2020 AMANDA GUEDES NOGUEIRA MATUDA AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE UM SISTEMA ADESIVO MODIFICADO POR PARTÍCULAS DE VIDRO BIOATIVAS São José dos Campos 2020 AMANDA GUEDES NOGUEIRA MATUDA AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES DE UM SISTEMA ADESIVO MODIFICADO POR PARTÍCULAS DE VIDRO BIOATIVAS Dissertação apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-Graduação em ODONTOLOGIA RESTAURADORA. Área: Dentística. Linha de pesquisa: Avaliação clínica e laboratorial de alterações da estrutura dental, de materiais e técnicas de prevenção e tratamento em dentística. Orientadora: Profa. Associada Rebeca Di Nicoló Coorientador: Prof. Associado César Rogério Pucci Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2020]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Matuda, Amanda Guedes Nogueira Avaliação das propriedades de um sistema adesivo modificado por partículas de vidro bioativas / Amanda Guedes Nogueira Matuda. - São José dos Campos : [s.n.], 2020. 85 f. : il. Dissertação (Mestrado em Odontologia Restauradora) - Pós-Graduação em Odontologia Restauradora - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2020. Orientadora: Rebeca Di Nicoló Coorientador: César Rogério Pucci 1. Adesivos dentinários. 2. Biovidro. 3. Resistência à tração. 4. Força de união. I. Di Nicoló, Rebeca, orient. II. Pucci, César Rogério, coorient. III. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. IV. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. V. Universidade Estadual Paulista (Unesp). VI. Título. BANCA EXAMINADORA Profa. Associada Rebeca Di Nicoló (Orientadora) Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Associado Carlos Rocha Gomes Torres Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Profa. Dra. Ilene Cristine Rosia Cesar Universidade do Vale do Paraíba (Univap) Faculdade de Ciências da Saúde Campus de São José dos Campos São José dos Campos, 04 de fevereiro de 2020. DEDICATÓRIA Aos meus pais, José Armando de Castro Nogueira e Márcia Regina dos Santos Guedes Nogueira, por todo amor, dedicação, carinho e respeito com que me criaram. Pela formação, educação, valores e princípios que me passaram ao longo da vida. Sempre serão um exemplo para mim. Tenho muito orgulho de ser filha de vocês, meus amores, minha vida! Ao meu marido, Fábio da Silva Matuda, por todo incentivo, paciência, amor, cumplicidade. Por me entender e me dar forças nos momentos mais difíceis. Por todo suporte durante esses anos de estudos, sempre acreditando em mim e no meu trabalho. Sempre terá minha admiração. Sem você não teria chegado até aqui. Amo você! Ao meu irmão Pedro Paulo Guedes Nogueira pelo amor e companheirismo. Por me conceder a alegria de ser tia e pelos momentos de alegria que passamos juntos. Por isso e muito mais, amo você! Aos meus sogros, Joaquim Matuda e Diva da Silva Matuda, pelo apoio e suporte. Pelo carinho e cuidado com que me tratam e por estarem sempre por perto. Agradeço de coração! AGRADECIMENTOS A Deus, por todos os Seus planos para minha vida serem sempre maiores que os meus sonhos. Ao Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos ICT-UNESP, na pessoa da diretora Profa. Associada Rebeca Di Nicoló e do vice-diretor Prof. Associado Cláudio Antonio Talge Carvalho. Ao Programa de Pós-graduação em Odontologia Restauradora área Dentística, na pessoa do coordenador Prof. Associado Carlos Rocha Gomes Torres. À minha orientadora Rebeca Di Nicoló, pela oportunidade de ter sido sua orientada, por sempre ser tão gentil e atenciosa. Ao meu coorientador Prof. Associado César Rogério Pucci, pela oportunidade, pelos ensinamentos transmitidos e por toda paciência. Obrigada pela dose extra de incentivo, palavras de otimismo e por acreditar no meu trabalho. Muito obrigada! Às minhas queridas amigas de turma, Sheyla Mamede Veloso, Sabrina Elise Moecke e Lilian Guimarães Alarça Nunes, obrigada pela amizade, carinho e por terem dividido comigo os momentos de dificuldade. Obrigada pela ajuda em todos os momentos. Admiro muito vocês e fiquei extremamente feliz em conhecê-las. Obrigada por tudo! Às colegas e amigas Tânia Mara da Silva e Érika Priscila Siqueira, por terem me ajudado no laboratório tantas vezes. Obrigada pela paciência e por terem sido tão atenciosas. Aos amigos, Manuela, Amjad, Adrielle, Ana Luíza, Mariane, Rafael, Stephanie, Ana Paula, Tamires, Stefhany, Ana Flávia, Mateus, Marina e Natália, obrigada por toda ajuda e pelos bons momentos juntos. Às alunas de iniciação científica Ana Helena Moreira Barnabé e Poliana Maria de Oliveira Silva, pela troca de experiências e pela ajuda no laboratório. Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Odontologia Restauradora área Dentística. Ao Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), da Universidade do Vale do Paraíba (Univap), na pessoa da bióloga Priscila Maria Sarmeiro Correa Marciano Leite, por ter nos cedido o espaço e os equipamentos, além de nos auxiliar na elaboração de alguns testes, agradeço imensamente. Aos professores participantes da Banca Examinadora, Prof. Associado Carlos Rocha Gomes Torres e Profa. Dra. Ilene Cristine Rosia Cesar, muito obrigada por aceitarem o convite prontamente e fazerem parte desse dia tão especial para mim. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da Bolsa de Mestrado, através do processo nº 88882.434236/2019-01, no período de 01/12/2018 a 31/01/2020. Agradeço a todos que contribuíram com esse trabalho, pela ajuda e incentivo. Muito obrigada! “Por isso não tema, pois Estou com você; não tenha medo, pois Sou o seu Deus. Eu o fortalecerei e o ajudarei; eu o segurarei com a Minha mão direita vitoriosa.” Isaías 41:10 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 9 LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................... 12 RESUMO ................................................................................................................... 13 ABSTRACT ............................................................................................................... 14 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 18 2.1 Sistemas adesivos ............................................................................................ 18 2.2 Teste de microtração......................................................................................... 23 2.3 Partículas de vidro bioativas ............................................................................ 31 3 PROPOSIÇÃO ....................................................................................................... 36 3.1 Objetivo geral ..................................................................................................... 36 3.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 36 3.3 Hipóteses nulas testadas .................................................................................. 36 4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 37 4.1 Comitê de ética .................................................................................................. 37 4.2 Delineamento experimental .............................................................................. 37 4.2.1 Unidade experimental .................................................................................... 37 4.2.2 Fatores de estudo ........................................................................................... 37 4.2.3 Variável de resposta ....................................................................................... 38 4.3 Materiais utilizados ........................................................................................... 38 4.4 Seleção das amostras para o teste de resistência de união ......................... 39 4.5 Preparo das amostras para o teste de resistência de união ......................... 39 4.6 Divisão dos grupos experimentais .................................................................. 41 4.7 Incorporação das partículas de vidro bioativas no adesivo .......................... 42 4.8 Aplicação do adesivo e técnica restauradora ................................................. 43 4.9 Teste de resistência de união ........................................................................... 46 4.10 Grau de conversão .......................................................................................... 49 4.11 Atividade antibacteriana ................................................................................. 52 4.11.1 Teste de difusão em ágar ............................................................................. 53 4.11.2 Contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) ............................ 55 4.12 Análise ilustrativa por MEV ............................................................................ 55 5 RESULTADO ......................................................................................................... 56 5.1 Estatística para resistência de união ............................................................... 56 5.2 Estatística do grau de conversão .................................................................... 62 5.3 Estatística da atividade antibacteriana ............................................................ 65 5.3.1 Difusão em ágar .............................................................................................. 65 5.3.2 Unidade formadora de colônia (UFC) ........................................................... 66 5.4 Análise ilustrativa por MEV .............................................................................. 68 6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 70 6.1 Discussão da metodologia ............................................................................... 70 6.2 Discussão dos resultados ................................................................................ 72 7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 75 REFERÊNCIAS* ....................................................................................................... 76 ANEXOS ................................................................................................................... 84 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Preparo das amostras.................................................................... 40 Figura 2 – Finalização do preparo das amostras............................................ 41 Figura 3 – Delineamento dos grupos de pesquisa.......................................... 42 Figura 4 – Incorporação das partículas no adesivo......................................... 43 Figura 5 – Técnica restauradora..................................................................... 45 Figura 6 – Confecção dos palitos para o teste de resistência de união........... 47 Figura 7 – Teste de resistência de união......................................................... 49 Figura 8 – Grau de conversão........................................................................ 51 Figura 9 – Avaliação das atividades antibacterianas...................................... 52 Figura 10 – Teste de difusão em ágar............................................................. 54 Figura 11 – Preparação dos discos de adesivo............................................... 54 Figura 12 – Preparação das placas para UFC............................................... 55 Figura 13 – Análise descritiva das médias de resistência de união (MPa) e desvio padrão............................................................................................... 57 Figura 14 – Porcentagem de tipos de fratura após teste de microtração....... 59 Figura 15 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB.................................................................................................... 60 Figura 16 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB0,5............................................................................................... 61 Figura 17 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB1.................................................................................................. 62 Figura 18 – Análise descritiva das médias de grau de conversão e desvio padrão.......................................................................................................... 63 Figura 19 – Análise ilustrativa do teste de difusão em ágar........................... 65 Figura 20 – Análise descritiva das médias de atividade antibacteriana (UFC) e desvio padrão.................................................................................. 67 Figura 21 – Fotomicrografia de MEV da superfície dos discos de adesivo dos diferentes grupos................................................................................... 69 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Análise descritiva para os diferentes grupos em ordem decrescente quanto à resistência adesiva (MPa)........................................ 56 Tabela 2 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator para resistência de união...................................................................................... 58 Tabela 3 – Resultado do Teste de Tukey para resistência de união.............. 58 Tabela 4 – Análise descritiva para os diferentes grupos em ordem decrescente quanto ao grau de conversão................................................... 63 Tabela 5 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator para o grau de conversão................................................................................................ 64 Tabela 6 – Resultado do Teste de Tukey para o grau de conversão............. 64 Tabela 7 – Análise descritiva para os diferentes grupos em ordem decrescente quanto à atividade antibacteriana (UFC).................................. 66 Tabela 8 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator para a atividade antibacteriana (UFC)..................................................................... 67 Tabela 9 – Resultado do Teste de Tukey para a atividade antibacteriana (UFC)............................................................................................................ 68 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µTBS Resistência de união à microtração 10-MDP 10-Metacriloiloxidecil dihidrogênio fosfato A Área de união ANOVA Análise de variância ATR Refletância total atenuada BHI Brain heart infusion Bis-GMA Bisfenol A glicol dimetacrilato CHX Clorexidina CIV Cimento ionômero de vidro CIVMR Cimento ionômero de vidro modificado por resina CQ Canforoquinona EDAB Etil 4-dimetilaminobenzoato F Força aplicada FTIR Espectroscopia de infravermelho transformada de fourier GC Grau de conversão HAp Hidroxiapatita sintética HEMA 2- hidróxietil metacrilato ICP-OES Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente acoplado MCVL Microscopia confocal de varredura a laser MEV Microscopia eletrônica de varredura MMPs Metaloproteinases de matriz MPa Megapascal PBS Solução salina estéril tamponada com fosfato UFC Unidade formadora de colônia δ Força de união a microtração Matuda AGN. Avaliação das propriedades de um sistema adesivo modificado por partículas de vidro bioativas [dissertação]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2020. RESUMO O objetivo desse estudo foi avaliar as propriedades de um sistema adesivo modificado com a incorporação de partículas de vidro bioativas (SCHOTT Bioactive Glass) em duas diferentes concentrações (0,5 e 1%). Foram avaliados a resistência de união da interface adesiva, o grau de conversão e a atividade antibacteriana, além da análise por meio do Estereomicroscópio e Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Os adesivos foram divididos em três grupos: ASB - Adesivo Single Bond 2 (3M-ESPE) sem a incorporação de partículas bioativas, ASB0,5 – Adesivo Single Bond 2 com a incorporação de partículas bioativas na concentração de 0,5% e ASB1 – Adesivo Single Bond 2 com a incorporação de partículas bioativas na concentração de 1%. Para o teste de resistência de união foram utilizados 30 molares humanos hígidos (n=10) que posteriormente foram observados em Estereomicroscópio para análise do padrão da fratura. O grau de conversão foi feito no FTIR, onde foram feitas três leituras das gotas do adesivo dos diferentes grupos. A atividade antibacteriana foi feita através dos testes de difusão em ágar e contagem da unidade formadora de colônia (UFC), onde foram utilizados discos de adesivos polimerizados dos diferentes grupos. Os testes antibacterianos foram repetidos por três vezes. Os dados foram analisados estatisticamente quanto à sua normalidade. Como estes apresentaram distribuição normal, realizou-se o teste de análise de variância (ANOVA) paramétrica um fator (sistema adesivo) e o teste de Tukey, sendo adotado o nível de significância de 5% para a tomada de decisões. De acordo com os resultados obtidos na microtração (MPa±Dp) , a maior média foi observada no grupo ASB0,5 49,04±4,72A, seguida do grupo ASB 41,19±2,34B e a menor média foi observada no grupo ASB1 27,15±2,36C. No grau de conversão a maior média foi observada no grupo ASB 77,75±2,97A, seguido do grupo ASB0,5 63,18 ± 20,03A e grupo ASB1 58,35 ± 14,95A. Na atividade antibacteriana não houve diferença na formação de áreas de inibição, entretanto na unidade formadora de colônia o grupo ASB0,5 0,36±0,02B apresentou menor média em relação aos grupos ASB1 0,53±0,06A e ASB 0,51±0,01A. Foi concluído que a incorporação de partículas de vidro bioativas na concentração de 0,5% no sistema adesivo, aumentou a resistência de união da interface adesiva e apresentou atividade antibacteriana (UFC), no entanto, nas diferentes concentrações, não influenciou no grau de conversão do adesivo. Palavras-chave: Adesivos dentinários. Biovidro. Resistência à tração. Força de união. Matuda AGN. Evaluation of the properties of an adhesive system modified by bioactive glass particles [dissertation]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2020. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the properties of a modified adhesive system with the incorporation of bioactive glass particles (SCHOTT Bioactive Glass) in two different concentrations (0.5 and 1%). The bond strength of the adhesive interface, the degree of conversion and antibacterial activity were evaluated, in addition to analysis using the Stereomicroscope and Scanning Electron Microscope (SEM). The adhesives were divided into three groups: ASB - Single Bond 2 Adhesive (3M- ESPE) without the incorporation of bioactive particles, ASB0.5 - Single Bond 2 Adhesive with the incorporation of bioactive particles at a concentration of 0.5% and ASB1 - Single Bond 2 adhesive with the incorporation of bioactive particles at a concentration of 1%. For the microtensile bond strength test, 30 healthy human molars (n = 10) were used, which were subsequently observed in a stereomicroscope to analyze the fracture pattern. The degree of conversion was made in the FTIR, where three readings of the drops of the adhesive of the different groups were made. The antibacterial activity was performed through the agar diffusion tests and colony forming unit (CFU) counting, where polymerized adhesive discs from different groups were used. The antibacterial tests were repeated three times. The data were analyzed statistically for normality. As these showed normal distribution, the parametric one-way analysis of variance (ANOVA) test (adhesive system) and the Tukey test were performed, with a significance level of 5% for decision making. According to the results obtained in microtensile (MPa ± Dp), the highest average was observed in the ASB0.5 group 49.04 ± 4.72A, followed by the ASB group 41.19 ± 2.34B and the lowest average was observed in the ASB1 group 27.15 ± 2.36C. In the degree of conversion, the highest average was observed in the ASB group 77.75 ± 2.97A, followed by the ASB0.5 group 63.18 ± 20.03A and ASB1 group 58.35 ± 14.95A. In the antibacterial activity there was no difference in the formation of areas of inhibition, however in the colony-forming unit the ASB0.5 group 0.36 ± 0.02B presented a lower average in relation to the ASB1 groups 0.53 ± 0.06A and ASB 0.51 ± 0.01A. It was concluded that the incorporation of bioactive glass particles at a concentration of 0.5% in the adhesive system, increased the bond strength of the adhesive interface and showed antibacterial activity (CFU), however, in different concentrations, did not influence the degree of conversion of the adhesive. Keywords: Dentin-bonding agents. Bioglass. Tensile strength. Bond strength. 15 1 INTRODUÇÃO As resinas compostas são os materiais mais utilizados para restaurações diretas na odontologia atual, devido em grande parte às suas propriedades estéticas, facilidades de manipulação e modernas tecnologias adesivas (Huang et al., 2018). A adesão dos compósitos de resina às estruturas dentárias foi realmente efetiva após Nakabayashi et al. (1982) observarem a formação de uma nova estrutura de resina, reforçada por fibrilas colágenas em dentina condicionada com ácido fosfórico. Essa nova estrutura recebeu o nome de camada híbrida. Ainda hoje, esse conceito de hibridização representa o principal mecanismo de retenção dos sistemas adesivos. O sucesso da adesão de resinas compostas às estruturas dentárias, está diretamente relacionado com a duração das restaurações na cavidade bucal e interrupção do ciclo restaurador repetitivo, em que restaurações são periodicamente trocadas por outras cada vez maiores e de maior complexidade (Spencer et al., 2010). Assim, pesquisas sobre estratégias para aumentar a durabilidade da interface adesiva estão em constante crescimento e evolução. Existem dois grandes desafios associados à durabilidade da interface adesiva, a cárie secundária e a degradação da interface adesiva (Gou et al., 2018). A cárie secundária é a causa mais prevalente de substituição de restaurações dentárias, devido a migração de bactérias e seus subprodutos através da interface adesiva (Nedeljkovic et al., 2015). A disponibilidade de oxigênio e nutrientes para as bactérias retidas permitem que elas se proliferem, causando a cárie secundária e dano pulpar ao longo do tempo (Nedeljkovic et al., 2015). O outro grande desafio está associado à degradação da interface adesiva. O sistema adesivo utilizado no processo de adesão deve ser capaz de preencher completamente os espaços ao redor da fibrilas colágenas desmineralizadas, caso isso não ocorra, forma-se uma zona fragilizada dentro da camada híbrida, dando início a nanoinfiltração, hidrólise das fibrilas colágenas e consequentemente a degradação da interface adesiva (Spencer et al., 2010; Hashimoto et al., 2011). Com a degradação ocorre a diminuição da resistência de união dente-restauração, comprometendo o selamento da cavidade, resultando em manchamento marginal, cárie secundária e 16 perda prematura de restaurações diretas e indiretas (Drummond, 2009). A principal causa da degradação é a presença das enzimas endógenas de matriz extracelular, as metaloproteinases (MMPs), nas fibrilas colágenas expostas da dentina condicionada. (Gou et al., 2018; Hashimoto et al., 2011; Huang et al., 2018). O condicionamento ácido necessário para procedimentos adesivos, desmineraliza a porção superficial da dentina, deixando as fibras colágenas expostas e ativando as metaloproteinases (Tezvergil-Mutluay et al., 2011). Quando as MMPs de dentina são expostas e ativadas, estas enzimas degradam o colágeno tipo I (Carrilho et al., 2009). Novas estratégias para solucionar os dois desafios mencionados acima podem ser cruciais para aumentar a longevidade das restaurações adesivas (Perdigão et al., 2013). Portanto uma alternativa para essas limitações seria o desenvolvimento de sistemas adesivos que apresentem atividades antimicrobianas, através da biomodificação por meio de agentes bioativos. A clorexidina possui atividade antimicrobiana de amplo espectro, propriedades anti-MMP e já foi incorporada em materiais restauradores (Gendron et al., 1999; Cheng et al., 2012;). Porém, como a clorexidina não co-polimeriza com monômeros de resina de metacrilato, eventualmente se libera da rede de resina polimerizada, portanto, os adesivos que incorporam clorexidina não fornecem efeitos antimicrobianos e anti-proteolíticos de longa duração. (Sadek et al., 2010). Atualmente partículas de vidro bioativas estão sendo utilizadas (Crovace et al., 2016; Niu et al., 2012, 2014a, 2014b) para o desenvolvimento de materiais restauradores que favorecem a remineralização, a inibição de enzimas, a prevenção do crescimento bacteriano e o controle do pH (Osorio et al., 2012; Xu et al., 2009). A incorporação das partículas de vidro bioativas em materiais dentários, como no sistema adesivo, pode induzir a remineralização dos espaços interfibrilares não infiltrados por adesivo, protegendo assim as fibrilas colágenas (Bauer et al., 2016). Além de funcionar como um agente de remineralização, a presença de partículas de vidro bioativas na interface resina-dentina também pode controlar o crescimento bacteriano e prevenir a recorrência de cáries sob o material restaurador (Martins et al., 2011; Waltimo et al., 2007). Partículas de vidro bioativas liberam os íons de sua composição que formam uma matriz mineral equivalente à da hidroxiapatita natural, esses íons de cálcio se dissolvem e há um aumento de sua atividade no local. Sílica hidratada na superfície 17 do vidro favorece a nucleação de hidroxiapatita (Kaur et al., 2014). Além disso, as partículas de vidro bioativas apresentam um aumento imediato e duradouro do nível de pH, isso promove um efeito substancial de autoproteção em relação a uma ampla gama de bactérias e fungos em testes (Kaur et al., 2014). As partículas bioativas da SCHOTT-Bioactive Glass apresentam grande potencial de liberação de cálcio e propriedades antimicrobianas*. Portanto, a incorporação dessas partículas no adesivo pode colaborar com as propriedades do material favorecendo a estabilidade da interface adesiva. Assim verificou-se a necessidade de estudos sobre os efeitos antimicrobianos de adesivos modificados com essas partículas de vidro bioativas na camada híbrida. Adicionalmente, caso apresente um potencial em aumentar a longevidade da interface, seria positivo acrescentar esse material na composição de adesivos, de resinas, na cimentação ortodôntica e em selantes atuando sobre a prevenção de cáries. Os resultados deste estudo inicial com a incorporação de partículas de vidro bioativas no adesivo podem trazer inovações que terão relevância clínica, com a possibilidade de patentear esse novo material. _______________________ * Informações obtidas no site: (https://www.schott.com/) 18 2 REVISÃO DE LITERATURA Para facilitar a compreensão, a revisão da literatura será dividida em três tópicos principais: Sistemas adesivos; Teste de microtração e Partículas de vidro bioativas. 2.1 Sistemas adesivos Buonocore (1955) iniciou a Odontologia Adesiva, através da introdução da técnica do condicionamento ácido do esmalte, criando-se assim, uma nova perspectiva nos procedimentos restauradores. O estudo mostrou que a adesão de discos de resina acrílica, com 5 mm de diâmetro, à superfície de esmalte foi maior quando este era condicionado com ácido fosfórico a 85% por 30 segundos, do que quando não recebia nenhum tratamento previamente à colocação da resina acrílica. O autor concluiu que o tratamento empregado promoveu a formação de microporosidades na superfície do esmalte, aumentando sua área superficial, a capacidade de umedecimento da superfície e, finalmente, permitindo a infiltração e a adesão mecânica da resina acrílica com a superfície do esmalte. Nakabayashi et al. (1982) foram os primeiros a descreverem a formação da camada híbrida em um estudo que avaliou um sistema adesivo à base de monômeros resinosos hidrofóbicos e hidrofílicos denominado 4 - metacriloxietil trimetacrilato anidro 4-META/metil metacrilato-tri-n-butil borano oxidizado (MMA/TBB-O) em relação a sua efetividade associada a um agente condicionante composto pela união do cloreto férrico a 3% e ácido cítrico a 10%. Esta solução ficou conhecida como 10-3, pois essa combinação de ácidos removeu totalmente a lama dentinária e desmineralizou a dentina subjacente em aproximadamente 5 μm de profundidade. Foram utilizados cilindros de esmalte e dentina humana e bovina condicionados, onde os monômeros resinosos hidrofóbicos e hidrofílicos (4-META), infiltraram-se entre as fibras colágenas expostas e, posteriormente, foram polimerizados. As imagens foram 19 observadas em microscopia eletrônica de varredura, uma região mista abaixo da interface adesiva, com monômeros resinosos no interior da dentina desmineralizada e os autores a denominaram camada híbrida. Essa nova união micro-mecânica, foi responsável pelos altos valores de união obtidos por essa técnica. Pashley et al. (1988), observaram que a natureza distintamente globular de parte da smear layer da dentina, é criada com lixa ou brocas, além disso a matriz da dentina pode ser severamente alterada durante a criação da smear layer, pois o calor substancial e forças de cisalhamento podem ser geradas na superfície da dentina enquanto ela é cortada. Porém independentemente de como esses grânulos podem ser produzidos, os autores concluíram que eles são uma parte importante da subestrutura da smear layer da dentina, pois em uma adesão dentinária o material é colocado na dentina preparada e a adesão que se desenvolve é entre o material e a camada de smear layer e não a matriz de dentina mineralizada subjacente. Pashley (1992), observou ainda que a remoção da camada de smear layer pelo condicionamento ácido, ocasiona um aumento da permeabilidade da dentina, umidade superficial, potencial de irritação pulpar, desnaturação do colágeno e possível discrepância entre profundidade de desmineralização e capacidade de penetração do agente adesivo. Por isso, foi concluído que o sistema adesivo deve ser hidrofílico, ter afinidade à água, com capacidade de penetrar tanto em dentina intertubular como em dentina peritubular, além disso, a profundidade de desmineralização causada pelo ácido depende não só do tempo de condicionamento, como também da concentração, tipo de ácido utilizado e concentração mineral do substrato em questão. Tay et al. (1998) realizaram um estudo com o objetivo de investigar a ultraestrutura da interface resina-dentina quando um sistema de primer contendo o sal de sódio de NTGGMA e BPDM (bifenil dimetacrilato) foi usado com diferentes concentrações de água como parte do solvente de primer. Os autores relataram que com o uso da versão de primer isenta de água, a hibridização ótima foi observada sempre que a dentina foi seca antes da adesão. Na versão com 5% de água, a dessecação prolongada resultou em hibridação comprometida, enquanto os glóbulos de resina foram observados na superfície da camada híbrida quando foi empregada uma técnica úmida. Na versão de 17% de água, bolhas de superfície e glóbulos característicos do "fenômeno de overwet" foram observados. Foi concluído que entre 20 os dois extremos de um espectro morfológico de condições de adesão, as diferentes versões de primers exibiram diferentes faixas de sensibilidade. Houve uma mudança na 'janela de oportunidade' para a hibridação ótima e vedação tubular, dependendo do teor de água do sistema de primer investigado. Segundo um estudo de Tay et al. (1996), o excesso de umidade leva à separação de fases da solução primer ou primer-adesivo nos sistemas à base de acetona e a diluição dos componentes resinosos em adesivos que possuem a água como solvente ou co-solvente. Além disso, de acordo com o estudo, o excesso de água ocupa espaço dentro dos túbulos dentinários e isso impede a formação de tags de resina. Por outro lado, os espaços interfibrilares diminuem com a falta de água, ocorrendo falha na infiltração dos monômeros resinosos para a formação da camada híbrida. Diante das circunstâncias na técnica de adesão úmida, surgiram no mercado, no início dos anos 90, sistemas adesivos que não necessitam de condicionamento prévio com ácido fosfórico, com isso ocorre maior controle da umidade no substrato dentinário. Esse sistema recebeu o nome de adesivo autocondicionante. Os adesivos autocondicionantes são bem adotados na prática geral, pela facilidade de uso e ao rápido tempo de aplicação. No entanto, o ácido fosfórico ainda é frequentemente recomendado para condicionar somente o esmalte seguindo uma maneira chamada técnica "seletiva", isto em particular quando a maioria das margens da cavidade terminam em esmalte. Por isso, o objetivo do estudo de Hanabusa et al. (2012), foi testar se um novo adesivo autocondicionante de uma etapa pode ser aplicado de maneira completa ou seletivas, usando duas abordagens diferentes, etch-and-rinse ou autocondicionante. Foram utilizados vinte e cinco terceiros molares humanos não cariados que foram armazenados em cloramina / água a 0,5% a 48º C e foram utilizados no prazo de 1 mês após a extração. Os dentes foram divididos aleatoriamente em dois grupos principais, seguindo-se 5 protocolos de adesivo. O primeiro foi selecionado e aplicado ao esmalte "recortado", seguindo-se um self-etch ou um protocolo de adesivo etch- and-rinse, e dentina após um autocondicionamento, uma união a seco ou um protocolo de adesivo de adesão úmida etch-and-rinse. A partir deste estudo, pode-se concluir que a eficácia de adesão do adesivo autocondicionante de uma etapa, pode ser melhorado se as margens do esmalte forem condicionadas seletivamente com 21 ácido fosfórico. Na dentina, uma abordagem autocondicionante é preferida, uma vez que a análise interfacial revelou claramente baixa qualidade hibridação. Embora o condicionamento prévio da dentina não tenha reduzido a força de adesão "imediata", espera-se que a estabilidade da adesão seja menor do que a produzida quando o adesivo de uma etapa é aplicado à dentina após uma abordagem autocondicionante. Perdigão (2010), concluiu que as variações morfológicas e físicas na dentina humana, fazem dela um substrato difícil para a obtenção de uma união durável entre resina e dentina. Como foi observado por Ryou et al. (2013), segundo os autores, a redução da integridade da camada híbrida facilita a perda de adesão. O estudo explorou as variações espaciais no comportamento mecânico de dentina infiltrada em resina usando análise dinâmica nanoscópica (DMA). Espécimes de dentina completamente desmineralizados infiltrados com adesivo comercial e controle foram avaliados. A importância da hidratação no comportamento mecânico também foi avaliada a partir da comparação de respostas nas condições de dentina hidratada e desidratada. Foi concluído que a microestrutura e a hidratação desempenham papéis críticos no comportamento mecânico da camada híbrida. De acordo com Tjäderhane et al. (2013), os monômeros adesivos não são capazes de encapsular completamente a matriz colágena exposta, deixando fibras colágenas totalmente ou parcialmente expostas na base da camada híbrida, faltando a proteção da resina polimerizada. A falta da proteção da resina e a presença de água deixam as fibras colágenas desmineralizadas vulneráveis à degradação hidrolítica que depende do tempo. A literatura científica frequentemente mostra que a ligação resina-dentina obtida com sistemas adesivos atuais é propensa à degradação por MMPs ao longo do tempo (Tjäderhane et al., 2013; Yiu et al., 2012), incentivando o desenvolvimento de novos estudos nesse campo. Por esse motivo, Silva et al. (2015), desenvolveram sistemas adesivos experimentais de condicionamento ácido total contendo inibidores de MMPs (GM1489, Galardin, Batimastat e diacetato de clorexidina) e avaliaram sua porcentagem de grau de conversão, sorção de água, solubilidade e estabilidade da união resina-dentina, por um período de doze meses. Os inibidores de MMP Galardin, Batimastat e GM1489, na concentração de 5 mM, e diacetato de clorexidina na concentração de 2% em peso foram incorporados em quatro adesivos experimentais, contendo HEMA, 22 TEGDMA, 4-META, EDMAB e canforoquinona. O sistema adesivo experimental sem qualquer inibidor de MMP foi utilizado como controle e o sistema adesivo, Adper Single Bond 2 foi utilizado como grupo controle comercial. Os autores concluíram que sistemas adesivos experimentais com GM1489 e diacetato de clorexidina apresentaram as melhores propriedades físico-químicas e preservaram a estabilidade resina-dentina após 12 meses de armazenamento de água. O GM1489 pode ser adequado para inclusão como um inibidor de MMP em sistemas adesivos de condicionamento ácido total, para manter a estabilidade da ligação resina-dentina ao longo do tempo. Amaral et al. (2016) também desenvolveram adesivos experimentais de condicionamento ácido total, investigando a influência da concentração de 4-META e do tipo de solvente no grau de conversão e na estabilidade da ligação resina-dentina. Quatro concentrações diferentes de 4-META (12% em peso, 20% em peso, 30% em peso, 40% em peso) foram adicionadas a um sistema adesivo modelo consistindo em TEG-DMA (25% em peso), UDMA (20% em peso), HEMA. (30% em peso), água (4% em peso), canforoquinona (0,5% em peso) e amina terciária (0,5% em peso) dissolvidos em 20% de acetona ou 20% de etanol. A % de DC foi avaliada por espectroscopia de FT-IR. A resistência à microtração foi avaliada após 24 h, 6 meses e 1 ano de armazenamento de água a 37 °C. Independentemente do tipo de solvente orgânico, a incorporação de concentrações elevadas de 4-META (40% em peso) melhorou a estabilidade da ligação resina-dentina dos sistemas adesivos de condicionamento ácido total experimentais durante um período de 1 ano. Recentemente Delaviz et al. (2019), investigaram oligômeros antimicrobianos sintetizados a partir de ciprofloxacina e metronidazol, quanto ao seu potencial uso em adesivos dentários. Adesivos experimentais foram preparados utilizando os monômeros comerciais bisfenol A diglicidilmetacrilato (BisGMA) e HEMA combinado com os oligômeros antimicrobianos. Eles foram caracterizados quanto à viscosidade e tenacidade à fratura interfacial. A suscetibilidade da bactéria cariogênica Streptococcus mutans à combinação foi avaliada. A estabilidade hidrolítica e a liberação do fármaco a partir dos oligômeros foram estudadas em condições de tampão e simuladores da saliva humana. A citotoxicidade de filmes com oligômeros de fármacos a 15% em peso co-polimerizados com monómeros comerciais foi avaliada utilizando fibroblastos gengivais humanos. Foi concluído que os oligômeros 23 antimicrobianos podem ser incorporados em sistemas adesivos odontológicos usando formulações que mostram resistência à fratura comparável a materiais comerciais, e podem oferecer um meio de fornecer a liberação de fármaco antimicrobiano local na interface marginal. 2.2 Teste de microtração O teste de microtração foi introduzido por Sano et al. (1994) com o objetivo de analisar a resistência de união da interface adesiva, estudando o relacionamento entre a área de superfície adesiva e a resistência de união à tração. As dimensões dos espécimes foram reduzidas pelos autores, a fim de se obter pequenas áreas de dentina. Terceiros molares com porções de esmalte oclusal, mesial e distal removidas, para obtenção dos espécimes. Os grupos foram então divididos de acordo com o tipo de sistema adesivo aplicado: sistema adesivo convencional Scotchbond Multi- Purpose (3M ESPE) e sistema adesivo autocondicionante Clearfil Liner Bond 2 (Kuraray). Em seguida, restaurações foram realizadas com 3-5 mm de espessura, em resina composta ou ionômero de vidro e os espécimes foram armazenados em água destilada a 37 ºC por 24 h. Após este tempo, as raízes foram removidas e pequenos cortes variando de 0,5 mm a 3 mm de espessura foram realizados em direção ao longo eixo do dente. Amostras compostas por restauração, interface adesiva e dentina foram então obtidas. A espessura da interface foi reduzida com o auxílio de pontas diamantadas esféricas dando-lhe o formato de ampulheta. Os autores variaram a espessura e a largura da interface adesiva. Para a realização do teste de tração, os espécimes foram fixados com cola de cianoacrilato a um dispositivo específico e encaixados em uma máquina de ensaios universal com velocidade de 1mm/min. De acordo com os resultados, a resistência de união para as interfaces com áreas menores do que 0,4 mm² foi de aproximadamente 55 MPa para o Clearfil Liner Bond, 2,38 MPa para o Scotchbond Multi-Purpose e 20 MPa para o Vitremer. Para essas áreas reduzidas, todas as falhas foram na interface adesiva. Os autores observaram que a resistência de união foi inversamente proporcional à área da superfície adesiva e que o teste de microtração promove naturalmente falhas adesivas. E concluíram 24 que, o novo método permite medir altos valores de resistência adesiva, sem falhas coesivas em dentina, e possibilita múltiplas medidas a partir de um único dente. Ao longo dos anos, foram propostas alterações ao método inicialmente descrito, em relação ao tamanho e formato dos espécimes, método de corte para obtê- los e dados considerados para análise estatística. Schreiner et al. (1998) confeccionaram espécimes em formato de ampulheta ao invés de palito. Os autores concluíram que com relação à resistência adesiva, espécimes em forma de palito apresentaram valores significantemente maiores que os obtidos em forma de ampulheta. Fatias foram obtidas a partir de cortes iniciais no dente a ser testado, logo após foram desgastadas na interface adesiva por meio de ponta diamantada esférica em alta rotação, onde se reduziu a área de união a ser testada. No entanto, uma maior incidência de fraturas prematuras, principalmente para materiais com resistência adesiva relativamente baixa, foram associadas à metodologia de obtenção de espécimes em forma de ampulheta. Pashley et al. (1995), relataram o processo de adesão nos diferentes substratos através de uma revisão de literatura sobre o ensaio de microtração. Foram estudadas as variáveis envolvidas durante o condicionamento ácido, aplicação do “primer” e do adesivo. Segundo os autores, para os sistemas adesivos atuais, este ensaio apresenta como vantagens valores de união entre 20-30 Mpa. Além dos elevados valores de união, o padrão de fratura encontrado é, predominantemente, adesivo, com poucas fraturas coesivas. O teste de microtração permite a mensuração de valores de união exclusivamente da interface adesiva, mesmo que estas sejam pequenas áreas, permitindo inclusive a análise de superfícies irregulares. A obtenção de corpos-de-prova com uma interface de união de 1 mm2, facilita a avaliação em microscopia eletrônica de varredura. Os autores também relataram como uma vantagem do ensaio, o cálculo da média e desvio-padrão utilizando apenas um dente. Como desvantagens, o método apresenta um período laboratorial intensivo, com uma técnica sofisticada, necessitando de equipamentos especiais. Também existe uma dificuldade da mensuração de valores abaixo de 5 MPa. Além disso, devido as pequenas dimensões dos corpos-de-prova a desidratação dos mesmos é outro fator a ser considerado. Cardoso et al. (1998), avaliaram três sistemas adesivos, utilizando o teste de microtração, cisalhamento e tração. Para isso, foram utilizados 30 molares humanos 25 embebidos em resina acrílica e 3 superfícies do mesmo dente foram expostas para a realização de cada tipo de teste. Os resultados do estudo demonstraram que todos os testes classificaram a mesma ordem para os sistemas adesivos. O teste de microtração não indicou diferenças estatísticas entre os sistemas adesivos. O teste de cisalhamento demonstrou que o sistema adesivo Single Bond 2 apresentou resultados significativamente superior do adesivo Etch & Prime 3.0. Porém, o adesivo Scotchbond Multi-Purpose não diferiu de nenhum dos outros dois sistemas adesivos. O teste de tração encontrou os mesmos resultados do teste de cisalhamento. Os autores relataram que ao comparar os diferentes testes, o teste de microtração demonstrou os valores mais altos de médias e o menor coeficiente de variação entre os testes. Com isso, os autores concluíram que dependendo do teste utilizado resultados diferentes podem ser encontrados. Pashley et al. (1999), realizaram uma revisão de literatura com o objetivo de descrever as modificações propostas para o de ensaio de microtração, possibilitando que os pesquisadores adotem as modificações que melhor julgarem. Os corpos-de- prova do ensaio de microtração podem ser obtidos de 2 maneiras diferentes. Podendo ser confeccionados na forma de palito ou de fatia. As fatias apresentam de 0,5 a 1mm de espessura, posteriormente, as interfaces de união das fatias são desgastadas para a obtenção de áreas de união de 0,5 a 1mm2 de maneira a concentrar as forças de tração na interface a ser testada. A principal vantagem do ensaio é a obtenção de múltiplos corpos-de-prova de apenas um único dente. O ensaio de microtração pode ser utilizado para medir valores de união de diferentes regiões dentinárias, como a região oclusal, coronária, cervical e intrapulpar. Assim fornece subsídios para comparar dentina normal versus dentina cariada ou dentina normal versus dentina cervical esclerótica. A técnica se mostra adequada para a avaliação da durabilidade da interface de união da resina e tecidos dentais duros. Desta forma, os autores concluíram que o ensaio de microtração oferece uma maior versatilidade de técnica em relação aos ensaios convencionais. Entretanto, uma técnica mais rebuscada, proporcionando uma análise adequada da resistência de união de materiais adesivos e substratos. Tanumiharja et al. (2000), avaliaram a resistência de união de sete sistemas adesivos e os respectivos padrões de fraturas. As superfícies oclusais dentinárias de vinte e oito molares humanos foram expostas e foram aplicados os diferentes sistemas 26 adesivos: Solid Bond, EBS- Multi, PermaQuik, One Coat Bond, Gluma One Bond, Prime & Bond NT/NRC e Clearfil Liner Bond. Após a aplicação dos diferentes sistemas adesivos, blocos de resina composta, Silux Plus, foram confeccionados e cortados para a obtenção de fatias. Os resultados demonstraram que os sistemas Clearfil e PermaQuik não diferiram entre si, mas apresentaram os maiores valores de união quando comparados com os demais sistemas. Já os valores de união dos adesivos Solid Bond, EBS- Multi, One Coat Bond e Gluma One Bond não diferiram estatisticamente entre si. Loguercio et al. (2005a) avaliaram a variabilidade intradentes e interdentes de resistência de união à microtração, utilizando dois diferentes tipos de sistemas adesivos aplicados à dentina. Vinte molares humanos tiveram o esmalte oclusal removido para a exposição da dentina. Foram então divididos de acordo com o tipo de sistema adesivo aplicado: sistema adesivo Single Bond (3M ESPE) e sistema adesivo One Step (Bisco). Em seguida, foram confeccionadas restaurações em resina composta Filtek Z250 (3M ESPE). O armazenamento dos espécimes se deu em água destilada à 37 ºC por 24 h. Logo após, os dentes foram seccionados para se obter palitos com uma interface de aproximadamente 0,8 mm². Para a realização do teste de microtração foi utilizada uma máquina de ensaios universal a uma velocidade de 0,5 mm/min. A análise de fratura foi feita em estereomicroscópio com um aumento de 400x. Para a análise estatística, os autores observaram a variância de efeito randomizado (interdentes) e a variância de erros (intradentes). A variabilidade intradentes foi maior do que a variabilidade interdentes. Assim os autores concluíram que os palitos de um mesmo dente não podem ser considerados como unidade experimental, pois não preenchem todos os requisitos para utilização do modelo estatístico ANOVA. Portanto, a unidade experimental a ser considerado nos testes de microtração deve ser o dente. Loguercio et al. (2005b) fizeram um estudo para avaliar a influência da região nos valores de união e a durabilidade da interface resina/dentina. Trinta terceiros molares humanos tiveram a dentina exposta e todo o esmalte periférico removido. Dois sistemas adesivos (Single Bond e One-Step) foram aplicados na dentina e camadas de resina composta (Z-250) foram aplicadas para a obtenção de um bloco de resina composta. Estes dentes foram divididos em 3 grupos (n=5). O grupo A apresentou palitos com uma área de união de 0,8mm2, os quais foram submetidos ao 27 ensaio imediatamente após a sua confecção. No grupo B os dentes restaurados foram armazenados, durante 6 meses, antes da realização dos cortes em palitos. No grupo C, as restaurações foram seccionadas em palitos, sendo estes armazenados durante 6 meses até a realização do ensaio mecânico. Nos grupos A e B, a localização dentinária dos palitos (periféricos e centrais) foi avaliada. Os valores de união foram expressos, utilizando-se um index que considera as falhas do tipo coesivas e estima os valores das falhas prematuras dos palitos. A Análise de Variância, um critério, e o teste de Tukey foram realizados (α=0,05) para a comparação entre os grupos A, B e C. Para a avaliação tempo e região dentinária, para cada sistema adesivo, foi aplicada a ANOVA, dois critérios. Os resultados demonstraram que para o sistema adesivo Single Bond, os valores do grupo A foram significantemente maiores que para os grupos B e C. Já para o sistema One Step, o grupo A apresentou melhores resultados que o grupo B, o qual demonstrou maiores valores de união que o grupo C. Já para a análise da região dentinária, não houve diferença entre as regiões quando o ensaio de microtração foi realizado imediatamente após a confecção dos espécimes. Entretanto, após 6 meses de armazenagem, os palitos da região central dentinária demonstraram valores de união superiores dos palitos localizados na região periférica. Os autores concluíram que o corte e posterior armazenamento alteram os valores de união e que os valores de união são menores na periferia da dentina quando comparados com os palitos localizados na região central do dente. Camargo et al. (2007) analisaram o teste de microtração e as variáveis relacionadas a ele, desde a obtenção dos corpos de prova até a análise de fraturas, através de uma revisão crítica da literatura. Algumas vantagens do teste desenvolvido por Sano et al. (1994) foram destacadas pelos autores: a análise de diferentes regiões de um mesmo dente (variando profundidade ou a mineralização tecidual) se tornou possível; a análise da interface adesiva foi aperfeiçoada; houve a diminuição da ocorrência de falhas coesivas; a obtenção de um grande número de corpos de prova a partir de um mesmo dente; análise de fratura através de MEV ou MET. Contudo, de acordo com Camargo et al. (2007), quando o palito é considerado como unidade experimental incorre-se numa falha estatística, pois os dados são tratados de forma independente quando não o são, já que os palitos provenientes de um mesmo dente receberam o mesmo tipo de tratamento. Assim, para efeito de análise estatística, o 28 dente deve ser tratado como unidade experimental e a média calculada a partir dos espécimes testados de cada dente deve ser considerada. Armstrong et al. (2010) realizaram uma revisão crítica da literatura a respeito da mecânica, geometria, aplicação de carga e outros parâmetros dos testes de resistência adesiva, microcisalhamento e microtração, citando suas vantagens e limitações. De acordo com os autores uma das vantagens do design de pesquisa dos testes “micro” é a possibilidade de testar vários espécimes a partir de um único dente, isso não é possível com os métodos convencionais “macro”. A distribuição de forças, a resistência adesiva e o modo de falha são influenciados pelo modo de fabricação do espécime, dispositivo de fixação e pelo método de aplicação de carga, somados às propriedades dos materiais que compreendem a resina, o dente e a interface adesiva. Entre as vantagens desses testes de resistência adesiva estão: 1) possível avaliação da resistência de união localizada; 2) avaliação da variabilidade intra e interdente; 3) menor número de falhas coesivas no substrato; 4) avaliação da espessura de dentina remanescente; 5) possibilita estudos químicos, morfológicos e mecânicos de uma mesma amostra; entre outras. Os testes “micro” também apresentam certas limitações, entre elas: 1) são trabalhosos e exigem boa técnica; 2) oferecem dificuldade para avaliar resistência de união muito baixa (valores menores que 5 MPa); 3) as amostras podem ser facilmente danificadas ou perdidas; 4) falta de consenso para a realização dos testes; 5) falta de consenso para se reportar a ocorrência e falhas pré-teste; entre outras. Para os autores o uso da análise de elementos finitos e a compreensão dos relatórios de conduta do teste podem auxiliar na padronização dos procedimentos. E para um futuro próximo, tantos os testes “micro” quanto os “macro”, permanecem como importantes ferramentas para análise de resistência adesiva assim como, as técnicas investigativas morfológicas e espectroscópicas, a fim de aumentar a vida útil das restaurações de resina composta. Raposo et al. (2012) realizaram um estudo com o intuito de avaliar o efeito do dispositivo de fixação de espécimes para testes, a geometria do espécime, o método de fixação no teste de microtração, o modo de fratura e a distribuição de forças, utilizando um sistema adesivo etch-and-rinse de 2 passos (Adper Single Bond II; 3M ESPE) na adesão a dentina humana. Foram utilizados 21 molares humanos que tiveram a superfície oclusal removida a fim de expor a dentina. As superfícies dentinária receberam o sistema adesivo, que foi aplicado de acordo com as instruções 29 do fabricante. Uma fina camada de resina composta (Filtek Z250, Cor A2; 3M ESPE), 0,5 mm, foi colocada sobre o adesivo fotopolimerizado, tendo suas margens totalmente localizadas em dentina. Após, restaurações com a mesma resina foram realizadas. Em seguida, os dentes foram estocados em saliva artificial por 24 h em temperatura ambiente. Passado o período de armazenamento, cada dente foi seccionado em duas metades sendo que, de uma das metades foram obtidos 4 espécimes em forma de palito com uma interface de 1 mm², e da outra metade foram obtidos dois espécimes de 2 mm² que foram desgastados até obterem a forma de um halter com uma interface de 1mm com um raio de curvatura de 0,6 mm. Os espécimes foram divididos de acordo com os seguintes grupos experimentais: Di – espécimes em forma de halter fixados no dispositivo Dircks (n = 42); GeS - espécimes em forma de palito fixados no dispositivo Geraldeli’s com cola de cianoacrilato Superglue Gel (Loctite; Henkel Corp; Avon); GeZ - espécimes em forma de palito fixados no dispositivo Geraldeli’s com cola de cianoacrilato Zapit (Dental Ventures of America Inc.; Corona). Os espécimes foram levados a uma máquina de ensaios universal a uma velocidade de 1 mm/ min. O modo de fratura foi analisado com o estereomicroscópio e a localização da fratura inicial por MEV e espectroscopia por energia dispersiva de Raio – X. Foram criados modelos tridimensionais para cada dispositivo/espécime para a análise de elementos finitos. De acordo com os resultados encontrados o efeito do tipo de dispositivo empregado não foi significante e o tipo de falha não foi influenciado pelo dispositivo; o uso do dispositivo Dircks foi menos sensível ao erro humano do que Geraldeli’s, e proporcionou uma distribuição de forças mais uniforme na camada adesiva dos espécimes em forma de halter do que Geraldeli’s na camada adesiva dos espécimes em forma de palito; os espécimes que receberam repetidas aplicações de cola apresentaram melhores médias de resistência adesiva do que aqueles que receberam apenas uma aplicação de cola. Os autores concluíram que os parâmetros para o teste de microtração podem influenciar diretamente os resultados e consequentemente as comparações interestudos. Campillo-Funollet et al. (2014) realizaram um estudo a fim de explicar a influência da singularidade do stress na interface periférica do espécime no teste de resistência adesiva levando em consideração o efeito tamanho dependente do espécime. Foram avaliadas as singularidades teoricamente previstas e o efeito do tamanho do espécime na medição da resistência adesiva. Para tanto, diferentes 30 modelos (ampulheta, cilíndricos e em forma de halter) foram criados, como também, ambientes de estudo com aplicação de altos níveis de carga e diferentes situações por meio do ANSYS Meshing (v 14); os métodos de elementos finitos e de elementos de contorno foram utilizados para a análise de resistência de união dos espécimes; a presença de altas concentrações de forças e singularidades também foi analisada. O efeito do tamanho dos espécimes foi comparado com dados anteriormente publicados. Os resultados mostraram que a análise elementos finitos dos modelos de um único material em forma de ampulheta versus os de formato cilíndrico resultou diferentes distribuições teóricas de força; quando utilizado o formato cilíndrico ou de halter houve uma distribuição de carga mais homogênea no plano crítico simétrico. Para espécimes multimateriais, singularidades matemáticas na borda livre da interface adesiva se tornaram um desafio computacional, o que resultou em uma malha - dependência no padrão de análise de elementos finitos. Em uma análise ponderada do método de elementos de contorno, o design eliminou a malha - dependência pela captura do efeito da singularidade, mostrando então, que o efeito do tamanho do espécime corresponde aos dados já publicados anteriormente na literatura. Os autores concluíram que a atenção ao tamanho do espécime ampliou o uso empírico dos métodos de microtração. A análise dos métodos de elementos finitos e de elementos de contorno identifica as concentrações de forças e que, especialmente, as singularidades das forças marginais devem ser consideradas durante os testes de resistência de união, pois os tornam mais confiáveis. As variações de resistência tamanho – dependentes geralmente atribuídas aos efeitos da distribuição de falhas através da região interfacial não foram tão relevantes como a presença de singularidades nos limites de união. Além disso, o efeito tamanho dependente da amostra deve ser considerado na avaliação ou concepção de novos sistemas adesivos. Armstrong et al. (2016) publicaram diretrizes com o objetivo auxiliar o pesquisador na realização do teste de microtração. Segundo os autores, a adesão às estruturas dentárias deve fornecer força retentiva, vedação marginal, ser relativamente simples de executar e ter durabilidade clínica. Melhorias futuras na adesão adesiva à estrutura dentária requerem métodos de teste in vitro que fornecem dados confiáveis para o desenvolvimento de materiais e / ou avaliação de variáveis experimentais. O objetivo do projeto foi identificar um método de teste relativamente 31 fácil de executar, reproduzível e útil para a previsão de resultados clínicos. O teste de resistência de união à microtração, especialmente após submeter as amostras a um desafio de durabilidade, é atualmente recomendado pelos autores como a melhor medida de avaliação da retenção da restauração do composto dental. As orientações publicadas destinaram-se a ajudar o pesquisador na realização do teste de microtração. Recentemente Cardoso De Cardoso et al. (2019) avaliaram a resistência de união à dentina imediata e por 6 meses de adesivos universais usados nas estratégias de união etch-and-rinse ou self-etch. Os adesivos testados foram Ambar Universal, G- Bond, Single Bond Universal, Tetric N-Bond Universal e Ybond Universal. Os adesivos padrão ouro (Scotchbond Multipurpose Plus e Clearfil SE Bond) foram utilizados como controles. Foram avaliadas a resistência da união à microtração (n = 5 dentes), pH e conversão C = C (n = 3). Os dados foram analisados em α = 0,05. Segundo o estudo, todos os adesivos apresentaram diferenças no pH. A conversão C = C foi diferente na maioria dos adesivos. A maioria dos adesivos apresentou quedas discretas na resistência de união durante o envelhecimento quando usadas na estratégia de autocondicionamento. Os autores concluíram que o desempenho da adesão de adesivos universais à dentina depende do material. Em geral, parece que o uso de adesivos universais na dentina não deve ser precedido pelo condicionamento com ácido fosfórico. 2.3 Partículas de vidro bioativas Vidros bioativos são um grupo de biomateriais que são utilizados nas áreas da odontologia e ortopedia Abbasi et al. (2015). Há quarenta e cinco anos, esses vidros bioativos modificaram as funções e capacidades dos biomateriais de bioinertes para bioativos, estimulando uma resposta forte após o implante no corpo humano (Abbasi et al., 2015). Os vidros bioativos contêm óxidos de cálcio, sódio, fósforo e silício em uma proporção que fornece ao material, atividade de superfície e concomitantemente a propriedade de formar uma forte ligação com o osso (Stoor et al., 1998). Em um 32 ambiente aquoso, o cálcio, sódio, fósforo e silício são liberados do vidro, resultando em um aumento no pH e na pressão osmótica em sua vizinhança (Stoor et al., 1998). Como estes fatores influenciam potencialmente a viabilidade de microrganismos orais na margem dentogengival, (Stoor et al., 1998) estudaram os efeitos do vidro bioativo S53P4 sobre os microrganismos orais Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis. Isso foi feito incubando cada microrganismo em uma suspensão, na presença de vidro bioativo S53P4 em forma de pó. Foi concluído pelos autores que em soluções aquosas, o vidro bioativo em pó S53P4 parece ter um amplo efeito antimicrobiano em microrganismos de placa supra e subgengival. Consequentemente, pode ser útil como um ingrediente em produtos para os dentes que podem ter efeitos benéficos na saúde bucal, tanto do ponto de vista cariológico como periodontal. Hench em 1969, na Universidade da Flórida, foi quem inventou o primeiro vidro bioativo (Hench, 2006). Ele iniciou sua pesquisa para superar um problema encontrado nos materiais de implante disponíveis (metais e polímeros) projetados para serem bioinertes; eles iniciavam um fibroso encapsulamento após a implantação, em vez de formar uma ligação estável com os tecidos. Hench tentou fazer um vidro degradável no sistema Na2O-CaO-SiO2-P2O5 com alto teor de cálcio. Ele descobriu que esse vidro com a composição de 46,1% molar de SiO2, 24,4% de Na2O, 26,9% de CaO e 2,6% de P2O5 (mais tarde denominado 45S5 e Bioglass®), formava uma ligação com o osso de forma tão firme que não poderia ser removido sem quebrar o osso. Na verdade, este vidro liga-se rapidamente ao osso e estimula o crescimento ósseo da interface osso-implante. Esta ligação óssea é o resultado da formação da camada de hidroxiapatita sintética (HAp) na superfície do vidro, após a dissolução inicial do vidro (Hench, 2006). Esta descoberta foi a introdução do campo de cerâmicas bioativas e o início da formação de muitos novos materiais, como a HAp e outros fosfatos de cálcio. Todos os vidros, vitrocerâmicas e cerâmicas usadas como materiais de implantes são chamados “biocerâmicas”, mas “Biovidro®” é referido como a composição 45S5 original e não deve ser usado como um termo geral para vidros bioativos (Jones, 2013). 33 Wilson e Low (1992), compararam quatro materiais cerâmicos bioativos atualmente recomendados para regeneração de tecidos ósseos no tratamento da doença periodontal, com partículas de Biovidro, de tamanho equivalente em duas composições, em modelo de macaco. Os autores concluíram que os materiais da Biovidros foram facilmente manipulados, eram hemostáticos e osteoprodutores, permitindo a restauração do osso alveolar e do ligamento periodontal. O crescimento epitelial foi inibido e a fixação epitelial foi próxima ao nível de pré-implantação. Os outros materiais foram mais lentos para agir e o crescimento epitelial foi para o mesmo nível que nos defeitos de controle não preenchidos. Mais tarde, Norton e Wilson (2002), avaliaram o resultado clínico de implantes colocados em locais enxertados com vidro bioativo. Dezessete pacientes tratados consecutivamente foram encaminhados para um consultório particular especializado em cirurgia para reparo de defeitos dentoalveolares e / ou manutenção do rebordo no local das cavidades de extração, antes da implantação. O vidro bioativo disponível em 1 de 2 formas foi utilizado como material de enxerto aloplástico. Núcleos ósseos foram trefilados no momento da implantação e processados e examinados para avaliar a resposta tecidual sob o microscópio de luz. A mobilidade dos implantes, os níveis de osso marginal e a saúde dos tecidos moles foram avaliados ao longo de um período de acompanhamento de 2 a 3 anos para determinar o sucesso do tratamento. Foi concluído que os implantes sobrevivem por até 3 anos em locais enxertados com vidro bioativo, mesmo quando esses enxertos parecem apenas conduzir lentamente um novo crescimento ósseo. Waltimo et al. (2009) relataram que uma preparação ideal de suspensões de vidro bioativo 45S5 para desinfecção do canal radicular deve combinar alta indução de pH com capacidade de liberação contínua de espécies alcalinas. A hipótese do estudo foi que mais material por volume de pasta de vidro bioativo é obtido com um material micrométrico (tamanho de partícula de <5 micrometros) ou um híbrido micrométrico / nanométrico, em vez de apenas uma contrapartida nanométrica. Isso deve correlacionar-se com a capacidade alcalina e a eficácia antimicrobiana. Os autores concluíram que a suspensão híbrida se comportou de forma semelhante à preparação micrométrica. Zhang et al. (2010) correlacionaram o comportamento de dissolução de seis vidros bioativos, com os efeitos antibacterianos dos mesmos vidros contra dezesseis 34 espécies bacterianas clinicamente importantes. Vidros em pó (<45 microns) foram imersos em fluido corporal simulado (SBF) por 48 h. O pH na solução dentro do pó de vidro foi medido in situ com um microeletrodo. Após 2, 4, 27 e 48 h, o pH e a concentração de íons após remoção das partículas e mistura da SBF foram medidas com um eléctrodo de pH de vidro normal e ICP-OES. As bactérias foram cultivadas em caldo com o pó de vidro durante até 4 dias, após o que a viabilidade da bactéria foi determinada. O efeito antibacteriano dos vidros aumentou com o aumento do pH e concentração de íons alcalinos e, portanto, com o aumento da tendência de dissolução dos vidros, mas também dependeu do tipo de bactéria. As mudanças nas concentrações dos íons Si, Ca, Mg, P e B na SBF não mostraram influência estatisticamente significante na propriedade antibacteriana. Os vidros bioativos mostraram fortes efeitos antibacterianos para uma ampla seleção de bactérias aeróbicas em uma alta concentração de amostra (100 mg/mL). Os efeitos antibacterianos aumentaram com a concentração de vidro e uma concentração de 50 mg/mL (SA / V 185 cm-1) foi necessária para gerar os efeitos bactericidas. Os autores concluíram que a compreensão dos mecanismos de dissolução dos vidros bioativos é essencial na avaliação de seus efeitos antibacterianos. Profeta et al. (2012) desenvolveram um estudo para avaliar os efeitos bioativos do BAG durante os procedimentos de adesão dentina e enxágue na interface resina-dentina. O objetivo foi alcançado através da avaliação da resistência de união à microtração (µTBS) das amostras após 24 h e 6 meses de armazenamento em solução tampão fosfato (PBS). A análise fractográfica também foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A ultramorfologia e a análise de nanoinfiltração da dentina ligada à resina foram realizadas com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Um BAG com partículas tamanho <10µm foi empregado nos procedimentos adesivos usando duas abordagens experimentais diferentes: BAG-AD (30% em peso BAG incluído na composição de um adesivo experimental), e BAG-PR (BAG aplicado diretamente em dentina molhada antes dos procedimentos com o adesivo experimental). O adesivo puro, sem BAG, serviu como controle. Os autores concluíram que o uso de adesivo contendo BAG pode aumentar a durabilidade das ligações resina-dentina através de efeitos terapêuticos / protetores associados à deposição mineral dentro da interface de ligação e uma possível 35 interferência com a atividade enzimática colagenolítica (metaloproteinases da matriz) responsável pela degradação da camada híbrida. Sauro e Pashley (2016) relataram que investigações recentes revelaram que a técnica de abrasão a ar realizada com vidro bioativo 45S5 (BAG) é capaz de criar uma superfície coberta de partículas bioativas terapêuticas para procedimentos de adesão. O BAG pode reagir com os fluidos corporais, evocando a precipitação da hidroxiapatita (HAp) e remineralização da dentina na interface adesiva, especialmente quando usada em combinação com materiais liberadores de flúor, como cimentos de ionômero de vidro (CIV) e cimento de ionômero de vidro modificado por resina (CIVMR). A conclusão que os autores chegaram foi que o próximo passo será a comercialização de materiais à base de resinas, como compósitos fluidos e sistemas adesivos “inteligentes”, contendo reagentes biomiméticos que possam remineralizar e prevenir a degradação de ligações resina-dentina para aumentar sua longevidade clínica. Recentemente Bauer et al. (2019) publicaram um estudo com o objetivo de avaliar o efeito de suspensões de vidro bioativo (45S5 e NbG) na resistência de união (µTBS), dureza, módulo de elasticidade, pH e atividade antibacteriana das interfaces resina-dentina após 3 meses. Grupos com diferentes concentrações (5% e 20%) de dois tipos de vidro (45S5 e NbG), e um grupo controle (água destilada) foram estudados. Os autores concluíram que o molhamento da dentina com a suspensão de 20% de vidro 45S5 impediu a redução na resistência de união; aumentou a dureza; módulo de elasticidade da interface resina-dentina, e demonstrou atividade antibacteriana contra Streptococcus mutans. 36 3 PROPOSIÇÃO 3.1 Objetivo geral Avaliar as propriedades de um sistema adesivo modificado com a incorporação de partículas de vidro bioativas (SCHOTT Bioactive Glass) em duas diferentes concentrações (0,5 e 1%). 3.2 Objetivos específicos a) Avaliar a resistência de união da interface adesiva, grau de conversão e a atividade antibacteriana; b) Analisar o padrão da fratura por meio de estereomicroscópio; c) Analisar ilustrativamente a atividade antibacteriana através do Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). 3.3 Hipóteses nulas testadas A inclusão de partículas de vidro bioativas incorporadas ao sistema adesivo em duas diferentes concentrações (0,5 e 1%): H01 – Não interfere na resistência de união da interface adesiva; H02 – Não altera o grau de conversão do material; H03 – Não possui atividade antibacteriana. 37 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Comitê de ética Esta pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética e Pesquisa do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos - UNESP, através da Plataforma Brasil do Ministério da Saúde, CAAE: 02035118.1.0000.0077, conforme anexo A e B. 4.2 Delineamento experimental 4.2.1 Unidade experimental a) Espécimes de dentina obtidos de dentes humanos; b) Gotas do adesivo; c) Discos de adesivo polimerizados. 4.2.2 Fatores de estudo Tratamento em 3 níveis: a) Adesivo Comercial; b) Adesivo Comercial + Partículas de vidro bioativas 0,5%; c) Adesivo Comercial + Partículas de vidro bioativas 1% 38 4.2.3 Variável de resposta a) Resistência de união (Microtração). b) Grau de conversão. c) Atividade antibacteriana (Difusão em ágar e Unidade formadora de colônia). 4.3 Materiais utilizados Todos os materiais, fabricantes e composições estão listados no Quadro 1. Quadro 1 - Materiais utilizados no estudo Material Marca Comercial Fabricante Composição Ácido fosfórico Etch-37% Bisco Inc., Schaumbur g, IL, USA Ácido fosfórico 37% Sistema Adesivo Single Bond 2 3M ESPE, St. Paul, MN, EUA Bis-GMA, HEMA, dimetacrilato, água, etanol, fotoiniciador, nanopartículas de sílica, copolímero funcional de metacrilato de ácidos poliacrílico e polialcenóico Resina Composta Filtek-Z 350XT 3M ESPE, St. Paul, MN, USA Bis-GMA, UDMA, TEGDMA, Bis- EMA, nanosílica filler, zircônia/ partículas de sílica. Partícula de vidro bioativa SCHOTT Bioactive Glass for Dental Materials SCHOTT AG, Landshut, Bayern, Germany Diopsídio (CaMgSi2O6) – Wollastonita (CaSiO3); Diopsídio (CaMgSi2O6) – Fluorapatita [Ca5(PO4)3F] – Fosfato tricálcico (3CaO•P2O5), óxidos dopantes Ag2O, CuO, SrO, ZnO, MnO, Bi2O3. Fonte: Elaborado pelo autor. 39 4.4 Seleção das amostras para o teste de resistência de união Os espécimes foram obtidos de 30 molares humanos extraídos e doados por consentimento livre e esclarecido dos pacientes, seguindo os seguintes critérios: precisavam estar hígidos e livres de alterações em esmalte e dentina. Os dentes foram armazenados em água destilada a 4 ºC até o momento do uso. 4.5 Preparo das amostras para o teste de resistência de união Os dentes foram fixados em resina acrílica autopolimerizável (Jet-Artigos Odontológicos, Clássico, São Paulo, SP, Brasil) (Figura 1A e 1B) com o auxílio de um molde de silicone Rhodorsil (Artigos Odontológicos Clássico, Campo Limpo Paulista, SP, Brasil) (Figura 1C e 1D), onde toda a coroa permaneceu exposta e a superfície oclusal paralela à base da resina acrílica (Figura 1E e 1F), logo em seguida o esmalte oclusal foi removido na máquina de cortes seriados Labcut 1010 (Extec Technologies Inc., Enfield, CT, EUA) (Figura 1G) em um corte paralelo aproximadamente 4 mm acima da junção amelo-cementária para expor a dentina (Figura 1H). 40 Figura 1 – Preparo das amostras Legenda: a) resina acrílica autopolimerizável; b) representação do preparo da resina acrílica autopolimerizável; c) molde de silicone; d) representação do preenchimento do molde com a resina acrílica; e) fixação do dente na resina acrílica; f) dente fixado na resina acrílica com a coroa exposta e a superfície oclusal paralela à base da resina acrílica; g) máquina de cortes seriados; h) representação do corte paralelo aproximadamente 4 mm acima da junção amelo-cementária para expor a dentina. Fonte: Elaborada pelo autor. 41 Na sequência, os espécimes foram levados a uma politriz circular (DP-10, Panambra, São Paulo, SP, Brasil), para desgaste do esmalte remanescente sobre a dentina oclusal, e para padronização da dentina. O desgaste foi feito com discos de lixas de carboneto de silício (Extec Corp., Enfield, CT, EUA) de granulação 600, a 300 rpm, sob refrigeração com água. Os espécimes ficaram em contato com a superfície da lixa por 30 s (Figura 2A e 2B). Figura 2 – Finalização do preparo das amostras Legenda: a) espécime em contato com a superfície da lixa; b) espécime pronto. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.6 Divisão dos grupos experimentais Para a realização dos tratamentos, os adesivos foram divididos em três grupos: um grupo controle composto pelo Adesivo Comercial Single Bond 2 (3M- ESPE) sem a incorporação de partículas bioativas, outro grupo composto pelo Adesivo Comercial Single Bond 2 com a incorporação de partículas bioativas na concentração de 0,5% e outro grupo composto pelo Adesivo Comercial Single Bond 2 com a incorporação de partículas bioativas na concentração de 1%. Para o teste de resistência de união foram utilizados 30 molares humanos hígidos (n=10). A Figura 3 mostra a divisão experimental dos grupos para a resistência de união. 42 Figura 3 – Delineamento dos grupos de pesquisa para o teste de resistência de união Fonte: Elaborado pelo autor. 4.7 Incorporação das partículas de vidro bioativas no adesivo As partículas de vidro bioativas (SCHOTT Bioactive Glass) possuem tamanho de aproximadamente 2 µm e foram pesadas minuciosamente em balança de precisão (Mettler, Toledo, Suíça) (Figura 4A) nas concentrações 0,5 e 1% em peso. As partículas foram então misturadas ao adesivo Single Bond 2 (3M-ESPE) em vidro fechado âmbar (Figura 4B) em ambiente escuro para evitar exposição precoce à luz (Figura 4B). A mistura foi feita em vibrador (Maxi Mix II VortexMixer, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemanha) (Figura 4C) até a obtenção de uma solução homogênea e clara (transparente), com as partículas inteiramente incorporadas. Em seguida, os frascos foram mantidos sob agitação constante (Orbit 300, LabNET International Inc., Woodbridge, NJ, EUA) (Figura 4D), por 48 horas. Após o preparo, os adesivos experimentais foram armazenados em frascos escuros sob refrigeração (4 ºC). No momento do uso as partículas foram levadas para agitação novamente. 43 Figura 4 – Incorporação das partículas no adesivo Legenda: a) balança analítica de precisão; b) representação da pesagem das partículas em vidro âmbar; c) representação dos componentes no frasco no vibrador; d) representação do frasco em agitador por 48 h. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.8 Aplicação do adesivo e técnica restauradora Foi realizado o condicionamento ácido da dentina com a aplicação de ácido fosfórico a 32% (Uni-Etch, Bisco Inc., Schaumburg, IL, EUA) por 15 s (Figura 5A), lavagem com água deionizada por 15 s (Figura 5B) e secagem com papel absorvente para manter a dentina condicionada visivelmente úmida. A aplicação do sistema adesivo foi realizada sobre a dentina exposta (Figura 5C). A aplicação foi feita de forma ativa durante 20 s, em seguida foi utilizado jato de ar para remoção do solvente (Figura 5D) e posteriormente a fotopolimerização por 20 s (Figura 5E). Após a 44 aplicação do sistema adesivo, foram adicionados 3 incrementos de 1,5 mm de espessura da resina composta nanoparticulada (Filtek Z 350 XT - 3M-ESPE - Cor A2) em todos espécimes (Figura 5F). Estes foram fotoativados, um de cada vez, por 20 s, a uma distância padronizada, com o aparelho fotopolimerizador de LED (Radii-cal, SDI, Victoria, Austrália). A restauração finalizada pode ser observada na Figura 4G. 45 Figura 5 – Técnica restauradora Legenda: a) condicionamento ácido; b) lavagem; c) aplicação do adesivo; d) jato de ar para evaporação do solvente; e) fotopolimerização; f) aplicação de um incremento de resina composta; g) restauração finalizada. Fonte: Elaborada pelo autor. 46 4.9 Teste de resistência de união Os dez espécimes de cada grupo foram submetidos ao teste de resistência da união às tensões de microtração. Este teste foi realizado em uma máquina de ensaios universal EMIC DL2000 (EMIC, São José dos Pinhais, PR, Brasil) (Figura 6A) com uma célula de carga de 10 kg à velocidade de 0,5 mm/min para avaliar a força adesiva na interface material restaurador/dentina. O conjunto resina acrílica-amostra foi posicionado na Labcut 1010 (Extec Technologies Inc., Enfield, CT, EUA) para a realização de cortes paralelos no longo eixo da coroa, em baixa velocidade e sob refrigeração abundante (Figura 6B). A partir das secções de 1 mm de espessura nos sentidos mesiodistal e vestíbulo-lingual (Figura 6C e 6D), obtiveram-se palitos de resina composta e dentina, com aproximadamente 1 x 1 mm de largura (Figura 6E), sendo realizada a mensuração da área de adesão antes do teste de microtração com paquímetro digital (Starret Indústria e Comércio Ltda., Itu, SP, Brasil) (Figura 6F). Os palitos de resina-dentina obtidos de cada espécime ficaram armazenados em tubos identificados (vol. 2 mL) do tipo Eppendorf (Eppendorf, São Paulo, SP, Brasil), em estufa a 37 ºC, em água deionizada por 24 h antes do teste de microtração. 47 Figura 6 – Confecção dos palitos para o teste de resistência de união Legenda: a) máquina de ensaios universal EMIC DL2000; b) conjunto resina acrílica-amostra sendo posicionado na Labcut 1010; c) secções de 1 mm de espessura no sentido mesiodistal; d) secções de 1 mm de espessura no sentido vestíbulo-lingual; e) palitos de resina composta e dentina com aproximadamente 1 x 1 mm de largura; f) mensuração da área de adesão dos palitos. Fonte: Elaborada pelo autor. Para o teste de resistência de união, os palitos (Figura 7A) foram fixados individualmente pelas suas extremidades com adesivo cianoacrilato em gel (Zapit, Dental Ventures of American, Corona, CA, EUA) no dispositivo metálico (Figura 7B), de modo a posicionar a área adesiva perpendicularmente ao longo eixo da força de 48 tração, para realização do ensaio de microtração na máquina de testes (Figura 7C), no momento da fratura, o teste é automaticamente interrompido (Figura 7D). A resistência de união foi calculada em MPa pela fórmula: δ= F/A Onde, δ é a força de união a microtração, F é a força aplicada e A é a área de união entre resina – adesivo – dentina. Ao final do ensaio as partes fraturadas foram limpas e secas e então analisadas quanto ao padrão de fratura em estereomicroscopio ótico com aumento de 40x (Zeis, steREO Discovery V20, Göttingen, Germany), e classificadas quanto ao tipo de fratura. As falhas pré-teste e fraturas coesivas em resina e dentina não foram consideradas. Adesiva – Para fraturas em que a falha ocorreu na interface adesivo-estrutura dental ou na interface entre o adesivo e a resina composta, em mais de 75% da área analisada. Coesiva em resina – Para fraturas em que a falha ocorreu predominantemente no interior da resina composta, cerca de 75%. Coesivas na estrutura dental – Para fratura em que a falha ocorreu predominantemente no interior da estrutura dental, cerca de 75%. Mista – Para fraturas nas quais não existiu uma predominância maior que 75% de qualquer tipo de falha. 49 Figura 7 – Teste de resistência de união Legenda: a) palito pronto; b) palito fixado no dispositivo de microtração metálico; c) máquina EMIC com a carga de célula; d) palito fraturado após o teste de microtração. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.10 Grau de conversão O grau de conversão (GC) foi medido através de Espectroscopia de Infravermelho Transformada de Fourier (FTIR) (FT-IR, PerkinElmer Spectrum, MA, EUA) (Figura 8A). As amostras dos sistemas adesivos foram analisadas por meio de absorbância com o dispositivo de refletância total atenuada (ATR) MIRacle com placa de cristal de diamante de ZnSe (PIKE Technologies, Madison, WI, EUA) (Figura 8B) com uma resolução de 4 cm-1 e faixa de transmissão entre 650 - 4000 cm-1. O software utilizado foi o Spectrum TimeBase (Perkin Elmer, MA, EUA). Inicialmente, foi colocado sobre o cristal do ATR uma gota de 3 µL o adesivo com auxílio de uma pipeta (LambdaTM Plus, Corning Co., Corning, NY, EUA), quantidade necessária para o 50 adesivo molhar toda a superfície do cristal em ambiente de luz amarela (Figura 8C). A gota do adesivo foi selada com lamínula para microscópio e fita adesiva a fim de evitar a evaporação dos componentes. Imediatamente, foram coletados os dados de absorbância pelo software utilizando os parâmetros de intervalo de onda de 1560 cm- 1 a 1760 cm-1, resolução de 4 cm-1 e 32 capturas. Em seguida, essa mesma amostra de adesivo foi fotoativada com o fotopolimerizador (Aparelho LED; Demi Light Curing System – Kerr Corporation, EUA) com potência de 1200 mW/cm2, por um período de 20 segundos (Figura 8D), a uma distância de 5 mm aproximadamente (Figura 8E). Após 5 minutos, os dados foram coletados novamente, gerando os espectros de antes e depois de polimerizados. O processo foi repetido 3 vezes para cada grupo de adesivo, de onde foi obtida a média do grau de conversão. Para gerar o valor de GC, os espectros foram comparados e analisados na mudança do espectro nas bandas de absorção próximas a 1638cm-1, onde se encontrou a ligação dupla de carbono presente nos grupos metacrilatos polimerizáveis do adesivo. As bandas de absorção associadas ao anel benzênico aromático do BisGMA, que não sofreram grandes alterações antes e depois da polimerização, foram usadas como referência interna de proporcionalidade da matéria (bandas próximas a 1608 cm-1). Por fim, esses valores de cada amostra foram calculados através da fórmula: 𝐺𝐶 = 100 𝑥 (1 − 𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃â𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒂𝒏𝒕𝒆𝒔 𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃â𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒅𝒆𝒑𝒐𝒊𝒔 ) 51 Figura 8 – Grau de conversão Legenda: a) Espectroscopia de Infravermelho Transformada de Fourier (FTIR); b) placa de cristal de diamante de ZnSe; c) o adesivo sendo colocado sobre o cristal com auxílio de uma pipeta em luz amarela; d) amostra do adesivo sendo fotoativada com o fotopolimerizador; e) distância do fotopolimerizador de 5 mm aproximadamente. Fonte: Elaborada pelo autor. 52 4.11 Atividade antibacteriana Os testes para avaliar a atividade antibacteriana foram realizados no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), da Universidade do Vale do Paraíba (Univap) em São José dos Campos, com a supervisão da bióloga Priscila Maria Sarmeiro Correa Marciano Leite. Streptococcus mutans (ATCC 700610) foi utilizado para avaliação das atividades antibacterianas dos adesivos contendo as partículas de vidro bioativas. O S. mutans foi cultivado em caldo Brain Heart Infusion (BHI; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) (Figura 9A). O caldo foi aquecido até a diluição completa e esterilizado em autoclave por 15 minutos a 121 ºC e mantido durante 24 h em estufa bacteriológica (Marconi MA32) à 37 °C, recolhidas por centrifugação e lavadas três vezes com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). As bactérias foram ressuspensas em BHI e diluídas para uma concentração final de 1,0 x 107 unidades formadoras de colônia (UFC) / mL (Figura 9B). A densidade bacteriana foi determinada usando um espectrofotômetro (Cary 50 Bio UV-Vis Spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) a uma densidade óptica de 600 nm (Figura 9C). Figura 9 – Avaliação das atividades antibacterianas Legenda: a) caldo BHI; b) Streptococcus mutans; c) espectrofotômetro. Fonte: Elaborada pelo autor. 53 4.11.1 Teste de difusão em ágar As suspensões bacterianas (1,0 x 107 UFC / mL; 100 mL) foram colocadas nas placas de ágar BHI através de uma pipeta (Figura 10A) e foi feito o espalhamento na placa com uma alça de Drigalski (Figura 10B e 10C). Discos do adesivo fotopolimerizados (6,5 mm de diâmetro; 1,5 mm de espessura) (Figura 11C) foram preparados através de uma matriz de silicone (Figura 11A e 11B) e colocados numa placa de ágar inoculada com bactérias e incubados a 37 °C durante 24 h. Depois este período, o diâmetro dos halos de inibição foi medido e os resultados analisados de acordo com o preconizado pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute, 2005), onde a formação de halo indica que o microorganismo é sensível ao agente testado e a não formação de halo indica que o microorganismo é resistente ao agente testado. 54 Figura 10 – Teste de difusão em ágar Legenda: a) suspensões bacterianas sendo colocadas na placa de ágar BHI; b) espalhamento com a alça de Drigalski; c) placas prontas para receberem os discos. Fonte: Elaborada pelo autor. Figura 11 – Preparação dos discos de adesivo Legenda: a) gota do adesivo na matriz de silicone; b) fotopolimerização do adesivo; c) disco de adesivo fotopolimerizado. Fonte: Elaborada pelo autor. 55 4.11.2 Contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) Os discos foram transferidos para placas contendo ágar BHI (Figura 12A e 12B). Após o período de incubação uma alíquota de 150 µL do sobrenadante de cada poço foi retirada e levada para leitura de densidade óptica das amostras utilizando o espectrofotômetro (Spectra Count, Packard, USA) com um filtro de 600 nm. A viabilidade bacteriana foi determinada por contagem de unidades formadoras de colônias e o processo foi feito por três vezes. Figura 12 – Preparação das placas para UFC Legenda: a) preparação das placas com ágar BHI; b) placas contendo os discos com as bactérias. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.12 Análise ilustrativa por MEV Para a avaliação em MEV foram utilizadas os discos de adesivo fotopolimerizados, dos diferentes grupos, após terem ficado nas placas de ágar com o Streptococcus mutans para análise da presença de bactérias. Os espécimes foram posicionados em ‘stubs’ de alumínio, cobertos com ouro/paládio (Desk II – Denton Vacuum) e examinados em microscópio eletrônico de varredura (JMS 5310 – Jeol) operando com aumento de 2000 e 5000 vezes. 56 5 RESULTADO 5.1 Estatística para resistência de união Para efeito de análise estatística, foi realizada uma média calculada com os espécimes (palitos) testados para cada dente humano preparado. As médias em MPa foram submetidas à análise estatística por meio dos programas computacionais: MINITAB (Minitab, version 14.12, 2004) e STATISTIX (Analytical Software, version 8.0, 2007). Os dados de resistência de união (MPa) foram analisados estatisticamente, sendo avaliados quanto à sua normalidade. Como estes apresentaram distribuição normal, realizou-se o teste de análise de variância (ANOVA) paramétrica um fator (sistema adesivo) e o teste de Tukey, sendo adotado o nível de significância de 5% para a tomada de decisões. Na Tabela 1 encontram-se os valores da estatística descritiva. Os valores de média e desvio-padrão de resistência de união (MPa) obtidos nos 3 grupos estudados. Tabela 1 - Análise descritiva para os diferentes grupos em ordem decrescente quanto à resistência de união (MPa) Adesivo Comercial Valores em MPa±Dp 0,5% partículas (ASB0,5) Sem partículas (ASB) 49,04±4,72 41,19±2,34 1% partículas (ASB1) 27,15±2,36 Fonte: Elaborada pelo autor. 57 A Figura 13 apresenta a análise descritiva das médias de resistência de união (MPa) e desvio padrão dos diferentes sistemas adesivos. Figura 13 – Análise descritiva das médias de resistência de união (MPa) e desvio padrão Fonte: Elaborada pelo autor. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) a um fator. Dessa forma observaram-se diferenças estatisticamente significantes para o fator Adesivo, considerando um nível de significância de 5% (Tabela 2). 58 Tabela 2 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator para a resistência de união Fatores SQ GL QM F P Adesivo 45926,69 1 45926,69 4133,837 0,000000* Interação 2459,87 2 1229,93 110,706 0,000000* Resíduo 299,97 27 11,11 --- --- Legenda: (GL): grau de liberdade; (SQ): soma dos quadrados; (QM): quadrado médio; (F): razão; (P): valor. *p < 0,05 Fonte: Elaborada pelo autor. Aplicou-se o Teste de Tukey (5%) com a finalidade de observar as diferenças significativas nos fatores avaliados (Tabela 3). Na Tabela 3 observam-se os resultados do fator Adesivo para o teste de Tukey (5%). Os adesivos com diferentes concentrações de partículas apresentaram média de resistência de união significantemente diferentes na ordem decrescente ASB0,5>ASB>ASB1. De acordo com os resultados obtidos, a maior média foi observada no grupo ASB0,5 49,04 ± 4,72, seguida do grupo ASB 41,19 ± 2,34 e a menor média foi observada no grupo ASB1 27,15 ± 2,36 havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Tabela 3 – Resultado do Teste de Tukey para a resistência de união Sistema Adesivo Valores em MPa±Dp Grupos Homogêneos ASB0,5 ASB 49,04±4,72 41,19±2,34 A B ASB1 27,15±2,36 C Legenda: (Dp): desvio-padrão. Fonte: Elaborada pelo autor. 59 A Figura 14 mostra a porcentagem de tipos de fratura dos palitos após o teste de microtração para cada grupo. Observa-se que houve predominância dos tipos de fratura adesiva e mista, sobre os tipos coesivas. Figura 14 – Porcentagem de tipos de fratura após teste de microtração Fonte: Elaborada pelo autor. As imagens obtidas pelo estereomicroscópio óptico (Stemi 2000-C, ZEISS, Oberkochen, Alemanha) da análise do padrão de fratura dos palitos fraturados seguem abaixo. A figura 15 mostra a imagem de um palito fraturado do grupo ASB em um aumento de 132x, observa-se que houve fratura do tipo mista. 60 Figura 15 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB Fonte: Elaborada pelo autor. A figura 16 mostra a imagem de um palito fraturado do grupo ASB0,5 em dois aumentos, observa-se que houve fratura do tipo adesiva. 61 Figura 16 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB0,5 Legenda: a) Imagem em aumento 131x; b) Imagem com aumento de 225x Fonte: Elaborada pelo autor. A figura 17 mostra a imagem de um palito fraturado do grupo ASB1 em aumento de 132x, observa-se que houve fratura do tipo mista. 62 Figura 17 – Imagem de estereomicroscópio óptico do palito fraturado do grupo ASB1 Legenda: a) Imagem em aumento 131x do palito do grupo ASB1. Fonte: Elaborada pelo autor. 5.2 Estatística do grau de conversão Na tabela 4 apresentam-se os valores de média e desvio padrão do grau de conversão dos sistemas adesivos dos diferentes grupos deste estudo. De acordo com os resultados obtidos, a maior média foi observada no grupo ASB 77,75 ± 2,97, seguido do grupo ASB0,5 63,18 ± 20,03 e grupo ASB1 58,35 ± 14,95 não havendo diferença estatisticamente significativa entre eles. A presença de partículas de vidro bioativas nas concentrações de 0,5 e 1%, não influenciou no grau de conversão do sistema adesivo. 63 Tabela 4 - Análise descritiva para os diferentes grupos em ordem decrescente quanto ao grau de conversão Adesivo Comercial Média±Dp Sem partículas (ASB) 0,5% partículas (ASB0,5) 77,75±2,97 63,18±20,03 1% partículas (ASB1) 58,35±14,95 Fonte: Elaborada pelo autor. A Figura 18 apresenta a análise descritiva das médias e desvio padrão dos diferentes sistemas adesivos para o grau de conversão. Figura 18 – Análise descritiva das médias de grau de conversão e desvio padrão Fonte: Elaborada pelo autor. 64 Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) a um fator. Dessa forma não se observaram diferenças estatisticamente significantes, considerando um nível de significância de 5%