1 MILENA FONTES LUIZETE Aplicações de MALDI-MS na análise de peptídeos produzidos por cianobactérias. Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção de Título de Doutora em Química. Orientador: Prof. Dr. Humberto Márcio Santos Milagre ARARAQUARA 2017 DADOS CURRICULARES Nome: Milena Fontes Luizete Data de nascimento: 27/10/1988 Formação Acadêmica: Bacharela em Química com Atribuições Tecnológicas Instituição: Instituto de Química – UNESP Araraquara Título: Mestre em Química Instituição: Instituto de Química – UNESP Araraquara Produção Científica Sandonato, B. B., Santos, V. G., Luizete, M. F., Bronzel Jr, J. L., Eberlin, M. N., Milagre, H. M. S. MALDI Imaging Mass Spectrometry of Fresh Water Cyanobacteria: Spatial Distribution of Toxins and Other Metabolites, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 28, No. 4, 521-528, 2017. Resumos apresentados em Eventos Científicos (1) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Non-ribosomal cyanopeptides founded in Brazilian Cyanobacteria Bloom: Identification and characterization by MALDI-TOF-MS.’ 39ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química: Criar e Empreender. 2016. (2) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Peptides Quantification: Improved Performance by the Binary Matrices System for MALDI-TOF-MS.’ 63rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2015. (3) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Metabolomic profiling of cyanobacteria by mass spectrometry’ 38a Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2015. (4) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘MALDI-TOF-MS for the differentiation of Strains of Cyanobacteria by their secondary metabolites profile.’ 63rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2015. (5) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘A Binary Matrix for Improvement of Quantitative Analysis of Microcystins by MALDI-TOF-MS.’ na 62nd Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2014. (6) Apresentação de resumo na forma de poster: ‘Otimização experimental da derivação de parabenos para análise via CG-EM.’ 5 Congresso Ibero Americano de Química Analítica, 2012. Dedico este trabalho aos meus pais Luis e Marilaine, à minha irmã Marina, ao meu companheiro de jornada e marido Érico, e aos meus avós Vanda, Lico (in memorian), Tonho e Cida (in memorian). Agradecimentos Ao Prof. Dr. Humberto M. S. Milagre, pela constante orientação, amizade e incentivo, serei eternamente grata por todos seus ensinamentos nos aspectos profissionais e pessoais. À Prof. Dra. Cíntia D. F. Milagre, juntamente com todo Milagre Research Group, pelas nossas reuniões e discussões amplamente proveitosas para minha formação. Ao Instituto de Química e o Programa de Pós-Graduação pelo apoio e infraestrutura. À FAPESP e CNPq, por fomentarem as pesquisas dispostas neste trabalho. À CAPES pela bolsa concedida e manutenção do Portal de Periódicos. Ao Instituto Pasteur e ao Laboratório ThoMSon, pela parceria e colaboração. Sou imensamente grata à Deus, à Maria, mãe das mães e aos meus protetores espirituais. Gratidão aos meus pais pela minha vida, e por passarem a vida deles se esforçando para que eu trilhasse o caminho dos estudos desde o pré-primário até este momento. À minha irmã Marina, pelos sorrisos e apoio constante. Ao meu marido e companheiro de jornada Érico, que a todo momento esteve do meu lado, me dando apoio em todos os aspectos. Aos meus avós, Vanda e Lico (in memorian), Tonho e Cida (in memorian), que me acompanham desde o nascimento e são exemplos em minha vida. Sou imensamente grata às minhas amigas irmãs Vanessa e Mi Murad, que há dois anos estão ao meu lado todos os dias desta caminhada. Gratidão ao Núcleo Ju Marconato, por ser meu refúgio e o bálsamo dos meus dias. Gratidão à Lu, Naira e Paulinha, pelos abraços sinceros. Gratidão aos amigos de laboratório, Luna, Maraylla, Iris, Carol, Raquel, Bruno, João, que me acompanharam no dia a dia. Não poderia deixar de agradecer também, os porteiros do Instituto de Química: Raquel, Joel e Seu Haliaben, pelos primeiros sorrisos que eu via quando aqui chegava. Em especial a Raquel pela sincera amizade. Agradeço também toda turma de manutenção, em especial ao Senhor Abraão, ao Rogério e o Carlos, que prontamente atendiam aos meus pedidos, quando o ar condicionado da sala do equipamento chorava, entre tantas outras manutenções que realizaram com profissionalismo. Meu sincero sentimento de GRATIDÃO a todos vocês. ‘’A experiência mais bela que podemos ter é a do mistério. Ela é a emoção fundamental que está na origem da arte e da ciência verdadeiras. Quem não a conhece e não consegue maravilhar-se com ela está praticamente morto e seus olhos estão obscurecidos. ’’ Albert Einstein Resumo Neste trabalho, a técnica Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS) foi utilizada em diferentes aplicações para a análise de peptídeos produzidos por cianobactérias. Esta técnica é extremamente rápida, possui alta resolução, requer pouquíssimo preparo de amostra e não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfiram na análise. Por estes motivos MALDI- MS tem sido amplamente utilizada não somente na detecção de diferentes variantes de cianopeptídeos, mas também para quantificação das cianotoxinas. Este trabalho utilizou um sistema binário de matriz para a quantificação de microcistinas, utilizando as matrizes ácido α-ciano-4-hidroxicinamico e o ácido sinapínico (50/50, v/v) para obter uma mistura homogênea de matriz/analito, superando a baixa reprodutibilidade inerente da técnica MALDI-MS. Paralelamente, foi realizado o imageamento de espécies de cianobactérias de água doce cultivadas em meio sólido por MALDI-TOF-MS. Os resultados obtidos apresentaram novas perspectivas com relação à distribuição espacial dos peptídeos produzidos pelas espécies de cianobactérias estudadas, como a nodularina-R (m/z 825) e nodularina-[Har] (m/z 839) produzida pela espécie Nodularia harveyana PCC 7804, os peptídeos MC-LR (m/z 995) produzidos pela espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820, e o sideróforo anaquelina (m/z 761.3) produzidos pela espécie Anabaena Cylindrica PCC 7122. Além disto, amostras da floração de cianobactérias, que ocorre na Represa Salto Grande, localizada na cidade de Americana – SP, foram analisadas e nelas foram identificados onze cianopeptídeos de quatro classes diferentes, sendo quatro microcistinas (MC-LR, MC-YR, MC-Hil e MC-RR), quatro aeruginosinas (602, 298 A, 644 e 646), duas cianopeptolinas (972 e 986), e uma variante de microviridina (1707). Palavras Chaves: MALDI-MS. Espectrometria de Massas. Cianobactérias. Microcistinas. Cianopeptídeos. Abstratc In this work, the technique Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS) were used in different application for analysis of peptides produces by cyanobacteria. This technique is extremely fast, has high resolution, requires very little sample preparation and does not allow any contaminants present in the sample to interfere with the analysis. For these reasons, MALDI-MS has been widely used not only in the detection of different variants of cyanopeptides, but also for the quantification of cyanotoxins. This work utilized a matrix binary system for the quantification of microcystins, using the α-cyano-4-hydroxynamic matrix and sinapinic acid (50/20, v/v) to obtain a homogeneous matrix/analyte mixture, overcoming the low reproducibility inherent to the MALDI-MS technique. Simultaneously, we performed the imaging of freshwater cyanobacteria cultivated in solid medium by MALDI-TOF-MS. The results obtained presented new perspectives regarding the spatial distribution of the peptides produced by the studied cyanobacteria species, for exemple the nodularin-R (m/z 825), nodularin-[Har] (m/z 839) for the species Nodularia harveyana PCC 7804, MC-LR peptides (m/z 995) for the species Microcystis aeruginosa PCC 7820, and the siderophore anaquelin (m/z 761.3) for the species Anabaena cylindrica PCC 7122. In addition, samples of cianobacteria’s bloom, present in Salto Grande Lagoon, located in Americana-SP, were analyzed and were identified some peptides, being four microcystins (MC-YR, MC-YR, MC-Hil and MC-RR), four aeruginosins (602, 298 A, 644 and 968), two cyanopeptolins (972 and 986), and one variant of microviridin(1707). Lista de Figuras FIGURA 1 - Estromatólito encontrado no Lago Innes - Sul da Austrália. Fonte: Falconer, I. R. Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies (FALCONER, 2003a) . ..................................................................................................................... 22 FIGURA 2 - Estrutura celular básica de uma cianobactéria. Fonte: http://reasonandscience.heavenforum.org/t1551-cyanobacteria (adaptado) ............. 23 FIGURA 3 – Microscopia ótica para visualização da espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820. A) Vizualização das colônias (aumento 40x), B) Visualização das células (aumento de 100x). ................................................................................................... 24 FIGURA 4 – Microscopia ótica (aumento 100x) das espécies A) Anabaena cilyndrica PCC 7122, célula em destaque heterocisto e B) Nostoc sp. PCC 9237, célula em destaque acinete. ...................................................................................................... 25 Figura 5 - Imagens de cianobactérias em A) Fonte Termal (Yellowstone National Park) e B) Deserto. Fonte: A)http://www.webexhibits.org/causesofcolor/5D.html, B)http://www.kavlifoundation.org/science-spotlights/microbiome-astrobiology-how- search-life-other-worlds#.WL1UcPnyuUk .................................................................. 28 FIGURA 6 - Imagens de Florações de Cianobactérias obtidas por satélites. Lago Eire (EUA), Mar de Bering (Alasca), Golfo do México e Costa da Argentina. Fonte: NASA Goddard Space Flight Center/Flickr .......................................................................... 29 FIGURA 7 - Estrutura química das neurotoxinas Anatoxina, Anatoxina-a (s) e Saxitoxina. ................................................................................................................. 30 FIGURA 8 - Estrutura química de um lipossacarídeo (LPS) ..................................... 31 FIGURA 9 - Estrutura química da cilindrospermopsina ............................................. 32 FIGURA 10 - Hepatócitos isolados incubados na ausência ou presença de microcistina: (a) hepatócito controle; (b) hepatócito incubado por 30 minutos na presença de microcistina. Fonte: Microcystin Toxicity - Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies. ........................................................................................... 33 FIGURA 11 - Estrutura da microcistina-LR (MC-LR). Em azul: L-aminoácidos, posição 2, L e posição 4 R. Em vermelho: Adda, em preto: os quatro D-aminoácidos, posição 1, 3, 6 e 7. .................................................................................................... 33 FIGURA 12 - Estruturas de algumas microcistinas e sua nomenclatura. .................. 34 FIGURA 13 - Estururas e nomenclatura da nodularins- R e nodularina-Har. ............ 35 FIGURA 14 - Representação da fonte de ionização MALDI-MS. Fonte: Milagre, H.M.S. ....................................................................................................................... 38 FIGURA 15 - Principais matrizes utilizadas em UV-MALDI. ...................................... 40 FIGURA 16 - Mecanismo Unificado de ionização do analito por MALDI-MS. ........... 42 FIGURA 17 - Representação da formação de ‘hot-spots’ e a variabilidade dos espectros obtidos, dependendo do local onde o laser incide. Fonte: Bronzel, 2015 - adaptado. .................................................................................................................. 44 FIGURA 18 - Espectro MALDI-(+)-TOF/MS obtido pela análise de MC-RR (2.50 µmol/L) e da Angiotensina I (2.50 µmol/L). ................................................................ 52 FIGURA 19 - Filamento de Spirulina. Fonte: Jerine, P. S, Kadar, B. S, Giridharan, R., Udhaya, L. B, Sabina, E. P. (2017). .......................................................................... 63 FIGURA 20 - Estruturas químicas da Scytonemina e Mycosporina-2-glicina. ........... 64 FIGURA 21 – Metabólitos secundários produzidos pelas cianobactérias classificados de acordo com a classe estrutural. Fonte: Chipala, G. E., Mo, S., Orjala, J., 2011 (adaptado). ................................................................................................................ 65 FIGURA 22 - Exemplos de diferentes classes de cianopeptídeos. ........................... 67 FIGURA 23 - Amino ácidos e resíduos de aminoácidos não usuais presentes nas estruturas dos cianopeptídeos. ................................................................................. 68 FIGURA 24 – Esquema da biossíntese da Nodularina-R. Fonte: Moffitt, M. C., Neilan, B. J. (2004) (RANTALA et al., 2004). ........................................................................ 69 FIGURA 25 – Estrutura química da Aeruginosina 298A. ........................................... 70 FIGURA 26 - Estrutura química da Cianopeptolina 1083. ......................................... 71 FIGURA 27 - Estrutura de uma microviridina. As ligações em destaque podem ocorrer após a tradução da sequência primária de aminoácidos. ............................. 72 FIGURA 28 – Etapas realizadas para realização do imageamento por IMS. a) Amostra inserida na placa de MALDI-MS, b) análise por MALDI-TOF-MS (varredura de toda área por pixels), c) cada pixel possui um espectro de massas, d) associação dos sinais selecionados, com suas respectivas coordenadas no espaço, formando a imagem...................................................................................................................... 75 FIGURA 29 - Método de análise de cianobactérias por MALDI-TOF-MS. ................ 80 FIGURA 30 - Passo a passo para o imageamento das culturas de cianobactérias. Fonte: Sandonato, B. B. et al, 2017 (adaptado) (SANDONATO et al., 2017). .......... 82 FIGURA 31 - Imagem por microscopia óptica (aumento 100X) das espécies: Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 .................................................................................................. 83 FIGURA 32 – Estrutura dos cianopeptídeos identificados pelas análises de MALDI- TOF-MS..................................................................................................................... 85 FIGURA 33 – Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Microcystis aeruginosa PCC7820. ............................................................................ 86 FIGURA 34 - Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Nodularia harveyana PCC7804. ................................................................................ 87 FIGURA 35 - Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Anabaena cylindrica PCC7122. ................................................................................. 88 FIGURA 36 - MALDI-IMS slide com colônias de Microcistis artuginosa PCC 7820 com a área scaneada delimitada pelo retângulo em vermelho. Imagem MALDI-IMS gerada para: (b) íon m/z 603.3 correspondente a aeruginosina 602 e m/z 995.6 correspondente a molécula protonada de MC-LR. .................................................... 90 FIGURA 37 - a) MALDI-IMS slide com as colônias de cianobactérias N. harveyana PCC 7804, no lado direito do slide e A. Cylindrica PCC 7122 do lado esquerdo, b) imagem gerada por MALDI-IMS da distribuição do sideróforo anaquelina (m/z 761), c e d) imagens geradas por MALDI-IMS dos peptídeos cíclicos nodularina-R (m/z 825), nodularina-[Har] (m/z 839). .............................................................................. 91 FIGURA 38 - MALDI-IMS imagem para as três espécies de cianobactérias N. harveyana PCC 7804, M. aeruginosa PCC 7820 e A. cylindrica PCC 7122. Imagem (a) para os biomarcadores nodularina Nod-[Har] (m/z 839.5), microcistinas MC-LR (m/z 995.6) e anaquelina (m/z 761.3). Imagens (b) a (g) para os íons desconhecidos m/z 619.1, 638.5, 989.4, 1276.3, 1643.6 e 1971.5. ................................................... 92 FIGURA 39 - Imagens de Floração de Cianobactérias, Americana -SP. Fonte: arquivo pessoal do autor. .......................................................................................... 96 FIGURA 40 – Mapa de Hidrografia da cidade de Americana -SP. Fonte: http://www.americana.sp.gov.br/v6/images/perfil_municipio/perfil_2011_mapa_hidrog rafico.jpg .................................................................................................................... 97 FIGURA 41 – Espécies de cianobactérias encontradas na floração da Represa Salto Grande. A) Microcystis sp. CENA120, B) Cyanobium sp. CENA122, C) Romeria victoriae CENA123. Fonte: adaptado de Genuário, D. B., 2016. ............................... 98 FIGURA 42 - Esquema básico da Fonte de ionização por eletronspray. ................ 100 FIGURA 43 - A) Esquema de um experimento Full scan B) Esquema de um experimento de MS/MS. .......................................................................................... 102 FIGURA 44 – a) Imagem da floração de cianobactérias presente em Americana-SP, Brasil vista por satélite. Fonte: Google Maps. b) Imagem do Ponto de Coleta 1: 22°42.350’ S 047°16.058’ W. c) Imagem do ponto da margem da Represa na Associação Barco Escola. Fonte: Arquivo pessoal do autor. .................................. 104 FIGURA 45 – Fluxograma do procedimento experimental realizado para identificação dos cianopeptídeos encontrados na floração de cianobactérias da Represa Salto Grande. ................................................................................................................... 106 FIGURA 46 - Imagem das cianobactérias vistas ao microscópio óptico, zoom de 100x. A) Células em forma filamentosas, B e C) Células em forma de cocos de diferentes tamanhos, tais como Microcistis sp. ....................................................... 108 FIGURA 47 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das amostras coletadas em diferentes pontos: a) Ponto de coleta 1; b) Ponto de coleta 2; c) Ponto de coleta 3. ............... 109 FIGURA 48- Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das análises das células referentes as extrações realizadas utilizando metanol, a) análise referente às células restantes da extração 1, b) análise referente às células restantes da extração 2,c) análise referente às células restantes da extração 3, d) análise referente às células restantes da extração 4. .......................................................................................................... 111 FIGURA 49 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das análises dos solventes das extrações realizadas utilizando metanol. a) análise referente ao solvente de extração 1, b) análise referente ao solvente de extração 2, c) análise referente ao solvente de extração 3, d) análise referente ao solvente de extração 4. .................................... 112 FIGURA 50 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS obtidos das análises das frações; a) espectro referente a análise da fração 20% MeOH, b) espectro referente a análise da fração 40% MeOH, c) espectro referente a análise da fração 60% MeOH, d) espectro referente a análise da fração 80% MeOH, e) espectro referente a análise da fração 100% MeOH ............................................................................................ 113 FIGURA 51 - Estrutura das aeruginosinas identificadas na floração de Americana. ................................................................................................................................ 114 FIGURA 52 - Estruturas das cianopeptolinas identificadas na floração de Americana. ................................................................................................................................ 116 FIGURA 53 - Estrutura das MC’s encontradas na floração de Americana. ............. 117 FIGURA 54 - Espectro de MS/MS do íon m/z 603. ................................................. 122 FIGURA 55 - Espectro de MS/MS do íon m/z 605. ................................................ 123 FIGURA 56 - Espectro de MS/MS do íon m/z 645. ................................................. 124 FIGURA 57 - Espectro de MS/MS do íon m/z 647. ................................................. 125 FIGURA 58 - Espectro de MS/MS do íon m/z 987. ................................................. 126 FIGURA 59 - Espectro de MS/MS do íon m/z 973. ................................................. 127 FIGURA 60 - Espectro de MS/MS do íon m/z 959. ................................................. 128 FIGURA 61 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1072. ............................................... 129 FIGURA 62 - Espectro de MS/MS do íon m/z 995. ................................................. 130 FIGURA 63 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1009. ............................................... 131 FIGURA 64 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1045. ............................................... 132 FIGURA 65 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1707. ............................................... 133 Lista de Tabelas Tabela 1 - Classificação de Ordens de cianobactérias de acordo com a classificação botânica e suas subseções correspondentes pela classificação bacteriológica. Fonte: Chemical and Biological Investigations of Vietnamese Cyanobacteria. .................... 26 Tabela 2 - Parâmetros utilizados para as análises por MALDI-TOF. ........................ 47 Tabela 3 - Estruturas das matrizes de MALDI-MS utilizadas neste trabalho. ............ 51 Tabela 4 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes utilizadas, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L)............................................... 53 Tabela 5 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 55 Tabela 6 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes binárias, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L)............................................... 57 Tabela 7 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 58 Tabela 8 - Dados obtidos por Puddick, 2007 utilizando ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico como matriz. ............................................................................................... 58 Tabela 9 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 59 Tabela 10- Espécies de cianobactérias e seus respectivos meios de cultivo. .......... 78 Tabela 11- Meios de cultivo BG-110+ NaNO3 (2mM) + NaHCO3 (10mM). ................ 79 Tabela 12- Meios de cultivo BG-110 e solução de metais traços. ............................. 79 Tabela 13 - Espécies de cianobactérias e os respectivos m/z relativos aos cianopepitídeos identificados. ................................................................................... 84 Tabela 14 - Parâmetros utilizados para as análises por MALDI-TOF. .................... 105 Tabela 15- m/z referentes aos peptídeos identificados na floração por MALDI-TOF- MS. *Valores descritos na literatura. ....................................................................... 110 Tabela 16 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-MS/MS das aeruginosinas detectadas e identificadas nesta floração. ................................................................................................................................ 115 Tabela 17 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-HRMS/MS das cianopeptolinas detectadas e identificadas nesta floração. .................................................................................................................. 117 Tabela 18 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-HRMS/MS das MC’s detectadas e identificadas nesta floração. ... 118 Lista de Abreviaturas ACN: acetonitrila Adda: ácido (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metóxi-2,6-trimetil-8,10-deca-4,6-dienóico Asp: asparagina A: alanina BG: Blue-Green Medium CENA: Centro de Energia Nuclear na Agricultura CHCA: ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico Choi: 2-carboxi-6-hidroxioctahidroindol CV: coeficiente de variação DHB: ácido diidroxibenzóico DNA: ácido desoxirribonucleico ESI: Electrospray Ionization ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Har: homoarginina Hil: homoisoleucina Hpla: ácido hidroxi-fenillático HPLC: High performance liquid chromatography IMS: imaging mass spectrometry Ileu: isoleucina IR: infravermelho L: leucina LD50: dose letal mediana LDQ: lower limit of detection LPS: lipopolissacarídeos MC: microcistina MC’s: microcistinas m/z: razão massa/carga MALDI: Matrix Assisted Laser/Dessorption Ionization MCP: micro-channel plate MDL: minimum detection limit MMA’s: micosporinas MS: Mass Spectrometry MS/MS ou MS2: Tandem Mass Spectrometry PEG: Polietilenoglicol PCC: Pasteur Collection of Cyanobacteria PCP’s: Produtos de cuidado pessoal PP1: protein phosphatase 1 PP2: protein phosphatase 2 Q: quadrupolo R: arginina SA: ácido sinapínico TFA: ácido trifluoroacético TOF: analisador por tempo de vôo UPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography UV: ultravioleta (v/v): volume/volume Y: tirosina Sumário Prefácio ..................................................................................................................... 19 CAPÍTULO 1: Desenvolvimento de método de quantificação por MALDI-TOF-MS, utilizando matrizes binárias. ...................................................................................... 22 1. Introdução ............................................................................................................. 22 1.1. Cianobactérias: fósseis vivos .............................................................................. 22 1.2. Estrutura celular das cianobactérias ................................................................... 23 1.3. Nomenclatura e Classificação das Cianobactérias ............................................. 25 1.4. A ecologia das cianobactérias ............................................................................ 28 1.5. Cianotoxinas ....................................................................................................... 30 1.5.1. Neurotoxinas ................................................................................................... 30 1.5.2. Dermatotoxinas ............................................................................................... 31 1.5.3. Citotoxinas ....................................................................................................... 31 1.5.4. Peptídeos Hepatotóxicos ................................................................................. 32 1.6. Quantificação de Microcistinas: a importância, métodos utilizados e seus desafios ..................................................................................................................... 36 1.6.1. Matrix Laser Assisted Desorption/Ionization (MALDI) ..................................... 38 1.6.1.1. Principais componentes da fonte de ionização MALDI: o comprimento de onda do laser ............................................................................................................. 39 1.6.1.2. Principais componentes de MALDI – Matrizes, suas estruturas e funções .. 39 1.6.1.4. Metodologias de preparo de amostra para análise por MALDI-MS. ......... 42 1.6.2. A aplicação de MALDI-MS como ferramenta para a quantificação de microcistinas .............................................................................................................. 45 2. Objetivos ............................................................................................................... 46 3. Materiais e Métodos .............................................................................................. 47 3.1. Padrões químicos, solventes e matrizes ............................................................. 47 3.2. Parâmetros utilizados pelo Equipamento ............................................................ 47 3.3. A energia do laser utilizada ................................................................................. 48 3.4. Preparo das soluções de matriz .......................................................................... 48 3.5. Sistemas de Matrizes Binárias ............................................................................ 48 3.6. Soluções Padrão ................................................................................................. 48 3.7. Preparo de amostra ............................................................................................ 49 3.8. Tratamento estatístico dos dados obtidos........................................................... 49 4. Resultados e Discussões ...................................................................................... 51 5. Conclusões ........................................................................................................... 60 CAPÍTULO 2: Imageamento de Cianobactérias de água doce por MALDI Imaging Mass Spectrometry: Distribuição de toxinas e outros metabólitos. ........................... 62 1. Introdução ............................................................................................................. 62 1.1. Cianopeptídeos .................................................................................................. 65 1.1.1. Aeruginosinas .................................................................................................. 70 1.1.2. Cianopeptolinas ............................................................................................... 70 1.1.3. Microviridinas .................................................................................................. 71 1.1.4. Nodularinas e Microcistinas ............................................................................. 72 1.1.5. Cianopeptídeos como fontes de novos fármacos ............................................ 72 1.2. MALDI-IMS ......................................................................................................... 73 2. Objetivos ............................................................................................................... 77 3.Materiais e Métodos ............................................................................................... 78 3.1. Esterilização dos materiais ................................................................................. 78 3.2. Cultivo das espécies de cianobactérias.............................................................. 78 3.3. Preparo de amostra para as análises de cianobactérias cultivadas no laboratório e amostras ambientais por MALDI-TOF-MS. ............................................................ 80 3.4. Imageamento das culturas de cianobactérias Microcystis aeruginosa PCC 7820, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122. ......................... 81 4. Resultados e Discussão ........................................................................................ 83 4.1. Identificação dos cianopeptídeos produzidos pelas espécies Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nostoc sp. PCC 9237, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 por MALDI-TOF-MS ................................................ 83 4.2. Imageamento das espécies Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nostoc sp. PCC 9237, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 por MALDI- TOF-IMS.................................................................................................................... 89 5. Conclusões ............................................................................................................ 93 CAPÍTULO 3: Identificação de cianopeptídeos presentes na floração de cianobactérias presente na Represa Salto Grande. .................................................. 95 1. Introdução ............................................................................................................. 95 1.1. Floração de Cianobactérias presente na Represa Salto Grande (Americana – SP) 95 1.2. Eletrospray ......................................................................................................... 99 1.3. Tandem Mass Spectrometry (MS/MS ou MS2) ................................................. 101 2. Objetivos ............................................................................................................. 103 3. Materiais e Métodos ............................................................................................ 104 3.1. Coleta de amostras ambientais de floração tóxica de cianobactérias. .............. 104 3.2. Análise das amostras ambientais por MALDI-TOF-MS .................................... 105 3.3. Análise das amostras ambientais de floração tóxica de cianobactérias por ESI- qQ-TOF-MS/MS. ..................................................................................................... 106 4. Resultados e Discussões .................................................................................... 108 5. Conclusões .......................................................................................................... 120 Apêndice: Espectros de MS/MS dos cianopeptídeos identificados na floração de cianobactérias. ........................................................................................................ 122 Referências ............................................................................................................. 134 19 Prefácio Cianobactérias são consideradas fósseis vivos, com origem a aproximadamente 3.5 bilhões de anos, habitando diversos ecossistemas, principalmente ecossistemas aquáticos. A facilidade de adaptação das cianobactérias deve-se a produção de uma enorme variabilidade de metabólitos secundários, que são em sua maioria oligopeptídeos com uma grande diversidade estrutural. Estes peptídeos podem ser agrupados de acordo com suas características estruturais como aeruginosinas, cianopeptolinas, nodularinas, microviridinas e microcistinas. A população de células de cianobactérias em corpos de água varia sazonalmente podendo alcançar um crescimento exacerbado aumentando sua densidade celular em até 500%. Este fenômeno é denominado de floração de cianobactérias, sendo uma preocupação mundial recorrente, pois geram custos socioeconômicos e ecológicos. Algumas espécies de cianobactérias presentes nestas florações produzem metabólitos tóxicos que causam efeitos agudos ou crônicos na saúde humana e de outros organismos vivos. Tais toxinas são denominadas de cianotoxinas e a classe das microcistinas é a mais tóxica e recorrente nas florações de cianobactérias presentes em todo mundo. Neste contexto, torna-se necessário o monitoramento de microcistinas e suas concentrações em reservatórios de água para abastecimento público. Além disto, a detecção e o estudo das diferentes classes de peptídeos produzidos pelas cianobactérias presentes nestas florações são de interesse econômico e ecológico, já que estes peptídeos podem apresentar diferentes bioatividades. Uma técnica eficiente para a análise de cianopeptídeos presentes nas florações, é a Matrix Assistided Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS). Esta técnica é extremamente rápida, possui alta resolução, requer pouquíssimo preparo de amostra e não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfiram na análise. Por estes motivos MALDI-MS foi utilizada neste trabalho não somente na detecção de diferentes variantes de cianopeptídeos, mas também para quantificação de diferentes variantes de microcistinas. Sendo os objetivos gerais desta tese aplicar a técnica MALDI-MS no desenvolvimento de um método de quantificação de microcistinas avaliando o uso de diferentes matrizes e misturas binárias das mesmas; a aplicação de MALDI-IMS para o imageamento de cianobactérias de água doce, afim de verificar a dispersão espacial das cianotoxinas 20 produzidas pelas mesmas, e por fim, a análise de cianopeptídeos presentes em uma floração de cianobactérias da Represa Salto Grande (Americana-SP). 21 Capítulo 1 Desenvolvimento de método de quantificação de microcistinas por MALDI-TOF-MS, utilizando matrizes binárias. 22 CAPÍTULO 1: Desenvolvimento de método de quantificação por MALDI-TOF-MS, utilizando matrizes binárias. 1. Introdução 1.1. Cianobactérias: fósseis vivos As Cianobactérias, descritas como uma das formas mais antigas de vida presentes no planeta Terra, são consideradas como fósseis vivos e foram encontradas em rochas do Período Cambriano, com idade de aproximadamente 3,5 bilhões de anos (PERISSINOTTO et al., 2014). Estas rochas, denominadas de estromatólitos são formadas pela deposição laminar de carbonato de cálcio e outros sedimentos, que foram aprisionados durante os processos metabólicos e de crescimento das cianobactérias (RISHWORTH et al., 2017). Assim, a estrutura de um estromatólito apresenta camadas alternadas de células e sedimento (FIGURA 1). FIGURA 1 - Estromatólito encontrado no Lago Innes - Sul da Austrália. Fonte: Falconer, I. R. Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies (FALCONER, 2003a) . 23 1.2. Estrutura celular das cianobactérias Cianobactérias são micro-organismos procariontes fotossintetizantes (SANT’ANNA et al., 2006). A FIGURA 2 apresenta a estrutura básica de uma célula de cianobactéria e seus componentes principais. FIGURA 2 - Estrutura celular básica de uma cianobactéria. Fonte: http://reasonandscience.heavenforum.org/t1551- cyanobacteria (adaptado) As células de cianobactérias possuem apenas um único cromossomo circular. No entanto, além deste cromossomo, algumas espécies possuem plasmídeos, pequenos filamentos de DNA circulares, espalhados em seu citoplasma (SCHWABE et al., 1988). As Cianobactérias possuem parede celular e sucessivas camadas de membranas fotossintetizantes, paralelas umas às outras, denominadas de tilacóides. Nestas membranas estão presentes os pigmentos: clorofila-a e a ficocianina, que são responsáveis pela fotossíntese e pela coloração verde que a maioria das espécies possuem (WHITTON; POTTS, 2000). Outros pigmentos, tais como carotenoides e ficoeritrinas podem estar presentes, no entanto estes oferecem uma forte coloração vermelha às cianobactérias (FALCONER, 2003a). Algumas espécies de cianobactérias possuem vacúolos de gás, que permitem as células controlar sua posição vertical dentro da coluna de água, facilitando a locomoção das mesmas quando estão em busca de luminosidade e nutrientes necessários para sua sobrevivência (GANF; OLIVER, 1982). 24 Quanto a sua morfologia, as cianobactérias são encontradas na forma de cocos unicelulares como, por exemplo, a espécie Microcystis aeruginosa, ou na forma de filamentos como as espécies Nostoc sp. e Anabaena cillindrica. As Cianobactérias unicelulares possuem uma bainha ou envoltório mucilaginoso, evidenciando a individualidade metabólica de cada célula quando as mesmas estão em suas colônias (FABBRO, 2002). A FIGURA 3 apresenta colônias e células da espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820. FIGURA 3 – Microscopia ótica para visualização da espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820. A) Vizualização das colônias (aumento 40x), B) Visualização das células (aumento de 100x). As espécies de cianobactérias filamentosas podem possuir células diferenciadas, com funções específicas (FALCONER, 2003a). Estas células possuem parede celular, no entanto não possuem tilacóides. Por exemplo, os heterocistos, células especializadas na fixação de nitrogênio, são maiores que as células comuns e podem estar presentes entre as células fotossintetizantes, no meio do filamento, ou até mesmo no final do mesmo (FIGURA 4) (FALCONER, 2003a). Outro tipo de célula diferenciada é o acinete, com formato de uma grande esfera é geralmente encontrado no final do filamento. O acinete tem a finalidade de armazenar nutrientes e material genético, pois, uma vez que a célula morre, ele é a célula que fica em estado vegetativo, sendo responsável por regenerar um novo filamento quando as condições de vida se tornarem novamente favoráveis (FALCONER, 2003a). A FIGURA 4 apresenta as imagens de microscopia ótica das espécies A) Anabaena cylindrica PCC7122 e B) Nostoc sp. PCC9237, sendo destacados o heterocisto e o acinete, respectivamente. 25 FIGURA 4 – Microscopia ótica (aumento 100x) das espécies A) Anabaena cilyndrica PCC 7122, célula em destaque heterocisto e B) Nostoc sp. PCC 9237, célula em destaque acinete. 1.3. Nomenclatura e Classificação das Cianobactérias As Cianobactérias são pertencentes ao Reino Monera e ao Filo Cyanobacteria. A classificação taxonômica quanto a Ordem destas espécies são realizadas de diferentes maneiras, sendo que as duas principais são: a classificação Botânica (KORMÁREK; ANAGNOSTIDIS, 1999), e a classificação bacteriológica (CASTENHOLZ, 1988). Desta maneira, segundo a classificação botânica, as espécies de cianobactérias estão divididas em quatro Ordens diferentes: Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales e Stigonematales (FESSER, 2010). Segundo a classificação bacteriolócica, cada uma destas ordens está dividida e representada em subseções. Tanto a classificação botânica quanto a classificação bacteriológica são realizadas de acordo com a morfologia e reprodução das espécies de cianobactérias. A Tabela 1 apresenta as principais características de cada uma destas Ordens (Classificação Botânica), e sua subseção correspondente na classificação bacteriológica (FESSER, 2010). 26 Tabela 1 - Classificação de Ordens de cianobactérias de acordo com a classificação botânica e suas subseções correspondentes pela classificação bacteriológica. Fonte: Chemical and Biological Investigations of Vietnamese Cyanobacteria. Classificação Botânica Classificação bacteriológica Características morfológicas e ocorrência no ambiente Exemplos de Gêneros Ordem Croococcales Subseção I Cianobactérias unicelulares. Sua reprodução ocorre em um ou mais planos, ou por brotamento. Suas colônias se mantem unidas por uma bainha de mucelagem. Suas espécies podem possuir vacúolo de gás. Vivem em água doce ou em água salgada. Microcystis Subseção II Cianobactérias unicelulares, suas colônias mantem-se unidas por gel-like matrix. As células se reproduzem por múltiplas divisões da célula mãe. Geralmente vivem em ambientes aquáticos. Pleurocapsa Ordem Oscillatoriales Subseção III Cianobactérias existentes na forma de tricomas. Não possuem células diferenciadas. Seus tricomas não possuem Oscillatoria Planktothrix Spirulina 27 ramificações. Algumas espécies possuem vacúolos de gás. A divisão celular ocorre sempre no plano perpendicular ao eixo longitudinal do tricoma. Suas espécies vivem em ambientes aquáticos diversos. Ordem Nostocles Subseção IV Cianobactérias filamentosas, possuem células diferenciadas, como acinetes e heterocistos. A reprodução celular ocorre por divisão binária. Suas espécies vivem desde ambientes aquáticos até ambientes terrestres. Anabaena Nostoc Nodularia Ordem Stigonematles Subseção V Cianobactérias na forma de tricomas, possuem ou não ramificações verdadeiras. Se reproduzem por divisão binária, que geralmente ocorre em mais de um plano. Podem possuir células diferenciadas. Ocorrem em ambientes aquáticos ou terrestres. Ficherella 28 1.4. A ecologia das cianobactérias No aspecto ecológico, as cianobactérias são consideradas uma das formas mais bem-sucedidas de vida (ROHRLACK; CHRISTIANSEN; KURMAYER, 2013), uma vez que, suas espécies podem ser encontradas em ecossistemas extremos, tais como as areias de desertos até rochas na Antártica. No entanto, a maior parte das espécies de cianobactérias habitam ecossistemas aquáticos, podendo também viver em condições extremas, como por exemplo em fontes termais, onde as temperaturas podem chegar até 77°C (WHITTON; POTTS, 2000). A FIGURA 5 apresenta imagens de cianobactérias encontradas em fontes termais e desertos. Figura 5 - Imagens de cianobactérias em A) Fonte Termal (Yellowstone National Park) e B) Deserto. Fonte: A) http://www.webexhibits.org/causesofcolor/5D.html, B) http://www.kavlifoundation.org/science- spotlights/microbiome-astrobiology-how-search-life-other-worlds#.WL1UcPnyuUk Além disto, as cianobactérias são encontradas em ambientes aquáticos com diferentes graus de salinidade, desde água doce, até ambientes com hipersalinidade com concentrações entre 3 e 4 mol/L (REED et al., 1984). A população de células de cianobactérias em corpos de água varia sazonalmente de acordo com a temperatura da água, irradiação solar e com a concentração de nutrientes presentes no ecossistema aquático (FALCONER, 2003b). O pico de maior concentração celular ocorre do meio ao final do verão, quando a temperatura da água e a luminosidade que incide sobre sua superfície são maiores. Somado a estas condições, o crescimento celular das cianobactérias está intimamente ligado as concentrações de fósforo e nitrogênio presentes na água (DOLMAN et al., 2012), e quando estas chegam a alcançar números extremos induzem o crescimento exacerbado das cianobactérias, podendo aumentar a densidade celular em até 500% (SANT’ANNA et al., 2007), este fenômeno é denominado de floração de cianobactérias. A FIGURA 6 apresenta a extensão de uma http://www.webexhibits.org/causesofcolor/5D.html 29 floração, mostrando algumas imagens de florações de cianobactérias obtidas por satélites da NASA. O Lago Erie, localizado na Região dos Grandes Lagos, apresenta uma floração de cianobactérias recorrente, como nos mostra a figura abaixo. A Região dos Grandes Lagos, representa aproximadamente 20% da água doce superficial presente no mundo e 84% da água superficial que abastece cerca de 35 milhões de pessoas da América do Norte (CARMICHAEL; BOYER, 2016). FIGURA 6 - Imagens de Florações de Cianobactérias obtidas por satélites. Lago Eire (EUA), Mar de Bering (Alasca), Golfo do México e Costa da Argentina. Fonte: NASA Goddard Space Flight Center/Flickr Desta forma, a maioria das florações de cianobactérias é uma preocupação mundial recorrente, gerando custos socioeconômicos e ecológicos altíssimos (IBELINGS et al., 2016), uma vez que o abastecimento público de água, o turismo (em áreas de recreação) e a pesca são amplamente prejudicados. Além disto, estas florações causam o desequilíbrio da cadeia alimentar, pois o excesso de matéria orgânica contribui para a anoxia e morte dos peixes (IBELINGS et al., 2016). Ademais, um dos maiores perigos é que algumas espécies de cianobactérias, presentes na maioria destas florações, produzem metabólitos tóxicos, denominados cianotoxinas, que causam efeitos agudos ou crônicos na saúde humana e de outros organismos vivos (GUPTA et al., 2001). 30 1.5. Cianotoxinas As cianotoxinas são mundialmente conhecidas por prejudicar a saúde humana. Estas toxinas podem causar irritações na pele através do contato com as mesmas, ou até intoxicações gastrointestinais crônicas e agudas, quando ingeridas, levando a morte dos indivíduos intoxicados. Além disto, as cianotoxinas são responsáveis por causarem adoecimento ou a morte de animais domésticos e selvagens (CARMICHAEL, 1997). As cianotoxinas geralmente são agrupadas de acordo com seus principais efeitos toxicológicos, sendo classificadas em: neurotoxinas, dermatotoxinas, citotoxinas e peptídeos hepatotóxicos (MEREL et al., 2013). 1.5.1. Neurotoxinas As neurotoxinas são alcaloides, que atuam como potentes bloqueadores neuromusculares que promovem a obstrução dos impulsos nervosos, causando a fasciculação muscular, diminuição da circulação sanguínea, cianose, paralisia e asfixia, provocando a morte do indivíduo em minutos ou horas, dependendo da quantidade de toxina ingerida (ARÁOZ; MOLGÓ; TANDEAU DE MARSAC, 2010). Os principais gêneros de cianobactérias responsáveis pela produção das neurotoxinas são: Anabaena sp., Oscillatoria sp., Planktothrix sp., Aphanizomenon, entre outras (DITTMANN; FEWER; NEILAN, 2013). A FIGURA 7 apresenta estruturas das neurotoxinas anatoxina-a, anatoxina-a (s) e a saxitoxina. FIGURA 7 - Estrutura química das neurotoxinas Anatoxina, Anatoxina-a (s) e Saxitoxina. 31 1.5.2. Dermatotoxinas As dermatotoxinas causam irritação e respostas alérgicas quando entram em contato com a pele de humanos ou animais. Se ingeridas, podem causar neutropenia, trombocitopenia e mudanças metabólicas como alcalose e acidose (KAUSHIK; BALASUBRAMANIAN, 2013). As primeiras espécies estudadas quanto a produção destas cianotoxinas foram dos gêneros Microcystis, Anabaena e Anacystis (RZYMSKI; PONIEDZIAŁEK, 2012). As dermatotoxinas são lipossacarídeos (LPS), componentes da parede celular das cianobactérias. Essas moléculas possuem em sua estrutura carboidratos (geralmente hexoses) e lipídeos, com cadeias de 14 a 18 carbonos (FIGURA 8) (RZYMSKI; PONIEDZIAŁEK, 2012). FIGURA 8 - Estrutura química de um lipossacarídeo (LPS) 1.5.3. Citotoxinas As citotoxinas agem diretamente na síntese de proteínas, causando a inibição da produção proteíca. Além disto, provocam a quebra das cadeias de DNA das células, acarretando problemas na divisão celular, o que pode levar a genotoxidade, hepatotoxidade e citotoxidade das células do indivíduo intoxicado (WESTRICK et al., 2010). 32 Um exemplo de citotoxina é a cilindrospermopsina (FIGURA 9). Esta citotoxina pode ser produzida pelas espéries: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans e Aphanizomenon ovalisporum (ŽEGURA; ŠTRASER; FILIPIČ, 2011). FIGURA 9 - Estrutura química da cilindrospermopsina 1.5.4. Peptídeos Hepatotóxicos As nodularinas e as microcistinas são as principais classes de peptídeos hepatotóxicos presentes nas florações de cianobactérias (RUNNEGAR; FALCONER; SILVER, 1981). Estas toxinas chegam ao fígado pelo transporte dos ácidos produzidos pela bile. Uma vez no citoplasma dos hepatócitos, os peptídeos hepatotóxicos inibem as atividades das enzimas serina/treonina fosfatases PP1 e PP2, induzindo a concentração de proteínas fosforiladas, resultando no descontrole da divisão celular, acarretando a promoção tumoral do fígado. A exposição aguda as microcistinas pode conduzir a necrose e a hemorragia intra-hepática, levando a morte dos indivíduos intoxicados, enquanto que a exposição crônica pode ocasionar neoplasia intestinal ou hepática (RUNNEGAR; FALCONER; SILVER, 1981). A FIGURA 10 apresenta dois hepatócitos isolados, incubados por 30 minutos, em duas soluções sendo uma na ausência e na presença de microcistinas. Podemos observar, na FIGURA 10(a), que o hepatócito que não entrou em contato com a microcistina, apresenta-se normal. Já o hepatócito da FIGURA 10(b) que foi submetido à presença de microcistinas sofreu severa degeneração e necrose (RUNNEGAR; FALCONER; SILVER, 1981). 33 FIGURA 10 - Hepatócitos isolados incubados na ausência ou presença de microcistina: (a) hepatócito controle; (b) hepatócito incubado por 30 minutos na presença de microcistina. Fonte: Microcystin Toxicity - Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies. 1.5.4.1. Microcistinas A classe das microcistinas (MC’s) é a mais tóxica e mais recorrente toxina presente nas florações de cianobactérias (PUDDICK et al., 2013), sendo produzida por inúmeros gêneros, como: Microcystis, Anabaena, Nostoc, Plantothrix, Oscillatoria (PRAKASH; LAWTON; EDWARDS, 2009)(YANG et al., 2014). As MC’s são heptapeptídeos cíclicos, que possuem em sua estrutura: quatro D- aminoácidos, dois L-aminoácidos variáveis (nas posições 2 e 4), e um amino ácido não usual, o Adda (ácido 2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metóxi-2,6-trimetil-8,10-deca-4,6- dienóico), apresentado na FIGURA 11. FIGURA 11 - Estrutura da microcistina-LR (MC-LR). Em azul: L-aminoácidos, posição 2, L e posição 4 R. Em vermelho: Adda, em preto: os quatro D-aminoácidos, posição 1, 3, 6 e 7. Posição 2 Posição 1 Posição 3 Posição 4 Posição 5 Posição 6 Posição 7 34 A nomenclatura das MC’s é baseada em suas principais variações estruturais. Os aminoácidos presentes na posição 2 e 4, definem parte de sua nomenclatura, por exemplo, a MC-LR possui o aminoácido leucina (L) na posição 2 e a arginina (R) na posição 4 (FERRANTI et al., 2013). Outros exemplos de estruturas de variantes de MC’s e suas nomenclaturas estão apresentadas na FIGURA 12. Por exemplo, a [D- Asp3] Microcistina-LR, não possui a metila no aminoácido asparagina, na posição 3. Assim como a [D-Asp3, ADMAdda5] Microcistina-RR, que possui acetilação no aminoácido Adda, na posição 5. Dentre todas as modificações possíveis, atualmente, aproximadamente 100 variantes de MC’s foram caracterizadas (CARMICHAEL; BOYER, 2016). FIGURA 12 - Estruturas de algumas microcistinas e sua nomenclatura. A toxicidade de cada microcistina varia de acordo com a sua estrutura. Por exemplo: a [(6Z)-Adda5] MC-LR, possui dose letal (LD50) >1200 µg/kg. No entanto, a MC-LR, considerada a mais tóxica das MC’s, possui LD50=50µg/kg (HOWARD; BOYER, 2007). Devido à alta toxicidade desta MC, a Organização Mundial da saúde recomenda que a concentração de MC-LR em água potável não exceda 1,00 μg/L (EPA, 2015). Considerando tal fato, a informação de quais variáveis de MC´s estão presentes nas florações de cianobactérias é de extrema importância, sendo então necessário o uso de técnicas capazes de realizar não somente a detecção das MC’s, 35 mas também com a capacidade de identificá-las de acordo com suas variáveis estruturais. 1.5.4.2. Nodularinas Assim como as microcistinas, as nodularinas também são peptídeos cíclicos, no entanto possuem cinco aminoácidos em sua estrutura (SARMA, 2013). Apresenta o aminoácido Adda, e apenas um aminoácido variável, na posição 4. A nomenclatura deste peptídeo também é baseada de acordo com este aminoácido variável e de acordo com os diferentes graus de metilação que a estrutura pode conter (PAERL; OTTEN, 2013). A FIGURA 13 apresenta duas estruturas diferentes de nodularinas e sua nomenclatura. A nodularina-R apresenta o aminoácido arginina (R) na posição 4, e a nodularina-Har possui o aminoácido homoarginina nesta mesma posição. Sete variantes desta classe de cianotoxinas foram caracterizadas até o momento (SANT’ANNA et al., 2007). FIGURA 13 - Estururas e nomenclatura da nodularins- R e nodularina-Har. 36 1.6. Quantificação de Microcistinas: a importância, métodos utilizados e seus desafios O lançamento do esgoto das cidades em rios e lagos é um dos maiores responsáveis pela formação das florações de cianobactérias em todo o mundo. A falta de tratamento ou o tratamento inadequado do esgoto no Brasil carreia os nutrientes fósforo e nitrogênio para os corpos d’água, o que induz o crescimento exacerbado das cianobactérias (DOLMAN et al., 2012). Com o crescimento demográfico, o aumento da produção industrial e desenvolvimento da agricultura, onde o uso de agroquímicos é utilizado, a partir da década de 90 as florações de cianobactérias começaram a ser frequentes em algumas regiões do país (CARNEIRO et al., 2012). No início de 1996, ocorreu um caso de extrema relevância no Estado de Pernambuco. Na cidade de Caruaru, 126 pacientes renais crônicos passaram a apresentar um quadro clínico de hepatotoxitose após terem sido submetidos às sessões de hemodiálise (CARVALHO et al., 2016)(LONE; KOIRI; BHIDE, 2015). Destes, 60 pacientes vieram a óbito. Com o conhecimento prévio da ocorrência de florações de cianobactérias em mananciais de abastecimento de água da região, foi conjecturada a hipótese dessas intoxicações terem sido causadas por hepatotoxinas presentes na água utilizada durante as sessões de hemodiálise (LONE; KOIRI; BHIDE, 2015). As análises confirmaram a presença de MC’s na água utilizada na clínica, especificamente as MC-LR, MC-YR e MC-AR (POURIA et al., 1998), bem como em amostras de sangue e fígado dos pacientes intoxicados (CARMICHAEL et al., 2001). Os níveis de MC’s em amostras ambientais são geralmente monitorados através diferentes técnicas analíticas. Ensaios bioquímicos, como testes imuno enzimáticos (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - ELISA) (QIAN et al., 2015) ou de inibição da proteína fosfatase (PPIA) (LAMBERT et al., 1994) são amplamente utilizados para detecção e quantificação de MC´s, devido à alta sensibilidade que apresentam. No entanto estas técnicas podem obter resultados falso positivos, ou falso negativos, além disto, não são capazes de identificar as diferentes variáveis estruturais de cada MC. Atualmente, outras metodologias têm sido relatadas na literatura, tais como o desenvolvimento de imuno sensores eletroquímicos não-enzimáticos, que utiliza nanopartículas de Ag (ZHAO et al., 2016), ou também imuno ensaios colorimétricos, 37 baseado em contas magnéticas usando anti-corpos conjugados com nano partículas de ouro (NEUMANN et al., 2016). Além disso, técnicas hifenadas, tais como eletroforese capilar (VASAS et al., 2006), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (CONG et al., 2006) ou ultra- cromatografia líquida de alta eficiência (UPLC) (LI et al., 2011) também têm sido estudadas. No entanto, estas técnicas requerem muito tempo para manipulação das amostras, tais como extração e pré-concentração das mesmas. E os tempos das eluições cromatográficas para análises de MC, quando se utiliza a técnica HPLC, são demasiadamente longos, com tempo de aproximadamente de trinta minutos (RAMOS et al., 2000). Alguns avanços foram obtidos usando UPLC, em que o tempo de execução da análise durou cerca de oito minutos para a quantificação de MC-LR em água de torneira (LI et al., 2011). Para a análise de MC’s, HPLC ou UPLC comumente são acoplados a UV-vis, Espectrometria de Massas (MS) ou Tandem Mass Spectrometry (MS/MS ou MS2). Diferentes das análises por UV-vis, as análises realizadas por MS podem identificar diferentes variantes de MC’s, fornecendo informações de MC já conhecidas, de acordo com os sinais de m/z característicos de cada uma delas, ou ainda pode auxiliar na elucidação de novas estruturas, utilizando análises de MS/MS como ferramenta. Uma técnica eficiente para a análise de MS de MC’s presentes em florações de cianobactérias, é a Matrix Assistided Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS) (QUESADA, 2014). A técnica MALDI-MS é extremamente rápida, possui alta resolução e requer pouquíssimo preparo de amostra. Além disto, não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfira na análise e possui baixo consumo de reagentes (QUESADA, 2014). Por estes motivos MALDI-MS tem sido amplamente utilizada não somente na detecção de diferentes variantes de MC’s, mas também para quantificação das mesmas, pois possui alta detectibilidade e é capaz de identificar as MC’s diretamente de amostras ambientais de florações, sem a necessidade da extração destas substâncias em laboratório (WEHR et al., 2015). Os detalhes dos princípios da técnica MALDI-MS serão descritos no próximo tópico desta tese. 38 1.6.1. Matrix Laser Assisted Desorption/Ionization (MALDI) A fonte de ionização MALDI foi desenvolvida pelos pesquisadores Michel Karas e Franz Hillenkamp, na Universidade de Münster, Alemanha. Em 1987, foi publicado o artigo que descreveu por completo os princípios desta técnica que recebeu grande destaque, pois MALDI-MS tornou possível a ionização de moléculas com massa molecular acima de 10.000 Da, termo lábeis e não voláteis (KARAS; HILLENKAMP, 1988). Com o passar dos anos, os princípios que foram detalhados neste artigo tiveram nenhuma ou pouquíssimas adições e correções. No entanto, a configuração dos equipamentos e as aplicações da técnica aumentaram exponencialmente. O processo de ionização por MALDI-MS, apresentado na FIGURA 14, ocorre pela incidência de um laser em uma mistura sólida, co-cristalizada de matriz/analito. Esta mistura é realizada sobre uma placa de metal (geralmente aço). Após a cristalização matriz/analito a placa de MALDI-MS é levada para dentro do espectrômetro de massas, onde a ionização ocorre em alto vácuo. A ionização por MALDI-MS ocorre a partir da incidência do laser sobre a mistura matriz/analito. A matriz absorve a energia do laser no comprimento de onda utilizado, fazendo com que ocorra a dessorção e a ionização do analito (GREAVES; ROBOZ, 2014). Os detalhes dos princípios da técnica serão descritos a seguir. FIGURA 14 - Representação da fonte de ionização MALDI-MS. Fonte: Milagre, H.M.S. 39 1.6.1.1. Principais componentes da fonte de ionização MALDI: o comprimento de onda do laser O comprimento de onda do laser utilizado é um importante parâmetro na técnica MALDI-MS. A escolha das matrizes de MALDI-MS que serão utilizadas está intimamente ligada ao tipo de lazer que o equipamento possui. Existem inúmeros tipos de laser, que variam sua natureza química e principalmente o comprimento de onda que emitem. A grande maioria dos equipamentos de MALDI-MS utilizam o laser de nitrogênio, com comprimento de onda utilizado de 337 nm. Neste caso consideramos a técnica como UV-MALDI, comumente utilizada com as matrizes α-ciano-4-hidroxicinamico e o ácido 2,5- dihidroxibenzóico, compatíveis com a absorção de energia no comprimento de onda utilizado (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). No entanto, outros comprimentos de onda podem ser utilizados, como por exemplo 2,79 µm, referente ao laser Er:YSSG, considerados como IR-MALDI (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). 1.6.1.2. Principais componentes de MALDI – Matrizes, suas estruturas e funções A fonte de ionização MALDI, como o próprio nome define, utiliza uma matriz que assiste à ionização. A matriz possui o principal papel de absorver a energia do laser, para então, dessorver e ionizar o analito. As matrizes de MALDI-MS geralmente são compostos orgânicos de baixa massa molecular, e possuem a capacidade máxima de absorção de energia no comprimento de onda do laser utilizado. Estas matrizes devem apresentar algumas características, tais como: ser estáveis nas condições de vácuo utilizadas pelo equipamento e não podem reagir com o analito (HOSSAIN; LIMBACH, 2010). Apesar de toda versatilidade da técnica MALDI-MS ainda não foi possível o desenvolvimento de uma matriz universal que seja aplicável aos diferentes analitos e aos diversos propósitos analíticos designados para MALDI-MS. O que existem são matrizes distintas de primeira escolha para determinadas classes de compostos (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). Como por exemplo, o ácido 3-hidroxi- picolínico, utilizado nas análises de ácidos nucleicos, ou os ácidos α-ciano-4- hidroxicinâmico e o 2,5-diidroxibenzóico que geralmente são empregados nas 40 análises de peptídeos e proteínas. As estruturas destes compostos estão apresentadas na FIGURA 15. FIGURA 15 - Principais matrizes utilizadas em UV-MALDI. 1.6.1.3. Mecanismos de ionização por MALDI Os mecanismos de dessorção/ionização são complexos e ainda não foram totalmente elucidados (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). Portanto, inúmeros são os trabalhos que discutem tais processos. Os espectros gerados por MALDI-MS apresentam preferencialmente íons monocarregados, com sinais de m/z de íons do analito carregados por prótons [M+H]+, ou por adutos metálicos como, por exemplo, com sódio [M+Na]+ ou potássio [M+K]+. Para explicar o mecanismo de formação destes íons monocarregados, dois modelos diferentes foram propostos, ‘lucky survivor’ e ‘Gas phase protonation’, que serão detalhados abaixo. a) ‘Lucky survivors’ (KARAS, 2000) O modelo ‘lucky surviviors’ explica a formação de íons monocarregados, [M+H]+. M. Karas e colaboradores (2000) detalharam tal modelo, que é baseado desde o preparo da amostra, até a ionização dos analitos. Neste modelo, considera-se que inicialmente, há uma mistura sólida de matriz/analito, na qual as moléculas do analito estão isoladas uma das outras. Isto ocorre devido à alta concentração da matriz, considerada muito maior que a concentração do analito. Além disto, é considerado que as moléculas dos analitos mantêm o estado de carga que possuem quando as mesmas estão em solução. Então o pH é aproximadamente conservado dentro dos cristais da matriz. Desta maneira, o excesso 41 de carga positiva presente em torno do analito é contrabalanceada com contra-íons, sendo eles os ânions da matriz, ou contaminantes da mesma, tais como Cl-. A incidência do pulso do laser, que ocorre sobre a mistura matriz/analito, faz com que ocorra a absorção da energia do laser pela matriz, possibilitando a ablação/dessorção de pequenos clusters de matriz/analito. O excesso de energia absorvida pela matriz permite que ocorra uma série de reações de neutralização, que resultam em espécies mais estáveis. Ou então, tal energia gera a dessolvatação e a evaporação de moléculas neutras e espécies iônicas presentes nestes clusters, de tal forma que a maioria das moléculas são neutralizadas e, o estado de carga dos íons de analito pré-formados em solução são mantidos. Estes íons monocarregados, são denominados de ‘lucky survivors’. b) ‘Gas phase protonation’ (KARAS; KRU, 2003; KNOCHENMUSS; ZENOBI, 2003) Diferentemente do ‘Lucky survivors’, o modelo ‘Gas phase protonation’ considera que as moléculas dos analitos estão neutras em solução sólida com a matriz. Então, após a absorção da energia do laser pela matriz ocorre a ablação/dessorção destes compostos. O excesso de energia absorvida é dissipado provocando sucessivas colisões das moléculas de analito com as moléculas de matriz, resultando na transferência de próton da matriz para o analito, gerando assim, íons monocarregados. Em 2011, os pesquisadores M.Karas e T. W. Jaskolla, publicaram um estudo mais aprofundado sobre como ocorre a formação de íons por MALDI-MS, neste trabalho conseguiram concluir que os dois modelos ‘Lucky survivors’ e ‘Gas phase protonation’ contribuem para o processo de ionização por MALDI-MS, então formularam o ‘Mecanismo unificado de ionização do analito por MALDI-MS’ (JASKOLLA; KARAS, 2011), apresentado na FIGURA 16. Neste trabalho, os pesquisadores verificaram que alguns parâmetros, tais como a influência do laser, a afinidade por prótons tanto do analito quanto o da matriz; assim como a composição e o tamanho dos cristais formados no preparo de amostra, podem influenciar no mecanismo de ionização do analito. Por exemplo, o processo ‘Gas phase protonation’ preferencialmente ocorre quando matrizes com maior reatividade e menor afinidade por prótons são utilizadas, como por exemplo α-ciano- 42 4-clorocinâmico. Entretanto, peptídeos de maior massa molecular, analisados com CHCA como matriz, são 90% ionizados de acordo com o processo ‘Lucky survivors’(JASKOLLA; KARAS, 2011). FIGURA 16 - Mecanismo Unificado de ionização do analito por MALDI-MS. 1.6.1.4. Metodologias de preparo de amostra para análise por MALDI-MS. Para uma amostra ser analisada por MALDI-MS apenas um pequeno volume da solução de analito e matriz é necessário. A solução de analito, com concentração em torno de 10-6 mol/L, geralmente é misturada com a solução da matriz com concentração próxima a saturação, 0,10 mol/L (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). Essa mistura pode ser realizada de diversas maneiras dependendo do modo de preparo escolhido. O preparo de amostra, que envolve a homogeneização da mistura matriz/analito e a cristalização da mesma, é considerado a etapa mais importante em uma análise por MALDI-MS, pois a qualidade deste preparo terá influência direta na qualidade dos espectros obtidos (HOSSAIN; LIMBACH, 2012). Os métodos de preparo de amostras para análise por MALDI-MS visam à redução da complexidade da mesma, minimizando ou eliminando sinais que podem interferir na análise a ser realizada. Tais métodos devem ser altamente reprodutíveis e não podem introduzir contaminantes na amostra, resultando em uma maior variabilidade nas intensidades dos sinais dos analitos (DUNCAN; RODER; HUNSUCKER, 2008). Cluster de matriz com o íon pré-formado do analito Sítio Básico Mobilidade de carga Amida da ligação Peptídica 43 Devido a versatilidade da técnica MALDI-MS, existem inúmeros protocolos de preparo de amostra relatados na literatura que podem ser utilizados de acordo com o objetivo a ser atingido. Alguns exemplos destes protocolos serão descritos a seguir. 1) Dried droplet: este preparo de amostra foi originalmente publicado pelos pesquisadores Karas e Hillekamp no ano de 1988. Nesta técnica, a matriz e a amostra são preparadas em um mesmo sistema de solventes. Em seguida, 1,00 µL de cada uma destas soluções são misturadas, e adicionadas sobre a placa de MALDI e então, esta mistura é cristalizada a temperatura ambiente (KARAS; HILLENKAMP, 1988). 2) Vacuum-drying: este método de preparo de amostra é apenas uma variação do Dried droped. A mistura matriz/amostra também ocorre antes da aplicação da mesma na placa de MALDI, no entanto, a gota é cristalizada dentro de um dessecador, sob vácuo. Isto ocorre com a finalidade de reduzir o tamanho dos cristais, e consequentemente aumentar a homogeneidade matriz/amostra (PAPAC; WONG; JONES, 1996). 3) Vacuum-drying adaptado: método adaptado no grupo Milagre de pesquisa. Nesta técnica o preparo de amostra é baseado no método Vaccum-drying. A diferença é que no Vaccum-Drying adaptado a amostra e a matriz são adicionadas na placa de MALDI em momentos distintos, de modo que 1,50 µL de amostra é depositada na placa, e é secada em um dessecador sob vácuo. Em seguida, a matriz é adicionada sobre a amostra, e a placa novamente é colocada sob vácuo, para que a mistura matriz/amostra cristalize (SANDONATO. B. B, 2013). A cristalização e a homogeneização da mistura matriz/amostra são variáveis que devem ser observadas durante o preparo de amostra. Cristalizações rápidas geram cristais menores e uma incorporação mais homogênea do analito na estrutura cristalina da matriz, ao passo que uma cristalização demorada resulta em cristais maiores e a incorporação do analito na amostra pode ocorrer de forma altamente variável (DUNCAN; RODER; HUNSUCKER, 2008). O resultado da formação e deposição dos cristais sobre a placa de MALDI depende intimamente da matriz escolhida e da tensão superficial criada pelo sistema matriz/analito/solvente, que pode acarretar a distribuição não uniforme dos cristais formados sobre o spot (HILLENKAMP; PETER-KATALINIC, 2007). 44 Os espectros obtidos com melhor qualidade, claramente são gerados onde a incidência do laser ocorre sobre os locais do spot onde há maior concentração de cristais. Então, quando não há homogeneidade na cristalização a qualidade das análises realizadas requer a interferência manual do analista que controla o experimento. Alguns equipamentos possuem um microscópio, que torna capaz a observação do sistema e auxilia na aquisição dos espectros. No entanto, em alguns casos, a aquisição ocorre de maneira subjetiva, pois não há meios de observar os locais que possuem maior concentração de cristais (HILLENKAMP; PETER- KATALINIC, 2007). A FIGURA 17 apresenta nitidamente as irregularidades que podem ocorrer na cristalização da mistura matriz/amostra e a variabilidade dos espectros obtidos. A irregularidade na cristalização matriz/analito faz com que a baixa reprodutibilidade shot-to-shot (referentes aos pulsos do laser que incide sobre a mistura analito/matriz) e ‘spot-to-spot’ (devido à dificuldade de obter cristalizações iguais para diferentes spots) sejam problemas inerentes da técnica MALDI-MS. Resultando num grande desafio que leva os pesquisadores da área buscar e criar novas metodologias para resolver estes problemas, desde criar e adaptar novos protocolos de preparo de amostra, até testar e desenvolver diferentes matrizes. FIGURA 17 - Representação da formação de ‘hot-spots’ e a variabilidade dos espectros obtidos, dependendo do local onde o laser incide. Fonte: Bronzel, 2015 - adaptado. 45 Estes incovenientes foram solucionados, em parte, pelo uso de um padrão interno. Para a quantificação de microcistinas, o padrão interno utilizado pelos pesquisadores é a Angiotensina I ou a Bradicinina (PUDDICK et al., 2012). Para melhorar a homogeneidade na cristalização da matriz, este capítulo apresenta o desenvolvimento de um método de quantificação de MC’s possibilitando uma melhor homogeneidade de cristais por todo o spot, assim como sua reprodutibilidade em outros spots, como mostram os resultados gerados. 1.6.2. A aplicação de MALDI-MS como ferramenta para a quantificação de microcistinas A partir das informações relatadas na introdução deste capítulo, temos que a identificação e quantificação dos diferentes tipos de MC’s são de extrema importância e de grande interesse. No entanto, a técnica MALDI-MS possui alguns inconvenientes quando utilizada para quantificação, devido à baixa reprodutibilidade shot-to-shot e spot-to-spot. Para solucionar esse problema, várias abordagens estão descritas na literatura, como por exemplo, procedimentos empíricos como a seleção matriz e otimização do protocolo de preparação de amostras (PUDDICK et al., 2012). Outra alternativa utilizada é a combinação de diferentes matrizes para aumentar a homogeneidade da distribuição da amostra ao longo da superfície do spot e aumentar a reprodutibilidade spot-to-spot (PAPAC; WONG; JONES, 1996). Neste contexto, este capítulo tem o objetivo de desenvolver um método para a quantificação de MC’s e diferentes peptídeos por MALDI-TOF-MS, utilizando uma combinação de duas matrizes de MALDI. 46 2. Objetivos Este capítulo tem como objetivo o desenvolvimento de um sistema de matrizes binárias para a quantificação de microcistinas por MALDI-MS. A metodologia desenvolvida visa a homogeneidade matriz/amostra ao longo de todo o spot, afim de reduzir ao máximo os desafios inerentes a esta técnica de ionização. Além disto, este capítulo visa o desenvolvimento de um método extremamente rápido e eficiente para a quantificação de diferentes variantes de MC’s e outros peptídeos utilizando MALDI-TOF-MS, testanto diferentes matrizes e sistemas binário. 47 3. Materiais e Métodos 3.1. Padrões químicos, solventes e matrizes As matrizes ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA), ácido α-ciano-4- benziloxicinâmico, ácido α-ciano-4-fenilcinâmico, ácido cafeico, ácido cumarico, ácido ferúlico, ácido sinapínico (SA), ácido 2,5-dihidroxi-benzoico (DHB) e acetato de angiotensina I humana ≤ 90%, MC-LR, MC-RR, MC-YR, foram obtidas pela empresa Sigma-Aldrich. O ácido α-ciano-4-clorocinamico foi obtido pela Santa Cruz Biotechnology (Dallas, USA). Água ultrapura (com resistividade>18MΩ_cm) e os solventes (HPLC grade) foram utilizados para o preparo de todas as soluções. 3.2. Parâmetros utilizados pelo Equipamento As análises foram realizadas no equipamento MALDI-TOF-MS Micromass- Waters (M@LDI-LR, Manchester, Reino Unido). Os espectros foram adquiridos no modo reflecton e positivo, com as voltagens do equipamento conforme descritas na Tabela 2. O laser utilizado foi o de nitrogênio ( = 337 nm). O equipamento foi calibrado com polietilenoglicol (PEG) no intervalo entre m/z 600-1250, para resolução acima de 10000. Para realizar as análises utilizou-se uma placa de MALDI de aço inoxidável de 96 spots (Micromass®, Manchester, Reino Unido). Cada um dos spots possui a capacidade de 1.50 µL, e a placa possui 4.00x5.50 cm de dimensão. Todos os espectros obtidos foram tratados no software Masslynx 4.0 (Waters, Manchester, Reino Unido). Tabela 2 - Parâmetros utilizados para as análises por MALDI-TOF. Parâmetros Voltagens (V) Tensão de pulso 2500 Tensão do reflecton 2000 Tensão da fonte 15000 Tensão do MCP (microchannel plate - detector) 18000 48 3.3. A energia do laser utilizada Com o objetivo de obter os melhores e reprodutivos espectros possíveis, primeiramente a energia ótima do laser foi avaliada para cada matriz, e então fixada para todas as análises que foram realizadas posteriormente. No equipamento utilizado existe três opções de níveis de energia de laser fornecidos para a análise: alta, média e baixa, e cada um destes níveis, possuem o ajuste fino representado em porcentagem (%), em um intervalo de 0-100% para cada um deles. Então, para as matrizes: CHCA, ácido α-ciano-4-cloro-cinâmico, ácido α-ciano- 4-benziloxicinâmico, ácido α -ciano-4-fenil-cinâmico e ácido sinapínico o laser foi definida em baixa potência; para a matriz de ácido ferúlico e ácido cumárico, a potência do laser foi definida no médio, e para o ácido cafeico, em alta potência. 3.4. Preparo das soluções de matriz Matriz individual: todas as soluções de matriz foram preparadas em 70% de acetonitrila, 30% de água deionizada e 0,10% de ácido trifluoroacético. Todas as soluções de matriz foram preparadas na concentração de 20,00 mg/mL. 3.5. Sistemas de Matrizes Binárias Com o objetivo de otimizar o método de preparo de amostra para a análise quantitativa de MC’s por MALDI-TOF-MS foram utilizados diversos sistemas de matrizes binárias combinando as matrizes α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA), ácido gentísico (DHB), ácido α-ciano-4-clorocinâmico, ácido α-ciano-4-benziloxicinâmico e ácido sinapínico (SA). 3.6. Soluções Padrão Todas as soluções padrão foram preparadas em metanol/água 40% (v/v). Cada uma delas foram misturadas na proporção 9:1 (v/v) com uma solução de contendo Angiotensina I (Padrão Interno) e ZnSO4, de modo que a concentração final destes compostos eram de 2,50 μmol/L e 5,00 mmol/L respectivamente. 49 Para medir a precisão das matrizes avaliadas, foi calculado o coeficiente de variação para cada uma delas, utilizando 2,50 μmol/L de MC-RR. A matriz individual e matriz binária que apresentaram melhores dados de precisão foram selecionadas para construir curvas de calibração para uma delas, utilizando como padrões as MC- RR, MC-LR e MC-YR, nas concentrações 10,00, 7,00, 5,00, 2,50, 1,00, 0,50, 0,10 μmol/L. 3.7. Preparo de amostra O método de preparo de amostra utilizado foi o Vaccum Drying Modificado (SANDONATO. B. B, 2013). Inicialmente 1,00 µL de amostra foi aplicado sobre um spot da placa de MALDI, em seguida foi realizada a secagem da amostra em um dessecador acoplado a uma bomba de vácuo (Tecnal, modelo TE-058). Após a secagem da amostra, 1,50 µL de solução da matriz foi adicionado por cima da amostra seca, e então a placa foi novamente levada para a o vácuo, onde ocorreu a cristalização da mistura matriz/amostra. 3.8. Tratamento estatístico dos dados obtidos Foram testados neste capítulo, dois métodos diferentes para a quantificação de microcistinas, o primeiro utilizando diferentes matrizes de MALDI-MS e o outro utilizando sistemas de matrizes binárias. Para avaliar a precisão destes métodos o coeficiente de variação (CV) foi calculado para cada deles. Os CVs foram calculados com base nas análises, realizadas em quadruplicata, a partir da relação entre o desvio padrão e a média, obtidos pela razão entre as intensidades dos sinais das análises de MC-RR (2,50 µmol/L) e do padrão interno, Angiotensina I (2,50 µmol/L), de acordo com a equação: CV= (s/X)*100 O limite de detecção (LD) foi calculado utilizando a equação abaixo. 𝐿𝐷 = (3,14∗𝑠)−𝑏 𝑚 50 Todos os fatores desta equação foram obtidos através de uma curva de calibração, construída no intervalo de x0 à xs, sendo x0 o branco, e xs uma amostra de concentração igual a 0,10 µmol/L. Os valores de 𝑚 e 𝑏 são os respectivos coeficientes angular e linear desta curva, e 𝑠 é o valor obtido do desvio padrão de sete replicatas de xs. 3,14 é o valor de one- tailed-t-test com 99% de confiança. O limite de quantificação do método (LQ) é calculado com estes mesmos valores, no entanto o fator de multiplicação é 10 ao em vez de 3,14. 51 4. Resultados e Discussões Até o presente momento, os métodos de quantificação de microcistinas descritos na literatura foram desenvolvidos a partir de diferentes protocolos de preparo de amostra já descritos em estudos anteriores (PUDDICK et al., 2012). Entretanto, este é o primeiro trabalho no qual diferentes matrizes, e diferentes sistemas de matrizes binárias foram avaliadas, fixando o preparo de amostra. Neste trabalho as matrizes foram selecionadas com base na estrutura da matriz de MALDI-MS do ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico, amplamente utilizada nas análises de peptídeos, sendo a principal matriz utilizada para análise de MC’s (Tabela 3). Os ácidos α-ciano-4-fenil-cinâmico, ácido α-ciano-4-benziloxi-cinâmico, ácido α-ciano-4- cloro-cinâmico, diferem pelo grupo ligado na posição R2. Os ácidos ferúlico, cafeico e cumárico, não possuem o grupo ciano ligado na posição α à carboxila, e têm grupos diferentes ligados nas posições R1, R2 e R3. A matriz DHB foi escolhida para ser testada neste trabalho por ser amplamente utilizada nas análises de peptídeos por MALDI-TOF-MS. Tabela 3 - Estruturas das matrizes de MALDI-MS utilizadas neste trabalho. Matriz R1 R2 R3 R4 Ácido α-ciano-4-hidróxi-cinâmico H OH H CN Ácido α-ciano-4-cloro-cinâmico H Cl H CN Ácido α-ciano-4-benziloxi-cinâmico H Benziloxi H CN Ácido α-ciano-4-fenil-cinâmico H Ph H CN Ácido sinapínico CH3O OH CH3O H Ácido ferúlico CH3O OH H H Ácido cafeico OH OH H H Ácido cumárico H OH H H OH O R4 R1 R2 R3 52 Para avaliar o desempenho de cada matriz testada, foram realizadas análises que utilizaram a MC-RR (m/z 1038.62), obtida comercialmente, como analito, e Angiotensina I (m/z 1296.71) como padrão interno. A FIGURA 18 apresenta um espectro obtido em uma destas análises. Neste espectro estão apresentados os sinais de m/z de cada padrão e abaixo, a respectiva intensidade obtida para cada um deles. FIGURA 18 - Espectro MALDI-(+)-TOF/MS obtido pela análise de MC-RR (2.50 µmol/L) e da Angiotensina I (2.50 µmol/L). m/z 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 1200 1220 1240 1260 1280 1300 1320 1340 % 0 100 MCRR2.5_ANG2.5_f1_a 3 (0.108) Sb (1,40.00 ); Cm (2:9) TOF LD+ 2.36e31296.71 2364 1038.62 1553 1039.62 977 1040.61 342 1041.63;80 1297.72 1739 1298.72 914 1299.73 258 53 A Tabela 4 apresenta as imagens de microscopia óptica das cristalizações obtidas para cada uma das matrizes utilizadas e os CV’s obtidos para cada uma delas. Tabela 4 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes utilizadas, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L). Matriz Coeficiente de variação (%) 1 Ácido ferúlico 10,50 2 Ácido sinapínico 4,90 3 Ácido α-ciano-4-cloro- cinâmico 12,00 4 Ácido α-ciano-4-benziloxi- cinâmico 7,00 5 Ácido α-ciano-4-fenil- cinâmico 34,60 6 Ácido cafeico 19,30 7 Ácido cumárico 7,10 8 Ácido gentísico 10,00 54 Assim a homogeneidade matriz/amostra também é diferenciada, e diferentes valores de coeficientes de variação (CV’s) são obtidos. Consequentemente, o uso de uma matriz distinta pode tornar um método mais preciso que o outro, podendo gerar maior homogeneidade dos dados, e menores valores de CV’s. Nas imagens dos spots apresentados na Tabela 4, fica clara a existência de irregularidades na cristalização das matrizes, o que provoca a formação dos conhecidos ‘hot-spots’(FIGURA 17), locais no spot onde há maior concentração de mistura analito/matriz resultando em grandes variações nas intensidades dos sinais obtidos do analito e do padrão interno. Isso pode ocorrer uma vez que o laser pode incidir onde há maior concentração de cristais de matriz/analito, o sinal obtido será de alta intensidade, diferentemente do que ocorre quando o laser incide em locais onde há baixa concentração ou nenhuma concentração de cristais, gerando sinais de baixa intensidade. Estes fatos aumentam consideravelmente os coeficientes de variação obtidos para cada matriz utilizada. As cristalizações irregulares não são adequadas para métodos que tem como objetivo a quantificação, devido à baixa reprodutibilidade que apresentam. Exemplos disto são as matrizes: ácido ferúlico, ácido α-ciano-4-cloro-cinâmico, ácido α-ciano-4- fenil-cinâmico, ácido cafeico e ácido gentísico, que obtiveram CV’s entre 10,00- 39,00%. A matriz ideal para quantificação por análise MALDI-TOF-MS deve possuir uma cristalização uniforme e ter uma distribuição homogênea de matriz/amosta ao longo de todo spot. Assim serão gerados espectros reprodutivos, e baixos valores de CV’s serão obtidos. Ao observar os cristais de CHCA e SA pode-se constatar que os mesmos são pequenos e estão uniformemente distribuídos ao longo de todo o spot, portanto, essas matrizes são apropriadas para a quantificação de MC. As análises utilizando as matrizes CHCA e SA obtiveram valores de CV iguais a 4,80 e 4,90%; respectivamente. Apontando que o objetivo de obter uma co-cristalização de matriz/amostra homogênea, apresentando uma boa reprodutibilidade foi alcançado. Tais resultados comprovam que o uso de CHCA para a quantificação de MC's é eficiente e também demonstrou que o uso de SA é outra opção viável de matriz para quantificação de MC’s. Além disso, ao utilizar CHCA e SA como matrizes de MALDI-MS, aplicando o 55 ‘vacum drying adapted’ como protocolo de preparação da amostra, os CV obtidos foram menores do que os relatados na literatura onde o método ‘thin layer’ foi utilizado com CHCA como matriz (PUDDICK et al., 2012). Devido aos resultados satisfatórios de CV’s obtidos pelo método que utiliza as matrizes CHCA e SA individualmente, curvas de calibração foram construídas para avaliação dos parâmetros de linearidade e do limite de detecção obtidos para cada uma destas matrizes. Os resultados alcançados estão apresentados na Tabela 5. Tabela 5 - Resultados de CV (para o ponto de concentração de 2,5 µmol/L), limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi-cinâmico (50:50, v/v). CV (%) MDL (µmol/L) Curva de calibração R2 CHCA 4,80 0,011 y = 0,281x + 0,083 0,98 SA 4,90 0,070 y = 0,073x + 0,015 0,89 Ao analisar os valores apontados na Tabela 5, pode-se concluir que o valor de MDL foi menor do que o valor publicado na literatura, 0,031 μmol/L, quando o CHCA é utilizado como matriz. No entanto, o valor de R2 é semelhante, 0,99, o que indica uma boa linearidade. Contudo, na literatura não há informações sobre qualquer avaliação do uso de SA como matriz que objetiva a quantificação de MC’s, mas neste trabalho a curva de calibração para esta matriz foi construída e o valor de LD calculado foi promissor. Uma estratégia que tem sido utilizada para aumentar a homogeneidade da cristalização é o uso da combinação de duas matrizes de MALDI-MS, que pode ser preparada de diferentes maneiras, empregando proporções de massa/massa ou volume/volume (LAŠTOVIČKOVÁ; CHMELIK; BOBALOVA, 2009; LAUGESEN; ROEPSTORFF, 2003). O uso desta combinação de matrizes aumenta a qualidade das análises realizadas por MALDI-MS com relação à reprodutibilidade dos espectros gerados, assim como a resolução dos sinais (JACKSON; ATTALLA, 2010). Então, com o objetivo de melhorar a homogeneidade da mistura matriz/amostra e otimizar nossos coeficientes de variação foram testadas diversas matrizes binárias, modificando as combinações de matrizes e a proporção volume/volume entre as mesmas. De acordo com a homogeneidade da mistura matriz/analito, e o coeficiente de 56 variação obtido pelas análises supracitadas na Tabela 4, as matrizes selecionadas para serem testadas em conjunto foram: ácido gentísico, ácido α-ciano-4-cloro- cinâmico e ácido α-ciano-4-benziloxi-cinâmico, ácido sinapínico, ácido α-ciano-4- hidróxi-cinâmico. Assim, todas as combinações de matrizes binárias ácido α-ciano-4-hidroxi- cinâmico: ácido gentísico, ácido α-ciano-4-cloro-cinâmico: ácido sinapínico, ácido α- ciano-4-cloro-cinâmico: ácido α-ciano-4-benziloxi-cinâmico, ácido sinapínico: ácido α- ciano-4-hidroxi-cinâmico, ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico: ácido α-ciano-4-cloro- cinâmico, foram preparadas em quadruplicata e analisadas para o cálculo de CV’s. A Tabela 6 apresenta as imagens das cristalizações obtidas para uma das matrizes utilizadas, assim como os valores de CV’s obtidos para cada uma delas. 57 Tabela 6 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes binárias, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L). Para todas as combinações de matrizes binárias foram utilizados sistemas de proporções volume/volume de 25/75, 50/50 e 75/25. O sistema de proporção 50/50 (v/v) resultou nos melhores coeficientes de variação para todos os sistemas de matrizes binárias quando comparamos as análises utilizando apenas uma matriz, Tabela 4. Além disto, ao observarmos a entrada 5 da Tabela 6, que apresenta as cristalizações obtidas utilizando a mistura de CHCA e SA como matrizes, tem-se que todos os spots possuem cristalização homogênea. No entanto, o que apresenta a Matriz binária 50:50 (v/v) 75:25 (v/v) 25:75 (v/v) 1 ácido α-ciano-4- cloro-cinâmico: ácido sinapínico CV = 5,61% CV = 25,5% CV = 6,72% 2 ácido α-ciano-4- cloro-cinâmico: ácido α-ciano-4- benziloxi-cinâmico CV = 5,39% CV = 7,35% CV = 49,4% 3 ácido α-ciano-4- hidróxi-cinâmico: ácido α-ciano-4- cloro-cinâmico CV = 8,49% CV = 42,2% CV = 23,7% 4 ácido α-ciano-4- hidroxi-cinâmico: ácido gentísico CV = 11.1% CV = 10.8% CV = 30.6% 5 ácido sinapínico: ácido α-ciano-4- hidroxi-cinâmico CV = 4,66% CV = 17,2% CV = 13,8% 58 melhor homogeneidade matriz/analito ocorre quando utiliza-se o ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi-cinâmico (50/50, v/v), que gera um excelente valor de CV, 4,6%. Essa homogeneidade da matriz/analito em todo o spot evita formação de ‘hot- spots’, sendo que em qualquer local onde o laser incide a relação dos sinais entre a MC-RR e Angiotensina I é constante. Então, devido aos resultados obtidos, o método foi aplicado também para as MC-LR e MC-YR, e os parâmetros obtidos estão apresentados na Tabela 7. Para avaliar os resultados gerados neste trabalho, os mesmos foram comparados com os dados já relatados na literatura para a quantificação de MC’s, que encontram-se na Tabela 8. Tabela 7 - Resultados de CV (para o ponto de concentração de 2,5 µmol/L), limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico (50:50, v/v). Peptídeos CV (%) LD (µmol/L) LQ (µmol/L) Curva de calibração R2 MC-LR 5,5 0,045 0,25-10.0 y = 0,25x + 0.068 0,99 MC-RR 4,6 0,010 0,13-10.0 y = 0,34x + 0.16 0,98 MC-YR 5,2 0,045 0,33-10.0 y = 0,25x + 0.099 0,98 Tabela 8 - Dados obtidos por Puddick, 2007 utilizando ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico como matriz. CV (%) LD (µmol/L) LQ (µmol/L) Curva de calibração R2 MC-LR 9,5 0,087 0,28-10,0 y = 0,129x + 0,015 0,99 MC-RR 6,2 0,031 0,12-10,0 y = 0,075x + 0,0034 0,99 MC-YR 6,8 0,056 0,18-10,0 y = 0,170x + 0,064 0,98 Ao comparar os resultados apresentados nas TABELAS 7 e 8, pode-se concluir que os CVs obtidos quando o sitemas de matrizes binárias são utilizados para as análises de MC-LR (5,5%) e M-YR (5,2%) são próximos aos valores de CV’s anteriormente publidados. Entretanto, os valores de MDLs medidos foram melhores do que os resultados obtidos na literatura. Além disto, as curvas de calibração construídas para cada MC apresentaram boa linearidade no intervalo de concentração de 0,10 μmol/L – 10,00 μmol/L, com valores de R2 de 0,98 e 0,99. 59 Devido ao sucesso do método otimizado para a quantificação das MC-RR, MC- LR e MC-YR, que são peptídeos cíclicos com arginina nas suas estruturas, decidiu-se então, ampliar a aplicação deste método, aplicando o mesma na quantificação de outros peptideos, que também contêm arginina, contudo, que apresentam estruturas lineares e com diferentes m/z. Para tal finalidade foram escolhidos: a bradicinina (BRAD) (m/z 1061,21) e fibrilopeptídeo humano B (FIBRI) (m/z 1570,57), para avaliação dos parâmetros obtidos pelas curvas de calibração contruídas (Tabela 9). Este método mostrou excelente reprodutibilidade para ambos os peptídeos, com valores de CV de 2,90% e 3,60%, para BRAD e FIBRI, respectivamente. Além disso, foram obtidos baixos valores de MDL, 0,039 μmol/L para BRAD e 0,084 μmol/L para FIBRI, apontando que este método é sensível para estes peptideos. A linearidade obtida também foi muito satisfatória para brad, com valor R2 de 0,99, melhor que a obtida para FIBRI, com R2 igual a 0,92 (Tabela 9). Estes resultados mostraram que o método desenvolvido por este grupo de pesquisa, pode ser utilizado tanto para quantificação de MCs quanto para outros peptídeos com diferentes estruturas. Tabela 9 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi-cinâmico (50:50, v/v). CV (%) MLD (µmol/L) LDQ (µmol/L) Curva de calibração R2 BRAD 2,9 0,039 0,31-10,0 y = 0,29x + 0,027 0,99 FIBRI 3,6 0,084 0,66-10,0 y = 0,15x + 0,010 0,92 60 5. Conclusões O método para quantificação de microcistinas, desenvolvido neste capítulo, minimizou ao máximo os problemas de reprodutibilidade inerente à técnica MALDI- MS. O uso da combinação das matrizes CHCA e SA (50/50, v/v), otimizou a cristalização e homogeneização matriz/amostra por todo o spot, tornando o método mais reprodutivo e mais sensível que os métodos já descritos na literatura. Além disto, o método desenvolvido é um método rápido, de baixo custo, que utiliza muito pouco solvente, além de proporcionar a quantificação dos diversos congêneres de microcistinas que podem estar presentes em uma floração tóxica de cianobactérias. 61 Capítulo 2 Imageamento de Cianobactérias de água doce por MALDI Imaging Mass Spectrometry: Distribuição espacial de toxinas e outros metabólitos. 62 CAPÍTULO 2: Imageamento de Cianobactérias de água doce por MALDI Imaging Mass Spectrometry: Distribuição de toxinas e outros metabólitos. 1. In