1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Campus do Litoral Paulista INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Leishmania (Leishmania) infantum EM HAMSTERS: ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS NO CÓLON Thaís Martins Chucri São Vicente -SP 2022 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Campus do Litoral Paulista UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CÂMPUS DO LITORAL PAULISTA INFECÇÃO EXPERIMENTAL POR Leishmania (Leishmania) infantum EM HAMSTERS: ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS NO CÓLON Candidata: Thaís Martins Chucri Orientadora: Prof.ª Dra. Renata de Britto Mari. Co-orientador: Prof.º Dr. Luiz Felipe Domingues Passero. São Vicente -SP 2022 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus do Litoral Paulista, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade de Ambientes Costeiros. 3 4 Agradecimentos À minha orientadora Renata de Britto Mari, agradeço pelo acolhimento, pela excelente condução do trabalho, pela paciência e pela confiança depositada. Ao meu co-orientador Luiz Felipe Domingues Passero, pelas orientações e ajuda no transcorrer do trabalho. Aos colegas do laboratório LABMA, em especial à Gabriela P. Marinsek, Ítalo N, Cavallone, Sarah K. Santos de Lima, Karine S. Oliveira, Alexandre R. Gonçalves e Nathalia Sales, vocês me ajudaram demais. À minha família pela compreensão nas horas de ausência. Aos meus pais, Antônio Jorge e Vera Lúcia pelo amor e incentivo. Vocês são meu alicerce. À minha irmã Christiane e à amiga Thaís Trombin pelo companheirismo e por me engajarem sempre. Ao programa de Pós-graduação em Biodiversidades dos Ambientes Costeiros e a todos colegas, técnicos e funcionários do Instituto de Biociências - Câmpus do Litoral Paulista, pela oportunidade e execução da tese. À professora Márcia Dalastra Laurenti e ao Laboratório de Patologia de Moléstias infecciosas (LIM 50) pela colaboração na execução de parte do trabalho. Aos queridos coordenadores Luiz Roberto Biondi e Juliana Plácido Guimarães pelo apoio dispensado. Através deles agradeço as duas Instituições que leciono, UNIMES e Centro Universitário São Judas Tadeu – Campus Unimonte. Aos meus alunos, fonte de motivação para continuar melhorando sempre. Finalmente, eu agradeço à Deus por colocar no meu caminho seres tão especiais que me permitiram chegar até aqui, dar-me resiliência, manter a esperança para concluir meu doutorado. 5 Dedico este trabalho ao meu filho Arthur, você é a conquista mais importante da minha vida. 6 O presente trabalho será apresentado em forma de artigo a ser submetido à revista Gastroenterology Research, cujas normas estão em anexo. 7 Infecção Experimental por Leishmania (Leishmania) infantum em Hamsters: Alterações Morfofuncionais do Cólon. Thaís Martins Chucri¹; Sarah Kymberly Santos Lima¹; Ítalo Novaes Cavallone¹; Karine Soares de Oliveira¹; Jéssica Adriana de Jesus²; Márcia Dalastra Laurenti²; Luiz Felipe Domingues Passero¹; Renata de Brito Mari¹ ¹Laboratório de Morfofisiologia Animal, Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências – Campus do Litoral Paulista (UNESP – IB/CLP), Praça Infante Dom Henrique, s/n – Parque Bitaru, São Vicente, São Paulo, Brasil. ²Laboratório de Moléstias Infecciosas (LIM 50), Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), Av. Doutor Arnaldo, 455 – Cerqueira César, São Paulo, São Paulo, Brasil. Correspondência Nome: Thaís Martins Chucri Endereço: Delfim Moreira 20 Email: thais.chucri@saojudas.br Telefone: +55 (13)981251070 Fax: 8 Resumo Background e Objetivo: A degradação ambiental e as mudanças climáticas são alguns dos fatores que contribuem para uma maior ocorrência de doenças. Dentre elas, a leishmaniose visceral (LV), uma importante zoonose com letalidade de aproximadamente 95%. É uma infecção sistêmica crônica e quando o parasito atinge o trato gastrointestinal pode provocar alterações morfofisiológicas significativas. No entanto, pouco se sabe sobre o impacto causado por Leishmania no sistema nervoso entérico (SNE). Os neurônios desse plexo desempenham importante papel em manter o peristaltismo e auxiliar na resposta imune do órgão. Diante do exposto e dada a importância do SNE para manter a homeostase do organismo, o objetivo desse estudo foi investigar o comprometimento morfofisiológico das subpopulações de neurônios NADH-dp e NADPH-dp e histopatológico do intestino grosso de hamsters infectados experimentalmente. Métodos: Os animais foram infectados com formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum e aos 30, 60 e 90 dias pós infecção foram conduzidos para a eutanásia. Posteriormente as regiões do cólon ascendente e descendente foram coletadas e destinadas para a análise de unidades Leishman-Donovan, técnicas de evidenciação e morfometria neuronal, além das análises histopatológicas através de cortes histológicos por hematoxilina-eosina (HE), ácido periódico de Schiff (PAS+) e Alcian Blue (AB+) pH 2,5. Resultados: Foram observadas a presença de amastigotas no intestino dos animais, bem como alterações na densidade e morfometria de ambas as subpopulações neuronais, 9 causando alterações na plasticidade neuronal. Na análise histopatológica, foram evidenciadas alterações na estratigrafia e nas células da mucosa, no entanto, nenhum sinal clínico da doença foi registrado. Conclusões: A infecção por Leishmania (L.) infantum causa alterações morfofisiológicas no intestino grosso de hamsters infectados, além de alterações no plexo mioentérico que podem ocorrer de forma direta, por ação do patógeno ou indiretamente por mecanismos imunes envolvidos na defesa contra o parasito. Palavras-chave: Leishmaniose visceral; Sistema Nervoso Entérico; Intestino Grosso; Histopatologia. INTRODUÇÃO A Leishmaniose é uma doença parasitária de carácter zoonótico causada pelo protozoário do gênero Leishmania, na qual os cães são considerados como o principal reservatório do ciclo doméstico [1]. É considerada uma das doenças causadas por protozoários mais preocupantes do mundo [2], sendo um grave problema de saúde pública, onde as condições precárias de higiene, a falta de saneamento básico e a degradação ambiental, são fatores que contribuem com a sua crescente transmissão e propagação [3;4;5]. A forma visceral da leishmaniose, possui como agente etiológico a Leishmania (Leishmania) infantum, sendo considerada uma das mais graves, especialmente para pacientes com comorbidades imunossupressoras, como por exemplo, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) [6;7]. No mundo, estima-se que ocorram mais de 50.000 novos casos por ano e, o Brasil, está entre os 10 países que mais notifica, sendo o responsável por 97% dos casos que 10 ocorrem nas Américas. Quando não tratada, a doença pode ser fatal em 95% dos casos [2;8]. As principais manifestações clínicas e histopatológicas na leishmaniose visceral (LV) ocorrem principalmente no fígado, baço, linfonodo e medula óssea [9;10;11]. No entanto, pode afetar também outros órgãos, como o sistema nervoso, genito-urinário e o trato gastrointestinal, sendo este último o mais comprometido [12;13;14]. Alterações histológicas no intestino de animais e humanos com LV são amplamente discutidas [15;16;17;18;19;20]. A carga parasitária presente no órgão em questão pode levar a presença de infiltrados inflamatórios, hiperplasia celular, alterações na camada mucosa e submucosa, lesão no epitélio, perda de criptas ou fibrose na lâmina própria [21]. O trato gastrointestinal (TGI) é composto por diversos órgãos, que compreende o estômago, intestino delgado e o intestino grosso. Estes possuem características distintas permitindo que o corpo mantenha seu metabolismo. A região do intestino grosso, mais especificamente o cólon, é responsável pela absorção de água e eletrólitos, formação e transporte de fezes e, digestão química realizada pela microbiota intestinal [22]. Quando associado ao sistema linfático, o TGI constitui o maior e mais complexo órgão, onde estão presentes aproximadamente 50% dos linfócitos de todo o corpo [23]. A barreira gastrointestinal, possui diversos mecanismos de defesa, sendo eles, a presença de bactérias comensais, a morfologia das túnicas intestinais, a camada de muco, o sistema imunológico da mucosa e o sistema nervoso entérico (SNE) [24;25;26]. O sistema imune do intestino, possui a maior concentração de células do corpo, especialmente de macrófagos, que possuem um papel importante na resposta imune inata e na homeostase do órgão [27]. Dado o constante contato com 11 diversos microrganismos comensais, patogênicos ou mesmo moléculas derivadas da ingestão de alimentos, o intestino possui uma intrincada interação antigênica. Assim sendo, as respostas imunológicas no órgão devem ser reguladas para que por um lado não sejam exacerbadas e prejudiciais ao organismo frente aos antígenos, e por outro, efetivas contra patógenos quando houver necessidade. Além disso, no intestino encontra-se o GALT (tecido linfoide associado ao intestino), que contribui com a proteção do organismo gerando respostas imunológicas contra patógenos e, no intestino grosso é representado por folículos isolados [28;29]. Componente importante para a defesa do organismo é a barreira física epitelial do intestino. Dentre as células que compões essa barreira, estão as células produtoras de muco, como as caliciformes que são produtoras de mucinas que formam uma camada protetora no epitélio intestinal e, os linfócitos intraepiteliais (IELs) que possuem a função proteger a barreira mucosa, participar de respostas inflamatórias e contribuir no reparo de lesões, além, de regular e manter a homeostase intestinal [30;31]. Ao longo de todo o TGI, encontra-se o SNE. Um sistema composto por uma rede de milhares de neurônios entéricos, dispostos em pequenos gânglios que são ligados por fibras nervosas e, embora receba uma ampla contribuição do sistema nervoso central através da inervação simpática e parassimpática, o SNE atua de forma independente [26; 32]. Esse sistema consiste em dois plexos ganglionares principais, o plexo submucoso e o plexo mioentérico, sendo esse último localizado entre a túnica muscular longitudinal externa e a circular interna. Os neurônios do SNE são responsáveis por controlar a motilidade, o transporte de fluidos na mucosa e o fluxo sanguíneo local [26;33]. 12 O SNE está suscetível a sofrer diversas alterações ao longo do tempo, podendo ocasionar distúrbios na motilidade e homeostase do intestino [34]. Além disso, alguns estudos já relataram que infecções ocasionadas por protozoários, como o da espécie Toxoplasma gondii, podem acarretar diversas alterações na plasticidade dos neurônios do plexo mioentérico, como mudanças na densidade e morfometria neuronal [35;36;37]. Já com protozoários da espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, foi relatada a hipertrofia dos neurônios mioentéricos imunorreativos HuC / HuD no íleo de hamsters, justificada pelo aumento da atividade metabólica dos mesmos, como um mecanismo de adaptação do órgão diante da infecção parasitária [38]. No entanto, pouco se sabe das alterações no sistema nervoso entérico relacionado ao protozoário da LV. A interação do SNE com o sistema imune, forma uma grande defesa do intestino, atuando em conjunto quando ocorrem infecções, para regular a homeostase e a fisiologia intestinal [39;40]. A interação entre esses sistemas é bidirecional, onde as células do sistema imune são afetadas pelos neurotransmissores, e os neurônios, são afetados pelas citocinas que são liberadas pelas células imunológicas [41;42]. Outra particularidade dos neurônios entéricos é a plasticidade fenotípica, que pode ser alterada em resposta aos patógenos e serve como um mecanismo de resposta adaptativa ao dano produzido no organismo [26]. Ou seja, de acordo com diferentes estímulos pode ocorrer a mudança do seu código químico e liberação de outro neurotransmissor [30]. Fato este de grande relevância para compreensão das doenças intestinais, podendo ser definitivo para determinação de manifestações clínicas e para o desenvolvimento de processos inflamatórios intestinais [39]. 13 Portanto, considerando o que foi supracitado, mediante a complexidade e importância do SNE para o controle e funcionamento de todo TGI e a importância imunológica e fisiológica do cólon, faz-se necessário estudar as alterações neurológicas que ocorrem em neurônios mioentéricos do cólon ascendente e descendente de hamsters infectados experimentalmente por L. (L.) infantum durante os períodos de 30, 60 e 90 dias pós infecção. METODOLOGIA Foram utilizados 30 hamsters dourados (Mesocricetus auratus), por serem modelos animais que mimetizam as infecções naturais que ocorrem em humanos, cães, gatos e raposas [43]. Os animais utilizados tinham oito semanas de vida e 300 gramas de peso corporal e, durante o experimento foram tratados com ração peletizada industrial, água filtrada “ad libitum” e com ciclo de luz de 12h. Foram montados seis grupos, com cinco animais cada. Três grupos foram considerados controles (GC) e os outros três grupos experimentais (GE). Os animais GE foram infectados com 2x107 promastigotas de L. (L.) infantum (MHOM/BR/72/46) por via intraperitoneal. Já os animais GC foram inoculados pela mesma via apenas com solução fisiológica (100μL/animal). Aos 30, 60 e 90 dias pós infecção (DPI), os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO². Todo o procedimento experimental foi aprovado pelo CEUA nº 05/2017. Os parasitos utilizados nos experimentos estavam em fase estacionária de crescimento, além disso, a cepa utilizada no estudo foi cedida pelo Prof. Dr. Fernando Tobias Silveira, do Laboratório de Leishmaniose Prof. Dr. Ralph Laison, Departamento de Parasitologia, Instituto Evandro Chagas (Pará Estado, Brasil). Em cada período experimental o baço, o fígado e o cólon ascendente e descendente foram coletados e destinados para as posteriores análises. 14 Análise de carga parasitária Baço, fígado e cólon (ascendente e descendente) foram coletados, pesados e aposicionados contra lâminas, as quais foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa. Posteriormente, as lâminas foram analisadas sob microscópio optico para contabilizar as formas amastigotas de L. (L.) infatum. A análise foi realizada a partir do método de LDU (Leishman-Donovan units) [44]. Os resultados foram expressos pela razão do número de amastigotas encontradas em ao menos 1000 células nucleadas e normalizadas de acordo com o peso do respectivo órgão. LDU = número de amastigotas x 1000 células nucleadas peso do órgão Evidenciação Neuronal Detecção dos neurônios mioentéricos metabolicamente ativos (NADH-diaforase positivos) (GABELLA, 1969). Os segmentos intestinais do cólon ascendente e descendente foram lavados e preenchidos com solução de Krebs (pH 7,3). Posteriormente os segmentos passaram por duas lavagens de dez minutos cada em solução de Krebs, e foram incubados em solução de Krebs contendo Triton X-100 a 0,3% durante cinco minutos. Mais duas lavagens de dez minutos em cada solução de Krebs foram realizadas, para posterior incubação em meio de reação para evidenciar os neurônios mioentéricos NADH-dp constituído por 25mL de solução estoque de Nitro Blue Tetrazolium (NBT, solução estoque com concentração de 0,5 mg/mL), 25 mL de tampão fosfato de sódio (0,1 M; pH 7,3), 0,05 g de β-NADH em 50mL de água destilada. O tempo de incubação foi padronizado em 1 hora. Ao final, os segmentos 15 foram fixados em solução de formolaldeído a 10% em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,3). Detecção dos neurônios mioentéricos nitrégicos (NADPH-diaforase positivos) (SCHERER-SINGLER et al., 1983). Os segmentos intestinais do cólon ascendente e descendente foram lavados e preenchidos com PBS (pH 7,4). A seguir, os segmentos foram submetidos a duas lavagens em solução de PBS (10 minutos cada) seguidas de permeabilização em PBS contendo Triton X-100 a 0,3% diluídos em tampão fosfato de sódio (pH 7,3) por 10 minutos. Posteriormente, mais duas lavagens em PBS durante 10 minutos cada foram realizadas. Para evidenciar os neurônios mioentéricos NADPH-dr positivos (NADPH-dp), após as lavagens, os segmentos foram incubados em meio de reação constituído por 50 mg de NBT, 100 mg de β-NADPH e 0,3% de Triton X-100 em tampão Tris-HCl (0,1M pH 7,6) por 2 horas. Posteriormente as extremidades foram liberadas e os intestinos imersos em solução de paraformaldeído a 4% para a fixação e armazenagem. Obtenção dos preparados de membrana Após período de fixação, cada intestino foi seccionado ao longo do eixo longitudinal na margem mesentérica e microdissecado sob estereomicroscópio, para retirada das túnicas mucosa e submucosa e preservação das túnicas muscular e serosa. Os preparados de membrana obtidos foram montados entre lâmina e lamínula de vidro com resina sintética Permount®. Densidade Neuronal Por meio dos preparados de membrana obtidos foi possível observar os perfis ganglionares. A densidade neuronal foi avaliada em 60 gânglios [19] com o auxílio 16 de microscópio de luz (aumento de 100X) sendo as imagens capturadas pela câmera digital Motic Image® e transferidas para o computador. Todos os neurônios presentes no perfil ganglionar fotografado foram quantificados. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. Área do perfil do corpo celular dos neurônios mioentéricos (µm²) A mensuração da área do perfil do corpo celular dos neurônios mioentéricos, foi realizada com o auxílio do programa de análise de imagem computadorizado Image-Pro-Plus 3.0.1. Para tanto, as imagens dos neurônios capturadas para a análise de densidade neuronal foram utilizadas para a análise morfométrica. Foram mensurados o perfil celular (PC) dos 100 primeiros neurônios observados por animal. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. Análise histopatológica e morfométrica do intestino grosso Fragmentos com aproximadamente três centímetros do cólon ascendente (porção proximal) e descendente (porção proximal) dos animais foram coletados e fixados em formol a 10%. Após a fixação por 48 horas, os segmentos foram lavados em álcool etílico a 70%, desidratados em série crescente de álcoois até o absoluto e diafanizados em xilol. Posteriormente, passaram para etapa de inclusão em parafina. Os materiais foram submetidos a três cortes transversais semi-seriados com 5µm, com espaçamento de 300µm entre cada corte, no qual cada corte foi dividido em quatro campos amostrais, totalizando 12 quadrantes por animal (Figura 1). 17 Figura 1. Esquema da divisão em quadrantes para amostragem dos campos microscópicos do intestino de Mesocricetus auratus Os cortes foram corados com a técnica de Hematoxilina e Eosina (HE) para avaliação geral da morfologia do cólon e para análises de morfometria das pregas instestinais, espessura da túnica muscular e parede total, todas as medidas em micrômetro (µm). Para contagem de linfócitos intra-epiteliais (IELs) e das células mucosecretoras (PAS+), os cortes foram corados pela técnica Periodic Acid-Schiff (PAS) e para contagem de células mucosecretoras (AB+), os cortes foram corados por Alcian Blue (AB) pH 2,5 e contra corados com Hematoxilina. Foram analisadas a densidade de células caliciformes e IELs, relacionando à quantidade de enterócitos em campos escolhidos aleatoriamente. Todos os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. Análise estatística Os dados obtidos pelas análises de densidade e morfometria neuronal foram inicialmente submetidos ao teste de Shapiro-Wilk para a verificação da normalidade e teste de Levene para avaliar a homoscedasticidade. Foram testadas diferenças estatísticas entre os grupos controle e experimental para cada período de exposição (30, 60 e 90 dias). Para tanto, utilizou-se o teste t-student, seguido pelo teste de Tukey, quando seguidas as premissas para o uso de testes paramétricos. Quando violadas essas premissas, o teste de Mann-Whitney foi empregado seguido pelo pós-teste de Dunn’s. 18 Os resultados obtidos foram analisados no GraphPad Prism 9.0 e o nível de significância adotado para os resultados obtidos foi de 5% (p < 0,05). RESULTADOS A análise LDU, indicou aumento da carga parasitária durante todos os períodos experimentais, progressivamente, em todos os órgãos analisados (Supl. 1). No cólon ascendente e descendente, formas amastigotas foram detectadas em todos os períodos analisados, entretanto, apenas no cólon ascendente observou-se aumento progressivo do parasitismo de maneira significativa (p<0,05) (Figura 2). Figura 2. Unidades de Leishman-Donovan (LDU) expressas em média, do baço, fígado, cólon ascendente e descendente dos hamsters em 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) por L. (L.) infantum. Os resultados referentes a densidade dos neurônios NADH-dp e NADPH-dp, encontram-se suplementados em anexo (Supl. 2). No cólon ascendente (Figura 3a), a densidade dos neurônios NADH-dp, reduziu significativamente (p<0,05) durante todos os períodos estudados. Já no cólon descendente (Figura 3b), apenas no período de 60 DPI houve aumento significativo (p<0,05) de 23%. 19 Figura 3 - Densidade dos neurônios metabolicamente ativos (NADH-dp), cólon ascendente (A) e descendente (B) do plexo mioentérico dos hamsters após 30, 60 e 90 dias de infecção (DPI) por L. (L.) infantum. Fotomicrografias (barra=100µm) evidenciando os gânglios com setas pretas. *Letras diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. A análise de densidade dos neurônios NADPH-dp, no cólon ascendente (Figura 4a), apenas no período de 60 DPI foi observado aumento significativo (p<0,05) de 69% quando comparado com seu respectivo controle. No entanto, no cólon descendente (Figura 4b), no período de 90 DPI a redução na densidade foi de 26%. Assim como ocorreu com a outra subpopulação neuronal, a análise do perfil 20 quantitativo dos neurônios NADPH-dp também apresentou alterações na plasticidade em ambos os segmentos intestinais quando comparados com seus respectivos controles. Figura 4 - Densidade dos neurônios nitrérgicos (NADPH-dp), cólon ascendente (A) e descendente (B) do plexo mioentérico dos hamsters após 30, 60 e 90 dias de infecção (DPI) por L. (L.) infantum. Fotomicrografias (barra=100 µm) evidenciando os gânglios com setas pretas. *Letras diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. Os resultados da morfometria do perfil celular dos neurônios NADH-dp e NADPH-dp encontram-se suplementados em anexo (Supl. 3). A análise do perfil celular dos neurônios da subpopulação NADH-dp do cólon ascendente (Imagem 5a), 21 apresentou diferença significativa (p<0,05) em sua morfometria nos períodos 30 DPI e 90 DPI, com redução de 9% e aumento de 20%, respectivamente. No cólon descendente (Imagem 5b), apenas no período de 60 DPI houve redução de 52% quando comparado com seu respectivo controle. Na análise dos neurônios NADPH-dp, no cólon ascendente (Imagem 5c), houve redução significativa (p<0,05) nos períodos de 30 DPI e 90 DPI, de 20% em ambos os períodos. No cólon descendente (Imagem 5d) apenas no período de 90 DPI houve aumento significativo (p<0,05) de 26%. Figura 5 – Morfometria (µm²) do perfil celular expressa em média ± desvio padrão dos neurônios metabolicamente ativos (NADH-dp), cólon ascendente (A) e descendente (B) e, dos neurônios nitrérgicos (NADPH-dp), cólon ascendente (C) e descendente (D), do plexo mioentérico dos hamsters com 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) por L. (L.) infantum. *Letras diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. 22 Os resultados morfoquantitativos mostram alterações nos neurônios do plexo mioentérico em ambos os segmentos intestinais. Embora as alterações tenham ocorrido de maneiras diferentes em cada parte do cólon, é possível verificar que a infecção parasitária afetou significativamente (p<0,05) a plasticidade dos neurônios NADH-dp e NADPH-dp durante todos os períodos experimentais estudados. Em uma análise macroscópica do intestino, não foi observada nenhuma ulceração em ambos os segmentos. Os resultados da estratigrafia intestinal encontram-se em anexo (Supl. 4). A estratigrafia intestinal do cólon ascendente (Figura 6a), indicou hipertrofia (p<0,05) na espessura das pregas da mucosa nos períodos de 30 DPI e 60 DPI, de 43% e 29%, respectivamente. A túnica muscular apresentou hipertrofia de 41% e 18% nos períodos de 30 DPI e 60 DPI, no entanto, no período de 90 DPI, houve atrofia da túnica de 4%. A parede total do órgão apresentou hipertrofia de 40% e 22% nos períodos de 30 DPI e 60 DPI, respectivamente, seguido de atrofia em 90 DPI de 4%, sendo essas alterações significativas (p<0,05) em todos os períodos estudados. No cólon descendente (Figura 6b), sua estratigrafia apresentou atrofia das pregas da mucosa de 22% em 60 DPI. No mesmo período, também foi observada a redução da parede total do órgão em 17%. 23 Figura 6. Estratigrafia intestinal (µm) das mensurações de altura da prega da mucosa, espessura da túnica muscular e parede total expressas em média ± desvio padrão do cólon ascendente (A) e descendente (B) nos grupos controle (GC) e experimental (GE), durante os períodos de 30, 60 e 90 DPI. Fotomicrografia do cólon ascendente (A) e descendente (B) em 100 µm, apresentando as pregas da mucosa (PR), a túnica muscular (TM) e a parede total do intestino (PT). *Letras diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. Os resultados da análise das células do cólon ascendente e descendente, encontram-se suplementados em anexo (Supl. 5). No cólon ascendente (Figura 7a), a densidade de células caliciformes PAS+ reduziu significativamente (p<0,05) nos períodos de 30 DPI e 90 DPI, em 15% e 13% respectivamente. Já, as células caliciformes AB+, apresentou redução 24 significativa (p<0,05) nos períodos de 60 DPI e 90 DPI, de 14% e 30%. No cólon descendente (Figura 7b), as células caliciformes PAS+ apresentaram redução na densidade nos períodos de 30 DPI e 60 DPI, de 52% e 25% respectivamente e, no período de 90 DPI, aumento na densidade em 64%, sendo significativo (p<0,05) em todos os períodos. As caliciformes AB+ desse segmento intestinal, no período de 30 DPI houve redução de 38% e aumento de 96% no período de 90 DPI. Figura 7. Porcentagem da razão entre a densidade de células caliciformes Alcian Blue (AB), Ácido Periódico de Schiff (PAS), linfócitos intraepiteliais (IELs) por densidade de enterócitos da mucosa do cólon ascendente (A) e descendente (B) nos grupos controle (GC) e experimental (GE), durante os períodos experimentais de 30, 60 e 90 DPI. *Letras diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. As análises da parede intestinal mostraram que ambos os segmentos intestinais estudados sofreram diversas alterações na estratigrafia do intestino assim, como, na densidade de células da mucosa ao longo da infecção parasitária. Entretanto, apenas no cólon ascendente observou-se alterações significativas (p<0,05) em toda a parede intestinal durante todos os períodos estudados. 25 DISCUSSÃO Os presentes resultados demonstram as alterações morfofisiológicas no cólon ascendente e descendente em hamsters, decorrente da infecção causada por L. (L.) infantum durante os três períodos experimentais. Tais alterações são provenientes da presença das formas amastigotas encontradas no cólon desses animais. Assim como no intestino grosso, observou-se também um crescente parasitismo no fígado e baço com a evolução da doença. A presença das formas amastigotas no intestino foi relatada em infecções naturais [16;20;45;46] e experimentais [18;19;38;47]. A doença possui como principais sinais clínicos febre prolongada, aumento do baço e fígado e perda de peso [48]. Em nosso estudo, as manifestações clínicas listadas acima não foram avaliadas, entretanto, as alterações histológicas clássicas da doença, como a hipertrofia e hiperplasia de macrófagos infectados em baço e fígado, diminuição de áreas de polpa branca em baço e a presença de nódulos macrofágicos em fígado denotam comprometimento sistêmico da doença. Adicionalmente, observou-se expansão de parasitos a órgão não clássico, como o intestino, demonstrando que a resposta imunológica dos animais não foi suficiente para conter os parasitos. Corroborando com nossos achados, em estudo semelhante realizado no jejuno de hamsters [19], foram observadas alterações semelhantes no intestino, oriundas do parasitismo no órgão. O parasitismo no intestino desencadeou alterações nas populações dos neurônios mioentéricos NADH-dp e NADPH-dp. No cólon ascendente a densidade dos neurônios metabolicamente ativos reduziu durante todo o período de infecção parasitária e apresentou atrofia no período de 30 DPI, sugerindo que a infecção afeta negativamente o funcionamento desses neurônios, resultando em baixa atividade metabólica, assim como também foi observado no jejuno de ratos 26 infectados com Toxoplasma gondii [49;50]. Já, no período de 90 DPI, a hipertrofia desses neurônios indica uma adaptação para atender todas as demandas do organismo frente à progressão do parasito [51;52;53]. O aumento na densidade juntamente com a atrofia dos neurônios NADH-dp observado no período de 60 DPI no cólon descendente, sugere adaptação do organismo frente à infecção parasitária. Infecções causadas por Leishmania (L) infantum mostraram resultados similares com os neurônios metabolicamente ativos do plexo mioentérico no jejuno de hamsters [21]. No cólon ascendente, o aumento na densidade de citocinas inflamatórias liberadas pelo sistema imunológico, com o objetivo de combater o parasito, leva ao aumento da densidade de neurônios nitrérgicos, acarretando na hipertrofia da túnica muscular. Isso porque, a subpopulação dos neurônios NADPH-dp produz óxido nítrico (NO) e, utilizam desse neurotransmissor criando uma barreira protetora, tornando-os menos vulneráveis a morte e mantendo o funcionamento do intestino [56;57;58]. A atrofia celular observada nos períodos de 30 DPI e 90 DPI pode estar relacionada ao processo de adaptação às necessidades do TGI [55]. Assim como no jejuno de hamsters com L. (L) infantum [19], a atrofia desses neurônios pode ter ocorrido em reposta à infecção parasitária, resultando em um aumento a produção de NO, já que este é uma molécula citotóxica que inibe as enzimas essenciais mitocondriais e nucleares. Entretanto, quantidades excessivas de NO são prejudiciais não só para o parasita, mas também para as células intestinais [59]. O comprometimento das enzimas citoplasmáticas neuronais pode estar correlacionado com a diminuição da área celular. No segmento do cólon descendente, há redução na densidade dos neurônios NADPH-dp no período de 90 DPI, que pode ser explicado como um reflexo da carga 27 parasitária no órgão e cronicidade da infecção, assim como já mencionado em estudos realizados com infecções de T. gondii e Trypanossoma cruzi, onde os autores indicam essa resposta como aumento das atividades do sistema imunológico [60;61;62;63]. Uma outra explicação pode se dar devido a uma compensação pelo aumento no metabolismo desses neurônios, já que no mesmo período, os neurônios apresentaram hipertrofia ou, até mesmo, uma resposta compensatória à imunidade, assim como observado nos neurônios nitrérgicos do intestino delgado de hamsters infectados por L. (L.) infantum [19]. No entanto, no intestino grosso, as perdas neuronais são mais acentuadas e, os neurônios viáveis, sofrem hipertrofia [27] atuando como um mecanismo de adaptação as condições adversas sofridas pelas células no organismo [37;54]. Há nos dois segmentos intestinais, uma resposta compensatória entre ambas as subpopulações neuronais, pois o processo inflamatório desencadeia um desequilíbrio na resposta imunológica da barreira intestinal [32], estando os resultados relacionados ao processo de adaptação neuronal às necessidades do TGI [55]. Alterações na plasticidade ocorrem como efeito da adaptação à novas condições de estresse, mantendo a homeostase do intestino [64]. Além das alterações nos neurônios do plexo mioentérico, também foram observadas alterações na dinâmica da estratigrafia intestinal em ambos os segmentos estudados. A musculatura do TGI é composta por uma grande rede de células que desempenham um importante papel na mediação da resposta imunológica. A hipertrofia da túnica muscular observada no presente estudo, pode estar relacionada com o aumento da resposta imunológica conduzindo a eventos pró-inflamatórios que foi induzido pela instalação do parasita no intestino [47;65;66]. Em um estudo de infecção induzida por T. gondii, foi observado o mesmo no jejuno 28 de ratos [49]. Por outro lado, assim como observado em estudo no duodeno de gatos infectados com toxoplasmose [67], a atrofia da túnica muscular pode indicar tolerância imune, resultado da cronificação da doença [68]. O aumento das pregas intestinais demonstra a adaptação do órgão para que haja maior superfície de contato com o lúmen intestinal. No entanto, a atrofia das pregas pode estar relacionada ao processo de turnover celular, que quando acelerado pode influenciar de forma negativa a diferenciação das células epiteliais, ocasionando disfunção do intestino [66]. Entretanto, as alterações observadas na morfometria da parede total, tanto do cólon ascendente quanto do cólon descendente, apresentaram-se como um reflexo das alterações da túnica muscular e das pregas intestinais do órgão. As avaliações histológicas, indicaram que durante todos os períodos de infecção, a camada mucosa adaptou-se morfologicamente para manter a homeostase intestinal [15], tendo uma participação efetiva, influenciando e interagindo com as demais camadas, células e substâncias do intestino grosso. A camada mucosa controla a passagem de substâncias através do epitélio interagindo com a microbiota e auxiliando na criação da barreira intestinal, tornando um mecanismo essencial que mantém o bom funcionamento dos tecidos [69]. Portanto, quaisquer modificações na superfície de contato da barreira intestinal ou em sua composição mediada por patógenos, podem induzir a um processo inflamatório, como, distúrbios intestinais [70]. O intestino, possui uma barreira mecânica e imunobiológica, constituída por células como os IELs e as células caliciformes. Estes linfócitos são células da imunidade inata que atuam na defesa do hospedeiro secretando citocinas para o recrutamento e sinalização celular [69]. No entanto, em nossos resultados não foi 29 observada nenhuma modificação na densidade de IELs durante toda a infecção parasitária. No presente estudo, houve redução das células caliciformes secretoras de mucinas neutras (PAS+) e ácidas (AB+) nos períodos de 30 DPI e 60 DPI, em ambos os segmentos intestinais. Em trabalhos similares, a infecção por T. gondii e L. (L.) infantum também foi observada a redução de células caliciformes, o que indica um processo de desenvolvimento de defesa do organismo frente a infecção [19; 67]. No entanto, no período de 90 DPI, foi observado aumento na densidade em ambas as populações celulares. Essas células são abundantes nas criptas do intestino grosso e formam ligações cruzadas entre si, que servem para originar o muco que protege e lubrifica o revestimento do intestino [72]. O aumento na densidade de células caliciformes no cólon indica uma reação de defesa do intestino em decorrência do estresse causado pela infecção, assim como observado em infecções causadas por T. gondii e Leishmania spp [66;67;73] corroborando com nossos resultados. Portanto, é possível afirmar que a infecção causada pelo protozoário Leishmania (L.) infantum, resulta em problemas além dos descritos anteriormente na literatura, como os sinais clínicos e as alterações histopatológicas, pois também acarreta em diversas alterações morfofisiológicas no intestino grosso dos animais infectados. Essas alterações são um reflexo da relação intrínseca relação entre o sistema imune e os neurônios do plexo mioentérico, que buscam manter a homeostase do intestino enquanto enfrentam o patógeno. Os resultados são consistentes com a literatura, indicando a importância do SNE diante da resposta em defesa ao hospedeiro. 30 REFERÊNCIAS 1. Bern C, Maguire JH, Alvar J. Complexities of assessing the disease burden attributable to leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis. 2008; 2(10): e313. 2. WHO (World Health Organization). Leishmaniasis: epidemiology and access to medicines. Geneva, Switzerland. 2018. 3. MS (Ministério da Saúde). Casos confirmados de Leishmaniose Visceral, Brasil, Grandes Regiões e Unidades Federadas 1990 a 2015. 2017. 4. Malafaia G. Leishmaniose visceral e desnutrição: uma relação ainda muito negligenciada. Ver Soc Bras Med Trop. 2010; 43(4): 478-479. 5. Almeida AS, Werneck GL, Resendes APC. Classificação orientada a objeto de imagens de sensoriamento remoto em estudos epidemiológicos sobre leishmaniose visceral em área urbana. Cad Saúde Púb. 2014; 30(8):1639- 1653. 6. WHO (World Health Organization). Leishmaniasis. 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Tabela 2 – Densidade dos neurônios metabolicamente ativos (NADH-dp) e dos neurônios nitrérgicos (NADPH-dp) expressos em média ± desvio padrão dos períodos de 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) nos animais dos grupos controle (GC) e experimental (GE). Densidade Neuronal 30 DPI 60 DPI 90 DPI GC GE GC GE GC GE C ó lo n a s c e n d e n te NADH- dp 22,7 ±1,55a 13,25 ±0,63b 19,72 ±1,99a 16,83 ±2,05b 19,67 ±3,71a 16,025 ±1,76b NADPH- dp 10,3 ±2,02 12,44 ±1,73 11,93 ±0,5a 14,67 ±0,69b 13,65 ±0,53 14,52 ±1,75 C ó lo n d e s c e n d e n te NADH- dp 23,75 ±0,78 18,9 ±4,69 13,1 ±4,015a 22,17 ±0,89b 16,4 ±1,13 17,325 ±4,09 NADPH- dp 11,18 ±1,19 11,76 ±1,95 10,66 ±1,71 9,8 ±1,12 13,38 ±3,48a 9,87 ±0,42b *Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. . 41 Tabela 3 – Morfometria neuronal (µm²) dos neurônios metabolicamente ativos (NADH- dp) e dos neurônios nitrérgicos (NADPH-dp) expressa em média ± desvio padrão nos períodos de 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) dos animais dos grupos controle (GC) e experimental (GE). Morfometria do perfil celular (µm²) 30 DPI 60 DPI 90 DPI GC GE GC GE GC GE C ó lo n a s c e n d e n te NADH- dp 150,91 ±7,25a 136,73 ±0,02b 183,88 ±59,01 137,30 ±11,81 117,61 ±16,52a 141,61 ±13,71b NADPH- dp 104,66 ±13,9a 83,29 ±3,68b 102,78 ±19,59 90,41 ±3,88 107,15 ±2,94a 85,19 ±9,09b C ó lo n d e s c e n d e n te NADH- dp 130,87 ±4,89 165,16 ±33,87 267,42 ±66,21a 128,87 ±37,13b 188,41 ±80,89 181,56 ±85,49 NADPH- dp 76,01 ±4,5 80,55 ±10,1 98,35 ±11,6 97,27 ±10,67 90,04 ±24,53a 113,9 ±2,48b *Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. Tabela 4 – Morfometria intestinal (µm) expressa em média ± desvio padrão nos períodos de 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) dos animais dos grupos controle (GC) e experimental (GE). Grupos Estratigrafia intestinal (µm) 30 DPI 60 DPI 90 DPI GC GE GC GE GC GE C ó lo n A s c e n d e n te Prega da Mucosa 176,6 253,8 179,4 232,5 251,2 232,1 ± 70,7a ± 50,7b ± 80,4a ± 55,5b ± 25,7 ± 59,7 Túnica Muscular 59,3 83,8 62,1 73,4 82,3 78,4 ± 23,9a ± 16,7b ± 23,2a ± 15,6b ± 10,7a ± 36,2b Parede Total 270,4 380,3 280 342,8 361,2 345,6 ± 111,5a ± 64,9b ± 115,4a ± 70,4b ± 44a ± 102,9b C ó lo n d e s c e n d e n te Prega da Mucosa 323 267,3 344,8 268,6 339 317,5 ± 149 ± 79,2 ± 162a ± 88,9b ± 65,2 ± 89,9 Túnica Muscular 94.2 93,7 97,1 92,3 76,1 82,5 ± 47,8 ± 23,7 ± 48,9 ± 29,8 ± 10,1 ± 17,5 Parede Total 457,2 397,5 483 398,6 459,2 450,5 ± 187,6 ± 105,6 ± 203,4a ± 113,5b ± 84,8 ± 116,8 42 *Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. Tabela 5 – Razão entre linfócitos intraepiteliais (IELs), alcian blue (AB+) e ácido periódico reativo de Schiff (PAS+) e enterócitos expressa em porcentagem (%) ± desvio padrão nos períodos de 30, 60 e 90 dias pós-infecção (DPI) dos animais dos grupos controle (GC) e experimental (GE). Densidade de células da mucosa (%) 30 DPI 60 DPI 90 DPI GC GE GC GE GC GE C ó lo n a s c e n d e n te IELs/ Enterócito 1,94 ± 0,4 1,6 ± 0,5 1,37 ± 0,6 0,9 ± 0,2 1,8 ± 0,5 1,2 ± 0,7 AB+/ Enterócito 31,0 ± 3,0 33,0 ± 7,0 35,0 ± 5,0 a 20,0 ± 6,0 b 10,0 ± 4,0 a 18,0 ± 6,0 b PAS+/ Enterócito 18,0 ± 6,0 a 12,0 ± 3,0 b 10,1 ± 4,3 12,0 ± 3,0 13,0 ± 3,0 a 9,0 ± 1,0 b C ó lo n d e s c e n d e n te IELs/ Enterócito 1,4 ± 0,6 1,59 ± 0,6 2,0 ± 0,6 1,5 ± 0,6 1,0 ± 0,3 0,4 ± 0,3 AB+/ Enterócito 18,0 ± 6,3 a 6,8 ± 3,0 b 11,2 ± 3,0 7,2 ± 1,3 9,8 ± 2,0 a 25,9 ± 9,0 b PAS+/ Enterócito 16,0 ± 4,3 a 9,8 ± 0,2 b 13,4 ± 2,0 a 7,7 ± 1,2 b 10,6 ± 2,0 a 21,0 ± 9,0 b *Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) com seus respectivos grupos controles. 43 Normas da revista Gastroenterology Research. Link com informações para os autores (normas e formatação) https://gastrores.org/index.php/gastrores/about/submissions#authorGuidelines Submissions Author Guidelines Our requirements for submitted manuscripts are in accordance with the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals. For general information about the structure and content of a biomedical manuscript, authors should get familiar with the ICMJE Uniform Requirements for Manuscripts before reading the specific instructions for Gastroenterology Research below. General Requirements Important notes: If you submit manuscripts via the online submission system, the first step is to register as a user of this site, make sure to check to register as Author, then you may add yourself as a Reader or a Reviewer as you like. When you upload your files, the manuscript main text is uploaded as the SUBMISSION FILE, and all other files are uploaded as SUPPLEMENTAL FILES, such as figures, cover letter, etc. All manuscripts should be submitted electronically via our website, submissions via regular postal mail are not acceptable at the moment. Manuscripts should be double- spaced (including references, tables, and figure legends). Gastroenterology Research does not enforce a word limit for the manuscript, neither has a limit for figures, tables, legends and references. Before submitting online, authors are asked to have their manuscript saved in word file and each figure saved as a separate electronic file, preferably named as "figure 1.tif," "figure 2.jpg," etc. Manuscripts are accepted for consideration with the understanding that they have been submitted solely to Gastroenterology Research and that they have not been previously published, either in whole or in part. Gastroenterology Research is a fully peer-reviewed journal. The editors reserve the right to make editorial changes in all matter published in the Journal. A cover letter should accompany the manuscript. It should include the name, mailing address, telephone and FAX numbers, and e-mail address of the corresponding author. Clinical Trials Registration Authors are encouraged to register their clinical trials with an international recognized clinical trials register, such as: clinicaltrials.gov; the EU Clinical Trials Register; WHO Clinical Trials Registry Platform. 44 Though not strictly required, the following clinical reporting guidelines are recommended to follow when preparing the relevant manuscripts. • Randomized trials (CONSORT) • Observational studies (STROBE) • Systematic reviews (PRISMA) • Case reports (CARE) • Qualitative research (SRQR) • Diagnostic / prognostic studies (STARD) • Quality improvement studies (SQUIRE) • Economic evaluations (CHEERS) • Animal pre-clinical studies (ARRIVE) • Study protocols (SPIRIT) • Clinical practice guidelines (AGREE) Authorship The ICMJE recommends that authorship be based on the following 4 criteria (www.icjme.org): 1) Substantial contributions to the conception or design of the work; or the acquisition, analysis, or interpretation of data for the work; AND 2) Drafting the work or revising it critically for important intellectual content; AND 3) Final approval of the version to be published; AND 4) Agreement to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved. Corresponding Author There must be a corresponding author (not more than 2 in a manuscript) clearly indicated in the title page, with his/her full academic affiliation, contact information (email, tel., fax). The corresponding author is the person who is taking the responsibilities of the manuscript being prepared following research and publishing integrity and ethics. The galley proof will be sent to the corresponding author for proofreading. Meanwhile, the galley proof might be also "carbon copy, CC" to the submitting individual, but that is not for all articles. "The corresponding author is the one individual who takes primary responsibility for communication with the journal during the manuscript submission, peer review, and publication process, and typically ensures that all the journal's administrative requirements, such as providing details of authorship, ethics committee approval, clinical trial registration documentation, and gathering conflict of interest forms and statements, are properly completed, although these duties may be delegated to one or more coauthors. The corresponding author should be available throughout the submission and peer review process to respond to editorial queries in a timely way, and should be available after publication to respond to critiques of the work and cooperate with any requests from the journal for data or additional information should questions about the paper arise after publication"( www.icjme.org). 45 Submitting Author The submitting author is the person who carries out the submission work and submits the manuscript (usually via online submission portal) to the journal. The submitting author is not necessarily the corresponding author, however, upon receiving the manuscript submitted by the individual (submitting author) other than the corresponding author, we assume that the submitting author has obtained explicit permission from the corresponding author to do so, and we assume that the corresponding author is fully aware of and approves the submission and oversees the editorial procedures of the manuscript. In this circumstance, a submission approval letter from the corresponding author might be requested by the editor, and the corresponding author should provide such letter before we do any processing of the manuscript. Valid Email Address The submitting author and corresponding author are responsible for providing valid and attended email address, and should check the email regularly, in order not to delay the editorial procedure. The galley proof will be sent to the corresponding author for proofreading. Meanwhile, the galley proof might be also sent “carbon copy, CC” to the submitting individual, but that is not for all articles. Preparation of Original Articles Original Articles are full-length reports of original research and will be considered for either the Clinical Research or the Basic Research. All articles should cover topics relevant to clinical and basic studies in gastroenterology. Title Page Title: Include animal species. Use no abbreviations. Limit: 150 characters with spaces. Short Title: limit 45 characters (with spaces). Authors Include first and last names of all authors, and name and full location of department and institution where work was performed. Grant Support List grant support and other assistance if applicable. Correspondence Provide name, complete address, e-mail address, telephone number, and fax number of the corresponding author. Financial Disclosures All authors must disclose any financial arrangement(s) they may have with a company whose product figures prominently in the submitted manuscript or with a company making a competing product. Structured abstract 46 Limit: 350 words. Organize according to the following headings: Background & Aims, Methods, Results, and Conclusions. Do not use footnotes, or references. Key words Provide up to 8 keywords. Introduction Should be brief and set out the purposes for which the study has been performed along with relevant previous studies only wherever essential and necessary. Materials and methods Should be sufficiently detailed so that readers and reviewers can understand precisely what has been done without studying the references directly. The description may be abbreviated when well accepted techniques are used. Describe ethical guidelines followed, for human or animal studies. Cite approval of institutional human research review committee or animal welfare committee. Outline statistical methods used. When describing the results of hypothesis testing, report P values and/or confidence intervals. Using phrases such as "not significant" is not sufficient. Identify drugs and chemicals used by generic name, if trademarks are mentioned, manufacturer name and city are given. Results Should be presented precisely and directly. Do not include discussion of their importance in this section of the manuscript. Tables Tables should be prepared without use of tabs; most table editor programs can be uploaded successfully. Figures Images: Images can be clinical, pathologic (gross or microscopic), endoscopic, or radiographic. They should be of high quality (300 dpi or greater, clear, and in good focus), and illustrate well the diagnosis. Color files should be submitted in the CMYK color space. Authors are encouraged to present color figures in a manner that will allow the data to be interpreted by colorblind readers. You must add arrows if necessary on the figure to call out the relevant or important element of the figure, the legend should state what the arrows indicate. Font If your figures include text, an 8 to 10 point font should be used. Acceptable fonts are "sans serif" fonts such as Arial, Helvetica, and Myriad. Examples of unacceptable fonts ("serif" fonts) are Times. Photographs Photographs of identifiable patients must come with written permission to publish from the patient. 47 Line art and graphs: any graphs or line art you submit are at a resolution of at least 300 dpi so that they are readable to reviewers. Accepted figure file formats: We support the following file formats: .bmp, .gif, .jpg, .png, .tif, .eps. When sending image files, please do not embed them in Word or PowerPoint. You may submit mixed file formats such as image1.jpg, image2.tif, image3.eps. Preferred figure file formats: .tiff, .psd .eps and .jpg. Image file formats not supported at this time: ChemDraw, CorelDraw, Canvas, FreeHand, Excel, SigmaPlot, and Equation Editor. You may export image files from these programs as PDF, Jpeg, or other acceptable file formats. File naming convention: Figures should be named consecutively such as "figure 1.tif," "figure 2.jpg," etc., with the file extension appended (.tif, .jpg, .eps, etc). Each figure should be saved as a separate electronic file. Authors must be aware of that color figure printing fee will be incurred. If the manuscript is reviewed with color figures, and the author does not wish to pay for printing color figures, the authors may choose to have their color figures printed in grayscale or black-and-white. Color figures are always free online. Discussion Discussion should be directly related to the study being reported. Do not include a general review of the topic only. An in-depth and insightful discussion in regarding to the new findings is encouraged. References Number references in the order cited as Arabic numerals in square brackets on the line. Only literature that is published or in press (with the name of the publication known) may be numbered and listed; abstracts and letters to the editor may be cited. Other materials, such as manuscripts submitted, unpublished data, personal communications, and the like, should not be cited. List all authors up to seven, using "et al." when the number is greater than seven. Journal Articles Joffe SW, Dewolf M, Shih J, McManus DD, Spencer FA, Lessard D, Gore JM, et al. Trends in the medical management of patients with heart failure. J Clin Med Res. 2013;5(3):194-204. Books Watson JD. The Double Helix. New York: Atheneum, 1968:1-6. Book Chapters Hofmann AF. The enterohepatic circulation of bile acids in health and disease. In: Sleisinger MH, Fordtran JS, eds. Gastrointestinal Disease. Volume 1. 5th ed. Philadelphia: Saunders, 1993:127-150. Figure and table legends Please do not embed or flatten the text into the image files. Legends should be in Word file and start from a new page, and numbered corresponding to the appearing order in the text. 48 Submission Declarations (Conflict of Interest, Human and Animal Rights, Informed Consent, ant others) The authors should declare any conflict of interests related to the manuscript. Published research must comply with the guidelines for human studies and animal welfare regulations. Authors should state that subjects have given their informed consent and that the study protocol has been approved by the institute’s committee on human research. Further, they should also state that animal experiments conform to institutional standards. Pease include the following declarations, any submissions missing a single item of declaration will be returned for resubmission. Original Article, Short Communication • Acknowledgement • Financial Disclosure or Funding • Conflict of Interest • Informed Consent • Author Contributions • Institutional Review Board Approval (IRB Approval, add in the Methods section) • Ethical Compliance with Human/Animal Study (add in the Methods section. Examples: This study was conducted in compliance with the ethical standards of the responsible institution on human subjects as well as with the Helsinki Declaration; or, This study was conducted in compliance with all the applicable institutional ethical guidelines for the care, welfare and use of animals.) • Data Availability Decisions The single most important criterion for acceptance is the originality of the work. However, a decision to accept a manuscript is not based solely on the scientific validity of its content. Other factors may affect decisions, such factors are, the extent and importance of new information in the paper compared with that in other papers being considered, the Journal's need to represent a wide range of topics, and the overall suitability for Gastroenterology Research. Decisions on peer-reviewed papers are sent to the authors via email within an average of 3 weeks from the date of submission. Open Access Publishing Charge This is an open access journal, an open access Article Publishing Charge is required for accepted articles, fees vary from article types, click here for rates details. Upon acceptance for publication, this fee is payable, an invoice will be sent to the submitting author or corresponding author. Editing Accepted papers are subject to copyediting according to the style of Gastroenterology Research, authors will be sent galleys (HTML and PDF) for proofreading. The authors need to approve all the statements contained in the article including the changes the copyeditor has made before publication. Disclaimer 49 The statements and opinions contained in this journal are solely those of the individual authors and do not necessarily reflect those of the editors or the publisher. The appearance of advertizements in the Journal is not a warranty, endorsement or approval of the products or services advertized or of their safety. The Editor-in-Chief and the Publisher disclaim responsibility for any injury to persons or property resulting from any ideas or products referred to in the articles or advertizements. Open access This journal provides immediate open access to its content, by this way, we make research freely available to the public and support a greater global exchange of knowledge. By default, Elmer Press publishes all articles under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (Attribution- NonCommercial 4.0 International CC-BY-NC 4.0), which permits unrestricted non- commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright, license, and permission for authors The authors retain the copyright of their published articles, and the corresponding author has the right to grant on behalf of all authors the license (Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License) to the publisher. This license allows authors to use their own articles for their own non-commercial purposes without seeking permission from us, but should provide proper acknowledgement and citation of the first publication in our journal. If the use is for commercial purpose, the authors should obtain permission from us, and a fee may apply. 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