UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CAMPUS DE ARAÇATUBA - FACULDADE DE ODONTOLOGIA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTICÊNTRICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS ANGELA CRISTINA DE NICOLA ATUAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO RELÓGIO NA SENESCÊNCIA REPRODUTIVA DE RATAS WISTAR ARAÇATUBA 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CAMPUS DE ARAÇATUBA - FACULDADE DE ODONTOLOGIA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTICÊNTRICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS ATUAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO RELÓGIO NA SENESCÊNCIA REPRODUTIVA DE RATAS WISTAR Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de doutora em Ciências Fisiológicas. Área de Concentração: Fisiologia Orientada: Angela Cristina de Nicola Orientadora: Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles Co-orientadora: Profª Drª Maristela de Oliveira Poletini ARAÇATUBA 2017 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Nicola, Angela Cristina de. N634a Atuação das proteínas do relógio na senescência reprodu- tiva de ratas Wistar / Angela Cristina de Nicola. – Araçatuba, 2017 114 f. : il. ; tab. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Rita Cássia Menegati Dornelles Coorientadora: Profa. Maristela de Oliveira Poletini 1. Núcleo supraquiasmático 2. Envelhecimento 3. Ritmo circadiano 4. Eixo hipotálamo-hipófise-gônadas 5. Clock genes I. T. CDD 612 Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550 FOLHA DE APROVAÇÃO Angela Cristina de Nicola Atuação das proteínas do relógio na senescência reprodutiva de ratas Wistar Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós- graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de doutora em Ciências Fisiológicas. Área de Concentração: Fisiologia Orientadora: Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles Co-orientadora: Profª Drª Maristela de Oliveira Poletini Sessão Pública: 12/12/2017 Banca Examinadora: Prof. Dr. Rita Cássia Menegati Dornelles – UNESP - Araçatuba Prof. Dr. Maristela de Oliveira Poletini – UFMG Prof. Dr. Grace Schenatto Pereira Moraes Instituição: Univeridade Federal de Minas Gerais - UFMG Prof. Dr. Luciana Pinato Instituição: Faculdade de Filosofia e Ciências de Marília – FFCM/UNESP Prof. Dr. Rovena Clara Galvão Januário Engelberth Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Prof. Dr. Cristiane Mota Leite Instituição: Universidade Norte do Paraná - UNOPAR DADOS CURRICULARES Nascimento: 12.11.1983, Birigui - SP Filiação: Vitor de Nicola Eurides Garbuio de Nicola 2003/2006: Curso de Graduação em Licenciatura para Ciências Biológicas Fundação Educacional de Penápolis – FUNEPE – Penápolis – SP. 2008/2010: Curso de Pós-Graduação Latu-Sensu em Planejamento Ambiental - Fundação Educacional de Penápolis – FUNEPE – Penápolis – SP. 2011/2013: Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP. 2013/2017: Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Fisiológicas, nível de Doutorado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP. DEDICATÓRIA A Deus, pelo dom concedido A minha família, pelo apoio incansável AGRADECIMENTOS À UNESP – Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de realizar este curso. Ao Diretor da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Prof. Titular Wilson Roberto Poi pelo apoio. Ao apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa de mestrado e à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado se São Paulo) pela concessão do auxílio à pesquisa. À FUNDUNESP (Fundação para Desenvolvimento da UNESP) e a Pró-Reitoria de Pós-graduação da UNESP (PROPG-UNESP) pelo apoio financeiro durante as viagens para realização de disciplinas. A todos os funcionários da UNESP, que de acordo com suas funções, prestaram sua importante parcela de contribuição nos diferentes estágios de realização desta pesquisa. Ao Prof° Emérito da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Dr° José Antunes Rodrigues, pela acolhida e valiosa colaboração de seu laboratório. Ao Prof. Dr° João César Bedran de Castro pelos pareceres semestrais emitidos nos relatórios. À Profª Drª Maristela de Oliveira Poletini pela co-orientação. A todos os professores do Departamento de Ciências Básicas. Aos novos amigos do laboratório de Neuroendocrinologia da Faculdade de Medicina da USP/Ribeirão Preto, sob a direção dos Professores Dr José Antunes Rodrigues e Dra Lucila Leico Kagohara Elias. Às técnicas Maria Valci Aparecida dos Santos, Milene Mantovani Mata e Marina Holanda pelo suporte. À Drª Tatiane Vilhena Franco (FMRP/USP) por toda ajuda na realização das imunohistoquímicas. AGRADECIMENTOS À Drª Cristiane Mota Leite pelo empréstimo das sondas de qPCR para realização de testes do gene para Kiss1, Kiss1-r, AVPR1a À Drª Gloria Hoffman (Morgan State University/Baltimore/USA) por todos esclarecimentos e orientações prestados via email. Ao Prof° Celso Rodrigues Franci pela gentil dosagem hormonal realizada. Aos meus antigos e recém-chegados amigos de laboratório, pela companhia de todas as horas. Ao técnico Fauze Ribas de Toledo, que prestou valorosa contribuição na confecção do sistema de iluminação utilizado durante os experimentos do período noturno. À Professora Dra Margaret de Castro da divisão de Endocrinologia do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, que gentilmente cedeu alíquota de sonda para nossos testes de qPCR. Ao Professor Dr. Eduardo Santos da UFMG pelo auxílio e esclarecimento de dúvidas sobre as análises circadianas. Aos meus amigos Leandro dos Santos Figueiredo, Sabrina Tristão e Susana Quiros Cognuck por sempre cederem um espaço em suas casas para que eu me hospedasse durante a realização dos experimentos no departamento de Fisiologia da FMRP/USP A todos que direta ou indiretamente fizeram parte das novas descobertas aqui relatadas. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu eterno companheiro, hoje marido, Dennis, que incondicionalmente soube compreender minhas ausências e incansavelmente apoiou-me nesta caminhada. A meus pais, por seus impagáveis incentivos e socorro diante dos obstáculos encontrados. As minhas “pequenas”, por cederem suas vidas em prol de novas descobertas científicas. A minha orientadora Drª Rita Cássia Menegati Dornelles, que desde o mestrado deu- me a oportunidade de tê-la como minha dirigente na busca pelo conhecimento científico, cuja confiança no bom desenvolvimento da pesquisa a mim confiada, o apoio diante dos desafios e o cuidado, que como orientadora, sempre dispendeu para a boa formação acadêmica de seus alunos. À Drª Maristela de Oliveira Poletini (UFMG/MG), que prontamente aceitou nosso convite de co-orientação deste trabalho. A DEUS principalmente, que me proporcionou chegar até aqui, tornando-me capaz de realizar um bom trabalho e proveu-me de espírito investigativo em busca do conhecimento que move um cientista. “O cientista não é o homem que fornece as verdadeiras respostas; é quem faz as verdadeiras perguntas” (Claude Lévi-Strauss) RESUMO NICOLA, AC. Atuação das proteínas do relógio na senescência reprodutiva de fêmeas Wistar. 2017. 114f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2017. O envelhecimento é considerado processo multidimensional no qual fatores ambientais podem proteger ou, inversamente, agravar seus sinais, de maneira não linear, nos processos fisiológicos e neurocomportamentais. Durante este processo, os ritmos circadianos são interrompidos ou fragmentados com dissociação consequente dos ritmos circadianos do indivíduo e disfunções relacionadas ao relógio circadiano contribuem para o envelhecimento e para patologias a ele relacionadas. O objetivo deste estudo foi averiguar possível alteração temporal do sistema CLOCK no eixo HPG e a relação com às alterações hormonais que caracterizam a periestropausa. Foram utilizadas fêmeas adultas com ciclo estral regular (CD) na fase do diestro e fêmeas senis com ciclo estral irregular e persistência da fase do diestro (IDP). Para análises de expressão gênica dos clock genes Per2, Rev-erbα e Bmal1 no eixo HPG, foram utilizados punchs das regiões do NSQ, onde também foi analisado RNAm de AVP, APO e HMB destes animais, além da adenohipófise e ovários dos quais se extraiu o RNA para confecção do cDNA e realização de qPCR. A determinação da atividade neuronal vasopressinérgica no NSQ foi realizada por imunoistoquíca com dupla marcação para cFos e AVP em tecido previamente fixado com paraformaldeído. A concentração plasmática de gonadotrofinas foi determinada por radioimunoensaio. De modo geral, os animais IDP revelaram alterações no perfil de expressão gênica durante o fotoperíodo, com redução de amplitude, deslocamento/desalinhamento de fase e ausência de antifase. O NSQ de animais IDP apresentou menor expressão de Rev-erbα e maior expressão de RNAm para AVP em relação ao grupo CD. A quantificação relativa de Bmal1 foi semelhante em ambos os grupos e não houve diferenças entre grupos na expressão de Per2. Na APO, animais IDP apresentaram maior expressão de Per2 e menor quantidade de RNAm para Rev-erbα. No HMB observou-se menor expressão para Per2 e Rev-erbα e maior expressão de Bmal1 nas fêmeas IDP. Per2 e Bmal1 na adenohipófise tiveram menor expressão que o gene Rev-erbα no grupo senil e o ovário destes animais revelou maior expressão para Per2 e Rev-erbα, em comparação com os animais CD. As concentrações plasmáticas de FSH foram maiores nas fêmeas com ciclo irregular (2,05 ± 0,44 ng/mL), principalmente durante a fase clara, assim como o LH (0,24 ± 0,07 ng/mL), cujos maiores valores foram encontrados durante a fase escura e com perfil semelhante ao RNAm de AVP. As imunomarcações revelaram alta atividade vasopressinérgica na porção dorsomedial do NSQ das fêmeas IDP. Juntos estes dados permitem concluir que há desarranjo na expressão temporal dos genes Per2, Rev-erbα, Bmal1 que compõem a maquinaria molecular do relógio circadiano, bem como de RNAm para AVP no NSQ, de fêmeas Wistar na periestropausa. Além disso, a maior atividade neuronal vasopressinérgica e a ausência de oscilação de Rev-erbα e Bmal1 no NSQ destes animais, comprometem a correta comunicação do relógio central do NSQ com o eixo HPG, inviabilizando a manutenção da fertilidade feminina e contribuindo para a senescência reprodutiva. PALAVRAS-CHAVE: Envelhecimento reprodutivo, Clock genes, Vasopressina, Ritmo circadiano, Eixo HPG ABSTRACT ABSTRACT NICOLA, AC. Clock protein action in the senescence reproductive of female Wistar rats. 2017. 114f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2017. Aging is considered a multidimensional process in which environmental factors can protect or, conversely, aggravate its signals, non-linearly, in physiological and neurobehavioral processes. During this process, circadian rhythms are disrupted or fragmented with consequent dissociation of the individual's circadian rhythms and circadian clock-related dysfunctions contribute to aging and related pathologies. The objective of this study was to investigate possible temporal alteration of the CLOCK system in the HPG axis and the relation with the hormonal changes that characterize periestropause. Adult females with regular estrus cycle in the diestrous phase (RD) and old females with irregular estrous cycle and persistent diestrous phase (IPD). For analyzes of the gene expression of the genes Per2, Rev-erbα and Bmal1 in the HPG axis, punchs from the NSQ regions were used, where AVP, POA and MBH RNAm from these animals were also analyzed, as well as the adenohypophysis and ovaries from which they were extracted the RNA for cDNA production and qPCR performance. The determination of the vasopressinergic neuronal activity in the NSQ was performed by immunohistochemical with double labeling for cFos/AVP in tissue previously fixed with paraformaldehyde. The plasma concentration of gonadotrophins was determined by radioimmunoassay. In general, the IPD animals show alterations in the gene expression profile during the period analyzed, with amplitude reduction, phase shift / misalignment and absence of antiphase. The NSQ of IPD animals presented lower expression of Rev-erbα and higher RNAm expression for AVP than RD group. The relative quantification of Bmal1 was similar in both groups and there were no differences between groups in the expression of Per2. In PAO, IPD animals showed higher expression of Per2 and less amount of RNAm for Rev-erbα. MBH showed lower expression for Per2 and Rev-erbα and higher Bmal1 expression in IPD females. Per2 and Bmal1 in the adenohypophysis had lower expression than the Rev-erbα gene in the old group and the ovary of these animals showed higher expression for Per2 and Rev-erbα, in related to to the RD animals. Plasma concentrations of FSH were higher in females with irregular cycle (2.05 ± 0.44 ng / mL), mainly during the light phase, as well as LH (0.24 ± 0.07 ng / mL) whose values were found during the dark phase and with a profile similar to AVP RNAm. Immunolabeling demonstrated high vasopressinergic activity in the dorsomedial portion of the NSQ of the IPD females. Together these data allow us to conclude that there is a breakdown in the temporal expression of the Per2, Rev-erbα, Bmal1 genes that make up the molecular machinery of the circadian clock, as well as RNAm for AVP in NSQ of Wistar females in peri-masterpause. In addition, the increased vasopressinergic neuronal activity and the absence of Rev-erbα and Bmal1 oscillation in the NSQ of these animals compromise the correct communication of the central clock of the NSQ with the HPG axis, making it impossible to maintain female fertility and contributing to reproductive senescence. ABSTRACT KEY WORDS: Reproductive aging, Clock genes, Vasopressin, Circadian rhythm, HPG axis LISTA DE ILUSTRAÇÕES LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Representação da localização anatômica do núcleo supraquiasmático e de suas subdivisões conforme neurotransmissores liberados. Figura 2 - Representação esquemática do funcionamento do relógio molecular em mamíferos. Figura 3 - Coleta do lavado vaginal e visão microscópica do lavado vaginal nas diferentes fases do ciclo estral em fêmeas com ciclo regular e irregular com persistência o diestro. Figura 4 - Delineamento experimental do estudo. Figura 5 - Diagrama esquemático de cortes coronais representando as localizações dos punches da APO, NSQ e HMB. Figura 6 - Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no NSQ realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. Figura 7 - Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR na APO realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. Figura 8 - Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no HMB realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. Figura 9 - Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR na adenohipófise realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. Figura 10 - Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no ovário realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. Figura 11 – Secções médio-caudais do NSQ consideradas em todos os grupos experimentais para a contagem de neurônios vasopressinérgicos imunorrativos para cFos. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 12 - Oscilações na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP no NSQ. Figura 13 - Oscilações na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 na APO. Figura 14 - Oscilações na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 no HMB. Figura 15 - Oscilações na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 na adenohipófise. Figura 16 - Oscilações na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 no ovário. Figura 17 – Perfil hormonal de gonadotrofinas plasmáticas ao longo de 24h. Figura 18 – Atividade de neurônios vasopressinérgicos imunorreativos para cFos no NSQ ao longo de 24h. Figura 19 – Fotomicrografias de neurônios vasopressinérgicos da porção dorsomedial do NSQ imunorreativos para cFos em ratas ciclando em diestro e ratas com ciclo irregular em diestro persistente LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Tabela1 – Sequências e concentrações dos primers utilizados e número de acesso do gene LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE ABREVIATURAS % - porcento ∆∆Ct – delta delta Ct °C – grau Celsius µL – microlitro µm – Micrômetro 3V – terceiro ventrículo ACTH - hormônio adrenocorticotrófico ANOVA – análise de variância APO – área pré-óptica APO-AH - área pré-óptica anterior APOm – área pré-óptica medial APOr – área pré-óptica rostral ARC – núcleo arqueado ARNTL – gene Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 AVP – arginina-vasopressina AVPe – núcleo anteroventral periventricular Bmal1 – gene brain and muscle arnt-like protein 1 BMAL1 – proteína brain and muscle arnt-like protein 1 BSA – albumina sérica bovina CCGs – genes controlados pelos genes do relógio cDNA - ácido desoxirribonucleico complementar CEUA – comitê de ética no uso animal cFos – proteína cFos integrante da grande família Fos de fatores de transcrição CGs- células da granulosa LISTA DE ABREVIATURAS CK1ε – caseína quinase 1 epsilon CLOCK - proteína circadian locomotor output cycles kaput Clock – gene Circadian Locomotor Output Cycles Kaput ClockΔ 19 – deleção no éxon 19 do gene Clock CRH – hormônio liberador de corticotrofina Cry 1 e 2 – gene cryptocrome 1 e 2 Ct – threshold cycle DAB – diaminobenzidina 3,3’ DBT – proteína Doubletime DHEA – deidroepiandrosterona DM – porção dorsomedial DNA – ácido desoxirribonucleico dNTPs – desoxinucleotídeo trifosfatos E-box - enhancer box EDTA – ácido etilenodiamino tetracético Eff% - taxa de eficiência de amplificação ER – receptor de estrógeno FSH – hormônio folículo estimulante GABA – ácido gama-aminobutírico GH – hormônio do crescimento Glu – glutamato GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas h – hora H2O2 – peróxido de hidrogênio LISTA DE ABREVIATURAS H3 – histona 3 H3K27me – histona 3 metilada na lisina 27 H3K4me3 – histona 3 trimetilada na lisina 4 H3K9ac – histona 3 acetilada na lisina 9 H3K9me - histona 3 metilada na lisina 9 H4 – histona 4 H4K16 – histona 4 desacetilada na lisina 16 HCl – ácido clorídrico HDAC – histona desacetilase HDM – hipotálamo dorsomedial HMB – hipotálamo médio basal HPA – hipotálamo-hipófise-adrenal HPG – hipotálamo-hipófise-gônadas IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IGF - fator de crescimento semelhante à insulina ip - intraperitoneal Kg – kilograma Kiss- proteína kisspeptina codificada pelo gene Kiss1 LED - light emitting diode ou diodo emissor de luz LH – hormônio luteinizante M – molar mg – miligrama mg/Kg – miligramas/quilogramas min – minuto LISTA DE ABREVIATURAS mL – mililitro mm – milímetros n – número amostral ng – nanogramas ng/mL – nanograma/mililitro NiSO4 – sulfato de níquel nm – nanômetros nM – nanomolar NPAS - neuronal PAS 1 NPAS1 – proteína de domínio PAS 1 neuronal NR1D1 - subfamília de receptor nuclear 1, grupo D, membro 1 OC – quiasma óptico OVLT – órgão vasculoso da lamina terminalis PACAP – polipeptídeo hipofisário ativador de adenilato ciclase PB – tampão fosfato PBS – tampão fosfato salina pc/ip – peso corporal/intraperitoneal PER – proteína Period Per 1, 2 e 3 – gene period 1, 2 e 3 Per2 – gene Period 2 PFA – paraformaldeído pH – potencial hidrogeniônico PR – receptor de progesterona PVN – núcleo paraventricular do hipotálamo LISTA DE ABREVIATURAS qPCR – reação em cadeia da polimerase quantitativa R2 – coeficiente de determinação Rev-erbα ou NR1D1 – gene Rev-ErbA alpha ou receptor nuclear receptor subfamília 1, grupo D, membro 1 RIE – radioimunoensaio RNA – ácido ribonucleico RNAm – ácido ribonucleico mensageiro RORs - receptores órfãos relacionados ao ácido retinóico rpm – rotação por minuto RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction ou reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa NSQ – núcleo supraquiasmático SIRT - sirtuína SIRT1 – sirtuína1 TIM – proteína Timeless TSH – hormônio tiroestimulante VIP – peptídeo vasoativo intestinal VL – porção ventrolateral AVP1a – receptor de vasopressina 1a https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction SUMÁRIO SUMÁRIO 1. Introdução ............................................................................................................................ 31 2. Hipótese ............................................................................................................................... 45 3. Objetivos .............................................................................................................................. 45 3.1.Objetivos gerais .................................................................................................................. 45 3.2.Objetivos específicos .......................................................................................................... 45 4. Delineamento Experimental ................................................................................................ 47 4.1.Experimento 1: Avaliação da expressão dos genes Per2, Bmal1, Rev-erbα nos núcleos HMB, NSQ, APO, adenohipófise e ovários; e de AVP no NSQ de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. ............................................................................... 47 4.2.Experimento 2: Atividade dos neurônios vasopressinérgicos do núcleo supraquiasmático (NSQ) durante ritmo circadiano de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. ................................................................... 47 4.3.Experimento 3: Determinação das concentrações plasmáticas de FSH e LH de ratas cíclicas em diestro e ratas com ciclo irregular em diestro persistente ................... 48 5. Material e Métodos ............................................................................................................... 50 5.1. Animais .............................................................................................................................. 50 5.2. Ciclo estral ......................................................................................................................... 50 5.3. Experimento I – Avaliação da expressão dos genes Per2, Bmal1, Rev-erbα nos núcleos HMB, NSQ, APO; adenohipófise e ovários de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. .............................................................................................................. 52 5.3.1 Ensaio de PCR quantitativo em tempo real (qPCR): Extração de RNA total, reação de transcriptase reversa (RT-PCR) e qPCR .................................................................................. 54 5.4. Experimento II: Atividade dos neurônios vasopressinérgicos do núcleo supraquiasmático (NSQ) de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. ............................................................................................................... 61 5.4.1. Coleta das Amostras ....................................................................................................... 61 SUMÁRIO 5.4.1.1. Perfusão ....................................................................................................................... 61 5.4.1.2. Imunoistoquímica ........................................................................................................ 62 Obtenção dos cortes .................................................................................................................. 62 Preparação do tecido ................................................................................................................. 62 Incubação com os anticorpos .................................................................................................... 63 Montagem dos cortes ................................................................................................................ 64 Análises imunoistoquímicas ..................................................................................................... 64 6. Resultados ............................................................................................................................. 68 6.1. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP no NSQ e RNAm para Per 2, Rev-erbα, Bmal1 na APO e HMB de ratas adultas cíclicas em diestro e senis com ciclos irregulares em diestro persistente. ............................................................................................ 68 6.1.1 Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP RNAm no NSQ ...... 68 6.1.2. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 na APO ............................ 71 6.1.3. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 no HMB ........................... 73 6.1.4. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 na Adenohipófise ............ 75 6.1.5. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 no Ovário ......................... 77 6.2. Análises Imunoistoquímicas .............................................................................................. 79 6.3. Dosagens Plasmáticas de Gonadotrofinas ......................................................................... 81 7. Discussão .............................................................................................................................. 84 8. Conclusão ............................................................................................................................. 98 9. Referências Bibliográficas .................................................................................................. 101 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO 31 1. Introdução O envelhecimento é considerado processo multidimensional no qual fatores ambientais podem proteger ou, inversamente, agravar seus sinais, de maneira não linear, nos processos fisiológicos e neurocomportamentais (SCHMIDT; PEIGNEUX; CAJOCHEN, 2012). Este fenômeno está promovendo alteração na estrutura da pirâmide demográfica em todo o mundo. Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE-2008) revelam que em 2000, para cada pessoa com 65 anos ou mais, 12 estavam na faixa potencialmente ativa, i.e, de 15 a 64 anos. Entretanto, em 2050, teremos pouco menos de 3 pessoas na faixa etária potencialmente ativa para cada idoso. As alterações no sistema nervoso que ocorrem no período do envelhecimento determinam mudanças na forma como os indivíduos sentem e percebem o mundo bem como as interações com ele. Desta forma, o conhecimento das bases neurobiológicas que estão determinando esta fase sobre os componentes desses sistemas é de interesse da comunidade científica. O aumento da expectativa de vida e de doenças degenerativas que provocam alterações cognitivas, determinam a grande necessidade de conhecimento sobre o processo de envelhecimento cerebral saudável. Nos últimos anos, estudos sobre o relógio biológico em diversos órgãos vem lançando luz sobre os caminhos subjacentes envolvidos no período do envelhecimento, com a promessa de intervenções para prolongar a vida saudável (CORNELISSEN; OTSUKA, 2017). Entre os desafios dos biogerontologistas está a questão da extensa variabilidade entre os indivíduos idosos e a necessidade de conhecimento sobre a forma como o cérebro envelhece, o que possibilitará a maioria dos indivíduos desfrutar de melhor qualidade de vida em idade avançada. Seres vivos, animais e vegetais, possuem mecanismos rítmicos internos de adaptação frente à alterações do ambiente denominados de relógio biológico. A temporização interna é mantida por eventos bioquímicos que ocorrem de maneira circadiana, ultradiana ou INTRODUÇÃO 32 infradiana, respectivmente, em períodos aproximados de 24h, maiores que 24h e menores que 24h. Durante o envelhecimento dos organismos é possível detectar, em período de 24 h, diminuição na amplitude e precisão de ritmos metabólicos, comportamental e endócrino, regulados por marca-passo circadiano central (núcleo supraquiasmático (NSQ), e por osciladores locais nos tecidos periféricos de mamíferos (MOHAWK; GREEN; TAKAHASHI, 2012). Disfunções no relógio circadiano contribuem para patologias e doenças (JENWITHEESUK et al., 2014), pois controla sistemas associados ao envelhecimento, tais como: o controle do metabolismo, a resposta ao estresse oxidativo e a reparação do DNA (KHAPRE; SAMSA; KONDRATOV, 2010; KONDRATOVA; KONDRATOV, 2012). O funcionamento do relógio biológico é alvo de estudos desde a década de 70, com a descoberta na oscilação diária das proteínas PER (period), TIM (timeless), DBT (doubletime) que conferem ritmicidade circadiana de atividade locomotra em Drosophila melanogaster, cujos mecanismos moleculares são curiosamente conservados em mamíferos (KOH et al., 2006). Mamíferos exibem sistema circadiano organizado de forma hierárquica, no qual marcapasso mestre no NSQ regula diariamente os osciladores dos tecidos periféricos (KO; TAKAHASHI, 2006) de acordo com o fotoperíodo, que por sua vez, determina a fase dos relógios celulares periféricos através de variedade de relés de sinalização, incluindo ritmos endócrinos e ciclos metabólicos (LIU; CHANG, 2017). O NSQ, pequeno núcleo localizado bilateralmente acima do quiasma óptico na zona ventral periventricular do hipotálamo, é composto, em roedores, por aproximadamente 20 mil pequenos neurônios interconectados (SOLLARS; PICKARD, 2015) e com distribuição anatômico-fisiológica bem definida. Estes neurônios recebem informação luminosa a partir de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis que expressam melanopsina na retina através do trato retino-hipotalâmico e sincronizam a fase do relógio circadiano com a variação do ciclo claro e escuro (DIBNER; SCHIBLER; ALBRECHT, 2010) (Figura 1). INTRODUÇÃO 33 Fig. 1 – Representação da localização anatômica do núcleo supraquiasmático e de suas subdivisões conforme neurotransmissores liberados. Abreviações Glu: Glutamato, PACAP: polipeptídeo hipofisário ativador de adenilato ciclase, VIP: Peptídeo vasoativo intestinal, GABA: ácido gamaaminobutírico, AVP: arginina- vasopressina, DM: porção dorsomedial ou “shell”, VL: porção ventrolateral ou “core”, OC: quiasma óptico, 3V: terceiro ventrículo (Fonte: Adaptado de (HAFNER; KOEPPL; GONZE, 2012). O substrato molecular para temporização circadiana consiste de sistema de alças de retroalimentação transcricional-translacional envolvendo família de genes do relógio (clock genes) que interagem (TAKAHASHI et al., 2008). Dentro da alça principal, os genes transativadores Bmal1ou ARNTL (gene Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1) e Clock conduzem a transcrição dos genes repressores Period (Per1, Per2) e Cryptocrome (Cry1, Cry2), que após a tradução suprimem a atividade de BMAL1:CLOCK. Com o envelhecimento, os ritmos circadianos são alterados ou fragmentados com dissociação consequente dos ritmos circadianos do indivíduo (SATINOFF et al., 1993). Apesar das evidências para comprometimento circadiano em animais velhos e às respostas adversas (DAVIDSON et al., 2008), pouco se sabe sobre as alterações nos osciladores circadianos e a senescência reprodutiva, uma vez que o processo do envelhecimento é INTRODUÇÃO 34 fortemente influenciado por mecanismos epigenéticos, dos quais o remodelamento da cromatina, incluindo as modificações em histonas, podem exercer efeito crucial na regulação gênica, mesmo em células como os neurônios (TANIURA; SNG; YONEDA, 2007). O hipotálamo consiste de conjunto de células neurossecretoras distintas localizadas na base do cérebro que interpretam, integram e respondem a sinais externos e internos ao e do organismo visado sua homeostasia. Processos vitais sob controle hipotalâmico incluem a regulação da temperatura corporal, ingestão de nutrientes e equilíbrio energético, ciclos de sono-vigilía, comportamento sexual, ciclicidade reprodutiva, equilíbrio hidroeletrolítico, adaptação ao estresse, crescimento e ciclos circadianos ou ultradianos (KRONENBERG, 2013; LARSEN, 2003). Durante o envelhecimento, a capacidade de resposta desses neurônios diminui, comprometendo negativamente as atividades do organismo (CHEN; MAEVSKY; UCHITEL, 2015). O declínio reprodutivo e o envelhecimento feminino resultam da deterioração de funções hipotalâmicas (WISE, 1999; WISE et al., 1997; WISE; SMITH, 2001; WISE et al., 1999). Fêmeas de roedores em meia-idade (10-12 meses) exibem atrasos no horário e início do pico do hormônio luteinizante (LH), com alterações em sua amplitude (NASS et al., 1984; WISE, 1982). Durante esta fase de vida, estes animais também apresentam alterações na expressão de neuromediadores, neuropeptídeos e receptores (KRAJNAK et al., 1998), bem como na ritmicidade de diferentes ritmos biológicos, cuja perda geral é devida a alterações no funcionamento do sistema nervoso central (SNC) (KRAJNAK; ROSEWELL; WISE, 2001). Em mulheres, o envelhecimento é caracterizado pela cessação da função ovariana e dos ciclos reprodutivos, além de ser processo acompanhado pelo declínio da saúde cardiovascular, do controle motor, da integridade óssea e das faculdades cognitiva e psicossocial (UTIAN, 2005). INTRODUÇÃO 35 Os genes do relógio são expressos de maneira circadiana em neurônios produtores do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), nos gonadotrofos hipofisários e nos ovários, onde sinais neuronais dependente do ciclo claro/escuro são necessários para a indução do aumento de LH, cujo controle é dado pelo relógio biológico (FRANKE, 2003). A expressão destes genes está intimamente relacionada com a função dos componentes do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (HPG), cujo funcionamento determina a reprodução (YIN; GORE, 2010). Este eixo coordena o mecanismo reprodutivo através do GnRH que, secretado por neurônios dos núcleos hipotalâmicos, estimula a liberação das gonadotrofinas hipofisárias, as quais estimulam a secreção dos esteroides ovarianos. A organização temporal da atividade pulsátil no eixo HPG é essencial para a geração do pico pré-ovulatório de LH e manutenção dos ciclos reprodutivos femininos. Neurônios de estruturas como o núcleo anteroventral periventricular (AVPe) projetam-se diretamente para os neurônios GnRH, são imunorreativos ao estradiol (PETERSEN; OTTEM; CARPENTER, 2003) e desempenham função essencial no controle da liberação desse decapeptídeo e na indução, pelos esteroides ovarianos, da concentração máxima (pico) do LH (BU; LEPHART, 2007; SMITH, 2008). Estes neurônios expressam família de neuropeptídios codificados pelo gene Kiss1, coletivamente chamada de kisspeptinas (Kiss), os quais respondem positivamente ao estradiol no horário do pico pré-ovulatório de LH (SMITH; CLIFTON; STEINER, 2006), apresentam padrão circadiano de atividade em escuro constante (ROBERTSON et al., 2009). Neurônios Kiss localizados no AVPe e núcleo arqueado (ARC) do hipotálamo médio basal controlam, sob controle circadiano, diferencialmente o pico pré-ovulatório: ARC, responsável pela pulsatilidade do GnRH, atua regulando o feedback negativo e o AVPe, responsável pela geração do pico de GnRH, atua sobre o feedback positivo dos esteróides sexuais (YAP et al., 2016). Também está evidenciado que os neurônios secretores de GnRH do hipotálamo e da área pré-óptica anterior (APO-AH) de roedores são as principais células que regulam a função INTRODUÇÃO 36 reprodutiva (GORE; ROBERTS, 1995), sendo o momento do declínio reprodutivo relacionado à idade, dependente de complexa interação de alterações que ocorrem em todos os níveis do eixo HPG (OTTINGER, 2010). Em roedores, neurônios GnRH localizam-se em diferentes regiões cerebrais, incluindo estruturas septais, olfatórias, pré-ópticas e hipotalâmicas (SILVERMAN; JHAMANDAS; RENAUD, 1987). A população destes neurônios, com atividade intensa durante o pico de GnRH, concentra-se na área pré óptica rostral (APOr), composta por APOm (área pré-óptica medial) e AVPe, com localização próxima à região do órgão vasculoso da lâmina terminalis (OVLT) (LEE; SMITH; HOFFMAN, 1990; WINTERMANTEL et al., 2006). Assim como em humanos, o momento da ovulação em roedores é controlado por estímulos hormonais (com destaque para o estradiol), que indicam a maturação do oócito, associados ao controle do relógio biológico, que determinam o comportamento sexual e o período do dia em que a liberação do óvulo acontece (SIMONNEAUX; BAHOUGNE, 2015). Atrasos ou adiantamentos no início do período de luz provocam alterações no horário da ovulação (HOFFMANN, 1969) e, em fêmeas de camundongos e hamsters, alterações em seu período circadiano de atividade são acompanhadas por alterações no horário do pico de LH, podendo levar à infertilidade (LUCAS et al., 1999; MILLER et al., 2004). A interação reprodutiva com o fotoperíodo representa mecanismo adaptativo que evoluiu para otimizar as possibilidades de fertilização e, em última análise, assegurar a sobrevivência da espécie (CAVIGELLI et al., 2005; HORVATH, 1998; LEVINE, 2002; NELSON, 2011). Em mamíferos, o NSQ é responsável por numerosas funções fisio- comportamentais (PILORZ; STEINLECHNER; OSTER, 2009) e cabe a ele a função de sincronizar os múltiplos relógios periféricos, sendo considerado o relógio central capaz de gerar ritmos circadianos (SILVER et al., 1996). Através da liberação programada de sinais neuro-humorais, o NSQ controla a ritmicidade do comportamento reprodutivo, o ciclo estral e INTRODUÇÃO 37 parâmetros endócrinos (PILORZ et al., 2009). Neurônios do NSQ projetam-se diretamente para neurônios GnRH (KALSBEEK; BUIJS, 2002), onde o pico pré-ovulatório é primariamente controlado por duas redes de aferência, uma vasopressinérgica de controle indireto, e outra de controle direto, através do peptídeo vasoativo intestinal (VIP), que possivelmente também modula, de maneira indireta, neurônios do hipotálamo dorso-medial (HDM) (SIMONNEAUX; BAHOUGNE, 2015). Além disso, redes de interneurônios que circundam os neurônios GnRH também são importantes moduladores de sua atividade mediante regulação hormonal exercida por folículos ovarianos em maturação (LEVINE, 1997; VAN DER BEEK, 1996) para a indução dos níveis de secreção de GnRH associados ao pico de LH (MILLER et al., 2006). Ausência ou desregulação em uma destas redes abole o pico de GnRH, levando à anovulação (KALRA, 1993) e a ablação do NSQ ou a desconexão de suas projeções neuronais para a APO resulta em aciclicidade estral, indicando ação fundamental destes núcleos na função reprodutiva (BROWN-GRANT; RAISMAN, 1977; WIEGAND; TERASAWA, 1982; WIEGAND et al., 1980). Os “genes do relógio”, como Per1 e Per2, compõem a maquinaria molecular do relógio biológico e regulam a expressão de centenas de produtos gênicos (PILORZ et al., 2009). A expressão do gene promotor alvo Per 1 ocorre de maneira circadiana nos neurônios GnRH (GILLESPIE et al., 2003) e a expressão de todos os cognatos dos genes de relógio foi detectada nos gonadodrofos hipofisários (OLCESE; SIKES; RESUEHR, 2006; RESUEHR et al., 2007; RESUEHR; RESUEHR; OLCESE, 2009). A descoberta de que os genes de relógio exibem expressão de maneira circadiana em vários tecidos periféricos e em várias regiões cerebrais (BALSALOBRE, 2002) evidencia que o relógio biológico é composto, além do relógio central, por osciladores periféricos (POLETINI, 2012). Estudos realizados por Funabashi e colaboradores (2000) e Watson e colaboradores (1995) demonstraram densa inervação vasopressinérgica na APO, eferente da porção dorsomedial do NSQ, sugerindo que INTRODUÇÃO 38 sinais circadianos são comunicados sinapticamente para neurônios, responsivos ao estradiol, do AVPe. Além disso, RNAm de receptores para arginina-vasopressina (AVP) foi detectado em neurônios da APOm, onde o aumento induzido nos níveis extracelulares de AVP de animais com o NSQ intacto, tem efeito estimulador sobre o pico de LH (PALM et al., 2001). Este efeito está restrito a período de tempo específico, que coincide com a janela de tempo sensível para sinal neuronal antes do pico de LH (EVERETT; SAWYER, 1950) e com o pico da secreção de AVP por neurônios NSQ (GILLETTE; REPPERT, 1987; KALSBEEK et al., 1995). A completa ausência de qualquer sinal circadiano do NSQ não induz variação em níveis basais de LH, no entanto, a administração de AVP, durante 2 horas, na APOm é suficiente para reestabelecer o aumento repentino de LH, que é comparável com oscilações (forma e amplitude) induzidas por estrogênios em animais NSQ intactos (PALM et al., 1999). A secreção aumentada de AVP por terminais de neurônios eferentes do NSQ na APOm é o sinal circadiano essencial para a geração do pico de LH (KALSBEEK; BUIJS, 2002) Animais submetidos à mutação do gene dominante negativo ClockΔ 19 (Clock delta 19) possuem ciclos estrais prolongados, com extenso período da fase de estro (DOLATSHAD et al., 2006; MILLER et al., 2004) e ausência do pico pré-ovulatório de LH no proestro (MILLER et al., 2004), sugerindo anormalidade no ritmo de AVP expressa em neurônios NSQ, bem como reduzida expressão do receptor AVP1a em NSQ em regiões-alvo do hipotálamo (MILLER et al., 2006). Embora a identidade molecular do sinal temporal do NSQ seja desconhecida, o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) e, em particular, a AVP, têm sido reportados no controle temporal de secreção do GnRH (KALSBEEK; BUIJS, 2002; VAN DER BEEK et al., 1997). A expressão de AVP é regulada pelos genes do relógio ativadores de transcrição Clock e Arntl, os quais induzem a expressão do receptor por ligação a elementos de E-box no promotor de AVP (GRACE; FINK; QUINN, 1999; LOWREY; TAKAHASHI, 2004; MUNOZ; BREWER; BALER, 2002). INTRODUÇÃO 39 O mecanismo molecular para o funcionamento do relógio biológico está relacionado com a expressão das proteínas do relógio através de retroalimentação transcricional que envolve pelo menos dez genes (BUHR; TAKAHASHI, 2013) (Fig. 2). Em mamíferos, os genes Clock, Bmal1, Per (1, 2 e 3) e Cry (1 e 2), promovem a tradução de proteínas cuja expressão é autorregulada por alças de retroalimentação positiva e negativa, com taxas de transcrição/tradução que variam durante período aproximado de 24 horas (ALBRECHT et al., 1997; SHEARMAN et al., 1997). No citoplasma, as proteínas PER 1, 2 e 3 juntamente com as proteínas CRY 1 e 2, dimerizam-se para compor a alça de retroalimentação negativa, e após serem fosforiladas pela ação da enzima caseína-quinase1 epsilon (CK1ε), entram no núcleo nas horas iniciais da fase escura para inibir a ação dos dímeros CLOCK - BMAL1 e CLOCK - NPAS1 (neuronal PAS 1, membro da família basic helix-loop-helix–PAS), responsáveis pela alça de retroalimentação positiva na região promotora dos genes Per (1, 2 e 3) e Cry (1 e 2), assim como no gene Rev-erbα ou NR1D1 (membro da família dos receptores órfãos do ácido retinóico) e Rors (a, b, c). CRY 1 e 2 e PER 2 também regulam a transcrição de Bmal1, através dos genes Reverb-α (inibidor da transcrição de Bmal1 via elementos ROR) (RORE) e Rors (estimulador da transcrição de BMAL1) (FROY, 2013), reiniciando a formação dos dímeros de CLOCK e o ciclo de ativação (REPPERT; WEAVER, 2002). Camundongos com mutações genéticas que abolem a expressão dos genes Cry 1 e 2, assim como Per 1 e 2 deixam de apresentar comportamentos rítmicos circadianos (OKAMURA et al., 1999). Estes mecanismos de transcrição-tradução caracterizam a ferramenta molecular pelo qual o núcleo NSQ sincroniza (ou determina) o ritmo circadiano (REPPERT; WEAVER, 2002). INTRODUÇÃO 40 O ritmo de expressão dos clock genes também é regulado por hormônios como melatonina e glicocorticoides. A principal fonte de melatonina em vertebrados é a glândula pineal, no entanto, células da retina, células na glândula do Harder em animais quadrúpedes e alguns grupos de células somáticas do trato gastrointestinal igualmente sintetizam este hormônio (TRIVEDI et al., 2017), secretado primariamente à noite e com controle de síntese regulado durante o ciclo claro-escuro (HARDELAND, 2008). A expressão de seus receptores explica a ação direta da melatonina em muitos órgãos, uma vez que sua produção circadiana e a presença destes receptores no NSQ, representam a associação entre a produção de Fig. 2 - Representação esquemática do funcionamento do relógio molecular em mamíferos. Alças autorregulatórias de transcrição/tradução funcionam juntas para produzir ritmos robustos de 24 horas de expressão gênica. As proteínas CLOCK e BMAL1 dimerizadas compõem a alça de ativação diurna desta maquinaria, enquanto REV-ERBα e PER/CRY associados à quinases são componentes repressores da ação transcricional de Clock/Bmal1. As proteínas do relógio molecular também controlam a expressão de vários genes, chamados de genes sob o controle do sistema clock (CCGs) que também exibem atividade circadiana. Abreviações: BMAL1, brain and muscle ARNT-like1; CLOC circadian locomotor output cycles kaput; CRY, cryptochrome; PER, period (Adaptado de (PARTCH; GREEN; TAKAHASHI, 2014) . MEMBRANA CELULAR NÚCLEO CITOPLASMA INTRODUÇÃO 41 melatonina e a maquinaria do ritmo circadiano (JENWITHEESUK et al., 2014). De forma recíproca, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) influencia fortemente a atividade/ritmo circadiano do sistema CLOCK através dos glicocorticóides (NADER; CHROUSOS; KINO, 2010), cujas concentrações circulantes flutuam naturalmente e são fortemente regulados de maneira circadiana, em animais diurnos, incluindo os seres humanos (CHROUSOS, 1995; CHROUSOS, 2001). A influência exercida pela liberação rítmica diária deste hormônio na atividade do eixo HPA, é orquestrada por eferências do NSQ aos neurônios corticotróficos (CRH)/vasopressinérgicos do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) (BAO et al., 2008), e permite o “reset”/reajuste dos relógios periféricos frente à situações de estresse, além de suas oscilações periféricas em alguns tecidos (FUKUOKA et al., 2005; SEGALL et al., 2006). O princípio de qualquer relógio circadiano está no ciclo de retroalimentação dos processos de transcrição/tradução, fortemente modulados por mecanismos epigenéticos (SWEATT et al., 2013). A acetilação de histonas H3 e H4 relacionado com os promotores de genes que fazem parte do mecanismo de relógio molecular são diferentemente regulados durante o ciclo circadiano (BELLET; SASSONE-CORSI, 2010; NARUSE et al., 1999). Desmetilação de regiões específicas no interior do locus do gene GNRH desempenha função na ativação in vivo da transcrição de GnRH. Metilação na lisina 9 e 27 da histona 3 (H3K9me e H3K27me) geralmente é observada em genes silenciados (RUTHENBURG et al., 2007; WANG et al., 2008), enquanto que a trimetilação na lisina 4 da histona 3 (H3K4me3) é característica de transcrição ativa (BERGER, 2007; WANG et al., 2008). Em mamíferos são encontradas proteínas histonas desacetilases (HDAC) conhecidas como sirtuinas (SIRT), que originalmente foram identificadas como fator de silenciamento genético (HERSKOVITS; GUARENTE, 2013). A ativação de SIRT1 diminui a acetilação de H3, e deste modo a repressão de genes circadianos de modo tempo-específico (BELLET et INTRODUÇÃO 42 al., 2013), além de, alterar a estrutura da cromatina por desacetilação na lisina 16 da histona 4 (H4K16) e na lisina 9 da histona 3 acetilada (H3K9ac) (VAQUERO; REINBERG, 2009), ambas relacionadas com a ativação gênica (GUTTMAN et al., 2009; RUTHENBURG et al., 2007; WANG et al., 2008). De abundante expressão no ARC (CAKIR et al., 2009; DIETRICH et al., 2010), SIRT1 promove a metilação na lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) (VAQUERO; REINBERG, 2009), modificação associada com o silenciamento gênico (GUTTMAN et al., 2009; RUTHENBURG et al., 2007; SCHAEFER et al., 2009; WANG et al., 2008). Em tecidos periféricos, tais como o fígado, foi demonstrado que SIRT1 pode influenciar o ritmo circadiano de célula autônoma por diversos mecanismos (CHANG; GUARENTE, 2013), como por exemplo, a desacetilação de BMAL1, que afeta sua atividade (NAKAHATA et al., 2008) ou de PER2 que altera sua estabilidade (ASHER et al., 2008). Diversos estudos (KRAJNAK et al., 2001; LLOYD; HOFFMAN; WISE, 1994) têm demonstrado que a capacidade do relógio temporal circadiano do cérebro na condução dos eventos neuroquímicos diurnos é reduzida com a idade, explicando a ocorrência da atenuação e dessincronização nos ritmos de vários neurotransmissores envolvidos com a secreção de GnRH-LH durante a instauração da senescência reprodutiva. Em nosso laboratório, analisamos a atividade neuronal de núcleos envolvidos com o processo reprodutivo de fêmeas Wistar com 18 meses, no período caracterizado como diestro persistente (NICOLA, 2013). Os resultados evidenciaram alteração na atividade neuronal do AVPe e Locus Coeruleus e que estas alterações ocorrem primariamente às ovarianas, possivelmente devido à mudanças no microambiente celular e sua maquinaria genética. Também foi detectada maior atividade dos neurônios noradrenérgicos, porém, menor conteúdo de noradrenalina em neurônios da APO e de GnRH no hipotálamo médio basal. Sugerimos que a temporização circadiana em todo o eixo HPG encontra-se alterada, resultando em descompasso para síntese e liberação de INTRODUÇÃO 43 gonadotrofinas com consequente ausência do pico pré-ovulatório, caracterizando a aciclicidade reprodutiva. A literatura destaca a ação de diversos hormônios controladores dos ritmos biológicos, tais como melatonina, TSH, Fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1), GH, DHEA (Dehydroepiandrosterona), hormônios do eixo HPA: ACTH (hormônio adreormnocorticotrófico) e CRH (hormônio liberador de corticotrofina), glicocorticoides, conforme há o avanço da idade; no entanto, o comportamento dos hormônios reprodutivos sobre a atividade do NSQ e vice-versa durante a instauração da senescência reprodutiva feminina, ainda carece de maiores esclarecimentos. Mediante essas informações e tendo em vista a existência de sistemas circadianos multiosciladores em cada componente do eixo HPG (SELLIX; MENAKER, 2010), nossa proposta é analisar o comportamento dos clock genes no eixo HPG de fêmeas de roedores no período da periestropausa, uma vez que as alterações hormonais neste período somadas à fatores epigenéticos na maquinaria do sistema CLOCK, podem determinar a perda da organização temporal endógena, favorecendo a progressão para o término da fertilidade determinando a estropausa (roedores) ou menopausa (mulheres). HIPÓTESE E OBJETIVOS HIPÓTESE E OBJETIVOS 45 2. Hipótese Hipotetizamos a ocorrência de alterações nos ritmos circadianos no eixo HPG e que estas alterações desempenham função importante para a condução da senescência reprodutiva. 3. Objetivos 3.1. Objetivos gerais Averiguar possível alteração temporal do sistema CLOCK no eixo HPG e a relação com às alterações hormonais que caracterizam a periestropausa. 3.2. Objetivos específicos A partir da caracterização de modelo para estudo fisiológico do envelhecimento reprodutivo feminino realizamos análises de regiões centrais a fim de caracterizar as alterações que ocorrem neste período para melhor compreender a senescência reprodutiva. Portanto, neste estudo buscou-se testar se: - há alteração temporal (ao longo de 24h), in vivo, na expressão de RNAm dos genes Per2, Rev-erbα, Bmal1 nos núcleos anteroventralperiventricular (AVPe) e supraquiasmático (NSQ), no hipotálamo médio basal (HMB), na adenohipófise e nos ovários de animais senis (18 meses) em diestro persistente comparado com o de animais adultos (4 meses) na fase de diestro? - ocorre alteração temporal na expressão gênica de arginina-vasopressina (AVP) no NSQ de animais adultos (4 meses) na fase de diestro e animais senis (18 meses) em diestro persistente? - há diferença de atividade vasopressinérgica na porção dorsomedial do NSQ de animais adultos (4 meses) na fase de diestro e animais senis (18 meses) em diestro persistente? - de que forma possíveis alterações na maquinaria circadiana contribuem para a persistência da fase do diestro em fêmeas de roedores? DELINEAMENTO EXPERIMENTAL DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 47 4. Delineamento Experimental 4.1. Experimento 1: Avaliação da expressão dos genes Per2, Bmal1, Rev-erbα no HMB, NSQ, APO, adenohipófise e ovários; e de AVP no NSQ de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. Ratas Wistar adultas (4 meses) com ciclo regular em diestro (Grupo CD) e senis (18 meses) com ciclo irregular em diestro persistente (Grupo IDP), foram decapitadas a cada 6 horas (8h, 14h, 20h, 02h), do dia do diestro (n= 5-10 animais/horário), após análise de 3 ciclos estrais consecutivos para determinação da regularidade/irregularidade do ciclo. Os órgãos-alvo foram removidos com instrumentais autoclavados e descontaminados com RNAse away (Sigma®). Os encéfalos foram imediatamente congelados a -80° C e hipófise e ovários foram acondicionados em eppendorffs RNAse free autoclavados, para rapidamente serem congelados em nitrogênio líquido. Todos os tecidos foram armazenados em -80°C até o devido processamento. As regiões cerebrais foram microdissecadas segundo as coordenadas estereotáxicas do atlas de Paxinos e Watson (2007) e posteriormente foi realizada a extração de RNA, síntese de cDNA e qPCR para avaliação quantitativa de RNAm para os respectivos alvos nos respectivos tecidos. 4.2. Experimento 2: Atividade dos neurônios vasopressinérgicos do núcleo supraquiasmático (NSQ) durante ritmo circadiano de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. Neste segundo experimento também foram utilizados animais distribuídos segundo descrito acima (n= 7-10 animais/horário), para serem perfundidos transcardiacamente, sob anestesia, a cada 6 horas (8h, 14h, 20h, 02h) por período de 24h, no dia do diestro. Seus cérebros foram removidos, pós fixados em PFA 4%, saturados em sacarose 30%, congelados em isopentano a -50°C e armazenados a -80° C. Posteriormente foram realizados cortes histológicos DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 48 seriados de 30 µm do NSQ para realização de dupla imunomarcação das proteínas cFos e AVP. 4.3. Experimento 3: Determinação das concentrações plasmáticas de FSH e LH de ratas cíclicas em diestro e ratas com ciclo irregular em diestro persistente Para análise das concentrações plasmáticas de gonadotrofinas, foi coletado sangue diretamente do tronco encefálico dos animais experimentais submetidos à decapitação. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm, na temperatura de 2° C durante 15 min. O plasma foi aliquotado em eppendorfs de 500 µL e armazenado em freezer (-20° C) para dosagem dos hormônios hipofisários: FSH e LH, por radioimunoensaio (RIE). MATERIAL E MÉTODOS 50 5. Material e Métodos 5.1. Animais Todos os procedimentos animais foram aprovados (CEUA: 2014-00269) pela Comissão de Ética no Uso de Animal da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Araçatuba, SP, Brasil), estando em conformidade com o guia de cuidados para uso de animais de laboratório. Após a aprovação do protocolo experimental, fêmeas Wistar nas idades de 4 e 18 meses (n=10 animais/horário/experimento), provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA) foram mantidas em caixas coletivas (4 animais/caixa), em ambiente com controle de temperatura (22 ± 2°C), umidade (55 ± 10%) e ciclo de luz (12/12 h - luzes acesas às 7h), com acesso livre à água e ração (Presence® ratos e camundongos). Os procedimentos experimentais durante a fase escura do fotoperíodo, foram realizados com o auxílio de sistema de iluminação variável com emissão de comprimento de onda específico na faixa espectral de 720 nm (luz vermelha), sob fonte de radiação por light emission diodo (LED) com intensidade menor que 1 lux (POLETINI et al., 2007; SELLIX et al., 2006), controlado por luxímetro (Minipa® digital lux meter MLM-1011). Todos os animais experimentais foram submetidos à decapitação ou perfusão transcardíaca em quatro horários distintos na fase do diestro: 08, 14, 20, 02 horas, perfazendo total de 12h de fase clara e 12h de fase escura do fotoperíodo. 5.2. Ciclo estral O acompanhamento do ciclo estral de todos os animais (Fig. 3 A) foi realizado diariamente através do esfregaço vaginal colhido no período matutino (9h), para determinação da regularidade (Fig. 3B) do ciclo estral bem como a irregularidade do ciclo (Fig. 3C), com a persistência da fase do diestro nos animais de 18 meses. O esfregaço vaginal diário foi analisado a fresco ao microscópio óptico, segundo a técnica de Long e Evans (1922) por 15 dias 51 consecutivos, durante o terceiro e décimo sétimo mês das ratas. Foram utilizadas para este estudo somente os animais adultos que apresentaram ciclo estral regular e ratas senis com irregularidade estral, ou seja, que apresentaram diestro persistente durante o período correspondente a três ciclos consecutivos. Fig. 3 - (A) Coleta do lavado vaginal. Visão microscópica do lavado vaginal nas diferentes fases do ciclo estral em fêmeas com ciclo regular (B) e irregular com persistência do diestro (C). Fonte: Laboratório de Fisiologia Endócrina e Envelhecimento. A DIESTRO DIESTRO DIESTRO DIESTRO C DIESTRO METAESTRO B ESTRO PROESTRO 52 A Figura 4 apresenta resumidamente o organograma do delineamento experimental, coleta e análises das amostras dos grupos experimentais. 5.3. Experimento I – Avaliação da expressão dos genes Per2, Bmal1, Rev-erbα no HMB, NSQ, APO, adenohipófise e ovários de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. Para a remoção do APO, HMB e NSQ foi utilizada a técnica de “punch” descrita por Palkovits (1973), conforme indicado na Figura 5. Em criostato, sob condições estéreis e livres de RNAse, o cérebro foi fixado à plataforma recoberta com meio próprio para congelamento (Tissue-tek o.c.t. coumpound, Miles INC.) adaptada ao equipamento, com temperatura mantida à –20°C. Foi realizada única fatia de 1000 µm a partir de + 0,48mm ântero-posterior ao bregma para o APO (agulha redonda de 1.5 mm), única fatia de 600 µm imediatamente após o APO será feita para o NSQ a partir de -0,48 mm posterior ao bregma (agulha de 1.0 mm redonda) e duas Fig. 4 – Delineamento experimental do estudo 53 fatias subsequentes de 1000 µm para o HMB a partir de -1,72 mm posterior ao bregma (agulha de 1mm quadrada). O NSQ foi microdissecado com auxílio de agulha redonda com 1 mm de diâmetro posicionada centralmente ao 3°V (Figura 5B), o HMB foi microdissecado com auxílio de agulha quadrada com 1 mm de diâmetro posicionada centralmente ao 3°V (Figura 5C-D), tendo a base do cérebro como referência, e a APO microdissecada com agulha redonda com 1 mm de diâmetro, posicionada acima do quiasma óptico (Figura 5A). As microdissecções da APO e HMB já foram anteriormente validadas conforme descrito em Nicola e colaboradores (2016) e Leite e colaboradores (2016) (LEITE et al., 2016) e o NSQ microdissecado como descrito em De Araújo e colaboradores (2016), com adaptações. Fig. 5 - Diagrama esquemático de cortes coronais representando as localizações dos punchs da APO, NSQ e HMB. As coordenadas indicam a distância do bregma à face rostral de cada seção, de acordo com o Atlas de coordenadas estereotáxicas de Paxinos e Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). APO foi dissecada a partir de 0,48 mm do bregma (círculo) utilizando-se agulha de 1,0 mm de diâmetro, posicionada acima do quiasma óptico (A) e o NSQ a partir de -0,48 mm do bregma, com agulha redonda de 1,0 mm de diâmetro (círculo), posicionada centralmente ao 3V (B). HMB dissecado com agulha quadrada de 1,0 mm da terceira e quarta secções, iniciando aproximadamente -1,72 e -2,76 mm a partir do bregma, respectivamente (quadrado) (C-D). 54 5.3.1 Ensaio de PCR Quantitativo (qPCR): Extração de RNA total, reação de transcriptase reversa (RT-PCR) e qPCR O RNA total dos tecidos isolados foi extraído com Tri-Reagent-LS (Life Technologies, E.U.A.), conforme instruções do fabricante, ressuspendido em 10 L de H2O DEPC (Life Technologies, E.U.A.) e tratado com DNase I (2U/µL) conforme instruções do fabricante (turbo-DNA-freeTM, Life Technologies, E.U.A.). A concentração de RNA foi determinada por leitura de absorbância em 260 nm (NanoDrop 2000/2000c, E.U.A.). A reação de transcriptase reversa (RT-PCR) foi realizada com 5 L de RNA total (500 ng), utilizando 2,5 L de RT Random Primers 10X (Tabela 1), 1uL de dNTPs (100mM), 2,5L de tampão de PCR 10X, 1,5-2,0 µL do inibidor de ribonuclease, 1,25 µL de MultiScribe™ Reverse Transcriptase - 50 U/μL, Thermo Fisher Scientific) e 12,75 L de H2O RNAse free, totalizando volume de 25 L por reação. A mistura foi homogeneizada e, após breve centrifugação, incubada em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Life Technologies, E.U.A.) por 10 min/ 25oC e 120 min/37oC, seguido de resfriamento a 4ºC. O cDNA sintetizado foi utilizado nas reações subsequentes de PCR quantitativo (em tempo real) utilizando-se Sybergreen (Invitrogen). Para esses ensaios, serão preparadas soluções contendo os primers dos genes-alvo e housekeeping (10 nM) e o mix de Sybergreen (Invitrogen). Essa solução será aliquotada em tubos eppendorf (10 L/poço) e o cDNA de cada amostra, dos grupos experimentais descritos, adicionado ao tubo (2 L/poço). As soluções com cDNA foram distribuídas nos poços da placa de experimento, totalizando volume final da reação de 12 L/poço. Os housekeeping 18S e 26S foram testados e analisados através do software RefFinder, para a escolha do melhor gene normalizador para os experimentos, sendo escolhido o gene 26S. Os ensaios foram realizados em StepOne™ Real-Time PCR System 55 (Applied Biosystems) nas seguintes condições: Holding Stage: 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos (Cycling Stage) de 15s a 95 ºC e 1 min a 60 ºC, 15s a 95 ºC, 1 min a 60oC e 15s a 95oC, com aumento gradativo de 0,3oC (Melt Curve Stage). Antes do início de cada ensaio, foi realizada curva-teste (iniciando em 1:2 até 1:64) para verificação da eficiência do primer/sonda a partir de pool de 2 L de todas as amostras, a fim de definir a melhor diluição das amostras (com base nos menores valores de Ct) e escolha do método a ser empregado: ∆∆Ct (taxa de eficiência do primer/sonda entre 90 a 110%) ou curva-padrão relativa (taxas de eficiência do primer/sonda inferiores ou superiores a 90 e 110%), conforme recomendações contidas no manual da Applied Biosystems (Figuras 6-10). Para os ensaios com amostras dos núcleos APO, HMB, hipófise e ovário foram utilizadas amostras diluídas em 1:4, enquanto que para o NSQ foi utilizada a diluição de 1:5, definidas pelo melhor valor de Ct obtido pela curva-teste. As análises foram realizadas através do método ∆∆Ct (Livak; Schmittgen, 2001). Para PCR semi-quantitativa em Tempo Real (qPCR), do gene Bmal1 foi utilizado ensaio inventoriado por TaqMan® (Life Technologies, Foster City, CA, EUA) Rn00577590_m1 Arntl (Applied Biosystems) e Rat ACTB 20x (NM_031144.2, Applied Biosystems), como controle endógeno, com cDNA diluído 1:2 para todas as amostras, após realização de curva-teste. As análises foram realizadas pelo método da curva padrão relativa, no qual as amostras são pipetadas de maneira a termos, na mesma placa, uma curva com os pontos 1:2 a 1:64 contendo o controle endógeno + pool de amostras da região-alvo e Bmal1 + pool de amostras da região-alvo, bem como, amostras + controle endógeno e amostras + Bmal1, totalizando volume final de reação de 12 L/poço. Os resultados da expressão foram calculados pela divisão do valor do gene alvo normalizado pelo controle endógeno pelo valor do grupo calibrador. Valores acima de 0,2 entre as replicatas foram automaticamente excluídos. Todos os resultados foram expressos em unidades arbitrárias de expressão gênica. http://www.med.nyu.edu/ocs/small-instrument-fleet/available-instruments/ab-stepone http://www.med.nyu.edu/ocs/small-instrument-fleet/available-instruments/ab-stepone http://www.med.nyu.edu/ocs/small-instrument-fleet/available-instruments/ab-stepone http://www.med.nyu.edu/ocs/small-instrument-fleet/available-instruments/ab-stepone http://www.med.nyu.edu/ocs/small-instrument-fleet/available-instruments/ab-stepone 56 Fig. 6 – Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no NSQ realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. (A) Gene constitutivo βactina; (B) Gene constitutivo 26S; (C) Gene Per2; (D) Gene Rev-erbα; (E) Gene AVP; (F) Gene Bmal1. R2=coeficiente de determinação, Eff%= taxa de eficiência de amplificação do primer/sonda A B D E C F 57 Fig. 7 – Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR na APO realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. (A) Gene constitutivo βactina; (B) Gene constitutivo 26S; (C) Gene Per2; (D) Gene Rev-erbα; (E) Gene Bmal1. R2=coeficiente de determinação, Eff%= taxa de eficiência de amplificação do primer/sonda. E B C D A A 58 Fig. 8 – Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no HMB realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. (A) Gene constitutivo βactina; (B) Gene constitutivo 26S; (C) Gene Per2; (D) Gene Rev-erbα; (E) Gene Bmal1. R2=coeficiente de determinação, Eff%= taxa de eficiência de amplificação do primer/sonda. A B C D F 59 Fig. 9 – Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR na adenohipófise realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. (A) Gene constitutivo βactina; (B) Gene constitutivo 26S; (C) Gene Per2; (D) Gene Rev-erbα; (E) Gene Bmal1. R2=coeficiente de determinação, Eff%= taxa de eficiência de amplificação do primer/sonda A B C D E 60 Fig. 10 – Curvas-teste de eficiência de sonda/primer para qPCR no ovário realizadas a partir de pool de amostras dos grupos experimentais. (A) Gene constitutivo βactina; (B) Gene constitutivo 26S; (C) Gene Per2; (D) Gene Rev-erbα; (E) Gene Bmal1. R2=coeficiente de determinação, Eff%= taxa de eficiência de amplificação do primer/sonda A B C D E 61 Template access numbers Primers and probes Concentração Final mPer2 (NM_031678.1) Forward: 5'-GGTCGAGCAAAGGACCGAC-3' Reverse: 5'-GCTGCTCATGTCCACGTCTT-3' 10 µM mAVP (NM_016992.2) Forward: 5'-TGCCTGCTACTTCCAGAACTGC- 3' Reverse: 5'-AGGGGAGACACTGTCTCAGCTC- 3' 10 µM mRev-erbα (NM_001113422.1) Forward: 5'-ACAGCTGACACCACCCAGATC-3' Reverse: 5'- CATGGGCATAGGTGAAGATTTCT-3' 10 µM 26S RNA (NM_013224) Forward: 5'-CGATTCCTGACAACCTTGCTA-3' Reverse: 5'-CGTGCTTCCCAAGCTCTATGT-3' 10 µM mBMAL1 (NM_024362.2) mACTB (NM_031144.2) (Rn00577590_m1) (Rn00667869_m1) * Tabela1 – Sequências e concentrações dos primers utilizados e número de acesso do gene. * Conforme ensaio invetoriado fornecido pelo fabricante (Thermofisher Scientific). 5.4. Experimento II: Atividade dos neurônios vasopressinérgicos do núcleo supraquiasmático (NSQ) de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. 5.4.1. Coleta das Amostras 5.4.1.1. Perfusão Animais adultos e senis foram perfundidos transcardiacamente nos horários das 08, 14, 20 e 02 horas do diestro. Para a experimentação, os animais foram previamente anestesiados com Cloridrato de Cetamina (Syntec® 80 mg/Kg pc/ip) e Cloridrato de Xilazina (Syntec® 40 mg/Kg pc/ip) e tiveram sua região torácica exposta para incisão de cânula no ventrículo esquerdo. Após o clampeamento da artéria aorta abdominal foi introduzida cânula conectada à bomba de perfusão (Miniplus 3 GILSON®) até atingir a artéria aorta ascendente para o clampeamento de todo o conjunto (músculo cardíaco e bomba). 62 Durante a perfusão, utilizou-se aproximadamente 40 mL de tampão fosfato salina (PBS) a 0,01 M para a lavagem sistêmica do animal (fluxo 8 mL/min, por aproximadamente 5 min) e limpeza do cérebro. Posteriormente, volume aproximado de 400 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% (obtido a partir da mistura de solução PBS 0,2 M e PFA 8% na proporção 1:1) foi injetado no animal para a fixação do tecido cerebral, durante 50 minutos. Após a remoção, o encéfalo foi mantido no mesmo fixador (PFA 4%) durante 2 horas, em geladeira. Após este período, foi retirado e imerso em solução de sacarose 30% diluída em PB 0,2 M, onde permaneceu até a saturação. Em seguida, o mesmo foi cuidadosamente seco em papel absorvente para ser congelado através de mergulho rápido em isopentano (Sigma Aldrich® St. Louis, Missouri, EUA) à -50ºC durante 1 min. Logo após, foi armazenado a -70º C para processamento e análise posteriores. 5.4.1.2. Imunoistoquímica Obtenção dos cortes Cortes coronais seriados de 30 µm da região do NSQ (CARD et al., 1988) (Figura 11) foram obtidos em criostato (Leica® CM3050 S) a –22º C, conforme Atlas de Watson e Paxinos para coordenadas estereotáxicas em cérebro de rato (2007), armazenados em tubos com 1,5 mL de solução crioprotetora e estocados a -20°C para serem processados imunoistoquimicamente um em cada série de quatro cortes (distando 120 µm/série) para cFos/AVP. Preparação do tecido A imunoistoquímica foi realizada pelo método “free-floating”. Antes do início da imunoistoquímica os cortes foram lavados três vezes, por 5 minutos, em PB 0.01M, pH=7.2, para remoção da solução crioprotetora. Todas as etapas da preparação do tecido foram realizados à temperatura ambiente, com soluções diluídas em PB 0.1M, pH 7.2, intercalados por três lavagens com PB 0.01M durante 5 minutos. https://www.google.com.br/search?q=St.+Louis&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3sLC0SK5U4gAxzcoryrW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQDMHhGVQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwjC8qzttLTWAhXEDJAKHSyLA_MQmxMIiwEoATAQ https://www.google.com.br/search?q=St.+Louis&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3sLC0SK5U4gAxzcoryrW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQDMHhGVQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwjC8qzttLTWAhXEDJAKHSyLA_MQmxMIiwEoATAQ 63 Os cortes foram imersos em água oxigenada (H2O2 1%) durante 30 minutos, para eliminação da peroxidase endógena. A seguir, os cortes foram lavados com PB 0.01M até a eliminação da água oxigenada. As ligações inespecíficas foram bloqueadas com a incubação por 60 minutos em albumina bovina (BSA 5%). Incubação com os anticorpos Uma vez que cFos é considerado marcador celular de atividade neuronal (PETERFI et al., 2004) e que a porção dorsomedial do NSQ possui ritmo de produção espontânea desta proteína (SUMOVA et al., 1998), foi realizada dupla marcação para cFos/AVP nos grupos experimentais. Um em cada quatro cortes foi incubado à temperatura ambiente e sob agitação por 18h com anticorpo policlonal produzido em coelho (1:10.000; anti cFos AB5, PC38, Calbiochem®), em solução contendo TX-100 0,3% e soro normal de cabra (S1000 Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 2% em PB 0,1M. Depois de lavados, os cortes foram incubados com 2º anticorpo biotinilado, anti-IgG de coelho produzido em cabra (BA-1000; Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) diluído 1:200 em PB 0,1M contendo TX-100 0,3%, durante 1h. Após as lavagens com PB 0,01M, os cortes foram incubados com o complexo Avidina-Biotina (1:100; KIT ABC Elite PK 6000, Vectastain) por 60 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o substrato cromógeno 3,3-diaminobenzidina (DAB) (0,075 mg/mL DAB, Sigma), intensificado com solução de sulfato de níquel (NiSO4) e cloreto de cobalto (CoCl2) 1% (Êxodo Científica®, Sumaré, Brasil) acrescidos de 0,5 µL/mL de solução de H2O2 30%) em tampão fosfato 0,1M (pH=7.2), por 23 minutos em média. A reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PB0,01M e novo bloqueio das ligações inespecíficas foi realizado com BSA 5% por 1h30 min. Posteriormente foram incubados com o anticorpo anti-AVP, produzido em coelho (anti-AVP, Bachem T4563), diluído 1:20.000 em solução de PB 0,1M contendo TX-100 0,3% e soro normal de cabra 2% (S1000 Vector 64 Laboratories, Burlingame, CA, USA), durante 48 h à 4ºC. Depois de lavados, os cortes foram incubados com 2º anticorpo biotinilado, anti-IgG de coelho produzido em cabra (BA-1000, Vector), diluído 1:200 em solução contendo TX-100 0,3% e soro normal de cabra 2% em PB 0,1M durante 1 h. Após as lavagens com PB 0,01M, os cortes foram incubados com o complexo Avidina-Biotina (1:100, KIT ABC Elite PK 4100, Vectastain), por 60 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado DAB (0,075 mg/mL e 0,3 µL/mL de solução de H2O2 30%) em tampão fosfato (pH=7,2), por 15 minutos e a reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PB 0,01M. Montagem dos cortes Os cortes imersos em PBS foram montados em lâminas gelatinizadas e após secarem por algumas horas, foram desidratados em álcool etílico nas concentrações de 75, 95 e 100% e diafanizados em xilol, para serem recobertos por lamínula com o uso de Entelan (Merck) e guardadas até o momento da análise. Análises imunoistoquímicas Utilizando-se microscópio óptico (Leica DM 4000B LED) associado a sistema para análise de imagens (LAS V.4) foi realizada contagem bilateral dos neurônios duplamente imunorreativos à cFos e AVP na porção dorsomedial em aumento de 400X. Foram considerados nesta análise neurônios vasopressinérgicos com alta e média intensidade de marcação nuclear. Após serem fotografados (câmera Leica DFC 450), os cortes histológicos do NSQ de cada animal (Figura 18) foram cuidadosa e individualmente analisados, de modo que a contagem bilateral dos neurônios vasopressinérgicos imunorreativos à cFos ocorresse nas secções comuns a todos os animais. Nesta análise foi utilizada objetiva de 40 X e foram consideradas apenas as regiões do bregma -0.60 mm e -0.72 mm (plates 38 e 39) do atlas para coordenadas estereotáxicas em cérebro de rato de Paxinos (PAXINOS; WATSON, 2007), conforme Figura 11 65 abaixo: Fig. 11 – Secções médio-caudais do NSQ consideradas em todos os grupos experimentais para a contagem de neurônios vasopressinérgicos imunorreativos à cFos. (A) Bregma -0.60 mm (plate 38) e (B) Bregma -0.72 mm (plate 39). 5.5. Experimento III: Determinação das concentrações plasmáticas de FSH e LH de ratas cíclicas em diestro e com ciclo irregular em diestro persistente. As concentrações plasmáticas de LH, FSH foram determinadas por método de radioimunoensaio (RIE) de duplo anticorpo utilizando reagentes provindos do National Hormone and Peptide Program (Harbor-UCLA, Torrance, CA). Os anticorpos específicos (anti-rat) utilizados foram LH-S10, FSH-S11 diluídos em tampão fosfato com soro de coelho. As preparações de referências padrões LH- RP3 LH, FSH-RP3 ng/mL foram diluídas em tampão fosfato gel de 0,1% (0,01 M, pH = 7,5). Os hormônios foram iodinados e purificados no Laboratório do Dr. Celso Rodrigues Franci (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, Brasil), onde também foi produzido, em ovelha, o anticorpo inespecífico para precipitação da reação nos ensaios. Todas as amostras foram dosadas em duplicata no mesmo ensaio. A dose mínima detectável foi de 0,04 ng/mL para LH, 0,09 ng/mL para FSH. Os coeficientes de variação intra-ensaio foram 1,8% e 3% para LH e FSH, respectivamente. 66 5.6. Análise estatística Após realização do teste de normalidade de Shapiro-Wilk, as diferenças estatísticas foram determinadas por ANOVA de duas vias usando Graph Pad Prism® software (CA, USA), versão 7.0 para Windows, seguido do pós-teste de Tukey para comparações múltiplas. Os resultados foram expressos nos gráficos utilizando-se os valores da média  EPM . O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 para todas as comparações. 67 RESULTADOS RESULTADOS 68 6. Resultados 6.1. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP RNAm no NSQ e Per 2, Rev-erbα, Bmal1 na APO e HMB de ratas adultas cíclicas em diestro e senis com ciclos irregulares em diestro persistente. 6.1.1 Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP RNAm no NSQ Os resultados de expressão relativa de RNAm para genes de relógio relacionados com as alças principal e auxiliar de inibição transcripcional/translacional no eixo HPG demonstram alterações temporais na amplitude do ritmo circadiano em animais senis com idade de 18 meses, cujos ciclos são irregulares e permanecem em persistente diestro. Análise estatística para Rev- erbα, Bmal1 e AVP no NSQ apontou interação dos fatores idade e fotoperíodo (axbRev- erbα<0,0001; axbBmal1<0,001 e axbAVP<0,0001). Observa-se que há maior expressão às 20h do perfil gênico de Per2 (Fig. 12A, E) entre os grupos, com consequente alteração de amplitude e no perfil de expressão entre o período claro e escuro. O grupo em diestro persistente não apresentou diferença estatística entre os horários da fase clara e escura, enquanto que o grupo de ratas adultas cíclicas no diestro (CD) apresentou menor expressão do gene às 8h (p<0,0001) e 14h (p<0,05) comparado com às 20h. A comparação intergrupos também não apontou diferença estatística. A expressão temporal para RNAm de Rev-erbα no NSQ do grupo cíclico foi maior às 14h (p<0,0001) diminuindo às 20 e 02h, enquanto que para os animais com ciclo irregular em diestro persistente (IDP), esta expressão quase não se altera, sendo maior às 20h em relação às 8h (p<0,05) (Figura 12B, F). Diferenças temporais intergrupos foram observadas às 14 (p<0,01) e às 20h (p<0,01), com interação da idade e fotoperíodo extremamente significante (axb<0,0001) (Figura 12B). Diferenças estatísticas na expressão relativa de RNAm para Bmal1 foram observadas na RESULTADOS 69 fase clara do grupo cíclico em relação à fase escura (p14x20h<0,01; p8x20h<0,0001; p8x02h<0,01), entretanto nos animais IDP não houve diferenças estatísticas (Figura 12C,G). Foi observada interação idade e fotoperíodo (p<0,001). A vasopressina nos animais cíclicos foi maior às 02h em relação às 8h (p<0,01); nos animais senis foi maior às 20 e 2h em relação aos horários das 8 (p<0,0001) e 14h (p<0,0001) (Fig. 11D, H). A interação da idade e fotoperíodo foi extremamente significante (p<0,0001) com diferença entre os grupos às 20h (p<0,0001). RESULTADOS 70 Fig. 12 - Oscilações diárias na expressão relativa de RNAm para Per 2, Rev-erbα, Bmal1 e AVP no NSQ (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, RESULTADOS 71 6.1.2. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 na APO A análise para RNAm de Per2, Rev-erbα e Bmal1 na APO apontou interações dos fatores idade e fotoperíodo para Per2 e Rev-erbα (axbPer2<0,0001, axbRev-erbα<0,05, axbBmal1= 0,0834). O grupo com IDP revelou maior expressão gênica de RNAm para Per2 às 20h comparado com os demais horários (p<0,0001) enquanto que o grupo CD apresentou diferença estatística durante os horários da fase escura em relação às 8h (p20h<0,0001 e p02h<0,05) (Figura 13A, D). Rev-erbα em animais CD apresentou maior expressão às 14h (p14hx08h<0,01; p14hx02h<0,001) e às 20h (p20hx08h<0,05; p20hx02h<0,001), quando comparados às 8h e às 02h (Figura 13B, E). Já os animais com IDP expressaram menor quantidade de RNAm para Rev-erbα, com quantidades semelhantes expressas na fase clara e início da fase escura, porém com baixas quantidades às 02 h (p08x02h<0,0001; p14x02h<0,001; p20x02h<0,0001) e não diferindo das ratas CD neste mesmo horário. Bmal1 (Fig. 13C, F) em animais CD apresentou diferença estatística nos horários das 8 (p<0,05) e 02h (p<0,01), comparado com às 20h, contrastando com o grupo em diestro persistente, cuja diferença foi observada no horário das 14h em relação às 20h (p<0,05). Ratas CD e IDP, quando comparadas temporalmente, mostraram diferenças às 20h para Per2 e às 14h para Rev-erbα. quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, E) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B, F) Rev-erbα; (C, G) Bmal1 e (D, H) AVP em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. avs 8h; bvs.14h e cvs. 20h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbPer2=0,2100; axbReverbA<0,0001; axbBmal1<0,001; axbAVP<0,0001 Replicatas com variação acima de 0,2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e ReverbA; curva-padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 72 Fig. 13 - Oscilações diárias na expressão relativa de RNAm para Per 2, Rev-erbα e Bmal1 na APO (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, D) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B, E) Rev-erbα; (C, F) Bmal1 em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente. * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Cíclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. avs 8h; cvs. 20h e dvs. 02h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbPer2<0,0001; axbRev-erbα<0,05. Replicatas com variação acima de 0,2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e Rev-erbα; curva-padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 73 6.1.3. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 no HMB Na região do HMB o RNAm para Per2 foi significantemente menor durante a fase clara e início da fase escura no grupo em IDP (p<0,0001), enquanto o CD mostrou diferença às 02h em relação às 14h (p<0,01) (Figura 14A, D). Rev-erbα apresentou maior expressão em ratas cíclicas às 8 e 14h em relação às 20 e 02 h (p<0,05). O gene Bmal1 revelou-se estatisticamente significante às 14h (p<0,001) e às 02 h (p<0,01) em relação às 20h no grupo cíclico. O grupo IDP não apresentou diferenças entre o fotoperíodo. Diferenças entre os grupos CD e IDP foram observadas nos horários das 8h (p<0,0001), 14h (p<0,0001) e 20h (p<0,0001) para Per2 e às 8h (p<0,01) e 14h (p<0,0001) para Rev-erbα (Figura 14A-B; D-E). Interação dos fatores idade e fotoperíodo ocorreu somente para as análises de Per2 (axb<0,0001) e Rev-erbα (axb<0,0001) (Figura 14A-C; D-F). RESULTADOS 74 Fig. 14 - Oscilações diárias na expressão relativa de RNAm para Per 2, Rev-erbα e Bmal1 no HMB (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, D) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B, E) Rev-erbα e (C, F) Bmal1 em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente. * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. bvs.14h; cvs. 20h e dvs. 02h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbPer2<0,0001; axbRev-erbα<0,0001; axbBmal1=0,2906. Replicatas com variação acima de 0,2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e Rev-erbα; curva- padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 75 6.1.4. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 na Adenohipófise A expressão de RNAm para Per2 na adenohipófise de ratas CD (Figura 15A, D) demonstrou expressiva interação dos fatores idade e fotoperíodo (axbPer2<0,0001), com pico de expressão do gene às 20h (p08hx20h <0,0001; p14hx20h<0,0001) e mínimo de expressão às 8h. O grupo IDP revelou diferença estatística às 20h em comparação às 8h (p<0,05). Ratas CD e IDP quando comparadas, apontaram diferenças às 20h (p<0,0001). A análise do gene Rev- erbα também demonstrou interação expressiva dos fatores idade e fotoperíodo (axb<0,001). O grupo CD (Figura 15B, E) exibiu maior expressão às 20h em realção aos horários das 8h e 02h (p<0,001). O grupo IDP revelou máximo de expressão às 20h comparado aos horários das 8h, 14h e 02h (p<0,0001). Diferenças estatísticas para o RNAm de Bmal1 (Figura 15C, F) foram encontradas nos mesmos horários em ratas CD e IDP, sendo 14h, 20h e 02h os horários de menor expressão do gene em relação às 8h (p<0,0001 e p<0,01 para IDP 8h vs. 02h). Neste gene não foi observada interação dos fatores idade e fotoperíodo (axb=0,3964). Ratas CD e IDP quando comparadas, apresentaram diferenças significantes às 14h (p<0,01), 20h (p<0,0001) e 02h (p<0,0001) para Bmal1, Per2 e Rev-erbα, respectivamente. B Figura 3 - Oscilações diárias na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 no HMB (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo X pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07:00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 20:00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B) Rev-erbα e (C) Bmal1 em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. bvs.14h; cvs. 20h e dvs. 02h. axb = interação idade e tempo. axbPer2<0.0001; axbRev-erbα<0.0001; axbBmal1=0.2906. Replicatas com variação acima de 0.2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e Rev-erbα; curva-padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 76 Fig. 15 - Oscilações diárias na expressão relativa de RNAm para Per 2, Rev-erbα e Bmal1 na hipófise (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, D) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B, E) Rev-erbα e (C, F) Bmal1 em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. avs.08h; bvs.14h e dvs. 02h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbPer2<0,0001; axbRev-erbα<0,0001; axbBmal1=0,3964. Replicatas com variação acima de 0,2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e Rev-erbα; curva-padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 77 6.1.5. Expressão relativa de RNAm para Per2, Rev-erbα e Bmal1 no Ovário O tecido ovariano dos animais IDP apresentou maior expressão de RNAm para Per2 do que os animais cíclicos na mesma fase (Figura 16A, D), sendo que o maior ponto de expressão no grupo CD foi às 20h (p<0,0001), enquanto que o grupo IDP apresentou diferenças estatísticas às 14h, 20h e 02h às 8h (p<0,0001) e às 20h comparado às 02h (p<0,0001). Diferenças intergrupos foram observadas às 8 h (p<0,05), 14 h e 02 h (p<0,0001). A interação dos fatores idade e fotoperíodo foi extremamente significante (axb<0,0001), inclusive para os genes Rev-erbα e Bmal1 (axb<0,0001) (Figura 16B, E). Os grupos CD e IDP apresentaram perfil de expressão gênica semelhante para Rev-erbα, com altos valores de expressão no final da fase clara e início da fase escura. Diferenças estatísticas no grupo CD foram observadas às 14 e 20h em comparação com às 8h (p<0,0001), às 20h (p<0,001) e 02h (p<0,0001) em relação às 14h, e às 20h comparado com as 02h (p<0,0001). O grupo IDP apresentou diferenças estatísticas nos horários das 14 (p<0,0001) e 02h (p<0,05) em relação às 8h, no horário das 20 e 02h (p<0,0001) comparado com às 14h e no horário das 20h em relação às 02h (p<0,0001). Diferenças intergrupos foram verificadas às 8h (p<0,001) e às 20h (p<0,0001). Expressão significante para RNAm de Bmal1 (Fig. 16C, F) foi observada em ambos os grupos. Animais CD e IDP tiveram maior expressão às 8h (pCD14 e 20h<0,001 e pIDP14 e 20h<0,0001) e menor expressão às 14 e 20h em relação às 2h (pCD8 e 20h<0,0001; pCD14h<0,05 e pIDP14 e 20h<0,0001). Diferença estatística intergrupo foi verificada no horário das 02h (p<0,0001) e a interação dos fatores idade e fotoperíodo foi extremamente significante (axb<0,0001). RESULTADOS 78 Fig. 16 - Oscilações diárias na expressão relativa de Per 2, Rev-erbα e Bmal1 no ovário (n=3-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Todas as amostras foram coletadas seis horas após o primeiro horário (8h), durante 24 horas. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, D) Expressão temporal relativa de RNAm para Per2; (B, E) Rev-erbα e (C, F) Bmal1 em animais com ciclo regular em diestro e ciclo irregular em diestro persistente * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. avs.08h; bvs.14h; cvs.20h e dvs. 02h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbPer2<0,0001; axbRev-erbα<0,0001; axbBmal1<0,0001. Replicatas com variação acima de 0,2 foram automaticamente excluídas dos grupos. ∆∆Ct para Per2 e Rev-erbα; curva-padrão relativa para Bmal1. RESULTADOS 79 6.2. Análises Imunoistoquímicas Após análise estatística, observou–se que houve interação da idade e fotoperíodo (axb<0,05). Animais CD não revelaram diferenças estatísticas durante o fotoperíodo, enquanto que os animais IDP demonstraram maior atividade vasopressinérgica às 20h em relação às 08h (p<0,05) e às 02h (p<0,001), bem como às 14h em relação às 02h (p<0,05). A análise intergrupos apontou diferença estatística no horário das 20h (p<0,01) (Fig. 18 A-B ). Fig. 18 – Atividade de neurônios cFos/AVP imunorreativos no NSQ ao longo de 24h (A, B). Coletas realizadas a cada seis horas após o primeiro horário (8h) (n=5 -7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horár ios. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Ciclo claro / escuro 12/12 h. * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. bvs.14h; cvs.20h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axb<0.05. RESULTADOS 80 Fig. 18 – Fotomicrografias de neurônios vasopressinérgicos da porção dorsomedial do NSQ duplamente marcados com cFos (setas) às 20h do dia do diestro. Animal CD em aumento de 200x (A) e de 400x (B); Animal IDP em aumento de 200x (C) e de 400X (D) RESULTADOS 81 6.3. Dosagens Plasmáticas de Gonadotrofinas Análise estatística das concentrações plasmáticas de FSH e LH apontaram interação da idade e fotoperíodo (axbFSH<0,0001 e axbLH<0,001). Os dados de FSH (Fig. 17A, C) para o grupo CD não revelaram diferenças estatísticas, enquanto que para o grupo IDP foram estatisticamente significantes nos horários da 20h e das 02h em comparação com às 08h (p20h<0,0001; p02h<0,05) e às 14h (p20h<0,0001; p02h<0,05), bem como às 02h em comparação com as 20h (p02h<0,05). Análise intergrupos revelou diferença estatística no horário das 08h (p<0,0001). Os resultados para LH (Fig. 17B, D) no grupo CD não foram significantes. Para os animais IDP houve maior concentração plasmática de LH no início da fase escura quando comparada ao período claro (p<0,01). Animais CD e IDP apresentaram diferenças às 20h (p<0,01). RESULTADOS 82 Fig. 17 – Perfil hormonal de gonadotrofinas plasmáticas ao longo de 24h. Coletas realizadas a cada seis horas após o primeiro horário (8h) (n=5-7). Fase clara e escura estão representadas ao longo do eixo “X” pelos respectivos horários. Início da fase clara às 07h00, quando as luzes foram acesas e início da fase escura às 19h00. Ciclo claro / escuro 12/12 h. (A, C) FSH; (B, D) LH. * Indica variação intergrupos no mesmo horário: (■) Cíclico em diestro x (□) Ciclo irregular com diestro persistente. Letras indicam variação temporal dentro do grupo. avs.08h; bvs.14h; cvs.20h. axb = interação de idade e fotoperíodo. axbFSH<0,0001; axbLH<0,001. DISCUSSÃO DISCUSSÃO 84 7. Discussão No presente estudo observou-se, durante o período que antecede a cessação dos ciclos ovulatórios em roedores, alteração na sincronia temporal de autorregulação do sistema Clock no eixo HPG de fêmeas. O conhecimento sobre como ocorre o controle dos genes do relógio em ovários, hipófise e hipotálamo de fêmeas durante a transição para a senescência reprodutiva ainda é pouco explorado, sendo a compreensão da relação reprodução/ritmicidade circadiana obtido a partir de animais mutantes ou com lesões no NSQ. É importante ressaltar que o modelo animal utilizado neste estudo infere as alterações fisiológicas centrais e periféricas que ocorrem durante determinado período do organismo, resultando no envelhecimento. Os resultados aqui descritos propiciam esclarecimentos iniciais acerca de questões sobre o modo como alterações nas estruturas do eixo HPG contribuem para a senescência biológica. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que Per2 no NSQ de fêmeas no período de diestro persistente não difere do perfil de expressão de animais cíclicos em diestro. No entanto, durante a fase clara do período analisado nota-se que os animais IDP possuem ligeiro aumento de expressão do gene que se mantém no final desta fase, diferentemente do que ocorre com os animais CD. Fêmeas Wistar no período de periestropausa também revelaram que a expressão gênica de Per2 no NSQ ao longo de 24 horas ocorre sob desalinhamento do fotoperíodo, possivelmente por ser este período de grandes flutuações neurohumorais influenciadas pelo descompasso do ritmo biológico, cujo reflexo primário é diretamente observado na am