RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 01/03/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Adailson Henrique Domingues ISOLAMENTO DE MICROVESÍCULAS E SUA CARACTERIZAÇÃO PROTEÔMICA NO VENENO DA ABELHA Apis mellifera. Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais (Bioquímica). Orientadora: Profa. Dra. Lucilene Delazari dos Santos Botucatu, SP 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU ISOLAMENTO DE MICROVESÍCULAS E SUA CARACTERIZAÇÃO PROTEOMICA NO VENENO DA ABELHA Apis mellifera Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais (Bioquímica). Adailson Henrique Domingues Orientadora: Profa. Dra. Lucilene Delazari dos Santos Botucatu, SP 2024 2 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Domingues, Adailson Henrique. Isolamento de microvesículas e sua caracterização proteômica no veneno da abelha Apis mellifera / Adailson Henrique Domingues. - Botucatu, 2024 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Medicina, Botucatu Orientador: Lucilene Delazari dos Santos Capes: 20800002 1. Proteômica. 2. Venenos de Abelha. 3. Espectrometria de massa. 4. Vesículas Extracelulares. Palavras-chave: Análise proteômica; Envenenamento por abelhas; Espectrometria de massas; Microvesículas extracelulares; Nanoparticle Tracking Analysis. 3 4 RESUMO Conforme foram ocorrendo a multiplicação e propagação das abelhas africanizadas aumentaram acentuadamente os acidentes apílicos no Brasil, fazendo com que as autoridades de saúde pública incluíssem este acidente como objeto de vigilância sanitária. Cerca de 8,24% do número total de acidentes causados por animais peçonhentos no Brasil são provocados por múltiplas ferroadas de abelhas. Diante do crescente número de casos clínicos por acidentes por abelhas africanizadas e, consequentemente de óbitos, despertou-se a necessidade de se dispor de um tratamento eficaz. Assim, a equipe de pesquisadores do Centro de Veneno de Animais Peçonhentos – CEVAP/SP em parceria com o Instituto Vital Brazil (RJ), desenvolveram um soro antiapílico, o qual foi testado em um estudo clínico fase I/II em pacientes que sofreram múltiplas ferroadas de abelhas africanizadas. Neste contexto, os estudos de venômica realizados por nosso grupo de pesquisa, evidenciaram que mesmo após a soroterapia específica desses pacientes, ainda existem toxinas do veneno da abelha no sangue dos pacientes tratados após a alta médica. Diante dessa observação clínica e tendo em vista estudos já publicados na literatura sobre a presença de microvesículas no veneno de serpentes, postularam- se hipóteses sobre a presença do veneno da abelha Apis mellifera presente na corrente sanguínea dos pacientes deste estudo clínico: “O veneno da abelha foi liberado na corrente sanguínea dos pacientes tardiamente pois estavam encapsulados em microvesículas oriundas do próprio veneno?” ou “O veneno da abelha foi liberado na corrente sanguínea dos pacientes tardiamente pois estavam encapsulados em microvesículas formadas pelo próprio organismo dos pacientes por meio do brotamento de microvilos na fagocitose celular dos antígenos circulantes após o acidente?”. Assim, o objetivo desse trabalho foi isolar as microvesículas extracelulares do veneno de Apis mellifera, quantificar e mensurar seus diâmetros, além de descrever o perfil proteico total dessas microvesículas por meio da estratégia de análise proteômica. Os resultados que foram obtidos neste trabalho evidenciaram múltiplas proteínas, onde dentre as 4 frações analisadas em laboratório, somente a fração 1 e 2 resultaram e expressaram conteúdo proteico, enzimático e fragmentos peptídicos. Muitas proteínas foram encontradas, e analisadas sua relação com o envenenamento provenientes das abelhas africanizadas Apis mellifera, em que o processo de atuação de tais proteínas ainda deixa dúvidas sobre os conceitos de seus impactos no corpo humano. Desta forma, supoe-se que, as microvesiculas presentes no veneno da abelha Apis mellifera sao frutos do desprendimento de brotos membranares de orgaos/tecidos durante sua vida, os quais podem ser conduzidos para a glandula de veneno pela proximidade que a mesma tem com o intestino deste inseto. Dentre várias proteínas encontradas a proteína acid phosphatase type 7 (Fosfatase ácida tipo 7) juntamente com a proteína Fosfatase 1H, têm relação ao envenenamento das abelhas africanizadas Apis mellifera, induz reações de toxidade que são inoculadas durante a ferroada no momento de defesa das abelhas melíferas, conduzido o acometido a reações alérgicas após envenenamento da apitoxina. Por fim os resultados obtidos neste trabalho serão de grande contribuição para próximos estudos envolvendo as proteínas caracterizadas nas microvesículas. Palavras-chaves: Envenenamento por abelhas, análise proteômica, microveísulas extracelulares, espectrometria de massas, Nanoparticle Tracking Analysis. 5 ABSTRACT As the multiplication and spread of Africanized bees occurred, beekeeping accidents in Brazil increased sharply, causing public health authorities to include this accident as an object of health surveillance. Around 8.24% of the total number of accidents caused by venomous animals in Brazil are caused by multiple bee stings. Faced with the growing number of clinical cases due to accidents involving Africanized bees and, consequently, deaths, the need for effective treatment has emerged. Thus, the team of researchers from the Venomous Animal Poison Center – CEVAP/SP, in partnership with the Vital Brazil Institute (RJ), developed an anti-epile serum, which was tested in a phase I/II clinical study on patients who suffered multiple Africanized bee stings. In this context, venomics studies carried out by our research group showed that even after specific serum therapy for these patients, bee venom toxins still exist in the blood of patients treated after medical discharge. In view of this clinical observation and taking into account studies already published in the literature on the presence of microvesicles in snake venom, hypotheses were postulated about the presence of Apis mellifera bee venom present in the bloodstream of patients in this clinical study: “The venom of the bee was released into the patients’ bloodstream late because they were encapsulated in microvesicles originating from the venom itself?” or “Was the bee venom released into the patients' bloodstream late because they were encapsulated in microvesicles formed by the patients' own bodies through the sprouting of microvilli in the cellular phagocytosis of circulating antigens after the accident?” Thus, the objective of this work was to isolate the extracellular microvesicles from Apis mellifera venom, quantify and measure their diameters, in addition to describing the total protein profile of these microvesicles through the proteomic analysis strategy. The results obtained in this work showed multiple proteins, where among the 4 fractions analyzed in the laboratory, only fractions 1 and 2 resulted and expressed protein, enzymatic content and peptide fragments. Many proteins were found, and their relationship with poisoning from Africanized bees Apis mellifera was analyzed, in which the process of action of such proteins still leaves doubts about the concepts of their impacts on the human body. In this way, it is assumed that the microvesicles present in the venom of the Apis mellifera bee are the result of the detachment of membrane buds from organs/tissues during their life, which can be led to the venom gland due to the proximity it has to the intestine of this insect. Among several proteins found, the protein acid phosphatase type 7 (acid phosphatase type 7) together with the protein Phosphatase 1H, are related to the poisoning of Africanized bees Apis mellifera, it induces toxicity reactions that are inoculated during the sting during the defense of honey bees , leading the affected person to allergic reactions after apitoxin poisoning. Finally, the results obtained in this work will be of great contribution to future studies involving the proteins characterized in microvesicles. Keywords: Bee poisoning, proteomic analysis, extracellular microvehicles, mass spectrometry, Nanoparticle Tracking Analysis. 6 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Notificações por tipo de acidente segundo ano do acidente ..................... 11 Tabela 2 - Estatísticas referentes às microvesículas extracelulares do veneno da abelha Apis mellifera com o método Merger Data (+/- Desvio Padrão) ..................... 30 Tabela 3: Identificação das proteínas presentes nas microvesículas extracelulares do veneno da abelha Apis mellifera ............................................................................... 31 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Abelha Apis mellifera realizando uma ferroada ........................................ 13 Figura 2 - Sistema glandular da Abelha Apis mellifera .............................................. 14 Figura 3 - Divisão Morfológica das abelhas Apis mellifera ........................................ 12 Figura 4 - Placa de vidro associada à fios elétricos de baixa voltagem .....................24 Figura 5 - A. Placa de coleta de veneno aderida à caixa da colmeia. B. funcionamento da voltagem dos fios de baixa voltagem e atividade das abelhas ... 25 8 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 8 1.1. As abelhas Apis mellifera e as notificações dos acidentes apílicos no Brasil ..... 10 1.2. Abdômen e ferrão das abelhas Apis mellifera .................................................... 12 1.3. Apitoxina, extração, composição e sintomas ...................................................... 14 1.4. Importância do estudo da apitoxina .................................................................... 18 1.4. Microvesículas .................................................................................................... 20 1.5. Análise Proteômica como uma estratégica investigativa prognóstica e/ou diagnóstica ................................................................................................................ 23 2. OBJETIVO .......................................................................................................... 24 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 25 3.1. Obtenção do veneno da abelha Apis mellifera ................................................... 25 3.2. Isolamento de microvesículas presentes no veneno da abelha Apis mellifera ... 26 3 3. Análise de rastreamento de nanopartículas ou Nanoparticle Tracking Analysis 27 3.4. Quantificação de proteínas ................................................................................. 27 3.5. Eletroforese Unidimensional (SDS-PAGE) ......................................................... 27 3.6. Digestão Enzimática das proteínas em gel ......................................................... 28 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 34 5.1. Proteínas encontradas nas frações estudadas das Vesículas Extracelulares .... 37 6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 42 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 43 9 1. INTRODUÇÃO Segundo Pegoraro (2017), a apicultura foi revolucionada em 1851, quando o Padre e Matemático, Lorenzo Lorraine Langstroth, estudando as colmeias de abelhas nos Estados Unidos, descobriu o “espaço abelha” e arquitetou a primeira colmeia racional, nomeando-a de Langstroth. Foi aí que a apicultura passou a ser racional e o modelo de colmeia Langstroth difundida no mundo inteiro. Para que o homem pudesse consumir o mel, era promovida uma genuína caçada ao mel, a qual, muitas vezes, era dificultada pelo fato de os enxames se localizarem em locais de difícil acesso que proporcionavam risco à vida dos coletores. Como naquela época não se sabia separar o mel dos favos, o homem ingeria uma mistura composta por mel, pólen, cera e as crias das abelhas, muitas das vezes, os enxames morriam ou tinham que fugir, fazendo com que o homem tivesse que caçar mais ninhos para consumir o alimento (SOUZA et al., 2019). Conforme Queiroga et al. (2015), o mel sempre chamou a atenção do homem, sendo um dos alimentos mais antigos. O uso do mel vai além da alimentação do ser humano, na antiguidade, o produto era utilizado como conservante de frutas, grãos, medicamento e, inclusive, como oferenda aos deuses egípcios. De acordo com Rodrigues (2017), nesse período, a exploração das abelhas era feita de forma rústica, quando o mel e a cera eram obtidos com a destruição parcial da colmeia. Os produtos eram adquiridos em pequenas quantidades e as abelhas tinham que refazer a colmeia após cada colheita. A história da apicultura no Brasil teve início no ano de 1839, quando o Padre Antônio Carneiro introduziu as abelhas europeias (Apis mellifera), trazidas da cidade de Porto, em Portugal, e as instalou no estado do Rio de Janeiro para a produção comercial de mel e para extração de cera no intuito da confecção de velas (QUEIROGA et al., 2015; PEGORARO et al., 2017). A apicultura brasileira desenvolveu sua cultura de forma rudimentar na região sudeste, trazendo impactos tecnológicos, sociais e biológicos, sendo exploradas para produção de cera e mel, sem muitos critérios de segurança e de uma forma pouco profissional. Em 1950, segundo um levantamento de produção em toneladas de mel de abelha, constatou que a produção brasileira era baixa forçando produtores buscarem alternativas em outros países de novas espécies de abelhas (QUEIROGA et al., 2015; PEGORARO et al., 2017). 10 De acordo com Pegoraro et al. (2017), as abelhas africanas (Apis mellifera scutellata) no ano de 1956 no município de Rio Claro (SP), o professor Warwick E. Kerr, com a crescente narrativa da necessidade de aumento de produção de cera e mel, foi em busca de novas opções de espécies voltadas ao aumento da produtividade de mel no Brasil. Após sua viagem pela África, trouxe algumas abelhas rainhas da espécie Apis mellifera scutellata. Porém, após diversas colmeias enxamearem pela cidade de Rio Claro e região, houve novas abelhas, proveniente de diversos cruzamento originando abelhas hibridizadas, denominadas como abelhas africanizadas, as quais, formam todo o plantel existente atualmente no Brasil. Neste novo cenário as abelhas hibridizadas, são insetos que se situam no Filo Artrópodes, o qual possui a maior diversificação de organismos do Reino Animalia, pertencem à classe Insecta, ordem dos Himenópteros, gênero Apis, família Apídae, espécie mellifera. É constituída por mais de 20 mil espécies diferentes de abelhas, sendo a espécie Apis mellifera a mais importante em relação à polinização, auxiliando na produção de alimentos, a exemplo de mel, cera, pólen, própolis e geleia real. O gênero Apis abrange as abelhas sociais, as quais são mais empregadas comercialmente, e são classificadas em sete espécies distintas, sendo elas: Apis dorsata, A. cerana, A. florea, A. koschevnikov, A. andreniformes, A. laboriosa e A. mellifera. Apesar das riquezas de espécies e do conhecimento da fauna da família Apídae e dos ecossistemas, ainda se carece muito de estudos sobre as abelhas brasileiras, deixando-as num status de pouco conhecida (DOMINGOS, 2016; SANTOS, 2017). 11 1.1. As abelhas Apis mellifera e as notificações dos acidentes apílicos no Brasil As abelhas africanizadas surgiram de cruzamentos e são consideradas poli híbridas. Tal cruzamento ocorreu entre as espécies africanas Apis mellifera scutellata e Apis mellifera adansonni, com as espécies europeias Apis mellifera mellifera e Apis mellifera carnica, lingustica e caucasica. Desse cruzamento, surgiram abelhas altamente produtoras de mel, com alta capacidade de enxameação, adaptabilidade às diversas condições climáticas e tolerantes a pragas e doenças (SILVA et al., 2020). Porém, o resultado da africanização das abelhas trouxe situações problemáticas para o Brasil, quanto ao despreparo no manejo e formas de extração dos derivados naturais. A nova espécie de abelha possuía característica de defesa superior a outras espécies anteriormente introduzidas no país, característica essa herdada das abelhas africanas. Nesse período, por ser uma espécie defensiva e responsável pelos altos índices de acidentes, agricultores desistiram de seu manejo, havendo abandono da apicultura devido à agressividade apresentada pelas abelhas, fato ocorrido concomitantemente pela falta de informação da população daquela época e pelo fato de elas estarem próximas a animais domésticos (ALVES, 2016 e PEGORARO et al., 2017). Iniciou-se, então, um processo de repulsa a essas abelhas e boatos de que denominavam o polihíbrido de abelha assassina, não o bastante, as abelhas africanizadas demonstraram rápida adaptabilidade ao clima tropical e a vegetação presente no país, favorecendo, deste modo, à acelerada reprodução da espécie e à elevada enxameação, sendo que somente mais tarde com auxílio de novas técnicas na agricultura, voltaram a manejar para fins comerciais de seus derivados (ALVES, 2016 e PEGORARO et al., 2017). 12 A defensividade das abelhas é causadora dos acidentes acometidos pelo seu envenenamento, sendo classificado pelo Sistema de Informação de Agravos de Notificação do Ministério da Saúde do Brasil (SINAN), como um animal peçonhento de alto índice de periculosidade, quanto aos seus ataques. É sabido que muitos acidentes apílicos ocorreram conforme a expansão das abelhas africanizadas no Brasil, fazendo com que as autoridades de saúde pública incluíssem este acidente como objeto de vigilância sanitária (SINAN, 2023). Além dos processos alérgicos, que variam desde leves a graves, as múltiplas ferroadas por abelhas estão associadas em geral a quadros de envenenamentos graves. Recentemente, os acidentes causados por abelhas têm merecido maior atenção devido à sua gravidade e sua letalidade. Segundo o SINAN, (Tabela 1), os acidentes por abelhas representam cerca de 8,42% do número total de acidentes causados por animais peçonhentos (SINAM, 2023). Entre os 5 principais tipos de acidentes por animais peçonhentos (ofidismo, araneísmo, escorpionismo e erucismo), o acidente por abelhas é o único que não tem um soro específico para o tratamento no Brasil, porém há estudos acerca de sua produção (MINISTÉRIO, 2024). Tabela 1 - Notificações por Tipo de Acidente segundo Ano do acidente Ano acidente Branco Serpente Aranha Escorpião Lagarta Abelha Outros Total Em Branco 17 - - - - - - 17 2017 - - - 1 - - - 1 2020 2 10 8 81 5 8 5 119 2021 35 150 226 693 28 96 54 1282 2022 4468 28701 31826 177486 5054 23849 11968 283352 Total 4522 28861 32060 178261 5087 23953 12027 284771 Fonte: Ministério da Saúde/SVSA - Sistema de Informação de Agravos de Notificação - Sinan Net. A partir do histórico de acidentes provenientes do manejo das abelhas e na extração de seus derivados sempre houve uma grande preocupação por órgãos e ministérios da saúde quando ao alto risco do seu manejo, uma vez que as abelhas, por ação de defesa, ferroam quando se sentem ameaças (SINAM, 2023). 13 1.2. Abdômen e ferrão das abelhas Apis mellifera O corpo da Apis mellifera é dividido em três partes: cabeça, tórax e abdômen (Figura 2). O ferrão das abelhas Apis mellifera é constituído de uma parte operante e uma parte glandular, com exceção de outras partes não vivas, tais como a quitina, esclerotina, resilina e cera, que estão presentes no corpo dos insetos e possibilitam que o mesmo tenha resistência, rigidez, flexibilidade e impermeabilidade. A parte operante é dividida em aparato motor, formado por placas cuticulares e lancetas, que ficam conectadas ao aparato motor por braços cuticulares curvos (CARVALHO, 2019). Figura 2 - Divisão Morfológica das abelhas Apis mellifera Fonte: ARBOITTE, M. Z – 2008 No momento da ferroada ocorre a inoculação do veneno, e a abelha vêm a óbito por deixar parte de seu abdome e intestino ligado ao ferrão, como mostra abaixo a Figura 1, que tem formato pontiagudo com fisga/farpas, relação essa que faz com que parte de seu corpo fique presa no momento da ferroada na pele da pessoa acometida (COSTA et al., 2020). 14 Figura 1 - Abelha realizando uma ferroada Fonte: ARBOITTE, M. Z – 2008 O ferrão pode ser utilizado pelas fêmeas para defesa individual ou da colmeia, embora a fêmea que ferroou morra, já que o ferrão fica preso no objeto ferroado. Esta ação é vantajosa do ponto de vista da espécie, onde a perda de alguns indivíduos não afeta a sobrevivência da colônia. Na rainha, as farpas do ferrão são menos desenvolvidas do que nas operárias e a musculatura ligada ao ferrão mais forte, para que ela não o perca após a ferroada (CARVALHO, 2019). Dessa forma, para a rainha, o ferrão é mais um instrumento de orientação, que visa à identificação das células dos favos onde vai depositar os ovos, ou para ferroar outra rainha que tenha nascido ao mesmo tempo, com quem disputará pela hegemonia da colmeia (RAMOS & CARVALHO, 2007). As glândulas de veneno consistem em um tubo longo, fino e convoluto, que finda em uma bifurcação em fundo cego e uma parte alargada, que funciona como reservatório para a secreção. Este reservatório liga-se ao ferrão por um ducto curto, durante a ferroada, o veneno produzido pelas glândulas de veneno, escorre por um canal entre o estilete e as lancetas, penetrando no objeto ferroado, como mostra abaixo na (Figura 3), (CARVALHO, 2019). 15 Figura 3 - Sistema glandular da Abelha Fonte: Fonte: ARBOITTE, M. Z – 2008 1.3. Apitoxina, extração, composição e sintomas A palavra apitoxina vem do latim e significa: apis - abelha e toxikon – veneno. O veneno é utilizado como formas de defesa e proteção da colmeia. Fato esse que favorece à eficiente comunicação entre as abelhas por meio de feromônios de alarme produzidos pelas células da glândula de veneno (isopentilacetato) e das glândulas mandibulares (2-heptanona) das operárias. Esses feromônios atuam como sinalizadores para as demais operárias da colmeia onde está o possível inimigo (NOGUEIRA-COUTO & COUTO, 2002). Muitos métodos são utilizados para extração do veneno, porém, alguns métodos necessitam da retirada da bolsa de veneno, o que acomete a morte das abelhas. O método mais indicado é o que utiliza equipamentos que emitem impulsos elétricos, que permitem adquirir o veneno puro, sem sacrificar as abelhas. Na abelha Apis mellifera, a composição do veneno varia de acordo com a sub espécie, fase do 16 desenvolvimento e com os hábitos alimentares. As principais alterações encontradas são variações nas concentrações das proteínas do veneno ao longo das estações do ano, demonstrando uma influência do meio (RUVOLO-TAKASUSUKI, 2019). A coleta por meio de estimulação elétrica proporciona uma solução de veneno muito mais consistente e clara do que a coleta manual. Diferenças significativas na forma, distribuição, intensidade e presença ou ausência de picos também são notáveis quando se comparam as duas metodologias de coleta de veneno. Portanto, a elétrica foi a metodologia selecionada para as comparações das análises de veneno realizadas neste trabalho (FERREIRA, J., et. Al. 2010). Segundo Abreu et al. (2000), abelhas com sete dias são lentas a estímulos elétricos e melhoram sua produção de veneno com o passar do tempo, com a necessidade de sair das colmeias em busca de alimento seu sentido de defesa vai apurando, trazendo respostas mais ágeis ao perigo proporcionando maior quantidade de produção de veneno. Segundo Valderrama (2003), realizando um comparativo nos Estados Unidos, em produção de veneno de diferentes espécies de abelhas, o veneno de abelhas africanizadas (Apis mellifera melífera, Apis mellifera scutellata, Apis mellifera ligustica, Apis mellifera carnica) e abelhas europeias (Apis mellifera ligustica), destoam em quantidades em produção sendo 94 e 147mg de apitoxina/abelha, respectivamente. Segundo Funari (2011), os reservatórios de venenos das abelhas europeias constituem de maior quantidade de veneno comparados aos das abelhas africanizadas, mais no momento dos estímulos elétricos, as abelhas africanizadas liberam maior quantidade de veneno, comparado com as abelhas europeias. Neste contexto as particularidades das abelhas africanizadas trazem um animal mais resistente a doenças e ataques de possíveis predadores naturais, sendo uma característica positiva quanto a produção de apitoxina. Contudo deve se preocupar com a frequência de extração. Segundo BOGDANOV (2018), quando realizado de três a quatro coletas mensais a produção de mel reduz em aproximadamente 10 a 15% de sua produção. Segundo DURAN et al. (2011), as eletroestimulações utilizadas para coleta de apitoxina no intervalo de 20 a 30 dias não interferem na produção das colônias, não havendo mortalidade significativa e sua produção de apitoxina continuaram o mesmo. 17 Segundo Valderrama (2003), as abelhas africanizadas são mais agressivas e consequentemente mais habilidosas quanto a sua ferroada, apresentando trintas vezes mais velocidade que as europeias. Utilizando desses mecanismos de proteção e defesa de colmeias a produção de veneno bruto é muito mais elevada do que outras abelhas e sua proliferação de enxames são de fácil formação, sendo uma espécie de fácil adaptação a diferentes climas e territórios. Segundo Bucio & Martinez (2018), ao realizarem sua pesquisa constataram que a extração de veneno de abelha por estímulos elétricos é indicado, pois não matam os animais produtores e culmina em aumentos de ganhos econômicos no apiário sendo interessante sua associação a produção de mel, onde sua produção é alta ocasionada pelos períodos de floração. Sendo assim o veneno injetado em uma ferroada contém aproximadamente 50 μg de matéria seca. As principais proteínas presentes são a Melitina (50% do Peso Seco do Veneno - PSV), Fosfolipase A2 (12% PSV), fator degranulador de mastócitos (3% PSV), hialuronidase (3% PSV) e apamina (2% PSV). Além disso, estão presentes aminas biogênicas, entre elas histamina (1 % PSV), dopamina (0,5% PSV) e noradrenalina (0,5% PSV), (JESUS, 2020). A toxicidade desses venenos é atribuída a três componentes protéicos: enzimas (Fosfolipases A2 e Hialuronidase), grandes peptídeos (Melitina, Apamina e 7 Peptídeo degranulador de mastócitos - PDM) e pequenas moléculas (Peptídeo e Aminas biogênicas), que possuem atividades alérgicas e farmacológicas. Os fatores alergênicos são enzimas como melitina, fosfolipases, hialuronidases, lipases e fosfotases, proteínas antigênicas que inoculadas durante a ferroada, iniciam respostas imunes responsáveis pela hipersensibilidade de alguns indivíduos e pelo início da reação alérgica (JESUS, 2020). Tanto as Fosfolipases A2 quanto a Melitina são tóxicas, porém quando agem juntamente seus efeitos são potencializados, fazendo com que a lise celular ocorra mesmo na presença de baixas concentrações desses componentes. A Melitina e Fosfolipase A2 agem de forma sinérgica sobre os fosfolipídios das membranas, resultando no comprometimento de sua integridade e da membrana mitocondrial, comprometendo a fosforilação oxidativa e a cadeia respiratória, ocasionando dano tecidual (LIMA et al., 2006). Em indivíduos que levam múltiplas ferroadas de abelhas africanizadas, geralmente é detectada hemólise intensa acompanhada por insuficiência renal, 18 causada pela ação da apamina, melitina e fosfolipase A2 sobre a membrana eritrocitária. Os indivíduos acometidos por milhares de ferroadas evoluem rapidamente para um quadro clínico grave de insuficiência respiratória e renal agudas. Nos casos letais, os indivíduos apresentam necrose tubular aguda com presença de cilindros de hemoglobina e/ou mioglobina no interior dos túbulos renais. Os músculos esqueléticos apresentam proteólise intensa com liberação de mioglobina e creatinofosfoquinase para a circulação. Alguns indivíduos apresentam lesões com presença de necrose muscular. O fígado pode apresentar sinais de degeneração hidrópica decorrente do grave envenenamento (Barraviera, 1994). Geralmente, as picadas de abelha podem apresentar dois resultados diferentes:  Anafilaxia: ocorre em indivíduos alérgicos ao veneno de abelha. Nestes casos, uma única ferroada pode causar reações alérgicas generalizadas graves, podendo levar à morte. Estas consequências não estão relacionadas com a toxicidade do veneno devido à pequena quantidade inoculada. (BARBOSA et al., 2014).  Toxicidade direta do veneno: ocorre quando há um elevado número de picadas – geralmente mais de 200 em adultos. Nesse caso, o volume do veneno é suficiente para causar danos a órgãos vitais. Lesões diretas aos sistemas cardiovascular, muscular, neurológico, dermatológico, metabólico, hematológico, respiratório e renal podem levar à morte (BARBOSA et al., 2014). 19 1.4. Importância do estudo da apitoxina A apitoxina é o veneno das abelhas. É produzido por glândulas de secreção ácida e secreção alcalina, as quais, por sua vez seu estudo é importante pois, podem ser usadas em tratamento de artrite, tendinite, afecção cutâneas, reumatismo, entre outras doenças, sendo utilizado por farmácias de manipulação e indústrias químicas pelo fato de possuir tal toxicidade, para produção de remédios anti-inflamatórios, relaxantes musculares, antibacterianos, entre outros (TOMAZINI, 2019). Atualmente, existem muitos tratamentos que empregam apitoxina, os mais utilizados administram o veneno subcutânea, injeções ou diretamente pelas ferroadas das abelhas, este último, por sua vez, deve ser aplicado em pequenas doses (RUVOLO-TAKASUSUKI, 2019). Outra grande importância do estudo da apitoxina e a sua ação de envenenamento após as ferroadas das abelhas melíferas, que favorece o estudo e desenvolvimento de um anti-soro contra o veneno da abelha Apis mellifera proporciona um tratamento mais rápido e eficiente para vítimas de ferroada em massa. Mas um anti-soro eficaz deve levar em conta que deve ser o resultado da imunização de animais com um pool representativo de venenos de abelhas melíferas, provenientes das muito diferentes condições ambientais, estágios de desenvolvimento, época de ordenha e dieta que o inseto pode ser sujeito (SCIANI, et al. 2010) Diante do crescente número de casos clínicos por acidentes por abelhas africanizadas e, consequentemente de óbitos, despertou-se a necessidade de se dispor de um tratamento eficaz. E desta forma, um estudo clínico Fase 1 e 2 utilizando de um soro antiapílico tem sido testado em pacientes que sofrem por múltiplas ferroadas de abelhas africanizadas (BARBOSA et al, 2021). Para tratar esses ataques massivos, pesquisadores brasileiros desenvolveram o primeiro antiveneno específico contra a exposição à ferroada de abelhas africanizadas. Este produto único, o primeiro deste tipo no mundo, foi testado com segurança em 20 pacientes durante um ensaio clínico de Fase 2 (ORSI, et al, 2024). O antiveneno apílico inibiu as atividades enzimáticas da fosfolipase e da hialuronidase. Em experimentos de citometria de fluxo, o antiveneno apílico 20 neutralizou a redução da viabilidade celular devido à necrose pelo veneno de abelha atividades da melitina. Estes resultados mostraram que este antiveneno é um inibidor eficaz das ações do veneno das abelhas (CRUZ, et al. 2021). Neste contexto, observaram que mesmo após a soroterapia específica desses pacientes acometidos por múltiplas ferroadas de abelhas Apis mellifera deste estudo clínico, os estudos de venenemia evidenciaram a existência das toxinas do veneno da abelha no sangue dos pacientes tratados após 10 dias da alta médica (BARBOSA et al, 2021). Durante a soroterapia específica, os níveis séricos do veneno da abelha no sangue dos pacientes reduziram drasticamente até o momento em que os pacientes tiveram alta hospitalar, porém, nas consultas de retorno após 10, 20 e 30 dias, os mesmos estudos de venenemia evidenciaram elevados níveis de veneno da abelha circulantes nos pacientes (BARBOSA et al, 2021). Pesquisas realizadas através da técnica de espectrometria de massa qualitativa evidenciaram a presença da proteína melitina na corrente sanguínea dos pacientes em casos caracterizados como leves, moderado e graves em 30 dias após a administração do soro anti-apilico. Neste contexto os testes realizados em resposta clínica dos participantes, resultados dos exames laboratoriais de resposta de fase aguda, testes de ELISA e a espectrometria de massa consideram que embora o produto administrado seja seguro são necessários retornos clínicos e revisão do protocolo, para aferição da quantidade de frascos de soro anti-apílico a serem administrados (BARBOSA et al, 2021). Diante dessa observação clínica e tendo em vista estudos já publicados na literatura sobre a presença de microvesículas no veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (SOUZA-IMBERG, et. al, 2017), há a necessidade de pesquisas sobre os elevados níveis de veneno de abelha sendo transportados e novamente envenenado pelo deslocamento das microvesículas. 21 1.4. Microvesículas A comunicação entre as células é um evento essencial em todos os organismos vivos que é alcançado através de vários mecanismos, entre os quais a secreção de elementos solúveis é um fator importante. Nas últimas duas décadas, um novo método de comunicação intercelular foi desenvolvido e são reconhecidas como um novo método de comunicação intracelular com uma faixa de sinalização, através da secreção de partículas nanométricas ligadas à membrana, conhecidas como vesículas extracelulares que são liberadas pelas células nos espaços extracelulares. (ZABOROWSKI, 2015 & YÁÑEZ-MÓ, 2015). São consideradas vesículas de entrega de carga porque abrigam ácidos nucléicos, proteínas, lipídios e metabólitos que refletem sua origem celular. As vesículas extracelulares são encontrados em quase todos os fluidos do corpo, desde fluidos sinoviais e leite materno até saliva, plasma e urina (YÁÑEZ-MÓ, 2015). O termo “vesícula extracelular” foi usado pela primeira vez na literatura em 1971 por um estudo que envolveu análise microscópica eletrônica da alga de água doce 'Ochromonas danica' (SAILLIET, 2022). Naquela época, vários nomes eram usados para mencionar vesícula extracelular, como vesículas de desprendimento, fragmentos de membrana, vesículas de membrana plasmática, microvesículas e exossomos (SAILLIET, 2022). As vesículas extracelulares surgiram como importantes mediadores da comunicação intercelular em uma ampla gama de processos biológicos. Para futuras aplicações terapêuticas e para a investigação em biologia de vesícula em geral, compreender o destino in vivo dos vesículas extracelulares é de extrema importância (WIKLANDER, et al, 2015). Vesículas extracelulares são um grupo de vesículas com estrutura de membrana liberadas pelas células, incluindo exossomos, microvesículas, corpos apoptóticos e oncossomas. Vesículas extracelulares são agora reconhecidas como importantes ferramentas de comunicação célula a célula, permitindo que as células troquem proteínas, lipídios e material genético para participar de processos fisiológicos e patológicos. Foi relatado que os vesículas extracelulares regulam as interações hospedeiro-patógeno e participam de processos patológicos de doenças infecciosas, doenças neurológicas, câncer e doenças cardiovasculares, mas 22 também desempenham um papel importante no processo de crescimento e desenvolvimento (WANG & ZEMG, 2023). Foi demonstrado que as vesículas extracelulares desempenham um papel importante na comunicação celular. Elas têm sido implicadas em processos importantes, como respostas imunes, manutenção da homeostase, coagulação, inflamação, progressão do câncer, angiogênese e apresentação de antígenos. Assim, as vesículas extracelulares participam de condições fisiológicas e patológicas (KONALA, et al. 2016 & RAPOSO, 2013). As vesículas extracelulares também podem ser encontrados em fluidos fisiológicos, como urina normal, sangue, líquido de lavagem brônquica, leite materno, saliva, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, líquido sinovial e ascite maligna. As vesículas extracelulares mais importantes são as microvesículas (MVs) e exossomos (KONALA, et al. 2016 & RAPOSO, 2013). A liberação de microvesículas para o espaço extracelular é um processo que ocorre tanto em procariotos como em eucariotos. A conservação dessas estruturas ao longo da evolução sugere que esses compartimentos vesiculares extracelulares possuem funções essenciais (para revisão ver GYÖRGY et al., 2011). Por muito tempo as microvesículas foram consideradas artefatos ou debris celulares, frequentemente observados por microscopia eletrônica no espaço intersticial de tecidos ou sangue, consideradas como consequência ou resultado da dinâmica celular. Atualmente são reconhecidas como estruturas específicas, distintas dos exossomos liberados após exocitose de corpos multivesiculares (CAMUSSI et al., 2010). A secreção de vesículas extracelulares durante a maturação dos reticulócitos foi reconhecida em 1983. Vesículas extracelulares são vesículas repletas de membrana que são secretadas por uma variedade de tipos de células, incluindo células dendríticas, plaquetas, mastócitos, células epiteliais, células endoteliais, células neuronais, células cancerígenas, oligodendrócitos, células de Schwann e células embrionárias (KONALA, et al. 2016 & RAPOSO, 2013). Microvesículas, ou vesículas de desprendimento, são formadas por brotamento externo da membrana celular em diferentes tipos de células que envolve a reorganização do citoesqueleto e também depende da concentração de cálcio intracelular (KONALA, et al. 2016). 23 para manter a comunicação intercelular. Eles são bastante semelhantes em os dois é a forma como são produzidos. Os exossomos são formados através da via corpos multivesiculares e são liberados após a fusão dos corpos multivesiculares membrana, eles são maiores em tamanho variando de 100 nm a 1000 nm, como já dito, enquanto os exossomos são menores em tamanho variando de 50 nm a 150 os exossomos são formados dentro da membrana celular, eles são mais próxima da célula-mãe. A composição geral de ambas as Vesículas extracelulares Elas têm diâmetro de 100–1000 nm e podem ser isolados por ultracentrifugação com densidade de 1,04 a 1,07 g / mL em gradiente de sacarose (RANI, 2015). As Microvesículas contêm grandes quantidades de proteínas e são ricas no marcador de superfície, bem como em colesterol, esfingomielina e ceramida (RAPOSO, 2013). As microvesículas estão envolvidas não só em processos fisiológicos, mas também patológicos. Em geral são crescentes em processos patológicos, níveis anormais de microvesículas são observados, sendo que a origem e composição celular destas estruturas são indicadores do tecido onde se localiza a doença, (GYÖRGY et al., 2011). Os exossomos e microvesículas, são regularmente secretados pelas células propriedades e são muito difíceis de separar. Uma das principais diferenças entre endolisossomal após a invaginação das membranas endossomais para formar com a membrana plasmática (SAILLIET, 2022). As microvesículas são formadas pelo brotamento externo da nm e têm uma densidade flutuante de 1,10 a 1,14 grama/ml (SAILLIET, 2022). Como enriquecidos em fosfatidilserina, enquanto a composição das microvesículas é mais são as mesmas, ou seja, cada um contém proteínas citoplasmáticas, lipídios, mRNA, miRNA e receptores (SAILLIET, 2022). 24 1.5. Análise Proteômica como uma estratégica investigativa prognóstica e/ou diagnóstica O desenvolvimento de estudos de Proteômica voltado a abelhas vêm sendo realizado a partir do ano de 2005 com a publicação de seu primeiro artigo sobre a composição do veneno de Apis mellifera, combinando duas técnicas que são elas análise por espectrometria de massas no equipamento tipo MALDI-TOF/TOF e eletroforese bidimensional, que obteve o êxito do encontro de três novas proteínas das abelhas (PEIREN et al, 2005). Sabe-se que as proteínas e peptídeos são responsáveis por controlar a maioria dos processos celulares, podendo agir como enzimas, anticorpos, hormônios, componentes estruturais e receptores celulares. As proteínas tem como importante função a catálise enzimática, transporte, movimentação, suporte mecânico, proteção imune, sinalização intra e extracelular dentre outras (ISFORT et al, 2002). Para melhor conhecer proteínas e peptídeos é fundamental avaliar o conjunto de proteína de uma amostra biológica. Um proteoma é dito como complexo e dinâmico, uma vez que, a composição proteica de uma amostra reflete o estado metabólico/fisiológico e das fases da diferenciação celular que a célula, tecido, órgão ou organismo se encontra no momento da investigação (JENSEN, 2004). A utilização do termo proteômica refere-se ao estudo desses conjuntos de proteínas definas como proteoma, estudando de forma descritiva e quantitativa de uma organela sub celular até a de um ecossistema, interações com outras proteínas, suas variações populacionais, mudanças em decorrência a resposta a um ambiente, mudanças decorrentes ao desenvolvimento normal ou alterado e modificações (VALLEDOR et al, 2011). Muitos foram os estudos de pesquisa básica publicados até o momento utilizando-se a estratégia proteômica para se comparar diferentes estados biológicos em geral, como por exemplo, identificar marcadores moleculares entre sistemas sadios e doentes, resistentes e susceptíveis, com características positivas e normais (SIZOVA et al, 2007). No entanto, a proteômica vem se tornando uma ferramenta importante em estudos de aplicação clínica, a qual tem sido vista como uma das chaves para a descoberta de novas drogas e no desenvolvimento de testes diagnósticos mais 25 específicos, quando se identifica marcadores moleculares para um determinado quadro clínico (FERNANDEZ et al, 2008 & SONG et al, 2014). No âmbito da investigação de biomarcadores em diferentes patologias, microvesículas extracelulares tem sido alvo de muitos estudos proteômicos a partir de fluídos corpóreos como o sangue e urina de pacientes (KIM, et al, 2015 & COCUCCI et al, 2015). Diante dessa observação clínica e tendo em vista estudos já publicados na literatura sobre a presença de microvesículas no veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (SOUZA-IMBERG et al, 2017) e da presença de melitina e fosfolipase A2 em seu reaparecimentos em 10, 20 e 30 dias após o tratamento do soro anti apilico na maioria dos participante pacientes (BARBOSA et al, 2021), postulou-se duas hipóteses: (1) O veneno da abelha foi liberado na corrente sanguínea dos pacientes tardiamente pois estavam encapsulados em microvesículas oriundas do próprio veneno. (2) O veneno da abelha foi liberado na corrente sanguínea dos pacientes tardiamente pois estavam encapsulados em microvesículas formadas pelo próprio organismo dos pacientes por meio do brotamento de microvilos na fagocitose celular dos antígenos circulantes após o acidente? Em suma, atualmente as microvesículas possuem múltiplas funções, dependendo de sua origem, sinalizando através de interações com outras células, transferindo material genético. Sua participação em processos fisiológicos ou patológicos mostra a importância das microvesículas e abre novas perspectivas de investigação sobre seu conteúdo e perfil proteico. 43 6. CONCLUSÃO Utilizando técnicas proteómicas para identicação das proteínas presentes nas micorvesículas do veneno de abelha Apis mellifera, após descarte do volume morto da coluna, 4 frações foram eluídas e coletadas e neste parâmetro somente as frações F1 e F2 foram aptas a pesquisa científica com microvesículas. Desta forma, supoe-se que, as microvesiculas presentes no veneno da abelha Apis mellifera sao frutos do desprendimento de brotos membranares de orgaos/tecidos durante sua vida, os quais podem ser conduzidos para a glandula de veneno pela proximidade que a mesma tem com o intestino deste inseto. Muitas proteínas foram encontradas, onde nenhuma com relação ao envenenamento das abelhas africanizadas Apis mellifera mas o processo de atuação de tais proteínas ainda deixa dúvidas sobre os conceitos de seus impactos no corpo humano, onde temos proteínas que desenvolvem ações térmicas característica do Alérgeno C uma das propriedades do veneno, ações catalíticas e de transporte. Dentre várias proteínas encontradas a proteína acid phosphatase type 7 (Fosfatase ácida tipo 7) juntamente com a proteína Fosfatase 1H, têm relação ao envenenamento das abelhas africanizadas Apis mellifera, induz reações de toxidade que são inoculadas durante a ferroada no momento de defesa das abelhas melíferas, conduzido o acometido a reações alérgicas após envenenamento da apitoxina. Por fim os resultados obtidos neste trabalho serão de grande contribuição para próximos estudos envolvendo as proteínas caracterizadas nas microvesículas, qual a sua ação no corpo humano após o desprendimento de microvesículas das células, proveniente do envenenamento de múltiplas picadas de abelhas Apis mellifera. 44 7. REFERÊNCIAS ABREU, R. M. M. Efeito de choques elétricos no comportamento das glândulas de veneno de operárias de Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apidae). 1996. 102f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, 1996. ALLIANCE OF GENOME RESCURSES. Fração 1: Proteína Krasavietz. Disponível em: https://www.alliancegenome.org/gene/FB:FBgn0250753. Acesso em 04/01/2024. ALVES, T. I. P. Aspectos históricos da apicultura em Sergipe: gerenciamento e aplicação de arranjo produtivo local de apicultura. 2016. 78 p. Dissertação (Mestrado em Saúde e Ambiente) - Universidade Tiradentes, 2016. 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