies têm sido identificadas em animais domésticos e selvagens, incluindo canídeos, veados, bovinos, roedores e até mesmo tartarugas marinhas. Para várias espécies de Bartonella o vetor é conhecido, como por exemplo: B. henselae, Ctenocephalides felis; B. quintana, Pediculus humanus corporis, e B. bacilliformis, Lutzomyia verrucarum. Bartonella spp. também tem sido detectada, por meio da PCR, em carrapatos das espécies Ixodes ricinus, I. scapularis, I. persulcatus, Dermacentor reticulatus e Rhipicephalus sanguineus (MOLIN et al., 2011), além de pulgas parasitas de humanos (Pulex irritans) 11 e moscas parasitas de veados (Lipoptena cervi, Lipoptena mazamae) (KRUSZEWSKA et al, 1996; DEHIO, 2004; HALOS et al., 2004; REEVES et al., 2006; SRETER-LANCZ et al., 2006; SUN et al., 2008; TSAI et al., 2011 citados por PITASSI, 2013). 2.2.2. Bartonella spp. e Infecções Animais Os seres humanos e outros animais, como gatos, cães, veados, leões, coelhos, roedores, golfinhos, ruminantes e até tartarugas marinhas são considerados reservatórios para espécies de Bartonella (MCGILL et al., 2005; VALENTINE et al., 2007; MOSEPELE et al, 2012;; TAY et al., 2014). Assim, no Brasil e em todo o mundo, são relatadas infecções por Bartonella spp. em felídeos e canídeos, domésticos ou selvagens, cativos ou de vida livre (MOKHTAR & TAY, 2011, ANDRÉ et al., 2014). Estudos científicos sugerem que algumas espécies de aves selvagens, por carrearem carrapatos infectados com vários patógenos, atuam também na manutenção e disseminação de Bartonella spp. A região espaçadora intergênica (ITS) de Bartonella grahamii foi detectada, por meio da técnica de nested PCR, em Ixodes turdus coletado de uma ave (Zoothera aurea), na Coreia (KANG et al., 2013). Já Mascarelli et al. (2014) relataram a identificação do DNA de duas espécies patogênicas de Bartonella spp (muito semelhantes a B. henselae e B. koehlerae) no sangue de aves migratórias, pertencentes à 19 espécies diferentes, na Carolina do Norte, Estados Unidos. Por outro lado, Molin et al. (2011), na pesquisa molecular da mesma bactéria, em carrapatos (principalmente Hyalomma rufipes) recolhidos de aves migratórias em ilhas no Mediterrâneo, não encontrou carrapatos infectados com Bartonella spp. De forma semelhante, Toma et al (2014) em pesquisa do DNA de Bartonella spp. em carrapatos de aves migratórias na região central da Itália, também não obtiveram positivos para o agente em questão. 2.2.3. Bartonella spp. e Infecções Humanas 12 As espécies de Bartonella são relacionadas a quatro doenças bem conhecidas: doença de Carrión, febre das trincheiras, doença da arranhadura do gato e angiomatose bacilar (DEHIO, 2004; LIU et al., 2012). Clinicamente, as espécies de Bartonella mais importantes e que são associadas ao maior número de doenças em seres humanos são a B. bacilliformis (agente da febre de Oroya e da verruga peruana), a B. henselae (agente da doença da arranhadura do gato, da angiomatose bacilar, da peliose bacilar hepática, de endocardite e de septicemia) e a B. quintana (agente da febre das trincheiras, da angiomatose bacilar, de bacteremia e de endocardite) (ANDERSON & NEUMAN, 1997; DEHIO, 2004; LIU et al., 2012 citados por PITASSI, 2013). A B. henselae e a B. quintana estão relacionadas com a maioria das taxas de morbidade e mortalidade em indivíduos imunodeficientes e a B. henselae é a espécie mais frequentemente associada a doenças humanas (KOEHLER et al., 2003; HARMS & DEHIO, 2012). Estas espécies causam um espectro de doenças específicas em hospedeiros imunodeficientes, causando febre, endocardite com cultura negativa, osteomielite e lesões angioproliferativas mais frequentes na pele, fígado e baço (MOSEPELE et al., 2012). Febre persistente, fadiga crônica e bacteremia assintomática também têm sido detectadas em pessoas infectadas pela B. henselae (HARMS & DEHIO, 2012). No Brasil, alguns relatos chamam a atenção para a transmissão de Bartonella spp. via transfusão sanguínea, com risco de morte aos pacientes (MAGALHÃES et al., 2009). O tratamento das bartoneloses depende da expressão clínica, do sistema imune do hospedeiro e da gravidade da doença. Algumas doenças causadas por Bartonella spp. podem ter resolução espontânea, mas, em outros casos, a doença pode ser fatal sem o uso de antibióticos adequados (ROLAIN et al., 2004). 2.3. Infecções por agentes da Ordem Haemosporida 2.3.1. Agentes etiológicos e transmissão Parasitas hemosporídeos (Sporozoa: Haemosporida) são um grupo cosmopolita de protistas heteroxenos obrigatórios que parasitam anfíbios, répteis, aves e mamíferos 13 e utilizam dípteros sugadores de sangue (Insecta: Diptera) como vetores. Taxonomistas descreveram mais de 200 espécies de hemosporídeos em mais de 100 espécies de aves, e os colocaram em quatro gêneros distintos, Plasmodium, Haemoproteus, Leucocytozoon e Fallisia. Os vetores desses parasitas são exclusivamente insetos dípteros hematófagos (BRAGA et al., 2011). Todos os quatro gêneros de parasitas têm ciclos de vida semelhantes, sendo que as diferenças residem basicamente na fase assexuada, no hospedeiro vertebrado. 2.3.2. Aves e Infecções por Plasmodium spp, Haemoproteus spp. e Leucocytozoon spp. Hemosporídeos têm sido estudados desde 1884 e infecções por Plasmodium spp. em aves são considerados modelos importantes no estudo da malária humana. Para as aves, declínio na produtividade e até alta mortalidade por essas infecções parasitárias têm sido relatadas. A maioria das infecções por parasitas do gênero Haemoproteus produz infecções subclínicas. Em alguns pássaros, anemia, anorexia e depressão foram observadas e há relatos de que algumas espécies deste parasita podem ser bastante virulentos e letais para algumas espécies de aves (ELAHI et al., 2014). Já parasitas do gênero Plasmodium causam malária aviária, e podem ser bastante virulentos, sobretudo para hospedeiros “imunologicamente despreparados”, ou seja, que mantém pouco ou nenhum contato com o parasita. Um dos impactos mais significativos das infecções por Plasmodium spp. sobre as aves hospedeiras ocorre a longo prazo sobre o sistema reprodutivo, acarretando decréscimo da população (LAPOINTE et al., 2012). Leucocytozoon normalmente provoca anemia e aumento do fígado e baço, e pode ser altamente patogênico em perus e patos (VALKIUNAS 2005; ELAHI et al., 2014). No que se refere aos vetores, onde estes parasitas realizam a fase sexuada, Plasmodium spp. são transmitidos por várias espécies de mosquitos (Culicidae), de diferentes gêneros; Haemoproteus, em geral, é transmitido por moscas Hipposbocidae 14 e Ceratopogonidae; já a transmissão de Leucocytozoon é realizada por moscas Simuliidae e Ceratopogonidae (subgênero Akiba). Até o momento, são conhecidas mais de vinte espécies de mosquitos anofelinos nos quais a esporogonia de Plasmodium spp. é completada. Assim, Anopheles spp. são vetores viáveis para P. cathemerium, P. gallinaceum, P. lophurae, P. fallax, and P. relictum (VALKIUNAS, 2005). Descobriu-se recentemente que a infecção crônica causada pelos hemosporídeos representados pelos agentes Plasmodium spp. e Haemoproteus spp., promove o encurtamento dos telômeros, e então as células morrem, acumulando danos nos tecidos e provocando disfunções nos órgãos. Esses fatores reduzem o tempo de vida das aves, interferindo no sucesso reprodutivo e na propagação da espécie (ASGHAR et al., 2015). No Brasil, Bennett & Lopes (1980) pesquisaram a prevalência de hemosporídeos em cerca de 3500 aves provenientes de três regiões ou cidades do Estado de São Paulo: Itapetininga, Casa Grande e Guaratuba. No referido estudo, os pesquisadores obtiveram a prevalência de 0,9% de Plasmodium spp. em Guaratuba (a região mais abundante em hemoparasitas: Plasmodium, Haemoproteus, Trypanosoma, microfilárias), e 1,8% de prevalência para o mesmo parasita em Itapetininga. Woodworth-Lynas et al. (1989) ampliaram o número de aves amostradas (15574 animais), porém também encontraram baixa prevalência de Plasmodium spp. (0,6%). Vale ressaltar que a técnica utilizada na pesquisa dos hemosparasitas em ambos os estudos citados foi unicamente a análise de esfregaços sanguíneos em microscopia de luz. Estudos que combinam a análise de esfregaços sanguíneos e PCR em geral obtém maior porcentagem de aves positivas, com prevalências que variam de 0 a 100% para Plasmodium spp. e 0 a 18,48% para Haemoproteus spp., em várias espécies de aves e diferentes regiões do Brasil (BUENO et al., 2010; LIMA et al., 2010; RIBEIRO et al., 2005; BELO et al., 2009, citados por BRAGA et al., 2011). Desta forma, estes parasitas são importantes na definição de estratégia de conservação das mais variadas espécies de aves selvagens, e estudos mais 15 aprofundados envolvendo prevalência da infecção nas aves e identificação de reservatórios e vetores devem ser conduzidos. 2.3.3. Ordem Haemosporida e infecções humanas O homem é o hospedeiro natural de Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, mas não se infecta, em geral, com plasmódios de outros mamíferos, aves ou répteis, nem mesmo com parasitas dos gêneros Leucocytozoon e Haemoproteus. Entretanto, algumas espécies que causam malária em símios como P. simium, P. brasilianum, P. cynomolgi, P. inui e P. knowlesi, já foram implicadas em malária em humanos, tanto em infecções acidentais como em infecções naturais. Reciprocamente, em condições naturais, os plasmódios da malária humana só se desenvolvem no homem, com exceção do P. malariae, que infecta também algumas espécies de macacos (RAMASAMY 2014). 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral O presente estudo teve como objetivo pesquisar em aves carnívoras e seus ectoparasitas, provenientes dos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro, a ocorrência de agentes Anaplasmataceae, Bartonellaceae e Haemosporida, utilizando métodos sorológicos e moleculares. 3.2. Objetivos específicos • Capturar aves carnívoras nos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro para obtenção de amostras de sangue, soro e ectoparasitas hematófagos (quando presentes) das mesmas; • Determinar a ocorrência de ectoparasitas hematófagos nestas aves; 16 • Pesquisar a presença de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cada ave amostrada; • Investigar a presença de anticorpos anti-Ehrlichia chaffensis, anti-E. canis e anti-Anaplasma phagocytophilum nas amostras de soro das aves, por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta; • Realizar a pesquisa de DNA de agentes Bartonellaceae (Bartonella spp.), Anaplasmataceae (E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, Neorickettsia risticii, N. helminthoeca, A. phagocytophilum e A. platys) e Haemosporida (Plasmodium spp., Haemoproteus spp. e Leucocytozoon spp.), nas amostras de sangue das aves e de seus ectoparasitas amostrados; • Sequenciar as amostras positivas, realizando análise molecular filogenética dos agentes encontrados. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Espécies amostradas e áreas de estudo Aves carnívoras pertencentes às Ordens Accipitriformes (águias e gaviões), Falconiformes (falcões e carcarás); Strigiformes (corujas) e Cathartiformes (urubus) foram capturadas e amostradas nos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro. As 121 amostras de sangue obtidas foram provenientes de aves capturadas em seu habitat natural, assim como de aves atendidas no Ambulatório de Animais Selvagens do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel (AASHVGLN), da FCAV - UNESP – Jaboticabal, no Ambulatório Veterinário da Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP, bem como no Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS) - Vargem Pequena/RJ (Quadro 1) (Licença IBAMA nº 31743-1; Protocolo – Comissão de Ética nº4153/12). 4.2. Métodos de Captura Para a captura de falcões, corujas e gaviões selvagens, utilizou-se armadilha do tipo “bal-chatri” (CARVALHO FILHO et al., 2005), com camundongos isogênicos de 17 pelagem negra como isca, gentilmente cedidos pelo biotério da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto - SP. A armadilha era transportada juntamente com os pesquisadores em veículo comum e, assim que as aves eram avistadas com auxílio de binóculo, a aproximação era gradativa, sendo que a armadilha era colocada no chão, dentro do campo visual do animal. Assim que a ave era capturada na tentativa de predar o camundongo, os pesquisadores se aproximavam rapidamente, procurando restringir a visão do animal com auxílio de uma pequena toalha de tecido, para minimizar o estresse. Uma vez desvencilhada da armadilha, todos os procedimentos previstos de colheita eram realizados. As aves capturadas por este método foram amostradas nos municípios de Jaboticabal – SP e Descalvado – SP, em vários trechos rodoviários (Quadro 1). Para a captura de urubus de vida livre, utilizou-se a estrutura de uma antiga pocilga, a qual foi telada, deixando uma porta cujo movimento (de abertura ou fechamento) era controlado por uma corda, à distância. Com o objetivo de atrair as aves, dentro da pocilga foram colocados restos de vísceras de animais, obtidos em frigoríficos próximos. Estes animais foram amostrados em uma propriedade rural no município de Santa Ernestina – SP. Já para as aves provenientes do Ambulatório de Animais Silvestres do HVGLN, da FCAV – UNESP – Jaboticabal, ou aquelas em recuperação no ambulatório veterinário da Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP e no Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS) - Vargem Pequena/RJ, a captura e manipulação das mesmas foram facilitadas pela condição do recinto. Antes do procedimento de colheita de sangue, as aves foram acondicionadas em gaiolas, o que permitiu a rápida captura e contenção física, minimizando o estresse dos animais (Figuras 1 a 4). 18 Figura 1. Captura de exemplar macho da espécie Falco sparverius em Jaboticabal - SP. Figura 2. Gavião Carijó (Rupornis magnirostris) jovem, capturado com auxílio da bal-chatri, em Descalvado – SP. 19 Quadro 1. Espécies e número de aves amostradas, incluindo local da captura e período de amostragem, assim como presença ou ausência de ectoparasitas, nos Estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Brasil. Espécie Nome comum Número de animais amostrados Local de amostragem Período de amostragem Presença de Ectoparasitas Speotyto cunicularia Coruja Buraqueira 09 1FCAV; 3AMC; 5Descalvado - SP 03.2012 a 06.2014 Não Tyto alba Suindara 07 1FCAV; 3AMC; 05.2012 a 04.2014 Não Polyborus plancus Carcará 06 1FCAV; 4RJ 05.2012 a 05.2014 Não Rupornis magnirostris Gavião-carijó 16 1FCAV; 3AMC; 4RJ; 2Jaboticabal- SP; 5Descalvado - SP 07.2012 a 07.2014 Sim (uma ninfa ingurgitada e três larvas de Amblyomma spp, em apenas uma ave) Coragyps atratus Urubu-de- cabeça-preta 38 1FCAV; 6Santa Ernestina – SP; 07.2012 a 10.2013 Não Asio clamator Coruja Orelhuda 09 1FCAV; 3AMC; 4RJ 08.2012 a 05.2014 Não Ictinia plumbea Gavião- pomba 01 1FCAV 09.2012 Não Megascops choliba Coruja-do- mato- pequena 14 1FCAV; 3AMC; 4RJ 10.2012 a 04.2014 Não Falco femoralis Falcão- coleira 04 1FCAV; 5Descalvado - SP 02.2013 a 06.2014 Não Falco sparverius Falcão Quiri- quiri 10 4RJ; 2Jaboticabal- SP; 5Descalvado - SP 03.2013 a 06.2014 Não Milvago chimachima Gavião - carrapateiro 03 3AMC; 5Descalvado - SP 12.2013 a 04.2014 Não Parabuteo unicinctus Gavião-asa- de-telha 02 4RJ Abril de 2014 Não Asio stygius Mocho-diabo 01 4RJ Abril de 2014 Não Falco peregrinus Falcão peregrino 01 4RJ Abril de 2014 Não 1. FCAV. Ambulatório de Animais Selvagens do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel (AASHVGLN) , Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal – SP (21º14’95” S; 48º17’69” O); 2. Jaboticabal-SP (21º13’83”S; 48º17’06”O); 3. AMC. Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP (23º10’11”S; 46º56’33”O); 4. RJ. Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS) - Vargem Pequena/RJ (22º59’75”S; 43º27’75”O); 5. Descalvado – SP (21º54’60”S; 47º37’14”O); 6. Santa Ernestina – SP (21º27’94”S; 48º23’81”O). 20 Figura 3. Armadilha improvisada em antiga pocilga em propriedade rural no município de Santa Ernestina - SP, para captura de urubus (Coragyps atratus) – A. Vista lateral; B. Vista Interna. A B 21 4.3. Colheita das amostras Após a captura, as aves foram contidas fisicamente e examinadas, observando- se o estado corpóreo, coloração de mucosas e aberturas naturais (bico, olhos, narinas, ouvidos, cloaca), além da verificação da presença de ectoparasitas. A colheita de sangue foi realizada por meio de venopunção, utilizando-se agulhas e seringas esterelizadas. Utilizou-se preferencialmente a veia jugular direita, veia ulnar ou basílica e veia metatársica dorsal, de acordo com a espécie animal. Utilizaram-se seringas de 1 mL e agulhas 0,45 x 13mm, sendo que o volume obtido variou de acordo com a espécie animal, respeitando-se a colheita de volume correspondente a no máximo 1% do peso vivo da ave. Logo após a colheita, foram realizados esfregaços sanguíneos das aves. Metade do sangue foi depositada em microtubos de 1,5 mL contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 10% como anticoagulante (9μL para cada 100 μL de sangue) e a outra parte em tubos sem anticoagulante para obtenção de soro. As amostras de sangue sem anticoagulante foram submetidas à centrifugação (5000 rpm, durante 20 minutos) e uma vez obtidas, as amostras de sangue e soro foram armazenadas em microtubos de 1,5 mL e mantidas a -20°C até a realização dos testes. Para alguns animais amostrados, não foi possível a obtenção de soro devido à dificuldade na colheita e ao estado geral do animal. Desta forma, obtivemos 88 amostras de soro e ou plasma das 121 aves amostradas. No momento da contenção, procedeu-se também à procura minuciosa dos ectoparasitos por toda a superfície corporal do animal, sobretudo nas regiões menos acessíveis para as aves (como região dorsal do pescoço e face), quando realizam a limpeza corporal. Os ectoparasitas encontrados foram retirados da ave manualmente e acondicionados em frascos contendo álcool 70%. 22 Figura 4. Contenção de Tyto alba para colheita de sangue, na Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP. 4.4. Pesquisa de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos Amostras de sangue dos animais capturados foram também utilizadas para confecção de três esfregaços sanguíneos por ave, os quais foram fixados pelo Metanol (Synth®) durante três minutos e corados pelo corante Giemsa (Sigma®) durante 40 minutos. A presença de corpúsculos de inclusão ou de mórulas sugestivos de Ehrlichia spp. e Anaplasma spp. nos leucócitos foram avaliados sob microscopia de luz (x1000), com a observação minuciosa de pelo menos 50 campos por lâmina. Também pesquisou-se a presença de hemosporídeos, tais como Plasmodium spp., Haemoproteus spp. e Leucocytozoon spp. 4.5. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) 23 A Reação de Imunofluorescência Indireta foi realizada para detecção de anticorpos anti - A. phagocytophilum, anti-Ehrlichia chaffeensis e anti-Ehrlichia canis, em 88 amostras de soro ou plasma das aves capturadas. Procedeu-se à diluição das amostras a 1:40 em solução salina tamponada com fosfato, PBS pH 7,2 (1,3 M NaCl; 27 mM KCl; 56 mM Na2HPO4; 10 mM KH2PO4; 9,2 mM NaH2PO4). Dez microlitros do soro diluído foram depositados em cada poço das lâminas contendo, em separado, substrato antigênico de A. phagocytophilum (amostra gentilmente cedida pelo Prof. Dr. John Stephen Dumler), E. chaffeensis (Scimedx Corporation, Denville, USA) e E. canis (Immunodot®, Jaboticabal, São Paulo, Brasil), reservando-se dois poços para a adição das amostras de controle positivo e negativo. As lâminas foram incubadas a 37° C por 30 minutos em câmara úmida; em seguida, foram lavadas em PBS (tamponado com fosfato, 0,01 M, pH 7,2), secas e à cada poço foram adicionados 10 L de conjugado (anti-IgG de ave, marcado pelo isoticianato de fluoresceína), diluído conforme orientação do fabricante (1:10; Sigma®). As lâminas foram então novamente incubadas (30 minutos a 37°C), em câmara úmida. Após nova lavagem e secagem, cada lâmina foi montada com lamínula em glicerina tamponada em tampão carbonato - bicarbonato (pH 9,5). As lâminas foram visualizadas em microscópio equipado com luz fluorescente para avaliação. Foram considerados positivos soros que reagiram na diluição de 1:40. A positividade da reação permitiu a observação de fluorescência nas mórulas, comparando-se com os controles positivo e negativo (RISTIC et al., 1972). Foram utilizadas amostras de soro de cervo-do-Pantanal (Blastocerus dichotomus) como controles positivo e negativo para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, e soro de cães como controles para E. canis, ambos obtidos no Laboratório de Imunoparasitologia, do Depto de Patologia, da FCAV – UNESP – Jaboticabal. 4.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 4.6.1 Extração de DNA 24 A extração de DNA de sangue total foi realizada utilizando-se o QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen®) de acordo com as recomendações do fabricante, porém com algumas modificações (uso do tampão ATL e 10 μL de sangue total, extraído duas vezes para realização de “pool”). O DNA extraído foi armazenado a -20°C e submetido a dosagem de sua concentração em aparelho espectrofotômetro (Nanodrop®, Thermo Scientific), antes da realização da PCR. 4.6.2 PCR em Tempo Real (qPCR) Realizou-se a PCR em Tempo Real (qPCR) Multiplex para Ehrlichia spp., (gene groE), Anaplasma spp. (gene groE) e Bartonella spp.(gene nuoG) (Tabela 1) (ANDRÉ, 2012), assim como qPCR para detectar especificamente E. chaffeensis (gene vlpt) e A. phagocytophilum (gene msp-2) (Tabela 2). As reações de amplificação foram realizadas utilizando uma reação de volume total final de 10 L, contendo uma mistura com 1 L do DNA-amostra, 0,2 M de cada oligonucleotídeo iniciador e sonda de hidrólise, tampão da PCR (IQ Multiplex Power Mix®, BioRad) e água estéril ultra-pura (Nuclease-Free Water®, Promega) q.s.p. 10 L. As reações de amplificação foram conduzidas em aparelho termociclador CFX96 Thermal Cycler® (BioRad). Todas as amostras foram testadas em duplicatas. Água estéril ultra-pura (Promega®) foi utilizada como “branco” na reação. A sequência térmica e de tempo de amplificação foram de: 95°C por 3 minutos seguidos por 40 ciclos compostos por 95°C por 10 minutos e 55°C por 30 segundos. Diluições seriadas foram feitas para construir padrões com diferentes concentrações de DNA plasmidial (plasmídeos IDT psmart, (Integrated DNA Technologies®, Coralville, Iowa, Estados Unidos) contendo a sequência-alvo (2,0 x 107 cópias/ μL a 2,0 x 100 cópias/ μL). A partir daí, a Eficiência da Amplificação (E) foi calculada a partir da curva-padrão por meio da fórmula E = 10–1/slope . 25 Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores e sondas de hidrólise (probe TaqMan) utilizados na qPCR multiplex para os gêneros Ehrlichia spp., Anaplasma spp. e Bartonella spp. (ANDRÉ, 2012). Agentes Gene alvo Oligonucleotídeos iniciadores Sonda de hidrólise (Probe TaqMan) Ehrlichia spp. groE 5’-GCGAGCATAATTACTCAGAG-3’ 5’-CAGTATGGAGCATGTAGTAG-3’ TET- 5’- CCACCTTATCATTACACTGAGACG- 3’[BHQ2a-Q]3’ Anaplasma spp. groE 5’-TTATCGTTACATTGAGAAGC-3’ 5’GATATAAAGTTATTAAAAGTATAAAGC-3’ Cy-5- 5’- CATTGGCTCTTGCTATTGCTAAT- 3’[BHQ2a-Q]3’ Bartonella spp. nuoG 5’-CAATCTTCTTTTGCTTCACC-3’ 5’-TCAGGGCTTTATGTGAATAC-3’ TexasRed-5’-TTYGTCATTTGAACACG- 3’[BHQ2a-Q]3’ Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores, genes alvo e sondas de hidrólise (probe TaqMan) utilizados nas qPCRs para E. chaffeensis e A. phagocytophilum (RELLER et al., 2010). 4.6.3 PCR Convencional 4.6.3.1 Reações de Amplificação Nas reações de PCR convencional, utilizou-se como gene alvo o 16SrRNA para agentes Anaplasmataceae e o gene citocromo B para agentes Haemosporida (Quadro 2). Para detecção e caracterização molecular das amostras PCR positivas para o gene 16SrRNA de Ehrlichia spp. e Anaplasma spp., utilizaram-se também protocolos baseados nos genes alvo omp-1, dsb e groESL (Quadro 3). Foram utilizados 5 ul de Agentes Gene alvo Oligonucleotídeos iniciadores Sonda de hidrólise (Probe TaqMan) E. chaffeensis A. phagocytophilum vlpt msp-2 F (5’-CTAATTCTGATTTACACGAGTCTTC-3’) R (5’-CATCATCTTCGAATTGAACTT C-3’) F (5’-GAAGATGAW GCTGATACAGTA-3’) R (5’- CAACHGCCTTAGCAAA CT-3’) 5’[TAMRA] (TTGA GTGTCC[BHQ2a-Q]3’ 5’[Cy-5](TTATCAGTC TGTCCAGTAACA[BHQ2a-Q] 3’ 26 DNA de cada amostra, 1,25 Taq DNA Polimerase (Invitrogen®, Carlsbad, California, Estados Unidos), Tampão da PCR (PCR buffer 10 X – 100nM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl), deoxinucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 1,5 mM de Cloreto de Magnésio, 0,5 μM de cada oligonucleotídeo iniciador e água ultra-pura estéril q.s.p. 25 μL. Nas reações de nested PCR, foram utilizados os mesmos reagentes e concentrações, porém 3μL do produto amplificado na primeira reação. Para controle interno da extração de DNA e possível detecção de inibidores da PCR, realizou-se inicialmente a amplificação do fragmento de DNA relacionado à enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores GAPDH-F CCTTCATTGACCTCAACTACAT e GAPDH-R CCAAAGTTGTCATGGATGACC) (BIRKENHEUER et al., 2003) . Os controles positivos de E. chaffeensis, A. phagocytophilum, N. risticii e N. helminthoeca foram gentilmente cedidos pelo Prof. John Stephen Dumler (University of Maryland, Maryland, USA). Já os controles positivos de E. canis e A. platys foram disponibilizados pela Profª Dr.ª Rosangela Zacarias Machado, no Laboratório de Imunoparasitologia (Departamento de Parasitologia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, FCAV – UNESP – Jaboticabal – SP). Os oligonucleotídeos iniciadores e as sequências térmicas utilizados nas PCRs convencionais para agentes Anaplasmataceae (gene 16SrRNA) e hemosporídeos (gene citocromo B) estão representados no Quadro 2. O critério de seleção dos genes alvo 16S e citocromo B baseou-se no fato de que os mesmos são genes conservados, e portanto permitiriam a detecção de várias espécies dos patógenos em questão, incluindo variantes genotípicas ainda não conhecidas. 27 Quadro 2. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores para as reações de PCR e nested PCR, tamanho do amplímero (pb), seqüência térmica e referências utilizadas, relacionados a cada agente pesquisado (agentes Anaplasmataceae gene alvo 16SrRNA; hemosporídeos , gene alvo citocromo B). Agente Sequencia do oligonucleotídeo pb Sequencia térmica Referência Ehrlichia spp. - ECC - ECB 5’- GAACGAACGCTGGCGGCAAGC-3’ 5’- CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA -3’ 478 -94°C por 5 min.; -40 ciclos: 1 min a 94°C, 1 min a 60°C e 1 min. a 72°C; 72°C por 5min MURPHY et al., 1998 Nested E. canis - ECAN-5 -HE3 5’-CAA TTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA -3’ 5’-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3’ 358 94°C por 5 min 40 ciclos: 1 min a 94°C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C; 72°C por 5 min MURPHY et al., 1998 Nested E. chaffeensis - CHAF - GAIUR 5’CAA TTG CTT ATA ACC TTT TGG TTA TAA AT 3´ 5´- GAC TTT GCC GGG ACT TCT TCT - 3´ 410 94°C por 5 min 40 ciclos: 1 min a 94°C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C; 72°C por 5 min PERSING, 1996; Nested E. ewingii - 18F - 1448R - Ewingii - GAIUR 5´- AGTTTGATCATGGCTCAG-3´ 5´- CCATGGCGTGACGGGCAGTGTG-3´ 5´-CAATTCCTAAATAGTCTCTGACTATT-3´ 5´-GACTTTGCCGGGACTTCTTCT-3´ 412 94°C por 5 min 40 ciclos: 1 min a 94°C, 2 min a 45°C e 2 min a 72°C 72°C por 5 min PERSING, 1996 Anaplasma platys - Platys F - Platys-R 5´- AAGTGCAACGGATTTTTGTC-3´ 5´- CTTTAACTTACCGAACC-3 504 94°C por 5 min 40 ciclos: 30 s a 95°C, 30 s a 60°C e 90 s a 72°C; 72°C por 5 min INOKUMA et al., 2001 A. phagocytophilum - gE3a - gE10R - gE2 - gE9f 5´- CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC-3´ 5´- TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC´-3´ 5´- GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG-3´ 5´-AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3´ 546 94°C por 5 min 40 ciclos: 30 s a 94°C, 30 s a 55°C e 1 min a 72°C; 72°C por 5 min MASSUNG et al., 1998 Neorickettsia risticii - ER3-F - ER2-R - ER3a-F - ER2a-R 5´- ATTTGAGAGTTTGATCCTGG-3´ 5´- GTTTTAAATGCAGTTCTTGG-3´ 5´- CTAGCGGTAGGCTTAAC-3´ 5´- CACACCTAACTTACGGG-3´ 529 94°C por 5 min 40 ciclos: 1 min a 94°C, 2 min a 72°C e 2 min a 72°C; 72°C por 5 min CHAE et al., 2003 N. helminthoeca NeoSH – F NeoSH - R 5’-TAGGCCCGCGTTAGATTAGCTTGT-3’ 5’-TACAACCCAAGGGCCTTCATCACT-3’ 200 94°C por 2 min 40 ciclos: 1 min a 94°C, 45 s a 67°C e 45 s a 72°C; 72°C por 5 min HEADLEY et al., 2006 Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. HamNF-1 HaemNR3 Haem F Haem R2 5’ – CATATATTAAGAGAATATGGAG-3’ 5’ – ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3’ 5’ – ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3’ 5’ – GCATTATCTGGATGTGATAATGGT-3’ 480 94°C por 3 min 20 ciclos: 30 s. a 94°C, 30 s a 50°C e 45 s. a 72°C; 72°C por 10 min; 94°C por 3 min 35 ciclos: 30 s. a 94°C, 30 s. a 55°C e 45 s. a 72°C; 72°C por 10 min; HELLGREN et al., 2004 BENSCH et al., 2000 Leucocytozoon spp. HaemFL HaemR2L 5’ – ATGGTGTTTTAGATACTTACATT – 3’ 5’ – CATTATCTGGATGAGATAATGG – 3’ 478 94°C por 3 min 35 ciclos: 30 s. a 94°C, 30 s. a 50°C e 45 s. a 72°C; 72°C por 10 min; HELLGREN et al., 2004 28 Quadro 3. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho do amplímero (pb), sequência térmica e referências, utilizados nas reações de PCR e nested PCR realizadas apenas para amostras previamente positivas na qPCR para o gene groESL e PCR convencional para o gene 16SrRNA (Ehrlichia spp. Anaplasma spp.). Agente (gene alvo) Sequência do oligonucleotídeo pb Sequencia térmica Referência Ehrilichia spp.(omp-1) - conP28-F1 - conP28-R1 - conP28-F2 - conP28-R2 5´-AT(C/T)AGT(G/C)AAA(A/G)TA(T/C)(A/G)T(G/A)CCAA-3´ 5´- TTA(G/A)AA(A/G)G(C/T)AAA(C/T)CT(T/G)CCTCC-3´ 5’CAATGG(A/G)(T/A)GG(T/C)CC(A/C)AGA(AG)TAG-3´ 5´-TTCC(T/C)TG(A/G)TA(A/G)G(A/C)AA(T/G)TTTAGG-3 300 94°C por 3 min.; 35 ciclos: 1 min a 94°C, 1 min a 50°C e 2 min. a 72°C; 72°C por 7min. INAYOSHI et al., 2004 Ehrilichia spp.(dsb) - dsb 330 - dsb 728 5’-GATGATGTCTGAAGATATGAAACAAAT-3’ 5’- CTGCTCGTCTATTTTACTTCTTAAAGT-3’ 409 95°C por 2 min. 50 ciclos: 15 s a 95°C, 30 s a 58°C e 30 s a 72°C; 72°C por 5 min. DOYLE et al., 2005 Ehrlichia e Anaplasma spp. (groESL) - HS1a - EHR-CS778R - HS43 - HSVR 5’-AITGGGCTGGTAITGAAAT-3’ 5’- CCICCIGGIACIAIACCTTC-3’ 5’-AT(A/T)GC(A/T)AA(G/A)GAAGCATAGTC-3’ 5’-CTCAACAGCAGCTCTAGTAGC-3’ 1297 3 ciclos iniciais: 94°C por 1 min., 48ºC por 2 min., 72ºC por 1 min. e 30 s; 37 ciclos: 94°C por 1 min., 48ºC por 2 min., 72ºC por 1 min. e 30 s; 72ºC por 5 min; Na segunda reação (nested PCR), a temperatura de anelamento foi aumentada para 55°C. SUMNER et al., 1997; NICHOLSON et al., 1999; LOTRIC- FURLAN et al., 1998; LIZ et al., 2000 4.6.3.2 Eletroforese de DNA em gel de agarose Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,5% corado com Brometo de Etídeo (0,5 μL/mL) em tampão de corrida TEB pH 8,0 (44,58 M Tris-base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mM EDTA). A eletroforese foi realizada a 90 V/ 50mA durante 55 minutos. Para a determinação dos produtos amplificados foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 pares de base. Os resultados foram visibilizados e analisados por meio de um transiluminador de luz ultravioleta acoplado a um programa computacional de análise de imagens (Chemidoc - BioRad®). 4.6.3.4 Extração e Purificação das amostras Após a reação de PCR, as bandas referentes a cada amplímero foram cortadas 29 do gel de agarose com lâmina de bisturi estéril, pesadas e colocadas em tubos de polipropileno de 2,0 mL devidamente identificados. Na sequência, foi realizada extração do produto da PCR em gel de agarose, utilizando-se um kit de purificação de DNA (Fermentas®) de acordo com as recomendações do fabricante. Para as amostras em que se observou apenas uma banda no gel, procedeu-se a purificação do DNA diretamente do produto da nested PCR, utilizando-se o mesmo kit. A quantificação de material amplificado foi realizada em aparelho espectrofotômetro (Nanodrop®, Thermo Scientific), por meio da leitura da absorbância de cada amostra. 4.6.4 Sequenciamento O sequenciamento dos produtos amplificados foi realizado por meio de sistema automatizado baseado no método da terminação da cadeia por dideoxinucleotídeo (SANGER et al., 1977). O protocolo da reação de sequenciamento foi realizado com algumas modificações a partir daquele descrito pelo fabricante do Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer Applied Biosystems) e as amplificações se deram inicialmente no termociclador (MJ Research-Inc). O sequenciamento foi conduzido no Centro De Recursos Biológicos e Biologia Genômica, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (Unesp – Campus de Jaboticabal - SP). 4.6.5 Análise das sequências e construção das árvores filogenéticas A trimagem foi feita pelo programa Phred (EWING et al., 1998), que avalia os eletroferogramas gerados nos sequenciamentos, observando-se a qualidade dos picos correspondentes à cada base sequenciada e conferindo um valor de probabilidade de erro a cada uma das amostras. Foram consideradas as bases com qualidade acima de 20. O programa CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php) foi utilizado para realizar o alinhamento da sequência consenso. O programa BLAST foi utilizado para analisar as 30 sequências de nucleotídeos (BLASTn), objetivando-se procurar e comparar sequências similares em banco de dados internacionais (GenBank) (BENSON et al., 2002) com aquelas obtidas. As sequências salvas em modo “FASTA” foram alinhadas com outras sequências homólogas do mesmo gene sequenciado retiradas do banco de dados (genbank), utilizando o software Clustal/W via Bioedit v. 7.0.5.3 (HALL, 1999). Foi realizada análise de máxima verossimilhança utilizando o cluster blackbox RaxML (STAMATAKIS et al., 2008), via portal CIPRES (MILLER et al., 2010), estimando a proporção de sítios invariáveis pelo modelo evolutivo GTRGAMMA+I. A edição das árvores filogenéticas assim como o enraizamento (via grupo externo) foi realizada utilizando o software Treegraph 2.0.56-381 beta (STOVER e MULLER, 2010). 5. RESULTADOS 5.1. Presença de Ectoparasitas Apenas um gavião carijó (R. magnirostris) (0,8%), capturado com auxílio da bal- chatri no município de Descalvado-SP estava parasitado com carrapatos. Foram recolhidas uma ninfa de Amblyomma spp. próxima da abertura nasal esquerda da ave, assim como três larvas do mesmo gênero, nas patas do animal (Figura 5). Para a identificação específica dos carrapatos amostrados, ainda será realizada a PCR convencional (baseada no gene 18S) a partir do DNA extraído dos mesmos. 31 Figura 5. Gavião Carijó (R. magnirostris) recém capturado em Descalvado – SP, evidenciando a presença de uma ninfa ingurgitada de Amblyomma spp. na proximidade da abertura nasal esquerda. 5.2. Avaliação dos esfregaços sanguíneos Nas lâminas coradas pelo Giemsa e avaliadas em microscopia de luz (com aumento de 400 ou 1000X), não foram encontradas mórulas ou inclusões de Ehrlichia spp. ou Anaplasma spp. no interior dos leucócitos observados. De forma semelhante, outros parasitas, tais como Plasmodium spp., Haemoproteus spp. e Leucocytozoon spp. também não foram visualizados. 5.3. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Cinco aves (5,68%) mostraram-se sororreagentes na diluição de 1:40 na RIFI para A. phagocytophilum, em um total de 88 amostras de soro ou plasma testadas, o que equivale a uma prevalência de 5,68%. As amostras positivas foram referentes a 32 duas aves da espécie Rupornis magnirostris (gavião carijó), capturados utilizando-se a bal-chatri nas proximidades da FCAV – UNESP – Jaboticabal, e três da espécie Coragyps atratus (urubu), provenientes do município de Santa Ernestina - SP. Observou-se que as amostras reagiram fracamente, no que se refere a intensidade da fluorescência, quando comparadas com o controle positivo (Figura 6). Já na RIFI utilizando-se antígeno de Ehrlichia chaffeensis, três amostras (3,41%) mostraram-se reagentes na diluição de 1:40. As aves soropositivas foram um espécime de Coragyps atratus (urubu), proveniente do município de Santa Ernestina – SP, uma ave da espécie Asio clamator (coruja orelhuda), proveniente do AASHVGLN - FCAV – UNESP - Jaboticabal – SP e também um exemplar de Megascops choliba (coruja-do-mato- pequena), proveniente da AMC - Jundiaí, SP. Destas aves, a intensidade da fluorescência foi maior na RIFI realizada com o soro de C. atratus, enquanto as outras amostras reagiram fracamente em relação ao controle positivo (Figura 7). Em relação à RIFI para E. canis, todas as amostras testadas mostraram-se soronegativas (Figura 8). Figura 6. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de cervo-do-Pantanal) para A. phagocytophilum. Em A, são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B, não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 400X e 1000X, respectivamente. A B 33 Figura 7. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de cervo-do-Pantanal) para Ehrlichia chaffeensis. Em A são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 1000X. Figura 8. Reação de Imunofluorescência Indireta, mostrando soropositividade (A) e soronegatividade (B) dos controles positivo e negativo (soro de felino) para Ehrlichia canis. Em A são observadas mórulas fluorescentes no interior das células, ao passo que em B não se verifica a presença das mesmas. Aumento de 1000X. 5.4. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) Os resultados da qPCR Multiplex para Ehrlichia spp e Anaplasma spp. revelaram a positividade de 12 aves para Anaplasma spp. (9,91%), com eficiência da reação de E=84,7% para Ehrlichia e E=89,8% para Anaplasma. (Tabela 3; Figura 9). Na qPCR para E. chaffeensis, A. phagocytophilum e Bartonella spp, todas as A B A B 34 amostras testadas mostraram-se negativas (Figuras 10, 11 e 12), com eficiência da reação de 100,2%, 95,5% e 97,5%, respectivamente. Figura 9. Resultados da qPCR para Ehrlichia spp e Anaplasma spp. (gene alvo groE; linhas azul e violeta, respectivamente). Em A, são evidenciadas amostras positivas para Anaplasma spp. do lado direito e inferior do quadro. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação. A B 35 Tabela 3. Espécies e origem das aves positivas na qPCR para Anaplasma spp. (gene groE). Nºda amostra Nome comum Nome científico Local de amostragem 75 Coruja-do-mato Megascops choliba 1AMC; 78 Coruja Buraqueira Speotyto cunicularia 1AMC; 83 Suindara Tyto alba 1AMC; 87 Mocho Orelhudo Asio clamator 1AMC; 113 Coruja Buraqueira Speotyto cunicularia 2Descalvado - SP 115 Gavião carrapateiro Milvago chimachima 2Descalvado - SP 116 Falcão- de-coleira Falco femoralis 2Descalvado - SP 117 Falcão- de-coleira Falco femoralis 2Descalvado - SP 118 Gavião Carijó Rupornis magnirostris 3Jaboticabal - SP; 119 Gavião Carijó Rupornis magnirostris 2Descalvado - SP 120 Gavião Carijó Rupornis magnirostris 3Jaboticabal - SP; 121 Gavião Carijó Rupornis magnirostris 2Descalvado - SP 1. AMC. Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP (23º10’11”S; 46º56’33”O); 2. Descalvado – SP (21º54’60”S; 47º37’14”O); 3. Jaboticabal-SP (21º13’83”S; 48º17’06”O). 36 Figura 10. Resultados da qPCR realizada para Ehrlichia chaffeensis (gene alvo vlpt) (linha azul). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação. A B 37 Figura 11. Resultados da qPCR realizada para A. phagocytophilum (gene alvo msp-2) (linha violeta). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação. A B 38 Figura 12. Resultados da qPCR realizada para Bartonella spp. (gene alvo nuoG) (linha vermelha). Em A, apenas os padrões são evidenciados no quadro, enquanto todas as amostras testadas mostraram-se negativas. Em B, a curva-padrão evidencia a eficiência da reação. A B 39 5.5. Reação em Cadeia da Polimerase Convencional (cPCR) Todas as amostras testadas mostraram amplificação do fragmento referente ao gene alvo GAPDH, atestando que as mesmas estavam livres de inibidores na cPCR. Na PCR convencional realizada para o gene 16SrRNA para E. chaffeensis, cinco aves (4,13%) mostraram-se PCR positivas, com confirmação pelo sequenciamento do produto da nested PCR. As aves PCR positivas foram representadas por dois exemplares de Speotyto cunicularia (coruja buraqueira), provenientes do Ambulatório de Animais Selvagens da FCAV – UNESP – Jaboticabal (AASHVGLN) e da Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP (AMC), um espécime de Megascops choliba (Coruja-do- mato-pequena), também proveniente do AASHVGLN da FCAV – UNESP – Jaboticabal, uma ave da espécie Rupornis magnirostris (gavião carijó) e um espécime de Tyto alba (Suindara), ambos proveniente da AMC – Jundiaí – SP (Quadro 4, Figura 13). Figura 13. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 410 pb, na PCR para E. chaffeensis (gene 16SrRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Technologies®); Canaleta 1: controle positivo (410 pb); Canaleta 29: branco; Canaletas 2, 3, 11, 18 e 23: amostras PCR positivas. Já na PCR convencional realizada para E. canis (gene 16SrRNA), três aves mostraram-se positivas (2,47%): dois indivíduos da espécie Rupornis magnirostris (gavião carijó), provenientes do AASHVGLN da FCAV – UNESP- Jaboticabal e do município de Descalvado – SP, e um espécime de Asio clamator (Coruja Orelhuda), proveniente do Ambulatório Veterinário da AMC - Jundiaí, SP (Figura 14). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 410pb 40 M 1 2 3 4 5 6 7 Figura 14. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 358 pb, na PCR para E. canis (gene 16SrRNA). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Techonologies®); Canaleta 1: controle positivo (358 pb); Canaleta 7: branco; Canaletas 4 e 5: amostras PCR positivas. Amostras PCR positivas para o gene alvo 16SrRNA de E. chaffeensis e E. canis, foram também submetidas à PCRs convencionais para os genes omp-1, dsb e groESL, porém todas as amostras mostraram-se negativas. Algumas aves também mostraram-se PCR positivas para hemosporídeos: três indivíduos da espécie Megascops choliba (coruja-do-mato-pequena), provenientes da AMC – Jundiaí – SP e PCR positivas para Haemoproteus spp. (2,48%), e um exemplar de Ictinia plumbea (gavião-pomba), proveniente do AASHVGLN da FCAV – UNESP – Jaboticabal – SP, e PCR positiva para Plasmodium spp. (0,83%). Uma vez que a PCR convencional não permite a diferenciação dos agentes, a identificação do gênero do parasita foi realizada por meio do sequenciamento dos amplímeros (Quadro 5). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Figura 15. Fotografia de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com Brometo de Etídio, evidenciando bandas na altura de 480 pb, na PCR para Plasmodium ssp. e Haemoproteus spp. (gene citocromo B). Canaleta M: marcador de tamanho molecular em escala de 100 pares de bases (Life Techonologies®); Canaleta 2: controle positivo; Canaleta 16: branco; Canaletas 2, 3, 9 e 14: amostras PCR positivas. 480pb 358pb 41 No que se refere à PCR convencional baseada no gene 16SrRNA para A. phagocytophilum, A. platys, E. ewingii, Neorickettsia risticii e N. helminthoeca todas as amostras mostraram-se negativas. Em relação aos carrapatos, nenhuma amostra mostrou-se positiva, apesar da ave da qual os mesmos foram colhidos (Ave 119) apresentar-se positiva na qPCR para Anaplasma spp. (groESL) (Quadro 4). Foi observada a co-positividade de Ehrlichia spp. (detectada na cPCR) e Anaplasma spp. (detectado na qPCR) nas amostras de número 78 (Coruja buraqueira), 83 (Suindara), 87 (Coruja Orelhuda) e 121 (Gavião-carijó). Em relação à amostra de número 89, foi observada co-positividade para Ehrlichia spp. na RIFI e Haemoproteus spp. na cPCR, porém não foi observada co-positividade entre agentes Anaplasmataceae na RIFI e na PCR (qPCR e cPCR) (Quadro 4). 42 Quadro 4. Resumo dos resultados positivos, indicando a espécie da ave, local de colheita da amostra e a positividade negatividade para os vários testes realizados. Nº da Amostra Espécie (nome comum) Local de colheita PCR E. chaffeensis PCR E. canis RT – PCR Anaplasma (groESL) RIFI E. chaffeensis RIFI A. phagocytophilum PCR Plasmodium Haemoproteus 10 Gavião pomba 1. FCAV - - - - - + 21 Gavião Carijó 2. Jaboticabal - - - - + - 24 Coruja orelhuda 1. FCAV - - - + - - 32 Urubu 5. Santa Ernestina - - - - + - 35 Urubu 5. Santa Ernestina - - - + - - 54 Urubu 5. Santa Ernestina - - - - + - 59 Urubu 5. Santa Ernestina - - - - + - 62 Coruja Buraqueira 1. FCAV + - - - - - 63 Coruja-do-mato 1. FCAV + - - - - - 68 Gavião Carijó 1. FCAV - + - - - - 69 Gavião Carijó 4.Descalvado - - - - + - 71 Gavião Carijó 3.AMC + - - - - - 75 Coruja-do-mato 3.AMC - - + - - - 78 Coruja Buraqueira 3.AMC + - + - - - 83 Suindara 3.AMC + - + - - - 87 Coruja orelhuda 3.AMC - + + - - - 89 Coruja-do-mato 3.AMC - - - + - + 90 Coruja-do-mato 3.AMC - - - - - + 92 Coruja-do-mato 3.AMC - - - - - + 113 Coruja Buraqueira 4.Descalvado - - + - - - 115 Gavião carrapateiro 4.Descalvado - - + - - - 116 Falcão Coleira 4.Descalvado - - + - - - 117 Falcão Coleira 4.Descalvado - - + - - - 118 Gavião Carijó 2. Jaboticabal - - + - - - 119 Gavião Carijó 4.Descalvado - - + - - - 120 Gavião Carijó 2. Jaboticabal - - + - - - 121 Gavião Carijó 4.Descalvado - + + - - - 1. FCAV. Ambulatório de Animais Selvagens do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel (AASHVGLN) , Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal – SP (21º14’95” S; 48º17’69” O); 2. Jaboticabal-SP (21º13’83”S; 48º17’06”O); 3. AMC. Associação Mata Ciliar – Jundiaí – SP (23º10’11”S; 46º56’33”O); 4. Descalvado – SP (21º54’60”S; 47º37’14”O); 5. Santa Ernestina – SP (21º27’94”S; 48º23’81”O). 43 5.6. Análise das sequências Produtos da PCR para E. chaffeensis purificados e enviados para sequenciamento foram analisadas no Blast e as sequencias obtidas apresentaram até 100% de identidade com E. chaffeensis str. West Paces, USA (número de acesso no GenBank CP007480.1). Da mesma forma, as sequências obtidas das amostras positivas purificadas da cPCR para Haemoproteus spp e Plasmodium spp (gene citocromo B), revelaram até 98% de identidade com Haemoproteus spp. detectados em pinguins de Magalhães em reabilitação no Brasil (número de acesso no GenBank KJ575554.1) e 97% com Plasmodium spp. detectado em cegonhas na América (número de acesso no GenBank JX546139.1) Além disso, verificou-se também que os produtos da cPCR para E. canis (gene 16SrRNA) apresentaram até 99% de identidade com E. canis detectada em carrapatos no Brasil (número de acesso no GenBank KF972450.1) (Quadro 5). Quadro 5. Identidade pelo Blast dos amplímeros sequenciados. Nº da amostra Agente identificado Gene alvo Tamanho do Fragmento Identidade pelo Blast Descrição Máx. % Identidade Nº de acesso 10 Plasmodium spp. Citocromo B 480 pb Plasmodium sp CMV-2012 hap. H5 97% JX546139.1 62 Ehrlichia spp. 16SrRNA 410 pb E. chaffeensis str West Paces 98% CP007480.1 63 Ehrlichia spp. 16SrRNA 410 pb E. chaffeensis str West Paces 99% CP007480.1 68 Ehrlichia spp. 16SrRNA 358 pb E. canis clone Bctick-5 99% KF972450.1 71 Ehrlichia spp. 16SrRNA 410 pb E. chaffeensis str West Paces 99% CP007480.1 78 Ehrlichia spp. 16SrRNA 410 pb E. chaffeensis str West Paces 100% CP007480.1 83 Ehrlichia spp. 16SrRNA 410 pb E. chaffeensis str West Paces 99% CP007480.1 87 Ehrlichia spp. 16SrRNA 358 pb E. canis clone Bctick-5 99% KF972450.1 89 Haemoproteus spp. Citocromo B 480 pb Haemoproteus sp. Haplotype 41 97% AF465589.1 90 Haemoproteus spp. Citocromo B 480 pb Haemoproteus sp. SPMAG-5868 98% KJ575554.1 92 Haemoproteus spp. Citocromo B 480 pb Haemoproteus sp. Haplotype 41 96% AF465589.1 121 Ehrlichia spp. 16SrRNA 358 pb Ehrlichia ewingii isolate Aa2FT269 81% KJ942205 44 5.7. Árvores Filogenéticas A análise filogenética realizada para as sequências do gene 16SrRNA de Ehrlichia spp. encontradas nas aves carnívoras do presente estudo posicionou quatro das sequências no mesmo ramo das sequências de Ehrlichia chaffeensis encontradas em um cervo-do-Pantanal (Blastocerus dichotomus - DQ345720) e em um veado-catingueiro (Mazama gouazoubira - JF952894) no Brasil, de uma sequência de Ehrlichia chaffeensis obtida através de um isolado humano (M73222) dos Estados Unidos e também de uma sequência de Ehrlichia spp. (JN217093) encontrada em uma ave carnívora do Brasil. Porém, três sequências obtidas das amostras de sangue das aves 62, 68 e 121, posicionaram-se em um ramo totalmente distinto das outras sequências de Ehrlichia depositadas no genbank, com base na análise filogenética de máxima verossimilhança (Figura 16) estimando a proporção de sítios invariáveis pelo modelo GTRGAMMA+I. Em relação à análise filogenética do DNA de Haemoproteus spp., baseada no gene mitocondrial citocromo b, as sequências de Haemoproteus spp. encontradas nas aves sob estudo, posicionaram-se no mesmo grande ramo que as sequências de Haemoproteus pallidus (DQ630004.1), Haemoproteus parabelopolskyi (KM361478.1), Haemoproteus belopolskyi (DQ630006.1), Haemoproteus lanii (DQ630012.1), Haemoproteus micronuclearis (HQ386236.1), Haemoproteus homobelopolskyi (HQ386241.1), Haemoproteus nucleofascialis (HQ386243.1), Haemoproteus majoris (AF254977.1), Haemoproteus paranucleophilus (HQ386242.1) e Haemoproteus balmorali (DQ630014.1) previamente depositadas no Genbank, porém formaram um ramo distinto d