UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO MASSAL E FORMULAÇÃO DE Bipolaris euphorbiae VISANDO A OBTENÇÃO DE UM BIOHERBICIDA Ana Carolina Ribeiro Machado Bióloga 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO MASSAL E FORMULAÇÃO DE Bipolaris euphorbiae VISANDO A OBTENÇÃO DE UM BIOHERBICIDA Ana Carolina Ribeiro Machado Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agropecuária JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL 2013 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. Machado, Ana Carolina Ribeiro M149o Otimização da produção massal e formulação de Bipolaris euphorbiae visando a obtenção de um bioherbicida / Ana Carolina Ribeiro Machado. – – Jaboticabal, 2013 ix, 70 f. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2013 Orientador: Antonio Carlos Monteiro Banca examinadora: Kátia de Lima Nechet, Kátia Cristina Kupper, Rita de Cássia Panizzi, Sandra Regina Ceccato Antonini Bibliografia 1. Produção massal. 2. Compatibilidade. 3. Armazenamento. 4. Infectividade. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 632.937 DADOS CURRICULARES DA AUTORA ANA CAROLINA RIBEIRO MACHADO - Nasceu em 21 de abril de 1981, na cidade de Goiânia, Goiás e formou-se em Biologia (licenciatura plena) pela Universidade Estadual de Goiás (UEG) em 2004. Em 2006 concluiu o Curso de Especialização (lato sensu) em Microbiologia pelo Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás. No mesmo ano ingressou no Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) / Unesp - Jaboticabal, recebendo o titulo de mestre em 2008. Ingressou no Curso de Doutorado do mesmo programa, em 2008. Publicou e apresentou 25 trabalhos em anais de congressos e simpósios científicos e 04 artigos completos em periódicos especializados. Ministrou aulas das disciplinas de Microbiologia Geral e Microbiologia Ambiental do curso de graduação em Ciências Biológicas da FCAV/Unesp e da disciplina Biologia, Produção e Utilização de Microrganismos Patógenos de Insetos do Programa de Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária, como professora convidada. Não sei se a vida é curta ou longa para nós, mas sei que nada do que vivemos tem sentido, se não tocarmos o coração das pessoas. Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve, palavra que conforta, silêncio que respeita, alegria que contagia, olhar que acaricia, amor que promove. E isso é o que dá sentido à vida, é o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais, mas que seja intensa, verdadeira, pura enquanto durar. Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina. Cora Coralina Ao meu orientador, Prof. Monteiro, que encerra um ciclo de dedicação à pesquisa e formação de novos profissionais AGRADEÇO EM ESPECIAL À minha base... meus pais José de Roma e Fátima Ao meu marido, amigo e companheiro Edson Júnior OFEREÇO Ao pequeno Samuel, meu maior e mais bonito projeto de vida, que me faz desde já a pessoa mais feliz e realizada desse mundo DEDICO AGRADECIMENTOS À Deus por ter me proporcionado encontros tão especiais e pela oportunidade de crescimento pessoal e profissional ; Ao meu mentor e amigos espirituais pelo amparo, suporte e vibrações positivas; Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro pela confiança, paciência, amizade, por ser um exemplo a ser seguido de profissional íntegro e dedicado; À Profª Drª Sandra Regina Ceccato Antonini e Drª Kátia de Lima Nechet pela atenção e carinho que tiveram com o trabalho e considerações valiosas; À Profª Drª Rita de Cassia Panizzi e Drª Kátia Cristina Kupper por mais uma vez colaborarem com suas sugestões para a melhoria do trabalho; À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Programa de pós-graduação em Microbiologia Agropecuária, pelo apoio e concessão da bolsa de doutorado; Ao Dr. Claudinei Cruz e a toda equipe do NEPEAM pela valiosa colaboração na fase final do trabalho; Às amigas especiais e que ao longo desses 4 anos tomaram rumos incríveis: Luciana Yoshida, Dinalva Alves Mochi e Claudia de Sousa Demétrio; À querida Edna D’Áquila, sempre tão amável e disposta a ajudar; Aos meus pais incríveis pelo amor incondicional, por terem me guiado e orientado sempre pelo caminho do bem... enfim, por tudo o que sou hoje; Ao meu grande amor, maior e melhor amigo, Edson Júnior, pelo incentivo, apoio... por simplesmente fazer parte da minha vida e ter sido a razão de toda essa história ter começado; À família maravilhosa que me recebeu de braços abertos e que hoje faço parte com tanto orgulho: Cris, Ed, Paula, Fernanda, Ricardo, Melissa e Joaquim; À minha família de “sangue” (irmão, tios (as), primas) pelo amor, torcida e por dividirem comigo mais essa conquista; À amiga-irmã Jô Guedes pelo carinho e dedicação a mim e aos meus pais; A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, seja cientificamente ou não... MUITÍSSIMO OBRIGADA! i SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURA E TABELAS ....................................................................... iii RESUMO ........................................................................................................... vi ABSTRACT........................................................................................................ viii CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................... 1 1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 2 3. REFERÊNCIAS........................................................................................... 8 CAPÍTULO 2 - PADRONIZAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PRÉ-ETAPAS PARA FORMULAÇÃO DE BIOHERBICIDA À BASE DE Bipolaris euphorbiae....... 15 RESUMO............................................................................................................ 15 ABSTRACT........................................................................................................ 16 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 17 2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 19 2.1. Fungo.................................................................................................... 19 2.2. Influência do período de incubação na produção de Bipolaris euphorbiae................................................................................................... 19 2.2.1. Cultivo em meio sólido....................................................................... 19 2.2.2. Cultivo em sistema bifásico................................................................ 20 2.2.3. Avaliação............................................................................................ 20 2.3. Influência do volume de suspensão de Bipolaris euphorbiae para produção em sistema bifásico...................................................................... 21 2.4. Secagem de conídios de Bipolaris euphorbiae...................................... 21 2.5. Obtenção de conídios de Bipolaris euphorbiae.................................... 2.6. Análise estatística.................................................................................. 23 23 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 24 3.1. Influência do período de incubação na produção de Bipolaris euphorbiae................................................................................................... 24 3.2. Influência do volume de suspensão de Bipolaris euphorbiae usada na fase sólida do sistema bifásico................................................................ 26 ii 3.3. Secagem de conídios de Bipolaris euphorbiae...................................... 27 3.4. Obtenção de conídios de Bipolaris euphorbiae..................................... 30 4. CONCLUSÕES............................................................................................. 5. REFERÊNCIAS............................................................................................ 31 31 CAPÍTULO 3 - PERFIL DE TOXICIDADE DE ADJUVANTES AO FUNGO Bipolaris euphorbiae E AVALIAÇÃO DE SUA VIABILIDADE E INFECTIVIDADE APÓS FORMULADO.............................................................. 35 RESUMO ............................................................................................................ 35 ABSTRACT......................................................................................................... 37 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 39 2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 40 2.1. Toxicidade dos adjuvantes ao Bipolaris euphorbiae.............................. 40 2.2. Composição da formulação à base de Bipolaris euphorbiae................ 44 2.3. Avaliação da viabilidade de Bipolaris euphorbiae durante o armazenamento da formulação.................................................................... 44 2.4. Avaliação da infectividade Bipolaris euphorbiae em Euphorbia heterophylla após formulação....................................................................... 45 2.5. Análise estatística................................................................................. 46 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 46 3.1. Toxicidade dos fotoprotetores ao Bipolaris euphorbiae......................... 3.2. Toxicidade dos surfactantes ao Bipolaris euphorbiae.......................... 3.3. Toxicidade dos antiumectantes ao Bipolaris euphorbiae....................... 3.4. Toxicidade dos espalhantes adesivos ao Bipolaris euphorbiae............ 3.5. Avaliação da viabilidade de Bipolaris euphorbiae durante o armazenamento da formulação.................................................................... 3.6. Avaliação da infectividade de Bipolaris euphorbiae em Euphorbia heterophylla após formulação....................................................................... 46 50 53 56 59 61 4. CONCLUSÕES............................................................................................. 5. REFERÊNCIAS............................................................................................ CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................... 63 64 70 iii LISTA DE FIGURA E TABELAS Página CAPÍTULO 2 Figura 1. Equipamento de fluxo contínuo de ar usado para secagem do material contendo o fungo......................................................... 22 Tabela 1. Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae produzidos pelo método convencional de cultivo em meio sólido e submetido a diferentes períodos de incubação................................................................................... 24 Tabela 2. Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae produzidos no meio líquido e no meio sólido do sistema bifásico, em diferentes períodos de incubação.......................... 26 Tabela 3. Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae no meio sólido do sistema bifásico, inoculado com diferentes volumes de suspensão fúngica obtida a partir do cultivo em meio líquido, após 7 dias de incubação..................................... 27 Tabela 4. Desdobramento da interação métodos de secagem versus situações de avaliação, significativa para a viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae............................................... 28 Tabela 5. Umidade perdida pelo material resultante do cultivo do fungo em meio solido, após o emprego de diferentes métodos de secagem..................................................................................... 29 Tabela 6. Desdobramento da interação métodos de obtenção versus situações de avaliação, significativa para a viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae............................................... 30 CAPÍTULO 3 Tabela 1. Adjuvantes químicos avaliados quanto à compatibilidade com Bipolaris euphorbiae, para compor uma formulação à base do fungo.......................................................................................... 43 iv Tabela 2. Toxicidade dos fotoprotetores NeoHeliopan Hydro®, NeoHeliopan AV® e NeoHeliopan E1000® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos...................................................... 47 Tabela 3. Toxicidade dos fotoprotetores Tinosorb M®, Complexo de filtros UVA/UVB e Eusolex 232® e Eusolex 6007® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos....................................... 48 Tabela 4. Toxicidade dos surfactantes Unitol L 20®, Ultranex NP 95® e Tween 80® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos............ 51 Tabela 5. Toxicidade dos surfactantes Triton X-100® e Ultrol IT 80® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos....................................... 52 Tabela 6. Toxicidade dos antiumectantes carbonato de cálcio, talco e carbonato de sódio anidro para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos..................................................................................... 54 Tabela 7. Toxicidade dos antiumectantes óxido de magnésio, celulose microcristalina e dióxido de silício para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos...................................................... 55 Tabela 8. Toxicidade dos espalhantes adesivos DuFol®, Agral® e Energic® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos............ 57 Tabela 9. Toxicidade do espalhante adesivo Haiten® e do agente adesivo PVP K-30® para Bipolaris euphorbiae cultivado em meio de cultura contendo diversas concentrações dos produtos..................................................................................... 58 Tabela 10. Desdobramento da interação condições de armazenamento versus período de avaliação, significativa para a viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae.......................................... 59 v Tabela 11. Sintomas de infecção de Euphorbia heterophylla causados pela pulverização com a formulação de Bipolaris euphorbiae... 62 vi OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO MASSAL E FORMULAÇÃO DE Bipolaris euphorbiae VISANDO A OBTENÇÃO DE UM BIOHERBICIDA RESUMO - O uso de bioprodutos como estratégia de controle de plantas daninhas, pode apresentar várias limitações, principalmente quanto à produção massal e formas de conservação do produto, sendo fundamental o desenvolvimento de formulações adequadas e eficientes contra a planta alvo. O fungo Bipolaris euphorbiae é considerado um potencial bioagente para o controle de Euphorbia heterophylla, uma das plantas daninhas mais importantes da soja. O presente trabalho teve por objetivos: 1) otimizar a produção do fungo, em meio sólido e em cultivo bifásico, determinando o período adequado de incubação; 2) determinar a toxicidade de adjuvantes ao fungo e selecionar produtos para compor a formulação; 3) avaliar a viabilidade da formulação armazenada, ao longo do tempo, sob temperatura ambiente e refrigeração e 4) avaliar a infectividade do fungo em E. heterophylla, após formulado. Para otimizar a produção do fungo, investigou-se a influência do período de incubação e a quantidade de inóculo no cultivo bifásico. A secagem dos conídios foi realizada em estufa sob várias temperaturas, fluxo laminar, fluxo contínuo de ar e câmara asséptica em temperatura ambiente. Conídios secos foram obtidos por peneiramento e utilizando moinho de bola, de martelo e moedor de grãos. Em todos os ensaios avaliou-se a viabilidade dos conídios e também a esporulação no meio sólido e sistema bifásico. Em seguida, analisou-se a compatibilidade do fungo com 7 fotoprotetores, 5 surfactantes, 6 antiumectantes e 5 espalhantes adesivos, usados nas concentrações de 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 1%. Os parâmetros avaliados foram: germinação, crescimento vegetativo e esporulação, e com base neles foi feita a classificação toxicológica dos produtos. O cultivo do fungo em meio sólido, pelo período de 10 dias, proporcionou a melhor relação “esporulação com alta viabilidade versus tempo”, produzindo 8,3 x 107 conídios g -1 substrato. No cultivo bifásico, a incubação por 7 dias proporcionou os maiores valores numéricos para esporulação em ambas as fases (meio líquido e meio sólido), totalizando 14 dias para produção, com rendimento final de 3,7 x 107 con. g -1 substrato. A quantidade de inóculo líquido não foi um fator determinante para vii aumentar a esporulação do fungo no meio sólido deste método de cultivo. A secagem do material (substrato + fungo) em estufa a 55 e 60ºC proporcionou significativa redução na germinação dos conídios, enquanto que o fluxo contínuo de ar, em temperatura ambiente, manteve a integridade das partículas e permitiu maior perda de água do material. A obtenção seca dos conídios por meio de moagens causou severos danos à integridade dos conídios, especialmente o moinho de bola. O peneiramento foi o método mais apropriado, permitindo extrair conídios com alta viabilidade. Dentre os adjuvantes testados para compor a formulação foram selecionados o fotoprotetor Tinosorb M® a 1%, o surfactante Tween 80® a 0,1%, o antiumectante dióxido de silício a 1%, o espalhante adesivo Haiten® a 0,01% e o polímero adesivo PVP K-30® a 0,1%. Para compor a formulação, o antiumectante foi adicionado ao pó de conídios, sendo que esta mistura foi armazenada e permaneceu viável (94,9% de germinação) após 245 dias sob refrigeração. Em temperatura ambiente houve uma redução de 64% na viabilidade dos conídios armazenados, entre a primeira e última avaliação. Sintomas típicos de infecção causados pelo fungo, como clorose, necrose foliar e murchamento e redução de 18% na altura do caule, comprando-se com o tratamento controle, foram observados. A formulação foi capaz de manter a infectividade do fungo para E. heterophylla e pode representar um passo importante visando obter um bioproduto à base de B. euphorbiae. Palavras-chave: Produção massal, secagem, extração, compatibilidade, armazenamento, infectividade. viii OPTIMIZATION OF MASS PRODUCTION AND FORMULATION OF Bipolaris euphorbiae AIMING TO OBTAIN A BIOHERBICIDE ABSTRACT - The use of bioproducts as a tactic to weed control has several limitations especially with regard to mass production and product forms of conservation, being fundamental to develop suitable and effective formulations against the target plant. The fungus Bipolaris euphorbiae is considered a potential bioagent to control Euphorbia heterophylla, one of the most important weeds in soybeans. The present study aimed to 1) optimize the production of the fungus, in solid and biphasic cultivation, determining the appropriate period of incubation, 2) verify the fungus toxicity of adjuvants and select products to compound the formulation, 3) evaluate the viability of the formulation stored, over time, at room temperature and under refrigeration and 4) evaluate the infectivity of the fungus in E. heterophylla after formulated. To optimize the production of the fungus, it was investigated the influence of incubation period and the amount of inoculum in the biphasic system. The drying of conidia was performed in a oven under varying temperatures, laminar flow, continuous flow of air and aseptic chamber at room temperature. Conidia drying were performed in oven under varying temperatures, flow laminar, continuous air flow and aseptic chamber in room temperature. Dried conidia were obtained through sieving and using ball mill, hammer mill and grain. It was evaluated the conidia viability and the sporulation on solid medium and biphasic system. Next, it was analyzed the compatibility of the fungus with sunscreens (7), surfactants (5), anti-humectants (6) and spreaders-stickers (5), used at 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1%. The evaluated parameters were germination, vegetative growth and sporulation and toxicological classification was determined. The best relation “sporulation versus cultivation” in the solid medium was obtained after 10 days of incubation, earning 8.3 x 107 conidia g-1substrate. In biphasic system, the incubation for 7 days provided the highest numerical values for sporulation in both phases (liquid and solid medium), totaling 14 days for production, with yield of 3.7 x 107 con. g -1 substrate. The amount of liquid inoculum used in this system was not important for increasing the production. The drying of material in a oven at 55 and 60ºC provided a ix significant reduction in conidial germination, while the continuous flow of air, at room temperature, maintained the conidia viability allowing more loss of humidity. Obtaining conidia by grinding caused damage to the integrity of conidia, especially the ball mill. The sieving provided to obtain pure conidia with high viability. Among the adjuvants tested it was selected the sunscreen Tinosorb M® (1%), the surfactant Tween 80® (0,1%), the anti-humectant silicon dioxide (1%), the spreader-sticker Haiten® (0,01%) and the polymer adhesive PVP K-30® (0,1%). To compose the formulation, anti-humectant agent was added to the powder of conidia, and this mixture was stored and remained viable (94.9% germination) after 245 days under 4oC. At room temperature, there was a 64% reduction in the viability of conidia stored between the first and last evaluation. Typical symptoms of infection occasioned by the fungus were observed, as chlorosis, leaf necrosis and wilting and 18% reduction in stem height, comparing with the control treatment. The formulation was able to maintain the fungus infectivity for E. heterophylla and may represent an important step to obtain a bioproduct based on B. euphorbiae. Keywords: Mass production, drying, extraction, compatibility, storage, infectivity 1 CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. INTRODUÇÃO As plantas daninhas são responsáveis por inúmeros impactos negativos em ecossistemas terrestres e aquáticos e constituem um fator limitante cada vez mais significativo para a produção agrícola (BARRETO, 2009). Interferências diretas e indiretas nas atividades agropecuárias podem ser atribuídas à presença de tais plantas, entre as quais se destacam a competição por recursos como água, luz, nutrientes minerais e espaço que afetam o crescimento, o desenvolvimento e a produtividade da cultura, a depreciação da qualidade do produto colhido, a intoxicação de animais domésticos, além de atuarem como hospedeiras alternativas de pragas e nematóides. (PITELLI, 1987; AMARAL, 2006). Em razão das interferências mencionadas, o controle de plantas daninhas assume importante papel no manejo de inúmeras culturas. As estratégias de controle, por meios preventivos, mecânicos, químicos ou biológicos, devem estar inseridas em um sistema de manejo integrado, de modo a interferir negativamente no estabelecimento e competição destas plantas (BRACCINI, 2011). O uso de herbicidas químicos representa a principal ferramenta de controle em função da grande oferta de produtos, economia de mão-de-obra e rapidez da operação (BURNSIDE, 1992; INOUE e OLIVEIRA Jr, 2011). No entanto, o uso constante de determinado herbicida ou de produtos com o mesmo mecanismo de ação exerce alta pressão seletiva, que aumenta o número de indivíduos tolerantes e a manifestação de biótipos resistentes dificultando assim o controle (PONCHIO, 1997; INOUE e OLIVEIRA Jr, 2011). Além disso, há problemas de ordem ambiental associados à intensa utilização de herbicidas químicos. A resistência de plantas daninhas a tais produtos pode ser considerada um aspecto que vem incentivando pesquisas, durante a última década, para o desenvolvimento de bioherbicidas como método alternativo de controle. A utilização de bioherbicidas teve um início promissor no Brasil, com a implementação, na década de 80, de um programa pioneiro de controle biológico utilizando-se o fungo Bipolaris euphorbiae Muchovej e Carvalho 1989 para o controle 2 de Euphorbia heterophylla L., uma importante planta daninha que afeta negativamente a soja e outras culturas (BARRETO e EVANS, 1998; NECHET; BARRETO; MIZUBUTI, 2006; BARRETO, 2009). Por se tratar de um patógeno específico, de grande agressividade, fácil multiplicação e boa esporulação, B. euphorbiae é considerado um potencial candidato para o controle biológico desta planta daninha que vem apresentando populações resistentes a herbicidas inibidores de enzima acetolactato sintase (ALS). No entanto, para viabilizar o uso de B. euphorbiae em programas de manejo integrado de E. heterophylla é necessário desenvolver métodos de produção do fungo em grande quantidade e uma formulação que permita obter um bioproduto. O desenvolvimento de uma nova e eficaz formulação microbiana não significa uma simples mistura de inertes a determinado ingrediente ativo. Aspectos como o tipo e características do ingrediente ativo, características do sistema produtivo (condições de cultivo, sistema de secagem e obtenção do ingrediente ativo), a compatibilidade dos componentes da formulação com o patógeno e a estabilidade deste durante o armazenamento, são imprescindíveis para viabilizar o uso de bioprodutos em campo (MORANDI e BETTIOL, 2009). A produção massal do bioagente de controle e principalmente a obtenção de formulações adequadas, são os maiores desafios no desenvolvimento de bioprodutos (CONSOLO; SALERNO; BERON, 2003; ALMEIDA; ROCHA; BATISTA FILHO, 2007; ELZEIN; KROSCHEL; CADISCH, 2008). O presente trabalho teve por objetivos otimizar a produção de B. euphorbiae pelos métodos bifásico e convencional em meio sólido, determinar as pré-etapas de formulação do fungo por meio da avaliação de métodos de secagem e obtenção de conídios, estabelecer o perfil de toxicidade de diversos adjuvantes ao fungo e avaliar a manutenção da estabilidade do fungo associado aos componentes da formulação durante o armazenamento. 2. REVISÃO DE LITERATURA Euphorbia heterophylla L. (Euphorbiaceae), popularmente conhecida como amendoim-bravo ou leiteiro, dentre outras denominações, é frequentemente 3 encontrada como invasora de culturas economicamente importantes como milho, cana-de-açúcar, feijão e soja e ocupa a quarta posição de frequência e ocorrência em todas as culturas brasileiras (VICENTINI; PENHA; FONSECA, 2010). É uma das espécies mais preocupantes devido aos impactos econômicos na agricultura, especialmente na cultura da soja em que, atualmente, o Brasil é o 2º maior produtor mundial. O complexo agroindustrial da soja no país é de grande importância já que tem aproximadamente 7% de participação no produto interno bruto (PIB) e cerca de 30% de participação no PIB agrícola (CONAB, 2011). O amendoim-bravo possui um crescimento muito rápido e pode formar uma densa cobertura sobre as plantas cultivadas, estabelecendo assim uma competição por luz e nutrientes do solo, sobretudo no estádio de florescimento em que a soja tem maior requisito nutricional (WILSON, 1981; NECHET; BARRETO; MIZUBUTI, 2006; BIANCO; PITELLI; CARVALHO, 2007). As sementes germinam durante quase todo o ano, havendo períodos de maior intensidade no verão (BRINGHENTI e OLIVEIRA, 2011; VOLL et al., 2005). Pode ainda interferir na eficiência da colheita e na qualidade da soja colhida, causando a fixação de impurezas, devido ao látex produzido e aumento no teor de umidade do grão, bem como a quantidade de contaminantes (WILLARD e GRIFFIN, 1993). Além disso, E. heterophylla é um ótimo alimento para o percevejo-marrom-da-soja Euschistus heros, uma das pragas mais agressivas desta cultura, alimentando-se das duas espécies vegetais quando ocorrem simultaneamente (PINTO e PANIZZI, 1994), além de poder atuar como reservatório do fungo Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis causador do cancro da haste da soja (GARRIDO e DHINGRA, 1997). A dificuldade de controle de E. heterophylla é um dos aspectos que preocupam os sojicultores, além do fato de que herbicidas eficazes têm alto custo e necessitando de mais de uma aplicação durante a safra (BARBOSA et al., 2002). Os herbicidas químicos inibidores da enzima acetolactato sintase (ALS) são um dos mais importantes grupos atualmente comercializados (OLIVEIRA Jr, 2011) e constituem a principal ferramenta para controle de E. heterophylla (VIDAL e MEROTTO Jr, 2001). As imidazolinonas, sulfoniluréias, sulfonanilidas e triazolopirimidinas são os principais grupos químicos que inibem a ALS, enzima responsável pela catalase de uma das reações iniciais da via metabólica de 4 produção dos aminoácidos valina, leucina e isoleucina (GAZZIERO et al., 1998; VIDAL e MEROTTO Jr, 1999; CHRISTOFFOLETI; KEHDI; CORTEZ, 2001; OLIVEIRA Jr, 2011). Dentre a vasta gama de herbicidas disponíveis no mercado, o grupo B (inibidores da ALS) é o que apresenta o maior numero de casos de resistência documentados (TRANEL e WRIGHT, 2002). Segundo esses autores, alguns aspectos levaram a essa situação, tais como a) o uso repetitivo na agricultura, em função do amplo espectro de recomendações às mais diversas culturas; b) a alta eficiência de controle, acarretando na produção de sementes apenas dos biótipos resistentes; c) o prolongado efeito residual no solo, aumentando a pressão seletiva para biótipos resistentes e d) a alta freqüência inicial de biótipos resistentes em função de características genéticas. Em relação a este último aspecto, Vargas, Borén e Silva (2001) determinaram que, em E. heterophylla, a resistência a herbicidas do grupo B é codificada por um gene dominante nuclear com dominância completa. Quando a resistência depende de um único gene (monogênica) a possibilidade de desenvolvimento de biótipos resistentes é maior e mais rápida que a dependente de mais de um gene (poligênica). Além disso, para a planta daninha em questão, foram identificados biótipos com resistência múltipla a inibidores da ALS e da PROTOX (TREZZI et al., 2005) e ao glifosato (VIDAL et al., 2007). Este contexto representa, portanto, uma oportunidade para a busca de estratégias alternativas de controle desta planta daninha, sendo o controle biológico um dos mais discutidos e com potencial de utilização. O objetivo desta estratégia não é a erradicação de populações de espécies invasoras que ocorrem em determinadas áreas, mas sim a redução de sua densidade populacional a níveis aceitáveis ou subeconômicos (BARRETO, 2009). O termo bioherbicida se refere ao uso de patógenos como agentes de controle de plantas daninhas, geralmente aplicados por meio da estratégia inundativa, cujo objetivo é criar uma rápida epidemia da doença e levar as plantas à morte, pela aplicação de massivas doses de inóculo do patógeno (BOYETCHKO et al., 2002; CRUMP; ASH; FAGANO., 1999). A aplicação de herbicidas biológicos é similar aos herbicidas químicos, o que os tornam uma opção bastante atrativa ao desenvolvimento industrial (BARRETO, 2009; TESSMANN, 2011). Além deste aspecto técnico, a exigência cada vez maior 5 por produtos que ofereçam menores riscos à saúde e ao meio ambiente, também pode ser considerada atrativa do ponto de vista industrial. Dentre os patógenos passíveis de utilização, o fungo Bipolaris euphorbiae Muchovej e Carvalho 1989, inicialmente identificado como Helminthosporium euphorbiae, é considerado um candidato ideal para o controle biológico de E. heterophylla, por se tratar de um patógeno específico, de fácil multiplicação em laboratório e apresentar grande capacidade de esporulação. Em condições ideais é capaz de provocar manchas necróticas no caule e nas folhas, clorose, anormalidade no crescimento, necrose e murchamento, podendo evoluir para o total desfolhamento e morte da planta (ZILLINSKY, 1984; HARBORNE, 1993). Os sintomas apresentados são ocasionados pela ação de uma fitotoxina, ainda não identificada, produzida pelo fungo durante o processo de infecção. O exato mecanismo pelo qual a infecção se estabelece não foi totalmente compreendido, mas investiga-se a possibilidade de envolver complexas mudanças bioquímicas no interior da planta hospedeira (HARBORNE, 1993). Vários são os trabalhos que investigaram o potencial do fungo como agente de biocontrole desta importante planta daninha, obtendo-se resultados promissores quanto à redução do desenvolvimento da planta e em alguns casos, alcançando elevados índices de mortalidade (YORINORI, 1985; GAZZIERO et al., 1989; MARCHIORI et al., 2001). A associação do fungo com herbicidas químicos comumente utilizados na cultura da soja também vêm sendo investigada, em estudos de compatibilidade, visando incrementar o controle de E. heterophylla (GAZZIERO e YORINORI, 1988; NEMOTO et al., 2002; NECHET; BARRETO; MIZUBUTI, 2006). O programa pioneiro de controle biológico de plantas daninhas no Brasil foi realizado na Embrapa Soja - CNPSo, nos anos de 1980-1981, e visava o desenvolvimento de um micoherbicida à base de B. euphorbiae para o controle de E. heterophylla. Apesar do início promissor, os trabalhos foram interrompidos por limitações verificadas para os isolados disponíveis do fungo, pelo fechamento temporário do mercado em razão do lançamento de herbicidas químicos com boa ação contra a planta e por fim, por mudanças de prioridades de pesquisa na instituição (NECHET; BARRETO; MIZUBUTI, 2006; BARRETO, 2009). Entretanto, 6 em razão de questões já comentadas, como a ocorrência de populações resistentes e preocupações de ordem ambiental, a planta ganhou novamente importância. A utilização de produtos biológicos em programas de manejo agrícola ainda enfrenta algumas limitações no que diz respeito à produção massal e formas de conservação do produto, sendo fundamental o desenvolvimento de formulações (ALMEIDA; ROCHA; BATISTA FILHO, 2007). O desafio nesse sentido é a obtenção de produtos estáveis durante o armazenamento. A estabilidade por 12-18 meses em temperatura ambiente é um requisito mínimo para aumentar a competitividade no mercado (RAMEGOWDA, 2005). Com relação à produção massal de B. euphorbiae, trabalhos foram desenvolvidos visando determinar as condições físicas e exigências nutricionais ideais, além de métodos e meios de cultivo adequados, de baixo custo e fácil obtenção (PENARIOL et al., 2008; MORAES, 2009) A formulação é a maneira de apresentar o ingrediente ativo em uma forma física mais efetiva, que se inicia com a produção do patógeno e segue com a adição de produtos (adjuvantes) que visam: a) estabilizar o agente biológico durante o armazenamento; b) facilitar o manuseio e aplicação do produto; c) proteger o bioagente contra fatores ambientais adversos, aumentando sua persistência no ambiente; d) aumentar a atividade do patógeno, incrementando sua reprodução, contato e interação com a praga-alvo (JONES e BURGES, 1998; MORENTINI e MELO, 2007; ALMEIDA et al., 2008). Sob esse aspecto, considera-se importante encontrar adjuvantes compatíveis ao patógeno e que promovam melhorias em uma ou mais características essenciais para o estabelecimento da interação antagonista (FRAVEL; CONNICK; LEWIS, 1998). Dentre os adjuvantes que vêm sendo pesquisados para formulações de micohebicidas, destacam-se os surfactantes, que adicionados à calda promovem a suspensão, dispersão, incremento da deposição, molhamento, adesão e retenção dos conídios, aumentando a toxicidade sobre o alvo (COSTA et al., 2003) e os fotoprotetores que conferem proteção contra a radiação UV, especialmente a UVB de maior interesse biológico por causar danos severos aos fungos (EDGINGTON et al., 2000). 7 Apesar do potencial e êxito inicial de vários bioherbicidas formulados, as expectativas pouco realistas de mortalidade das plantas daninhas, além da questão da vida útil do produto e a competitividade por preço, comparado aos herbicidas quimicos, têm levado, em parte, a queda do desenvolvimento e eventual abandono de alguns potenciais candidatos a bioherbicidas (WATSON et al., 2000). O primeiro bioproduto registrado nos Estados Unidos foi o Devine®, uma formulação líquida composta por clamidósporos do fungo Phytophthora palmivora para controle de Morrenia odorata em citrus, produzindo nível de controle de 90 a 100% com apenas uma aplicação (CHARUDATTAN, 1991; TESSMANN, 2011). Apesar da eficiência, o produto não apresenta grande estabilidade e sob refigeração possui uma vida útil de apenas 6 semanas e por essa razão é produzido somente mediante pedidos antecipados (TeBEEST e TEMPLETON, 1985). Outro exemplo é o Collego®, bioherbicida usado para o controle de Aeschynomene virginica (angiquinho) em cultura de arroz e soja. O produto consiste em uma formulação seca composta por esporos do fungo Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene, (TeBEEST e TEMPLETON, 1985) e vem apresentando níveis de controle acima de 90% (TESSMANN, 2011). É comercializado como um pó molhável e para uso deve ser reidratado gradualmente e misturado a uma quantidade pré- embalada de açúcar que atua como fonte de nutrientes (ROSSKOPF; CHARUDATTAN; KADIR, 1999). Casst® e Biomal® são outros dois bioherbicidas, um à base de Alternaria cassia, visando o controle de Cassia obtusiflora, planta daninha da soja e do algodão nos EUA e o outro à base de Colletotrichum gloeosporioides f. sp. malvae, para controle de Malva pusilla em várias culturas, respectivamente. Embora tenham apresentado resultados eficientes para o controle das respectivas plantas, os produtos não estão mais disponíveis comercialmente (TESSMANN, 2011). A qualidade dos bioprodutos disponíveis nem sempre é adequada, dificultando a implantação em programas de controle em maior escala. No Brasil, de modo geral, a produção em larga escala dos agentes biológicos é realizada com baixo nível tecnológico devido à deficitária infra-estrutura disponível e pelo fato da maioria dos produtos não ser submetida a estudos de pré-formulação, formulação e 8 controle de qualidade, o que compromete sua eficiência e amplia as possibilidades de estudos nesta área. (MORANDI e BETTIOL, 2009) 3. REFERÊNCIAS ALMEIDA, J.E.M.; BATISTA FILHO, A.; ALVES, S.B.; LEITE, G.L.; NEVES, P.M.J.O. Formulação de entomopatógenos na América Latina. In: ALVES, S.B.; LOPES, R. B. (Eds.). Controle Microbiano de Pragas na América Latina. Piracicaba: FEALQ, 2008. p.257-277. ALMEIDA, J.E.M.; ROCHA, T.C.; BATISTA FILHO, A. Desenvolvimento de método para extração física de conídios de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana para formulação pó seco e molhável de bioinseticida. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.74, n.4, p.369-371, 2007. AMARAL, A.L. 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Neste trabalho, objetivou-se otimizar a produção de Bipolaris euphorbiae em meio sólido e em sistema bifásico, e determinar os processos de secagem e obtenção de conídios. Investigou-se a influência do período de incubação e do volume da suspensão fúngica. A secagem dos conídios foi realizada em estufa sob várias temperaturas, fluxo laminar, fluxo contínuo de ar e câmara asséptica em temperatura ambiente. Conídios secos foram obtidos por peneiramento e moagem em diferentes tipos de moinhos. Avaliou-se a viabilidade dos conídios e a esporulação em meio sólido e sistema bifásico. A melhor relação “esporulação versus período de cultivo” no meio sólido foi obtida após 10 dias de incubação, rendendo 8,3 x 107 conídios g-1 substrato. O sistema bifásico não incrementou a esporulação do fungo (4,5 x 107 conídios g-1 substrato) cultivado por 14 dias e o volume de suspensão fúngica usado neste sistema não foi determinante para incrementar a produção. O fluxo contínuo de ar foi considerado o mais satisfatório do ponto de vista do controle biológico, pois permitiu maior perda de umidade (62,6%) com alta viabilidade (94,6%). A moagem reduziu a germinação dos conídios, enquanto o peneiramento proporcionou a obtenção de conídios em pó com alta viabilidade (94,8%). Palavras-chave: produção massal, secagem, obtenção de conídios 16 CHAPTER 2 - STANDARDIZATION AND OPTIMIZATION OF STEPS TO FORMULATE A BIOHERBICIDE BASED ON Bipolaris euphorbiae ABSTRACT - To make possible the use of bioproducts implies in the search for appropriate procedures to ensure mass production and formulation. This study aimed to optimize the production of Bipolaris euphorbiae in solid and biphasic system, to determine the drying processes, as well as obtaining of conidia. It was investigated the influence of incubation period and the amount of inoculum. The drying of conidia was performed in a oven under varying temperatures, laminar flow, continuous flow of air and aseptic chamber at room temperature. Dried conidia were obtained through screening and using different grind types. It was evaluated the conidia viability and the sporulation on solid medium and biphasic system. The best relation “sporulation versus cultivation” in the solid medium was obtained after 10 days of incubation, earning 8.3 x 107 conidia g-1substrate. The biphasic system did not increase the fungus sporulation (4.5 x 107 conidia g-1substrate) cultivated during 14 days and the amount of liquid inoculum used in this system was not determinant for increasing the production. The continuous air flow was considered the most satisfactory from the standpoint of biological control because it allowed more moisture loss (62.6%) with high viability (94.6%). Grinding reduced the germination of conidia, whereas the screening provided to obtain pure conidia with high viability (94.8%). Keywords: Mass production, drying, obtaining of conidia 17 1. INTRODUÇÃO Em ambientes agrícolas, plantas daninhas competem direta e indiretamente com as culturas economicamente importantes, reduzindo a sua produtividade, interferindo nas operações de colheita e atuando como hospedeiras alternativas para insetos-pragas e patógenos, além de afetar a qualidade do produto colhido (BARRETO, 2009). A interferência destas plantas é responsável por reduzir em 30 a 40% a produção agrícola nos trópicos (LORENZI, 2000) e constitui a maior barreira à produção de alimentos em muitas regiões do mundo Euphorbia heterophylla L. (Euphorbiaceae), popularmente conhecida como leiteiro ou amendoim-bravo, é uma das plantas daninhas mais temidas pelos produtores de soja, em função dos danos ocasionados e da dificuldade de controle, que é realizado, principalmente por herbicidas inibidores das enzimas acetolactato sintase (ALS) e protoporfirinogênio oxidase (PROTOX) (VIDAL e MEROTTO Jr, 2001). O uso recorrente de determinados herbicidas ou mecanismos de ação numa mesma área tem levado à seleção de populações resistentes a certos grupos químicos e consequentes falhas no controle. Para a planta daninha em questão, foram identificados biótipos resistentes aos inibidores de ALS, e com resistência múltipla a inibidores da ALS e da PROTOX (TREZZI et al., 2005) e ao glifosato (VIDAL et al., 2007). Além disso, problemas de ordem ambiental como a contaminação de alimentos, solo, água, desequilíbrios biológicos, intoxicação de agricultores, entre outros, também são consequências do uso intensivo e indiscriminado de pesticidas químicos. Situações dessa natureza ampliam as perspectivas do uso de agentes biológicos para o controle de plantas daninhas dentro de uma tendência mundial pela busca de sistemas alternativos de controle, que sejam, ao mesmo tempo, eficazes, econômicos e menos agressivos ao meio ambiente. O emprego de bioherbicidas representa um componente estratégico dos programas de manejo integrado de plantas daninhas, sendo o fungo Bipolaris euphorbiae Muschovej e Carvalho, um agente potencial para o controle biológico de E. heterophylla. Esse 18 fungo pode causar, em condições ideais, epifitotia, severa desfolhação, danos ao caule e morte do hospedeiro (BARRETO e EVANS, 1998). Entretanto, ainda existem limitações que inviabilizam o uso de bioprodutos em campo, especialmente no que diz respeito à produção em larga escala e formas de conservação do produto, sendo fundamental o desenvolvimento de formulações. A produção massal, a baixo custo e sob condições controladas, representa uma fase importante, visando garantir a obtenção de grandes quantidades do patógeno (LIMA; SOARES; BARRETO, 2010). Segundo PENARIOL et al. (2008), a introdução de B. euphorbiae em programas de manejo integrado de E. heterophylla é dependente da produção de conídios em larga escala; para viabilizar esta produção os autores investigaram meios líquidos e sólidos, obtidos de grãos e derivados e resíduos agroindustriais. Combinações destes substratos também foram avaliadas, visando incrementar a produção do fungo em meio sólido e em sistema bifásico de cultivo (MORAES, 2009). Contudo, o cultivo do fungo por este sistema não incrementou a produção, sugerindo o autor que tal resultado pode ser consequência do período de incubação ou quantidade de inóculo líquido usado para semear o meio sólido. No entanto, tais aspectos precisam ser investigados. No processo de produção de um bioproduto, a secagem e obtenção das unidades infectivas constituem importantes pré-etapas para a formulação. Manter o patógeno em uma fase infecciosa, porém fisiologicamente dormente, segura e de fácil aplicação é fundamental. A chave para prolongar a sua sobrevivência é parar a germinação e reduzir ao máximo possível o metabolismo (HORACZEK e VIERNSTEIN, 2004). Para isso, há a necessidade de extrair a água, de modo que os conídios permaneçam com um teor de umidade de 5 a 10%, e posteriormente seja realizada a extração dos conídios do substrato (SILVA e MELLO, 2007). Considerando a importância de desenvolver estudos visando a obtenção de bioherbicidas, o presente trabalho teve por objetivos otimizar as condições para a produção massal de B. euphorbiae em cultivo convencional em meio sólido e em cultivo bifásico, e determinar os processos adequados de secagem e obtenção de conídios, priorizando a manutenção da viabilidade destes. 19 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Fungo Foi utilizado o isolado FCAV # 569 de B. euphorbiae, obtido por pesquisadores do Centro Nacional de Pesquisa em Soja da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA/CNSo) e mantido estocado em tubos de ensaio contendo o meio de batata-dextrose-ágar (BDA), sob refrigeração, no laboratório de Microbiologia do Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Unesp. Para utilização nos ensaios, o fungo foi cultivado em placas de Petri contendo o meio mínimo de PONTECORVO et al. (1953), modificado por PENARIOL et al. (2008), com a adição de peptona e substituição de glicose por amido, e mantido a 25 ± 0,5 °C por 10 dias e fotoperíodo de 12 horas. 2.2. Influência do período de incubação na produção de Bipolaris euphorbiae Foram conduzidos ensaios para investigar a influência do período de incubação do fungo em meio sólido e no meio líquido do cultivo bifásico, visando obter, em menor tempo, maior esporulação com alta viabilidade. 2.2.1. Cultivo em meio sólido O meio utilizado para produção do fungo foi composto pela mistura dos substratos casca de soja e sorgo em grão (60:40) na quantidade de 50 g (peso seco) (MORAES, 2009). Para o preparo dos substratos, a casca de soja foi embebida em água destilada, na proporção 1:3 (p v-1), durante 15 minutos e posteriormente coada para remoção do excesso de água. O sorgo foi cozido em água destilada fervente, na mesma proporção acima, por cinco minutos em fogo brando e posteriormente coado. A mistura entre os substratos foi feita em peso úmido (g g-1), na proporção indicada e colocada em frascos erlenmeyers e autoclavados a 121°C e 1 Kgf cm-2 por 40 minutos. 20 A inoculação do fungo foi feita pela transferência, com auxílio de agulha de níquel-cromo, de 3 discos de 8 mm de diâmetro retirados de colônias crescidas em meio mínimo durante 10 dias. Os frascos foram mantidos a 25 ± 0,5°C e fotoperíodo de 12 horas, por período de 5 a 14 dias. 2.2.2. Cultivo em sistema bifásico Para este ensaio o meio líquido utilizado foi composto por melaço de cana-de- açúcar na concentração de 8% (v v-1), obtido por diluição em água destilada e o meio sólido, pela mistura de casca de soja e sorgo em grão (60:40) (MORAES, 2009) que foram preparados conforme descrito no item 2.2.1. O meio líquido, na quantidade de 100 mL, foi disposto em erlenmeyers e autoclavado a 121°C e 1 Kgf cm-2 por 20 minutos. A inoculação do fungo se deu conforme descrito no item anterior, e a incubação foi realizada por 3 a 10 dias, sob as condições de temperatura e fotoperíodo já mencionados anteriormente. Após o período determinado, a massa micelial formada foi triturada em mixer vertical SB 40 Black e Decker® por 3 segundos e em seguida coada em peneira com malha de 1 mm obtendo-se uma suspensão de conídios e fragmentos de micélio (MACHADO et al., 2010). Esta suspensão foi usada para semear o meio sólido na quantidade de 3 mL por frasco (MACHADO et al., 2010). Em seguida, as culturas foram mantidas a 25 ± 0,5°C e fotoperíodo de 12 horas, por período de 5 a 10 dias. 2.2.3. Avaliação No final de ambos os ensaios foram avaliadas a produção e viabilidade dos conídios. Para tanto, foram retiradas amostras contendo 1 g de substrato + fungo sendo este material transferido para tubos de ensaio contendo 9 mL de uma solução de Tween 80® (0,1% v v-1). Os tubos foram vigorosamente agitados e as suspensões obtidas, utilizadas para determinar o número de conídios produzidos, com auxílio da câmara de Neubauer. A viabilidade dos conídios foi avaliada em microcultivo e exame direto em lâmina ao microscópio, de acordo com metodologia descrita por FRANCISCO et al. (2006). Em lâminas de microscopia esterilizadas foram 21 previamente marcados três campos e a superfície recoberta com 4 mL de meio mínimo. Na região do meio de cultura correspondente a cada campo foi inoculado 0,1 mL da suspensão fúngica, obtida conforme descrito acima, e as culturas incubadas a 25 ± 0,5°C por 7 horas. Após esse período, o processo de germinação foi interrompido, pingando-se uma gota de corante [1 mL de solução estoque (1 g de azul de metileno em 20 mL de ácido lático) adicionada em 29 mL de ácido lático] em cada campo. Foram observados 150 conídios por campo, entre germinados e não germinados, estabelecendo-se uma relação, em porcentagem, de conídios viáveis. Determinou-se também a produção e viabilidade dos conídios formados em meio líquido, coletando-se 1 mL da suspensão usada para semear o meio sólido no sistema bifásico de produção. 2.3. Influência do volume de suspensão de Bipolaris euphorbiae para produção em sistema bifásico Visando incrementar o rendimento deste método de produção, a suspensão fúngica proveniente do cultivo em meio líquido e preparada conforme já descrito, foi inoculada no meio sólido nas quantidades de 1; 3; 5; 7 e 9 mL. Os frascos foram mantidos a 25 ± 0,5°C e fotoperíodo de 12 horas. Após incubação, pelos tempos definidos no ensaio de cultivo em sistema bifásico, foram avaliadas a produção e viabilidade dos conídios, conforme já descrito. 2.4. Secagem de conídios de Bipolaris euphorbiae O meio sólido contendo o fungo crescido foi submetido a diferentes condições de secagem, até massa constante, visando manter a integridade dos conídios. As condições avaliadas foram: a) estufa nas temperaturas de 30; 35; 40; 45; 50; 55 e 60°C; b) fluxo laminar em temperatura ambiente; c) temperatura ambiente em câmara asséptica; d) temperatura ambiente sob fluxo contínuo de ar (pressão de 3,5 ± 0,3 Kgf cm-2 e vazão de 15 L min-1) em equipamento construído para tal finalidade (Figura 1), totalizando 10 tratamentos. 22 Figura 1- Equipamento de fluxo contínuo de ar usado para secagem do material contendo o fungo. (A) Equipamento mostrando: 1- fonte de ar comprimido (compressor) e 2- fluxômetro; (B) Detalhe da parte superior do equipamento, mostrando saídas de ar com filtro; (C) Detalhe da parte interna do equipamento, mostrando a serpentina perfurada; (D) Peneira, que é colocada sobre a serpentina e (E) Peneira com material seco (fungo + meio sólido) retirado do equipamento. Exceto para o fluxo contínuo de ar, em que foi usado um recipiente integrado ao equipamento de secagem (peneira), o material foi disposto em bandejas de plástico previamente desinfetadas com álcool 96 oGL. A temperatura ambiente foi monitorada e variou de 24 a 27ºC durante os ensaios. Foi avaliada a viabilidade dos conídios antes e após os processos de secagem, e a perda de água. Para este último parâmetro foi estabelecida uma relação, em porcentagem, entre o peso inicial e final do material avaliado. Para a avaliação da viabilidade, em ambas as situações, foram preparadas suspensões contendo 1 g de material (meio sólido + fungo) e 9 mL de solução de Tween 80® (0,1% v.v-1) e o teste executado conforme metodologia descrita por FRANCISCO et al. (2006). 23 2.5. Obtenção de conídios de Bipolaris euphorbiae O meio contendo o fungo crescido e seco, de acordo com metodologia determinada no item anterior, foi submetido a três processos de moagem e ao simples peneiramento, para obtenção de conídios. Considerando a natureza dos substratos sólidos utilizados para a produção do fungo, a obtenção se caracterizou pela redução destes a um pó fino, exceto no peneiramento cujo objetivo foi extrair os conídios dos substratos. Para obtenção de um pó fino, foram utilizados: a) moinho de bola Marconi, modelo MA-350, com câmara fechada; b) moinho de martelo MR (Metalúrgica Roma), modelo MR-320, contendo 4 martelos e 1 peneira de 1 mm e c) moedor de grãos Arbel, modelo MCF-55. Para extrair os conídios foi utilizada uma peneira com malha de 1 mm, fechada e agitada manualmente por 10 minutos. Em seguida, a massa obtida foi submetida a peneira com malha de 0,25 mm para remoção de impurezas. No método de obtenção de conídios por meio do moinho de bola, o material foi colocado em uma cuba de moagem e mantido sob batidas intermitentes por 1 minuto. No moedor de grãos, o mancal de regulagem foi ajustado de modo que as moendas proporcionassem a redução do material a um pó fino. Para isso, a moagem foi realizada duas vezes consecutivas. Foi avaliada a viabilidade dos conídios antes e após cada um dos métodos de obtenção testados. As suspensões obtidas em ambas as situações foram compostas por uma amostra de 1 g de material seco antes da moagem e 1 g de pó obtido após os respectivos processos de moagem, sendo em seguida transferidas para tubos de ensaio contendo 9 mL de solução de Tween 80® (0,1% v v-1). Para os conídios extraídos por peneiramento usou-se 0,1 g diluído em 9,9 mL de solução de Tween 80® (0,1% v v-1). O teste foi executado conforme metodologia descrita por FRANCISCO et al. (2006). 2.6. Análise estatística Todos os ensaios foram realizados no delineamento inteiramente casualizado (DIC) com 4 repetições por tratamento. Os dados foram submetidos à análise de 24 variância pelo teste F e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Os ensaios de secagem e obtenção de conídios foram analisados utilizando-se um esquema fatorial com dois fatores: métodos de secagem versus situação de avaliação (antes e após a secagem), e métodos de obtenção versus situação de avaliação (antes e após a obtenção). Para execução das análises estatísticas foi utilizado o programa ESTAT (1997), versão 2.0. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Influência do período de incubação na produção de Bipolaris euphorbiae Tanto na produção convencional em meio sólido, como nas fases líquida e sólida do sistema bifásico, não houve influência do período de incubação na viabilidade dos conídios produzidos (p � 0,05), cuja germinação manteve-se maior que 97% em todos os tratamentos (Tabelas 1 e 2). Tabela 1 - Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae produzidos pelo método convencional de cultivo em meio sólido e submetido a diferentes períodos de incubação Período de incubação (dias) Esporulação (x 107 con. g-1 substrato) Viabilidade (%) 5 1,7 B 97,5 A 6 2,4 AB 98,3 A 7 4,7 AB 97,9 A 8 5,4 AB 99,4 A 9 6,7 AB 99,1 A 10 8,3 AB 98,8 A 11 7,3 AB 99,5 A 12 7,0 AB 99,5 A 13 8,0 AB 99,4 A 14 8,9 A 99,4 A Teste F CV (%) 2,52* 31,09 2,91* 0,89 Médias originais, porém análise de variância realizada com dados transformados em log (x+1) e arc sen�x/100, para esporulação e viabilidade, respectivamente. Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05). NS não significativo, * significativo a 5% de probabilidade, CV coeficiente de variação. 25 Sob cultivo convencional, a esporulação do fungo após 14 dias de cultivo diferiu significativamente apenas da obtida com 5 dias de incubação, apresentando o maior valor para este parâmetro (8,9 x 107 conídios g-1 de substrato) (Tabela 1). Tendo em vista a produção massal do fungo e obtenção de grande quantidade de conídios, pode-se considerar que a incubação por 10 dias apresenta a relação “esporulação com alta viabilidade versus período de incubação” mais aplicável. Isso porque, considerando os dados obtidos (Tabela 1), teoricamente num período de 30 dias, mantendo a incubação do fungo por 10 dias, seriam realizados 3 ciclos de produção, rendendo ao final 24,9 x 107 con. g-1 de substrato. Utilizando o período de incubação de 14 dias, que proporcionou maior valor numérico para esporulação neste ensaio, em 30 dias seriam gerados 2 ciclos com rendimento final de 17,8 x 107 con. g-1 de substrato. A média diária de esporulação obtida na primeira situação hipotética seria 32% maior, justificando ser este o período indicado para produção do fungo. A esporulação obtida sob tal condição (8,3 x 107 con. g-1 de substrato) foi maior do que a observada por MORAES (2009) que nas mesmas condições obteve 2,3 x 107 con. g-1 de substrato. Sistemas de produção em cultura líquida submersa são amplamente utilizados para produção massal de bioherbicidas (CHURCHILL, 1982; STOWELL, 1991) e para B. euphorbiae a esporulação no meio líquido, sem agitação e por diferentes períodos de incubação, foi da ordem de 105 conídios mL-1 (Tabela 2). Baseado na análise dos dados e considerando que o fungo produzido nesta fase foi usado como inóculo para a segunda etapa do cultivo bifásico, optou-se em selecionar o período de incubação de 7 dias, no qual observou-se o maior valor numérico (6,1 x 105 con. mL-1) de esporulação do fungo. No cultivo em meio sólido, a incubação por 7 dias proporcionou o maior valor numérico de esporulação, embora sem diferir dos demais tratamentos (p � 0,05), exceto 5 dias de incubação (Tabela 2). Os dados obtidos sugerem que a produção de B. euphorbiae pelo sistema bifásico de cultivo demandaria o total de 14 dias, enquanto que MORAES (2009) utilizou 17 dias 26 Tabela 2 - Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae produzidos no meio líquido e no meio sólido do sistema bifásico, em diferentes períodos de incubação. Período de incubação (dias) Meio líquido Meio sólido1 Esporulação (x 105 con. mL-1) Viabilidade (%) Esporulação (x 107 con. g-1) Viabilidade (%) 3 1,9 B 99,5 A - - 4 4,0 AB 99,7 A - - 5 3,8 AB 99,8 A 1,0 B 98,9 A 6 5,1 AB 99,8 A 2,2 AB 99,2 A 7 6,1 A 99,9 A 4,5 A 98,7 A 8 4,8 AB 99,7 A 4,0 A 98,7 A 9 5,1 AB 99,4 A 3,2 A 98,9 A 10 5,0 AB 99,3 A 3,7 A 98,8 A Teste F 2,44* 3,1* 5,86** 2,63NS CV (%) 30,23 0,24 24,3 0,24 1 Inóculo obtido após 7 dias de incubação em meio líquido. Médias originais, porém análise de variância realizada com dados transformados em log (x+1) e arc sen �x/100, para esporulação e viabilidade, respectivamente. Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05). NS não significativo, **, * significativo a 1% e a 5% de probabilidade, respectivamente. CV coeficiente de variação. 3.2. Influência do volume de suspensão de Bipolaris euphorbiae usada na fase sólida do sistema bifásico A esporulação foi significativamente maior quando os volumes de 5, 7 e 9 mL de suspensão fúngica foram usadas para semear o meio sólido (Tabela 3). Entretanto, o volume de suspensão não pode ser considerado um fator responsável pelo incremento da esporulação do fungo pelo sistema bifásico, visto que, mesmo usando o maior volume (9 mL), a produção de conídios foi 28,9% menor do que a obtida em meio sólido pelo sistema convencional, em 10 dias (Tabela 1). Além disso, semeando-se o substrato contido em 3 frascos com 3 mL de inóculo em cada um, teoricamente seria possível obter a produção total de 8,7 x 107 con. g substrato-1, maior do que a obtida (5,9 x 107 con. g substrato-1) semeando o substrato de apenas1 frasco com 9 mL (Tabela 3). Do ponto de vista industrial este é um importante aspecto a ser considerado. Comparando-se o método convencional de produção do fungo no meio sólido e a produção pelo sistema bifásico (Tabelas 1 e 2), a melhor relação esporulação versus período de incubação foi obtida no método convencional, que além de reduzir o 27 tempo de incubação, proporcionou maior esporulação do fungo. Possivelmente, o processo de retirada dos discos de 8 mm das placas contendo o fungo seja menos agressivo do que a trituração da massa micelial no meio líquido, permitindo mais rápida e eficiente colonização do meio sólido. Cabe ressaltar que o processo de produção em meio sólido empregado atualmente no país é simples e pouco automatizado, porém eficiente e de custo compatível com a estrutura produtiva nacional (MORANDI e BETTIOL, 2009). Tabela 3 - Esporulação e viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae no meio sólido do sistema bifásico, inoculado com diferentes volumes de suspensão fúngica obtida a partir do cultivo em meio líquido, após 7 dias de incubação. Volume de suspensão (mL) Esporulação (x 107 con. g-1) Viabilidade (%) 1 1,5 C 98,7 A 3 2,9 B 99,0 A 5 3,6 AB 98,9 A 7 4,1 AB 98,8 A 9 5,9 A 98,8 A Teste F CV (%) 13,17** 13,7 0,73NS 0,91 Médias originais, porém análise de variância realizada com dados transformados em log (x+1) e arc sen�x/100) Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05). NS não significativo, ** significativo a 1% de probabilidade, CV coeficiente de variação 3.3. Secagem de conídios de Bipolaris euphorbiae A análise de variância evidenciou que a interação dos fatores métodos de secagem versus situação de avaliação foi significativa (F= 48,80**) e o desdobramento desta interação (Tabela 4) permitiu avaliar o efeito sobre os conídios do fungo. A taxa de germinação manteve-se acima de 98% em todos os tratamentos antes da submissão aos métodos de secagem, garantindo homogeneidade das amostras. Os efeitos mais expressivos da influência do método de secagem sobre os conídios do fungo foram obtidos em estufa a 55 e 60ºC, havendo uma redução de 26 e 73% na germinação, respectivamente. Para os demais métodos, em geral, a integridade dos conídios foi preservada após a secagem, mantendo a viabilidade 28 maior que 94% (Tabela 4), valor considerado satisfatório do ponto de vista do controle de qualidade. Tabela 4 - Desdobramento da interação métodos de secagem versus situações de avaliação, significativa para a viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae Métodos de secagem Viabilidade dos conídios (%) Teste F Situação de avaliação Antes da secagem Após a secagem Fluxo laminar1 99,6 Aa 99,1 ABa 0,72NS Fluxo contínuo de ar1 98,9 Aa 94,6 Bb 9,13** Câmara asséptica1 98,9 Aa 98,7 ABa 0,08NS Estufa a 30°C 98,9 Aa 99,4 Aa 0,01NS Estufa a 35°C 98,4 Aa 97,3 ABa 0,74NS Estufa a 40°C 99,2 Aa 99,4 Aa 0,04NS Estufa a 45°C 98,6 Aa 99,2 Aa 0,02NS Estufa a 50°C 99,3 Aa 96,9 ABb 5,52* Estufa a 55°C 98,9 Aa 72,9 Cb 97,82** Estufa a 60°C 99,2 Aa 26,2 Db 473,65** Teste F 0,39 NS 98,56** - 1Sob temperatura ambiente. Médias com valores originais, mas análise realizada com dados transformados em arc sen �x/100. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna ou minúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05) NS não significativo; **, * significativo a 1% e a 5% de probabilidade, respectivamente. O objetivo da secagem do material é reduzir o conteúdo de água disponível, mantendo-a num teor que permita conservar a viabilidade dos conídios durante o maior período possível de armazenamento. O método de secagem que proporcionou a maior perda do teor de umidade foi o fluxo contínuo de ar, não diferindo estatisticamente dos métodos fluxo laminar e estufa a 50 e 60ºC (Tabela 5). O fluxo contínuo de ar é um método viável e reproduzível em escala industrial, sendo apropriado para a secagem dos conídios de B. euphorbiae, uma vez que proporcionou a maior perda de umidade, embora com redução de 4,3% na germinação. As temperaturas de 55 e 60oC também proporcionaram acentuada perda de umidade mas ocasionaram grande redução da viabilidade dos conídios (Tabela 4 e 5). Possivelmente, estas temperaturas alteraram componentes bioquímicos da maquinaria metabólica do conídio interferindo negativamente na sua germinação. 29 Tabela 5 - Umidade perdida pelo material resultante do cultivo do fungo em meio sólido, após o emprego de diferentes métodos de secagem. Método de secagem Teor de umidade perdido (%) Fluxo laminar1 54,00 AB Fluxo contínuo de ar1 62,65 A Câmara asséptica1 34,55 C Estufa a 30ºC 21,70 D Estufa a 35ºC 22,90 D Estufa a 40ºC 24,38 D Estufa a 45ºC 45,37 BC Estufa a 50ºC 50,66 AB Estufa a 55ºC 48,99 B Estufa a 60ºC 54,62 AB Teste F CV (%) 38,12** 5,62 1Sob temperatura ambiente. Médias originais, porém análise realizada com dados transformados em log x. Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05). **significativo a 1% de probabilidade, CV coeficiente de variação. A tolerância à secagem é um fator que pode limitar o sucesso e a comercialização de bioherbicidas (MONTAZERI e GREAVES, 2002). A redução da atividade metabólica dos conídios reduz a perda de reservas de armazenamento e minimiza a produção de metabólitos tóxicos (GUIJARRO et al., 2006). Relatos encontrados na literatura sugerem que o teor de umidade ideal do substrato contendo os conídios varia de 10 a 30% (SILVA e MELLO, 2007; LOMER e LOMER, s.d.). Os métodos de secagem comumente utilizados por indústrias no processamento de produtos à base de microrganismos são a liofilização, atomização e leito fluidizado (JIN e CUSTIS, 2011). Apesar da diferença de tecnologias e equipamentos utilizados entre esses métodos e os do presente trabalho, o que dificulta sobremaneira a comparação de resultados, a redução da viabilidade dos conídios de B. euphorbiae obtida após a secagem nas temperaturas mais altas, também foi observada quando outros patógenos foram secos pelos citados métodos (LARENA; MELGAREJO; de CAL, 2003; HORACZEK e VIERNSTEIN, 2004), com consequentes danos irreversíveis aos materiais biológicos devido ao calor excessivo e retirada de água (DAEMEN e VAN DER STEGE, 1982). Apesar de não terem proporcionado teores ideais de umidade, devido sua simplicidade, os métodos 30 empregados no presente trabalho podem contribuir para reduzir o custo de produção de um bioherbicida à base de B. euphorbiae. 3.4. Obtenção de conídios de Bipolaris euphorbiae A análise fatorial dos dados mostrou que a interação métodos de obtenção versus situação de avaliação foi significativa (F= 69,03**) e a partir do desdobramento desta interação foi possível observar os efeitos sobre a viabilidade dos conídios. Não houve diferença significativa quanto à germinação dos conídios previamente secos antes de serem submetidos aos métodos de obtenção, demonstrando que todos os tratamentos continham inicialmente partículas viáveis (Tabela 6). Tabela 6 - Desdobramento da interação métodos de obtenção versus situações de avaliação, significativa para a viabilidade de conídios de Bipolaris euphorbiae Métodos de obtenção Viabilidade dos conídios (%) Teste F Situação de avaliação Antes da obtenção1 Após obtenção Moinho de grãos 88,92 Aa 78,33 Bb 8,20** Moinho de martelo 93,85 Aa 83,95 Bb 10,46** Moinho de bola 91,20 Aa 12,60 Cb 340,16** Peneiramento 94,87 Aa 94,82 Aa 0,01NS Teste F 2,00NS 151,36** 1Secagem do meio sólido contendo o fungo em fluxo contínuo de ar sob temperatura ambiente. Médias com valores originais, mas análise realizada com dados transformados em arc sen �x/100. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna ou minúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p � 0,05). NS não significativo; ** significativo a 1% de probabilidade. Os métodos de obtenção de conídios por meio de moagem do material possivelmente provocaram danos na estrutura física e integridade dos conídios, reduzindo significativamente a germinação destes, especialmente no moinho de bola, cuja redução foi de 86%. A agressividade apresentada por este método se deve ao impacto intermitente de uma esfera de inox contra a parede da câmara de moagem e que provoca a redução das amostras a um pó fino. A obtenção por meio de peneiramento, embora de simples execução, foi a mais apropriada, permitindo extrair conídios com alta viabilidade (Tabela 6). 31 Não foram encontrados na literatura trabalhos realizados com o intuito de avaliar métodos de extração de conídios, o que justifica a necessidade de investigar essa pré-etapa do processo de formulação de bioprodutos. É importante considerar que o método de obtenção de conídios deverá ser compatível com o tipo de formulação pretendida. Seja ela qual for, o produto deve ser primeiramente submetido à secagem, a fim de assegurar que os conídios se manterão viáveis durante o armazenamento (LOMER e LOMER, s.d.). 4. CONCLUSÕES • O período de incubação influencia a produção de B. euphorbiae tanto no meio sólido como no sistema bifásico. • O volume de inóculo líquido usado para semear o meio sólido, não incrementa a produção do fungo pelo sistema bifásico, comparado ao sistema convencional de cultivo. • Os métodos de secagem e obtenção de conídios afetam a viabilidade de B. euphorbiae. 5. REFERÊNCIAS BARRETO, R.W. Controle Biológico de Plantas Daninhas com Fitopatógenos. In: BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B. (Eds). Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. 1st ed. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente; 2009. p.101-128. BARRETO, R.W.; EVANS, H.C. Fungal pathogens of Euphorbia heterophylla and E. hirta in Brazil and their potential as weed biocontrol agents. Mycopathologia, The Hague, v.141, n.1, p.21-36, 1998. 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O presente trabalho teve por objetivos determinar a toxicidade de adjuvantes ao fungo Bipolaris euphorbiae a fim de selecionar produtos para compor uma formulação, avaliar a viabilidade do fungo formulado e armazenado sob diferentes condições e testar a infectividade da formulação em Euphorbia heterophylla (amendoim-bravo). Foram testados os fotoprotetores NeoHeliopan AV®, NeoHeliopan Hydro®, NeoHeliopan E1000®, Eusolex 232®, Tinosorb M®, Eusolex 6007® e o complexo de filtros UVA/UVB; os surfactantes Triton X-100®, Ultrol IT 80®, Ultranex NP 95®, Unitol L 20® e Tween 80®; os antiumectantes celulose microcristalina, carbonato de sódio anidro, óxido de magnésio, talco, carbonato de cálcio e dióxido de silício; e os espalhantes adesivos DuFol®, Haiten®, Agral®, Energic® e PVP K-30®, nas concentrações de 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 1%. Os parâmetros avaliados foram germinação, crescimento vegetativo e esporulação e a classificação toxicológica foi determinada com base no cálculo do índice biológico. Apenas o fotoprotetor NeoHeliopan AV® nas concentrações de 0,5 e 1%, foi considerado tóxico ao fungo, inibindo completamente o seu desenvolvimento. Em contrapartida todas as concentrações de Tinosorb M® se mostraram compatíveis com o fungo. A germinação dos conídios foi o parâmetro que sofreu menor influência da presença dos surfactantes em meio de cultura, com exceção do Triton X-100®. Todos os produtos, exceto Unitol L20® a 0,01% e Tween 80® nas concentrações de 0,01 a 0,5%, foram considerados tóxicos ou moderadamente tóxicos ao fungo. Os antiumectantes carbonato de cálcio, talco, celulose microcristalina e dióxido de silício 36 não interferiram no desenvolvimento do fungo, especialmente quanto a germinação e crescimento, sendo considerados compatíveis. Os espalhantes adesivos testados influenciaram em um ou mais parâmetros avaliados, sendo a maioria, considerados tóxicos ou moderadamente tóxicos. O produto Haiten® (0,01%) mostrou-se compatível ao fungo, apresentando uma margem de segurança para seu uso, uma vez que foi considerado atóxico, mesmo utilizado em concentração cinco vezes maior (0,05%) do que a recomendada. Para compor a formulação, os conídios do fungo foram misturados ao dióxido de silício (1%) e armazenados sob refrigeração (4ºC) e em temperatura ambiente, durante 245 dias. A viabilidade foi avaliada mensalmente. Após este período, não houve diferença significativa na capacidade de germinação dos conídios armazenados sob refrigeração, que foi mantida maior que 89%. No armazenamento em temperatura ambiente observou-se uma redução considerável na viabilidade entre a primeira (97,7%) e a última avaliação (35,2%). Para avaliar a infectividade, a calda de pulverização foi composta pela mistura, em água, dos adjuvantes Tinosorb M® (1%), Haiten (0,01%), Tween 80® (0,1%) e PVP K-30® (0,1%) e os conídios em pó + dióxido de silício. Os tratamentos controle foram compostos por água destilada, e por calda contendo a mistura dos adjuvantes, exceto o antiumectante. A formulação não provocou a morte das plantas, porém sintomas típicos de infecção causados pelo fungo foram observados. Palavras-chave: formulação, fotoprotetores, surfactantes, antiumectantes, agentes adesivos, armazenamento. 37 CHAPTER 3 - TOXICITY PROFILE OF ADJUVANTS TO Bipolaris euphorbiae AND EVALUATION OF VIABILITY AND INFECTIVITY AFTER FORMULATION ABSTRACT - Adjuvants incorporation at formulations can positively influence the performance of bioagent control, contributing to preservation of the inoculum until being used. Adjuvants should not be toxic to pathogen and tests that evaluate the sensitivity of biologic products are essential. The storing for long periods of time should maintain the viability and infectivity of the pathogen, and represents a major challenge to make them commercially viable. The present study aimed to determine the toxicity of adjuvants to the fungus Bipolaris euphorbiae to select products to compose a formulation, evaluate the viability of the fungus formulated and stored under different conditions and test the infectivity of the formulation in Euphorbia heterophylla (wild poinsettia). Was tested the sunscreens NeoHeliopan AV®, NeoHeliopan Hydro®, NeoHeliopan E1000®, Eusolex 232®, Tinosorb M®, Eusolex 6007® and complex filters UVA / UVB; the surfactants Triton X-100®, Ultrol IT 80®, Ultranex NP 95®, Unitol L 20® and Tween 80®, the anti-humectants microcrystalline cellulose, anhydrous sodium carbonate, magnesium oxide, talc, calcium carbonate and silicon dioxide; the spreaders-stickers DuFol®, Haiten®, Agral®, Energic® and PVP K-30®, at concentrations of 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1%. The evaluated parameters were germination, vegetative growth and sporulation and toxicological classification was determined based on the biological index calculation. Only the sunscreen NeoHeliopan AV® at 0.5 and 1% concentration was considered toxic to fungus by inhibiting completely its development. In contrast, all concentrations of Tinosorb M® were compatible with the fungus. Conidial germination was the parameter that suffered less influence of the presence of surfactants in the culture medium, except for Triton X-100. All products, except Unitol at 0.01% and Tween at 0.01 and 0.05%, were considered toxic or moderately toxic to the fungus. The anti- humectants calcium carbonate, talc, microcrystalline cellulose and silicon dioxide did not affect the development of the fungus, especially for germination and growth and were considered compatible. The spreaders-stickers tested influence on one or more parameters, mostly considered toxic or moderately toxic. Haiten® (0.01%) was 38 compatible to the fungus, providing a safety margin to its use, since it was considered non-toxic, even used at a concentration five times greater (0.05%) than the recommended dose. To compose the formulation, fungal conidia were mixed with silicon dioxide and stored under refrigeration and at room temperature for 245 days. The viability was monthly evaluated. After this period, there was no significant difference in germination capacity of conidia stored under refrigeration, which ramained greater than 89%. Storaging at room temperature revealed a considerable reduction in viability between the first (97.7%) and the final evaluation (35.2%). To evaluate the infectivity, the spray solution was made by mixing, in water, the adjuvants Tinosorb M® (1%), Haiten® (0.01%), Tween 80® (0.1%) and PVP K-30® (0,1%) with conidia powder + silicon dioxide. The control treatments were composed of distilled water, and spray solution containing the mixture of the adjuvants, except anti-humectant agent. Although formulation did not cause plant death, typical symptoms of infection caused by the fungus were observed. Keywords: formulation, sunscreens, surfactants, anti-humectants, adhesives agents, storage � � � � � � � � � � � � � 39 1. INTRODUÇÃO O controle de plantas daninhas vem assumindo um papel de destaque