i ELSA MARIA MATERON VÁSQUEZ SENSORES ELETROQUÍMICOS PARA O FÁRMACO CISPLATINA COMO FERRAMENTA BIOTECNOLÓGICA NO MONITORAMENTO CLINICO, METABÓLICO E AMBIENTAL Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutorado em Biotecnologia. Orientadora: Profª Dra Maria Del Pilar T. Sotomayor Araraquara 2015 ii iii iv CURRICULUM VITAE Dados curriculares Nome: Elsa Maria Materon Nome em citações bibliográficas: Elsa María Materón, Materón E.M. Elsa M. Materón. Naturalidade: Santiago de Cali, Colômbia Nacionalidade: Colômbia Formação acadêmica Graduação: Graduação em Química. Universidade Del Valle, realizado no Departamento de física de estado sólido e matéria condensada. Tendo como orientador Prof. Dr. Jesús Evelio Diosa Astaiza e Prof. Dr. Rubén Antonio Vargas Zapata. Período: 08/2000 a 08/2006 Titulo do projeto: Estudio de las transiciones de fase del sistema (1-x)NH4H2PO4-x- Al2O3 Pós-Graduação -Mestrado em Biotecnologia, realizado no Departamento de Físico-Química do Instituto de Química (UNESP), tendo como orientador Prof. Dr. Paulo Roberto Bueno. Período: 08/2009 a 08/2011 v Título do Projeto: Obtenção de micro/nanoparticulas poliméricas para o encapsulamento do fármaco bromidrato de galantamina. Período: -Doutorado em Biotecnologia realizado no Departamento de Química Analítica do Instituto de Química (UNESP), tendo como orientadora Profª Dra Maria D.P.T. Sotomayor. Título do Projeto: Sensores eletroquímicos para o fármaco cisplatina como ferramenta biotecnológica no monitoramento clinico, metabólico e ambiental Período: 08/2011 a 08/2015 Formação acadêmica complementar  07/2011 Controlled Release Technology: Polymeric Delivery Systems for Pharmaceuticals, Proteins, and other Agents. Massachusetts Institute of Technology (MIT). Boston, USA.  02/2013- 08/2013: Estágio de Doutorado, University of Waterloo, Waterloo, Canada. Titulo: Aptasensor eletroquímico para monitoramento de fármacos antitumorais no tratamento de quimioterapia. Orientador: Prof.Dr. Juewen Liu Bolsa: the Emerging Leaders of the Americas Program (ELAP).  01/2015- 04/2015: Estágio de Doutorado, University of Pennsylvania, Pennsylvania, USA. Titulo: Fabricação de híbridos nano/bio transistores de efeito de campo baseados em grafeno para detecção de biomarcadores de câncer. Orientador: Prof. Dr. A. T. Charles Johnson vi Participação em eventos científicos com apresentação de trabalhos  Materón, E. M. et al. Development of glutathione-se-transferase based biosensor for detection of tartrazine in food. XX SIBEE, Uberlândia-MG (Pôster).  Materón, E. M. et al. Multi-walled carbon nanotubes modified screen-printed electrodes for cisplatin detection. 227th Meeting ECS. Chicago, Illinois, 2015 (Pôster).  Materón, E.M. et al. “Eletrodos modificados com Glutationa-s-transferase para monitoramento de anticancerígenos”. La Serena- Chile (Oral), 2014.  Materon, E.; Wong, A.; Cilli, E.M.; Sotomayor, M.D.P.T. “Biossensor à base de pasta de carbono modificada com GTS para quantificação de cisplatina”. XIX SIBEE, Campos de Jordão. Brasil. (Pôster), 2013. Artigos publicados  Materón, E.M.; Wong, A.; Klein, S.; Liu, J.; Sotomayor, M.D.P.T., Multi-walled carbon nanotubes modified screen-printed electrodes for cisplatin detection, Electrochimica Acta 158 (2015) 271–276.  Wong, A.; Materón, E.M.; Sotomayor, M.D.P.T. Development of a biomimetic sensor modified with hemin and graphene oxide for monitoring of carbofuran in food, Electrochimica Acta 146 (2014) 830-837.  Materon, E.M.; Wong, A.; Sotomayor, M.D.P.T. Glutathione-s-transferase modified electrodes for detecting anticancer drugs, Biosensors and Bioelectronics 7 (2014) 232-236. vii  Hui Jiang, Elsa M. Materon, Maria Del Pilar Taboada Sotomayor, Juewen Liu. “Fast assembly of non-thiolated DNA on gold surface at lower pH”. Journal of Colloid and Interface Science 411 (2013) 92–97.  Vargas, R. A.; Castillo J. H.; Castillo, J. R.; Materón, E.M. Electrical relaxation in proton conductor composites base don (NH4)H2PO4/TiO2. Venezuela. Revista latino- americana de metalurgia y materiales.2009. vol51, fasc:2.  Materón, E. M. Castillo, J.; Castillo, R.; Vargas, R. “Estudio de las transiciones de fase de el sistema (1-x)NH4H2PO4-x-ZrO2., Revista Colombiana de Física, vol. 40, No. 1, Marzo 2008  Castillo, J.; Materón, E.M.; Castillo, R.; Vargas, R.; Bueno, P.R.; Varela, J. A. et al, “Electrical relaxation in proton conductor composites based on (NH4)H2PO4/TiO2” Ionics Magazine.24 decembre 2008.  Materón, E. M.; Vargas, R.; Ramirez, A.; Diosa, J. E. "Estudio de las transiciones de fase del sistema (1-x)NH4H2PO4-(x)Fe2O3". Revista Colombiana de Física. , Vol.39, n.2, 2007.  Materón, E. M.; Castillo, J.; Castillo, R.; Vargas, R. “Estudio de las transiciones de fase del sistema (1-x)NH4H2PO4-x-Al2O3, REVISTA COLOMBIANA DE FÍSICA, VOL. 38, No. 3. 2006 . viii DEDICATÓRIA A Jeová pela força e por guiar-me no caminho correto, A minha mãe por sempre estar disposta apoiar-me, A meu pai (em memória), seus ensinamentos viverão para sempre em mim. A Ademar Wong que sempre esteve ao meu lado, sempre me ajudando A Selisa Rollins, Lorena e Maria Luisa Candela. A meu eterno amigo e orientador de graduação Prof. Dr. Ruben A. Vargas, A Prof. Dr. Nelson Ramos, Prof. Dr. Juewen Liu, Profa. Dra. Hideko Yamanaka e Profa. Dra. Valnice Boldrin, pela paciência, apoio, atenções e disposição para responder com minhas dúvidas. A todos que me deram forças nesta etapa de minha vida. O professor se liga à eternidade. Ele nunca sabe quando cessa a sua influência Henry Adams ix AGRADECIMENTOS À minha orientadora Profa. Dra. Pilar Taboada por ter me aceitado no grupo de eletroquímica, além disso, agradeço-a por vincular-se na Biotecnologia, permitindo que minhas ideias fossem realizadas nessa tese. A meu orientador em Canadá, Prof. Dr. Juewen Liu, que confiou em meus conhecimentos e foi um apoio muito grande na elaboração desta tese e em minha vida. Além de dar-me muitas ferramentas para melhorar minha vida acadêmica. Sempre estarão em minha mente suas palavras e seu jeito tranquilo de resolver todo com um sorriso. Também a seu grupo de pesquisa Jimmy Huang, Feng Wang, Alexander Ip, Shine e Biwu, que foram muito amigáveis, me aconselharam, minhas tristezas me escutaram e me ensinaram a linda cultura chinesa. A meu orientador na universidade de Pensilvânia, Prof. Dr. Charles Johnson, junto a seu grupo Carl, Nick, Gao Zhaoli, Jinglei Ping, e Ramya, e especialmente Madeline Diaz, me ensinaram como a ciência pode ser divertida e louca. Eternamente agradecida à Madeline pela amizade, ensinamentos e o carinho, pois por mais que as temperaturas tenham chegado a -15 oC, sua amizade me encorajava a trabalhar mais fortemente e perseguir o conhecimento. À Profa.Dra. Hideko Yamanaka, Prof. Dr. Nelson Ramos, Profa. Dra. Maria Valnice, Prof. Dr. Stanlei Klein, Prof. Dr.. Reinaldo Marchetto pela contribuição através de discussões, pelo tempo, apoio e seus exemplos que me deram animo para continuar a luta. A meus amigos, Bárbara pela companhia e amizade, Angela pela eterna amizade de já 15 anos. Muito obrigada à Maria Luisa Candela pelo apoio e por ser uma mãe apesar da distância, minha irmã amiga Selisa Rollins pela amizade, apoio, cuidados e suas viagens desde Arizona ao Brasil para acompanhar-me quando ficava sozinha, Lorena minha irmã e amiga pelo apoio, ao Ademar Wong que sempre esteve ao meu lado sendo um suporte, pelas risadas, companhia nos momentos mais ruins e os bons, por corrigir o português, pelos ensinos da vida e acadêmica, minha mãe Nubia que sempre x é uma mãe maravilhosa cuidando-me e apoiando-me em tudo, todos vocês são muito valiosos para mim e são minha família. À CAPES pela bolsa concedida. Aos colegas de grupo de eletroanalítica pela convivência A todos os funcionários da seção de pós-graduação especialmente Wennia pela paciência e ajuda muito importante que proporciona aos estudantes. xi RESUMO Neste trabalho é apresentado o desenvolvimento de dois sensores eletroquímicos modificados para determinação sensível e seletiva de cisplatina, um dos fármacos mais frequentemente utilizados no tratamento oncológico de diversos tipos de patologias tumorais cancerosas. O primeiro sensor foi desenvolvido a base de pasta de carbono modificado com a enzima glutationa-s-transferase (GST). O biossensor é baseado na resposta inibitória da atividade enzimática da enzima GST devido à adição do fármaco cisplatina. Glutationa reduzida (GSH) e 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno foram utilizados como substratos para a enzima GST, os quais foram adicionados na concentração de 1,0 x 10-3 mol L-1 na cela de medida. As técnicas utilizadas para a caracterização do sistema foram espectroscopia de infravermelho, voltametria cíclica e impedância eletroquímica. Os resultados quantitativos daquelas interações foram obtidos usando VOQ, observando-se uma resposta linear entre 50 e 140 µmol L-1 de cisplatina e limite de detecção de 8,8 μmol L-1 de cisplatina. O biossensor apresentou uma boa repetibilidade intra-dia com um desvio padrão relativo de 4,2% avaliando quatro curvas analíticas. O uso da pasta de carbono ofereceu a possibilidade de uma simples, rápida e eficiente renovação da camada de superfície do eletrodo, o que permitiu a utilização da mesma pasta em várias medidas durante um longo período de tempo. Adicionalmente, foi desenvolvido um sensor não enzimático no monitoramento da cisplatina usando eletrodos impressos de carbono (SPCE, screen-printed carbon electrodes) modificados com nanotubos de carbono de multiplas paredes funcionalizados com grupos carboxila (MWCNT-COOH.SPCE) da DROPSENS® (SDS 110CNT). Com o propósito de avaliar a influência dos nanotubos de carbono na resposta do sensor de cisplatina foi utilisada a técnica de voltametria cíclica. O uso do surfactante dodecilsulfato de sódio (SDS) permitiu a determinação satisfatória da cisplatina por meio da técnica de voltametria de pulso diferencial com redissolução anódica. As análises com o MWCNT-COOH/SDS /SPCE ocorreram em potencial de - 0,25 V vs Ag/AgCl (KClsat) e cloreto de sódio 0,1 mol L-1 em pH 7,0 permitiram, nas condições otimizadas de análise, a obtenção de uma faixa de resposta entre 1,45 x 10-5 xii e 1,0 x 10-4 mol L-1 com um ajuste linear de R = 0,9974, uma sensibilidade de 4,5 x 104 (±1,0x103) µA mol L-1, com limites de detecção e quantificação de 4,6 x 10-6 e 1,4 x 10-5 mol L-1, respectivamente. A reprodutibilidade na resposta do sensor foi avaliada através da análise de três replicatas, obtendo-se o valor de desvio padrão relativo de 3,91%, demonstrando que o sensor tem alta estabilidade, repetibilidade e reprodutibilidade na determinação da cisplatina. A seletividade do sensor foi avaliada a partir da análise de outros complexos metalo-organicos de platina, como carboplatina e oxaliplatina e componentes organicos como doxorrubicina e gemcitabine, todos eles empregados na terapia antitumoral. Os resultados obtidos mostraram ausência de resposta eletroquimica para aqueles fármacos, e maior resposta eletroquímica para cisplatina. Quando aplicado em amostras de soro sanguíneo enriquecidas com cisplatina, os resultados obtidos na recuperação de cada amostra foram compatíveis com o metodo comparativo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Palavras chaves: Eletroquímica, biossensores, sensor, quimioterapia, cisplatina. xiii ABSTRACT This thesis presents the development of two electrochemical sensors for the sensitive and selective detection of cisplatin, one of the drugs most frequently used in the oncologic treatment of several cancer tumor pathologies. The first was a biosensor based on carbon paste modified with the enzyme glutathione-s-transferase (GST). The biosensing was based on the inhibitory response of the enzymatic activity of GST due to the addition of the drug cisplatin. Reduced glutathione (GSH) and 1-chloro-2,4- dinitrobenzene were used as substrates for the GST enzyme, and were added at the concentration of 1.0 x 10-3 mol L-1 in the measuring cell. The techniques used for the characterization of the system were infrared spectroscopy, cyclic voltammetry and electrochemical impedance. The quantitative results of those interactions, obtained by square wave voltammetry (SWV) and differential pulse with adsorptive stripping voltammetry were very similar, and very promising for the analysis of cisplatin. The biosensor showed, using SWV, a linear response between 50 and 140 µmol L-1 of cisplatin. The detection limit was 8.8 µmol L-1 of cisplatin. In the intra-day repeatability studies, the relative standard deviation was 4.2%, from the analysis of four analytical curves, showing the repetitiveness of the electrochemical response of the proposed sensor. The use of the carbon paste offered the possibility of the simple, quick and efficient renewal of the surface layer of the electrode, which allowed the use of the same paste for several measurements during a long period of time. Additionally, a non-enzymatic sensor was developed for the monitoring of cisplatin using screen-printed carbon electrodes (SPCE, screen-printed carbon electrodes), functionalized with multi-walled carbon nanotubes and factory modified with carboxyl groups (MWCNT-COOH) acquired from DROPSENS® (SDS 110CNT). The electrochemical characterization of the screen printed sensor in the presence of cisplatin was done by cyclic voltammetry technique, in order to evaluate the influence of carbon nanotubes on the sensor response. The MWCNT-COOH / SPCE has shown on xiv many occasions an unstable response in the detection of cisplatin using a sodium chloride supporting electrolyte. Such a condition has been solved with the use of various surfactants, among which sodium dodecyl sulfate (SDS) showed the best results in electrochemical measurements. This enabled the satisfactory determination of cisplatin by differential pulse voltammetry with anodic stripping voltammetry. Analysis with the MWCNT-COOH/SDS /SPCE occurred at potential of -0,25 V vs Ag/AgCl (KClsat) and using sodium chloride supporting electrolyte 0,1 mol L-1 in pH 7.0. It allowed the analysis conditions are optimized to obtain a response range between 1,45 x 10-5 e 1,0 x 10-4 mol L-1 with a linear adjustment R = 0,9974, sensitivity of 4,5 x 104 (±1,0x103) µA mol L-1, with limits of detection and quantification of 4,6 x 10-6 e 1,4 x 10-5 mol L-1, respectively. The reproducibility of the sensor response evaluated by the analysis of three replicates, shown a RSD of 3.91%, indicating that the biosensor has high stability, repeatability and reproducibility in determining the cisplatin. The selectivity of the sensor was evaluated from the analysis of other metallo-organic platinum complexes such as carboplatin and oxaliplatin and organic components such as doxorubicin and gemcitabine, all these used in antitumor therapy. The results showed no electrochemical response of some drugs and greater electrochemical response to cisplatin, which was due to the greater interaction with the surfactant (SDS). When applied to blood serum samples spiked with cisplatin, results in the recovery of each sample were satisfactory and were compatible with the comparative method (HPLC). Keywords: Electrochemistry, biosensors, sensor, chemotherapy, cisplatin. xv LISTA DAS FIGURAS Figura 1: Gráfico resumido da história da quimioterapia ................................................ 5 Figura 2: Ciclo de divisão celular ................................................................................... 9 Figura 3: Apresenta como agem os fármacos antitumorais durante o ciclo de divisão celular ........................................................................................................................... 10 Figura 4: Ação dos fármacos antitumorais no DNA ...................................................... 14 Figura 5: Fármacos anticancerigenos expulsos pela P-pg ........................................... 18 Figura 6: Estrutura química do substrato glutationa (GSH) ......................................... 21 Figura 7: Mecanismo redox da célula envolvendo as enzimas GSTs e detoxificação da cisplatina ....................................................................................................................... 22 Figura 8: Resumo dos principais mecanismos considerados na resistência ao agente antitumorar cisplatina. (baseado em Cepeda Victoria et al, 2007) ................................ 23 Figura 9: Mecanismo de detoxificação do cisplatina .................................................... 25 Figura 10: Mecanismo de hidrolises do fármaco cisplatina .......................................... 36 Figura 11: (A) reação catalisada por GST entre GSH e CDNB, gerando um aduto de cor amarela. (B) absorbância a 340 nm Da reação entre CDNB e GSH na presença de diversas quantidades de GST. A reação foi realizada em tampão fosfato 0,05mol L-1(pH 6,5) a 37º C. A linha de controle não contém GST (linha preta). (C) Otimização do pH para a reação catalisada de GST.(D) Perfil da inibição espectrofotométrica da reação enzimática na presença do fármaco cisplatina .............................................................. 45 Figura 12: (A) Voltamogramas cíclicos da pasta de carbono sem modificar (-GST) e modificada com GST (+GST). (B) Voltametria cíclica de pasta de carbono modificado com GST mostrando resposta do substrato e inibição da cisplatina em potencial entre - 0,4 e 0,8 V. Medidas realizadas em eletrólito suporte de tampão fosfato salino 0,05 mol L-1 em NaCl 0,01 mol L-1 a velocidade de varredura de 0,1 Vs-1 ................................... 48 Figura 13: Apresenta voltamogramas cíclicos das reações da enzima GST com (A) CDNB + GSH (B) cisplatina + GSH (C) comparação entre ambas às reações e (D) Estudo de velocidade de varredura .............................................................................. 51 xvi Figura 14: Gráfico de fluorescência da afinidade de GST com dois substratos CDNB (reta laranja) e cisplatina (reta azul) .............................................................................. 53 Figura 15: Variação da corrente de pico anódica com a velocidade e varredura e gráfico de ipa vs v1/2 (B). Condições de análise: [GSH],[CDNB] = 1 mmol L-1 e [Cisplatina] = 1 mmol L-1 , Fosfato 0,1 mol L-1 (pH 6,5) ................................................ 54 Figura 16: Gráfico de Bode das pastas de carbono sem modificar, pasta de carbono modificada com glutaraldeído e biossensor, medidas realizadas em tampão fosfato 0,05mol L-1 a pH 6,5 ...................................................................................................... 55 Figura 17: Espectros de infravermelho da pasta de carbono não modificada, pasta de carbono modificada com glutaraldeído e biossensor (pasta modificada com a enzima GST e glutaraldeido) ..................................................................................................... 56 Figura 18:Voltamogramas de onda quadrada obtidos na otimização do tempo de pré- concentração na resposta do biossensor 57 Figura 19:(A) Curva analítica obtida por VOQ em condições otimizadas: Solução tampão fosfato 5,0 x 10-3 mol L-1 (pH 6,5) com concentrações crescentes de cisplatina. [GSH] = [CDNB] = 1,0 x 10-3 mol L-1, [Cisplatina] em mol L-1: a = 0; b= 5,0x10-5; c= 6,5x10-5; d= 7,9x10-5; e= 9,0x10-5; f= 1,0x10-4; g=1,3x10-4; h=2,5x10-4; i=3,4x10-4. (B) Quantificação da queda de corrente de pico em função da concentração de cisplatina.Frequencia 10 Hz , Amplitude 0,1 V , degrau de potencial 5 x10 -3 V ............ 58 Figura 20: Quantificação por inibição pela diminuição da corrente de pico em função da concentração de cisplatina (A) e curva analítica (B) obtida pela VDP em 5,0 x 10-3 mol L-1 de solução tampão de fosfato (pH 6,5), [GSH] = [CDNB] = 1,0 x 10-3 mol L-1 e com diferentes concentrações de cisplatina em mol L-1: a = 0; b= 5,0x10-5; c= 6,5x10-5; d= 7,9x10-5; e= 9,0x10-5; f= 1,0x10-4 g=1,3x10-4; h=2,5x10-4. Amplitude 0.1 V, tempo de modulação 5 x 10-2 s, degrau de potencial 5 x10 -3 V. Intervalo de tempo 0,2 s ........... 60 Figura 21: Perfil da estabilidade do biossensor na presença de cisplatina ................. 62 Figura 22: (A) Representação da reação do GSH e GST, na presença de cisplatina. Neste caso os fármacos usados como antitumorais competem com o CDNB pelos sítios ativos da enzima produzindo uma diminuição no sinal de corrente. (B) Estruturas dos fármacos usados na quimioterapia. (C) Mecanismo proposto para a resposta do biossensor ..................................................................................................................... 65 xvii Figura 23: Resposta do biossensor para alguns possíveis compostos interferentes presentes no soro sanguineo ........................................................................................ 66 Figura 24: Resposta eletroquimica em voltametria cíclica da cisplatina em sensor impresso: (A) eletrodo não modificado, (B) modificado com MWCNT. Em diferentes ciclos de varredura de potencial .... ............................................................................... 67 Figura 25: Voltamograma cíclico do eletrodo modificado com MWCNT de uma solução contendo 0,1 mol L-1 de NaCl e 8,0x10-4 mol L-1 de SDS (NaCl/SDS) em ausência e presença de cisplatina ................................................................................................... 69 Figura 26: Voltamograma cíclico do eletrodo impresso na presença e ausência de SDS usando NaCl 0,1 mol L-1 como eletrólito de suporte. 70 Figura 27: Estudo do efeito do pH na resposta do sensor. Medidas realizadas em VPD usando 0,1 mol L-1 NaCl (pH 7,0), Tempo de modulação= 0,5 s, A = 75 mV, E = 8 mV, Eacc = -0.8 V and tacc = 50 s e [Cisplatina] = 2,0x10-3 mol L-1) ...................................... 71 Figura 28: Voltamogramas de pulso diferencial para a resposta à cisplatina do sensor proposto usando surfactante (A) CTAB, (B) Triton X e (c) SDS ................................. 72 Figura 29: Estrutura do surfactante dodecilsulfato de sódio (SDS) ......................... 73 Figura 30: (A) Perfil de resposta do sensor para cisplatina usando DPV; (B) Curva análitica correspondente ............................................................................................... 75 Figura 31: Perfil de resposta em VPD obtida para diferentes compostos antitumorais. Medidas realizadas em 0,1 mol L-1 NaCl (pH 7,0), Tempo de modulação= 0,5 s, A = 75 mV, E = 8 mV, Eacc = -0.8 V and tacc = 50 s em NaCl 0,1 mol L-1 (pH 7,0) [Cisplatina] = 1,0 x 10-3 mol L-1 ........................................................................................................... 76 Figura 32: Mecanismo de hidrólise da carboplatina ..................................................... 77 Figura 33: Mecanismo de hidrólise da oxoplatina ....................................................... 78 Figura 34: Mecanismo da formação de micelas com a cisplatina ................................ 80 Figura 35: Esquema ilustrativo do funcionamento do sensor/SDS na presença de cisplatina ..................................................................................................................... 81 Figura 36: Determinação da cisplatina em amostras de soro, (A) usando o sensor proposto; (B) por cromatografia líquida de alta eficiência ............................................. 82 xviii LISTA DAS TABELAS Tabela 1: Comparação dos dados obtidos por voltametria de onda quadrada e voltametria de pulso diferencial. .................................................................................... 61 Tabela 2: Resultados obtidos com o biossensor na análise dos fármacos antitumorais e metabolitos do sangue .................................................................................................. 63 Tabela 3: Parâmetros avaliados para o desenvolvimento do sensor ........................... 74 Tabela 4: Comparação do sensor com o método cromatográfico (HPLC) ................... 84 Tabela 5: Comparação de alguns métodos de determinação de Cisplatina encontrados na literatura ................................................................................................................... 84 xix LISTA DE ABREVIATURAS E DAS SIGLAS A – ámperes CAK- Quinase ativadora dependente de ciclina. CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno CKIs – Quinase inibidoras de Cdks. C-Jun-- c-Jun N-terminal kinases (JNKs) Cdks- Quinases dependentes de ciclinas. C-MOPP: Acrônimo da mistura dos fármacos o qual substituiu a mostarda nitrogenada pela Ciclofosfamida. Prednisona, ProCarbazina DPV – Voltametria de pulso diferencial EA – Eletrodo auxiliar ER – Eletrodo de referência ERCC1- excision repair cross-complementation group 1 ET – Eletrodo de trabalho FTIR – Espectroscopia infravermelho com transformada de Fourier P-gp- glicoproteina P GSH- Glutationa reduzida GSSG- Glutationa oxidada GST- Glutationa-s-transferase HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência i - Corrente elétrica NER- Reparo por excisão de base (Nucleotide Excision Repair) MT- Metalotioneína xx MMR-Reparo de pareamento errado (Mismatch Repair) MOMP- Acrônimo da mistura dos fármacos MOstarda nitrogenada com vincristina, Metotrexato, Prednisone MOPPC- Acrônimo da mistura dos fármacos MOstarda nitrogenada com vincristina, Prednisona, ProCarbazina MWCNT – Nanotubo de carbono de parede múltipla MWCNT/COOH/SPE- Eletrodo impresso modificado com nanotubos de carbono de paredes multiplex funcionalizado com grupo COOH MIP – Polímero molecularmente impresso RSD- desvio padrão relativo SDS- dodecilsulfato de sódio SPE- Eletrodo impresso SPCE- Eletrodo impresso baseado em carbono t - tempo VAMP: Acrônimo da mistura dos produtos químicos Vincristina, Ametopterina, 6- Mercaptopurina, e Prednisona VOQ – Voltametria onda quadrada VPD - Voltammetria de pulso diferencial VC – Voltametria cíclica V - Volts v- velocidade de varredura µ - micro xxi GLOSSÁRIO  Agente que se intercala: corante ou outro composto que contém um anel aromático ou outra estrutura plana que pode se encaixar entre duas bases sucessivas no DNA e pode causar mutação por inserção ou deleção  Anáfase: Estágio da mitose no qual as cromátides pareadas separam-se e movem- se para as extremidades opostas do fuso.  Angiogênese: formação de novos vasos sanguíneos ou seu desenvolvimento e crescimento a partir dos existentes.  Anóxia: estado de privação de oxigênio.  Antagonista: Agente que se liga a um receptor e inibe ligação do agonista específico para o receptor.  Apoptose: Forma de morte celular na qual a célula encolhe e condensa, seu citoesqueleto colapsa, a membrana nuclear se desintegra, e o DNA é fragmentado. A membrana celular fica alterada e evoca rápida fagocitose sem perda de conteúdo celular no meio circundante ou indução de uma resposta inflamatória.  ATP- binding cassette : Proteína cassete de ligação a ATP, transportadores ABC  Ciclina: Proteína cuja concentração flutua durante o ciclo celular e que ativa uma proteína quinase dependente de ciclina, regulando assim a progressão pelo ciclo.  Fase G0: estado de não divisão de uma célula que saiu do ciclo celular no ponto de restrição durante a fase G1.  Fase G1: Fase do ciclo celular que consiste da parte da interfase em que ocorre crescimento antes de inicio da replicação do DNA.  Fase M: Parte do ciclo celular na qual o núcleo e o citoplasma se dividem para formar duas células filhas.  Fase S: Fase do ciclo celular no qual ocorre a replicação do DNA e do cromossomo ocorre. xxii  Fuso mitótico: rede de microtúbulos formados durante a divisão celular, no final da prófase, Irradia de um centríolo em cada pólo para os centrómeros dos cromossomos duplicados. Serve para reparar os cromossomos irmão.  Glicoproteína: proteína conjugada que contém carboidrato covalente ligado.  Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA): LLA é um câncer semelhante à leucemia mielóide aguda, mas que se origina de outro grupo de células, os precursores dos linfócitos. Em uma pessoa com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), os blastos não se desenvolvem normalmente em células brancas do sangue. As células anormais então ocupam espaço na medula normalmente dedicado à células saudáveis, e dificultam a criação de novas células. Este processo pode levar a uma redução nos glóbulos vermelhos e no desenvolvimento de anemia, bem como uma redução de células brancas do sangue que leva a um sistema imunológico mais fraco.  Leucemia Mielóide Aguda (LMA): LMA é um câncer que se espalha rapidamente no sangue e medula óssea. Devido à origem das células leucêmicas, a medula óssea produz rapidamente um grande número de células, que na maioria das vezes não funcionam corretamente e substituem as células normais.  Leucemia mielomonocítica crônica (LMMC): é um tipo de câncer que começa nas células formadoras do sangue da medula óssea. Os pacientes com LMMC apresentam um elevado número de monócitos no sangue (pelo menos 1.000 por mm3). Em alguns casos a contagem de monócitos é muito mais elevada, fazendo com que a contagem total de células brancas do sangue seja alta.  Linfoma de Burkitt : (anteriormente denominado Linfoma Não-Hodgkin de alto grau de pequenas células não-clivadas) é uma neoplasia de células B maduras altamente agressiva que afeta principalmente a faixa etária mais baixa, sendo endemico nas regiões africanas.  Linfomas difusos de grandes células B (LDGCBs): é um tipo de câncer do sistema linfático que acomete principalmente gânglios em nosso organismo. Constitui um grupo heterogêneo dentro dos linfomas não Hodgkin.  Linfoma de Hodgkin: é uma forma de câncer que se origina nos linfonodos (gânglios) do sistema linfático, um conjunto composto por órgãos, tecidos que https://pt.wikipedia.org/wiki/Neoplasia xxiii produzem células responsáveis pela imunidade e vasos que conduzem estas células através do corpo.  Linfoma de não-Hodgkin: muito mais comuns, também são predominantemente derivados de linfócitos B, sendo que apenas cerca de 10% dos casos originam-se de linfócitos T ou NK. Ao contrário do linfoma de Hodgkin, os linfomas não Hodgkin não têm um tipo celular característico, apresentando expressiva heterogeneidade morfológica, imunofenotípica e genética. Estes tipos celulares são clonais, derivadas de um precursor linfoide comum que sofreu transformação neoplásica.  MAP Quinase (Mitogen Activated Protein Kinases - Proteíno-quinases ativadas por mitógenos) é uma subfamília de proteínas-quinase específicas de serina/treonina que respondem a estímulos extracelulares (mitógenos) e regulam várias atividades celulares, como expressão gênica, mitose, diferenciação, sobrevivência celular  Microtúbulo: estrutura cilíndrica longa oca (25 nm de diâmetro) do citoesqueleto. É composto de tubulina e está presente em cílios, flagelos, centríolos e fibras do fuso.  Mitógeno: proteína ( p. ex., fator de crescimento derivado de plaquetas) que estimula divisão celular primariamente atuando no ponto de restrição do ciclo celular.  P53: Proteína regulatória de genes (53 kDa) que é ativada por lesão no DNA e envolvida no controle do ciclo celular, apoptoses e na manutenção da estabilidade genética. Está mutada em cerca de metade dos cânceres humanos.  Pareamento de bases: formação de um número máximo de ligações de hidrogênio entre um par de bases complementares (uma purina e uma pirimidina) em duas fitas de um ácido nucleico ou em fita dobrada sobre si mesma.  Ponto de restrição: tempo durante a fase G1 do ciclo celular quando uma célula prossegue para a fase S ou sai para a fase G0.  Proto-oncogenes: Um proto-oncogene é um gene normal que se torna um oncogene devido a uma mutação ou ao aumento de expressão gênica. As proteínas resultantes podem ser denominadas "oncoproteínas". Os proto-oncogenes codificam proteínas que ajudam a regular o crescimento e a diferenciação celular.  Quinase ciclina dependente (cdk): proteína quinase cuja atividade é modulada pela concentração de uma ciclina. https://pt.wikipedia.org/wiki/Gene https://pt.wikipedia.org/wiki/Oncogene https://pt.wikipedia.org/wiki/Express%C3%A3o_g%C3%AAnica https://pt.wikipedia.org/wiki/Crescimento_celular https://pt.wikipedia.org/wiki/Diferencia%C3%A7%C3%A3o_celular xxiv  Reação fase I: reação metabólica em biotransformação que introduz ou expoê grupos funcionais, tornando o produto mais hidrossolúvel. (ex. oxidação, redução e hidrólise).  Reação de fase II: reação metabólica, (ex. acilação, sulfatação, conjugação) que geralmente segue uma reação de fase I na biotransformação e inativa o produto e o torna hidrossolúvel para excreção.  Reparo de pareamento errado (mismatch): (MMR) reparo enzimático de uma fita de DNA que contém uma base que não pode parear corretamente com a da fita complementar.  Reparo por excisão de base: correção de uma base anormal em uma fita de DNA por remoção dessa base por uma DNA glicosilase, remoção da unidade desoxirribosefosfato e possivelmente nucleotídeos vizinhos por uma endonuclease AP e prenchemento da falha por DNA polimerase e DNA ligase.  Reparo por excisão de nucleotídeo: (NER) Correção de uma lesão que distorce a estrutura helicoidal de uma fita de DNA por remoção do segmento anormal por uma excinuclease e preenchimento da falha por DNA polimerase e DNA ligase.  Rabdomiossarcoma embrionário: este rabdomiossarcoma é o mais comum e tende a se desenvolver na área de cabeça e pescoço, bexiga, vagina e na próstata e testículos ou em seu redor. As células do rabdomiossarcoma embrionário se assemelham às células pré-musculares de fetos de 6 a 8 semanas. Duas variantes de rabdomiossarcoma embrionário, o rabdomiossarcoma botrióide e o rabdomiossarcoma de células fusiformes, tendem a ter um prognóstico melhor do que a forma mais comum da doença.  Retinoblastoma: O retinoblastoma é um tumor maligno originário da membrana neuroectodérmica da retina embrionária, compreendendo de 2 a 4 % dos tumores malignos pediátricos, sendo assim, o tumor maligno ocular mais frequente da infância.  Sarcomas: São tumores que se desenvolvem no corpo que tem origem principalmente em células que fornecem sustentação, como células dos ossos, células de gordura, células que constituem nossos vasos sanguíneos, músculos, cartilagens, pleuras, meninges e inúmeras outros tipos de células. xxv  Tumor ascitico de Ehrlich : Tumor de Ehrlich foi introduzido por Ehrlich em 1986 e descrito em 1906 como um carcinoma mamário de camundongos fêmeas. Inicialmente, o tumor foi desenvolvido experimentalmente sob a forma sólida, sendo transplantado em animais da mesma espécie. Somente em 1932, com Loewenthal & Jahn, é que surgiu a forma ascítica, ou seja, aquela desenvolvida no peritônio de animais inoculados com células tumorais.  Tumor de Wilms: O tumor de Wilms é o tumor renal maligno mais frequente em crianças. A faixa etária de aparecimento é entre 2 a 4 anos. Frequentemente o tumor aparece apenas em um rim. Em cerca de 5% dos casos pode haver tumor bilateral, comprometendo os dois rins.  Walker 256: O carcinossarcoma 256 de Walker, descoberto por Walker em 1928 a partir de um adenocarcinoma de mama em rata, é mantido em vários laboratórios, por sucessivas inoculações. É um dos poucos modelos de tumores, disponíveis para estudos experimentais nas áreas médicas e biológicas em diferentes linhas de pesquisa. Esse tumor tem a vantagem de ser facilmente obtido "in vivo" pela inoculação de células em ratos, desenvolve-se rapidamente e falhas de inoculação e regressão espontânea são pouco freqüentes. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 1.1 HISTÓRIA DA QUIMIOTERAPIA ............................................................................. 1 xxvi 1.2 COMO AGE A QUIMIOTERAPIA .......................................................................... 8 1.2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS AGENTES CITOTOXICOS ............................................ 11 1.3 USOS CLÍNICOS DA QUIMIOTERAPIA ............................................................. 16 1.3.1 EFEITOS ADVERSOS DA QUIMIOTERAPIA .................................................. 17 1.3.2 RESISTÊNCIA A FÁRMACOS ANTITUMORAIS ........................................... 17 1.3.2.1 CAUSAS DA RESISTÊNCIA A ANTITUMORAIS........................................ 18 1.3.3 RESISTÊNCIA À CISPLATINA ........................................................................ 24 1.3.3.1 FUNÇÂO DA GSH NA RESISTÊNCIA À CISPLATINA ................................... 25 1.3.4 A IMPORTÂNCIA DA ELETROQUÍMICA NA QUIMIOTERAPIA ................... 28 1.3.4.1 SENSORES E BIOSENSORES ELETROQUÍMICOS .................................. 30 1.3.4.2 ELETROQUÍMICA NA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS ANTINEOPLÁSICOS .................................................................................................... 33 1.3.4.3 ELETROQUÍMICA NO ESTUDO DE INTERAÇÕES COM FÁRMACOS QUIMIOTERÁPICOS .................................................................................................... 35 1.3.4.4. MONITORAMENTO DE FÁRMACOS ANTITUMORAIS EM CULTIVOS DE CÉLULAS CANCERÍGENAS ........................................................................................ 36 1.3.4.5. QUÍMICA E ELETROQUÍMICA DA CISPLATINA E SEUS ANÁLOGOS .... 37 2 OBJETIVO ............................................................................................................. 41 3 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 42 3.1 REAGENTES E SOLUÇÕES .............................................................................. 42 3.2 PREPARAÇÃO DO BIOSSENSOR À BASE DE PASTA DE CARBONO MODIFICADA ............................................................................................................... 42 3.3 MEDIDAS ELETROQUÍMICAS .......................................................................... 43 3.3.1 BIOSSENSOR...................................................................................................... 43 3.3.2 SENSOR IMPRESSO ......................................................................................... 44 3.4 MEDIDAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS ........................................................... 45 3.8. ESTUDO DA SELETIVIDADE DO BIOSSENSOR ............................................. 46 3.9. APLICAÇÃO DO SENSOR IMPRESSO UTILIZANDO AMOSTRAS DE SORO SANGUÍNEO ................................................................................................................. 46 3.10. ANÁLISE EM HPLC DAS AMOSTRAS DE SORO SANGUÍNEO .................... 47 4 RESULTADOS E DISCUSÃO ................................................................................ 47 4.1 DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR PARA DETECÇÃO DE CISPLATINA BASEADO NA IMOBILIZAÇÃO DA GST EM PASTA DE CARBONO . 47 4.1.1 ESTUDOS PRELIMINARES EM ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS ............. 47 xxvii 4.1.2 ESTUDO ELETROQUÍMICO DA RESPOSTA DO BIOSSENSOR Á BASE DE PASTA DE CARBONO MODIFICADA COM GST NA PRESENÇA DE CISPLATINA .. 51 4.1.3 QUANTIFICAÇÃO DE CISPLATINA NO BIOSSENSOR PROPOSTO POR TECNICAS VOLTAMÉTRICAS DE PULSO. ................................................................ .57 4.1.4 AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DE ESTABILIDADE E SELETIVIDADE DO BIOSSENSOR ........................................................................................................ 67 4.1.5 ESTUDO DA RESPOSTA DO BIOSSENSOR FRENTE À ALGUNS MÉTABOLITOS PRESENTES NA SANGUE ................................................................ 71 4.2 ELETRODO DE CARBONO IMPRESSO MODIFICADO COM MWCNT NA DETECÇÃO DA CISPLATINA ..................................................................................... 73 4.2.1 CARACTERIZAÇÃO ELETROQUÍMICA DO SENSOR ................................... 73 4.2.2. INFLUÊNCIA DO ELETROLITO SUPORTE E pH NO SENSOR MWCNT- COOH/SDS/SPE ........................................................................................................... 76 4.2.3. OTIMIZAÇÃO DO SURFACTANTE UTILIZADO ............................................. 77 4.2.4 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DO MÉTODO PROPOSTO À BASE DE MWCNT-COOH/SDS/SPE ............................................................................................ 80 4.2.5 MECANISMO PROPOSTO PARA A DETERMINAÇÃO DA CISPLATINA .......... 86 4.2.6. APLICAÇÃO DO SENSOR EM AMOSTRAS DE SORO BIOLÓGICO ............... 89 5. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 93 REFERENCIAS ................................................................ Erro! Indicador não definido. 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 HISTÓRIA DA QUIMIOTERAPIA O câncer é definido como uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de células transformadas. A palavra câncer de origem latina, tem como significado “caranguejo”, possivelmente em analogia ao modo de crescimento infiltrante, que pode ser semelhante às pernas do crustáceo, as quais se introduzem na areia para se fixar e dificultar sua remoção. (ALMEIDA et al., 2005). O tratamento contra o câncer envolve procedimentos tais como cirurgia, radioterapia e terapias sistemáticas. Em etapas iniciais da doença com pacientes de baixo risco, uma simples cirurgia é suficiente, mas em muitos casos o uso de fármacos citotóxicos ou combinação destes é requerido. Dentro das terapias sistemáticas se encontram a terapia hormonal, terapia direcionada, imunoterapia e quimioterapia (FERNANDO; JONES, 2015). O uso da quimioterapia como tratamento começou no século XX junto com os intentos de encontrar agentes químicos capazes de tratar doenças. Em 1900, o famoso químico alemão Paul Ehrlich desenvolveu fármacos para tratamento de doenças infeciosas. Ehrlich foi o primeiro a documentar com eficácia a atividade de fármacos para tratamento de doenças em animais, como no caso fármacos contendo compostos arsenicais, que foram empregados para o tratamento de sífilis em coelhos. Além disso, Ehrlich também trabalhou, sem muito sucesso, com fármacos citotóxicos para o tratamento do câncer, incluindo o corante anilina e outros agentes alquilantes. (DEVITA; CHU, 2008). Foi Ehrlich quem introduziu o termo quimioterapia, o qual foi definido como o uso de agentes químicos para tratamento de doenças; hoje em dia, o termo mudou apreciavelmente: segundo a American Câncer Society, quimioterapia define o uso de medicamentos especificamente para o tratamento do câncer (American cancer society, 2015). Nas primeiras décadas do século XX foram desenvolvidos os primeiros modelos de câncer em animais, envolvendo os tumores ascítico de Ehrlich e Walker 256, e os sarcomas 37 e 180 (DEVITA; CHU, 2008), em decorrência, principalmente, do desenvolvimento do primeiro sistema de transplante de células tumorais em roedores 2 por George Clowes do Roswell Park Memorial Institute em Buffalo, New York. Esse avanço permitiu a padronização do sistema de modelos, o que permitiu que um grande número de fármacos viesse a ser testado contra os cânceres. Em 1935, o National Cancer Institute dos USA organizou um programa, sob orientação de Murray Shear, para uso daqueles “modelos de câncer” para testes de possíveis fármacos, e aquele programa foi o primeiro a testar um amplo número de compostos, incluindo produtos naturais. O projeto contava com colaboradores internacionais e interinstitucionais, porém os cientistas que empreenderam aqueles estudos não possuíam ainda as informações e a experiência necessária sobre como realizar testes químicos in vivo, e em decorrência disso, dos 3.000 compostos testados com o modelo murine S37, resultou que 2.998 deles tiveram de ser abandonados devido à sua alta toxicidade, enquanto que dois não apresentaram ação antitumoral. A falha do programa de Shear e o contemporâneo sucesso do tratamento hormonal de homens com câncer de próstata por Charles Huggins (Prêmio Nobel de Medicina em 1966) levou muitos cientistas ao ceticismo, que passaram a questionar a eficácia do uso de produtos químicos no tratamento de cânceres (DEVITA; CHU, 2008). De fato, foi uma catástrofe que abriu definitivamente o estudo sistemático da possiblidade de os produtos químicos serem usados no controle do câncer. Durante a Segunda Guerra Mundial havia sido desenvolvido um composto químico a base de enxofre (gás mostarda), que por acidente contaminou as tropas em Bari Harbor. Neste acidente foi observado o atrofiamento das glândulas linfáticas e problemas na medula óssea das pessoas afetadas. O estudo clínico do gás mostarda foi então realizado por muitos cientistas que examinaram os possíveis efeitos terapêuticos deste gás. Experimentos em roedores foram conduzidos transplantando células de tumor linfoide e tratando com “mostarda nitrogenada”. Diante dos resultados satisfatórios, o gás mostarda nitrogenado foi administrado em um paciente com Linfoma no-Hodgkin e com obstrução severa nas vias aéreas. O resultado foi uma notável regressão da doença no paciente, e assim, foram realizados outros testes em humanos com linfoma, obtendo- se os mesmos resultados. Ainda em meados da Segunda Guerra Mundial foi identificado o ácido fólico, um composto presente em vegetais de folhas verdes, que é importante para o funcionamento da medula óssea. Farber, Heinle and Welch testaram 3 o ácido fólico em pacientes com leucemia, e chegaram à conclusão que ele acelerava o crescimento das células de leucemia. Diante disso, os cientistas desenvolveram análogos do ácido fólico, a aminopterina e ametopterina, agora conhecidos como metotrexato, os quais foram antagonistas do folato. Este fármaco foi testado em crianças com leucemia, obtendo-se resultados de remissão inquestionável. Baseando- se nestes estudos foram desenvolvidos dois fármacos que são importantes no tratamento da leucemia aguda: 6- tioguanina e 6-mercaptopurina. Entre 1943-1944 começaram as pesquisas sobre sínteses e testes de compostos alquilantes, tais como o clorambucil e a ciclofosfamida. Foi nesse período que a cisplatina foi sintetizada por Michele Peyrone em Turim, Itália. Este composto foi conhecido como o "cloreto de Peyrone", e suas propriedades antiproliferativas foram observadas por Barnett Rosenberg na Universidade do estado de Michigan, através de estudos com complexos de coordenação de platina (LEBWOHL, 1998). Estes fármacos entre outros, foram empregados no tratamento da leucemia e usados em doenças como herpes viral, gota e como agentes imunossupressores em transplante de órgãos. Como resultado deste importante descobrimento, estes pesquisadores ganharam o prêmio Nobel de medicina em 1988. (DEVITA; CHU, 2008). Na metade dos anos 1950, Charles Heidelberger e colegas da Universidade de Wisconsin desenvolveram um fármaco para o câncer colorretal. O fármaco foi identificado como a fluoropirimidina 5-fluorouracila (5-FU). Este fármaco representa um dos primeiros exemplos de terapia dirigida, sendo introduzidos no uso clínico em 1958. Entretanto, apesar dos avanços e evidências claras do uso de fármacos ainda se tinha um ceticismo sobre a utilidade clínica na quimioterapia, até que finalmente, um tumor muito raro, o coriocarcinoma, que ocorre na placenta durante a gravidez, foi curado pelo uso do metotrexato. E mesmo com todos os esforços dos médicos e químicos, a quimioterapia na maioria dos centros médicos ainda não era bem vista, pois os produtos químicos ainda eram vistos como venenos (DEVITA; CHU, 2008). Skipper e colaboradores estudaram camundongos portadores de células L1210 de leucemia, em meados de 1960 sugeriram que seria necessária apenas uma célula sobrevivente ao tratamento do tumor, para desenvolver de novo a doença e matar os 4 camundongos. Os cientistas basearam-se nestas observações e nas hipóteses de morte celular, para afirmar que a dose de fármaco administrada vai depender da fração constante de células tumorais presentes no começo de cada tratamento. Estas observações mudaram a administração das doses de quimioterapia além de propor combinações de fármacos para o tratamento. Juntamente com Freireich e outros, Skipper estudou crianças com a doença, descobriram a eficácia dos alcaloides da vinca, a vincristina e a vimblastina, e desenvolveram o programa de tratamento conhecido como VAMP, acrônimo da mistura dos produtos químicos Vincristina, Ametopterina, 6-Mercaptopurina, e Prednisona. Os clínicos especializados em câncer tiveram ainda o desafio de tornar o tratamento mais fácil, superando as deficiências causadas pela doença e a toxicidade da quimioterapia, através do uso de transfusões de plaquetas para prevenir hemorragias e combinações de antibióticos para tratar infecções. Porém, fatos importantes, como o tratamento de leucemia em crianças, a cura da doença de Hodgking, e a cura do linfoma difuso de grandes células B, usando diversos programas como MOPPC (MOstarda nitrogenada com vincristina, Prednisona, ProCarbazina), MOMP (MOstarda nitrogenada com vincristina, Metotrexato, Prednisone) e C-MOPP o qual substituiu a mostarda nitrogenada pela ciclofosfamida, desencadearam a importância da quimioterapia. (DEVITA; CHU, 2008). Em 1972, o prêmio Lasker em pesquisa médica foi dado para os pesquisadores que mostraram provas que o câncer poderia, de fato, ser curado com fármacos. A partir disto, o campo da oncologia médica foi oficialmente estabelecido como subespecialidade da medicina interna, com a quimioterapia como ferramenta. Seguindo os trabalhos sobre linfoma, leucemia e câncer de seio, os pesquisadores Lawrence Einhorn e seu grupo, construíram o Memorial Hospital, onde começaram as pesquisas sobre o câncer testicular fazendo uso de cisplatina, vinblastina e bleomicina. Hoje em dia, os cânceres que têm uma maior taxa de remissão são os linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin, as leucemias linfoblastia aguda e mieloide aguda, e os cânceres de células germinativas, câncer de pulmão de pequenas células, ovário e o coriocarcinoma. Em crianças, os cânceres com uma boa taxa de sobrevivência são a leucemia aguda, o linfoma de Burkitt, e os tumores de Wilm e rabdomiossarcoma 5 embrionário. Embora o tratamento não seja muitas vezes curativo para esses tipos de câncer, tem havido uma melhoria significativa na sobrevida do paciente, livre da progressão da doença. Além disso, vários regimes de quimioterapia são empregados, um deles é a terapia neoadjuvante, que consiste em reduzir o tamanho do tumor primário para facilitar sua remoção, permitindo melhorar o resultado cirúrgico. Hoje em dia, a quimioterapia neoadjuvante tem sido amplamente usada em câncer de ânus, reto, bexiga, esófago e pescoço, além do câncer osteogênico e sarcoma de tecidos moles. De 1990-2007, a incidência e mortalidade do câncer começaram a declinar devido aos avanços no tratamento e diagnóstico precoce (DEVITA; CHU, 2008). 6 Figura 1: Gráfico resumido da história da quimioterapia (baseado em DEVITA; CHU, 2008) 7 Continuação da figura 1. 8 1.2 COMO AGE A QUIMIOTERAPIA As células cancerígenas diferem de células normais por sua capacidade de crescer e sobreviver. Mutações adquiridas pelos proto-oncogenes e genes supressores de tumor promovem a divisão celular, devido à perda da habilidade da célula regular e de realizar seu ciclo normal. As células tornam-se então insensíveis aos sinais que inibem o seu crescimento, e assim conseguem evitar a morte celular. Os quimioterápicos interferem diretamente no DNA ou nas proteínas chaves na divisão celular, causando a morte celular de células que estão em processo de divisão, por meio de sinais de morte celular programada ou apoptoses. (FERNANDO; JONES, 2015). Para entender como agem os fármacos quimioterapeuticos é preciso entender o ciclo de divisão celular. Para manter a homeostase celular no organismo, um número igual de células nasce e morre em uma dada unidade de tempo. Portanto, a divisão celular deve ser equilibrada pela morte celular, ambas as vias sendo igualmente ativas. “Aberrações” nessas vias algumas veces levam ao câncer. O ciclo de divisão celular é muito importante porque os fármacos antitumorais somente exercem sua ação em células que estão dividindo-se ativamente, e é por isso que tanto células normais e cancerosas são atingidas na quimioterapia, ocasionando os chamados efeitos colaterais. O modelo de ciclo celular divide-se em duas etapas, a interfase e a mitose ou cariocinese. A interfase compreende três fases designadas como: G1, S e G2 (Figura 2). Na fase S acontecem as sínteses e a duplicação do DNA. As fases e intervalo ou gap, G1 e G2, separam a fase M (fase onde ocorre a mitose) da fase S e a fase S da fase M. No intervalo G1 a célula cresce continuamente, e são produzidas as sínteses de algumas enzimas imprescindíveis para a fase seguinte, fase S. No G1 é onde se controla uma importante decisão celular: continuar proliferando ou entrar em período quiescente (G0). A G2 é outro ponto de checagem, onde a célula permanece até que todo o genoma seja completamente replicado e reparado antes de ser transmitido às células-filhas. Na fase M ocorre a mitose, levando à separação dos cromossomos, das organelas celulares, e do citoplasma da célula parental em duas 9 células filhas. As células de tecidos que possuem uma renovação rápida são extremadamente sensíveis a agentes ou tratamentos químicos ou físicos (quimioterapia ou radioterapia) que afetam a replicação do DNA. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005). O ciclo celular é regulado pela atividade de quinases dependentes de ciclinas (Cdks, cyclin-dependent kinases). Uma proteína-quinase tem como atividade básica a fosforilação de outras proteínas substratos, em outras palavras, seu papel fundamental é transferir um fosfato do ATP para os aminoácidos serinas ou treoninas de outras proteínas. As Cdks são ativadas e inativadas ao longo do ciclo e são fortemente reguladas pelas proteínas ciclinas, as quais são sintetizadas ao longo de todo o período interfásico e são degradadas rapidamente no final da mitose. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; DEVLIN, 2011). As Cdks desenvolvem sua função de quinases só quando elas conseguem-se ligar as ciclinas, formando um heterodímero Cdk-ciclina. A classificação das ciclinas são por letras (A,B,C,D,E até J) e as Cdks são aproximadamente 8 (Cdk1, Cdk2, Cdk3 até 8). Nos vertebrados, essas ciclinas formam complexos com quatro diferentes tipos de Cdks. As ciclinas D complexam-se com Cdk- 4 e Cdk6, as E com Cdk2, as ciclinas A com Cdk2, e as ciclinas B com Cdk1. Em seguida, os fosfatos ativadores corretos são adicionados por uma quinase ativadora dependente da ciclina (CAK, cyclin-dependent activating kinase), a qual fosforila um aminoácido próximo ao sitio ativo da Cdks, causando uma mudança conformacional que aumenta a eficiência da Cdk em fosforilar proteínas relevantes no ciclo e os fosfatos inibidores que são removidos por uma CDC25 fosfatase para gerar a atividade de Cdk que regula a etapa do ciclo celular. Ao final de cada etapa do ciclo celular, a proteína cíclina do complexo ciclina-Cdk é poliubiquitinada por uma ubiquitina ligase, e a ciclina poliubiquitinada é degradada, desligando a atividade da Cdk associada e permitindo que a via do ciclo celular prossiga para a etapa seguinte da via. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005, DEVLIN, 2011) A inativação do complexo ciclina- Cdk é produzida pela proteína Weel a qual é uma quinase de fase G2/ M que fosforila Cdk1 (conhecida como CDC2, responsável pela fase M) em um sitio inibitório (Pi), impedindo a atividade da Cdk1 e promovendo a entrada da célula na fase M. Os sinais que impedem uma célula de prosseguir para a fase M são gerados por replicação incompleta do DNA e por dano no DNA. Quando a célula está preparada para continuar 10 na fase M, a atividade do complexo é restaurada pela remoção do grupo fosfato inibitório pela proteína fosfatase Cdc25. A Cdc25 é ativada pela proteína pólo-quinase, que também fosforila os sítios ativos. Por outro lado, existe outro tipo de proteínas chamadas de CKIs (Cdk inhibitor proteins), as quais se ligam as Cdks inativando-as. Estas proteínas se encontram principalmente no controle das fases S e G1 do ciclo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005). Na fase G1/ S o substrato que regula as Cdks é a proteína Rb (proteína de sensibilidade ao retinoblatoma), assim denominada por sua deficiência no câncer retinoblastoma (DEVLIN, 2011). Outra proteína chave na regulação do ciclo celular é a p53, a qual é denominada “O guardião do genoma”. Quando acontece uma lesão no DNA celular, a p53 detém o ciclo celular para que a célula repare seu DNA. Se a lesão no DNA for irrecuperável, p53 induz a morte celular por apoptoses. A perda da função de p53 resulta na divisão celular com o DNA danificado, uma propriedade das células do câncer (DEVLIN, 2011). Dessa forma é muito importante compreender como os fármacos quimioterapeuticos agem no ciclo celular. Isso permite que oncologistas realizem as combinações de fármacos que devem ser administradas e também a frequência da administração da dose com base no comprimento das fases celulares (American cancer society, 2015; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; DEVLIN, 2011). 11 Figura 2: Ciclo de divisão celular (os semáforos representam os pontos de checagem do ciclo de divisão celular). Baseado na página: (https://www.youtube.com/watch?t=139&v=iEB8q9aR8#kcellcyclecheckpoints). 1.2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS AGENTES CITOTÓXICOS Muitos fármacos eficazes contra o câncer exercem sua ação sobre as células que se encontram no ciclo celular, e são denominados fármacos de ciclo celular específico e fármacos de ciclo celular não específico. Mais especificamente, a classificação bioquímica denomina alguns dos grupos de agentes citotóxicos mais empregados na quimioterapia como agentes genotóxicos (agentes alquilantes, agentes intercalantes, inibidores de enzimas e inibidores de mitoses) e antimetabólitos.(Figura 3). 12 Figura 3: Ação dos fármacos antitumorais durante o ciclo de divisão celular. Figura baseada em (FERNANDO; JONES, 2015)  Agentes genotóxicos: ligam-se ao DNA ou causam danos indiretamente através da alteração de enzimas presentes na replicação. Deste modo, induzem a apoptose. Estes fármacos dividem-se em: (i) Agentes alquilantes do DNA: são medicamentos que causam danos direto ao DNA através da modificação de suas bases. Isto permite que seja evitada a proliferação de células cancerosas. Estes medicamentos não são específicos e agem em todas as fases do ciclo celular (Figura 4). Os agentes alquilantes são utilizados para tratamento de diferentes tipos de cânceres tais como: leucemia, linfoma, a doença de Hodking, Mieloma multipla e sarcoma, e os câncer de pulmão, seio e ovários. Os medicamentos deste grupo podem causar danos a longo prazo na medula óssea. Em certos casos podem causar leucemia aguda. Por esta razão é importante 13 empregar doses baixas e limitar o tempo de uso. O risco de leucemia depois da administração de agentes alquilantes é aproximadamente de cinco a dez anos depois do tratamento. Alguns exemplos que correspondem a este grupo são as Triazinas: dacarbazina (DTIC) e temozolomida (Temodar®)(LUQMAN, 2005). Os medicamentos à base de platina (cisplatina, carboplatina e oxaliplatina) algumas vezes são vinculados neste grupo, pois destroem as células cancerosas de forma similar. Porém, estes medicamentos possuem menor probabilidade de causarem leucemia no futuro, diferentemente dos agentes alquilantes acima descritos. (LUQMAN, 2005)( American Cancer Society, 2015) (ii) Agentes intercalantes: se ligam aos sulcos na hélice do DNA, interferindo com a atividade da polimerase durante a replicação/transcrição (Figura 4). Dentro deste grupo estão as antraciclinas, as quais são antibióticos, intercalantes de DNA em sequências específicas, criando radicais que causam a quebra da fita. Estes antibióticos são produzidos pelo fungo streptomyces, e também agem sobre as topoisomerases I e II, requeridas para o desenrolamento do DNA na síntese do mesmo. Estes medicamentos agem em todas as fases do ciclo celular e também são empregados no tratamento de vários tipos de câncer. Um ponto a ressaltar, é que estes medicamentos podem causar danos permanentes no coração se forem empregadas altas doses. (LUQMAN, 2005) (iii) Inibidores do fuso mitótico: são fármacos que não alteram a estrutura nem a função do DNA. Os inibidores da mitose com frequência são alcaloides de origem vegetal e outros compostos derivados de produtos naturais (Figura 4). Este grupo de medicamentos consegue impedir a mitose ou evitar com que as enzimas sintetizem proteínas necessárias para a produção de células, afetando assim a divisão celular. Durante a mitose, o DNA da célula é replicado e depois dividido em duas células novas. O processo que separa os cromossomos que foram replicados em duas células necessita de fibras de fuso. Estas fibras estão constituidas por microtúbulos que se unem aos cromossomos replicados e separam uma cópia para cada lado da célula em divisão. Na ausência destas fibras de fuso, a célula não pode se dividir e 14 morre. Agentes inibidores de fuso funcionam de uma maneira dependente do ciclo celular, parando a divisão celular durante a mitose. Os inibidores de mitose exercem sua ação durante a fase M do ciclo celular, e conseguem provocar danos em todas as fases. Estes medicamentos são empregados no tratamento de câncer de seio, de pulmão, mielomas, linfomas e leucemias. Devido à sua natureza, deve-se controlar as doses, pois provoca danos aos nervos periféricos. Exemplos de fármacos são Placlitaxel, vinca alcaloides e o sintético docetaxel (Taxotere®). (CALEI; JONES, 2012; LUQMAN, 2005) (iv) Inibidores de enzimas: Estes compostos bloqueiam a replicação do DNA por meio da inibição de enzimas, como por exemplo, as topoisomerases, as quais ajudam a separar as fitas do DNA para que consigam realizar a cópia. Os Inibidores da Topoisomerase são empregados no tratamento de leucemias, câncer de pulmão, ovários, gastrointestinais, entre outros. Alguns exemplos de inibidores da Topoisomerase I são Topotecan e irinotecan. Inibidores da Topoisomerase II são etopósido (VP-16), mitoxantrona e tenipósido. O tratamento com inibidores da topoisomerase II aumenta o risco de um segundo câncer, a leucemia mielógena aguda (LMA). A leucemia secundaria pode surgir após 2 ou 3 anos após a administração do medicamento. (LUQMAN, 2005)  Antimetabólitos: são análogos estruturais dos metabólitos presentes na natureza envolvidos nas sínteses de DNA ou RNA. Eles geralmente substituem um metabólito que é normalmente incorporado no DNA ou RNA, ou competem com o sitio catalítico de uma enzima chave (Figura 4). Estes agentes causam danos nas células durante a fase S. Alguns exemplos destes tipos de fármaco incluem folatos, pirimidina e purina antagonistas. (i) Folato antagonista ou antifolatos: Folatos são coenzimas requeridas para metilação e necessárias na formação de purinas e timidilatos, como a TMP, timidina monofosfato). Os antifolatos, como o metotrexato, são inibidores de diidrofolato redutase (DHFR), enzima responsável pela redução de diidrofolato (FH2) a tetraidrofolato (FH4). A inibição desta enzima impede a formação de FH4, com 15 consequente acúmulo do substrato inibitório (tóxico), o poliglutamato de FH2, que provoca a interrupção da reação de redução. A ausência de folatos reduzidos impedem a ocorrência das reações de transferência de um carbono essenciais para a síntese de nucleotídeos de purina e de timidilato e, portanto, as sínteses de DNA e RNA. Metotrexato (MTX) é usado para tratamento para leucemia linfocitica aguda, células de linfomas grandes, coriocarcinoma e câncer de seio, bexiga, cabeça e pescoço, como também em doenças inflamatórias (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2012; LUQMAN, 2005). (ii) Antagonista de Pirimidina: Estes compostos bloqueiam a formação de nucleotídeos que contém pirimidinas, ou causam a terminação prematura da replicação do DNA, através da sua incorporação dentro da cadeia crescente de DNA, o que leva à terminação do processo. Os fármacos que pertencem a esta categoria são 5- fluorouracila (5-FU, Adrucil®, Fluorouracil, Efudex®, fluoroplex®), gemcitabina (Gemzar®) (LUQMAN, 2005). (iii) Antagonista de Purina: Estes compostos inibem a síntese de adenina e guanina, e alguns exemplos são acyclovir, 6-mercaptopurina (purinetol®, puri-netol®) e 6- tioguanina. Eles são empregados no tratamento de leucemia linfoide aguda ou leucemia linfoblastica aguda, leucemia mielóide aguda e leucemia mielomonocitica (LUQMAN, 2005). Outros medicamentos empregados no tratamento do câncer são: agentes de diferenciação, terapia hormonal, imunoterapia e corticoesteroides. 16 Figura 4: Ação dos fármacos antitumorais no DNA (baseada em LUQMAN, 2005) 1.3 USOS CLÍNICOS DA QUIMIOTERAPIA O tratamento com quimioterapia depende da história clínica do paciente e características do tumor. Geralmente, a quimioterapia pode ser classificada de acordo com sua finalidade como terapia adjuvante (depois de retirado o câncer mediante cirurgia e pode ajudar a eliminar células restantes) ou neoadjuvante (antes da cirurgia a quimioterapia pode diminuir o tamanho de tumor, facilitando a extirpação). Tratamento de doenças metastáticas tem um objetivo mais paliativo, com algumas 17 exceções. Existe um amplo espectro de sensitividade para quimioterapia que depende dos diferentes tipos de tumor. Como regra geral, as neoplasmas que tem capacidade de dividir-se mais rapidamente, são mais quimo-sensíveis. Resumindo-se, os três objetivos possíveis da quimioterapia são: 1.3.1 EFEITOS ADVERSOS DA QUIMIOTERAPIA A maioria dos agentes anti-neoplásicos atuam de forma não específica, lesando tanto células malignas como benignas. A toxicidade da quimioterapia varia dependendo do agente, doses, caminho, esquema de administração e fatores de predisposição do paciente. Os efeitos secundários podem incluir mielosupressão com leucopenia, trombocitopenia, anemia, ulceração em membranas mucosas e alopecia. Outros efeitos colaterais menos comuns são específicos para cada fármaco, por exemplo, a ocorrência de cistites com hemorragia pelo uso do fármaco Ifosfamida (FERNANDO; JONES, 2015). 1.3.2 RESISTÊNCIA A FÁRMACOS ANTITUMORAIS Resistência à quimioterapia é umas das razões pelas quais muitos tratamentos fracassam, em qualquer tipo de tumor. Em muitos casos, pacientes que inicialmente respondem para quimioterapia apresentam uma perda de resposta, e como resultado o 18 tumor continua seu crescimento. São reconhecidos dois tipos de resistência: a intrínseca, quando não há resposta mesmo no primeiro ciclo do tratamento, e a adquirida, quando surge no segundo ciclo (pós-terapia). 1.3.2.1 CAUSAS DA RESISTÊNCIA A ANTITUMORAIS Alguns destes mecanismos que poderiam ser utilizados pelas células cancerígenas para resistir aos agentes citotóxicos são provavelmente mecanismos de defesa das células normais para combater os ambientes cancerígenos. Dentre estas possíveis causas podem ser citados: -Redução da liberação dos agentes citotóxicos na célula: Quando os tumores aumentam de tamanho, eles precisam de sangue e nutrientes, criando regiões no tumor onde existem células em hipóxia. Nestas regiões, a vascularização é baixa, o que limita a concentração do fármaco que atinge a região (FERNANDO; JONES, 2015). -Diminuição da captação do fármaco: alteração na estrutura ou função da proteína que está envolvida no transporte do fármaco citotóxico afeta a quantidade disponível do fármaco. Por exemplo, um defeito no sistema carregador de redução de folato confere resistência para o fármaco metotrexato (FERNANDO; JONES, 2015). -Diminuição na ativação do fármaco: muitos dos fármacos empregados na quimioterapia são pro-fármacos, que requerem ativação metabólica por meio de enzimas chaves. A carboxilesterase é necessária para a ativação do cloridrato de irinotecano, e para isto precisa da bio-ativação do seu metabólito SN-38; reduzir a expressão da enzima pode causar resistência ao fármaco (FERNANDO; JONES, 2015). -Incremento do fluxo do fármaco: alguns tumores apresentam resistência a certos agentes, e uma razão é devido à presença de proteínas transportadoras que bombeiam ativamente o fármaco para fora das células, como a família ATP-binding cassette, também conhecida como família de ABC. É a maior família de proteínas 19 transportadoras, que tem como função absorção, distribuição e excreção de muitos substratos, que podem ser íons, açúcares, aminoácidos, fosfolipídios, colesterol, peptídeos, polissacáridos, proteínas e fármacos diversos. Até o dia de hoje se tem conhecimento de três tipos de proteínas transportadoras relacionadas com a resistência aos fármacos que são a glicoproteína P, MRPs (proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos), e BRCP (proteína associada à resistência do câncer de seio). Assim, aquelas proteínas têm um papel muito importante na proteção das células contra agentes xenofóbicos, tornando-as resistentes a muitos tipos de drogas (MRD, de Multiple Drug Resistent cells). Por exemplo, na resistência a drogas, o gene MDR-1 codifica para a proteína trans-membrana glicoproteína P, que utilizando a energia proveniente da hidrólise de ATP, promove o efluxo dos fármacos quando o gene está sobreexpressado. A Figura 5 mostra os fármacos eliminados pela glicoproteína P (MASTERS, 1990). Figura 5: Fármacos anticancerigenos transportados (expulsos) pela P-pg. 20 -Alteração em proteínas alvo: Este fenômeno ocorre possível durante o tratamento. Os alvos da terapia podem ser modificados de alguma forma, e deixam de ter qualquer influência celular significativa e, por tanto, não mais serão alvos úteis para se bloquear. Por exemplo, pacientes com câncer de seio, tratados com o anti-estrogênio (tamoxifen), podem adquirir uma resistência endócrina, a qual é caracterizada por uma perda dos receptores de estrogênio nas células tumorais resistentes. Outro exemplo é a topoisomerase, que é vital na replicação do DNA, e, portanto, um dos alvos favoritos dos agentes citotóxicos. A mutação nesta proteína causa a insensibilidade para os fármacos, como o etoposido, o qual está projetado para bloquear a atividade da topoisomerase II. (LUQMAN, 2005) -Aumento na reparação do DNA: A capacidade de reparação do DNA é um processo evolutivo de adaptação das células, para se proteger de radiações perigosas e compostos químicos nocivos, sendo, portanto fundamental para manter as células sadias. O mesmo caminho pode proteger as células cancerígenas contra os letais efeitos da radioterapia e da quimioterapia, resultando em resistência. O reparo do DNA é um tema complexo devido a que são muitas formas nas quais o DNA pode sofrer alterações, envolvendo fitas simples ou duplas, incluindo mutações, danos nas bases, entrecruzamento, entre outros. O reparo de cada tipo de dano necessita de uma estratégia bioquímica diferente, requerendo muitas vezes um grande número de enzimas. (MASTERS, 1990). Por exemplo: o reparo de dano de excisão de uma base requer no mínimo quatro passos: (1) reconhecimento das bases danificadas; (2) recorte da fita de DNA, perto ou no sitio do dano; (3) remoção de qualquer dano na base, e (4) substituição da base danificada. Assim, quaisquer anormalidades nas enzimas como O6-alquilguanina-alquiltransferasa ou alterações nos genes que reparam a excisão do DNA, parecem estar entre as causas de resistência. A sobre-expressão do gene ERCC1 (Excision Repair Cross-Complementing 1), está associada à resistência aos fármacos que contém platina (SÁNCHEZ-SUÁREZ; BENITEZ-BRIBIESCA, 2006). 21 -Incapacidade para sofrer apoptoses: Os tecidos normais, em contraste com os neoplásicos, não adquirem resistência à quimioterapia. Este fenômeno deve-se aos tecidos normais que estão intactos e em bom funcionamento, com toda “maquinaria genética”, que controla os chamados pontos de checagem do ciclo celular e da morte celular programada (apoptoses). Estas checagens não permitem que células com danos no DNA consigam dividir-se, deste modo, interrompem o ciclo celular até que este seja reparado, ou emitem sinais que levam à morte celular programada. A alteração destes sistemas de controle de crescimento celular pode ser uma das causas da resistência aos agentes citotóxicos. O não funcionamento correto destes mecanismos leva uma célula com danos no reparo do DNA a se replicar continuamente, no lugar de deter sua duplicação, contribuindo a erros genéticos. A proteína p53 tem a função de ativar a transcrição do DNA, e, portanto, pode agir como supressor de tumor. Quando a célula é exposta a fármacos que causam danos no DNA, ela age, detendo o ciclo celular ou na fase G1, ou na G2 (Figura 3). Caso o reparo ao DNA não seja mais possível, a proteína p53 induz a apoptose. As mutações no gene que codifica esta proteína são frequentes em tumores humanos, e as alterações na regulação da apoptose e dos pontos de controle do ciclo celular podem ser causas de resistência aos agentes citotóxicos. -Incremento no metabolismo do fármaco e detoxificação: A resistência aos agentes citotóxicos é um problema na quimioterapia. As células cancerígenas usam muitas estratégias para sobreviver aos tratamentos. Além do transporte ativo do fármaco mencionado anteriormente, outro mecanismo importante de resistência merece destaque, a detoxificação de fármacos dentro da célula, usando enzimas de detoxificação da fase II (KARWICKA, 2010). A principal rota de detoxificação oxidativa para fármacos, agrotóxicos, e outros agentes em mamíferos envolve as enzimas P-450 monoxigenases, metalotioneína, e glutiona-s-transferase (HAYAKAWA; UNDENFRIEND; JERINA, 1975). O mecanismo de detoxificação mediado pela enzima glutationa-s-transferase (GSTs), é foco nesse primeiro trabalho, que compreende uma família de enzimas 22 multifuncionais que catalisam o ataque nucleofílico da forma reduzida da glutationa (GSH) a compostos que apresentam um carbono, um nitrogênio ou um átomo de enxofre eletrofílico. Os substratos (eletrófilos) mais comuns das glutationa transferase incluem: haletos de alquila, epóxidos, compostos α,β-insaturados (como quinonas, iminoquinonas aldeídos, cetonas, lactonas e ésteres), haletos de arila e nitro aromáticos. As GSTs geralmente se encontram no meio biológico como homo ou heterodímeros (outros complexos também podem existir), apresentando dois sítios ativos independentes por dímero, um deles muito específico para a glutationa reduzida (GSH), e o outro, com menor especificidade, para os eletrófilos. (HUBER; ALMEIDA; FÁTIMA, 2008). A glutationa reduzida (GSH) (Figura 6), cujo nome químico é ɣ- glutamilcisteinilglicina (ɣ-glu-cys-gly) possui papel central na biotransformação e eliminação de xenobióticos e na defesa das células contra o estresse oxidativo. A GSH é um tripeptídeo que é encontrado intracelularmente em altas concentrações, essencialmente em todos os organismos aeróbicos. A biossínteses da GSH ocorre no citosol da célula de L-α-glutamato (glu), L-ɣ-cisteina (Cys) e glicina (gly) em uma reação de duas etapas, envolvendo ɣ-glutamilcisteina sintetase (ɣ-GCS) e glutationa sintetase (ɣ-GS)(Figura 7), sendo este o mais abundante composto tiol celular de baixa massa molecular; apresentando uma concentração de 2 mmol L-1 e mais de 10 mmol L-1 em eritrócitos humanos e hepatócitos, respectivamente. (HUBER; ALMEIDA; FÁTIMA, 2008). A GSH mantém o estado redox na célula. A grande maioria das reações de GSH envolve o grupo sulfidrila (SH), altamente polarizável, tornando-o um bom nucleófilo para reações com compostos químicos eletrofílicos. Esta habilidade de doar elétrons a outros compostos faz da glutationa um bom redutor. A combinação de sua abundancia nos organismos aeróbicos e das propriedades químicas do grupo sulfidrila suporta a proposta de que o GSH surgiu na evolução bioquímica como uma proteção contra espécies de oxigênio e compostos eletrofílicos gerados por processos oxidativos, tanto no organismo quanto no ambiente em que este vive (HUBER; ALMEIDA; FÁTIMA, 2008). 23 Figura 6: Estrutura química do substrato glutationa reduzida (GSH) A glutationa reduzida reage com as espécies reativas de oxigênio (ROS) formando GSSG, e, então, é transformado de novo à forma reduzida. O stress oxidativo pode afetar esta capacidade de regeneração, e como resultado o GSSG é acumulado no citosol. Este incremento se associa à doenças como estresse mental ou corporal, incremento no esforço físico ou efeitos de compostos tóxicos. Para manter o balanço redox, a GSSG pode ser removida para o exterior da célula ou pode reagir com grupos sulfidrila de proteinas, formando mistura de dissulfetos de proteina e glutationa. De forma similar, a glutationa consegue inativar muitos agentes quimioterapêuticos antes de atingir seu alvo, e estes são expulsos para fora da célula (Figura 7). A reação de conjugação que sofre a GSH com os agentes citotóxicos ocorre espontaneamente por meio da enzima glutationa-s-transferase (KARWICKA, 2010). Em células cancerígenas resistentes aos efeitos dos fármacos anticancerígenos foram encontrados altos níveis de glutationa quando comparadas com células normais devido a um incremento da expressão do gene ɣ-GCS. GSH participa na detoxificação dos fármacos contendo platina, arsênicos, agentes alquilantes (melphalan), antraciclinas (doxorubicina, daurubicina). Além disto, a glutationa favorece processos de reparo ao dano do DNA causados por estes fármacos (KARWICKA, 2010). 24 Figura 7: Mecanismo redox da célula envolvendo as enzimas GSTs e detoxificação da cisplatina (Baseada CHEN; e KUO, 2010) 1.3.3 RESISTÊNCIA À CISPLATINA Atualmente, a cisplatina é usada no tratamento de diferentes tipos de câncer, mas sua eficácia é limitada devido ao fato de que alguns tumores tem uma resistência natural a este fármaco, e outros desenvolvem a resistência durante o tratamento.O mecanismo que explica esta resistência ainda não está bem estabelecido. Porém, alguns estudos têm sido realizados para elucidar os possiveis mecanismos. Dentre eles podem-se citar: i) mudança no transporte do fármaco que leva à disminuição de acumulação do mesmo; ii) inativação pelo sistema de desintoxicação provocada por níveis elevados de proteínas intracelulares contendo grupos tiol, dentre eles, glutationa- 25 S-transferase (GST), metalotioneína (MT) e glutationa reduzida (GSH); iii) aumento de reparação/tolerância de adutos DNA-Pt e iv) mudança nas vias de morte celular por apoptose. Na Figura 8, mostra-se um esquema dos mecanismos relacionados à resistência ao fármaco cisplatina. Figura 8: Resumo dos principais mecanismos considerados na resistência ao agente antitumoral cisplatina. (baseado em Cepeda Victoria et al, 2007). Reparo por excisão de nucleotídeos (NER, Nucleotide Excision Repair), Reparo de pareamentos errados (MMR, Mismatch Repair) 1.3.3.1 FUNÇÂO DA GSH NA RESISTÊNCIA À CISPLATINA A resistência aos fármacos é um elemento chave na falha de agentes anticancerígenos na quimioterapia. A exposição a agentes quimioterápios pode levar à indução e expressão de produtos de genes que protegem a célula tumoral do efeito dos 26 fármacos. Na literatura se tem reportado a função dos GSTs no desenvolvimento de resistência aos agentes quimioterapêuticos, inseticidas, herbicidas e antibióticos microbianos (TOWNSEND; TEW, 2003). No momento, são conhecidos alguns possiveis caminhos que explicam a resistência induzida pela GSTs: (i) Efeitos de GSH no ATP-binding cassette transporter (ABC); (ii) Mecanismo de detoxificação da cisplatina;(iii) regulação de cobre intracelular que afeta a captação do fármaco; (iv) Inibição da via de sinalização JNK (c-junk N-terminal quinases), conduzindo à diminuição na apoptose induzida por cisplatina (TOWNSEND; TEW, 2003; KARWICKA, 2010). Com relação ao efeito do GSH no sistema transportador ABC, é conhecido que esta família de proteínas citoplasmáticas de membrana funciona como bomba de efluxo na eliminação de agentes antitumorais, xenobióticos e constituentes endógenos. Alguns destes transportadores requerem GSH como substrato, podendo ser empregada na reação de conjugação com a cisplatina antes de ser usada como substrato dos transportadores. ISHIKAWA e ALI-OSMAN foram os primeiros a reportar a formação do conjugado Pt(GS)2 em células leucêmicas da linhagem L1210 (ISHIKAWA T; ALI-OSMAN, 1993; KARWICKA, 2010). Nos primeiros estudos relacionados com o mecanismo de detoxificação, foi demonstrado que a resistência à multidrogas está associada com alterações significativas no perfil da enzima dependente de glutationa, e como um resultado deste processo, obtém-se alterações dos níveis de glutationa reduzida. As diferenças nas concentrações de enzimas dependentes de glutationa, tais como GST (Glutationa-s- transferase), gama GT (gama-glutamil transferase) e GPX (glutationa peroxidase), foram observadas em duas linhagens de células de ovário de adenoma tomadas a partir de um único paciente: nas linhagens de células sensíveis (PE01), e após o desenvolvimento da resistência para o clorambucil, cisplatina e 5-fuorouracil, linhagen de células (PE04). Na linhagem resistente à droga (PE04), uma maior atividade das três enzimas e um maior nível de glutationa reduzida (GSH) foram observadas em comparação com a linhagen sensível (PE01). (KARWICKA, 2010) 27 Como mencionado anteriormente a glutationa-s-transferase pertence a uma família de enzimas que catalisam a reação de conjugação de substrato eletrofílico com as moléculas de GSH. A ampla gama de substratos para a GSTcitosólico em humanos resulta do alto grau de polimorfismo e baixa especificidade da ligação formada. Esta propriedade de GST permite metabolização e desintoxicação de diversos substratos, como produtos endógenos da peroxidação lipídica, DNA, peróxidos e xenobióticos (cancerígenos, impurezas e fármacos) (Figura 9) ( KARWICKA, 2010). Figura 9: Mecanismo representativo da detoxificação do cisplatina (adaptado de TOWNSEND.; TEW, 2003). A GST é o principal tema de estudos sobre resistência à múltiplas drogas em câncer. No entanto, outras enzimas que participam na síntese de GSH e do metabolismo também estão envolvidas na resposta da célula ao efeito de quimioterápicos. Nas condições de aumentar a expressão GST, também aumentam os níveis de atividade de outras enzimas como, GPX e γ-GT. Além disso, a GST tem sido haletos de alquila, epóxidos, compostos α,β- insaturados (como quinonas, iminoquinonas aldeídos, cetonas, lactonas e ésteres), haletos de arila e nitro aromáticos, fármacos citotóxicos como cisplatina. 28 proposta como um possível “target” terapêutico e pode desempenhar um papel importante na etiologia de outras doenças, incluindo doenças degenerativas, escleroses múltiplas e asma (TOWNSEND; TEW, 2003). Um aumento nos níveis das GST encontra-se relacionado com os transportadores de cobre. CHEN e KUO, 2010, demonstraram que os níveis elevados de GSH, por si só podem sensibilizar toxicidade à cisplatina. A elucidação da produção de GSH que funciona como um quelante de cobre na regulação do seu transportador hCTR1 (human copper transporter 1) tem implicações importantes na quimioterapia do câncer, utilizando agentes antitumorais à base de platina. A relação entre as GST e a via da MAP–quinases (via de sinalização, MAP- quinase, Mitogen Activated protein kinase, Proteina-quinase ativadas por mitógenos) fornece a explicação do porquê outras drogas não estão sujeitas a conjugação com GSH, e do porquê não são substratos para as GST. Muitos agentes anticancerígenos induzem apoptose através da ativação da via da MAP- quinases, especificamente por meio de JNK e p38. Dentre os agentes antitumorais que requerem ativação da JNK por citotoxicidade tem-se a cisplatina. A inibição da via de sinalização JNK, conduz à diminuição na apoptose induzida por cisplatina, enquanto que a sobre-expressão de c- jun aumenta a sensibilidade celular para a cisplatina (POTAPOVA et al.,1997).Em resumo, elevados níveis de GST estão associados com o incremento da resistência à apoptose iniciada por uma variedades de estímulos (KARTALOU; ESSIGMANN, 2001). Estes dados são consistentes com a GST atuando como inibidor da via MAP–quinase. 1.3.4 A IMPORTÂNCIA DA ELETROQUÍMICA NA QUIMIOTERAPIA Nos últimos anos foiá incrementado o número de pacientes que são submetidos à quimioterapia. Dado a alta toxicidade destes fármacos precisa-se de ferramentas analíticas que permitam as análises de estes compostos citotóxicos com a finalidade de conseguir monitorá-los em sistemas ambientais, ou um objetivo mais ambicioso na 29 procura de conseguir estudar o metabolismo destes em pacientes ou profissionais expostos a estes compostos (NUSSBAUMER et al, 2011). Os primeiros métodos desenvolvidos para monitorar estes fármacos estão baseados em cromatografia com detecção UV (LC-UV), espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN), espectrometria de massas, espectroscopia Raman, cromatografia de gases, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) entre outras. (NUSSBAUMER et al, 2011). Estes métodos apresentam um bom desempenho para análises de amostras contendo elevadas concentrações. Porém, para baixas concentrações de agentes citotóxicos ou amostras complexas (biológicas ou meio ambientais), é necessário o tratamento da amostra, por exemplo, como um clean-up e pré-concentração, de forma tal, que a amostra possa ser analisada, além dos altos custos das análises e necessidade de pessoal qualificado, devido à complexidade dos equipamentos. (NUSSBAUMER et al. 2011). Os métodos analíticos são muito importantes na oncologia para: 1. Controle de qualidade de formulações comercializadas; 2. Estudo de liberação controlada de fármacos; 3. Análises de agentes citotóxicos em amostras biológicas; 4. Desenvolvimento de novos fármacos e formulações; 5. Monitoramento do fármaco na terapia; 6. Monitoramento de profissionais da saúde expostos aos agentes citotóxicos; 7. Análises de agentes citotóxicos em amostras ambientais, águas residuais (os fármacos citotóxicos são excretados pela urina, além disto, não se tem um controle rígido dos resíduos hospitalares relacionados com estes fármacos). Para cumprir com as funções mencionadas anteriormente, os métodos eletroquímicos nos últimos anos têm sido bem explorados através do uso de técnicas voltamétricas com grande diversidade de eletrodos modificados. De modo muito geral os conceitos básicos de sensores e biossensores eletroquímicos junto com alguns 30 exemplos, mostram que a eletroquímica apresenta-se como uma ótima ferramenta na quimioterapia. 1.3.4.1 SENSORES E BIOSENSORES ELETROQUÍMICOS Sensores e biossensores eletroquímicos têm apresentado extensas aplicações em diversas indústrias. Hoje em dia, muitos instrumentos analíticos utilizados no ambiente, alimentos, produtos farmacêuticos, também clínicas ou laboratórios e alguns dispositivos já comercializados point-of-care funcionam usando estes sensores. É bem conhecido que o primeiro biossensor amperométrico para glicose foi desenvolvido por Clark empregando como enzima glicose oxidase fisicamente imobilizada em uma membrana de cuprofano (celulose recuperada), conforme mencionado por FATIBELLO; CAPELATO (1992). Desde então, os biossensores de glicose amplamente empregados em glicosímetros são um importante exemplo dos sensores eletroquímicos de sucesso. Primeiramente, deve-se definir alguns termos empregados neste trabalho como, o que é um sensor e um biossensor? Que são eletrodos quimicamente modificados? Quais são as técnicas mais empregadas na detecção de fármacos? FARIDBOD, GUPTA e ZAMANI (2011) denominaram como sensores eletroquímicos aos dispositivos que transformam informações eletroquímicas em um sinal analiticamente útil. Estes compostos possuem dois componentes básicos, um sistema de reconhecimento químico (molecular), que é a parte mais importante do sensor e um transdutor fisicoquímico. O transdutor é um dispositivo que converte a resposta química em um sinal que pode ser detectado por meio de instrumentação elétrica moderna. Estas duas partes formam um eletrodo de trabalho (sensor) que juntamente com o eletrodo de referência e o auxiliar formam o sistema eletroquímico. Por outro lado, FATIBELLO e CAPELATO (1992), definiram os biossensores como um sensor que utiliza um material biológico (enzimas, anticorpo, antígeno, organismos, tecidos animais e vegetal, células, organelas, etc.), conectado a um transdutor (qualquer dispositivo capaz de transformar um tipo de sinal em outro) o qual converte um tipo de sinal 31 biológico em sinal elétrico. Uma das classificações dada aos sensores e biossensores é baseada no tipo de transdutor empregado. Nos últimos anos, tem se intensificado o uso dos sensores voltamétricos os quais empregam técnicas voltamétricas (BATCHELOR-MCAULEY, 2012). A voltametria permite obter informações eletroquímicas de um ou vários analitos, através da medição da corrente em função do potencial aplicado. Vários tipos de experimentos podem ser realizados para reunir informações como voltametria cíclica, voltametria de onda quadrada, voltametria de pulso diferencial e redissolução para citar algumas técnicas comuns. (KIMMEL et al, 2012). A voltametria cíclica é uma das voltametrias mais amplamente empregadas, sendo muito útil para se obter informações sobre o potencial redox e reações eletroquímicas do analito de interesse. Neste caso, ocorre a varredura de potencial entre dois pontos de valores V1 (inicial) e V2 (final) com uma taxa fixa. No entanto, quando o potencial atinge V2 a varredura é invertida e o potencial retorna para V1. A velocidade de varredura,  = (V2-V1)/(t2-t1), é um fator crítico, desde que a duração de uma varredura deve ser suficiente para permitir que a reação ocorra. O potencial medido entre o eletrodo de referência e o eletrodo de trabalho, enquanto a corrente circula entre o eletrodo de trabalho e contra-eletrodo. (GRIESHABER, D. et al.,2008). Por outro lado, existem as técnicas de pulso, entre elas voltametria de onda quadrada e voltametria de pulso diferencial. Estas técnicas de pulso foram desenvolvidas inicialmente para o eletrodo de gota de mercúrio e consiste em aplicar um pulso de potencial, deste modo, a corrente capacitiva extingue-se mais rapidamente do que a corrente faradáica, assim, a corrente é medida no final do pulso. Melhorando consideravelmente a sensibilidade do método, e consequentemente, o limite de detecção e de quantificação, por esta razão, são amplamente empregadas em análises farmacêuticas e detecção de traços de metais. (BRETT; BRETT, 1996; LOCATELLI, 2007). Para análises de fármacos, a voltametria de redissolução adsortiva (AdSV) é muito popular, uma vez que permite obter baixos limites de detecção (alcançando quantidades na ordem de g L-1). Adicionalmente, destaca-se o relativo baixo custo de 32 instrumentação, quando comprado com outros métodos comumente empregados. Voltametria de redissolução adsortiva tem num primeiro passo uma pré-concentração na superfície do eletrodo, a qual é uma vantagem frente aos métodos voltamétricos convencionais. Para análises de traços de compostos orgânicos ou inorgânicos, o composto será acumulado na superfície do eletrodo de trabalho, seguido de um processo de oxidação (voltametria de redissolução anódica) ou por meio de redução (voltametria de redissolução catódica). As técnicas de redissolução empregam diferentes tipos de eletrodo de trabalho, por exemplo, eletrodo de gota de mercúrio (HMDE), gota de mercúrio estática (HMDE), eletrodo de platina, eletrodo de pasta de carbono (CPE), eletrodo de carbono vítreo, eletrodo de cera impregnada (WIGE) ou eletrodo quimicamente modificado (CME), entre outros (EL-MAALI, 2004). Materiais baseados em carbono na forma de grafite, carbono vítreo, diamante, etc. desempenham um papel muito importante no desenvolvimento de eletrodos sólidos por várias razões: (i) O carbono tem uma ótima superfície química e uma cinética de oxidação lenta do carbono, conduzindo assim a uma ampla faixa de potencial útil, especialmente em direção anódica. Esta é uma importante vantagem sobre os eletrodos metálicos. (ii) Eletrodos baseados em carbono exibem também as mais baixas correntes de fundo na região anódica. (iii) Além disso, possuem baixo custo, e estão disponíveis em uma ampla variedade de formatos (USLU; OZKAN, 2014). Eletrodo quimicamente modificado é definido pela IUPAC, como um eletrodo feito de um material condutor ou semicondutor que é coberto com um filme monomolecular ou multimolecular, iônica ou polímérico, que por meio de reações faradáicas (transferência carga) ou diferentes potenciais interfaciais (sem transferência de carga) exibirá uma resposta na presença de uma sustância específica. Os processos no eletrodo quimicamente modificado (CME) não são puramente uma acumulação adsortiva, também pode ocorrer quimissorção, através de certas reações no CME sob condições controladas (EL-MAALI, 2004). 33 1.3.4.2 ELETROQUÍMICA NA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS ANTINEOPLÁSICOS Análise de fármacos é um importante ramo da química analítica, que tem um papel essencial no controle de qualidade. Além disso, seu monitoramento é importante para melhorar as doses terapêuticas em pacientes, e deste modo controlar os efeitos secundários, melhorando a eficácia do tratamento e a qualidade de vida do paciente. Em relação aos profissionais da saúde encarregados de administrar as doses terapêuticas e que são expostos a esses agentes antineoplásicos, pela inalação de aerossóis ou pós, ou por contato direto com a pele, a qual é considerada como a principal via de exposição, é evidente a importância do monitoramento contínuo nestas pessoas. Adicionalmente, desde a perspectiva do meio ambiente, necessita-se monitorar estes fármacos de ação anticancerígena dada sua alta toxicidade (SORSA; HEMMINKI; VAINIO, 1985; SORSA; ANDERSON, 1996; TURCI et al, 2006). Portanto, o desenvolvimento de um método sensível, simples, rápido, exato e confiável para determinação desta classe de princípios ativos é de grande importância e de interesse da saúde pública. BAGHERI E HOSSEINI (2012) estudaram o comportamento eletroquímico e o mecanismo redox do raloxifeno (RLX) usado para prevenção de câncer de seio em mulheres pôs-menopáusica e osteoporoses na superfície do eletrodo de carbono vítreo (GCE). A voltametria de pulso diferencial permite a detecção do RLX em amostras de plasma humano e formulações farmacêuticas. (BAGHERI, HOSSEINI, 2012). Com o propósito de miniaturizar e obter sensores ou biossensores portáteis para monitoramento de fármacos, eletrodos impressos (SPEs) têm sido utilizados com sucesso no desenvolvimento de sensores eletroquímicos para detecção de vários compostos farmacêuticos. Isso por que, os SPEs apresentam caraterísticas vantajosas como possibilidade de portatibilidade, baixo custo, fabricação fácil e em grande escala, modificação versátil, e rápida detecção dos fármacos em diversas matrizes sem tratamento prévio da amostra, excelente limite de detecção, robustez, e, além disso, estes dispositivos estão destinados a análises de micro-volumes de amostra (de 20 – 100 μL) (COUTO; LIMA; QUINAZ, 2015). 34 PRANJAL CHANDRA e colaboradores (2011) empregaram eletrodos impressos modificados com uma sonda de fita dupla de DNA (dsDNA) e cardiolipina (CL) para análises de alguns fármacos citotóxicos. O biossensor amperométrico permitiu a detecção simultânea de daunomicina (DAN), doxorubicina (DOX), idarubicina (IDA), e mitoxantrona (MIT), fazendo uso da propriedade das antraciclinas de interagir com o dsDNA de maneira est