UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA DIANA ZAPPAROLI “Pesquisa da contaminação e avaliação da infectividade por Trypanosoma cruzi em polpas de açaí comercializadas em municípios do Estado de São Paulo” Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos Botucatu- SP 2021 DIANA ZAPPAROLI “Pesquisa da contaminação e avaliação da infectividade por Trypanosoma cruzi em polpas de açaí comercializadas em municípios do Estado de São Paulo” Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos Botucatu- SP 2021 Dedicatória Dedico este trabalho a todos que apoiaram meus sonhos, acreditaram em mim e sempre ajudaram a manter-me focada em meus objetivos. Aos meus pais Simone e Paulo Roberto, ao meu irmão Paulo Diego, as minhas avós Marlene, Ivanil, Pelas sabias palavras em momentos delicados, pelas conversas, pelo apoio e compreensão. Pela atenção e amor dedicados a mim. E por sempre me encorajarem quando os caminhos se estreitavam durante esta jornada. E também por sempre despertarem minha curiosidade, que hoje se tornou a base para o meu conhecimento. Em especial a memória do meu Avô Geraldo, Por deixar como legado grandes virtudes, o sábio silêncio e sua serenidade. Por me acalmar mesmo agora sendo luz. Agradecimentos Primeiramente agradecer a Deus Pai, por permitir que eu fosse personagem da sua história, por ter escrito uma jornada de conhecimento e crescimento não apenas profissional e sim pessoal, ao qual não apenas escreveu, mas me capacitou para isso. Não poderia deixar de agradecer, em meio a pandemia, a saúde que concedeu não apenas a mim, mas a todos os envolvidos em minha vida científica e pessoal. Obrigada por me permitir viver a arte da VIDA. Agradeço ao meu anjo da guarda, por me manter focada nos meus objetivos, por guiar os meus passos, e iluminar os meus caminhos. Por me mostrar a luz quando a dificuldade me cercava. A minha orientadora Simone Baldini Lucheis, por toda a ajuda, por todo conhecimento transmitido e por toda orientação. Agradeço também ao meu co-orientador Rodrigo Mattos dos Santos, por ter me aconselhado a seguir este caminho, tão gratificante, e pelas colaborações científicas. Agradeço à minha banca de qualificação, aos suplentes Erika Alessandra Pellison Nunes da Costa e Ricardo de Souza Cavalcante, e aos titulares Rinaldo Poncio Mendes e Cilmery Suemi Kurokawa pelas valiosas sugestões realizadas para o crescimento e melhora da dissertação. Agradecer ao programa de pós-graduação em Doenças Tropicais pela oportunidade de colaborar com o avanço científico, através do meu egresso ao mestrado, com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecer aos meus amigos que o mestrado me deu a oportunidade de conhecer e conviver. À Lívia Maísa Giraldi e ao Wesley José dos Santos, que me passaram toda a base do meu conhecimento prático preciso para esta pesquisa. À Thainá Valente Bertozzo, colega de faculdade e hoje parceira de bancada, por ser aquela luz no fim do túnel, quando tudo estava perdido eis que surgia a Tainá com uma gota de esperança, e também por ser minha parceira de comer doces e sair da dieta. À Suzane Manzini, por ser paciente e me passar calma, ter mãos de fada pra PCR e tanto me ajudar, e também comer docinhos comigo. À Isabella Neves Aires, por me socorrer sempre que precisei, pelas conversas descontraídas e pela torta de limão maravilhosa. À Daniela Filadelfo Sanches e à Marcela Alexandrino, por todos os momentos de descontração, todas as risadas, mas também por todo o auxílio com minhas camundongas, e lâminas. Agredecer à minha amiga Mariana Zanchetta, e ao meu amigo Jonas Atique Sawazaki, pela companhia nas disciplinas, por tornar tudo mais leve e feliz, pelas boas conversas e por todos os almoços juntos. Agradecer aos meus familiares, que sempre estiveram comigo dia a dia, e me fizeram persistir em meu sonho, e alcançar assim meu objetivo, agradecer também os dias de descontração, tão necessários, para que a produtividade fosse impulsionada, por serem minha base, meu espelho e o meu tudo. Nesta vida nada e nem ninguém é por acaso. Acredito que todos têm uma missão, até mesmo porque, Deus já sabia de todos esses encontros, ele me mostrou que nada é possível sozinho e que tudo tem valor quando agregado há outras pessoas. A todos que contribuíram com seu conhecimento, ou auxílio para este trabalho ser concretizado, muito obrigada! “Aprenda com o ontem, viva para o hoje, esperança para o amanhã. O importante é não parar de questionar” (Albert Einstein) Resumo A doença de Chagas tem como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi (T.cruzi). Segundo a Organização Mundial da Saúde, de sete a oito milhões de pessoas encontram-se infectadas com T.cruzi, tendo-se como principais vias de transmissão a vetorial e a oral, a qual tem assumido uma grande importância epidemiológica, tendo em vista a não obrigatoriedade da pasteurização da polpa de açaí. O presente trabalho visou pesquisar T. cruzi em 35 amostras de sorvete de açaí comercializados em 11 diferentes pontos de venda da região de Botucatu-SP, bem como realizar a inoculação via gavagem de amostras de açaí em modelo murino. Para estes objetivos, as alíquotas de polpas de açaí foram submetidas ao método de tamisação direta e visualização sob microscopia óptica, sendo analisadas sob diferentes temperaturas de armazenamento e em diferentes períodos. Análises moleculares pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase convencional (cPCR) com os primers 121/122 e V7/V8 para T.cruzi, foram realizadas a partir das 35 amostras de açaí. Pela tamisação direta verificou-se uma (01) amostra positiva (2,86%), pela leitura das seis horas em temperatura ambiente, porém sem motilidade, a qual não se confirmou pela técnica molecular de PCR utilizando-se os primers 121/122 e V7/V8, para T. cruzi. No entanto, duas amostras de açaí (5,71%) e negativas à tamisação foram positivas à técnica de PCR com o uso do primer 121/122. Realizou-se a inoculação das amostras de açaí positivas à tamisação e à PCR, por via oral (gavagem) em camundongos Balb-C, a fim de se verificar a infectividade das amostras, tendo-se observado que, após período de incubação de 7 dias, a partir de microscopia direta em sangue e tecidos, verificou-se a presença de formas amastigotas em língua e formas tripomastigotas em esfregaço sanguíneo nos grupos de camundongos que receberam as amostras de açaí positivas à tamisação ou à PCR, o que indica a sua capacidade de produzir a infecção in vivo nos camundongos. Desta forma, reforça-se a importância da pasteurização do açaí, já que, até o momento, não há legislação que obrigue a pasteurização deste fruto comercializado como sorvete, necessitando-se de um controle de qualidade e boas práticas de manufatura do mesmo, para o consumo seguro de produtos derivados do açaí. Palavras-chave: doença de Chagas, diagnóstico, Trypanosoma cruzi, açaí, Euterpe oleracea. Abstract The etiological agent of Chagas disease is the protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi). According to the World Health Organization, between seven and eight million people are infected with T. cruzi, with the main routes of transmission being vectorial and oral, which has assumed great epidemiological importance, in view of the açaí pulp pasteurization is not mandatory. The present work aimed to research T. cruzi in 35 samples of açaí ice cream marketed in 11 different points of sale in the region of Botucatu-SP, as well as to carry out the inoculation via gavage of açaí samples in a murine model. For these purposes, the açaí pulp aliquots were submitted to the forced sieving technique and visualization under optical microscopy, being analyzed under different storage temperatures and in different periods. Molecular analyzes using the conventional Polymerase Chain Reaction technique (cPCR) with primers 121/122 and V7/V8 for T.cruzi, were carried out from 35 açaí samples. By forced sieving, one (01) positive sample (2.86%) was verified, by reading at six hours at room temperature, but without motility, which was not confirmed by the molecular PCR technique using primers 121/122 and V7/V8, for T. cruzi. However, two samples of açaí (5.71%) that were negative by forced sieving were positive by the PCR technique using primer 121/122. The inoculation of açaí samples positive to forced sieving and PCR, orally (gavage) was carried out in Balb-C mice, in order to verify the infectivity of the samples. After seven days, it was observed from direct microscopy in blood and tissues, the presence of amastigote forms in the tongue and trypomastigote forms in blood smears in the groups of mice that received the açaí samples positive to forced sieving or PCR, which indicates its ability to produce infection in vivo in mice. In this way, the importance of pasteurization of açaí is reinforced, since, to date, there is no legislation that requires the pasteurization of this fruit sold as ice cream, requiring quality control and good manufacturing practices, to the safe consumption of derived açaí products. Keywords: Chagas disease, diagnosis, Trypanosoma cruzi, açaí, Euterpe oleracea. Lista de figuras Figura 1:Testes diagnósticos para a doença de Chagas segundo períodos de infecção .................................................................................................................................. 26 Figura 2: Municípios do Estado de São Paulo selecionados para compra de açaí e pesquisa de Trypanosoma cruzi. ............................................................................... 34 Figura 3: Processo de tamisação das amostras de açaí. Colunas de filtração prontas para tamisação, com algodão ortopédico e microesfera de aço (A). Adição da amostra de açaí à coluna de filtração (B). Obtenção de eluato de açaí pela técnica de tamisação forçada (C). ............................................................................................................... 37 Figura 4: Obtenção do controle positivo. Aspiração de 5mL de açaí pasteurizado para obtenção de eluato (A). Adição do eluato de açaí ao tubo de centrifugação (B). Contaminação do açaí com cepa Y de Trypanosoma cruzi (C). Homogeneização do eluato de açaí contaminado com T. cruzi (cepa Y) (D). Distribuição do eluato contaminado com cepa Y de T. cruzi em microtubos estéreis e livres de DNAse e RNAse (E). ................................................................................................................ 41 Figura 5: Gavagem em camundongo Balb/C. Inoculação de amostra de açaí para avaliação da infectividade de T.cruzi. ........................................................................ 42 Figura 6: Acondicionamento dos camundongos. Cada grupo de camundongo em uma caixa (A). Em cada caixa foram acondicionados três (03) camundongos, os quais receberam água e ração ad libitum (B). .................................................................... 43 Figura 7: Retirada de órgãos e sangue por punção cardíaca a partir de um grupo amostral de camundongo (A e B); Órgãos retirados dos camundongos: fígado, baço, coração e língua (C); Seringa contendo aproximadamente 1 mL de sangue (D). ..... 44 Figura 8: Corte diagonal de órgão (A). Imprint de órgão em lâmina de microscopia (B). Procedimento realizado para todos os camundongos de todos os grupos, com órgãos e esfregaço sanguíneo (C). ....................................................................................... 45 Figura 9: Fixação das lâminas com Metanol (A). Coloração com Giemsa (B). ........ 45 Figura 10: Aspectos microscópicos de eluato de amostras de açaí para pesquisa de formas tripomastigotas de T. cruzi. Notar as diferenças entre os aspectos de visualização da amostra A (poucas sujidades) e B (muitas sujidades) ..................... 50 Figura 11: Visualização de forma tripomastigota de T. cruzi em amostra de açaí, pelo método direto de tamisação forçada – microscopia óptica (1000X). ......................... 51 Figura 12: Eletroforese em gel de agarose a 2% para os iniciadores 121/122 (~350pb) para Trypanosoma cruzi. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 2 e 3 – amostras amplificadas; 4 – controle positivo (Trypanosoma cruzi); 5 – controle negativo (água ultrapura). ......................................................................................... 53 Figura 13: Visualizações microscópicas de imprints de órgãos de camundongos previamente infectados com amostras de açaí. Figuras de A a E, referentes ao Grupo 1, controle positivo, o qual recebeu açaí contaminado com cepa Y de T.cruzi. Imprint de fígado, apresentando células rompidas liberando formas amastigotas de T. cruzi, bem como de células ainda não rompidas (A e B). Esfregaço de sangue, apresentando formas tripomastigotas de T. cruzi (C e D). Imprint de língua, com a presença de formas amastigotas, como indicada na seta (E). ....................................................... 55 Figura 14: Visualização microscópica de esfregaço sanguíneo de camundongo previamente infectado com açaí. Figura referente ao Grupo 3, correspondente a camundongo infectado com amostra de açaí positiva à tamisação forçada - amostra 19). Pode-se notar formas tripomastigotas de T. cruzi. ............................................. 56 Figura 15: Visualizações microscópicas de esfregaço sanguíneo e de imprint de língua de camundongo previamente infectado com açaí. Figuras A e B, referentes ao Grupo 4, infectados com amostra 12 (positiva à PCR). Esfregaço sanguíneo, podendo-se verificar forma tripomastigota de T. cruzi, circulada (A). Imprint de língua, verificando-se forma amastigota de T.cruzi, circulada (B). ........................................ 56 Figura 16: Visualização microscópica de esfregaço sanguíneo de camundongo previamente infectado com açaí. Figura referente ao Grupo 5, infectados com amostra de açaí positiva à PCR (amostra 13). Pode-se visualizar formas tripomastigotas de T. cruzi. .......................................................................................................................... 57 Lista de Quadros e Tabelas Quadro 1: Mensuração em tonelada da produção do fruto de açaí no Brasil e nas regiões da Federação, nos anos de 2018 e 2019. .................................................... 22 Quadro 2: Municípios de aquisição das amostras de açaí ....................................... 36 Quadro 3: Iniciadores para T.cruzi a partir de amostras de açaí – Técnica de cPCR .................................................................................................................................. 39 Tabela 1: Comparação de médias entre grupos para os pesos de órgãos. ............. 61 Tabela 2: Comparação de médias entre grupos para quantificação de DNA. .......... 62 Sumário 1 INTRODUÇÃO __________________________________________________ 18 2 REVISÃO DE LITERATURA _______________________________________ 19 2.1. Breve histórico. Dados epidemiológicos – infecção oral. Branqueamento e pasteurização do açaí - legislação ______________________________________ 19 3 OBJETIVOS ____________________________________________________ 31 4 MATERIAL E MÉTODOS _________________________________________ 33 4.1 Comitê de Ética ______________________________________________ 33 4.2 Aquisição e caracterização das amostras de açaí para pesquisa de Trypanosoma cruzi e municípios de procedência _________________________ 33 4.3 Pesquisa direta de T. cruzi nas amostras de açaí pela técnica de tamisação 36 4.3.1 Processo de tamisação forçada – método direto a partir de cada amostra de açaí ________________________________________________________ 36 4.4 Pesquisa molecular – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi ________________________________________________ 37 4.4.1 Extração de DNA para T. cruzi _________________________________ 37 4.4.2 Quantificação de DNA _______________________________________ 38 4.4.3 Reação em Cadeia da Polimerase convencional- cPCR para T. cruzi a partir das amostras de açaí _____________________________________________ 38 4.4.3.1 Controles positivos para PCR ______________________________ 38 4.4.4 Procedimento cPCR ________________________________________ 38 4.4.5 Eletroforese em gel de agarose ________________________________ 39 4.5 Inóculo, grupos experimentais e via de inoculação ___________________ 40 4.5.1 Obtenção das amostras controle negativo e positivo para os testes experimentais – inoculação via oral de açaí ___________________________ 40 4.5.2 Grupos de camundongos (Anexo 7) ____________________________ 41 4.5.3 Eutanásia e retirada de órgãos ________________________________ 43 4.5.4 Imprints __________________________________________________ 44 4.5.5 Coloração de Giemsa e análise das lâminas ______________________ 45 4.5.6 Preparo dos órgãos – Maceração de órgãos para extração de DNA ____ 46 4.5.7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – órgãos de camundongos __ 46 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO _____________________________________ 48 5.1 Amostras de açaí – comercialização e legislação ____________________ 48 5.2 Leitura direta – Microscopia óptica _______________________________ 49 5.3 PCR convencional – amostras de açaí ____________________________ 52 5.4 Grupos experimentais – Leitura em microscopia óptica dos esfregaços sanguíneos e imprints de órgãos de camundongos _______________________ 54 5.5 PCR convencional - órgãos de camundongos ______________________ 60 5.6 Análise estatística ____________________________________________ 60 6 CONCLUSÕES _________________________________________________ 64 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1_________________________________ 66 8 ANEXOS ______________________________________________________ 77 8.1 Anexo 1: Certificado de aprovação da pesquisa pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Botucatu, São Paulo (CEUA/FMB/Unesp). ______________ 77 8.2 Anexo 2: Protocolo de extração de DNA em tecidos - kit IllustraTissueTMgenomicPrep Mini Spin (GE Healthcare®) _________________ 78 8.3 Anexo 3: Quantificação de DNA a partir da extração das amostras de açaí comercializada. ___________________________________________________ 79 8.4 Anexo 4: Meio de cultura- NNN-LIT ______________________________ 80 8.5 Anexo 5: Meio de cultura- LIT (LIVER INFUSION TRYPTOSE) _________ 81 8.6 Anexo 6: Meio de cultura- 199 __________________________________ 82 8.7 Anexo 7: Fluxograma dos grupos dos camundongos inoculados via gavagem com amostras de açaí ______________________________________________ 83 8.8 Anexo 8: Protocolo de extração do DNA em sangue - Kit comercial Illustra Blood GenomicPrep (GE Healthcare®). ________________________________ 84 8.1 Anexo: 9: Pesagem de órgãos (valores em gramas) de camundongos infectados experimentalmente com amostras de açaí positivas para T.cruzi. ___ 85 8.2 Anexo 10: Quantificação de DNA a partir de órgãos de camundongos infectados experimentalmente com amostras de açaí positivas para T.cruzi. ___ 86 Introdução 18 1 INTRODUÇÃO Na década de 90 a doença de Chagas (DC) ou Tripanosomíase Americana foi considerada a doença parasitária mais importante da América Latina, segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2015). De acordo com uma estimativa de 2006, cerca de 6 a 7 milhões de pessoas encontram-se infectadas no México e América Central, causando 12.500 mortes por ano e 41.200 novos casos anualmente (YASUDA, 2021). A doença é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T.cruzi), pertencente à família Trypanosomatidae e à classe Kinetoplastida, descrita em 1909 por Carlos Chagas, no interior de Minas Gerais. A DC tem como vetor o triatomíneo hematófago, popularmente conhecido como “barbeiro”, pertencente à família Triatominae. Os principais vetores pertencem às espécies Triatoma infestans, Rhodnius prolixus e Panstrongylus megistus, bem como Triatoma brasiliensis e Triatoma sordida (CARDOSO et al, 2006). Segundo a Diretoria de Combate a Vetores, durante os períodos de janeiro de 2014 e março de 2015, as espécies de triatomíneos mais comuns que foram encontradas no Estado de São Paulo foram Triatoma sordida e Panstrongylus megistus, principais responsáveis pela transmissão vetorial (SUCEN, 2016). A DC é endêmica em 21 países das Américas; estima-se oito milhões de pessoas infectadas em todo o mundo, causando mais de 10.000 mortes por ano, principalmente na América Latina. No Brasil há de 1,9 a 4,6 milhões de pessoas infectadas com T. cruzi. Segundo o último Boletim Epidemiológico de 2019, foram notificados, apenas em 2018, 4.685 indivíduos suspeitos com doença de Chagas em fase aguda, tendo sido confirmada em 380 pacientes. A região Norte registrou uma proporção de 92,1%, a maior do país (BRASIL, 2019a; Santos et al., 2020). Os parasitas desenvolvem-se na porção posterior dos triatomíneos e são transmitidos pelas fezes e urina, recebendo o nome de tripomastigotas metacíclicos, que constituem a forma infectante. A infecção ocorre durante o repasto sanguíneo quando, ao coçar a picada do barbeiro, as formas tripomastigotas atingem as mucosas via corrente sanguínea, adentram as células do sistema fagocítico monocitário (SFM), principalmente os macrófagos, transformando-se em formas amastigotas, principalmente em fígado e baço. Estas multiplicam-se e diferenciam-se em tripomastigotas novamente, invadindo a circulação. Caso haja um novo repasto sanguíneo, de um vetor não infectado, inicia-se o ciclo de vida nos invertebrados. Após a absorção das formas tripomastigotas, estas transformam-se em epimastigotas, 19 formas não infectantes (encontradas no tubo digestivo do vetor, possuindo cinetoplasto junto ao núcleo, flagelo e membrana 12 ondulante), multiplicando-se e diferenciando-se novamente em tripomastigotas, as quais serão novamente eliminadas sob a forma de tripomastigotas metacíclicas em fezes e urina (NASCIMENTO, 2015). As principais formas de transmissão da DC são a via vetorial e oral, podendo ser ocasionada também pela via congênita (vertical); via transfusional; transplante de órgãos; ou por acidentes laboratoriais. Nos últimos anos ocorreu uma mudança no perfil epidemiológico de transmissão da doença de Chagas, tendo-se verificado uma intensificação no combate dos vetores empreendidas a quatro décadas, logo a via de transmissão mais comum passou a ser a via oral ao invés da via vetorial (DIAS et al, 2016). O vetor tem como habitat alimentos como o palmito, cana- de açúcar, babaçu, jaci (coquinho), açaí e bacaba, os quais são comercializados e consumidos muitas vezes de forma inadequada (BRASIL, 2017a). Portanto, observa-se uma intensificação no número de casos de DC aguda pelo consumo destes alimentos, produzidos de maneira artesanal e sem a fiscalização sanitária para a sua comercialização. Segundo um estudo realizado de 2000 a 2013, verificou-se um total de 1.570 casos de DC aguda registrados no Brasil, sendo 1.081 casos por transmissão oral, 100 por transmissão vetorial e apenas seis por transmissão vertical (BRASIL, 2015; DIAS et al., 2015). Desta forma, considerando-se a popularização do consumo de açaí de forma in natura (não pasteurizada), bem como devido à falta de pesquisas sobre a contaminação deste alimento com T. cruzi e comercializado em diferentes municípios do Estado de São Paulo, propõe-se o presente estudo. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Breve histórico. Dados epidemiológicos – infecção oral. Branqueamento e pasteurização do açaí - legislação O primeiro caso de infecção via oral, humana, foi investigada na Argentina por Mazza et al (1936), pela ingestão de leite materno. Salvador Mazza era médico sanitarista argentino, o qual dedicou boa parte da sua vida profissional para estudar DC, e destacou-se na luta contra esta enfermidade, completando os estudos realizados por Carlos Chagas. Em 1926, a Faculdade de Medicina, a qual era vinculado na época, estabeleceu a Missão de Estudos da Patologia Regional 20 Argentina (MEPRA), conhecida também como missão Mazza, O instituto MEPRA foi responsável por estudar doenças desconhecidas no Norte da Argentina, incluindo DC. O primeiro caso reportado de um surto de DC aguda por infecção via oral foi diagnosticado em 1965 na cidade de Teutônia, município de Estrela – Rio Grande do Sul (COURA, 1966; SILVA et al, 1968). Até o ano de 2004, a via oral era pouco investigada, e ganhou importância após um surto registrado no município de Navegantes, estado de Santa Catarina, no ano de 2005 (BRASIL, 2005a). Neste episódio registrou-se 31 pessoas infectadas e cinco óbitos, fato que segundo Steindel (2008) e Dias (2015), aumentou significativamente a porcentagem do número de óbitos registrados em 20%. Outros surtos de DC aguda foram registrados: no Maranhão, com 39 pacientes acometidos, devido à ingestão de suco de bacaba em um evento local, no qual a fruta era manipulada de forma artesanal, sem higienização (SIMÕES NETO et al., 2018). Mais recentemente, relatou-se um surto de contaminação oral pelo consumo de açaí na região Amazônica, envolvendo dez pacientes, tendo-se encontrado T. cruzi tanto no sangue dos pacientes quanto no suco de açaí (SANTANA et al., 2019). Segundo o Ministério da Saúde (BRASIL, 2020a), foram registrados 132 surtos de DC aguda no estado do Pará, 12 no Amapá, três no Amazonas, três em Tocantins, dois no Maranhão, um no Acre e um no Rio Grande do Norte. No Rio de Janeiro, verificou-se que, de 140 amostras de produtos de açaí comercializados em feiras e supermercados, 14 (10%) apresentavam DNA de T. cruzi (FERREIRA et al., 2018a). Um dos poucos estudos relatado na literatura, de Barbosa et al (2019) analisando amostras in natura de açaí procedido de Belém (Pará), inoculadas em modelos murinos, verificaram que o consumo de tal produto foi capaz de ocasionar casos de DC aguda, inclusive com óbito entre 17 e 52 dias após a infecção experimental. Outros dados de grande importância publicados pelo Ministério da Saúde, referente a um estudo de 2007 a 2016, descrevem que, das transmissões ocorridas no país, 69% foram por via oral, esta que prossegue atualmente sendo a principal via de infecção, sendo responsável por 87% dos casos no ano 2018 (BRASIL, 2015, 2019a). Segundo dados publicados pelo Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde (BRASIL, 2021) em 2020 foram registrados 146 casos de doença de Chagas no Brasil, tendo-se 75,34% dos casos pela via oral, 6,85% pela via vetorial, 15,07% ignoradas, e outras vias 2,74%. 21 Houve uma redução de 47% na notificação de casos suspeitos de fase aguda e 63% de casos confirmados por DCA em 2020 em relação a 2019. Entretanto, a maior distribuição, cerca de 84%, concentra-se na região Norte. Destes, o estado do Pará é responsável por 71% dos casos. Em relação às principais formas prováveis de transmissão ocorridas no país, 76% foram por transmissão oral, 8% por transmissão vetorial e em 15% não foi identificada a forma de transmissão (Brasil, 2021). O açaí (Euterpe oleracea) é um fruto típico e popular da região do norte do Brasil, que nos últimos anos ganhou importância devido aos benefícios para a saúde, associados à sua composição fitoquímica e capacidade antioxidante. O Brasil é um grande produtor do fruto do açaí, consumidor e o maior exportador da polpa de açaí congelada. O Pará é o maior produtor de açaí, responsável por mais de 90% da produção nacional, sendo que 60% permanecem no Estado. No âmbito nacional, os outros 35% destinam-se a outras regiões como São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro e, para exportação 5%; do total exportado, 70% foi destinado para os Estados Unidos, Alemanha, Bélgica e Holanda, respectivamente, nos anos de 2019 (CONAB, 2019). Outros estados, como Amazonas e Maranhão, são o segundo e terceiro maiores produtores de açaí. Porém, tratando-se do volume de exportação, o Estado de São Paulo tem saído à frente, respectivamente, do Pará, Amapá, Minas Gerais e Pernambuco nos anos de 2018 e 2019. Esses são dados da colheita principal, porém existe a colheita da entressafra por exemplo, em que o estado do Amapá tem sua produção de dezembro a abril, Amazonas de março a julho e o estado do Maranhão, de janeiro a maio (HOMMA et al., 2006; CONAB 2019). Mais recentemente, dados fornecidos pelo IBGE mostram o crescimento de produção (por toneladas) do Brasil e das regiões Norte, Nordeste e Sudeste, além de detalhar a produção (por tonelada) dos Estados (Quadro 1): 22 Quadro 1: Mensuração em tonelada da produção do fruto de açaí no Brasil e nas regiões da Federação, nos anos de 2018 e 2019. Variável – Quantidade produzida (Tonelada) Produto das lavouras temporárias e permanentes - Açaí Brasil e Grande Região Ano 2018 2019 1 Brasil 1.301.472 1.398.928 2 Norte 1.296.435 1.395.141 3 Nordeste 2.859 2.997 4 Sudeste 178 190 5 Centro-Oeste - - 6 Sul - - Unidade da Federação 1 Pará 1.230.699 1.320.150 2 Amazonas 62.329 67.757 3 Maranhão 742 751 Fonte: IBGE- Produção Agrícola Municipal, modificado* Centro-Oeste e Sul não consta dados. Ainda, segundo análise realizada pelo Conab (2019), estima-se que o Pará consuma cerca de 300 mil toneladas de açaí anualmente. Para fora do estado paraense, cerca de 150 toneladas de açaí são consumidas anualmente no estado de São Paulo, 500 toneladas no Rio de Janeiro e 200 toneladas nos demais estados brasileiros; além disso, ocorre expansão da comercialização de açaí para outros 16 países, como EUA, Alemanha, Bélgica e Holanda. Os EUA foi o país de maior consumo de açaí em 2018, liderando com 40% do consumo total, e em 2019 recebendo 70% do total da polpa de açaí exportada, para 23 assim produzir alimentos energéticos, sobremesas, medicamentos, suplemento alimentar e nutracêuticos; todos esses movimentos que o mercado do açaí gera, seja ele interno ou externo, faz parte no que chamamos de escoamento da produção e formando-se assim a rota do ouro roxo (TAVARES e HOMMA, 2015; CONAB, 2019). Logo, verifica-se uma tendência para que a via oral seja de maior prevalência para a infecção, já que se observam notificações de casos agudos devido a ingestão de alimentos contaminados com T. cruzi, principalmente pelo caldo de cana de açúcar (CARDOSO et al, 2006; VARGAS et al., 2018) e açaí (BARBOSA et al., 2019). Devido à popularização do consumo de açaí e ao número crescente dos casos de infecção via oral, o esperado seria a fiscalização rigorosa na produção, como é o caso da pasteurização ou branqueamento, para assegurar aos consumidores um alimento de boa qualidade. O processo chamado branqueamento é aplicado logo após a colheita, seleção e lavagem dos frutos de açaí, que pode ser realizado através de vapor ou água quente, sendo esta última a mais utilizada, o qual consiste em mergulhar o fruto em água aquecida à 80°C durante 10 segundos e, logo após, imergido em banho de água e gelo, sendo resfriada a temperatura ambiente, garantindo a inativação do T. cruzi, mas também inativando enzimas e, consequentemente, conservando a textura e coloração natural; as desvantagens principais é o possível sabor de cozimento e perda de nutrientes ; outro processo chama-se pasteurização, cujo método consiste no aquecimento da polpa de açaí entre 80 e 90°C e congelada imediatamente a - 20°C (congelamento), de modo que o parasita não resista à mudança brusca de temperatura tornando-se inviável; porém devido a pasteurização, a cor roxa- avermelhada natural do açaí pode ser perdida devido ao processo, além de exigir equipamentos de congelamento adequados. Importante salientar que, somente o resfriamento ou congelamento não previne a transmissão oral pelo T. cruzi (OPAS, 2009; FERREIRA et al, 2016a; PASSOS et al, 2012). Porém, a falta de obrigatoriedade do processo de pasteurização do produto tem gerado danos, tanto para a saúde pública quanto para os consumidores, devido ao fato de existir apenas leis que incentivam a pasteurização do açaí, como o projeto de lei n°6672/2016, que institui a Política Nacional de incentivo à produção e pasteurização da polpa de Açaí-PNA, cujo projeto foi arquivado no fim de janeiro de 2019, e logo no mês de março de 2019 foi feito um requerimento para desarquivamento, e seu status encontra-se tramitando em conjunto (BRASIL, 2017b). Esta situação pendente perante a legislação justifica o aumento dos dados estatísticos em relação à contaminação via oral, sendo o Brasil responsável por 69% 24 dos casos por esta via de contaminação (BRASIL, 2017b). O único projeto de lei que apresentava a possibilidade da obrigatoriedade da pasteurização era o PL n°178/2010, divulgado no endereço eletrônico do Senado Federal, que dispõe da obrigatoriedade da pasteurização do açaí para se evitar a contaminação e punição a quem comercializar a polpa de açaí não pasteurizada com multa, podendo até incluir prestação de serviços comunitários ou interdição do estabelecimento; no entanto, em 10/08/2010 tal projeto foi rejeitado por Comissão, em decisão terminativa; logo, esta tramitação encontra-se atualmente encerrada (BRASIL, 2010a). Por outro lado, há também uma instrução normativa no 37, publicada em 08/10/2018, pelo Ministério da Agricultura, através do Diário Oficial da União, a qual tem como objetivo estabelecer os padrões de qualidade que devem obedecer não apenas relacionado ao açaí, mas entre outras polpas, determinando assim aspectos físicos/químicos e qualidade sanitária na produção, inclusive citando como medidas de higiene o branqueamento ou pasteurização (BRASIL, 2018a). O processo de branqueamento é citado de acordo com as legislações estaduais que estabelecem requisitos higiênico-sanitários para a manipulação de açaí e bacaba por batedores artesanais, de forma a prevenir surtos com Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) e minimizando o risco sanitário, garantindo a segurança dos alimentos; entretanto, não há nenhuma lei que obrigue o processo de branqueamento (BRASIL, 2017a, 2018a). Apesar disso, os governos dos estados do Pará (2012) e Amapá (2015) estabeleceram legislações que estimulam a realização do branqueamento dos frutos. No ano de 2020 um grande avanço foi conquistado, a inserção da fase crônica da doença de Chagas como notificação compulsória (Portaria nº 1.061 de 18 de maio de 2020 revoga a Portaria nº 264, de 17 de fevereiro de 2020), visto que, anteriormente, somente a fase aguda da doença estava incluída na Lista Nacional de Doenças de Notificação Compulsória e Imediata, segundo a Portaria de Consolidação nº 4, de 28 de setembro de 2017 (BRASIL, 2017c, 2020b, c) Em 2017 foi consolidado o “Dia mundial de combate à DC”, durante a 72ª Assembleia Mundial da Saúde, sendo assim determinado, em 14 de abril de 2020, segundo o Ministério da Saúde (BRASIL, 2020d) cujas informações foram publicadas no Boletim Epidemiológico. Do ponto de vista técnico, o consumo de açaí (e de outros alimentos) pasteurizado é seguro. Por outro lado, dada à realidade econômica das áreas da região amazônica e a falta de regulamentação em relação à aplicação dessa técnica para a prevenção da contaminação do alimento com T. cruzi, deve-se fortalecer o 25 consumo de açaí (e de outros alimentos) em locais com boas práticas implantadas e que submetam os frutos à higienização e ao branqueamento, uma vez que esses procedimentos minimizam o risco de contrair DCA (OPAS, 2009). 2.2. Manifestações clínicas – DC A DC apresenta um quadro clínico composto por uma fase aguda (clinicamente aparente ou não), com alto nível de parasitemia; além de uma fase crônica, que pode se manifestar nas formas indeterminada (em que o paciente não apresenta sinais de comprometimento no aparelho circulatório e digestivo, podendo durar a vida toda; ou pode evoluir para a forma sintomática, com o nível de parasitemia baixo, porém constante); podendo apresentar a forma cardíaca, digestiva ou cardiodigestiva. Pacientes na fase crônica podem apresentar reativação da DC, ocasionada pela depressão do sistema imune; logo, poderão apresentar aumento da carga parasitária, como em pacientes transplantados recentemente. Um estudo realizado com pacientes chagásicos e co-infectados com HIV demonstrou que 73% dos indivíduos apresentavam dor de cabeça, déficit neurológico focal e febre, 47% apresentavam convulsões, e cerca de 30% apresentavam problemas cardíacos; um paciente portador do vírus com reativação, apresentou hemocultura positiva e, tão logo iniciado o tratamento específico para DC, os resultados foram negativos (FERREIRA et al., 2018b). As manifestações clínicas se apresentam de forma variada; geralmente, após um período de incubação, este pode divergir de acordo com o modo de transmissão: na via congênita, pode ser transmitida em qualquer período da gestação; na via vetorial, de 4 a 15 dias; via oral: 3 a 22 dias; via transfusional: 8 a 120 dias e, por acidentes laboratoriais, até 20 dias após exposição (BISIO et al, 2011; DIAS et al, 2015), e então inicia-se a infecção, podendo ou não o indivíduo apresentar sinais e sintomas. Uma das justificativas para isto é o fato de existirem diversas cepas, que são diferenciadas devido à virulência e à patogenicidade. As cepas mais estudadas são as cepas parentais: Y (altamente virulenta) e CL e MR (DE ARAÚJO et al, 1988; MACHADO et al, 2012; SIMÕES et al, 2018). Um dos fatores que diferenciam a patogenicidade de cada cepa é o tropismo e, no caso da cepa Y, o tropismo é por tecidos cardíacos, com citocinas liberadas durante o processo inflamatório e o recrutamento das células do sistema imune (PONCE et al., 2005). Segundo o estudo realizado por Lewis (2018), cujo objetivo era avaliar se as 26 diferentes vias de transmissão interferiam na gravidade da doença, em relação aos sintomas, identificou-se que, experimentalmente, a contaminação oral utilizando a cepa TcVI-CL Brener T. cruzi foi equivalente aos controles realizados com injeção através de agulha, revelando também que o tropismo de tecido cardíaco após contaminação oral é maior do que comparado a infecções por outras vias. 2.3. Diagnóstico De acordo com o Guia de Vigilância em Saúde, publicado pelo Ministério da Saúde em 2017, na fase aguda (parasitemia alta) os exames indicados são: identificação dos sintomas clínicos, exame parasitológico direto (padrão ouro para doença de Chagas aguda - DCA) identificando-se assim o parasita circulante no sangue, e sorológico com objetivo de pesquisa de IgM no sangue (BRASIL, 2017a). Por outro lado, na fase crônica, é indicado o exame sorológico com alta especificidade e diagnóstico molecular (Figura 1). Figura 1:Testes diagnósticos para a doença de Chagas segundo períodos de infecção Fonte: Rev Patol Trop Vol.42. out-dez. 2013 (BRASIL, 2013) As diferentes fases da doença, o modo de transmissão e a alta variabilidade genética do parasita determinam que os métodos de detecção molecular apresentam diferentes graus de sucesso. Os testes de diagnóstico molecular podem ser 27 empregados durante levantamentos epidemiológicos de transmissão, para o diagnóstico precoce de transmissão congênita e infecções agudas por transmissão oral, vias de transfusão ou transplante, reativação por imunossupressão e monitoramento da resposta ao tratamento em pacientes cronicamente infectados recebendo quimioterapia tripanocida (SCHIJMAN, 2018) A via oral é uma forma de transmissão importante, porém seu diagnóstico tem se tornado difícil devido aos amplos sintomas apresentados, sendo imprescindível um diagnóstico confirmatório para o manejo adequado do tratamento; para este, leva-se em conta os aspectos epidemiológicos, geográficos, tipos de alimentos consumidos pelo paciente e histórico de possíveis transplantes e/ou transfusões (YOSHIDA e CORTEZ, 2008). Outro aspecto importante é a determinação da via de infecção, o que pode estar relacionada com o sistema imune, pois quando há infecção por T. cruzi, ativa-se a resposta imune adaptativa, além da inata, interferindo na agressividade da infecção, com envolvimento de células T citotóxicas tipo 1 e 2 (Tc1/Tc2), células Th (contra patógenos intracelulares) e macrófagos. Um estudo mostrou que camundongos deficientes de células B apresentavam sinais mais graves, o que indica que a resposta imune humoral é imprescindível contra T. cruzi (SILVA, 2017). A infecção via oral exige que o patógeno colonize a mucosa gástrica e, mesmo que exposto ao ácido clorídrico e outras barreiras gástricas, ele garanta sua viabilidade, devido a mecanismos, como a grande quantidade de mucinas na superfície do T. cruzi (tcMUC) que são resistentes à degradação por proteases, glicosidases e ácido clorídrico. Outro método de evasão é a presença de uma glicoproteína conhecida como gp35/50, gp82 e gp30 (YOSHIDA e CORTEZ, 2008; YOSHIDA 2009). Após ocorrer a invasão do epitélio gástrico as tripomastigotas transformam-se em amastigotas e se replicam. Ambas as respostas (humoral/celular) participam do controle do parasita, com algumas citotoxinas destacando- se na regulação da resposta imune (ALVES, 2017; SOUZA, 2018). Os métodos moleculares têm contribuído para a capacidade de detectar e quantificar patógenos em alimentos e água (Palomino-Camargo e González-Muñoz, 2014; Ferreira et al., 2016b). Porém, a sensibilidade das provas moleculares varia de 50 a 90%, dependendo da metodologia empregada, dos genes alvo, da fase de infecção e da diversidade genética do Trypanosoma cruzi presente no material pesquisado (BRASIL et al., 2010b; SCHIJMAN et al., 2011). Em recém-nascidos, se faz o exame parasitológico direto nos primeiros meses de vida em duas amostras. Se o resultado for negativo faz-se também o sorológico 28 para pesquisa de IgG (DIAS et al., 2015; SIMÕES et al., 2018). Este é recomendado a partir do nono mês de vida devido ao fato da maturação do sistema imunológico dos recém-nascidos, pois antes do tempo determinado não há uma resposta imune adequada e capaz de ser detectada nos exames antes do sexto mês de vida (SIMÕES et al, 2018). Para as gestantes, o diagnóstico de Chagas é fechado quando há dois ou três testes sorológicos diferentes em resultados positivos, e para um teste alternativo usa-se a imunocromatografia devido sua alta sensibilidade e especificidade (DE OLIVEIRA IZAR, 2016; PONCE et al, 2005; RODDY et al, 2008; CARLIE et al, 2011). Recentemente foi publicado pela Fiocruz o novo kit de diagnóstico de DC crônica, com registro na Anvisa e produzido pela Unidade produtora de imunobiológicos da Fiocruz Bio-Manguinhos, com o intuito de contribuir para a melhoria do diagnóstico no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS), tendo em vista que os testes moleculares e sorológicos levam horas para apresentar um resultado, além de demandarem estrutura do laboratório, equipamentos modernos e qualificação dos profissionais. O novo teste é realizado em 15 minutos, utilizando amostras apenas pela punção da ponta do dedo do paciente (Fiocruz, 2020). 2.4 Tratamento A DC é uma doença negligenciada, com drogas aprovadas há mais de 40 anos de existência: benznidazol e nifurtimox (este último não disponível no Brasil), altamente tóxicas e pouco sensíveis, porém bastante eficazes na fase aguda. O fato de ser negligenciada implica falta de interesse das indústrias farmacêuticas em produzir medicamentos voltados para a doença; uma outra dificuldade encontrada é também a falta de padronização em relação a protocolos para os testes de drogas antichagásicas, além de que até 18 de maio de 2020 a Doença de Chagas não era considerada de notificação compulsória; logo, as informações não eram precisas. Atualmente, a DC crônica foi incluída na Lista Nacional de Notificações Compulsórias de doenças, agravos e eventos de saúde pública (DA SILVA et al, 2007; DIAS et al, 2009; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2020). A cura é determinada com a negativação do exame sorológico, sendo que, para a doença aguda, deve-se fazer o acompanhamento por cinco anos, excluindo-se possibilidade de reagudização (DIAS et al, 2015). Para a doença na fase crônica é recomendado o tratamento de sustentação 29 (minimização dos sintomas). Esta fase é caracterizada pelo nível de parasitemia baixo; porém, as manifestações clínicas (cardíacas, digestivas e cardiodigestivas) são graves, devido ao fato de haver a presença de formas amastigotas, infiltradas nos tecidos musculares, os quais dificilmente são atingidos pelas drogas (ZAIDAN, 2011; DIAS et al, 2015). Segundo o Guia de Vigilância em Saúde (BRASIL, 2017a) é importante ressaltar a obrigatoriedade do amparo aos doentes, feito pelo Sistema Único de Saúde (SUS), que atualmente disponibiliza como droga de tratamento o Benznidazol, mesmo que este cause variadas reações adversas como as expostas no artigo de Ferreira et al (2019), cujo trabalho demonstra que, quando adotado um esquema terapêutico, as reações adversas podem diminuir significativamente, e assim as taxas de adesão são maiores. A solicitação de uso do Benznidazol, oferecido pelo SUS por mediações das Secretarias Municipais de Saúde, depende da realização dos testes confirmatórios de doença de Chagas. O diagnóstico rápido e tratamento eficaz, dependem dos sinais e sintomas, os quais se apresentam de formas diferentes de acordo com a via de infecção (SOUZA, 2018; SILVA, 2017). Tendo em vista a negligência para notificação compulsória da doença de Chagas, à popularização do consumo de açaí e devido à falta de pesquisas sobre a contaminação deste alimento com T. cruzi, considerando a logística de produção do fruto, a famosa “rota do ouro roxo” até sua comercialização para diversas regiões do Brasil, propõe-se o presente estudo. Ainda, pretende-se avaliar a infectividade via oral em camundongos Balb-C a partir de amostras de açaí positivas à tamisação e à PCR para T.cruzi. 30 Objetivos 31 3 OBJETIVOS • Verificar a presença e motilidade de T. cruzi em polpas de açaí adquiridas do comércio em diferentes municípios do Estado de São Paulo; • Pesquisar o material genético de T.cruzi a partir das amostras de açaí; • Avaliar a infectividade “in vivo” das amostras de açaí positivas à tamisação e à prova molecular de PCR para T. cruzi. 32 Material e Métodos 33 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Comitê de Ética O trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética- CEUA da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP (nº de registro 1299/2019- anexo 1). 4.2 Aquisição e caracterização das amostras de açaí para pesquisa de Trypanosoma cruzi e municípios de procedência Foram adquiridas 35 amostras de açaí a partir de diferentes pontos de venda, supermercados e sorveterias tipo self- service, localizadas em onze municípios do Estado de São Paulo: Avaré, Botucatu, São Manuel, Bauru, Barra Bonita, Agudos, Pardinho, Pederneiras, Lençóis Paulista, Itatinga e Bofete (Figura 2). 34 Figura 2: Municípios do Estado de São Paulo selecionados para compra de açaí e pesquisa de Trypanosoma cruzi. Fonte: Google Maps – Com adaptações 35 As amostras de açaí foram adquiridas sob diferentes apresentações, dependendo do ponto de venda: em sorveterias self-service, era vendida uma porção de aproximadamente 100g de açaí (1bola/100mL), correspondendo a 33 amostras; e em supermercados o açaí era comercializado em potes de 180g, os quais não apresentavam o carimbo do Serviço de Inspeção Federal (S.I.F), correspondendo a duas amostras, uma do município de Botucatu e outra de Lençóis Paulista. Tendo em vista a variabilidade das marcas de açaí comercializadas em cada município, não foi possível estabelecer um número determinado de amostras a serem adquiridas em cada local; além disso, o intervalo de tempo de coleta até o processamento das amostras foi variável, tendo em vista que os pontos de coleta eram geograficamente diferentes. As coletas foram realizadas em dois dias diferentes: primeiramente foi organizado uma rota, cumprindo as coletas nas cidades de Lençóis Paulista, Agudos, Bauru, Pederneiras e Barra Bonita. No segundo dia, o mapeamento foi feito para que as coletas ocorressem nas cidades de São Manuel, Avaré, Itatinga, Pardinho, Bofete e Botucatu. Assim que adquiridas, as amostras de açaí foram identificadas e acondicionadas em caixa de isopor contendo gelo reciclável e transportadas em seguida ao laboratório, a fim de se iniciar o processo de filtração imediatamente. A identificação das amostras seguiu sua ordem de coleta, assim sendo numeradas de 1 a 35 (Quadro 2). 36 Quadro 2: Municípios de aquisição das amostras de açaí Número da amostra Cidade correspondente 1-3 Lençóis Paulista 4-7 Agudos 8-11 Bauru 12-14 Pederneiras 15-18 Barra Bonita 19-22 São Manuel 23-25 Avaré 26 e 27 Itatinga 28 Pardinho 29 e 30 Bofete 31-35 Botucatu Total 35 amostras 4.3 Pesquisa direta de T. cruzi nas amostras de açaí pela técnica de tamisação 4.3.1 Processo de tamisação forçada – método direto a partir de cada amostra de açaí Para a pesquisa das formas tripomastigotas de cada amostra de polpa de açaí coletada (100g), foi usado um método de filtração, o método de tamisação forçada, utilizando-se de 10mL, cuja metodologia foi descrita por Passos, Guaraldo, Barbosa (2012) e de Mattos et al. (2017), para posterior purificação de DNA e diagnóstico molecular para T.cruzi. O processo de filtração ou tamisação consiste em um processo de separação de conteúdo por tamanho de partícula ou por densidade. Este foi realizado utilizando- se de colunas de filtração (sob condições estéreis em capela de fluxo laminar), empregando-se seringas plásticas de 5mL e microesferas de metal estéreis com 3mm de diâmetro, preparando-se cada seringa para uma amostra, separadamente. Para a confecção das colunas na seringa, foi colocado uma primeira camada de algodão ortopédico, em sua base, para em seguida serem adicionadas as microesferas (de forma intercalada), até alcançar 1/3 da altura da seringa, e sua extremidade superior coberta por uma nova camada de algodão ortopédico ou lã 37 (Figura 3A), quando então foi adicionada a amostra de açaí, de forma fracionada (Figura 3B) e, após uma pequena pressão exercida, foi obtido o eluato (Figura 3C). Figura 3: Processo de tamisação das amostras de açaí. Colunas de filtração prontas para tamisação, com algodão ortopédico e microesfera de aço (A). Adição da amostra de açaí à coluna de filtração (B). Obtenção de eluato de açaí pela técnica de tamisação forçada (C). Fonte: Arquivo pessoal O processo permitiu a separação da parte sólida e líquida do açaí, garantindo assim a livre passagem dos parasitas através das colunas, passando a ficarem concentrados no eluato e permitindo que eles fossem recuperados, se estiverem presentes na polpa do açaí. Após a filtração, cada amostra de açaí foi fracionada em porções menores de aproximadamente 0,5mL de cada porção e mantidas sob temperaturas diferentes: a fresco, refrigeradas (4°C) e congeladas (-20°C). As amostras de açaí foram analisadas nos períodos de zero hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas e 48 horas, sendo o período de zero hora considerado o momento em que as amostras chegaram ao laboratório; o restante das amostras foram armazenados em freezer a -20ºC para as provas moleculares de PCR, bem como para a inoculação via gavagem em camundongos Balb-C. Para a contagem das formas tripomastigotas do eluato proveniente da filtração, foi realizada a leitura feita sob microscopia óptica, utilizando-se o aumento de 400X. 4.4 Pesquisa molecular – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi 4.4.1 Extração de DNA para T. cruzi Para as amostras de açaí foi utilizado o Kit comercial da GE Healthcare® (Ilustra Tissue and Cells GenomicPrep. Mini Spin kit), de acordo com o protocolo indicado pelo fabricante (Anexo 2). 38 4.4.2 Quantificação de DNA Todas as amostras de DNA extraídas foram quantificadas utilizando o aparelho NanoVue Plus (GE Healthcare®), no Laboratório de Sanidade Animal de Bauru - LASAB/APTA. O aparelho foi previamente calibrado utilizando-se 2μL de água ultrapura nas cavidades de leitura indicadas no aparelho. Após calibração, foram utilizados 2μL de cada amostra de DNA para leitura de quantificação. Os dados obtidos da quantificação, bem como a relação 260/280, encontram-se descritos no Anexo 3. Ácidos nucleicos absorvem luz à 260nm (comprimento de onda eletromagnética), enquanto proteínas absorvem luz à 280nm. A estimativa de pureza de DNA na amostra é verificada pela relação de absorbância 260/280. Valores dessa relação entre 1,8 a 2,0 são considerados ótimos para DNA. Valores abaixo de 1,8 podem indicar excesso de proteínas na amostra. 4.4.3 Reação em Cadeia da Polimerase convencional- cPCR para T. cruzi a partir das amostras de açaí 4.4.3.1 Controles positivos para PCR Foram utilizados dois controles positivos da reação, material de cultura de cepa Y de T. cruzi, mantidas em meios NNN-LIT (Anexo 4 e 5) e em meio 199 (Anexo 6) sob temperatura de 25oC em estufa B.O.D. 4.4.4 Procedimento cPCR O procedimento de cPCR foi realizado nos controles e em todas as amostras de açaí adquiridas do comércio dos onze municípios analisados, positivas ou negativas à tamisação. Para este processo foram escolhidos dois primers distintos: v7/v8 (561F e 561R), e o 121/122 (Quadro 3). 39 Quadro 3: Iniciadores para T.cruzi a partir de amostras de açaí – Técnica de cPCR Amplificação de interesse e alvo gênico Primers e tamanhos aproximados dos amplicons (em pares de bases - pb) Perfl de ciclagem e referência Família Trypanosomatidae (V7/V8) - Região V7/V8 do gene 16S SSU rRNA SSU561F: 5’TGGGATAACAAAGGAGCA3’ SSU561R: 5’CTGAGACTGTAACCTCAAAGC3’ ≈650pb 30x (94°C-30s; 54°C-1min; 72°C-2min.) (Noyes et al, 1996) Trypanosoma cruzi (121/122) - Minicírculos de kDNA 121: 5’AAATAATGTACGGGTGAGAGATGCATGA3’ 122: 5’GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT3’ ≈350pb 1x94°C–3min; 35x (94°C-30s; 57°C-30s; 72°C- 30s); 1x 72°C- 7min (Fitzwater et al., 2008). Em um tubo de 1,5mL foi adicionado 373,5μL água ultrapura, 58,5μL de Buffer, 18μL de MgCl, 11,25μL de dNTPs, 11,25μL do primer em teste (primer1 e primer2), e 11,25 μL de Taq-polimerase. Após homogeneizado foi passado para cada microtubo (0,2mL) 11 μL de mix e acrescentado 1 μL da amostra testada. Desta forma, cada microtubo continha 12μL, e para a ciclagem utilizou-se o termociclador da marca EPPENDORF - Master Cycle PRO, modelo 6321. Os produtos resultantes correspondem à amplificação do fragmento contendo uma região específica da região do microssatélite nDNA de T.cruzi, Todas as amostras foram submetidas à prova de cPCR em triplicata. 4.4.5 Eletroforese em gel de agarose O gel para eletroforese foi preparado com 2g de agarose pura em 100mL de tampão Tris-EDTA-Borato (TBE) 0,5X. A agarose foi dissolvida em TBE previamente aquecido, para que se dissolvesse totalmente e, após leve resfriamento, foi adicionado 7 μL de corante Syber Safe®. O material foi distribuído uniformemente na cuba de eletroforese. Alíquotas de 8μL das amostras amplificadas foram 40 homogeneizadas com 2μL de solução de azul de bromofenol, as quais foram submetidas à eletroforese horizontal em gel de agarose a 2,0% em tampão Tris- borato-EDTA (TBE) 1X e por último foi adicionado 4 μL de Ladder (100pb). A corrida foi realizada em 100 volts por 90 minutos. Ao final, as bandas eram visualizadas em transiluminador ultravioleta (fotodigitalização), com filtro de 300nm. Foram utilizados como controles positivos produtos da cepa amplificada de T. cruzi, e como negativa água mili-Q estéril, sendo o tamanho dos fragmentos amplificados verificados a partir da comparação visual com os padrões de peso molecular e com a cepa padrão utilizada como controle positivo. 4.5 Inóculo, grupos experimentais e via de inoculação 4.5.1 Obtenção das amostras controle negativo e positivo para os testes experimentais – inoculação via oral de açaí A partir de uma amostra de açaí pasteurizada (adquirida em pote e com carimbo do S.I.F, não pertencente à amostragem da pesquisa) foi realizada leitura em microscopia óptica no aumento 400X para pesquisa de formas tripomastigotas, sendo a mesma negativa e, portanto, a amostra controle negativo. Em seguida, procedeu-se o preparo de 50μL de T. cruzi (cepa Y) à uma alíquota da amostra de açaí pasteurizada, sabidamente negativa para T. cruzi, contaminando –o com a proporção de 2 x 106 parasitas/mL), adicionou-se 100μL açaí e 50μL de água ultra, obtendo-se assim o controle positivo para os experimentos a serem realizados com os animais (AMATO NETO et al, 1974; CARDOSO et al, 2006), conforme figuras 4. 41 Figura 4: Obtenção do controle positivo. Aspiração de 5mL de açaí pasteurizado para obtenção de eluato (A). Adição do eluato de açaí ao tubo de centrifugação (B). Contaminação do açaí com cepa Y de Trypanosoma cruzi (C). Homogeneização do eluato de açaí contaminado com T. cruzi (cepa Y) (D). Distribuição do eluato contaminado com cepa Y de T. cruzi em microtubos estéreis e livres de DNAse e RNAse (E). Fonte: Arquivo pessoal 4.5.2 Grupos de camundongos (Anexo 7) Com o objetivo de avaliar a infectividade das amostras de açaí positivas à tamisação e/ou à prova molecular de PCR para T. cruzi, foi realizada a inoculação destas amostras via oral (gavagem) em camundongos Balb/C, fêmeas, de 45 dias. Desta forma, foram determinados cinco (05) grupos de camundongos para avaliação da infectividade das amostras positivas à leitura direta e à cPCR. • Grupo 1: Controle positivo para T. cruzi Para este foram realizados a contaminação proposital de açaí, com cepa Y, como descrito no Item 4.5.1. • Grupo 2: Controle negativo para T. cruzi. Para este foram inoculados açaí sabidamente negativo para T. cruzi, como descrito no Item 4.5.1. • Grupo 3: Amostra positiva à leitura direta (método de tamisação forçada) – amostra 19 42 • Grupo 4: Amostra positiva à cPCR – amostra 12 • Grupo 5: Amostra positiva à cPCR- amostra 13 Todos os grupos foram compostos de três camundongos (total de 15 camundongos) Balb-C, fêmeas, de 45 dias de idade: todos os camundongos foram inoculados via gavagem, com uma quantidade de 100μL de açaí com adição de 100μL de água ultrapura (infecção oral), utilizando-se de uma cânula específica para o procedimento, e assim sucessivamente com as amostras correspondentes aos grupos (Figura 5). Figura 5: Gavagem em camundongo Balb/C. Inoculação de amostra de açaí para avaliação da infectividade de T.cruzi. Fonte: Arquivo pessoal Cada grupo de camundongos era acondicionado em uma caixa diferente, cada qual contendo os três (03) camundongos pertencentes a cada grupo (Figura 6). Os animais receberam água e alimento (ração) ad libitum durante toda a fase experimental. Toda a parte de experimentação animal foi realizada seguindo as recomendações da Comissão de ética de uso animal em experimentação (CEUA), através do Manual de Utilização Animal, publicado pela FIOCRUZ (2008). 43 Figura 6: Acondicionamento dos camundongos. Cada grupo de camundongo em uma caixa (A). Em cada caixa foram acondicionados três (03) camundongos, os quais receberam água e ração ad libitum (B). Fonte: Arquivo pessoal Após o período de incubação de sete dias, e avaliação de sinais clínicos visíveis, tais como pelos arrepiados e possível alteração da mucosa ocular conjuntival (PASSOS et al., 2012), foi realizada eutanásia dos camundongos para os procedimentos de punção cardíaca e retirada dos órgãos (fígado, baço, coração e língua). 4.5.3 Eutanásia e retirada de órgãos Decorrido o tempo de incubação, foi realizada a eutanásia, utilizando- se Thiopental® diluído a 5% (20mL em 1g), via intraperitoneal em camundongos. Em seguida, foi realizado o procedimento de exposição do coração e punção cardíaca, sendo possível a coleta de aproximadamente 1mL de sangue de cada camundongo (PASSOS et al., 2012; PAIVA et al, 2005; UNIFAL, 2016). A partir das amostras de sangue foram realizados esfregaços, para visualização das formas tripomastigotas, corados com a técnica de Giemsa e leitura sob microscopia óptica com óleo de imersão (aumento 1000X). Dos camundongos, foram retirados o coração, fígado, baço e língua, os quais foram pesados em balança analítica (BEL Engineering®) e realizados imprints com os fragmentos de cada órgão e posterior coloração de Giemsa, para pesquisa de formas amastigotas nos tecidos, pela leitura sob microscopia óptica com óleo de imersão (aumento 1000X). Portanto, foi obtido de cada camundongo quatro órgãos, bem como a retirada 44 de aproximadamente 1mL de sangue, pela punção cardíaca, para cada grupo (Figura 7). Figura 7: Retirada de órgãos e sangue por punção cardíaca a partir de um grupo amostral de camundongo (A e B); Órgãos retirados dos camundongos: fígado, baço, coração e língua (C); Seringa contendo aproximadamente 1 mL de sangue (D). Fonte: Arquivo pessoal Após todos esses procedimentos as carcaças dos roedores foram embaladas em papel alumínio, acondicionados em sacos plásticos (próprios para autoclave) e autoclavados a 120°C por 15 minutos, sendo os mesmos descartados em lixo infectante para posterior incineração. 4.5.4 Imprints Após a coleta dos órgãos (fígado, baço, coração e língua), a impressão em lâmina foi realizada imediatamente após corte diagonal dos mesmos utilizando-se de tesoura cirúrgica, e então com o auxílio de uma pinça, foi realizada com a parte interna dos órgãos uma leve compressão (“carimbo”) do fragmento sobre a lâmina, com movimentos delicados e sem sobreposição (Figura 8). A fixação, coloração e exame das lâminas foram realizadas conforme descrito no item 4.5.5. 45 Figura 8: Corte diagonal de órgão (A). Imprint de órgão em lâmina de microscopia (B). Procedimento realizado para todos os camundongos de todos os grupos, com órgãos e esfregaço sanguíneo (C). Fonte: Arquivo pessoal 4.5.5 Coloração de Giemsa e análise das lâminas Após o imprint dos órgãos em lâminas, as mesmas foram fixadas em álcool metílico (metanol) por 5 minutos; após, as lâminas foram vertidas para retirada do excesso e então foram coradas com corante de Giemsa por 30 minutos (Figura 9). Após decorrido este tempo, foram enxaguadas em água corrente para serem analisadas em microscópio óptico com óleo de imersão, sob aumento de 1000X. Figura 9: Fixação das lâminas com Metanol (A). Coloração com Giemsa (B). Fonte: Arquivo pessoal 46 4.5.6 Preparo dos órgãos – Maceração de órgãos para extração de DNA Em capela de fluxo laminar, a próxima etapa no processamento das amostras de tecidos (fígado, baço, coração e língua) foi a preparação dos inóculos para posterior extração do DNA. Desta forma, os fragmentos de tecidos foram retirados dos microtubos e macerados em cadinhos de porcelana estéreis. Após a maceração, adicionou-se 2 mL de Solução Salina Tamponada (SST) pH 7,2 pipetando-se 1.000 microlitros do sobrenadante para dois microtubos livres de DNAse e RNAse (1 mL para cada um), identificados e mantidos em freezer a -20 °C até a realização da extração de DNA. 4.5.7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – órgãos de camundongos A partir das amostras de tecidos macerados: fígado, baço, coração e língua, realizou-se o procedimento da extração de DNA, utilizando-se o Kit comercial da GE Healthcare® (Ilustra Tissue and Cells GenomicPrep. Mini Spin kit), de acordo com o protocolo indicado pelo fabricante (Anexo 2). Para as amostras de sangue foi utilizado o Kit comercial Illustra Blood GenomicPrep (GE Healthcare®) (Anexo 8). Em seguida foi realizado o processo de PCR e eletroforese, cuja metodologia está devidamente descrita anteriormente nos itens: 4.4.4 e 4.4.5. 47 Resultados e Discussão 48 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Amostras de açaí – comercialização e legislação A maioria dos locais de coleta funcionavam com o sistema de self-service, nos quais as amostras de açaí eram dispostas em freezers e vendidas por quilo, sob diferentes apresentações de sabores, tais como açaí com guaraná, acerola, morango e banana. Segundo um estudo realizado por Ferreira et al. (2018a) o xarope de guaraná colocado no açaí pode interferir e funcionar como um conservante para T. cruzi, mantendo assim por maior tempo sua viabilidade, devido a quantidade de carboidrato que esse tipo de xarope possui. A maioria dos açaís não apresentavam identificação das marcas comercializadas, exceto as grandes marcas, cujas franquias produzem seu próprio açaí, o que dificultou a garantia de que todos os açaís pertenciam a marcas distintas, impossibilitando assim sabermos se o açaí era pasteurizado ou não, além de ser impossível a identificação do selo do Serviço de Inspeção Federal (S.I.F). O selo do Sistema de Inspeção Federal (SIF), que é um serviço de fiscalização do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), é aplicado à produtos que podem ser produzidos e comercializados em todo o país e até exportados, assim como existem outros sistemas de inspeção para os produtos comercializados entre Estados, municípios e para produtos que são produzidos e comercializados, mas não importados, respectivamente: SISP (Serviço de Inspeção Estadual), SIM (Serviço de Inspeção Municipal), SISBI-POA (Sistema Brasileiro de Inspeção de Produtos de Origem Animal). Esses são serviços de inspeção de extrema importância para a saúde pública, pois visam as boas práticas de produção, assim garantindo a qualidade do produto final e segurança alimentar para o consumidor. Para as empresas se registrarem é utilizado o Sistema Integrado de Produtos e Estabelecimentos Agropecuários (SIPEAGRO), o qual consiste em uma ferramenta eletrônica do MAPA, utilizada para solicitação de registro de estabelecimentos que trabalham com classificação de produtos vegetais e com a elaboração (produção, envase, padronização) de bebidas, o que inclui o açaí, as polpas de frutas, os fermentados acéticos, a cachaça, os licores e outros produtos, além dos vinhos e seus derivados. Para estabelecimentos de pequeno porte, a Lei n° 13.648/2018 é regulamentada pelo Decreto Nº 10.026/2019, a qual enquadra as unidades de produção artesanal de polpa e suco de fruta, localizadas em áreas rurais que estejam sob a responsabilidade de agricultor familiar, ou empreendedor/empreendedora familiar rural que atenda ao http://legislacao.planalto.gov.br/legisla/legislacao.nsf/Viw_Identificacao/DEC%2010.026-2019?OpenDocument 49 disposto na Lei n° 11.326/2006, cujo objetivo é atender aos requisitos tecnológicos, sanitários e de identidade e qualidade (BRASIL, 2006, 2018b, 2019b). Há possibilidade de encontrarmos produtos sem o selo SIF, principalmente quando se trata de unidades de produção artesanal e familiar, porém o produto poderá ser comercializado com selo único indicativo de ARTE (Artesanal do Brasil) como descrito na Lei n° 13.680/2018, que se trata da comercialização de produtos com essa característica, de comercialização interestadual, porém que seguem as boas práticas agropecuárias e de fabricação, desde que submetidos à fiscalização (BRASIL, 2018c). O projeto de lei n°178/2010, recusou a obrigatoriedade da pasteurização do açaí, mantendo apenas, a Lei 6672/2016 a qual incentiva a produção da polpa de açaí pasteurizado, mesmo havendo diversos estudos na literatura indicando a importância do consumo do açaí pasteurizado como sendo mais seguro para a saúde do consumidor. Estudos mostram que o armazenamento da polpa de açaí à temperatura ambiente, à 4oC ou à -20oC, não afeta a capacidade de sobrevivência e virulência do T. cruzi, concluindo que o resfriamento não é o método eficaz para evitar DCA, porém o aquecimento acima de 44 °C de 10 a 20 minutos pode inativar T. cruzi na polpa de açaí (NEVES et al, 2007; BARBOSA et al, 2012; PASSOS et al, 2012; BRASIL, 2017b). Segundo o Ministério da Saúde, os produtores artesanais de açaí devem utilizar as técnicas de higienização e branqueamento (imersão em solução de hipoclorito) do fruto do açaí, além das boas práticas de coleta, transporte, armazenamento e manipulação, a fim de se evitar o risco de contaminação do fruto. É importante ressaltar que o processo de branqueamento é uma alternativa mais segura para o processamento artesanal do açaí, porém não é realizada de maneira frequente tendo em vista que, segundo os produtores, pode alterar o sabor e a coloração do açaí, o que prejudica a adesão dos mesmos. 5.2 Leitura direta – Microscopia óptica Após o processo de tamisação forçada, as amostras de açaí testadas apresentaram bastante divergência em sua apresentação por microscopia óptica (400X). A figura 10 demonstra dois exemplos de alguns deles, com algumas polpas se mostrando em sua visualização óptica uma forma mais uniforme e outros com maiores sujidades, o que dificultou a visualização microscópica do parasita, além do aspecto de coloração, a qual era por vezes muito escura, devido a quantidade de 50 matéria orgânica, mais especificamente fibras vegetais, como descrito por De Mattos et al. (2019). Figura 10: Aspectos microscópicos de eluato de amostras de açaí para pesquisa de formas tripomastigotas de T. cruzi. Notar as diferenças entre os aspectos de visualização da amostra A (poucas sujidades) e B (muitas sujidades) Fonte: Arquivo pessoal Em algumas amostras pode-se observar estruturas de fungos e fio de cabelo ou pelo, podendo ser considerado impróprio para consumo, segundo legislação brasileira RDC n° 175/2003 (BRASIL, 2003). Este fato confirma que as regras estabelecidas na RDC n° 218/2005 para a produção e processamento de açaí no Brasil não estão sendo cumpridas, pois ainda há falta do controle de qualidade dos produtos comercializados, o que demonstra a possibilidade de os produtos à base de açaí representarem uma ameaça à saúde da população, devido ao risco de transmissão oral (BRASIL, 2005b). Durante as leituras realizadas em diferentes períodos, como descrito no Item 4.3.1 (Pesquisa direta de T. cruzi nas amostras de açaí pela técnica de tamisação), foi possível visualizar uma amostra com estrutura de T. cruzi dentre as 35 amostras analisadas (2,86%), a qual não apresentava motilidade, com morfologia semelhante a tripomastigota de T. cruzi, como pode ser visualizado na figura 11, na leitura de 6 horas e em temperatura ambiente (amostra 19). 51 Figura 11: Visualização de forma tripomastigota de T. cruzi em amostra de açaí, pelo método direto de tamisação forçada – microscopia óptica (1000X). Fonte: Arquivo pessoal Esta amostra de açaí era procedente da cidade de São Manuel-SP, em cujo estabelecimento havia a identificação da marca comercializada. Pesquisando-se pelo site da marca deste açaí, não foi possível encontrar informações se a mesma apresentava o selo do SIF em seus produtos. O açaí estava disposto em freezer, para self- service, e seu sabor era tradicional, sem adição de xarope ou outros ingredientes. Pode-se justificar o fato de a estrutura não ter sido encontrada na leitura zero hora devido a quantidade de alíquota necessária ser pequena; além disso, deve-se considerar a quantidade de tripomastigotas que, nesse caso, devido ao processamento do açaí, acaba sendo diluído com outros materiais, tais como xarope de guaraná (ou outros sabores), mel, leite condensado, água, entre outros ingredientes, que irá variar, dependendo do tipo de polpa que se pretende produzir: especial, média ou popular (Bezerra, 2017). Segundo Sousa (2009) as condições de produção do fruto de açaí podem alterar as polpas e, consequentemente, os parasitas, como por exemplo, pH, umidade, temperatura e fertilidade do solo. Em relação à imobilidade da estrutura encontrada pode ser justificado devido ao tempo de incubação. Segundo um estudo realizado por De Mattos et al. (2019), com a contaminação experimental de amostras de açaí, durante a análise da integridade das formas de tripomastigotas, notou-se que os parasitas incubados em açaí por 4 horas a 26°C, apresentavam alteração de movimento, bem como apresentavam-se mais lentas e, 52 após 8h de incubação, as formas apresentavam total alteração da forma, tornando-se arredondadas, sendo que após 24h de incubação as formas tripomastigotas estavam totalmente lisadas, sendo impossível sua detecção. Os mesmos autores afirmam que o processo de refrigeração (4°C) possibilita às formas tripomastigotas manterem-se mais viáveis por 4horas, formas esta que se tornaram imóveis à leitura de 8h, e apenas à leitura de 24 horas as mesmas apresentaram suas formas alteradas para arredondadas, concluindo-se, portanto, que a leitura de 24 horas, nas duas temperaturas não houve detecção de parasitas vivos. Em estudo realizado por Santana et al (2019), os autores relatam que, após a contaminação do açaí e outros alimentos envolvidos na pesquisa, a sobrevivência dos parasitas varia de acordo com o tipo de alimento e presença ou ausência de refrigeração, levantando-se a hipótese de que a longa sobrevivência do parasita está associada ao congelamento da amostra na presença de crioprotetores, provavelmente presentes no teor gorduroso do suco de açaí. A contaminação do açaí é um problema de relevância em saúde pública, enfatizando a importância do presente estudo cuja proposta é a investigação do T. cruzi e/ou seu material genético, nas amostras de açaí comercializadas, tendo em vista que até o momento não há legislação que obrigue a pasteurização do açaí a ser comercializado, assim não havendo segurança do produto consumido. Considerando o aumento e a popularização do consumo de açaí e à possível infecção via oral, esta vem sendo uma problemática que pode levar a um aumento do número de casos agudos de DC pela contaminação oral. 5.3 PCR convencional – amostras de açaí Previamente à realização da PCR nas amostras extraídas de açaí, realizou-se a quantificação de DNA das mesmas, assim como nas amostras controle, apresentados no Anexo 3. Após extração de DNA, todas as 35 amostras coletadas foram destinadas à PCR convencional e eletroforese, utilizando-se os primers: 121/122 e V7/V8, os quais amplificam minicírculos de kDNA de T. cruzi. Dos resultados da PCR com os primers V7/V8 para a família Trypanosomatidae, todas as 35 amostras foram negativas. Porém, com os primers 121/122, específicos para T. cruzi, duas amostras, procedentes do município de Pederneiras- SP, foram positivas (Figura 13), as quais correspondem às amostras 12 e 13. Todas as amostras foram submetidas em triplicata para ambos os primers. 53 Figura 12: Eletroforese em gel de agarose a 2% para os iniciadores 121/122 (~350pb) para Trypanosoma cruzi. Marcador de peso molecular 100pb. Colunas 2 e 3 – amostras amplificadas; 4 – controle positivo (Trypanosoma cruzi); 5 – controle negativo (água ultrapura). Fonte: Arquivo pessoal As amostras 12 e 13 foram coletadas de sorveteria tipo self-service, procedentes do Município de Pederneiras-SP. No local não havia especificação da marca fornecida; o açaí estava acondicionado em freezer, com apresentação de diversos sabores, porém o coletado foi do sabor tradicional, prezando a não adição de qualquer tipo de xarope de frutas ou outros ingredientes. A amostra 19, a qual foi positiva à técnica de tamisação, foi negativa ao teste de PCR, justificando-se tal resultado, tendo em vista a sensibilidade e especificidade da técnica de PCR, a quantidade de DNA existente na amostra, além das sujidades inibitórias da reação de PCR. 54 5.4 Grupos experimentais – Leitura em microscopia óptica dos esfregaços sanguíneos e imprints de órgãos de camundongos Após o processo de eutanásia dos animais previamente infectados com amostras positivas á tamisação e à PCR, procedeu-se à pesagem dos órgãos: fígado, baço, coração e língua em balança analítica, resultados este descritos no Anexo 9 e leitura em microscopia óptica. Ressalta-se que não foi realizada análise estatística a partir dos resultados da pesagem da língua, tendo em vista que a mesma não foi retirada por inteiro, e sim apenas um fragmento. Foi possível encontrar algumas formas evolutivas de T. cruzi em grupos específicos, como indicado nas Figuras 13, 14, 15 e 16, a seguir: 55 Figura 13: Visualizações microscópicas de imprints de órgãos de camundongos previamente infectados com amostras de açaí. Figuras de A a E, referentes ao Grupo 1, controle positivo, o qual recebeu açaí contaminado com cepa Y de T.cruzi. Imprint de fígado, apresentando células rompidas liberando formas amastigotas de T. cruzi, bem como de células ainda não rompidas (A e B). Esfregaço de sangue, apresentando 56 formas tripomastigotas de T. cruzi (C e D). Imprint de língua, com a presença de formas amastigotas, como indicada na seta (E). Fonte: Arquivo pessoal Figura 14: Visualização microscópica de esfregaço sanguíneo de camundongo previamente infectado com açaí. Figura referente ao Grupo 3, correspondente a camundongo infectado com amostra de açaí positiva à tamisação forçada - amostra 19). Pode-se notar formas tripomastigotas de T. cruzi. Figura 15: Visualizações microscópicas de esfregaço sanguíneo e de imprint de língua de camundongo previamente infectado com açaí. Figuras A e B, referentes ao Grupo 4, infectados com amostra 12 (positiva à PCR). Esfregaço sanguíneo, podendo-se verificar forma tripomastigota de T. cruzi, circulada (A). Imprint de língua, verificando-se forma amastigota de T.cruzi, circulada (B). 57 Fonte: Arquivo pessoal Figura 16: Visualização microscópica de esfregaço sanguíneo de camundongo previamente infectado com açaí. Figura referente ao Grupo 5, infectados com amostra de açaí positiva à PCR (amostra 13). Pode-se visualizar formas tripomastigotas de T. cruzi. Fonte: Arquivo pessoal A visualização de formas evolutivas de T.cruzi em todos os grupos experimentalmente infectados indicam que as amostras de açaí contaminadas foram passíveis de realizar a infecção in vivo em camundongos. Apesar da baixa concentração de DNA nas amostras de açaí, o que foi possível de visualizar perante a leitura referente à quantificação de DNA (Anexo 3), pudemos inferir a baixa carga parasitária em sangue e tecidos. No grupo controle positivo (Grupo 1), inoculado com açaí contendo cepa Y de T.cruzi, foi possível a visualização de formas tripomastigotas no sangue, bem como de formas amastigotas em tecido hepático, o que difere das observações relatadas por Borges (1982), o qual observou formas amastigotas apenas em tecido cardíaco, 58 pela inoculação de cepa Y de T.cruzi e observação a partir do oitavo dia, em que verificou-se ação inicialmente miotrópica. Nossas observações permitiram visualização de formas amastigotas em fígado, no sétimo dia de infecção, podendo- se inferir que, devido ao fígado fazer parte do sistema fagócito monocitário, o qual possui grande quantidade de macrófagos, logo ocorre multiplicação intensa do T. cruzi, o qual invade as células sob a forma tripomastigota e ocorrendo sua diferenciação para formas amastigotas, com intensa multiplicação e invasão de novas células. Barreto de Albuquerque et al. (2018) verificaram que, em trabalho experimental em camundongos, o local de entrada do parasita, pela boca, pela infecção oral (IO), que é mais semelhante à infecção natural, comparado à infecção gastrointestinal (IG), promove diferentes respostas imunológicas e mortalidade do hospedeiro. Assim, em comparação com os camundongos inoculados via IG, os camundongos inoculados via IO apresentaram elevada taxa de infecção e parasitemia, tendo-se observado que cavidade oral era o sítio primário de infecção e que a cavidade nasal compreendeu a maior parte da replicação do parasita, verificado pela técnica de bioluminescência (SILVA-DOS-SANTOS et al., 2017). Em nossas observações, foi possível detectar-se formas amastigotas na língua, em camundongos pertencentes aos grupos 1 (controle positivo) e 4 (grupo de camundongos que receberam açaí positivo à PCR para T.cruzi), podendo-se inferir a maior carga parasitária nestes grupos. Deve-se atentar ao fato da cepa presente nas amostras de açaí utilizadas para inoculação serem desconhecidas, e que cada cepa tem seu pico de parasitemia e seu tropismo para determinado tecido, o que possibilita o desenvolvimento de diferentes formas clínicas de apresentação da DC. Segundo Nogueira-Paiva (2015) as cepas Be-62 são mais virulentas, apresentam pico de parasitemia no sétimo dia de infecção e suas formas são mais delgadas; já a Be-78 tem pico de parasitemia após 10 dias de infecção e visualmente suas formas são mais largas. Outro estudo realizado por Silva (2006), testando-se quatro cepas diferentes: AMJM, BFS, NCS, NBR, foi possível observar que as cepas apresentaram dias diferentes de pico de parasitemia variando de 18 a 23 dias e com diferentes reações inflamatórias, as quais algumas atingiram musculo cardíaco e esquelético como a AMJM; a cepa NCS ocasionou inflamações nos músculos cardíacos, esqueléticos e gânglios nervosos; já a BFS apresentou alterações nos músculos cardíacos e intestino. Schlemper Junior (1986), em um estudo com cepas do Sul do Brasil, estabeleceu 59 que a cepa SC-1 apresentava uma quantidade alta de parasitas circulantes logo no sexto dia de infecção e um nível de parasitemia crescente até a morte, e a SC-5 apresentou aumento de parasitemia após o décimo dia e um pico de parasitemia com 26 dias. Um estudo realizado por Magalhães (1985) demonstrou-se que a cepa Y de T.cruzi apresentou um aumento de parasitas no sétimo dia de infecção, e um pico de parasitemia no décimo dia de infecção, tendo-se seu parasitismo atingido macrófagos do baço, fígado e tecido adiposo e baixo tropismo por células do miocárdio, o que corrobora com as observações do presente estudo, já que não foram encontradas formas amastigotas em tecido cardíaco, tanto no grupo controle positivo, infectado com açaí contendo formas da cepa Y de T.cruzi, quanto dos demais grupos avaliados. Desta forma, nota-se que as cepas apresentam tropismo por diferentes locais, bem como pico de parasitemia divergentes. Verificamos de uma maneira geral, nos cinco grupos avaliados, uma baixa carga parasitária, a qual não possibilitou a detecção de DNA de T.cruzi a partir da PCR, sendo somente possível a pesquisa direta das formas de T.cruzi pela microscopia óptica. Na fase aguda da doença de Chagas o período de incubação varia de 20 a 40 dias, porém períodos mais curtos (8 dias) e mais longos (120 dias) já foram descritos, sendo mais prolongado do que se observa na transmissão pela via vetorial (Santos 2016). Estudo realizado por Añez (2021 ) pretendeu identificar se T. cruzi apresentava algum tropismo específico para tecidos ou para células generalizadas em mamíferos; desta forma, camundongos foram inoculados via intraperitoneal e intradérmica, e os resultados mostraram que T. cruzi de cepas DTU1 e DTU2 não apresentou tropismo específico de tecidos, sendo capaz de invadir tecidos ectodérmicas (cérebro e pele), mesodérmicas (coração e baço) e endodérmicas (fígado, musculo esquelético e intestino), independentemente da linhagem do parasita, forma infecciosa, rota de entrada ou tamanho do inóculo causando a infecção do hospedeiro. Dias et al. (2013), apresentaram um estudo com a evolução da infecção em camundongos inoculados via intraperitoneal e via oral, tendo-se verificado que, camundongos infectados oralmente apresentaram níveis de parasitemia, bem como taxas de infectividade e mortalidade, menores do que os animais inoculados via intraperitoneal, independentemente do inóculo. Neste estudo, os camundongos foram avaliados após 7 dias de evolução, quando então foram eutanasiados, sendo que não sabemos a cepa de T.cruzi a qual estava presente no açaí contaminado. Desta forma, a via oral da infecção por Trypanosoma cruzi, o período de 60 incubação, as cepas inoculadas e as consequências no hospedeiro são fatores importantes e condicionam à forma de como a doença irá manifestar-se dentro do modelo animal. Rotas distintas de entrada de parasitas podem afetar o sistema imunológico (BARRETO de ALBUQUERQUE et al, 2018). 5.5 PCR convencional - órgãos de camundongos Previamente à realização da PCR nas amostras extraídas de órgãos de camundongos macerados, realizou-se a quantificação de DNA (Anexo 10). Após extração de DNA, todas as 35 amostras coletadas foram destinadas à PCR convencional e eletroforese, utilizando-se os primers: 121/122, os quais amplificam minicírculos de kDNA de T. cruzi, com 330pb. Dos resultados da PCR com os primers 121/122, todas as 35 amostras foram negativas. Como discutido acima, verificamos uma baixa carga parasitária em sangue e tecidos dos cinco grupos avaliados, incluindo-se o grupo controle positivo, o qual também não possibilitou a detecção de DNA de T.cruzi a partir da PCR, sendo somente possível a pesquisa direta de formas amastigotas e tripomastigotas de T.cruzi pela microscopia óptica, nos grupos controle positivo e nos grupos de camundongos que receberam açaí positivo à técnica de tamisação forçada e açaí positivo à PCR para T.cruzi .Gomes (1998) relata que a PCR tem uma sensibilidade boa, porém ainda limitada em indivíduos com parasitemia baixa, o que pudemos observar frente ao teste de PCR a partir de sangue e órgãos de camundongos infectados com amostras de açaí positivas para T.cruzi. Além disso, trabalho de Pereira et al. (2016), afirmaram que a variabilidade na sensibilidade da PCR pode ser explicada devido a quantidade de parasitas existentes circulantes no momento da coleta. 5.6 Análise estatística Foram obtidos dados descritivos para os resultados parasitológicos e PCR, e dados numéricos para dados relacionados à pesagem de órgãos e quantificação de DNA. Desta forma, as análises basearam-se em um modelo linear generalizado com distribuição gama (assimétrica), seguido do teste de comparação múltipla de Wald. Em todos os testes foi fixado o nível de significância de 5% ou o p-valor correspondente. Todas as análises foram feitas pelo programa SAS for windows, v9.4. Com base nas análises sobre a pesagem de órgãos coletados nos diferentes 61 grupos de camundongos (Tabela 1), em uma análise geral, quando comparamos inicialmente o Grupo 1 (controle positivo), com os outros grupos, este difere-se estatisticamente: do grupo 2 no coração, do grupo 3 em fígado, do grupo 4 em relação a todos os órgãos, e do grupo 5 em coração e fígado. Verificou-se também diferença estatística entre o grupo 1 do grupo 2 (grupo controle negativo), em relação ao coração; porém o valor de p não mostra uma diferença estatística significativa. O valor de p mostra uma diferença estatisticamente considerável nos órgãos fígado e baço (em destaque na Tabela 1). Em relação ao fígado, quando comparamos os grupos 1 e 2, os mesmos diferem-se dos grupos 3, 4 e 5, indicando uma hepatomegalia. Em relação ao baço, a diferença estatística está nos grupos 1, 2, 3 e 5, quando comparado com o grupo 4, dados estes que não apresentaram relação com dados descritos anteriormente, indicando uma esplenomegalia. Os testes foram aplicados a todos os órgãos, com exceção da língua, pois não houve padrão de coleta, tendo em vista que se coletou apenas uma porção do órgão, e não o órgão inteiro, como ocorreu com o fígado, baço e coração. Desta forma, não foi realizada a comparação deste órgão entre os grupos. Tabela 1: Comparação de médias entre grupos para os pesos de órgãos. G1 G2 G3 G4 G5 Órgãos Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP p-valor Coração 0.11a 0.08 0.20b 0.01 0.15a 0.03 0.20b 0.02 0.18b 0.00 0.1684 Fígado 0.53a 0.13 0.76a 0.47 1.08b 0.04 1.08b 0.21 1.10b 0.19 0.0179 Baço 0.12a 0.04 0.19a 0.12 0.17a 0.01 0.54b 0.58 0.18a 0.05 0.0182 Comparação entre grupos utilizando um modelo linear generalizado com distribuição gama. Médias seguidas de mesma letra não diferem ao nível de 5% pelo teste de Wald O teste também foi aplicado para a comparação entre os grupos em relação a quantificação de DNA (Tabela 2). 62 Tabela 2: Comparação de médias entre grupos para quantificação de DNA. G1 G2 G3 G4 G5 Órgãos Variáveis Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP p-valor Baço DNA 1,71 0,04 1,52 0,43 1,72 0,07 1,78 0,03 1,84 0,03 0,3753 Coração DNA 1,55 0,19 1,79 0,25 1,74 0,05 1,72 0,28 1,62 0,44 0,7463 Fígado DNA 1,79a 0,05 1,87a 0,05 1,83a 0,04 1,32b 0,13 1,79a 0,02 <0,0001 Língua DNA 1,81 0,08 1,89 0,03 1,88 0,09 1,52 0,41 1,77 0,08 0,1890 Sangue DNA 1,7 0,26 1,86 0,06 1,78 0,34 1,73 0,17 1,82 0,09 0,8393 Comparação entre grupos utilizando um modelo linear generalizado com distribuição gama. Médias seguidas de mesma letra não diferem ao nível de 5% pelo teste de Wald Observa-se que o fígado apresentou diferença estatística significativa (em destaque na Tabela 2), entre os grupos. Isso pode ser justificado devido o fígado fazer parte do sistema fagócito monocitário, tendo-se assim grande quantidade de macrófagos, logo ocorrendo multiplicação intensa do T. cruzi, o qual invade as células sob a forma tripomastigota, adentrando em macrófagos, para sua diferenciação em amastigotas e intensa multiplicação. Considerando o valor de p indicar uma diferença estatística significativa para fígado, comparou-se os grupos entre si; logo, notou-se que o grupo 4, quando comparado a outros grupos diferencia-se, porém, esta significância não tem relação com os dados obtidos anteriormente de leitura de lâminas e pesagem de órgãos. 63 Conclusões 64 6 CONCLUSÕES - Este estudo permitiu a verificação de forma tripomastigota de T.cruzi em eluato de polpa de açaí, comercializada em sorveteria, sendo o primeiro relato na região; - Houve a detecção do material genético de T.cruzi em duas amostras de açaí, adquiridas de um mesmo município, sinalizando a importância da fiscalização para a comercialização adequada do fruto seguindo as boas práticas sanitárias; - A infectividade das amostras de açaí foi investigada, concluindo-se assim que as amostras de açaí positivas à tamisação e à PCR foram capazes de causar infecção in vivo em camundongos inoculados via gavagem. 65 Referências 66 1 ABNT. NBR 6023: informação e documentação: referências: elaboração. 2.ed. Rio de Janeiro: ABNT, 2018. ________________________________ 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1 ALVES, I. C. B. Caracterização da resposta imune humoral de indivíduos com Doença de Chagas. 2017. Tese de Doutorado. Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 2017. AMAPÁ (Estado). Lei n° 1914, de 03 de julho de 2015. Dispõe sobre a implementação do Programa Estadual de Qualidade do Açaí e cria o selo qualidade para estabelecimentos que produzam bebidas e alimentos de consumo humano de origem vegetal (açaí e bacaba) no Estado do Amapá e dá outras providências. Diário Oficial do Estado, Macapá, 3 jul, 2015. AMATO NETO V; CAMPOS R; HIGAKI Y. Analise clínica e baseada em exames subsidiarios de paciente da qual foi isolada, há vinte e três anos, a cepa y do Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto Medicina Tropical, São Paulo, VOL. 16, n. 4, p. 238-244, 1974. AÑEZ, N., & CRISANTE, G. The tissue specific tropism in Trypanosoma cruzi. Is it true? Acta Tropica, v. 213, p. 105736, 2021. BARRETO DE ALBUQUERQUE, Juliana et al. Inoculação oral versus intragástrica: Caminhos similares da infecção experimental de Trypanosoma cruzi? A partir de tecidos alvo, evasão de parasitas e resposta imune. Frontiers in Immunology, v. 9, p. 1734, 2018. BARBOSA, Rodrigo Labello et al. Survival in vitro and virulence of Trypanosoma cruzi in açaí pulp in experimental acute Chagas disease. Journal of Food Protection, v. 75, n. 3, p. 601-606, 2012. BARBOSA, Rodrigo Labello et al. Virulence of Trypanosoma cruzi from vector and reservoir in natura açaí pulp resulting in food-borne acute Chagas disease at Pará State, Brazil. Experimental Parasitology, v. 197, p. 68-75, 2019. BEZERRA, V. S. Açaí congelado / Valéria Saldanha Bezerra. – Brasília, DF : Embrapa Informação Tecnológica, 40 p. – (Coleção Agroindústria Familiar). 2017. BISIO, Margarita et al. Urbanization of congenital transmission of Trypanosoma cruzi: prospective polymerase chain reaction study in pregnancy. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 105, n. 10, p. 543-549, 2011. BORGES, M. M., Mello, D. A., & Teixeira, M. L. Results of the experimental infection of Calomys callosus (Rodentia) with human strains of Trypanosoma cruzi. Revista de Saúde Pública, v. 16, n. 4, p. 233-242, 1982. https://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=search&lang=en&terms=%22AMATO+NETO+V%22&index=au https://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=search&lang=en&terms=%22AMATO+NETO+V%22&index=au https://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=search&lang=en&terms=%22CAMPOS+R%22&index=au https://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=search&lang=en&terms=%22HIGAKI+Y%22&index=au 67 1 ABNT. NBR 6023: informação e documentação: referências: elaboração. 2.ed. Rio de Janeiro: ABNT, 2018. ________________________________ BORGES, C. R. B. Papel do óxido nítrico no desenvolvimento de lesões cardíacas na fase aguda e crônica da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi. 2008. 92 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Geral) - Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, 2008. BRASIL (SP). RDC 175, 08 de julho de 2003. Regulamento Técnico de Avaliação de Matérias Macroscópicas e Microscópicas Prejudiciais à Saúde Humana em Alimentos Embalados. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Disponível em: https://www.anvisa.gov.br/anvisalegis/resol/2003/rdc/175_03rdc.htm. BRASIL. Ministério da Saúde. Doença de Chagas aguda relacionada à ingestão de caldo de cana em Santa Catarina. Nota técnica. Brasília, 2005a. BRASIL (SP). RDC 218, 29 de julho 2005. Regulamento Técnico de Procedimento higiênico sanitários para manipulação de alimentos e bebidas preparados com vegetais. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). 2005b. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/inspecao/produtos-vegetal/legislacao- 1/biblioteca-de-normas-vinhos-e-bebidas/resolucao-rdc-no-218-de-29-de-julho-de- 2005.pdf/view BRASIL (SP). LEI Nº 11.326, DE 24 de julho de 2006. Constituição da República Federativa. Brasília, DF: Presidência da República. 2006. Disponível em: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2006/Lei/L11326.htm. BRASIL (SP). Projeto de lei n°178, de 10 de agosto de 2010a. Senado federal. Senado Federal: Brasília, DF, 2010. Disponível em: https://www25.senado.leg.br/web/atividade/materias/-/materia/97286. BRASIL, Pedro EAA et al. ELISA versus PCR for diagnosis of chronic Chagas disease: systematic review and meta-analysis. BMC Infectious Diseases, v. 10, n. 1, p. 1-17, 2010b. BRASIL. Ministério da Saúde. Recomendações sobre o diagnóstico parasitológico, sorológico e molecular para confirmação da doença de Chagas aguda e crônica. Revista Patologia Tropical, v. 42, n. 4. Brasília, 2013. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/portalsaude/arquivos/pdf/2013/Nov/18/Informe_Diagn ostico_DC_NUCOM_2_.pdf. E publicada com autorização da Gerência Técnica de Raiva e Chagas, Ministério da Saúde, 2013 BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde: Doença de Chagas Aguda no Brasil: Série Histórica de 2000 a 2013. Boletim Epidemiológico, 46, p21. Brasília, 2015. BRASIL (SP). Guia de vigilância em saúde – volume 3. 1ªed. Brasília, DF: Ministério da Saúde. 2017a. Disponível em: https://www.anvisa.gov.br/anvi